KR20070119615A - 개질된 베타 티모신 펩티드 - Google Patents

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KR20070119615A
KR20070119615A KR1020077018512A KR20077018512A KR20070119615A KR 20070119615 A KR20070119615 A KR 20070119615A KR 1020077018512 A KR1020077018512 A KR 1020077018512A KR 20077018512 A KR20077018512 A KR 20077018512A KR 20070119615 A KR20070119615 A KR 20070119615A
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에발드 하나펠
토마스 후프
앨런 엘 골드스테인
데이비드 크록포드
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리지너크스 바이오 파마소티컬스, 인코포레이티드
우니베르지테트 에를랑겐-뉘른베르크
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Abstract

본 발명은 산화 또는 과다 산화된 개질된 정상적인 메티오닌-함유 베타 티모신 펩티드, 그의 이소 형태, 그의 단편, 라세미체 티모신 베타 4 설폭사이드 외에 그의 단리된 R-에난티오머 또는 그의 단리된 S-에난티오머를 포함하거나 또는 정상적 메티오닌-함유 베타 티모신 펩티드의 아미노산 서열의 적어도 하나의 메티오닌에 대해 치환된 아미노산 치환체, 그의 이소 형태 또는 단편을 갖는 개질된 베타 티모신 펩티드, 그의 이소 형태 또는 그의 단편을 포함하는 조성물 및 이를 형성하는 방법에 관한 것이다.

Description

개질된 베타 티모신 펩티드 {MODIFIED BETA THYMOSIN PEPTIDES}
본 출원은 2005년 1월 14일자로 출원된 미합중국 가특허 출원 제60/643,684호, 동 제60/643,686호, 동 제60/643,687호 및 동 제60/643,688호 모두의 우선권을 주장한다.
본 발명은 베타 티모신 펩티드류, 그의 이소 형태 및 단편들의 분야에 관한 것이다.
티모신 β4는 시험관 내 상피 세포 이동 및 분화 중에 상향-조절되는 단백질로서 초기에 식별되었다. 티모신 β4는 원래 흉선으로부터 단리되었고, 여러 조직들에서 식별된 4.9 kDa의 편재하는 폴리펩티드인 43 아미노산이다. 상피 세포 분화 및 이동, T 세포 분화, 액틴 격리 및 혈관화에서의 역할을 포함하여 이 단백질에 대한 여러 가지 역할들이 개시되어 있다.
Tβ4의 아미노산 서열은 미합중국 특허 제4,297,276호에 개시되어 있으며, 참고 문헌으로서 본원에 인용한다. Tβ4는 진화하는 중에 고도로 보존되었다. 사실상, 생쥐, 쥐 및 인체 Tβ4 사이에 전체적인 상동성이 존재한다.
Tβ4는 포유 동물들에서 수많은 조직 유형들에 존재하는 것으로 밝혀졌으며, 또한 골수 세포들의 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제를 유도하고, 시상 하부 의 황체 형성 호르몬 방출 호르몬 및 황체 형성 호르몬의 분비를 자극하고, 마크로파지의 이동 억제 및 항원 표시를 증진, 및 시험관 내 T-세포주들의 표현형 변화들을 유도하는 것을 포함하는 각종 세포 및 생리적 과정들에 관련되었다.
티모신 베타 4 설폭사이드는 PCT 국제 공개 제WO99/49883호에 개시되어 있다.
당업계에는 개선된 베타 티모신 펩티드류에 대한 수요가 남아있다.
하나의 구체예에 따라, 조성물은 산화 또는 과다 산화된 개질된 정상적인 메티오닌-함유 베타 티모신 펩티드, 그의 이소 형태, 그의 단편, 라세미체 티모신 베타 4 설폭사이드 외에 그의 단리된 R-에난티오머 또는 그의 단리된 S-에난티오머를 포함하거나 또는 이 조성물은 개질된 베타 티모신 펩티드, 그의 이소 형태 또는 그의 단편을 포함하고, 정상적 메티오닌-함유 베타 티모신 펩티드의 아미노산 서열의 적어도 하나의 메티오닌에 대해 치환된 비-메티오닌 아미노산 치환체, 그의 이소 형태 또는 단편을 갖는다. 또한, 본 발명에 따라 조성물을 형성하는 방법들이 개시되어 있다.
상세한 설명
많은 베타 티모신 펩티드들은 그들의 아미노산 서열 내에 생체 내 및 시험관 내 산화에 적용되는 아미노산 메티오닌을 포함한다. 그러한 베타 티모신 펩티드들은 때때로 본 명세서에서 "정상적 메티오닌-함유 베타 티모신 펩티드들"이라 언급된다. 많은 공지된 베타 티모신들에서, 메티오닌은 위치 6에 존재한다.
아미노산, 메티오닌(C5H11NO2S)의 메티오닌 설폭사이드(C5H11NO3S)로의 산화는 정상적 메티오닌-함유 베타 티모신들에서 베타 티모신 설폭사이드인 조성물들을 초래한다. 산화는 임의의 적절한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 메티오닌-함유 베타 티모신들의 설폭사이드들로의 산화는 메티오닌-함유 베타 티모신들을 과산화수소에 노출시킴으로써 수행될 수 있다. 50 vol의 과산화수소에 의한 티모신 베타 4의 산화는 WO99/4988호에 개시되어 있으며, 참조 문헌으로서 이에 인용한다. 따라서, 티모신 베타 4는 WO 99/49883에 개시된 바와 같이 티모신 베타 4를 형성하기 위해 묽은 과산화수소에 의해 산화될 수 있다.
아미노산, 메티오닌(C5H11NO2S)의 메티오닌 설폭사이드(C5H11NO3S)로의 산화는 또한 그렇지 않으면 생체 내 및 시험관 내 모두에서 Tβ4 등의 메티오닌-함유 베타 티모신들의 주요 분해 경로를 나타낼 수 있다.
많은 베타 티모신들 및 이소 형태들이 확인되었으며, Tβ4의 공지된 아미노산 서열과 약 70%, 또는 약 75% 또는 약 80% 이상의 상동성을 갖는다. 그러한 베타 티모신들 및 이소 형태들은 예를 들면 Tβ4ala, Tβ9, Tβ10, Tβ11, Tβ12, Tβ13, Tβ14 및 Tβ15를 포함한다.
위치 6에 메티오닌을 함유하는 전형적인 베타 티모신들은 Tβ4, Tβ4ala, Tβ4xen, Tβ4met, Tβ10 및 Tβ13을 포함한다.
본 발명은 공지된 베타 티모신들, 상기 나열된 것들과 같은 그의 이소 형태들 및 단편들 뿐만 아니라 아직 확인되지 않은 정상적 메티오닌-함유 베타 티모신들 및 Tβ4 이소 형태들에 적용될 수 있다.
추가로, 공지되어 있거나 또는 아직 식별되지 않고, 위치 6 외의 펩티드 내의 위치에 1개 이상의 메티오닌들을 정상적으로 갖는 베타 티모신들, 그의 이소 형태들 및 그의 단편들에 적용될 수 있는 것으로 개시되어 있다.
특정 구체 예들에서, 메티오닌에 대해 치환된 아미노산은 중성, 비-극성, 소수성 및(또는) 비-산화성이다. 그러한 조성물들은 메티오닌-함유 베타 티모신들보다 더 큰 안정성을 갖는 한편, 대응하는 베타 티모신과 실질적으로 동일하거나 또는 상이한 활성을 갖는 장점들을 갖는다.
특정 구체 예들에서, 메티오닌에 대해 치환된 아미노산은 베타 티모신의 산화를 억제하고, 가장 바람직하게는, 치환된 베타 티모신의 생물학적 활성은 대응하는 메티오닌-함유 베타 티모신의 그것과 실질적으로 동일하다.
메티오닌-함유 베타 티모신 펩티드에서 메티오닌을 대체하는 것은 펩티드의 안정성 프로필의 변화를 초래하는 것으로 보인다. 추가로, 그러한 대체는 펩티드의 예측할 수 없는 새로운 특성들 뿐만 아니라 예측할 수 없는 변화되지 않은 특성들을 초래하는 것으로 보인다.
비제한적인 실시예들로서, 메티오닌-함유 베타 티모신 중의 메티오닌에 대해 치환되어야 하는 아미노산은 발린, 이소류신, 알라닌, 페닐알라닌, 프롤린 또는 류신이다.
일 실시예에서, 류신은 Tβ4 중의 메티오닌에 대해 치환된다.
일 실시예에 따라, 류신은 메티오닌에 대해 치환되고, 베타 티모신 펩티드는 Tβ4 이외의 것이다.
일 국면에 따라, 메티오닌-함유 베타 티모신 중의 메티오닌에 대해 치환되어야 하는 아미노산은 류신 이외의 것이다. 이러한 국면의 일부 구체예들에서, 메티오닌-함유 베타 티모신 중의 메티오닌에 대해 치환되어야 하는 아미노산은 발린, 이소류신, 페닐알라닌 또는 프롤린이다.
일 구체예에 따라, 메티오닌에 대해 치환되어야 하는 바람직한 아미노산은 발린 또는 이소류신이다.
다른 구체예에 따라, 메티오닌에 대해 치환되어야 하는 바람직한 아미노산은 알라닌이다.
또 다른 구체예에 따라, 메티오닌에 대해 치환되어야 하는 바람직한 아미노산은 발린이다.
본 발명에 따른 아미노산-치환된 개질된 베타 티모신 펩티드들, 그의 이소 형태들 및 그의 단편들은 임의의 적절한 방법에 의해, 예를 들면 고체상 펩티드 합성에 의해 제공될 수 있으며, 그의 일 실시예는 미합중국 특허 제5,512,656호에 개시되어 있다.
그 개시 내용은 또한 아미노산-치환된 개질된 베타 티모신 펩티드들의 형성 방법들에 적용될 수 있고, 여기서 메티오닌-함유 베타 티모신 펩티드, 그의 이소 형태 또는 단편의 아미노산 서열은 베타 티모신 펩티드, 그의 이소 형태 또는 단편 중의 적어도 하나의 메티오닌에 대해 비-메티오닌 아미노산으로 치환시킴으로써 개질된다. 이 방법은 개질된 베타 티모신 펩티드, 그의 이소 형태 또는 단편을 형성하도록 메티오닌-함유 베타 티모신 펩티드 서열, 그의 이소 형태 또는 단편 중의 적어도 하나의 메티오닌에 대해 비-메티오닌 아미노산으로 치환시키는 단계를 포함한다.
상기한 바와 같이, 티오닌 베타 4는 Tβ4leu를 포함하도록 그의 위치 6의 메티오닌에 대해 치환된 류신 치환체를 가질 수 있다.
메티오닌에 대해 치환된 아미노산 류신은 Tβ4의 산화를 억제한다. Tβ4leu는 Tβ4보다 큰 안정성을 갖는 한편, 놀랍게도 실질적인 액틴-결합 활성을 갖는 점에서 유리하다.
Tβ4에서 류신으로 메티오닌을 대체하는 것은 또한 펩티드의 예상치 못한 새로운 특성들을 초래할 수도 있다.
Tβ4leu의 형성 방법들이 개시되어 있고, 여기서 Tβ4의 아미노산 서열은 위치 6에서 Tβ4의 메티오닌에 대해 류신 아미노산으로 대체함으로써 개질된다. 이 방법은 Tβ4leu를 형성하도록 Tβ4 서열에서 메티오닌에 대해 류신을 치환시키는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 펩티드들은 실질적인 액틴-결합 활성을 소유할 수 있다.
이 조성물들은 다른 무엇보다도 항염증제로서 이용될 수 있다.
일 구체예에 따라, 산화된 메티오닌-함유 베타 티모신 펩티드, 그의 이소 형태 또는 단편이 티모신 베타 4 설폭사이드 이외에 제공된다.
개질된 베타 티모신 설폭사이드류를 형성하는 방법들에 적용될 수 있는 것은 베타 티모신 설폭사이드를 형성하기 위해 정상적 메티오닌-함유 베타 티모신 펩티드, 그의 이소 형태 또는 단편을 묽은 과산화수소 등의 산화제와 접촉시키는 단계를 포함한다는 것이다.
다른 구체예는 대응하는 베타 티모신 설폭사이드 펩티드를 형성하기 위해 티모신 베타 4 이외에 정상적 메티오닌-함유 베타 티모신 펩티드를 과산화수소와 같은 산화제와 접촉시키는 단계를 포함하는 베타 티모신 설폭사이드 펩티드의 형성 방법이다.
본원에 포함된 조성물들은 비-산화된 메티오닌-함유 베타 티모신들보다 큰 안정성을 갖지만, 대응하는 베타 티모신과 실질적으로 동일하거나 또는 상이한 활성을 소유하는 장점들을 갖는다.
메티오닌-함유 베타 티모신 펩티드의 설폭사이드로의 산화는 펩티드의 안정성 프로필의 변화를 초래한다. 추가로, 그러한 대체는 펩티드의 특정한 신규 특성들 뿐만 아니라 특정한 변화되지 않은 특성들을 초래할 수 있다.
정상적 메티오닌-함유 베타 티모신 펩티드의 과다 산화는 펩티드의 안정성 프로필의 변화를 초래한다. 추가로, 그러한 대체는 펩티드의 특정한 새로운 특성들 뿐만 아니라 특정한 변화되지 않은 특성들을 초래할 수 있다.
일 구체예에 따라, 과다 산화되어야 할 베타 티모신 펩티드는 Tβ4 이외의 것이다.
베타 티모신 설폭사이드들을 포함하여 메티오닌-함유 베타 티모신 펩티드들은 대응하는 베타 티모신 설폰 펩티드들을 형성하도록 퍼포름산 또는 퍼아세트산에 의해 과다 산화될 수 있고, 영향받지 않은 메티오닌의 황 원자는 2개의 산소에 의해 완전히 산화(과다 산화)된다.
일 구체예에 따라, Tβ4 술폰 이외에 개질된 메티오닌-함유 베타 티모신 설폰을 포함하는 조성물이 제공된다.
대응하는 베타 티모신 설폰 펩티드를 형성하기 위해 메티오닌-함유 베타 티모신 펩티드, 그의 설폭사이드, 이소 형태 또는 단편을 퍼포름산 및(또는) 퍼아세트산 등의 산과 접촉시키는 단계를 포함하는 베타 티모신 설폰의 형성 방법들이 포함된다.
다른 구체예에 따라, 대응하는 베타 티모신 설폰 펩티드를 형성하기 위해 티모신 베타 4 또는 티모신 베타 4 설폭사이드 외에 메티오닌-함유 베타 티모신 펩티드, 그의 설폭사이드, 이소 형태 또는 단편을 퍼포름산 및(또는) 퍼아세트산 등의 산과 접촉시키는 단계를 포함하는 베타 티모신 설폰 펩티드의 형성 방법이 포함된다.
또 다른 구체예에서, 티모신 베타 4 및(또는) 티모신 베타 4 설폭사이드는 티모신 베타 4 설폰을 형성하도록 퍼포름산 또는 퍼아세트산에 의해 산화되고, 여기서 티모신 베타 4의 위치 6에서 메티오닌의 황 원자는 2개의 산소들에 의해 완전히 산화(과다 산화)된다.
티모신 베타 4 설폰은 다른 무엇보다도 항염증제로서 이용될 수 있다.
Tβ4의 메티오닐 잔기에서 티오에테르는 선구 키랄성이고, 비-키랄제에 의한 산화(또는 과다 산화)는 설폭사이드(또는 설폰)의 2가지 형태, 즉 S- 및 R-형태들("에난티오머들")을 발생시킨다. 산화된 티모신 베타 4의 잠재적인 파트너인 모든 생체 분자는 키랄이기 때문에, 설폭사이드(또는 설폰)의 S- 또는 R-형태에 의해 형성된 착물들은 상이하다(부분 입체 이성질체들). 티모신 베타 4 설폭사이드(또는 설폰)의 형태들은 상이한 약력학 및 약물 동력학적 작용 뿐만 아니라 생물학적 활성들을 보일 수 있다. 따라서, 티모신 베타 4 설폭사이드(또는 설폰)의 S- 및 R-형태들은 상이한 생물학적 효과들을 가질 수 있다.
아미노산 분석 시스템은 산화된 티모신 베타 4 설폭사이드(또는 설폰)의 가수분해 후 L-메티오닌 (S)- 및 (R)-설폭사이드들(또는 설폰들) 사이에서 차별화되도록 사용될 수 있다. 예를 들면, 2가지 공정들이 산화 또는 과다 산화 후 티모신 베타 4 설폭사이드(또는 설폰)의 2가지 형태들을 단리 시키기 위해 사용될 수 있다. 메티오닌 설폭사이드들(또는 설폰들)의 상이한 형태들이 거울 및 거울상으로서 작용하더라도, 발생된 티모신 베타 4 설폭사이드들(또는 설폰들)은 펩티드의 다른 아미노산 잔기들이 비대칭 환경을 발생시키기 때문에 상 및 거울상의 쌍을 구성하지 않는다. 따라서, 분리물 형태들은 HPLC 기술들에 의해 분리될 수 있다. 이 형태들을 분리하기 위한 대안의 공정은 티모신 베타 4 설폭사이드(또는 설폰)의 하나의 형태를 환원시키지만 다른 형태를 환원시키지 않는 특이적 메티오닌 설폭사이드(또는 설폰) 환원 효소들의 사용일 수 있다. 티모신 베타 4 설폭사이드(또는 설폰)의 환원될 수 없는 형태의 분리는 HPLC에 의해 행해질 수 있다.
본원에 개시된 것은 R-티모신 베타 4 설폭사이드(또는 설폰) 및 S-티모신 베타 4 설폭사이드(또는 설폰)을 함유하는 혼합물로부터 R-티모신 베타 4 설폭사이드(또는 설폰)을 분리함으로써 분리된 R-티모신 베타 4 설폭사이드(또는 설폰)을 함유하는 조성물의 형성 방법이다.
본원에 개시된 것은 S-티모신 베타 4 설폭사이드(또는 설폰) 및 R-티모신 베타 4 설폭사이드(또는 설폰)을 함유하는 혼합물로부터 S-티모신 베타 4 설폭사이드(또는 설폰)을 분리함으로써 분리된 S-티모신 베타 4 설폭사이드(또는 설폰)을 함유하는 조성물의 형성 방법이다.
상기한 바와 같이, 많은 베타 티모신들 및 그의 이소 형태들은 확인되었으며, Tβ4의 공지된 아미노산 서열과 약 70%, 또는 약 75% 또는 약 80% 이상의 상동성을 갖는다. 그러한 베타 티모신들 및 이소 형태들은 예를 들면 Tβ4ala, Tβ9, Tβ10, Tβ11, Tβ12, Tβ13, Tβ14 및 Tβ15를 포함한다.
상기한 바와 같이, 위치 6에 메티오닌을 함유하는 전형적인 베타 티모신들은 Tβ4, Tβ4ala, Tβ4xen, Tβ4met, Tβ10 및 Tβ13을 포함한다.
상기한 바와 같이, 본원 명세서에는 공지된 베타 티모신들, 및 상기 나열된 것들과 같은 그의 이소 형태들 뿐만 아니라 아직 확인되지 않은 메티오닌-함유 베타 티모신들, 그의 이소 형태들 및 단편들이 포함된다.
상기한 바와 같이, 추가로 본원 명세서에는 공지되어 있거나 또는 아직 확인되지 않고, 위치 6 외의 펩티드 내의 위치에 1개 이상의 메티오닌들을 갖는 베타 티모신들, 그의 이소 형태들 및 그의 단편들이 포함된다.
Tβ4에 의해서와 같이, 메티오닌-함유 베타 티모신들의 메티오닐 잔기(들)에서 티오에테르는 선구 키랄성이기 때문에, 비-키랄제에 의한 산화(또는 과다 산화)는 S- 및 R-형태 ("에난티오머들")를 포함하여 설폭사이드(또는 설폰)의 적어도 2가지 형태들을 발생시킨다. 산화된 메티오닌-함유 베타 티모신들의 잠재적인 파트너인 모든 생체 분자는 키랄이기 때문에, 설폭사이드(또는 설폰)의 S- 또는 R-형태에 의해 형성된 착물들은 상이하다(부분 입체 이성질체들). 베타 티모신 설폭사이드(또는 설폰)의 상이한 형태들은 상이한 약력학 및 약물 동력학적 작용 뿐만 아니라 생물학적 활성들을 보인다. 따라서, 베타 티모신 설폭사이드(또는 설폰)의 S- 및 R-형태들은 상이한 생물학적 효과들을 가질 수 있다.
Tβ4에 의해서와 같이, 아미노산 분석 시스템은 산화된 베타 티모신 설폭사이드(또는 설폰)의 가수분해 후 L-메티오닌 (S)- 및 (R)-설폭사이드들(또는 설폰들) 사이에서 차별화되도록 사용될 수 있다. 예를 들면, 적어도 2가지 공정들이 산화 (또는 과다 산화) 후 베타 티모신 설폭사이드(또는 설폰)의 상이한 형태들을 단리시키기 위해 사용될 수 있다. 메티오닌 설폭사이드들(또는 설폰들)의 상이한 형태들이 거울 및 거울상으로서 작용하더라도, 발생된 베타 티모신 설폭사이드들(또는 설폰들)은 펩티드(들)의 다른 아미노산 잔기들이 비대칭 환경을 발생시키기 때문에 상 및 거울상의 쌍을 구성하지 않는다. 따라서, 상이한 형태들은 공지된 HPLC 기술들에 의해 분리될 수 있다. 상이한 형태들을 분리하기 위한 대안의 공정은 베타 티모신 설폭사이드(또는 설폰)의 하나의 형태를 환원시키지만 다른 형태를 환원시키지 않는 특이적 메티오닌 설폭사이드(또는 설폰) 환원 효소들의 사용일 수 있다. 효소적으로 환원된 형태로부터 베타 티모신 설폭사이드(또는 설폰)의 비-환원성 형태의 분리는 HPLC에 의해 행해질 수 있다.
본원에 개시된 것은 R-베타 티모신 설폭사이드(또는 설폰) 및 S-베타 티모신 설폭사이드(또는 설폰)을 함유하는 혼합물로부터 R-베타 티모신 설폭사이드(또는 설폰)을 분리함으로써 분리된 R-베타 티모신 설폭사이드(또는 설폰)을 함유하는 조성물의 형성 방법이다.
본원에 추가로 개시된 것은 S-베타 티모신 설폭사이드(또는 설폰) 및 R-베타 티모신 베타 4 설폭사이드(또는 설폰)을 함유하는 혼합물로부터 S-베타 티모신 설폭사이드(또는 설폰)을 분리함으로써 분리된 S-베타 티모신 설폭사이드(또는 설폰)을 함유하는 조성물의 형성 방법이다.
일 구체예에서, 본원 명세서는 본원에 개시된 바의 펩티드를 함유하는 조성물의 유효량을 투여함으로써 피검자 또는 피검자의 조직의 질병, 손상, 부상 및(또는) 상처를 치료하거나, 예방하거나, 억제하거나 또는 감소시키는 치료 방법을 제공한다. 그러한 투여는 직접적이거나 또는 전신으로 이루어질 수 있다. 직접 투여의 실례는 예를 들면 직접 도포 또는 흡입에 의해 조직을 본원에 개시된 바의 펩티드를 함유하는 용액, 로션, 고약, 겔, 크림, 페이스트, 분무제, 현탁액, 분산액, 하이드로겔, 연고, 또는 오일을 포함하는 담체와 접촉시키는 것을 포함한다. 전신 투여는 예를 들면 주사용 물 등의 제약학적으로 허용되는 담체 중에 본원에 개시된 바의 펩티드를 함유하는 조성물의 정맥내, 복강내, 근육내 주사를 포함한다. 피검자는 바람직하게는 포유 동물, 가장 바람직하게는 인간이다.
본원에 개시된 바의 조성물들은 임의의 적절한 효과량으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 본원에 개시된 조성물은 약 0.0001-1,000,000 마이크로그램의 범위의 복용량으로, 더욱 바람직하게는 약 0.1-5,000 마이크로그램 범위의 양으로, 가장 바람직하게는 약 1-30 마이크로그램 범위의 복용량으로 투여될 수 있다.
본원에 개시된 조성물은 매일, 격일로, 격주로, 격월 등으로 투여일 당 단일 도포 또는 다중 도포로, 예를 들면 투여 일당 2, 3, 4회 이상의 도포로 투여될 수 있다.
본 명세서는 또한 제약학적으로 또는 화장용으로 허용되는 담체 중에 본원에 개시된 바의 조성물의 치료 유효량을 포함하는 제약학적 또는 화장용 조성물을 포함한다. 그러한 담체들은 본원에 나열된 것들을 포함하여 임의의 적절한 담체를 포함한다.
본 명세서에 개시된 접근법들은 임의의 종래 투여 기술(예를 들면, 직접 투여, 국소 주사, 흡입 또는 전신 투여를 포함하지만, 이들로만 제한되지 않음)을 포함하여 본원에 개시된 바의 조성물을 피검자에게 투여하거나 또는 전달하는 여러 경로들을 포함한다. 본원에 개시된 바의 조성을 사용하거나 또는 함유하는 조성물 및 그 방법은 제약학상 허용되거나 또는 화장용의 비-독성 부형제들, 부가제들 또는 담체들과의 혼합물로 제약 또는 화장용 조성물들 내로 제형될 수 있다.
실시예 1
Tβ4val는 종래의 고체상 펩티드 합성에 의해, 예를 들면 미합중국 특허 제5,512,656호에 개시된 방법에 따라 위치 6에서 메티오닌에 대해 치환된 발린에 의해 생산되고, 예상되지 않고 예측할 수 없는 특성들을 갖는 펩티드를 초래한다.
실시예 2
Tβ4iso는 종래의 고체상 펩티드 합성에 의해 위치 6에서 메티오닌에 대해 치환된 이소류신에 의해 생산되고, 예상되지 않고 예측할 수 없는 특성들을 갖는 펩티드를 초래한다.
실시예 3
Tβ4 M6A는 종래의 고체상 펩티드 합성에 의해, 예를 들면 미합중국 특허 제5,512,656호에 개시된 방법에 따라 위치 6에서 메티오닌에 대해 치환된 알라닌에 의해 생산되고, 예상되지 않고 예측할 수 없는 특성들을 갖는 펩티드를 초래한다.
실시예 4
Tβ4phe는 종래의 고체상 펩티드 합성에 의해, 예를 들면 미합중국 특허 제5,512,656호에 개시된 방법에 따라 위치 6에서 메티오닌에 대해 치환된 페닐알라닌에 의해 생산되고, 예상되지 않고 예측할 수 없는 특성들을 갖는 펩티드를 초래한다.
실시예 5
Tβ4pro는 종래의 고체상 펩티드 합성에 의해, 예를 들면 미합중국 특허 제 5,512,656호에 개시된 방법에 따라 위치 6에서 메티오닌에 대해 치환된 프롤린에 의해 생산되고, 예상되지 않고 예측할 수 없는 특성들을 갖는 펩티드를 초래한다.
실시예 6
Tβ4leu는 종래의 고체상 펩티드 합성에 의해, 예를 들면 미합중국 특허 제5,512,656호에 개시된 방법에 따라 위치 6에서 메티오닌에 대해 치환된 류신에 의해 생산되고, 예상되지 않고 예측할 수 없는 특성들을 갖는 펩티드를 초래한다.
실시예 7
Tβ4leu는 본원에 개시된 바의 고체상 펩티드 합성에 의해 생산된다.
Tβ4에 비교한 바 Tβ4leu의 G-액틴 결합 친화도를 결정하기 위한 시험들이 수행되었다. 그 실험들은 2회 및 3회 반복되었고, 그 결과는 아래 나타낸다(3회 실험의 평균):
1차 결정: Tβ4 Kd = 1.28 마이크로M; Tβ4 leu Kd = 1.36 마이크로M
2차 결정: Tβ4 Kd = 0.54 마이크로M; Tβ4 leu Kd = 0.99 마이크로M
Tβ4의 경우에 더 낮은 값들은 그의 설폭사이드에 의해 유발된다. Tβ4 플러스 Tβ4-설폭사이드는 아미노산 분석에 의해 결정되었다. 제법에서 약 10%는 G-액틴에 약하게 결합된 설폭사이드였다. 따라서, 시험에서 Tβ4의 실제 농도는 더 낮았고, 유리 Tβ4의 감소는 비-산화된 Tβ4에 비교하였을 때 더 높았다. 유리 베타 티모신의 감소는 측정되었다. G-액틴 결합 Tβ4 및 유리 Tβ4는 한외 여과에 의 해 분리되었고, 한외 여과물 중의 Tβ4의 농도는 HPLC로 측정하였다. 이용된 공정은 Huff 등의 FEPS Letters, 414:39-44 (1997)에 개시되어 있다.
상기 데이터는 놀랍게도 베타 티모신 펩티드 등의 메티오닌에 대한 아미노산 치환이 베타 티모신 펩티드의 G-액틴 결합 능력에 실질적으로 부작용을 미치지 않음을 지시한다.
실시예 8
Tβ4 설폰은 Tβ4를 진한(30%) H2O2로 처리함으로써 Tβ4의 Met 잔류물의 완전 산화에 의해 생산되었다.
Tβ4 설폰의 화학적 특성이 확립되었다. 사용된 기술들은 HPLC, MALDI-TOF MS 및 아미노산 분석이었다. MALDI-TOF 분석은 펩티드 내로 O2의 혼입에 대응하는 32 Da의 펩티드의 분자량의 증가를 보였다.
Tβ4-설폰은 G-액틴의 결합이라는 용어로 특성화되었다. 그것은 G-액틴과의 착물을 형성하고, 그 착물의 Kd 값은 약 10 uM이다. 따라서, 그 착물은 Tβ4과의 착물에 비해 안정성이 적지만(1uM), 놀랍게도 Tβ4-설폭사이드(20uM)와의 착물보다 더 안정하다.
실시예 9
Tβ4ala, Tβ4xen, Tβ9met, Tβ10 및 Tβ13을 포함하는 베타 티모신들은 대응하는 베타 티모신 설폭사이드들을 형성하도록 본원에 개시된 바와 같이 묽은 과산화수소와 접촉함으로써 설폭사이드류로 전환된다.
실시예 10
Tβ4ala, Tβ4xen, Tβ9met, Tβ10 및 Tβ13을 포함하는 베타 티모신들은 대응하는 베타 티모신 설폰 펩티드들을 형성하도록 본원에 개시된 바와 같이 퍼포름산 및(또는) 퍼아세트산과 접촉함으로써 베타 티모신 설폰으로 전환된다.
실시예 11
S- 및 R-형태의 1대 1 혼합물인 Tβ4 설폭사이드는 특이적 메티오닌 설폭사이드 환원 효소들에 의해 환원되었다(MSR-A 및 MSR-B). 이러한 공정에 의해 S-형태 또는 R-형태는 다른 형태가 설폭사이드로서 머무르는 동안 감소되었다. 이 공정은 2가지 시료를 제공하였다: 하나의 시료는 Tβ4와 R-Tβ4 설폭사이드의 혼합물을 함유하고, 다른 시료는 Tβ4와 S-Tβ4 설폭사이드의 혼합물을 함유한다. 2개의 시료들은 HPLC에 의해 분리되었고, 순수한 S-Tβ4 설폭사이드 및 R-Tβ4 설폭사이드가 단리되었고, G-액틴과 이들의 착물들의 해리 상수들이 결정되었다. 놀랍게도, 이들의 착물들의 해리 상수들은 동일하였다. (R/S)-Tβ4 설폭사이드 또는 R-Tβ4 설폭사이드 또는 S-Tβ4 설폭사이드와 G-액틴의 착물들의 안정성은 동일하다 (Kd~20uM). 액틴-Tβ4 설폭사이드의 Kd는 약 1 uM이다. R-Tβ4 설폭사이드는 G-액틴에 결합함으로써 S-Tβ4 설폭사이드로 (및 S-Tβ4는 R-Tβ4로) 전환된다. 이러한 라세미체화는 Kd 값들의 차별성들을 폐지할 수 있다.
실시예 12
실시예 8에 따라 생산된 Tβ4-설폰 뿐만 아니라 실시예 9에 따라 생산된 베 타 티모신 설폭사이드들 및 실시예 10에 따라 생산된 베타 티모신 설폰들은 그들의 각각의 단리된 S-에난티오머들 및 R-에난티오머들을 형성하도록 분리된다.

Claims (24)

  1. 산화 또는 과다 산화된 개질된 정상적인 메티오닌-함유 베타 티모신 펩티드, 그의 이소 형태, 그의 단편, 라세미체 티모신 베타 4 설폭사이드 외에 그의 단리된 R-에난티오머 또는 그의 단리된 S-에난티오머를 포함하거나 또는 정상적 메티오닌-함유 베타 티모신 펩티드의 아미노산 서열의 적어도 하나의 메티오닌에 대해 치환된 비-메티오닌 아미노산 치환체, 그의 이소 형태 또는 단편을 갖는 개질된 베타 티모신 펩티드, 그의 이소 형태 또는 그의 단편을 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 정상적 메티오닌-함유 베타 티모신이 Tβ4, Tβ4ala, Tβ4xen, Tβ4met, Tβ10 및 Tβ13인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 치환체가 류신, 발린, 이소류신, 알라닌, 페닐알라닌 또는 프롤린인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 메티오닌-함유 베타 티모신 펩티드가 Tβ4인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 치환체가 류신, 발린, 이소류신, 알라닌, 페닐알라닌 또는 프롤린인 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 치환체가 중성, 비-극성, 소수성 또는 비-산화성 중의 적어도 하나인 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 치환체가 상기 펩티드의 산화를 억제하는 것인 조성물.
  8. 제1항에 있어서, Tβ4 이외에 메티오닌-함유 베타 티모신 펩티드의 아미노산 서열의 적어도 하나의 메티오닌에 대해 치환된 류신 외에 비-메티오닌 아미노산 치환체를 갖는 개질된 베타 티모신 펩티드, 그의 이소 형태 또는 단편 또는 정상적 메티오닌-함유 베타 티모신 펩티드의 이소 형태 또는 단편을 포함하는 조성물.
  9. 위치 6의 메티오닌에 대해 치환된 류신을 갖는 개질된 Tβ4 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 개질된 메티오닌-함유 베타 티모신 펩티드, 그의 이소 형태 또는 그의 단편이 설폭사이드인 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 개질된 메티오닌-함유 베타 티모신 펩티드, 그의 이소 형태 또는 단편이 설폰인 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 티모신 베타 4 설폰을 함유하는 조성물.
  13. 제1항에 있어서, Tβ4ala 설폰, Tβ4xen 설폰, Tβ4met 설폰, Tβ10 설폰 또는 Tβ13 설폰을 포함하는 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 단리된 R-에난티오머를 포함하는 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 단리된 S-에난티오머를 포함하는 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 티모신 베타 4 설폭사이드의 단리된 R-에난티오머를 포함하는 조성물.
  17. 제1항에 있어서, 티모신 베타 4 설폭사이드의 단리된 S-에난티오머를 포함하는 조성물.
  18. 베타 티모신 설폰 펩티드를 형성하도록 정상적 메티오닌-함유 베타 티모신 펩티드를 산과 접촉시키는 단계를 포함하는 제1항의 베타 티모신 설폰 펩티드의 형성 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 산은 퍼포름산 또는 퍼아세트산 중의 적어도 하나를 포함하는 것인 방법.
  20. 대응하는 R-베타 티모신 설폭사이드 또는 설폰 및 S-베타 티모신 설폭사이드 또는 설폰의 혼합물로부터 R-베타 티모신 설폭사이드 또는 설폰을 분리시키는 단계를 포함하는, 단리된 R-베타 티모신 설폭사이드 또는 설폰을 포함하는 제1항의 조성물의 형성 방법.
  21. 대응하는 S-베타 티모신 설폭사이드 또는 설폰 및 R-베타 티모신 설폭사이드 또는 설폰의 혼합물로부터 S-베타 티모신 설폭사이드 또는 설폰을 분리시키는 단계를 포함하는, 단리된 S-베타 티모신 설폭사이드 또는 설폰을 포함하는 제1항의 조성물의 형성 방법.
  22. 제1항에 있어서, 개질된 베타 티모신 펩티드, 그의 이소 형태 또는 그의 단편을 형성하도록 정상적 메티오닌-함유 베타 티모신 펩티드의 아미노산 서열의 적어도 하나의 메티오닌에 대해 비-메티오닌 아미노산 치환체로 치환시키는 단계를 포함하는 개질된 베타 티모신 펩티드의 형성 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 아미노산 치환체가 류신, 발린, 이소류신, 알라닌, 페닐알라닌 또는 프롤린인 방법.
  24. 펩티드 Tβ4leu를 형성하도록 Tβ4의 위치 6의 메티오닌에 대해 아미노산 류신으로 치환시키는 단계를 포함하는 제9항의 펩티드 Tβ4leu의 형성 방법.
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