MX2008000269A - Core 2 beta(1,6)-acetilglicosaminiltransferasa como marcador de dagnostico para la aterosclerosis. - Google Patents

Abstract

Se describe un metodo para indicar la presencia de ateroesclerosis (particularmente ateroesclerosis de arteria coronaria) en un sujeto, que comprende comparar el nivel de Core 2 de GlcNAc-T en una muestra de tejido proveniente de un sujeto con un nivel de referencia, determinado para el mismo tejido. Un nivel de Core 2 de GlcNAc-T en la muestra de tejido proveniente de un sujeto, que es mas alta que aquel del nivel de referencia, es indicadora de que el sujeto esta afectado con aterosclerosis (particularmente aterosclerosis de arterias coronarias - enfermedad de arterias coronarias - CAD). En modalidades preferidas, la muestra consiste de leucocitos y el nivel de proteina es determinado como la actividad enzimatica utilizando UDP-GlcNAc radiomarcado y un derivado de Gal((1,3)-GalNAc.

Description

CORE 2 BETA(l,6)-ACETILGLICOSAMINILTRANSFERASA COMO MARCADOR DE DIAGNOSTICO PARA LA ATEROESCLEROSIS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención es realizada en el campo de los métodos para el diagnóstico de las enfermedades vasculares y en particular la ateroesclerosis . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Se sabe que la ateroesclerosis (AS) posee un componente inflamatorio y Core 2 GlcNAc-T (también conocido como UDP-GlcNAc:Galßl, 3GalNAc-R (GlcNAc a GalNAc) ß-l,6-N-acetilaminotransferasa o Core 2-ß-l,6-N-acetilaminotransferasa - EC 2.4.1.102) ha estado implicado en la inflamación (WO 0031109) . Se ha especulado que los inhibidores de Core 2 GlcNAc-T pueden ser útiles en AS (por ejemplo, WO 0185748) , no obstante, los estudios no publicados han examinado los niveles de Core 2 GlcNAc-T en pacientes que sufren de ateroesclerosis ni tampoco el nivel de esta enzima ha sido sugerido como un marcador para la ateroesclerosis en un sujeto. Los actuales inventores han encontrado sorprendentemente que, el nivel de la actividad de Core 2 GlcNAc-T en las muestras de sangre de pacientes con ateroesclerosis es marcadamente elevada con relación a los individuos saludables, afectados, consecuentemente los REF. :189113 niveles de Core 2 GlcNAc-T pueden ser utilizados para indicar la presencia de la ateroesclerosis en un sujeto. Las muestras de sangre pueden ser preparaciones particularmente aisladas que contienen células polimorfonucleares (PMNs) y otras subpoblaciones de leucocitos y más particularmente preparaciones aisladas que contienen PMNs y Células Mononucleares de Sangre Periférica (PBMCs) . La ateroesclerosis incluye (ateroesclerosis de las arterias coronarias/enfermedad de las arterias coronarias -CAD/enfermedad cardiaca isquémica - IHD/enfermedad cardiovasuclar arterioesclerótica - ASCVD/enfermedad cardiaca coronaria - CHD) . BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En consecuencia, un primer aspecto de la presente invención proporciona un método para indicar la presencia de ateroesclerosis en un sujeto, que comprende la comparación del nivel de Core 2 GlcNAc-T en una muestra de tejido de un sujeto, con un nivel de referencia determinado para el mismo tejido. Un nivel de Core 2 GlcNAc-T en la muestra de tejido proveniente de un sujeto que es más alto que el nivel de referencia, es indicador de que el sujeto está afectado con la ateroesclerosis. Típicamente, el nivel de referencia es establecido en el tejido por la determinación del nivel medio de Core 2 GlcNAc-T en muestras de tejido provenientes de una población de uno o más individuos asociados con una ausencia de AS; preferentemente, el nivel de referencia es establecido en el tejido por la determinación del nivel medio de Core 2 GlcNAc-T en muestras de tejido provenientes de una población de 5 o más individuos asociados con una ausencia de AS; más preferentemente, el nivel de referencia es establecido en el tejido por la determinación del nivel medio de Core 2 GlcNAc-T en las muestras del tejidos provenientes de una población de 10 o más individuos asociados con un ausencia de AS. Convenientemente, la muestra de tejido es una muestra de sangre. Convenientemente, el nivel de Core 2 GlcNAc-T puede ser determinado en leucocitos que pueden ser aislados de sangre por métodos bien conocidos en la materia. Particularmente, el nivel de Core 2 GlcNAc-T puede ser determinado en preparaciones aisladas que contienen PMNs y otras sub-poblaciones de leucocitos, y más particularmente, en preparaciones aisladas que contienen PMNs y PBMCs . El nivel de Core 2 GlcNAc-T puede ser el nivel de del transcrito de ARN de Core 2 GlcNAc-T, el nivel de la proteína de Core 2 GlcNAc-T o el nivel de la actividad enzimática de Core 2 GlcNAc-T; preferentemente éste es el nivel de actividad enzimática de Core 2 GlcNAc-T. Los ensayos adecuados para la actividad enzimática Core 2 GlcNAc-T incluyen aquellos que utilizan sustratos radiomarcados o compuestos aceptores, utilizando sustratos fluorescentemente marcados o compuestos aceptores, o mediante la derivatización de un producto formado antes del análisis (por ejemplo, mediante CLAR) por ejemplo, aquellos descritos en la presente o en Chibber et al., Diabetes 49, 1724-1730 (2000), Palmerini CA. et al., Glycoconj J. Agosto;13 (4) : 631-6(1996) o Kuhns W. et al., Glyco conjúgate Journal 10 381-394 (1993) (todas las cuales son incorporadas por referencia en la presente) . Los leucocitos pueden ser aislados de muestras de sangre y la actividad de Core 2 GlcNAc-T determinada como se describe en Chibber et al., (2000) o por el protocolo descrito en la presente bajo el ejemplo 1. Los inventores han determinado que el nivel de actividad enzimática de Core 2 GlcNAc-T en preparaciones de leucocitos obtenidas de individuos saludables y evaluadas por el método de Chibber et al (2000) o como se detalla en el ejemplo 1, está entre 40 y 1000 pmoles/hora/mg de proteína y típicamente entre 50 y 500 pmoles/hora/ g de proteína. El valor medio puede estar entre 50 y 1000, típicamente entre 100 y 500 y más típicamente entre 200 y 400 pmoles/hora/mg. Los niveles de Core 2 GlcNAc-T en individuos afectados con ateroesclerosis estarán en la región de al menos 2 veces, preferentemente al menos 4 veces, más preferentemente al menos 6 veces y lo más preferentemente al menos 8 veces el nivel de referencia de los individuos saludables no afectados, cuando las muestras de sangre son tratadas y los leucocitos evaluados de acuerdo a Chibber et al (2000) o como se detalla en el ejemplo 1. El método de la invención puede ser llevado a cabo convenientemente utilizando un kit que comprende los componentes necesarios para llevar a cabo el método de la invención. De este modo, en una segunda modalidad de la invención es proporcionado un kit para indicar la presencia de la ateroesclerosis en un sujeto. El kit comprenderá preferentemente un compuesto aceptor. Un compuesto aceptor es un compuesto al cual Core 2 GlcNAc-T es capaz de transferir un residuo monosacárido. Preferentemente, el compuesto aceptor es un derivado de Galß (1 , 3 ) GalNAca. Los compuestos aceptores adecuados son por ejemplo, Galß(l,3)GalNAc-Bn, Galß (1, 3) GalNAc-p-nitrofenol o Galß (1,3) GalNAca-p-NHdansilfenilo . Opcionalmente, el kit comprenderá también UDP-GlcNAc, el cual puede estar radiomarcado. Convenientemente, UDP-GlcNAc es marcado con 14C o 3H. Opcionalmente, el kit puede contener además N-acetilglucosamina (GlcNAc) y los reactivos para la lisis de leucocitos, tales como un detergente (por ejemplo, Triton-XlOO) . El kit puede comprender instrucciones para su uso .

La presente invención será descrita ahora además por referencia a los siguientes ejemplos, esquemas y figuras no limitantes . Las modalidades adicionales que caen dentro del alcance de la reivindicación serán aparentes para aquellos expertos en la técnica a la luz de éstas . BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS FIGURAS La Figura 1 es una gráfica que ilustra los niveles de actividad de Core 2 GlcNAc-T en leucocitos provenientes de individuos control saludables y sujetos con enfermedad cardiaca isquémica (IHD) . Para los controles n = 19 para los pacientes con IHD, n = 13. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN EJEMPLOS 1. Determinación de la actividad de Core 2 GlcNAc-T en leucocitos aislados de sangre de pacientes diagnosticados con la enfermedad cardiaca isquémica. 13 pacientes de edad media de ambos géneros con IHD y 19 controles saludables de edades similares, fueron utilizados en este estudio. Los pacientes con diabetes fueron excluidos . Los pacientes con IHD incluidos en el estudio sufrieron angina estable,' angina inestable o habían sufrido recientemente un infarto al miocardio . Se tomaron muestras de sangre en tubos heparinizados . Las muestras de sangre fueron colocadas en capas sobre un volumen igual de Histo-Paque 1077 (Pharmacia y disponible de Sigma, Poole, Dorset, Reino Unido) y centrifugadas a 400 g por 30 minutos. La capa de color ante (que contiene células mononucleares de sangre periférica (PBMNC) y leucocitos polimorfonucleares (PMN) ) se lavó en solución salina amortiguada con fosfato. Los leucocitos aislados fueron congelados y usados en cloruro de sodio al 0.9%, Triton-XlOO 1 mM al 0.4%, PMSF y fue evaluada Core 2 GlcNAc-T. La reacción fue realizada en 50 mmol/1 de ácido 2 (N-morfolino) 2 (N-morfolino) etansulfónico, pH 7.0; 1 mmol/1 de UDP GlcNAc, 0.5 µCi de UDP-6 [3H] -N-acetilglucosamina (16,000 dpm/nmol, NEN Life Science Products, Hounslow, Reino Unido); 0.1 mol/1 de GlcNAc; 1 mmol/1 ßDgal (1-3 ) D -GalNAc-p-nitrofenol y 15 µl de lisado celular (100-200 µg de proteína) para un volumen final de 30 µl . Después de incubar la mezcla por 1 hora a 37°C, la reacción fue terminada por la adición de 1 ml de agua enfriada con hielo y procesada sobre una columna C18 Sep-Pak (Waters-Millipore, Watford, Reino Unido) . Después de lavar la columna con 20 ml de agua, el producto fue eluido con 5 ml de metanol y la radioactividad fue contada. La actividad endógena de Core 2 GlcNAc-T fue medida en ausencia del ' aceptor agregado. Los resultados son mostrados en la Figura 1. La actividad de Core 2 GlcNAc-T en individuos saludables fue de 287 ± 147.2 pmoles/hora/mg o proteína, mientras que en pacientes con IHD el valor fue de 2376 ± 461. Estos valores están en concordancia con aquellos de los tres grupos de individuos saludables en Glibber et al (2000) en la cual los valores fueron 249 ± 35.9 (n = 25), 334 ± 86 (n = 11) y 283 ± 37 (n = 31) pmols/hora/mg. Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método para indicar la presencia de ateroesclerosis en un sujeto, caracterizado porque comprende la comparación del nivel de Core 2 GlcNAc-T en una muestra de tejido proveniente de un sujeto con un nivel de referencia determinado para el mismo tejido; un nivel de Core 2 GlcNAc-T en la muestra de tejido proveniente de un sujeto que es más alta que aquella del nivel de referencia, es indicadora de que el sujeto está afectado con ateroesclerosis. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra de tejido es una muestra de sangre. 3. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque el nivel de Core 2 GlcNAc-T es medido en leucocitos. . El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque los leucocitos son aislados de la sangre. 5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el nivel de Core 2 GlcNAc-T es el nivel de actividad enzimática de Core 2 GlcNAc-T 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el nivel de actividad enzimática de Core 2 GlcNAc-T de los leucocitos de un sujeto es al menos 2 veces mayor que aquella del nivel de referencia que es indicadora de ateroesclerosis en el sujeto. 7. Un kít para indicar la presencia de ateroesclerosis en un sujeto, al medir la actividad enzimática de Core 2 GlcNAc-T, y caracterizado porque comprende un compuesto al cual Core 2 GlcNAc-T es capaz de transferir un residuo monosacárido. 8. El kit de conformidad con la reivindicación 7 , caracterizado porque el compuesto al cual Core 2 GlcNAc-T es capaz de transferir un residuo monosacárido, es un derivado de Galß(l,3)GalNAc. 9. El kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, caracterizado porque el compuesto al cual Core 2 GlcNAc-T es capaz de transferir un residuo monosacárido es Galß (1, 3 ) GalNAc-Bn, Galß (1, 3 ) GalNAc-p-aminofenilo, Galß (1, 3) GalNAc-p-nitrofenol o Galß (1, 3 ) GalNAca-p-NHdansilfenol . 10. El kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, caracterizado porque incluye además UDP-GlcNAc. 11. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque UDP-GlcNAc está radiomarcado.