JP5275026B2 - アテローム性動脈硬化のための診断マーカーとしてのコア２β（１，６）−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼ - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

アテローム性動脈硬化の診断
本発明は血管疾患の診断のための方法、特にアテローム性動脈硬化の分野においてなされた。

アテローム性動脈硬化（ＡＳ）は炎症性成分を有していることが知られ、コア２ＧｌｃＮＡｃ−Ｔ（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ（ＧｌｃＮＡｃからＧａｌＮＡｃ）β−１，６−Ｎ−アセチルアミノトランスフェラーゼ又はコア２β−１，６Ｎ−アセチルアミトトランスフェラーゼ−ＥＣ２．４．１．１０２としても知られている）は炎症に関与している（ＷＯ ００３１１０９）。コア２ＧｌｃＮＡｃ−Ｔ阻害剤はアテローム性動脈硬化に有用であるかもしれないと推測されてきたが（例えばＷＯ ０１８５７４８）、しかしながら、アテローム性動脈硬化に罹っている患者におけるコア２ＧｌｃＮＡｃ−Ｔのレベルについて検討された発表された研究はなく、被験者におけるアテローム性動脈硬化のためのマーカーとしてこの酵素のレベルが示唆されたこともない。

本発明者らは驚くべきことに、アテローム性動脈硬化を有している患者由来の血液サンプル中でのコア２ＧｌｃＮＡｃ−Ｔのレベルは、罹患していない健康な個体と比較して顕著に増加しており、従ってコア２ＧｌｃＮＡｃ−Ｔのレベルは被験者におけるアテローム性動脈硬化の存在を示唆するのに使用できるかもしれない、ということを見出した。

血液サンプルは特に、多核白血球（ＰＭＮｓ）及び他の白血球の亜母集団（ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を含んでいる単離された調製物であってもよく、そしてより特異的には多核白血球と末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）を含んでいる単離された調製物であってもよい。

アテローム性動脈硬化には、冠状動脈アテローム性動脈硬化／冠状動脈疾患（ＣＡＤ）／虚血性心疾患（ＩＨＤ）／動脈硬化性心血管疾患（ＡＳＣＶＤ）／冠状動脈性心疾患（ＣＨＤ）が含まれる。

従って本発明の第一の観点は、被験者においてアテローム性動脈硬化の存在を示唆する方法を提供するものであり、該方法は、被験者に由来する組織サンプル中のコア２ＧｌｃＮＡｃ−Ｔのレベルを、同じ組織について測定された対照のレベルと比較することを含む。被験者に由来する組織サンプル中のコア２ＧｌｃＮＡｃ−Ｔのレベルが対照のレベルよりも高いことは、該被験者がアテローム性動脈硬化に罹っていることを示唆するものである。

典型的には対照のレベルは組織中で、アテローム性動脈硬化の不在と関連している１人以上の集団に由来する組織のサンプルの中でコア２ＧｌｃＮＡｃ−Ｔの平均レベルを測定することにより確立され；好ましくは対照のレベルは組織中で、アテローム性動脈硬化の不在と関連している５人以上の集団に由来する組織のサンプルの中でコア２ＧｌｃＮＡｃ−Ｔの平均レベルを測定することにより確立され；より好ましくは対照のレベルは組織中で、アテローム性動脈硬化の不在と関連している１０人以上の集団に由来する組織のサンプル中でコア２ＧｌｃＮＡｃ−Ｔの平均レベルを測定することにより確立される。

都合良くは、組織サンプルが血液サンプルである。
都合良くは、コア２ＧｌｃＮＡｃ−Ｔのレベルを白血球中で測定してもよく、その白血球は本技術分野において良く知られた方法によって血液から単離されてもよい。

特にコア２ＧｌｃＮＡｃ−Ｔのレベルは、多核白血球と他の白血球亜母集団を含んでいる単離された調製物の中で、より特異的には多核白血球と末梢血単核球を含んでいる単離された調製物の中で測定される。

コア２ＧｌｃＮＡｃ−Ｔのレベルは、コア２ＧｌｃＮＡｃ−ＴのＲＮＡ転写産物のレベルであっても、コア２ＧｌｃＮＡｃ−Ｔの蛋白質のレベルであっても、あるいはコア２ＧｌｃＮＡｃ−Ｔの酵素活性であってもよく、それは好ましくは、コア２ＧｌｃＮＡｃ−Ｔの酵素活性のレベルである。

コア２ＧｌｃＮＡｃ−Ｔの酵素活性のための適切なアッセイには、放射標識された基質またはアクセプター化合物を用いたもの、蛍光標識された基質またはアクセプター化合物を用いたもの、あるいは生成した産物を分析（例えばＨＰＬＣによる）に先立って誘導体化することによるものを含み、例えば本願明細書中で述べられたもの、またはＣｈｉｂｂｅｒ ｅｔ ａｌ Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４９，１７２４−１７３０（２０００）， Ｐａｌｍｅｒｉｎｉ Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ． Ａｕｇ；１３（４）：６３１−６（１９９６）またはＫｕｈｎｓ Ｗ．ｅｔ ａｌ Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊｏｕｒｎａｌ １０ ３８１−３９４ （１９９３）（これら全てを参照することにより本願明細書中に援用する）の中で述べられたものがある。白血球は血液サンプルから単離されてもよく、コア２ＧｌｃＮＡｃ−Ｔ活性は、Ｃｈｉｂｂｅｒ ｅｔ ａｌ（２０００）の中で述べられたように、あるいは本願明細書中に実施例１として述べられたプロトコールによって測定される。

本発明者らは、健康な個体から得られた白血球調製物中のコア２ＧｌｃＮＡｃ−Ｔ酵素活性のレベルを測定し、Ｃｈｉｂｂｅｒ ｅｔ ａｌ（２０００）の方法または実施例１の中で詳細に述べられたようにしてアッセイしたところ、それは４０と１０００ｐｍｏｌ／時間／ｍｇ蛋白質の間であり、典型的には５０と５００ｐｍｏｌ／時間／ｍｇ蛋白質の間であった。

平均値は５０と１０００の間であってもよく、典型的には１００と５００の間、より典型的には２００と４００ｐｍｏｌ／時間／ｍｇの間である。
血液サンプルを処理し、白血球をＣｈｉｂｂｅｒ ｅｔ ａｌ（２０００）に従って、または本願明細書中に実施例１として詳述されたようにアッセイした場合には、アテローム性動脈硬化に罹っている個体におけるコア２ＧｌｃＮＡｃ−Ｔのレベルは、健康な罹っていない個体の対照レベルの、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも４倍、より好ましくは少なくとも６倍、最も好ましくは少なくとも８倍であろう。

都合良くは、本発明の方法は、本発明の方法を実施するのに必要な成分を含んでいるキットを用いて実施することができる。そこで本発明の第二の態様において、被験者にアテローム性動脈硬化があることを示すためのキットを提供する。好ましくは該キットはアクセプター化合物を含む。アクセプター化合物は、コア２ＧｌｃＮＡｃ−Ｔがその化合物にモノサッカライド残基を転移させることが可能な化合物である。好ましくはアクセプター化合物は、Ｇａｌβ（１，３）ＧａｌＮＡｃαの誘導体である。適切なアクセプター化合物は、例えば、Ｇａｌβ（１，３）ＧａｌＮａｃＢｎ、Ｇａｌβ（１，３）ＧａｌＮａｃ−ｐ−ニトロフェノール、またはＧａｌβ（１，３）ＧａｌＮＡｃα−ｐ−ＮＨダンシルフェニルである。

必要に応じて、該キットはＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃも含んでよく、それは放射標識されてもよい。都合良くは、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃが^１４Ｃまたは^３Ｈで標識されている。必要に応じて、該キットは更にＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）と、洗浄剤（例えばトライトン−Ｘ１００）などの白血球を溶解するための試薬を含んでもよい。該キットは使用のための指示書を含んでもよい。

本発明を下記の非限定的な実施例、スキーム及び図面を参照として更に述べる。それらに照らして本技術分野の当業者は、本発明の範囲内に入る更なる態様を思い付くであろう。

１．虚血性心疾患を有すると診断された患者の血液から単離された白血球中のコア２ＧｌｃＮＡｃ−Ｔ活性の測定
虚血性心疾患を有する両方の性別の１３人の中年の患者と、年齢を適合させた健康な１９人のコントロールを、この研究に用いた。糖尿病を有する患者は除外した。この研究の中に含まれる虚血性心疾患の患者は安定狭心症、不安定狭心症を患っているか、あるいは最近心筋梗塞を患った。

血液をヘパリン処理したチューブに採取した。等容量のＨｉｓｔｏ−Ｐａｑｕｅ１０７７（ファルマシア及びシグマから入手可能、プール、ドーセット、英国）の上に血液サンプルを積層し、４００ｇで３０分間遠心した。バフィーコート（末梢血単核球細胞（ＰＢＭＮＣ）および多形核（ＰＭＮ）白血球を含んでいる）をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。単離された白血球を凍結し、０．９％ＮａＣｌ、０．４％トライトン−Ｘ１００、１ｍＭ ＰＭＳＦの中で溶解し、コア２ＧｌｃＮＡｃ−Ｔをアッセイした。５０ｍｍｏｌ／Ｌの２（Ｎ−モルフォリノ）２（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルフォン酸 ｐＨ７．０；１ｍｍｏｌ／ＬのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、０．５μＣｉのＵＤＰ−６［３Ｈ］−Ｎ−アセチルグルコサミン（１６，０００ｄｐｍ／ｎｍｏｌ、ＮＥＮライフサイエンスプロダクト、ハウンズロー、英国）；０．１ｍｏｌ／ＬのＧｌｃＮＡｃ；１ｍｍｏｌ／ＬのβＤｇａｌ（１−３）Ｄα−ＧａｌＮＡｃ−ｐ−ニトロフェノールおよび１５μｌの細胞溶解液（１００−２００μｇ蛋白質）の中で、３０μｌの最終容量で反応を行った。その混合液を３７℃で１時間インキュベートした後に、１ｍｌの氷冷水を添加することにより反応を終了し、Ｃ１８Ｓｅｐ−Ｐａｋカラム（ウォーターズ−ミリポア、ウォトフォード、英国）上で処理した。２０ｍＬの水でカラムを洗浄した後、生成物を５ｍＬのメタノールで溶出し、放射活性を計測した。コア２ＧｌｃＮＡｃ−Ｔの内因性活性を、添加したアクセプターの非存在下で測定した。結果を図１に示す。

健康な個体におけるコア２ＧｌｃＮＡｃ−Ｔ活性は、２８７±１４７．２ｐｍｏｌ／時間／ｍｇ又は蛋白質であり、一方、虚血性心疾患を有している患者においてその値は２３７６±４６１であった。これらの値はＣｈｉｂｂｅｒ ｅｔ ａｌ（２０００）における健康な個体の３群における値と一致しており、Ｃｈｉｂｂｅｒ ｅｔ ａｌ（２０００）においてそれらの値は２４９±３５．９（ｎ＝２５）、３３４±８６（ｎ＝１１）及び２８３±３７（ｎ＝３１）ｐｍｏｌ／時間／ｍｇであった。

図１は、健康なコントロール個体と虚血性心疾患（ＩＨＤ）を有する被験者に由来する白血球におけるコア２ＧｌｃＮＡｃ−Ｔ活性のレベルを描くグラフである。コントロールについてはｎが１９、虚血性心疾患の患者についてはｎが１３である。

Claims (8)

1. 被験者においてアテローム性動脈硬化の存在を示唆する方法であって、
   該方法は被験者に由来する組織サンプル中のコア２ＧｌｃＮＡｃ−Ｔの酵素活性のレベルを、同じ組織について測定された対照レベルと比較することを含み、
   ここにおいて、被験者に由来する組織サンプル中のコア２ＧｌｃＮＡｃ−Ｔの酵素活性のレベルが対照レベルよりも高いことは、該被験者がアテローム性動脈硬化を患っていることを示唆する、
   前記方法。
2. 組織サンプルが血液サンプルである、請求項１記載の方法。
3. コア２ＧｌｃＮＡｃ−Ｔ酵素活性のレベルが血液サンプルの白血球中で測定される、請求項２記載の方法。
4. 被験者の白血球のコア２ＧｌｃＮＡｃ−Ｔの酵素活性のレベルが、対照のレベルより少なくとも２倍高いことは、該被験者におけるアテローム性動脈硬化を示唆するものである、請求項１記載の方法。
5. コア２ＧｌｃＮＡｃ−Ｔの酵素活性を測定することによって被験者におけるアテローム性動脈硬化の存在を示唆するためのキットであって、Ｇａｌβ（１，３）ＧａｌＮＡｃの誘導体である化合物、を含む前記キット。
6. Ｇａｌβ（１，３）ＧａｌＮＡｃの誘導体である化合物が、Ｇａｌβ（１，３）ＧａｌＮＡｃ−Ｂｎ、Ｇａｌβ（１，３）ＧａｌＮＡｃ−ｐ−アミノフェニル、Ｇａｌβ（１，３）ＧａｌＮＡｃ−ｐ−ニトロフェノールまたはＧａｌβ（１，３）ＧａｌＮＡｃα−ｐ−ＮＨダンシルフェノールである、請求項５記載のキット。
7. さらにＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを含む、請求項５又は６記載のキット。
8. ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃが放射標識されている、請求項７記載のキット。

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