MX2007008465A

MX2007008465A - Peptidos de beta timocina modificados.

Info

Publication number: MX2007008465A
Application number: MX2007008465A
Authority: MX
Inventors: Allan L Goldstein; Ewald Hannappel; Thomas Huff; David Crockford
Original assignee: Regenerx Biopharmaceuticals Inc
Priority date: 2005-01-14
Filing date: 2006-01-17
Publication date: 2008-01-28
Also published as: EP1835927A1; JP2008526978A; WO2006076523A1; EP1835927A4; IL184284A; KR20070119615A; US20080248993A1; AU2006204911A1; CA2593198A1; IL184284A0

Abstract

La invencion describe una composicion incluye un peptido de beta timocina que contiene metionina oxidada o super oxidada, isoforma de esta, fragmento de esta, R-enantiomero aislado de esta o S-enantiomero aislado de esta, diferente del sulfoxido de timocina beta 4 racemica, o un peptido de beta timocina modificada, isoforma o fragmento de esta, que tiene un sustituyente de aminoacido sustituido por cuando menos una metionina de una secuencia de aminoacidos de un peptido de beta timocina que normalmente contiene metionina, isoforma o fragmento de esta; y metodos para la formacion de la misma.

Description

PEPTIDOS DE BETA TIMOCINA MODIFICADOS Campo de la Invención La presente invención se relaciona con el campo de los péptidos de beta timocina, isoformas y fragmentos de éstos.

Antecedentes de la Invención La presente invención reivindica el beneficio de la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos de América número 60/643,684, de la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos de América número 60/643,686, de la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos de América número 60/643,687, y de la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos de América número 60/643,688, todas presentadas el 14 de enero de 2005. La timocina ß4 se identificó inicialmente como una proteína que es sobre-regulada durante la migración y diferenciación de células endoteliales in vitro. La timocina ß4 fue aislada originalmente a partir del timo y es un polipéptido ubicuo de 43 aminoácidos y 4.9 kDa, identificado en una variedad de tejidos. Se le han atribuido varios papeles a esta proteína incluyendo un papel en una diferenciación y migración de célula endotelial, diferenciación de célula T, secuestro de actina y vascularización. La secuencia de la Tß4 se describe en la patente de los Estados Unidos de América número 4,297,276, la cual se incorpora a la presente mediante referencia. La Tß4 fue altamente conservada durante la evolución. En efecto, existe homología total entre la Tß4 de murino, de rata y de ser humano. Se ha encontrado que está presente la Tß4 en numerosos tipos de tejidos en mamíferos y también ha sido implicada en una amplia variedad de procesos celulares y fisiológicos que incluyen la inducción de actividad de la desoxinucleotidil transferasa Terminal en las células de la médula ósea, estimulación de la secreción de hormona de liberación de la hormona de luteinización hipotalámica y hormona de luteinización, inhibición de la migración y mejoramiento de la presentación de antígeno de macrófagos e inducción de cambios fenotípicos en líneas de células T in vitro.

El sulfóxido de timocina beta 4 se describe en la publicación internacional PCT número WO 99/49883. Existe la necesidad en la técnica de péptidos mejorados de beta timocina.

Compendio de la Invención De acuerdo con una modalidad, una composición comprende un péptido de beta timocina que normalmente contiene metionina, modificada, oxidada o súper oxidada, isoforma de ésta, fragmento de ésta, R-enantiómero aislado de ésta o S-enantiómero aislado de ésta, diferente del sulfóxido de timocina beta 4 racémica, o la composición comprende un péptido de beta timocina modificada, isoforma o fragmento de ésta, que tiene un sustituyente de aminoácido que no es metionina, sustituido por cuando menos una metionina de una secuencia de aminoácidos de un péptido de beta timocina que normalmente contiene metionina, isoforma o fragmento de ésta. También se describen métodos para la formación de una composición de acuerdo con la presente invención.

Descripción Detallada de la Invención Muchos péptidos de beta timocina incluyen en sus secuencias de aminoácidos el aminoácido metionina, el cual está sujeto a oxidación in vivo e in vitro. Dichos péptidos de beta timocina algunas veces son referidos aquí como "péptidos de beta timocina que normalmente contienen metionina." En muchas de la beta timocinas que se conocen, la metionina está presente en la posición 6. La oxidación del aminoácido, metionina (C5HnN?2S), a sulfóxido de metionina (C5H11NO3S), en beta timocinas que normalmente contienen metionina, resulta en composiciones que son sulfóxidos de beta timocina. La oxidación puede ser realizada utilizando cualquier método adecuado. Por ejemplo, la oxidación de beta timocinas que contienen metionina a sulfóxidos puede llevarse a cabo exponiendo las beta timocinas que contiene metionina a peróxido de hidrógeno. La oxidación de la timocina beta 4 con 50 vol. de peróxido de hidrógeno se describe en la publicación WO 99/4988, que se incorpora a la presente como referencia. De esta manera, la timocina beta 4 puede ser oxidada mediante peróxido de hidrógeno diluido para formar sulfóxido de timocina beta 4 como se describe en la publicación WO 99/49883.

La oxidación del aminoácido, metionina (C5HnN?2S), a sulfóxido de metionina (C5H1 1NO3S), o de otra manera, también puede representar una vía de degradación mayor de las beta timocinas que contienen metionina tal como Tß4, tanto in vivo como in vitro. Se han identificado muchas beta timocinas e isoformas y tienen aproximadamente 70%, o aproximadamente 75%, o aproximadamente 80% o más homología con la secuencia de aminoácidos conocida de la Tß4. Tales beta timocinas e isoformas incluyen, por ejemplo, Tß4ala, Tß9, TßlO, Tßl 1, Tß412, Tßl3, Tßl4 y Tßl5. Las beta timocinas de ejemplo que contienen metionina en la posición 6 incluyen Tß4, Tß4ala, Tß4xep, Tß9met, TßlO y Tßl 3. La invención es aplicable a beta timocinas conocidas, isoformas y fragmentos de éstas, tales como aquellos de la lista anterior, así como también beta timocinas que normalmente contienen metionina e isoformas de Tß4, así como también fragmentos de éstas, que todavía no se han identificado. Adicionalmente, la descripción es aplicable a beta timocinas, isoformas y fragmentos de éstas, que se conocen o que todavía no se identifican, las cuales normalmente tienen una o más metioninas en una ubicación en el péptido distinto de la posición 6. En ciertas modalidades, un aminoácido sustituido por metionina es neutro, no polar, hidrofóbico y/o de no oxidación. Tales composiciones tienen ventajas en mayor estabilidad que las beta timocinas que contienen metionina, mientras que poseen actividad sustancialmente igual que, o diferente de la correspondiente beta timocina. En ciertas modalidades, un aminoácido que está siendo sustituido por metionina inhibe la oxidación de la beta timocina, y más preferiblemente, la actividad biológica de la beta timocina sustituida es sustancialmente la misma que aquella de la correspondiente beta timocina que contiene metionina. El reemplazo de metionina en un péptido de beta timocina que contiene metionina parece resultar en un cambio en el perfil de estabilidad del péptido. Adicionalmente, dicho reemplazo parece resultar en nuevas propiedades impredecibles del péptido, así como propiedades sin cambio impredecibles.

Como ejemplos no limitantes, un aminoácido que va a ser sustituido por metionina en la beta timocina que contiene metionina es valina, isoleucina, alanina, fenilalanina, prolina o leucina. En una modalidad, la leucina es sustituida por metionina en Tß4. De acuerdo con una modalidad, cuando la leucina es sustituida por metionina, el péptido de beta timocina es diferente de la Tß4. De acuerdo con un aspecto, el aminoácido que va a ser sustituido por metionina en la beta timocina que contiene metionina es diferente de la leucina. En algunas modalidades de este aspecto, el aminoácido que va a ser sustituido por metionina en la beta timocina que contiene metionina es valina, isoleucina, alanita, fenilalanina o prolina. De acuerdo con una modalidad, el aminoácido preferido que va a ser sustituido por metionina es valina o isoleucina. De acuerdo con otra modalidad, el aminoácido preferido que va a ser sustituido por metionina es alanina. De acuerdo con todavía una modalidad adicional, el aminoácido preferido que va a ser sustituido por metionina es valina. De acuerdo con la presente invención pueden proveerse péptidos de beta timocina modificada de aminoácido sustituido, isoformas y fragmentos de ésta mediante cualquier método adecuado, tal como mediante síntesis de péptido de fase sólida, un ejemplo de la cual se describe en la patente de los Estados Unidos de América No. 5,512,656. La descripción también es aplicable a métodos para la formación de péptidos de beta timocinas modificadas de aminoácido sustituido, en donde la secuencia de aminoácidos de un péptido de beta timocina que contiene metionina, isoforma o fragmento de ésta es modificado sustituyendo un aminoácido diferente de la metionina por cuando menos una metionina en el péptido de beta timocina, isoforma o fragmento de ésta. El método involucra la sustitución de un aminoácido distinto de la metionina por cuando menos una metionina en una secuencia de péptido de beta timocina que contiene metionina, isoforma o fragmento de ésta a fin de formar un péptido de beta timocina modificado, isoforma o fragmento de éste. Como se apuntó anteriormente, la Timocina beta 4 puede tener un sustituyente de leucina sustituido por metionina en la posición 6 de ésta, a fin de comprender Tß4leu.

El aminoácido leucina que está siendo sustituido por metionina, inhibe la oxidación de la Tß4. La Tß4leu tiene las ventajas de mayor estabilidad que la Tß4, en tanto que sorprendentemente posee actividad importante de unión de actina. El reemplazo de metionina con leucina en la Tß4 también puede resultar en nuevas e inesperadas propiedades del péptido. Se describen métodos para la formación de Tß4 eu, en donde la secuencia de aminoácidos de la Tß4 es modificada sustituyendo un aminoácido leucina por la metionina en la Tß4 en la posición 6. Este método involucra la sustitución de leucina por metionina en la secuencia de la Tß4 en la posición 6, a fin de formar Tß4leu. Los péptidos de acuerdo con la presente invención pueden poseer actividad sustancialmente de unión a actina. Las composiciones pueden ser utilizadas, entre otras cosas, como agentes antiinflamatorios. De acuerdo con una modalidad, se provee un péptido de beta timocina que contiene metionina oxidada, isoforma o fragmento de ésta, diferente del sulfóxido de timocina ß4.

También se aplica a métodos para la formación de sulfóxidos de beta timocina modificada que comprenden el poner en contacto un péptido de beta timocina que normalmente contiene metionina, isoforma o fragmento de ésta con un agente de oxidación tal como peróxido de hidrógeno diluido, para formar un péptido de sulfóxido de beta timocina. Otra modalidad consiste en un método para formar un péptido de sulfóxido de beta timocina el cual comprende el poner en contacto un péptido de beta timocina que normalmente contiene metionina, isoforma o fragmento de ésta, diferente de la timocina beta 4, con un agente de oxidación tal como peróxido de hidrógeno para formar un correspondiente péptido de sulfóxido de beta timocina. Las composiciones que aquí se incluyen tienen ventajas en una mayor estabilidad que las beta timocinas que contienen metionina no oxidada, en tanto que poseen actividad sustancialmente igual, o diferente de la correspondiente beta timocina. La oxidación de un péptido de beta timocina que contiene metionina a un sulfóxido resulta en un cambio en el perfil de estabilidad del péptido. Adicionalmente, dicho reemplazo puede resultar en ciertas nuevas propiedades del péptido, así como también en ciertas propiedades que permanecen sin cambio. La súper oxidación de la metionina en un péptido de beta timocina que normalmente contiene metionina resulta en un cambio en el perfil de estabilidad del péptido. Adicionalmente, dicho reemplazo puede resultar en ciertas nuevas propiedades del péptido, así como también en ciertas propiedades que permanecen sin cambio. De acuerdo con una modalidad, el péptido de beta timocina que va a ser súper oxidado es diferente de la Tß4. Los péptidos de beta timocina que contienen metionina, incluyendo sulfóxidos de beta timocina, pueden ser súper oxidados por ácido perfórmico o peracético para formar un correspondiente péptido de sulfona de beta timocina, en el cual el átomo de azufre de la metionina afectada es totalmente oxidado (súper oxidado) con dos oxígenos. De acuerdo con una modalidad, se provee una composición que comprende una sulfona de beta timocina que contiene metionina modificada distinta de la sulfona de Tß4. Se incluyen métodos para formar una sulfona de beta timocina los cuales comprenden el poner en contacto un péptido de beta timocina que contiene metionina, sulfóxido, isoforma o fragmento de ésta con un ácido tal como el ácido perfórmico y/o peracético para formar un correspondiente péptido de sulfona de beta timocina. De acuerdo con otra modalidad, se incluye un métodos para formar un péptido de sulfona de beta timocina el cual comprende el poner en contacto un péptido de beta timocina que contiene metionina, sulfóxido, isoforma o fragmento de ésta, distinta a la timocina beta 4 o sulfóxido de timocina beta 4, con un ácido tal como el ácido perfórmico y/o peracético para formar un correspondiente péptido de sulfona de beta timocina. En otra modalidad, la timocina beta 4 y/o sulfóxido de timocina beta 4 se oxida mediante ácido perfórmico o ácido peracético para formar sulfona de timocina beta 4, en donde el átomo de azufre de la metionina en la posición 6 de la timocina beta 4 está totalmente oxidado (súper oxidado) con dos átomos de oxigeno. La sulfona de timocina beta 4 puede ser utilizada, entre otras cosas, como un agente anti-inflamatorio. Debido a que el tioéter en el residuo metionilo de la Tß4 es proquiral, la oxidación (o súper oxidación) con un agente no-quiral genera dos formas de un sulfóxido (o sulfona) a saber formas S- y R- ("enantiómeros"). Puesto que cada biomolécula que es una socia potencial de la timocina beta 4 oxidada es quiral, los complejos formados con la forma S- o la forma R- del sulfóxido (o sulfona) son diferentes (diastereómeros). Las formas del sulfóxido de timocina beta 4 (o sulfona) pueden mostrar diferente comportamiento farmacodinámico y farmacocinético así como también actividades biológicas. De esta manera, las formas S- y R- del sulfóxido (o sulfona) de timocina beta 4 pueden tener diferentes efectos biológicos. Se puede utilizar un sistema de análisis de aminoácido para discriminar entre (S)- y (R)-sulfóxidos (o sulfonas) de L-metionina después de la hidrólisis del sulfóxido (o sulfona) de timocina beta 4 oxidada. Por ejemplo, pueden utilizarse dos procedimientos para aislar las dos formas del sulfóxido (o sulfona) de la timocina beta 4 después de la oxidación o súper oxidación. Aunque las diferentes formas de los sulfóxidos (o sulfonas) de metionina se comportan como espejo e imagen de espejo, los sulfóxidos (o sulfonas) de timocina beta 4 generados constituyen no un par de imagen e imagen de espejo debido a que los otros residuos de aminoácido del péptido generan un ambiente asimétrico. De esta manera, las formas separadas son susceptibles de separación mediante técnicas de HPLC. Un procedimiento alternativo para separar las formas puede ser el uso de reductasas de sulfóxido (o sulfona) de metionina específicas que reducen una forma del sulfóxido (o sulfona) de timocina beta 4 pero no la otra. La separación de la forma no reducible del sulfóxido (o sulfona) de timocina beta 4 a partir de la forma reducida enzimática puede ser hecha mediante HPLC. Aquí se describe un método para la formación de una composición que contiene sulfóxido (o sulfona) de R-timocina beta 4, mediante la separación de sulfóxido (o sulfona) de de R-timocina beta 4 a partir de una mezcla que contiene sulfóxido (o sulfona) de R-timocina beta 4 y sulfóxido (o sulfona) de S-timocina beta 4. Aquí se describe un método para la formación de una composición que contiene sulfóxido (o sulfona) de S-timocina beta 4 separado, mediante la separación de sulfóxido (o sulfona) de S-timocina beta 4 a partir de una mezcla que contiene sulfóxido (o sulfona) de S-timocina beta 4 y sulfóxido (o sulfona) de R-timocina beta 4. Como se señaló anteriormente, se han identificado muchas beta timocinas e isoformas de éstas y tienen aproximadamente 70%, o aproximadamente 75%, o aproximadamente 80% o más homología con la secuencia de aminoácidos conocida de la Tß4. Tales beta timocinas e isoformas incluyen, por ejemplo, Tß4a a, Tß9, TßlO, Tßl 1, Tß412, Tßl3, Tßl4 y Tßl5. Como se señaló anteriormente, las beta timocinas de ejemplo que contienen metionina en la posición 6 incluyen Tß4, Tß4ala, Tß4xen, Tß9met, Tß 10 y Tß 13. Como se apuntó anteriormente, aquí se incluyen beta timocinas conocidas e isoformas, tales como aquellas de la lista anterior, así como también beta timocinas que contienen timocina, isoformas y fragmentos de éstas, que todavía no se han identificado. Como se indicó anteriormente, además se incluyen aquí beta timocinas, isoformas y fragmentos de éstas, que se conocen o que todavía no se identifican, las cuales tienen una o más metioninas en una ubicación en el péptido distinto de la posición 6. Como con la Tß4, debido a que el tioéter en el(los) residuo(s) metionilo de las beta timocinas que contienen metionina es proquiral, la oxidación (o súper oxidación) con un agente no-quiral genera cuando menos dos formas de sulfóxido (o sulfona), incluyendo una forma S- y una forma R- ("enantiómeros"). Puesto que cada biomolécula que es socia potencial de las beta timocinas que contienen metionina oxidada es quiral, los complejos formados con la forma S- o la forma R- del sulfóxido (o sulfona) son diferentes (diastereómeros). Las diferentes formas del sulfóxido (o sulfona) de la beta timocina muestran diferentes comportamientos farmacodinámico y farmacocinético así como también actividad biológica. De esta manera, las formas S- y R- del sulfóxido (o sulfona) de beta timocina pueden tener diferentes efectos biológicos. Como con la Tß4, se puede utilizar un sistema de análisis de aminoácido para discriminar entre (S)- y (R)-sulfóxido (o sulfona) de L-metionina después de la hidrólisis de un sulfóxido (o sulfona) de beta timocina oxidada. Por ejemplo, pueden utilizarse cuando menos dos procedimientos para aislar las diferentes formas de un sulfóxido (o sulfona) de beta timocina después de la oxidación (o súper oxidación). Aunque las diferentes formas de los sulfóxidos (o sulfonas) de metionina se comportan como espejo e imagen de espejo, los sulfóxidos (o sulfonas) de beta timocina generados constituyen no un par de imagen e imagen de espejo, debido a que los otros residuos de aminoácido del (los) péptidos generan un ambiente asimétrico. De esta manera, las diferentes formas son susceptibles de separación mediante técnicas de HPLC conocidas. Un procedimiento alternativo para separar las diferentes formas puede ser el uso de reductasas de sulfóxido (o sulfona) de metionina específicas que reducen una forma del sulfóxido (o sulfona) de beta timocina pero no la otra. La separación de la forma no reducible de un sulfóxido (o sulfona) de beta timocina a partir de la forma reducida enzimática puede ser hecha mediante HPLC. Aquí se describe un método para la formación de una composición que contiene un sulfóxido (o sulfona) de R-beta timocina separado, mediante la separación de un sulfóxido (o sulfona) de R-beta timocina a partir de una mezcla que contiene un sulfóxido (o sulfona) de R-beta timocina y sulfóxido (o sulfona) de S-beta timocina. Además se describe un método para la formación de una composición que contiene un sulfóxido (o sulfona) de S-beta timocina separado, mediante la separación de un sulfóxido (o sulfona) de S-beta timocina a partir de una mezcla que contiene un sulfóxido (o sulfona) de S-beta timocina y un sulfóxido (o sulfona) de R-beta timocina. En una modalidad, la descripción provee un método de tratamiento para tratar, prevenir, inhibir o reducir la enfermedad, daño, lesión y/o herida de un sujeto, o de un tejido en un sujeto, mediante la administración de una cantidad efectiva de una composición la cual contiene un péptido como se describe aquí mismo. La administración puede ser directa o de manera sistémica. Los ejemplos de la administración directa incluyen, por ejemplo, el contacto con el tejido, mediante aplicación directa o inhalación, con un portador que comprende una solución, loción, pomada, gel, crema, pasta, rocío, suspensión, dispersión, hidrogel, ungüento, o aceite que incluye un péptido como se describe aquí mismo. La administración sistémica incluye, por ejemplo, inyecciones intravenosa, intraperitoneal, intramuscular de una composición que contiene un péptido como se describe aquí mismo, en un portador farmacéuticamente aceptable tal como agua para inyección. El sujeto preferiblemente es un mamífero, más preferiblemente es un ser humano. Las composiciones, como se describe aquí mismo, pueden ser administradas en cualquier cantidad efectiva adecuada. Por ejemplo, una composición como se describe aquí mismo puede ser administrada en dosis dentro del intervalo de aproximadamente 0.0001 a 1,000,000 microgramos, más preferiblemente en cantidades dentro del intervalo de aproximadamente OJ a 5,000 microgramos, más preferiblemente dentro del intervalo de aproximadamente 1 a 30 microgramos. Una composición como la que se describe aquí puede ser administrada diariamente, cada tercer día, cada tercer semana, cada tercer mes, etc., con una sola aplicación o con múltiples aplicaciones por día de administración, tal como aplicaciones 2, 3, 4 o más veces por día de administración. La descripción también incluye una composición farmacéutica o cosmética que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición como se describe aquí mismo en un portador farmacéuticamente aceptable o cosméticamente aceptable. Dichos portadores pueden incluir cualquier portador adecuado, incluyendo aquellos que se han proporcionado en una lista aquí mismo. Los planteamientos descritos aquí involucran varias rutas de administración o de repartición de una composición como se describe en la presente, incluyendo cualesquiera técnicas de administración convencionales (por ejemplo, pero no limitadas a, administración directa, inyección local, inhalación o administración sistémica), a un sujeto. Los métodos y composiciones que utilizan o contienen una composición como las que se han descrito aquí pueden ser formulados en composiciones farmacéuticas o cosméticas mediante la mezcla con excipientes, aditivos o portadores farmacéuticamente aceptables o cosméticamente aceptables que no sean tóxicos.

Ejemplo 1 Se produjo Tß4val con valina sustituida por metionina en la posición 6, mediante síntesis convencional de péptido de fase sólida, por ejemplo, de acuerdo con el método descrito en la patente de los Estados Unidos de América No. 5,512,656, resultando en un péptido que tenía propiedades inesperadas e impredecibles. Ejemplo 2 Se produjo Tß4'so con isoleucina sustituida por metionina en la posición 6, mediante síntesis convencional de péptido de fase sólida, resultando en un péptido que tenía propiedades inesperadas e impredecibles. Ejemplo 3 Se produjo Tß4 M6A con alanina sustituida por metionina en la posición 6, mediante síntesis convencional de péptido de fase sólida, por ejemplo, de acuerdo con el método descrito en la patente de los Estados Unidos de América No. 5,512,656, resultando en un péptido que tenía propiedades inesperadas e impredecibles. Ejemplo 4 Se produjo Tß4phe con fenilalanina sustituida por metionina en la posición 6, mediante síntesis convencional de péptido de fase sólida, por ejemplo, de acuerdo con el método descrito en la patente de los Estados Unidos de América No. 5,512,656, resultando en un péptido que tenía propiedades inesperadas e impredecibles. Ejemplo 5 Se produjo Tß4pro con prolina sustituida por metionina en la posición 6, mediante síntesis convencional de péptido de fase sólida, por ejemplo, de acuerdo con el método descrito en la patente de los Estados Unidos de América No. 5,512,656, resultando en un péptido que tenía propiedades inesperadas e impredecibles. Ejemplo 6 Se produjo Tß4leu con leucina sustituida por metionina en la posición 6, mediante síntesis convencional de péptido de fase sólida, por ejemplo, de acuerdo con el método descrito en la patente de los Estados Unidos de América No. 5,512,656, resultando en un péptido que tenía propiedades inesperadas e impredecibles. Ejemplo 7 Se produjo Tß4leu mediante síntesis convencional de péptido de fase sólida como se describió aquí mismo. Se llevaron a cabo pruebas para determinar la afinidad de unión de G-actina de la Tß4 eu en comparación con la Tß4 natural. Los experimentos fueron repetidos dos veces por triplicado, con los resultados que se muestran más adelante (promedio de 3 experimentos): Primera Determinación: Tß4 Kd = 1.28 microM; Tß4leu Kd = 1.36 microM Segunda Determinación: Tß4 Kd = 0.54 microM; Tß4leu Kd = 0.99 microM Los valores más bajos en el caso de la Tß4 son causados por su sulfóxido. Se determinó mediante análisis de aminoácido la Tß4 más sulfóxido de Tß4.

Aproximadamente 10% en la preparación era sulfóxido que se une solo débilmente a G-actina. De esta manera la concentración real de Tß4 en la prueba es más baja y el aumento de Tß4 libre es más alto cuando se compara con Tß4 no oxidada. Se midió la disminución de beta timocina libre. La Tß4 unida a G-actina y la Tß4 libre se separaron mediante ultra filtración y se midió la concentración de la Tß4 en el ultra filtrado mediante HPLC. El procedimiento utilizado se describe en Huff et al., FEPS Letters, 414:39-44 (1997). Los datos anteriores indican de manera sorpresiva que la sustitución de aminoácido por metionina en un péptido de beta timocina no afecta de manera sustancialmente adversa las capacidades de unión de G-actina del péptido de beta timocina. Ejemplo 8 Se produjo sulfona de Tß4 mediante oxidación completa del residuo Met de la Tß4 mediante tratamiento de la Tß4 con H2O2 concentrado (30%). La naturaleza química de la sulfona de Tß4 se ha establecido. Las técnicas utilizadas fueron HPLC, MALDI-TOF MS y análisis de aminoácido. El análisis MALDI-TOF mostró un aumento de la masa molecular del péptido de 32 Da que corresponde con la incorporación de O2 dentro del péptido. La sulfona de Tß4 ha sido caracterizada en términos de la unión de G-actina. Forma un complejo con la G-actina y el valor de Kd del complejo es de aproximadamente 10 uM. Por lo tanto el complejo es menos estable en comparación con el complejo de Tß4 (1 uM) pero sorpresivamente más estable que el complejo con sulfóxido de Tß4 (20 uM). Ejemplo 9 Se convirtieron beta timocinas que incluían a Tß4ala, Tß4xen, Tß9met, TßlO y Tß 13 a sulfóxidos mediante su puesta en contacto con peróxido de hidrógeno diluido como se describe aquí para formar los correspondientes sulfóxidos de beta timocina. Ejemplo 10 Se convirtieron beta timocinas que incluían a Tß4ala, Tß4xen, Tß9met, TßlO y Tßl 3 a péptidos de sulfona de beta timocina mediante su puesta en contacto con ácido perfórmico y/o ácido paracético como se describe aquí para formar los correspondientes péptidos de sulfona de beta timocina. Ejemplo 11 Sulfóxido de Tß4, que es una mezcla uno a uno de las formas S- y R-, ha sido reducido mediante reductasas específicas de sulfóxido de metionina (MSR-A y MSR-B). Mediante este procedimiento se redujeron ya sea la forma S o la forma R en tanto que la otra forma permanecía como sulfóxido. El procedimiento proveyó dos muestras: una muestra conteniendo una mezcla de Tß4 y sulfóxido de R-Tß4 y la otra muestra conteniendo una mezcla de Tß4 y sulfóxido de S-Tß4. Las dos muestras fueron separadas mediante HPLC y se aislaron sulfóxido de S-Tß4 puro y sulfóxido de R-Tß4 puro. Se determinaron las constantes de disociación de sus complejos con G-actina. Sorpresivamente, las constantes de disociación de sus complejos fueron idénticas. Las estabilidades de los complejos de G-actina ya sea con sulfóxido de (R S)-Tß4 o sulfóxido de R-Tß4 o sulfóxido de S-Tß4 eran idénticas (Kd~20 uM). La Kd del sulfóxido de actina-Tß4 es de aproximadamente 1 uM. Es posible que el sulfóxido de R-Tß4 sea convertido a sulfóxido de S-Tß4 (y el sulfóxido de S-Tß4 sea convertido a sulfóxido de R-Tß4) mediante la unión a G-actina. Esta racemización aboliría las diferencias en los valores de Kd. Ejemplo 12 La sulfona de Tß4 producida de acuerdo con el Ejemplo 8, así como también sulfóxidos de beta timocina producidos de acuerdo con el Ejemplo 9 y sulfonas de beta timocina producidas de acuerdo con el Ejemplo 10 se separaron para formar respectivos enantiómeros S- y enantiómeros R de éstos.

Claims

Reivindicaciones 1. Una composición que comprende un péptido de beta timocina que normalmente contiene metionina oxidada o súper oxidada, isoforma, fragmento de ésta, enantiómero R aislado de ésta o enantiómero S aislado de ésta, diferente del sulfóxido de timocina beta 4 racémica, o que comprende un péptido de beta timocina modificado, isoforma o fragmento de ésta que tiene un aminoácido que no es metionina sustituido por cuando menos una metionina de una secuencia de aminoácidos de un péptido de beta timocina que contiene metionina que normalmente contiene metionina, isoforma o fragmento de ésta.
2. La composición de la reivindicación 1, en donde dicho péptido de beta timocina que normalmente contiene metionina es Tß4, Tß4ala, Tß4xep, Tß9met, TßlO o Tßl3.
3. La composición de la reivindicación 1, en donde dicho aminoácido sustituido es leucina, valina, isoleucina, alanina, fenilalanina o prolina.
4. La composición de la reivindicación 1, en donde dicho péptido de beta timocina que normalmente contiene metionina es Tß4.
5. La composición de la reivindicación 1, en donde dicho aminoácido sustituido es leucina, valina, isoleucina, alanina, fenilalanina o prolina.
6. La composición de la reivindicación 1, en donde dicho sustituyente de aminoácido en cuando menos una de neutro, no polar, hidrofóbico o de no oxidación.
7. La composición de la reivindicación 1, en donde dicho sustituyente de aminoácido inhibe la oxidación de dicho péptido.
8. La composición de la reivindicación 1, la cual comprende un péptido de beta timocina modificado, isoforma o fragmento de ésta que tiene un sustituyente de aminoácido que no es metionina distinto de leucina sustituido por cuando menos una metionina de una secuencia de aminoácidos de un péptido de beta timocina que contiene metionina distinto de Tß4, o una isoforma o fragmento de un péptido de beta timocina que normalmente contiene metionina.
9. La composición que comprende Tß4leu, la cual comprende una secuencia de aminoácidos de Tß4 modificada que tiene leucina sustituida por metionina en la posición 6 de ésta.
10. La composición de la reivindicación 1, en donde el péptido de beta timocina que contiene metionina modificada, isoforma o fragmento de ésta es un sulfóxido.
11. La composición de la reivindicación 1, en donde el péptido de beta timocina que contiene metionina modificada, isoforma o fragmento de ésta es una sulfona.
12. La composición de la reivindicación 1, la cual comprende sulfona de timocina beta 4.
13. La composición de la reivindicación 1, la cual comprende sulfona de Tß4ala, sulfona de Tß4xen, sulfona de Tß9met, sulfona de TßlO o sulfona de Tßl 3.
14. La composición de la reivindicación 1, la cual comprende un enantiómero R aislado.
15. La composición de la reivindicación 1, la cual comprende un enantiómero S aislado.
16. La composición de la reivindicación 1, la cual comprende un enantiómero R aislado de sulfóxido de timocina beta 4.
17. La composición de la reivindicación 1, la cual comprende un enantiómero S aislado de sulfóxido de timocina beta 4.
18. Un método para la formación de un péptido de sulfona de beta timocina de acuerdo con la reivindicación 1 , el cual comprende el poner en contacto un péptido de beta timocina que normalmente contiene metionina con un ácido, a fin de formar un péptido de sulfona de beta timocina.
19. El método de la reivindicación 18, en donde dicho ácido comprende cuando menos una de ácido perfórmico o ácido peracético.
20. Un método para la formación de una composición de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende un sulfóxido o sulfona de R-beta timocina aislado, dicho método comprendiendo la separación de un sulfóxido o sulfona de R-beta timocina de una mezcla de correspondientes sulfóxido o sulfona de R-beta timocina y sulfóxido o sulfona de S-beta timocina.
21. Un método para la formación de una composición de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende un sulfóxido o sulfona de S-beta timocina aislado, dicho método comprendiendo la separación de un sulfóxido o sulfona de S-beta timocina de una mezcla de correspondientes sulfóxido o sulfona de S-beta timocina y sulfóxido o sulfona de R-beta timocina.
22. Un método para la formación de un péptido de beta timocina modificado, isoforma o fragmento de éste como se definió en la reivindicación 1 , el cual comprende la sustitución de un aminoácido sustituyente que no es metionina por cuando menos una metionina de una secuencia de aminoácidos de un péptido de beta timocina que normalmente contiene metionina, isoforma o fragmento de éste, a fin de formar un péptido de beta timocina modificado, isoforma o fragmento de éste.
23. El método de la reivindicación 22, en donde dicho aminoácido sustituyente es leucina, valina, isoleucina, alanina, fenilalanina o prolina.
24. Un método para la formación de péptido Tß4leu, como se definió en la reivindicación 9, el cual comprende la sustitución del aminoácido leucina por metionina en la posición 6 a fin de forma péptido Tß4met.