MX2007006706A - Analogos de esfingosina 1-fosfato amida de arilo. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona compuestos que tienen actividad antagonista en los receptores S1P1 y/o S1P3. Estos compuestos tienen selectividad y potencia mejorada en los receptores S1P1 y/o S1P3.

Description

ANÁLOGOS DE ESFINGOSINA 1-FOSFATO AMIDA DE ARILO Solicitudes Relacionadas Esta solicitud reivindica la prioridad de una solicitud provisional titulada: "ANÁLOGOS DE 1 -FOSTATO ESFINGOSI NA AM I DA DE ARI LO META-SUSTITUI DO COMO ANTAGONISTAS DE RECEPTOR S 1 P", presentada el 6 de Diciembre de 2004, número de serie 60/633,587, los contenidos completos de la cual se incluye en la presente por referencia.

Patrocinio del Gobierno La invención descrita en la presente se hizo con ayuda del gobierno bajo los Números de Subvención GM06J958 y GM064101 , otorgada por los Institutos Nacionales de la Salud. El Gobierno de Estados Unidos tiene ciertos derechos en la invención.

Antecedentes de la Invención Esfingonsina 1 -fosfato (S 1 P) es un mediado de lisofosfolípido que evoca una variedad de respuestas celulares mediante la estimulación de cinco miembros de la familia del receptor de gen de diferenciación celular endotelial (EDG). Los receptores EDG son receptores acoplados por proteína G (GPCRs) y en estimulación propagan segundas señales mensajeras por medio de la activación de subunidades alfa de proteína G (Ga) heterotrimérica y dímeros beta-gamma (Gß?). Por último, esta señalización conducida por S 1 P da como resultado la supervivencia celular, migración de célula aumentada y, frecuentemente, mitogenesis. El desarrollo reciente de los receptores S1 P con objetivo de combatientes se ha proporcionado a la vista con respecto al papel de este sistema de señalización en homeostasis fisiológica. Por ejemplo, el inmunomodulador FTYJ20 (2-amino-2-[2-(4-octilfenil)etil]propano-1 ,3-diol), que siguiendo la fosforilación, es un combatiente de receptor S 1 P pan, reveló que el tono S 1 P influye en el tráfico de linfocitos (1 -4). La utilidad de un combatiente de receptor S 1 P fue inesperada -en realidad, antes de la especulación enfocada en el potencial (aún si n realizar) para los antagonistas S1 P como agentes antiangiogénicos. Recientes descubrimientos también sugieren una influencia fisiológica para S 1 P en la vasculatura. Mientras que todavía no se explora a detalle, se ha hipotetizado que S 1 P puede mediar las acciones anti-inflamatorias en las células endoteliales a través de su liberación de la lipoproteína de alta densidad (HDL) (5). Además, un antagonista de receptor S 1 P? descrito en la presente bloqueó la acción anti-inflamatoria de S 1 P, proporcionando de tal modo la evidencia de que este efecto mapea al receptor S 1 P? . Si se verifica, este resultado podría expandir el papel del receptor S 1 P? para incluir la extravasación de monoocitos influyente y además destaca cómo el desarrollo de los compuestos específicos de receptor S 1 P se encuentra expandiendo nuestro entendimiento de la biología de este importante sistema de señalización. Para caracterizar la biología asociada con los receptores S 1 P individuales además, hemos tomado un programa a desarrollar los análogos S 1 P con las metas dobles de expandir las relaciones de estructura-actividad (SAR) asociadas con las interacciones del receptor S1 P e identificar los compuestos específicos de receptor. Nuestros estudios han conducido a la identificación de una seria de análogos S 1 P que se comportan como antagonistas en dos de los cincos receptores S 1 P. Exista una gran necesidad sensible en la materia de análogos S1 P que puedan modular ia actividad de más de uno de los receptores S1 P. La presente invención satisface estas necesidades.

Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona compuestos que tienen actividad antagonista en los receptores S 1 P? y/o S 1 P3, y/o son resistentes a la hidrólisis (fosfatasas) en sistemas biológicos y/ tienen selectividad mejorada y potencia en los receptores S 1 P? y/o S 1 P3. De acuerdo con lo anterior se proporciona un éster o una sal del mismo, unida covalentemente a uno o dos compuestos de la fórmula (I): (i) en donde X y Y se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, OH, F, Cl, PO3 o metilo o X y Y tomados juntos con el átomo al cual se unen forman un grupo ceto; R1 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, halo, tri-fluorometilo, (C?-C6)-alquilo, alquilo (d-Ce) sustituido con halo, hidroxi-, alcoxi, o ciano; y R2 se selecciona del grupo que consiste de alquilo (d-Ce), alquilo sustituido por cicloalquilo, alquenilo (C2-C6), alquinilo (C2- Cß), arilo, arilo sustituido por alquilo, arilalquilo y arilaquilo sustituido por arilo; o un éster farmacéuticamente aceptable del mismo. La presente invención también proporciona esteres de cualquiera de los compuestos de la invención en donde la función de éster puede agregarse para formar pro-fármacos para aumentar la disponibilidad oral. La invención también proporciona los compuestos de la fórmula (I) para utilizarse en terapia médica. En otro aspecto, la presente invención también proporciona: una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la fórmula (I), o mezclas del mismo o sales farmacéuticamente aceptables, o esteres del mismo, y un excipiente farmacéuticamente aceptable (la composición preferentemente comprende una cantidad antagonista efectiva del compuesto o sal) ; un método para tratar enfermedades neoplásticas, comprendiendo administrar a un mamífero (por ejemplo, un humano) en necesidad de tal tratamiento, un compuesto de la fórmula (I ) o sales farmacéuticamente aceptables del mismo; un método para bloquear la angiogénesis (la formación de vasos sanguíneos) en un tumor que utiliza un compuesto de la invención para el tratamiento de las enfermedades neoplásticas; un método para la modulación del sistema i nmune al alterar el tráfico de linfocitos para el tratamiento de las enfermedades autoinmunes o la prolongación de la supervivencia del transplante de aloi njerto; un método para tratamiento de arritmias cardiacas; un método para inhibir la angiogénesis en un tumor, comprendiendo contactar (in vitro o in vivo) las células cancerígenas con una cantidad i nhibidora eficaz de un compuesto de l a fórmula I , o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. un compuesto de la fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para utilizarse en tratamiento médico (por ejemplo, el tratamiento de enfermedad neoplástica, prolongando la supervivencia del transplante de aloinjerto, para prevención de l a angiogénesis , alterar el tráfico de linfocitos, modular el sistema inmune, tratamiento de enfermedades autoinmunes, o el tratamiento de arritmias cardiacas); el uso de un compuesto de la fórmula I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para preparar un medicamento para inhibi r la angiogénesis en un tumor en un mamífero (por ejemplo, un humano). La invención también incluye un método para unir un compuesto de la fórmula I (por ejemplo, antagonistas de receptor S 1 P!/S1 P3) a sitios de receptor S1 P comprendiendo dichos receptores, in vivo o in vitro, con una cantidad de un compuesto de la fórmula I efectiva para unirse a dichos receptores. El tejido comprendiendo los sitios de receptor S 1 P designados unidos por ligante puede utilizarse para medir la selectividad de los compuestos de prueba para los subtipos de receptor específico, o pueden utilizarse como una herramienta para identificar los agentes terapéuticos potenciales para el tratamiento de enfermedades o condiciones asociadas con disfunción de coli na acetilo, al contactar dichos agentes con dichos complejos de receptor ligante, y medir el grado de desplazamiento del ligante y/o unión del agente. La invención también proporciona nuevos compuestos intermediarios y procesos descritos en la presente que son útiles para preparar los compuestos de la fórmula (I ), i ncluyendo los compuestos i ntermediarios genéricos y específicos así como los procesos si ntéticos descritos en los Diagramas y Ejemplos en la presente.

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 ilustra las estructuras de Esfingonsina 1 -fosfato, y los compuestos VPC222JJ, VPC23019, VPC23031 , VPC23089 y VPC25239. La Figura 2 (Paneles A-F) ilustran la actividad combatiente en los receptores S1 P? y S 1 P3. Las células HEK293T se transfectaron transitoriamente con cantidades iguales de receptor S 1 Pt o S 1 P3 humano y ADNs de plásmido Gi2Oc, Gß,5 y G?2. Las membranas se colectaron después de 60 horas. La activación del receptor se determinó utilizando un ensayo de unión de célula rota midiendo la unión de [?35S]GTP para la membrana como una función de la concentración lípida. La estimulación dependiente por concentración de los receptores S1 P? (Panel A) y S I P3 (Panel C) se observó con S 1 P (círculos rellenos) pero no VPC23019 (círculos abiertos). Cuando el ADN plásmido de receptor se excluyó, la unión no significante de [?35S]GTP se observó con 10 µM de S 1 P (Panel B), lo cual demuestra que la actividad es una función de la expresión del receptor. La unión de [?35S]GTP se observó con 10 µM de S1 P en células HEK393T transfectadas transitoriamente con solamente un receptor de ADN plásmido G¡2a y receptor; sin embargo, la respuesta fue al menos 3 veces menor a aquella de las células en donde tanto el receptor como todos los tres ADNs plásmido de proteínas G se agregaron (Panel B). Los puntos de datos son en triplicado y son representativos de dos experimentos independientes. La activación de porcentaje se basa en la normalización de los valores de desintegraciones por minuto (dpm) obtenidos de la concentración de S 1 P mínima y máxima. Los valores típicos de cero y 100% de unión fueron aproximadamente 300 y 3000 dpm/cavidad, respectivamente, tanto para los receptores S 1 P1 como S 1 P3 humanos. Panel D: ilustra la migración de las células T24 transfectadas establemente con el receptor S 1 P1 humano se observó con el combatiente S 1 P? VPC222J7 (10 nM) pero no VPC23019 (1 nM -1000nM). Los puntos de datos son en duplicado y son representativos de dos experimentos independientes. El porcentaje de migración se basa en la normalización de los valores de unidades de fluorescencia relativa (RFU) obtenidos de los valores RFU obtenidos de la migración observada con 0.1 % de vehículo BSA (mínimo) y VPC2227J (máximo). Los valores típicos para cero y 100% de migración fueron aproximadamente 30000 y 100000 RFU/cavidad, respectivamente. Paneles E y F: ilustran la movilización de calcio dependiente de la concentración de células T24 no transfectadas (inserción) y células T24 transfectadas establemente con el receptor S1 P3 humano se observó con S 1 P (círculos rellenos) pero no VPC23019 (círculos abiertos). Los puntos de datos son en triplicado y son representativos de dos experimentos independientes. El porcentaje de activación se basa en la normalización de los valores de unidades de fluorescencia relativa (RFU) obtenidos de la concentración de S 1 P mínima y máxima. Los valores típicos para cero y 100% de movilización de calcio fueron aproximadamente 400 y 4000 RFU/cavidad, respectivamente. La Figura 3 (Paneles A-D) Paneles A y B ilustran el antagonismo en los receptores S 1 P? y S 1 P3 por VPC23019. Las células HEK293T se transfectaron transitoriamente con cantidades iguales de receptor S 1 P1 o S1 P3 humano y ADNs plásmido Gi2a, Gßi, y G?2. Las membranas se colectaron después de 60 horas. La activación de receptor se determinó utilizando un ensayo de unión de célula rota midiendo la unión de [?35S]GTP a la membrana como una función de la estimulación de combatiente (S1 P). El bloqueo de la estimulación S 1 P en S 1 P? y S 1 P3 en el ensayo de unión de célula rota [?35S]GTP se realizó en la ausencia (círculos rellenos) o presencia de concentraciones de 10000 nM (círculos abiertos), 1000 nM (cuadros abiertos), y 100 nM (cuadros rellenos) de VPC23019. La constante de unión (pKb) se reporta como pKb+S.E . M . Los puntos de datos son en hextuplicado y son representativos de dos experimentos independientes para cada receptor. El porcentaje de activación se basa en la normalización de valores de desintegraciones por minuto (dpm) obtenidos de la concentración de S 1 P mínima y máxima. Los valores típicos para cero y 100% de unión fueron aproximadamente 300 y 3000 dpm/cavidad, respectivamente, tanto para los receptores S 1 P? como S1 P3 humano. El Panel C ilustra el bloqueo de la migración de células T24 transfectadas establemente con el receptor S1 P? humano con el combatiente S1P? VPC22277 (10 nM) se observó con 10,100 y 1000 nM de concentraciones de VPC23019. Los puntos de datos son en duplicado y son representativos de dos experimentos independientes. El porcentaje de migración se basa en la normalización de valores de unidades de fluorescencia relativa (RFU) obtenidos de los valores RFU obtenidos de la migración observada con BSA (mínimo) y VPC22277 (máximo). Los valores típicos para cero y 100% de migración fueron aproximadamente 30000 y 100000 de RFU/cavidad, respectivamente. El Panel D ilustra la movilización de Ca2+ observada con las células T24 transfectadas establemente con receptor S1P3 humano (línea sólida) no se alteró por pre-tratamiento con VPC23019 (10000?M - línea punteada) seguido por lavado. Los puntos de datos son en triplicado y son representativos de dos experimentos independientes. El porcentaje de activación se basa en los valores de unidades de fluorescencia relativa (RFU) obtenidos de la concentración S1P mínima y máxima. Los valores típicos para cero y 100% de movilización de calcio fueron aproximadamente 400 y 4000 RFU/cavidad, respectivamente. La Figura 4 (Paneles A y B) ¡lustran el desplazamiento de S1P radiomarcado por VPC23019 en S1Pt y S1P3. Las células HEK293T se transfectaron transitoriamente con cantidades iguales de receptor S1P1 o S1P3 humano y ADNs plásmido G¡2Ci, Gßi, y G?2. Las membranas se colectaron después de 60 horas. El desplazamiento de S1P radiomarcado se determinó utilizando un ensayo de unión por membrana midiendo la unión de [32P]S 1 P al receptor. El desplazamiento dependiente de dosis de [32P]S1 P se observó con S 1 P (A) y VPC23019 (B) tanto para receptores S 1 P1 (círculos cerrados) como SI P3 (círculos abiertos). Los valores pK¡ son el -logaritmo de la constante de unión inhibidora (K¡) y se reportan como pK¡±S. E. M . Los puntos de datos son en triplicado y son representativos de dos experimentos independientes para cada receptor. El porcentaje de unión se basa en la normalización de los valores de desintegraciones por minuto (dpm) obtenidos del mínimo y máximo. Los valores típicos para cero y 100% de unión fueron aproximadamente 1 0000 y 30000 dpm/tubo, respectivamente, tanto para los receptores S 1 P? como S 1 P3 humanos. La unión no específica se determinó como la unión residual de radioligante en la presencia de exceso de S1 P a membranas, tanto desnaturalizada por calor como no desnaturalizada por calor, de las células HEK293T transfectadas transitoriamente con ADNs de proteína G y receptor, y fue típicamente 60% de unión total. La Figura 5: (Panel A y B) ilustran la respuesta de combatiente en los receptores S1 P? y S 1 P3 se altera por los análogos relacionados a VPC23019. Panel A: El bloqueo de la migración de células T24 transfectadas establemente, con receptor S 1 P? humano obtenido con el combatiente S 1 Pi VPC22277 (10nM ) se observó con VPC23019, VPC23031 , VPC23089, y VPC25239 (50nM). Los puntos de datos son en duplicado y son representativos de dos experimentos i ndependientes. El porcentaje de migración se basa en los valores de unidades de fl uorescencia relativa (RFU) obtenidos de los valores RF U obtenidos de l a migración observada con BSA (mínimo) y VPC22277 (máximo). Los valores típicos para cero y 100% de migración fueron aproximadamente 30000 y 1 00000 RFU/cavidad , respectivamente. Panel B: El bloqueo de la movilización Ca2+ por medio de ia estimulación de las células T24 transfectadas establemente con receptor S 1 P3 humano se realizó en la ausencia (círculos rellenos) o presencia de 10000nM de VPC23031 (cuadros rellenos), VPC23089 (círculos abiertos), y VPC25239 (cuadros abiertos) . Los puntos de datos son en triplicado y son representativos de dos experimentos independientes. El porcentaje de activación se basa en la normalización de valores de unidades de fluorescencia relativa (RPU) obtenidos de la concentración S 1 P mínima y máxima. Los valores típicos para cero y 100% de movilización de calcio fueron aproximadamente 400 y 4000 RFU/cavidad, respectivamente. La Figura 6 (Paneles A-B) ilustra esquemas sintéticos para la síntesis de los compuestos de la invención, particularmente VPC441 16. La Figura 7 es un espectro 1 H N M R de compuesto VPC441 16, un compuesto de ia i nvención. La Figura 8 es un espectro 13C NM R de compuesto VPC44116, un compuesto de la invención.

Descripción Detallada Abreviaturas S 1 P, esfingosina-1 -fosfato; GPCR, receptor acoplado por proteína G; SAR, relación de actividad por estructura; EDG, gen de diferenciación de célula endotelial; EAE, encefalomielitis autoinmune experimental; NOD diabética no obesa; TNFa, factor alfa de necrosis tumoral; HDL, iipoproteína de alta densidad; RT-PCR, reacción en cadena de polimerasa de transcriptasa inversa.

Definiciones Al menos que se indique de otra forma, todos los términos científicos y técnicos utilizados en la presente tienen el mismo significado según se entiende comúnmente por un experto en la materia a quien pertenece esta invención. A pesar de que cualquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente pueden utilizarse en la práctica o prueba de la presente invención, los métodos preferidos y materiales se describen en la presente. Según se utiliza en la presente, cada uno de los siguientes términos tiene el significado asociado con este en esta sección. Los valores preferidos y específicos listados abajo para radicales, sustituyentes, y rangos, son para ilustración solamente, no excluyen otros valores definidos u otros valores dentro de los rangos definidos para los radicales y los sustituyentes. Los artículos "un" y "una" se utilizan en la presente para referirse a uno o más de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A manera de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento. Los "antagonistas" de receptor se definen como compuestos que 1 ) carecen de actividad combatiente intrínseca y 2) bloquean la activación de combatiente del (de los) receptor (es) S 1 P frecuentemente en una manera que es tanto completamente superable como reversible ("antagonista competitiva") . Según se utiliza en la presente, el término "purificado" y términos similares se refieren a un enriquecimiento de una molécula o compuesto en relación a otros componentes normal mente asociados con la molécula o compuesto en un ambiente nativo. El término "purificado" no necesariamente indica que la pureza completa de la molécula particular se ha logrado durante el proceso. Un compuesto "altamente purificado" según se utiliza en la presente se refiere a un compuesto que es mayor a 90% puro. Según se utiliza en la presente, el término "halógeno" o "halo" incluye bromo, cloro, fl uoro, y yodo. El término "haloalquilo" según se utiliza en la presente se refiere a un radical alquilo que lleva al menos un sustituyente de halógeno, por ejemplo, clorometilo, fl uoroetilo o trifl uorometilo y lo similar.

El término " alquilo d-C6," según se utiliza en la presente, representa un grupo alquilo ramificado o lineal que tiene de uno a seis átomos de carbono. Típicamente los grupos alquilo d-C6 incl uyen, pero no se limitan a, metilo, etilo, n-propilo, iso-propilo, butilo, iso-butilo, sec-butilo, tert-butilo, pentilo, hexilo y lo similar. El término "alquenilo C2-C6," según se utiliza en la presente, representa un grupo ramificado o lineal olefínicamente no saturado que tiene de 2 a seis átomos de carbono y al menos un enlace doble. Los ejemplos de tales grupos incluyen, pero no se limitan a, 1 -propenilo, 2-propenilo, 1 ,3-butadienilo, 1 -butenilo, hexenilo, pentenilo, y lo similar. El término " alquinilo C?-Cß," se refiere a un grupo ramificado o li neal no saturado que tiene de 2 al número específico de átomos de carbono y al menos un triple enlace. Los ejemplos de tales grupos incl uyen, pero no se limitan a, 1 -propinilo, 2-propi nilo, 1 -butinilo, 2-butinilo, 1 -pentinilo, y lo similar. El térmi no "cicloalquilo C3-C8," representa ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciciohexilo, cicioheptilo, ciclooctilo y lo similar. Según se utiliza en la presente, el térmi no "opcionalmente sustituido" se refiere de cero a cuatro sustituyentes, en donde los sustituyentes se seleccionan cada uno independientemente. Cada uno de l os sustituyentes independientemente seleccionados pueden ser los mismos o diferentes a otros sustituyentes. Según se utiliza en la presente el térmi no "arilo" se refiere a un sistema de anillo carbocíclico mono o bicíclico teniendo uno o dos anillos aromáticos incluyendo, pero no li mitándose a, fenil o, bencilo, naftilo, tetrahidronaftilo, indanilo, i ndenilo, y lo similar. Según se utiliza en la presente "arilo opcionalmente sustituido" incluye compuestos arilo teniendo de cero a cuatro sustituyentes, y un arilo sustituido incluye compuestos arilo teniendo uno a tres sustituyentes, en donde los sustituyentes incl uyen grupos tal como, por ejemplo, sustituyentes alquilo, halo o ami no. El término aril(alquilo Cs-Cs) se refiere a cualquier grupo arilo el cual se une a la porción principal por medio del grupo alquilo, y el térmi no (alquilo C5-C8)(arilo Cs-Cß) se refiere a un anillo aromático de cinco o seis miembros que se une a la porción principal por medio del grupo alquilo C5-C8. Según se utiliza en la presente, el término "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera de los vehículos farmacéuticos estándares, tal como una solución de salina regulada por fosfato, hidroxipropilo beta-ciclodextri nas (ciclodextrinas beta HO-propilo), agua, emulsiones tal como un aceite/agua o emulsión agua/aceite, y diversos tipos de agentes humectantes. El término también comprende cualquiera de los agentes aprobados por una agencia reguladora del Gobierno Federal de EE . U U. o listados en la Farmacopea de EE. U U . para utilizarse en ani males, i ncluyendo humanos. Según se utiliza en la presente, el término "tratar" i ncl uye profilaxis del desorden o condición específica, o aminoración de los síntomas asociados con un desorden o condición específica y/o prevención o eliminación de dichos síntomas. Según se utiliza en la presente, un "cantidad eficaz" significa una cantidad suficiente para producir un efecto seleccionado. Por ejemplo, una cantidad eficaz de un antagonista de receptor S1 P es una cantidad que reduce la actividad de señalización celular del receptor S1 P. Según se utiliza en la presente, un "material instructivo" incluye una publicación, un registro, un diagrama, o cualquier otro medio de expresión que puede utilizarse para comunicar la utilidad de la composición de la invención para su uso designado. El material instructivo del equipo de la invención puede, por ejemplo, fijarse a un contenedor que contiene la composición. Alternativamente, el material instructivo puede embarcarse por separado del contenedor con la intención de que el material instructivo y la composición se utilicen cooperativamente por el recipiente. El método de la invención incluye un equipo comprendiendo un inhibidor identificado en ia invención y un material instructivo que describe administrar el inhibidor o una composición que comprende el inhibidor a una célula o un animal. Esto deberá interpretarse que incluyen otras modalidades de los equipos que se conocen por aquellos expertos en la materia, tal como un equipo comprendiendo un (preferentemente estéril) solvente adecuado para disolver o suspender la composición de la invención antes de administrar el compuesto a una cél ula o un animal . Preferentemente, el animal es un humano. Se apreciará por aquellos expertos en ia materia que los compuestos de la invención que tienen un centro quiral pueden existir en y aislarse en formas racémicas y ópticamente activas. Algunos compuestos pueden mostrar el poli morfismo. Se entiende que la presente invención comprende cualquier forma racémica, ópticamente activa, polimórfica, o estereoisomérica, o mezclas de las mismas, de un compuesto de la invención, que poseen las propiedades útiles descritas en l a presente, siendo conocido en la materia cómo preparar las formas ópticamente activas (por ejemplo, por resolución de la forma racémica por técnicas de recristalización, por síntesis de materias primas ópticamente activas, por síntesis quiral , o por separación cromatográfica utilizando una fase estacionaria quiral) y cómo determi nar la actividad de antagonista S 1 P utilizando las pruebas estándares descritas en la presente, o utilizando otras pruebas si milares que se conocen bien en la materia. Los procesos para preparar los compuestos de la fórmula I o para preparar los compuestos intermedios útiles para preparar los compuestos de la fórmula I se proporcionan como modalidades adicionales de la invención. Los compuestos intermediarios útiles para preparar los compuestos de la fórmula I también se proporcionan como modalidades adicionales de la invención.

En casos en donde los compuestos son lo suficientemente básicos o acídicos para formar las sales base o acidas, el uso de los compuestos como sales puede ser adecuado. Los ejemplos de sales adecuadas son sales de adición acidas orgánicas formadas con ácidos que forman un anión fisiológicamente aceptable, por ejemplo, tosilato, metanosulfonato, acetato, citrato, malonato, tartarato, succinato, benzoato, ascorbato, a-cetoglutarato, y a-glicerofosfato. Las saies inorgánicas adecuadas también pueden formarse, incluyendo sales de clorhidrato, sulfato, nitrato, bicarbonato, y carbonato. Las sales aceptables pueden obtenerse utilizando los procedimientos estándares bien conocidos en la materia, por ejemplo, al reaccionar un compuesto lo suficientemente básico tal como una amina con un ácido adecuado que logra un anión fisiológicamente aceptable. Las sales de metal álcali (por ejemplo, sodio, potasio o litio) o metal de tierra alcalina (por ejemplo, calcio) de ácidos carboxílicos también pueden elaborarse. La presente invención se dirige a los análogos esfingosina 1 -fosfato (S 1 P) que tienen actividad como antagonistas de receptor en uno o más receptores S1 P, específicamente los tipos de receptor S 1 P? y S 1 P3. La invención incluye ambos compuesto que tienen una porción de fosfato así como también compuestos con surrogados de fosfato resistentes a la hidrólisis tal como fosfonatos, fosfonatos alfa-sustituidos particularmente en donde la sustitución alfa es un halógeno y fosfotionatos.

La descripción proporciona en la presente que un subgrupo de nuestros compuestos que contienen amida de arilo sean antagonistas en los receptores S1 P! y S1 P3. El compuesto de plomo en la serie, VPC2301 9, se encontró en los ensayos de célula completa y célula rota para comportarse como un antagonista competitivo en los receptores S1 Pi y S1 P3. El SAR de esta serie es excesivo, por ejemplo, una modificación ligera del compuesto de plomo dada como resultado en VPC25239, que fue un orden de logaritmo más potente en el receptor S1 P3. Estas nuevas entidades químicas permitirán el entendimiento adicional de la señalización S1 P y propocionarán plomos para el desarrollo adicional del antagonista de receptor S 1 P. Una modalidad del antagonista de receptor S1 P se proporciona por el compuesto antagonista competitivo VPC2301 9, el cual tiene la estructura: VPC23019 Esfingosina 1 -fosfato (análogos como antagonistas de receptor) , la actividad de antagonista se realiza solamente cuando 1 ) el grupo amino se encuentra en la config uración mostrada (R en este caso), 2) la cadena de alquilo es de 8 átomos de carbono (según se muestra) o menos y 3) la cadena de alquilo es meta (seg ún se muestra) u orto, pero no para, hacia la amida. También , VPC23019 se comporta como un antagonista de receptor competitivo en los receptores S1 P? y (pKb = 7.49 ± 0.16) S1 P3 (pKb = 5.98 ± 0.08) pero no es un combatiente en el receptor S1 P4 humano (pECso = 6.58 ± 0.08) y un combatiente parcial en el receptor S 1 P5 humano (pEC50 = 7.07 ± 0.12). VPC23019 es inactivo ya sea como un combatiente o como un antagonista en el receptor S 1 P2 humano en las concentraciones de hasta 10 micromoles. Los datos similares para los compuestos de antagonista relacionados (VPC25239, cadena de alquilo de 7 átomos de carbono, meta; VPC23031 , cadena de alquilo de 6 carbonos, meta; VPC23089, cadena de alquilo de 8 carbonos, orto) se encuentra también abajo. La diferencia saliente entre los compuestos en esta serie es que la reducción de la cadena de alquilo de 8 (VPC23019) a 7 (VPC25239) átomos de carbono da como resultado un aumento de orden de logaritmo en la potencia en el receptor SI P3 mientras se dejan las actividades en los otros tipos de receptor S1 P relativamente sin cambiar. Según se describe más abajo, aumentando la longitud de cadena de alquilo a 9 o 10 átomos de carbono (VPC23079, VPC23069, respectivamente), colocando la cadena de alquilo en la posición para (VPC22277), o colocando el grupo amino en la otra orientación espacial (VPC25027 (enantiómero S de VPC23019)), dio como resultado la conversión de los compuestos de los antagonistas a combatientes (o combatientes parciales) en el receptor S1 P?. Las vías sintéticas para todos los compuestos anteriormente mencionados se describen en el manuscrito anexo Davis et al.. Otra modalidad de un antagonista de receptor S 1 P se proporciona por VPC441 16, el cual tiene la estructura: VPC44116 VPC441 16 es un análogo de fosfonato metileno de VPC2301 9. VPC441 16 no se describe en el manuscrito Davis et al. , el cual se restringe a los compuestos que contienen fosfato. Las propiedades de antagonista de VPC441 16 (potencia, selectividad de tipo de receptor S1 P) son indistinguibles de VPC2301 9. Sin embargo, se espera que VPC441 16 no será un sustrato para las fosfohidrolasas de fosfato lípido que degradan los lípidos que contienen monoésteres de fosfato (por ejemplo, S 1 P, VPC23019). De esta manera, VPC441 16 se ha mostrado que tiene estabilidad metabolíticamente aumentada de manera significativa en los sistemas biológicos, por ejemplo, al menos 1 8 horas, en un ratón . Las vías sintéticas para el compuesto específico protegido por N-Boc de la invención , VPC441 16 se ilustra en las Figuras 6A y 6B. En una modalidad adicional de la invención , un compuesto (análogo de fosfotionato de VPC2301 9) con la fórmula (I I) se espera que retenga la actividad de antagonista en los receptores S1 Pn y S1 P3 y sea resistente a la hidrólisis (fosfatasas) en sistemas biológicos: en donde A" representa una ion anfotérico adecuado. En una modalidad adiciona l de la invención, los compuestos con la fórmula (l l l) se espera que retengan la actividad antagonista en los receptores S1 Pi y S1 P3 y sean resistentes a la hidrólisis (fosfatasas) en sistemas biológicos: (m) en donde X y Y se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, OH, flúor, cloro, PO3 o metilo; o X y Y juntos forman un grupo ceto; en donde los compuestos mono- o di-fluoro (F) se prefieren . Un valor específico para grupo alq uilo inferior es etilo o propilo. Un valor específico para X es flúor o cloro. Un valor específico para X es flúor. Un valor específico para Y es flúor o cloro.

Un valor específico para Y es flúor. Un valor específico para X y Y y el átomo al cual se unen forman un grupo >C=O. Un compuesto específico de la invención tiene el grupo R1 colocado ortho o para hacia la amida. Un valor específico para los grupos alquilo en R2 es longitudes de cadena de 5-8 átomos de carbono . Un compuesto específico de la invención tiene el grupo R2 colocado ortho o meta hacia la amida. Un compuesto específico de la invención tiene el grupo R2 colocado meta hacia la amida. La invención también incluye los compuestos que tienen las fórmulas: Los procesos para preparar los compuestos de la fórmula (I) se proporcionan como modalidades adicionales de la invención y se ilustran por los siguientes procedimientos en los cuales los significados de los radicales genéricos son seg ún se dan anteriormente al menos que se califique de otra forma. En casos en donde los compuestos son lo suficientemente básicos o acídicos para formar las sales base o acidas no tóxicas estables, la administración de los compuestos como sales puede ser adecuado. Los ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables son sales de adición acidas orgánicas formadas con ácidos que forman un anión fisiológicamente aceptable, por ejemplo, tosilato, metanosulfonato, acetato, citrato, malonato, tartarato, succinato, benzoato, ascorbato, -cetoglutarato, y -glicerofosfato. Las sales inorgánicas adecuadas también pueden formarse, incluyendo sales de clorhidrato, sulfato, nitrato, bicarbonato, y carbonato. Las sales farmacéuticamente aceptables pueden obtenerse utilizando procedimientos estándares bien conocidos en la materia, por ejemplo al reaccionar un compuesto lo suficientemente básico tal como una amina con un ácido adecuado que logra un anón fisiológicamente aceptable. Las sales de metal álcali (por ejemplo, sodio, potasio o litio) o metal de tierra alcalina (por ejemplo, calcio) de ácidos carboxílicos también pueden elaborarse. Los compuestos de la fórmula I pueden formularse como composiciones farmacéuticas y administrarse a un huésped mamífero, tal como un paciente humano en una variedad de formas adaptadas para la vía seleccionada de administración, es decir, oralmente o parenteralmente, mediante vías intravenosa, intramuscular, local o subcutánea. De esta manera, los presentes compuestos pueden administrarse sistémicamente, por ejemplo, oralmente, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable tal como un diluyente inerte o un vehículo comestible asimilable. Estos pueden encerrarse en cápsulas de gelatina de corteza suave o dura, pueden comprimirse en tabletas, o pueden incorporarse directamente con el alimento de la dieta del paciente. Para la administración terapéutica oral, el compuesto activo puede combinarse con uno o más excipientes y utilizarse en la forma de tabletas digeribles, tabletas bucales, pastillas, cápsulas, elíxires, suspensiones, jarabes, hostias, y lo similar. Tales composiciones y preparaciones deberán contener al menos 0.1 % de compuesto activo. El porcentaje de las composiciones y las preparaciones pueden, por supuesto, variarse y pueden convenientemente encontrarse entre 2 a aproximadamente 60% del peso de una forma de dosis de unidad dada. La cantidad del compuesto activo en tales composiciones terapéuticamente útiles es de tal forma que un nivel de dosis eficaz se obtendrá. Las tabletas, pastillas, pildoras, cápsulas, y lo similar también pueden contener lo siguiente: aglutinantes tales como goma tragacanto, acacia, almidón de maíz o gelatina; excipientes tales como fosfato de dicalcio; un agente desintegrador tal como almidón de maíz, almidón de papa, ácido algínico y lo similar; un lubricante tal como estearato de magnesio; y un agente edulcorante tal como sucrosa, fructosa, lactosa o aspartame o un agente saborizante tal como menta, aceite de gaultería, o saborizante de cereza puede agregarse. Cuando la forma de dosis de unidad es una cápsula, esta puede contener, además de materiales del tipo anterior, un vehículo líquido, tal como un aceite vegetal o un polietilénglicol . Otros diversos materiales pueden presentarse como revestimientos o de otra forma modificar la forma física de la forma de dosis de unidad sólida. Por ejemplo, las tabletas, pildoras, o cápsulas pueden revestirse con gelati na, cera, laca o azúcar y lo similar. Un jarabe o elixir puede contener el compuesto activo, la sucrosa o fructosa como un agente edulcorante, metilo y propilparabenos como conservadores, un tinte y saborizante tal como sabor cereza o naranja. Por supuesto, cualquier material utilizado en la preparación de cualquier forma de dosis de unidad deberá ser farmacéuticamente aceptable y sustancialmente no tóxica en las cantidades empleadas. Además, el compuesto activo puede incorporarse en las preparaciones de liberación sostenida y dispositivos. El compuesto activo también puede admi nistrarse intravenosamente o intraperitonealmente por infusión o i nyección. Las sol uciones del compuesto activo o sus sales pueden prepararse en agua, mezclarse opcionalmente con un agente tensoactivo no tóxico. Las dispersiones también pueden prepararse en glicerol, polietilénglicoles líquidos, triaceti na, y mezclas de los mismos y en aceites. Bajo condiciones ordi narias de al macenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservador para prevenir el crecimiento de microorganismos. Las formas de dosificación farmacéutica adecuadas para la inyección o infusión pueden incluir soluciones acuosas estériles o dispersiones o polvos estériles comprendiendo ingrediente activo los cuales se adaptan para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones infusibles o inyectables estériles, opcionalmente encapsuladas en liposomas. En todos los casos, la última forma de dosificación deberá ser estéril, fluida, y estable bajo las condiciones de elaboración y almacenamiento. El vehículo o portador líquido puede ser un medio de dispersión líquido o solvente comprendiendo, por ejemplo, agua, etanol, un poliol (por ejemplo, glicerol, propilénglicol, polietilénglicoles líquidos, y lo similar), aceites vegetales, esteres de glicerilo no tóxicos, y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, por la formación de liposomas, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerida en el caso de dispersiones o por el uso de agentes tensoactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede provocarse por diversos agentes antifúngicos o antibacterianos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol , ácido sórbico, timerosal, y lo similar. En varios casos, es preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, reguladores o cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede provocarse mediante el uso en las composiciones de agentes retardadores de absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Las soluciones inyectables estériles se preparan al incorporar el compuesto activo en la cantidad requerida en el solvente adecuado con varios de los otros ingredientes enumerados anteriormente, según se requiere, seguido por esterilización de filtro. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado por vacío y técnicas de liofilización, los cuales producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional presente en las soluciones filtradas previamente estériles. Para la administración local, los presentes compuestos pueden aplicarse en forma pura, es decir, cuando estos son líquidos. Sin embargo, será generalmente deseable administrarlos a la piel como composiciones o formulaciones, en combinación con un vehículo dermatológicamente aceptable, el cual puede ser un sólido o un líquido. Los vehículos sólidos útiles incluyen sólidos finamente divididos tales como talco, arcilla, celulosa microcristalina, alumina, y lo similar. Los vehículos líquidos útiles incluyen agua, alcoholes o glicoles o mezclas de agua-alcohol/glicol , en las cuales los presentes compuestos pueden disolverse o dispersarse en niveles efectivos, opcionalmente con la ayuda de agentes tensoactivos no tóxicos. Los adjuvantes tales como fragancias y agentes antimicrobianos adicionales pueden agregarse para optimizar las propiedades para un uso dado. Las composiciones líquidas resultantes pueden aplicarse de almohadillas absorbentes, utilizadas para impregnar vendas u otras prendas o rociarse sobre el área afectada utilizando rociadores de aerosol o tipo bomba. Los espesantes tales como polímeros sintéticos, ácidos grasos, sales de ácido graso y esteres, alcoholes grasos, celulosas modificadas o materiales de mineral modificado también pueden emplearse con vehículos líquidos para formar pastas esparcibles, geles, ungüentos, jabones, y lo similar, para la aplicación directamente a la piel del usuario. Los ejemplos de composiciones dermatológicas útiles que pueden utilizarse para suministrar los compuestos de la fórmula I a la piel se conocen en la materia, por ejemplo, véase Jacquet ef al. (Pat. de EE. UU. No. 4,608,392), Geria (Pat. de EE. UU. No. 4,992,478), Smith et al. (Pat. de EE. UU. No. 4,559, 157) y Wortzman (Pat. de EE. UU. No. 4,820,508). Las dosis útiles de los compuestos de la fórmula I pueden determinarse al comparar su actividad in vitro, y actividad in vivo en modelos de animal. Los métodos para la extrapolación de dosis efectivas en ratones, y otros animales, a humanos se conocen en la materia; por ejemplo, véase Pat. de EE. UU. No. 4,938,949. Generalmente, la concentración del (de los) compuesto(s) de la fórmula I en una composición líquida, tal como una loción, será de aproximadamente 0.1 -25% en peso, preferentemente de aproximadamente 0.5-10% en peso. La concentración en una composición sólida o semi-sólida tal como un gel o un polvo será de aproximadamente 0.1 -5% en peso, preferentemente aproximadamente 0.5-2.5% en peso.

La cantidad del compuesto, o una sal activa o derivado del mismo, requerida para utilizarse en el tratamiento variará no solamente con la sal en particular seleccionada sino también con la vía de administración, la naturaleza de la condición que se trata y la edad y condición del paciente y por último será a la discreción del médico o clínico tratante. En general, sin embargo, una dosis adecuada será en el rango de desde aproximadamente 0.5 a aproximadamente 100 mg/kg, por ejemplo, de aproximadamente 10 a aproximadamente 75 mg/kg de peso corporal por día, tal como 3 a aproximadamente 50 mg por kilogramo de peso corporal por día, preferentemente en el rango de 6 a 90 mg/kg/día, más preferentemente en el rango de 15 a 60 mg/kg/día. El compuesto se administra convenientemente en forma de dosis de unidad; por ejemplo, conteniendo 5 a 1000 mg, convenientemente 10 a 750 mg, más convenientemente, 50 a 500 mg de ingrediente activo por forma de dosis de unidad. Idealmente, el ingrediente activo deberá administrarse para lograr concentraciones de plasma de valor máximo del compuesto activo de desde aproximadamente 0.5 a aproximadamente 75 µM , preferentemente, aproximadamente 1 a 50 µM , más preferentemente, aproximadamente 2 a aproximadamente 30 µM . Esto puede lograrse, por ejemplo, por la inyección intravenosa de una solución de 0.05 a 5% del ingrediente activo, opcionalmente en salina, o administrarse oralmente como un bolo conteniendo aproximadamente 1 -100 mg del ingrediente activo. Los niveles de sangre deseables pueden mantenerse por infusión continua para proporcionar aproximadamente 0.01 -5.0 mg/kg/hr o por infusiones intermitentes conteniendo aproxi madamente 0.4-15 mg/kg del (de los) ingrediente (s) activo(s). La dosis deseada puede presentarse convenientemente en una dosis única o como dosis divididas administradas en intervalos adecuados, por ejemplo, como dos, tres, cuatro o más sub-dosis por día. La sub-dosis por sí misma puede dividirse además, por ejemplo, en un número de administraciones aproximadamente separadas discretas; tales como inhalaciones múltiples de un insuflador o por aplicación de una pluralidad de gotas en el ojo.

Materiales y Métodos Materiales - Los químicos para síntesis se adquirieron de Aldrich Chemical Compcualquier (Milwaukee, Wl) , Sigma Chemicals (St. Louis, MO), Advanced ChemTech Chemical Compcualquier (Louisville, KY), y/o NovaBiochem Chemical Comp cualquier (Laufelfingen, Switzerland) y se utilizan sin purificación adicional . [?-32P]ATP y [?-35S]GTP se adquirieron de Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ). El Equipo de Ensayo de Proliferación Celular CyQuant y el Indicador de Calcio Fluo-4AM se adquirieron de Molecular Probes (Eugene, OR). CHO y células T24 se adquirieron de la Colección de Cultivo Tipo Americano (Manassas, VA). Las células HEK293T se obtuvieron de Dr. Judy White (Dept. de Biología Celular, Universidad de Virginia, Charlottesville, VA). El medio de cultivo de tejido y FBS normal se obtuvieron de Invitrogen (Carlsbad, CA). FBS destilado con Carbón Vegetal/Dextrano (CD-FBS) se obtuvo de Gemini Bio-Products (Woodland, CA). Los ADNs de proteína G, a, ß y ? fueron un regalo de Dr. Doug Bayliss (Dept. de Farmacología, Universidad de Virginia). Esfingosina 1 -fosfato se adquirió de Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL).

Ejemplo 1 : Síntesis de VPC23019. VPC23031. VPC2S239 v VPC23089. La vía sintética a los compuestos mefa-sustituidos VPC23031 , VPC25239 y VPC23019 se inicia con un acoplamiento Sonogashira (6) de 3-yodo-1 -nitrobenceno con la terminal alquino adecuada. Los aductos resultantes se someten así a hidrogenación simultánea del grupo nitro y el enlace triple para generar anilinas mefa-sustituidas. Las anilinas se acoplan enseguida a una serina protegida y las amidas consiguientes se sometieron a la hidrogenolisis para lograr los alcoholes libres. Los alcoholes se fosforilatan subsecuentemente, se oxidan con peróxido de hidrógeno y después se someten a la desprotección global catalizada por ácido a fin de proporcionar los productos finales, VPC23031 , VPC25239 y VPC23019. La síntesis del compuesto orfo-sustituido, VPC23089, se comienza con la unión de 2-yodoanilina y 1 -octino por medio de un acoplamiento Sonogashira. La anilina consiguiente se acopla así a una serina protegida utilizando el reactivo PyBOP. La amida resultante se somete así a una etapa de hidrogenación/hidrogenolisis para remover el grupo protector éter bencilo y simultáneamente reducir el enlace triple de arilo. El alcohol liberado enseguida se fosforilata, se oxida con peróxido de hidrógeno y después se somete a la desprotección global catalizada por ácido a fin de proporcionar el producto final VPC23089. NM R y la espectrometría de masa se utilizaron para confirmar todas las estructuras. VPC23019 se encuentra disponible de Lípidos Polares Avanti .

Eiemplo 1A: Síntesis de VPC44116 El compuesto VPC44116 se preparó según se ilustra en las Figuras 6A y 6B, el grupo protector N-BOC se remueve utilizando las técnicas conocidas en la materia. Los espectros 1 H y 13C del producto obtenido se ilustran en las Figuras 7 y 8, respectivamente. La información espectral de masa es como sigue: MS m/z = 371 .9, 370.8 (valor máximo base), 348.8, 270.5, 178.6.

Eiemplo 2: Expresión Transitoria en Células HEK293T. El ADN plásmido de receptor adecuado (receptores codificadores S 1 P? humano, S 1 P2 humano, S 1 P3 humano, S 1 P4 humano, S 1 P5 humano, LPAi humano, LPA2 humano o LPA3 humano) se mezcla con cantidades iguales de proteínas codificadoras de plásmido G¡2a humana, vaca ß^ y vaca ?2 (para S 1 P3, se utiliza una Gi2a de rata mutada (C352F), y estos ADNs se utilizan para transfectar las monocapas de células HEK293T (en donde "T" indica la expresión del antígeno T grande de virus SV-40) utilizando el método precipitado de fosfato de calcio (7). Después de aproximadamente 60 horas, las células se colectan, las membranas se preparan, se alicuotan, y se almacenan a -70°C hasta utilizarse (8). La transfección de receptor y proteína G se confirma con el ensayo de unión [?-35P]GTP (abajo descrito), a medida que el análisis de las células HEK293T transfectadas con las proteínas G solo no respondió a la estimulación de combatiente (Véase Figura 2B).

Eiemplo 3: Expresión Estable en Células T24. Las monocapas de 24 células se co-transfectan con los ADNs codificadores de receptor S 1 P? , S 1 P2, S1 P3 humano y el ADN plásmido pl RESpuro2 (Clontech, San José, CA,), utilizando ya sea Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) o FuGENE 6 (Roche Applied Science, Indianapolis, I N). Las poblaciones clónales que expresan el gen de acetiltransferasa puromicina se seleccionan por adición de puromicina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) al medio de cultivo. Las cél ulas T24 crecen en monocapas en 37°C en un 5% de CO2/95% de atmósfera de aire en medio de crecimiento consistente de: 95% de medio DM EM/F-12 y 10% de FBS destilado por carbón vegetal/dextrano.

Eiemplo 4: Ensayo de Unión rv-3SS1. El ensayo de unión [?-35S]GTP se realiza según se describe previamente (8). Las membranas conteniendo 1 -5 µg de proteína se incuban en 0.1 ml de regulador de unión (en mM : HEPES/50, NaCI/100, MgCI2/10, pH 7.5) conteniendo 5 µg de saponina, 10 µM de GDP, 0.1 nM de [?-35S]GTP (1200 Ci/mmol), y lípido(s) indicado (s) por 30 min. en 30°C y se colectaron utilizando un Colector de Células Brandel (Gaithersburg, M D). Las muestras se analizan así para radionúclido unido.

Eiemplo 5: Ensayo de Migración Celular. Los ensayos de migración celular se realizan utilizando las cámaras Boyden modificadas (tratadas por cultivo de tejido, 24 mm de diámetro, 10 µm de espesor, 8 µm de poros, Transwell®; Costar Corp. , Cambridge, MA) conteniendo membranas de policarbonato que se revisten por la parte inferior con 0.1 % de gelatina. La parte inferior de las membranas de policarbonato se enjuagó una vez con medio de migración (DM EM/F12 sin Fenol Rojo y 0.1 % de BSA libre de ácido graso) y después se sumergió en la cámara inferior que contiene dos mililitros de medio de migración. Las células T24 transfectadas establemente con ADN de receptor S 1 P? humano crecieron en el medio DM EM/F12 que contiene FBS destilado con carbón vegetal/dexrano y 10 µg/ml de puromicina a 100% de confluencia en placas de cultivo de tejido de 150x25 mm y se priva del suero al menos 12 horas. Las células privadas de suero se removieron de platos de cultivo con 10X de Tripsina-EDTA (solución de sal balanceada de Hank conteniendo 5 mM de EDTA y 25 mM de HEPES, pH 7.2, y 0.1 % de tripsina; I nvitrogen, San Diego, CA), se suspendieron en regulador de migración y se colectaron por centrifugación a 130 x g por 5 minutos. El fluido sobrenadante se removió por aspiración y la pastilla de célula se volvió a suspender en medio de migración (106 células/ml). Un mililitro de suspensión celular se agregó a la parte superior de cada cámara de migración y el combatiente S1 P VPC22277 (10 nM) se agregó a la cámara inferior. Las células se dejaron migrar hacia la parte inferior de la membrana por 4 horas a 37°C en la presencia o ausencia de antagonista [VPC23019 (0 nM - 1000 nM), VPC23019, VPC23031 , VPC23089, y VPC25239 (todos 50 nM)], las cuales se agregaron a la cámara inferior. Las células no migrantes en la cámara superior se removieron por aspiración y las células migratorias unidas a la superficie inferior de la membrana se aislaron por incubación en 10X de Tripsina-EDTA por 1 min. a temperatura ambiente y tapando suavemente la placa para desplazar las células de la membrana. La masa de células migratorias por membrana se evaluó al combinar 100 µl de suspensión celular con un volumen igual de solución de tinte CyQuant (3.0 ml de regulador lisis 2X y 15 µl de tinte CyQuant), y la fluorescencia resultante se cuantificó utilizando el fluorimetro FlexStation™ (Molecular Devices, Menlo Park, CA). Cada determinación representa el promedio de dos cámaras de migración individuales. Para la determinación de la reversibilidad del antagonismo asociado con VPC23019, las células se incubaron con 10 µM de VPC23019 a 37°C por 30 minutos. La monocapa se lavó tres veces con salina regulada por fosfato y se procesó inmediatamente para el ensayo de migración celular, según se describe anteriormente.

Eiemplo 6: Medición de Movilización de Calcio Intracelular. Un fluorimetro FlexStation™ (Molecular Devices, Menlo Park, CA) se utilizó para medir el calcio intracelular en células T24 nativas y células T24 transfectadas establemente ya sea con ADN de receptor S 1 P2 humano como S 1 P3 humano. Las células se cultivaron (-50,000 células/cavidad) en microplacas negras de parte inferior transparente de 96 cavidades (Corning Costar Corp.) y se dejaron durante la noche a 37°C. Las células se cargaron con tinte con 4 µM de éster Fluo-4AM en un regulador de carga (Solución de Sal Balanceada con Hank, pH 6.4, conteniendo 20 mM de HEPES, 0.1 % de BSA libre de ácido graso, y 2.5 mM de probenecid) por 30 minutos a 37°C. Después de lavarse las monocapas de célula tres veces con salina regulada por fosfato, el regulador de carga se agregó y las células se expusieron a grupos de compuestos por 3 minutos a 25°C en el FlexTation™. En todos los casos, cada concentración de cada compuesto se probó en al menos al triplicado. Para la determinación de la reversibilidad del antagonismo asociado con VPC23019 (10 µM), el compuesto se agregó en combinación con el tinte de carga a las células y se incubó a 37°C por 30 minutos. Las células se lavaron con salina regulada por fosfato y se expusieron a los compuestos inmediatamente, según se describe anteriormente.

Eiemplo 7: Determinación de la constante de unión para VPC23019 en los receptores S1 P? v S1 P3. La constante de unión (Kb) para VCP23019 en los receptores S1 P? y S 1 P3 se determinó por análisis Schild de curvas que se fijaron utilizando el método de regresión no lineal discutido por Lew y Angus (9). En resumen, el análisis no lineal de la línea de mejor ajuste generada al diagramar el logaritmo negativo de los valores ECS0 obtenidos de las curvas de respuesta-dosis de combatiente, en la ausencia y presencia de concentraciones variantes de antagonista, se diagramó contra la concentración de antagonista para dar el valor Kb. Un análisis de prueba F también se realizó para establecer si el antagonista cumplió o no los criterios de una simple interacción competitiva.

Eiemplo 8: Radio-marcado de S1 P [32P]-S 1 P se preparó al incubar la esfingosina y [?-32P]ATP con lisato de célula de las células HEK293T transitoriamente transfectadas con ADN tipo 2 de cinasa de esfingosina humana.

Los 200 µl de reacción contuvieron 0.025 mM de esfingosina, 1 mCi [?-32P]ATP (7000 Ci/mmol) y regulador de cinasa (en mM : Mg(C2H3O2)2 (en 50 mM de Tris, pH 7.5)/10, NaF/10, y semicarbizide/2). La reacción se inició por la adición de 20 µg de lisato de célula y se incubó a 37°C por al menos 30 minutos. [32P]S 1 P se extrajo por la adición de 1.0N de HCl , 2.0M de KCl, metanol y cloroformo a la mezcla de reacción, se arremolinó, y se centrifugó a 1000 x g por 5-10 minutos. La capa orgánica se aisló y el procedimiento de extracción se repitió dos veces adicionales con la fracción acuosa restante. Las fracciones orgánicas combinadas se secaron bajo una corriente de gas de nitrógeno y se volvieron a suspender en 0.1 % BSA libre de ácido graso acuoso. La actividad específica del producto, [32P]S1 P, se estima que es aquella del sustrato radio-marcado, [?-32P]ATP, es decir, 7,000 Ci/mmol.

Eiemplo 9: Ensayo de Unión de r32P1S1 P. Las membranas que contienen 5 µg de proteína de células HEK293T transfectadas transitoriamente tanto con los ADNs de proteína G como de receptor se incubaron en 0.5 ml de regulador de unión (en mM: HEPES/50, NaCI/100, MgCI2/10, pH 7.5), 50 pM de [32P]S1 P, e indicaron el (los) lípido (s) por una hora a temperatura ambiente. El ligante unido se separó del ligante libre por filtración rápida y se analizó en un contador de escintilación de líquidos. La unión no específica se determinó como unión residual de radioligante en la presencia de S 1 P en exceso a membranas, tanto desnaturalizadas por calor como no desnaturalizadas por calor, de células HEK293T transfectadas transitoriamente con los ADNs de proteína G y de receptor, y fue típicamente 60% de unión total. La constante de unión (K¡) asociada con la interacción de ligante-receptor se determinó de IC50 utilizando la ecuación Chang-Prusoff (K¡-ICso/(1 + [L]/Kd]. En la aplicación de esta ecuación, la concentración de radioligando (L) es 0.05 nM y el valor Kd utilizado fue aquel reportado para la interacción de receptor S1 P-S 1 P? , es decir, 8.1 nM (12). Análisis Estadistico. Los valores EC50 e IC50 para todas las curvas de respuesta de dosis se determinaron por análisis de regresión no lineal de todos los datos utilizando el programa GraphPad Prism®. El error asociado con los datos colectados se reporta como el error estándar del valor promedio (S.E. M .).

Eiemplo 10: Resultados. VPC23019 es desprovista de agonismo en los receptores S1 P , v Sl P». En el curso de nuestras evaluaciones de SAR análogo S1 P, descubrimos que el compuesto amida de arilo VPC23019 (Figura 1 ) careció de la actividad combatiente en los receptores S1 P? (Figura 2A) y S 1 P3 (Figura 2C) en un ensayo de unión [?-35S]FTP de célula rota. En realidad, un perfil que sugiere el agonismo inverso se observó en concentraciones de VPC23019 mayores a 100 nM en este ensayo; sin embargo, la conformación de esta actividad en la presencia de un antagonista neutral podría requerirse para definir las observaciones con VPC23019 en estas concentraciones como actividad de combatiente inverso. A medida que tales compuestos no se encuentran disponibles, es posible que la reducción en la unión de [?-35S]GTP observada en estas concentraciones puede deberse a la alteración de VPC23019 de la actividad combatiente relacionada a la membrana endógena. Esta falta de la actividad combatiente se confirmó en ensayos de célula completa utilizando células T24 (derivadas de carcinoma de vesícula) en donde ya sea el receptor S 1 P? (T24-S 1 P?) o S 1 P3 (T24-S I P3) se expresaron establemente. El análisis RT-PCR detectó solamente el mARN de receptor S1 P2 endógenamente en las células T24; sin embargo, mientras que la eficacia de la respuesta fue la misma, S1 fue al menos 100 veces más potente que cuando los receptores S1 P? , S 1 P2, o S1 P3 (Figura 2E) se expresaron establemente. De esta manera, el sistema de células T24 proporciona una oportunidad para interrogar los receptores S 1 P introducidos por transfección. Numerosos estudios han demostrado que S 1 P puede promover la migración celular; sin embargo, se mostró recientemente que S1 P también puede inhibir la migración, posiblemente a través de la estimulación del receptor S 1 P2 (10). Para sortear este efecto inhibidor, utilizamos VPC22277 (Figura 1 ), un análogo S 1 P que es un combatiente en los receptores S1 P? y S1 P3, pero no el receptor S1 P2 (Tabla 1 ) - (todos los compuestos en las series de amida de arilo (11) son desprovistos de cualquier actividad en el receptor S1P2). Los valores pEC50 son la -concentración molar de logaritmo del compuesto resultante en 50% de unión de [?-35S]GTP máxima. Los valores pEC50 se reportan como pEC5o + S.E.M.

Tabla 1: Actividad Combatiente en los Receptores S1P na: no actividad combatiente (<10% de S1P Emax) wpa: actividad combatiente parcial débil (10-50% de SIP Emax) pa: actividad combatiente parcial (50-85% de S1P Emax).

También se encontró que la migración de las células T24- S1Pt podría inducirse por VPC22277, mientras que no se provocó la migración en respuesta a VPC23019 (Figura 2D). De igual forma, en los estudios de movilización de calcio de célula completa utilizando las células T24-S1P3, la movilización de calcio dependiente de dosis se observó con S1 P y VPC23019 (Figura 2E); sin embargo, esta actividad no es un resultado de estimulación del receptor S 1 P3, a medida que la movilización de calcio mediado por VPC2301 se observó con células T24 tipo silvestre (Figura 2F). De esta manera, VPC23019 está desprovista de actividad combatiente en los receptores S1 P? y S 1 P3 utilizando tanto los ensayos de célula completa como de célula rota.

VPC23019 bloquea la actividad combatiente en los receptores S1 P v S1 Pa. El descubrimiento de que VPC23019 mostró la actividad combatiente inverso en los receptores S1 Pn o S 1 P3 nos provocó investigar si este compuesto bloqueó la actividad combatiente. Utilizando el ensayo de unión [?-35S]GTP, encontramos que la incubación de S1 P con concentraciones crecientes de VPC23019 ya sea en los receptores S1 P? (Figura 3A) o S I P3 (Figura 3B) produjeron un cambio recto paralelo dependiente de dosis en las curvas de concentración-efecto de S1 P. Este cambio en las respuestas mediadas por combatiente se observó también en dos ensayos de célula completa-migración de célula (Figura 3C) y movilización de calcio. VPC23019 no mostró nada de actividad combatiente en los receptores de familia LPA^ EDG en concentraciones de hasta 30 µM , ni la acción de LPA bloqueada en estos sitios.

Afinidad de Receptor S1 P VPC23019. Los análisis de Schild de la acción de antagonista asociada con VPC23019 en el ensayo de unión [?-35S]GTP dio valores pKb en los receptores S l Pt (Figura 3A) y S 1 P3 (Figura 3B) de 7.49 +. 0.15 y 5.98 + 0.08, respectivamente. Adicionalmente, el método de regresión no lineal de Lew y Angus (9), el cual pronostica si un compuesto se comporta como un antagonista competitivo, VPC23019 sugerido se comporta como un antagonista competitivo en ambos receptores. El análisis de Schild de movilización de calcio en células T24-S 1 P3 dio un valor Kd para VPC23019 que fue aproximadamente 10 veces menos a aquel observado en el ensayo de unión [?-35S]GTP. Sin embargo, el análisis de regresión no lineal indicó que VPC23019 no se comportó como un antagonista competitivo en el ensayo de movilización de calcio con células T24-S 1 P3. De manera importante, tanto los ensayos de receptor S1 P de célula completa (movilización Ca2+ (S I P3 - Figura 3D) y migración de célula (S 1 P?-no mostrado)) se recuperaron completamente después del lavado del antagonista. De esta manera, el antagonismo mostrado por VPC23019 es reversible así como también completamente superable el criterio esencial para un antagonista competitivo. Para medir la afinidad de VPC23019 para los receptores S 1 P? y S I P3 directamente, examinamos la interacción de ligante-receptor asociada con los receptores S1 P? y S 1 P3 por medio de un ensayo de unión de receptor utilizando [32P]S 1 P en competencia con S1P y VPC23019. El análisis de S1P en el ensayo de unión de radioligando (Figura 4A) produjo valores pK¡ de 8.96 y 8.12 en los receptores S1P? y S1P3, respectivamente. Estos valores son de acuerdo con los valores pKd publicados para la unión de S1P radiomarcado a estos receptores (12-14). El ensayo de radioligando también reveló una excelente correlación entre pK¡ y el pKb para VPC23019 generado del análisis Schild tanto en los receptores S1P? como SIP3, es decir, valores pK¡ de 7.86 y 5.93, respectivamente (Figura 4B y Tabla 2). Finalmente, VPC23019 también se encontró que está provisto de la actividad combatiente en el receptor S1P2 y estudios de unión de radioligando con el receptor S1P2 reveló que VPC23019 no influyó en la unión de [3 P]S1P al receptor S1P2 en concentraciones hasta 10 µM (datos no mostrados). Los valores plC50 son el -logaritmo de la concentración molar de compuesto resultante en 50% de inhibición máxima de unión [32P]S1P. Los valores pK¡ son el-logaritmo de la constante de unión inhibidora (K¡), los cuales se pronostican utilizando la ecuación Chang-Prusoff (K¡=ICso/(1 + [L]/Kb). En la aplicación de está ecuación, la concentración de radioligando (L) es 0.05 nM y el valor Kb utilizado fue aquel reportado para la interacción de receptor S1P-S1P?, es decir, 8.1 nM (12). Las constantes de unión (pKb) se calcularon del análisis Schild modificado de Lew y Angus (9). Los valores pK¡ y pKb se reportan como pK¡ + S.E.M. y pKb +. S.E.M., respectivamente.

Tabla 2: Afinidad de Antagonista en los receptores S1 P . y S1 P3. fue competitivo.

Eiemplo 11. Lo siguiente ilustran las formas de dosis farmacéutica representativas, conteniendo un compuesto de la fórmula I (por ejemplo, Compuesto VPC441 16), para uso terapéutico o profiláctico en humanos. (i) Tableta 1 mg/tableta Compuesto VPC441 16 100.0 Lactosa 77.5 Povidona 15.0 HO-propil beta-ciclodextrina 6.0-10.0 Sodio Croscarmellosa 12.0 Celulosa microcristalina 92.5 Estearato magnesio 3.0 300.0 (ii) Tableta 2 mg/tableta Compuesto VPC44116 20.0 Celulosa microcristalina 410.0 HO-propil beta-ciclodextrina 6.0-10.0 Almidón 50.0 Glicolato de almidón de sodio 15.0 Estearato magnesio 5.0 500.0 (iii) Cápsula mg/cápsula Compuesto VPC44116 10.0 Dióxido de silicio coloidal 1.5 HO-propil beta-ciclodextrina 6.0-10.0 Lactosa 465.5 Almidón pregelatinizado 120.0 Estearato magnesio 3.0 600.0 (iv) Inyección 1 (1 mg/ml) mg/ml Compuesto VPC44116 To HO-propil beta-ciclodextrina 6.0-10.0 Fosfato de sodio dibásico 12.0 Fosfato de sodio monobásico 0.7 Cloruro de sodio 4.5 1.0N de solución de hidróxido de sodio (ajuste pH a 7.0-7.5) q.s. Agua para inyección q.s ad 1 mL (v) I nyección 2 (10 mg/ml) mg/ml Compuesto VPC441 16 (forma de ácido libre) 10.0 Fosfato de sodio monobásico 0.3 Fosfato de sodio dibásico 1 .1 HO-propil beta-ciclodextrina 6.0-10.0 HO-propil beta-ciclodextrina 6.0-10.0 Polietilénglicol 400 200.0 01 N de solución de hidróxido de sodio (ajuste pH a 7.0-7.5) q.s. Agua para inyección q.s. ad 1 mL (vi) Aerosol mg/recipiente Compuesto VPC441 16 20.0 Ácido oleico 10.0 HO-propil beta-ciclodextrina 6.0-10.0 Tricloromonofluorometano 5,000.0 Diclorodifluorometano 10,000.0 Diclorotetrafluoroetano 5,000.0 Las formulaciones anteriores pueden obtenerse por procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica farmacéutica.

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Claims (9)

1. REIVINDICACIONES 1 . Un compuesto teniendo la fórmula (I): (I) en donde X y Y se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno , OH , F, Cl, PO3 y metilo; o X y Y tomados juntos con el átomo al cual se unen forman un grupo ceto; R1 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, halo, tri-fluorometilo, (d-CeJ-alquilo, alq uilo (d-Ce) sustituido con halo, hidroxi, alcoxi, o ciano; R2 se selecciona del grupo que consiste de alquilo (C -C?), alquilo sustituido por cicloalq uilo (C3-C8) , alquenilo (C2-C6), alquinilo (C2-C6) , arilo, arilo sustituido por alquilo, arilalquilo y arilaquilo sustituido por arilo; o un éster farmacéuticamente aceptable del mismo. 2. El compuesto de la reivindicación 1 en donde R2 es orto o meta hacia la amida. 3. El compuesto de las reivindicaciones 1 o 2 en donde R2 es meta hacia la amida. 4. El compuesto de las reivindicaciones 1 -3 en donde X y Y son independientemente flúor o cloro. 5. El compuesto de las reivindicaciones 1 -3 en donde X y Y y el átomo al cual se unen forman un grupo >C=O. 6. El compuesto de las reivindicaciones 1 -5 en donde los grupos alquilo R2 tienen de 5-8 átomos de carbono. 7. El compuesto de las reivindicaciones 1 -6 en donde el compuesto de la fórmula (I) es un éster. 8. El compuesto de las reivindicaciones 1 -7 teniendo la fórmula: El compuesto de la reivindicación 8 teniendo la fórmula : 10. El compuesto de las reivindicaciones 1 -9 en donde el compuesto es una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de la fórmula 1 . 1 1 . El compuesto de las reivindicaciones 1 -9 en donde el compuesto es un éster farmacéuticamente aceptable de un compuesto de la fórmula 1 . 12. El compuesto de la reivindicación 1 1 en donde el grupo éster es metilo, etilo, propilo, bencilo, o tiene la fórmula O I o o 13. El compuesto de la reivindicación 12 teniendo la fórmula: 14. Un compuesto teniendo la fórmula: 1 8. Un método para tratar enfermedades neoplásticas en un paciente en necesidad del mismo comprendiendo la administración de una cantidad anti-angiogénica de un compuesto de las reivi ndicaciones 1 -16. 1 9. Un método para prolongar la supervivencia del transplante de aloinjerto en un paciente en necesidad del mismo comprendiendo la administración de una cantidad eficaz de un compuesto de las reivindicaciones 1 -16. 20. Un método para tratar enfermedades autoinmunes en un paciente en necesidad del mismo comprendiendo la administración de una cantidad eficaz de un compuesto de las reivi ndicaciones 1 -16 para alterar el tráfico de linfocitos y modular el sistema inmune. 21 . Un método para tratar arritmias cardiacas en un paciente en necesidad del mismo comprendiendo la administración de una cantidad eficaz de un compuesto de las reivindicaciones 1 -16. 22. Un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 -16, para utilizarse en terapia médica. 23. El uso de un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 16, para preparar un medicamento. 24. Uso de la reivindicación 23 para preparar un medicamento útil para prolongar la supervivencia del transplante de aloinjerto.