MX2007006347A - Nuevo uso de 5-metil-1-fenil-2-(1h)-piridona para el tratamiento y prevencion de cicatrices hipertroficas, y composicion conteniendo la misma. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con un nuevo uso de 5-metil-1-fenil-1(H)-piridona, para el tratamiento y prevención de la presencia de efectos nocivos en los implantes de mama, tales como son la inflamación, contracción de la cápsula y fibrosis.

Description

NUEVO USO DE 5-METIL-1-FENIL-2- <[1H) -PIRIDONA PARA EL TRATAMIENTO Y PREVENCION DE CICATRICES HI ERTRÓFICAS, Y COMPOSICIÓN CONTENIENDO LA MISMA CAMPO DE LA INVENCIÓ .

La presente invención se relaciona con un nuevo uso y composición farmacéutica de 5-metil-l-fenil-2- ( 1H) -piridona .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La 5-metil-l-fenil- ( 1H) -piridona, de fórmula; CH3 es un fármaco que ha sido aplicado en la restauración de los tejidos con lesiones fibróticas y para la prevención de lesiones fibróticas. Este compuesto, llamado Pirfenidona, es por si mismo un compuesto conocido y sus efectos farmacológicos han sido descritos en, por ejemplo, las solicitudes Japonesas KOKAI Nos. 87677/1974 y 1284338/1976, como un agente anti-inflamatorio que incluye los efectos anti-piréticos y analgésicos. Las patentes de los Estados i Unidos Nos. 3,839,346, publicada el 1 de octubre de 1974, 3,974,281, publicada el 10 de agosto de 1976, 4,042,699, publicada el 16 de agosto de 1977, y 4,052,509, publicada el 4 de octubre de 1977, describen métodos para la obtención de Pirfenidona, asi como su uso como agente antiinflamatorio. En la patente mexicana 182,266 se describe la actividad anti-fibrótica de la 5-metil-l-fenil- ( 1H) -piridona .

Se han descubierto nuevas aplicaciones de Pirfenidona, las cuales son objeto de la presente invención, demostrando que el compuesto tiene actividad en la disminución de los efectos nocivos observados después la implantación quirúrgica de implantes mamarios. La vida moderna se caracteriza especialmente por un culto a la vanidad y a la autoestima en las mujeres. Por esta razón, la cirugía estética es demandada ampliamente en estos tiempos. Una de las modalidades más solicitadas en cirugía estética es sin duda el implante de mama. Aunque cada vez esta clase de cirugía es más segura de realizar, la presencia de efectos indeseados y adversos continúa siendo evidente. Los efectos nocivos observados después de la colocación de los implantes de mama son inflamación, contracción de la cápsula y desarrollo de fibrosis. Diversos materiales han sido probados para disminuir estos efectos indeseables. Los conceptos actuales sobre belleza han aumentado la demanda de la cirugía mamaria con objetivos reconstructivos y de belleza. Sin embargo, a pesar de la gran utilidad de este procedimiento médico, una de las complicaciones mas frecuentes de post-cirugía es la hinchazón y la contracción de la cápsula alrededor del implante. Estas complicaciones causan la malformación, dureza, y dolor en la mama con alteraciones físicas y psicológicas en los pacientes. Las causas y la histopatogénesis de la contracción capsular no se han entendido totalmente. Diversas publicaciones mencionan una incidencia variable desde 0 hasta 74% (1), dependiendo de la implantación del tipo de cubierta del implante, de la textura superficial y del sitio anatómico (2) ( subglandular o subpectoral ) . Las causas de estas complicaciones pueden ser acumulación de líquidos en tejido en el bolsillo del implante, la respuesta inflamatoria intensa, la infección sub-clínica, la edad del paciente, los materiales extraños y la alteración de mecanismos celulares y moleculares en el área de la implantación. Cuando se coloca un implante, el cuerpo reacciona encapsulándolo e iniciando una reacción de rechazo (3.4) con la formación de una cicatriz hipertrófica (5.6) . Esta respuesta inmunológica produce citocinas y factores de crecimiento como IL-1, IL-6, TNF-a, PDGF y TGF-ß? (7, 8) . Se ha reportado la presencia de miofibroblas os en la estructura de la cápsula con la producción de a-SMA (actina de músculo liso alfa) , donde las cápsulas más seriamente deformes tienen una producción más alta de a-SMA que sugiere un papel directo de los miofibroblastos activados en el desarrollo de la contracción (8) . También se ha demostrado que el número de los miofibroblastos presentes en el tejido es proporcional al grueso de la contracción (9) . En un informe anterior usando ratas wistar, previa instilación del bolsillo del implante, estos se trataron con sulfonato de sodio de 2-Mercaptoetano (Mesna) y Mitomycin C con lo cual se redujo el grueso de la cápsula, el número de f ibroblastos y el depósito de colágena (10) . Para reducir la activación de los fibroblastos y la contracción de la herida, se ha utilizado la infiltración de esferoides en la herida y en el interior de los implantes con complicaciones de menor importancia. Estas complicaciones se presentan como piel delgada, atrofia del tejido fino, estratificación, piel azul y la exposición del implante. Por otra parte, se han encontrado nuevas drogas anti fibróticas , entre ellas la Pirfenidona (5 metil-1-fenil-2-(lH) piridona) (PFD) , la cual es un nuevo agente anti-fibrótico, que ha demostrado ser eficaz en prevenir la formación de fibrosis, tanto in vitro como in vivo. Inhibe la fibrosis del pulmón (20) , la adherencia peritoneal (21), la cirrosis del higado (22), los fibromiomas uterinos (23), la fibrosis del riñon (24), cicatrices queloide y en el desarrollo de tumor en sistema nervioso central. La Pirfenidona puede también inhibir FGF, FDP y TGF-ß en el fibroblasto humano bloqueando la fase Gl del ciclo celular. Puesto que el implante mamario induce fibrosis e inflamación, considerando que Pirfenidona ha demostrado poseer características anti-fibróticas y antiinflamatorias, en la presente invención se propuso demostrar el efecto de la Pirfenidona en la cicatriz y contracción capsular en implante mamario en un modelo animal de ratas. Así las cosas, el uso de Pirfenidona durante cuatro y ocho semanas después de colocado el implante de silicón, demostró una disminución en la activación del fibroblasto, del depósito de colágena y de la expresión de genes pro-fibrogénicos permitiéndonos proponer a la Pirfenidona como una droga eficaz contra los efectos nocivos de los implantes de pecho, con lo cual se asegura el éxito de esta clase de cirugías.

OBJETO DE LA INVENCIÓN Es un objeto de la presente invención describir un nuevo uso de pirfenidona para el tratamiento y prevención de la presencia de efectos nocivos en los implantes de mama, tales como son la inflamación, contracción de la cápsula y fibrosis. Un segundo objeto de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica cuyo componente activo es Pirfenidona, como agente activo en el tratamiento y prevención de la presencia de efectos nocivos en los implantes de mama, tales como son la inflamación, contracción de la cápsula y fibrosis. También, es nuestro objetivo demostrar las propiedades farmacológicas de una composición farmacéutica de Pirfenidona, para las complicaciones después de implantes de mama, tales como son la inflamación, contracción de la cápsula y fibrosis.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 ilustra la colocación del implante en el pecho; A) implantes liso y texturizado; B) selección de la glándula mamaria; C) incisión subglandular ; D) colocación del implante. La figura 2 ilustra una vista macroscópica de los implantes en el pecho mostrando un incremento en la cápsula y opacidad en los animales control sin diferencias entre los implantes liso y texturizado y entre las 4 y 8 semanas: A) implante liso en los animales control a las 4 semanas; B) implante texturizado en los animales control a las 4 semanas; . C) implante liso en los animales control a las 8 semanas; D) implante texturizado en los animales control a las 8 semanas. El tratamiento con PFD reduce el grueso de la capsula alrededor del tejido submamario sin diferencias entre los implantes liso y texturizado y en 4 y 8 semanas. E) implante liso tratado a las 4 semanas; F) implante texturizado tratado con a las 4 semanas; G) implante liso tratado a las 8 semanas; H) implante texturizado tratado con a las 8 semanas; La Figura 3A, muestra la tinción con Hematoxilina-eosina de los tejidos después del posicionamiento de los implantes de silicón. El grupo control presentó una infiltración abundante de células mononucleares y de células fibroblásticas . En los animales tratados con PFD se observó un número menor de células fibroblásticas y una infiltración disminuida de células inflamatorias. a) Implantes lisos en ratas control b) Implante texturizado en ratas control c) Implantes lisos en ratas tratadas con PFD, d) Implantes texturizados en ratas tratadas con PFD. La figura 3B muestra los resultados cuantitativos. En la Figura 4A se muestra la tinción tricrómica de Masson de tejido de glándula mamaria de animales controles y tratados con PFD. El contenido total de colágena en el tejido de las ratas tratadas con PFD fue 50% menos con respecto al grupo de ratas control tratadas con solución salina, a) Implantes lisos en ratas control b) Implante texturizado en ratas control c) Implantes lisos en ratas tratadas con PFD, d) Implantes texturizados en ratas tratadas con PFD. La figura 4B muestra los resultados cuantitativamente . La Figura 5 muestra: a) Inmunohistoquimica con un anticuerpo anti-cx-sma (actina de músculo liso alfa) en múltiples secciones de tejido de glándula mamaria. A) Implantes lisos en ratas control; B) Implante texturizado en ratas control; C) Implantes lisos en ratas tratadas con PFD; D) Implantes texturizados en ratas tratadas con PFD; y b) Análisis cuantitativo de las secciones de tejido mostradas en el Panel a. En la Figura 6 se muestran: A) PCR en tiempo real para el gen de TGF-ß en animales control y tratados con PFD. Barras blancas: grupo control. Barras negras: animales tratados con PFD (p< 0.05); y B) PCR en tiempo real para el gen de colágena I en animales control y tratados con PFD. Barras blancas: grupo control. Barras negras: animales tratados con PFD (p< 0.05).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En este estudio probamos dos diferentes texturas de implantes, liso y texturizado en un periodo comprendido entre cuatro y ocho semanas en un modelo animal de ratas. Después del análisis histológico, no se observaron ninguna diferencia entre los dos materiales. El estudio no demostró ninguna diferencia significativa en la contracción entre estos dos diferentes implantes aunque la mayoría de las pacientes prefirió los implantes lisos (30) . Aunque nuevos materiales se están introduciendo continuamente para los implantes de mama, el riesgo de efectos nocivos ha sido difícil de evitar. Por esta razón, varias drogas se han estado utilizando para disminuir las complicaciones de la post-cirugía . La Pirfenidona (PFD) es una nueva droga con características anti-inflamatorias y anti-fibróticas , demostrando que puede prevenir la contracción y la inflamación del implante con buenos resultados. Con la administración de PFD seguida a la implantación mamaria y durante todo el experimento, podemos prevenir la inflamación, la contracción y el grueso de la cápsula. PFD también demostró que reduce la expresión de agentes que favorecen la fibrogénesis como la colágena y el TGF-ß entre el 85¾ y el 60% respectivamente. Estos resultados están en concordancia con el efecto de PFD en otras enfermedades fibróticas divulgadas por otros autores y por nosotros, donde PFD inhibió la expresión de TGF-ß? y de colágena e índice reducido de la fibrosis en el 70%. Musters observó la proliferación de células mamarias estromales en la glándula mamaria tratada con TGF-ß? a las 4 y 22 horas después de la implantación de la pelotilla del implante que sugería un efecto de TGF en la proliferación de las células productoras de colágena (S. Musters y otros. American Dairy Science Association 2004) . Por la técnica de Inmunohistoquímica con el anticuerpo contra a-SMA detectamos la baja proliferación de fibroblastos con la administración de PFD que sugería su efecto anti-fibrotico vía la inhibición de la proliferación/activación de fibroblastos. Nuestros resultados demuestran un efecto anti-fibrótico y anti-inflamatorio de PFD, administrado en dosis de 200 a 400 mg/Kg de peso corporal, en los implantes de cirugía a los divulgados previamente por otros investigadores en varias enfermedades fibrogénicas que demuestran el alto potencial como droga preventiva de la fibrosis en implante mamario. Los resultados aquí obtenidos nos permiten proponer el uso de PFD en cirugía de implante post-mamario y así prevenir los efectos nocivos indeseables . ANIMALES y MÉTODOS Veinte ratas wistar femeninas fueron usadas en este estudio, obtenidas de Charles Rivers Inc., con un peso de aproximadamente 250g cada una y tratadas según los principios y procedimientos de la "GUÍA DEL INSTITUTO NACIONAL DE LA A SALUD PARA EL CUIDADO Y USO DE LOS ANIMALES DE LABORATORIO". Las ratas fueron divididas en dos grupos de diez ratas cada uno y se les implantaron implantes submamarios de gel de silicón lisos y texturizados a cada uno (NAGOR GFX) . A un grupo de animales le fue administrado en dosis de 200 a 400 mg/Kg de peso corporal, de pirfenidona en lml de solución por día, vía oral iniciando el día de la cirugía. Se administraron el mismo volumen de vehículo al otro grupo como grupo de control. Cinco animales de cada grupo fueron sacrificados a las 4 semanas y cinco animales a las 8 semanas. El te ido fino capsular de ambos implantes fue retirado y almacenado adecuadamente para el análisis histológico y molecular posterior . PROCEDIMIENTO QUIRÚRGICO Las ratas fueron anestesiadas administrando O.lcc/lOOg por peso de una mezcla de Droperidol y Ketamine vía intramuscular. La incisión paramediana abdominal fue hecha al lado de las glándulas mamarias y los bolsillos submamarios fueron cortados. Un implante liso fue insertado en el lado derecho mientras que el texturizado fue colocado en el lado izquierdo. Ambas incisiones fueron cerradas con 3 suturas de hilo de seda. Después de la cirugía, a los animales se les dejó recuperarse de la anestesia de manera natural .

ANÁLISIS HISTOLÓGICO (H-E) Para la evaluación histológica, el tejido fue fijado en formaldehído en solución buffer de una solución de fosfato (0.1M, pH 7.4 ) a temperatura ambiente. Secciones de 4 µp? de grosor fueron obtenidas y las laminillas fueron teñidas con Hematoxilina-eosina . La evaluación histológica fue determinada usando un analizador de imagen automatizado auxiliado por computadora (Image-Pro Plus 4.0 Media Cybernetics Inc., MD, E.E.U.U.) analizando diez áreas de campos seleccionados al azar por laminilla con la ampliación 200X del microscopio.

DETERMINACIÓN del ÍNDICE de FIBROSIS Las secciones capsulares de tejido fueron fijadas inmediatamente por inmersión en para-formaldehído diluido al 10%, en un buffer salino de fosfato (PBS) , deshidratado en alcohol etílico destilado y embebido en parafina. Las secciones (5µp? de grueso) fueron teñidas con tricrómico de Masson. En estas laminillas el porcentaje de tejido capsular afectado por fibrosis fue determinado usando un analizador de imagen automatizado auxiliado por computadora (Image Pro-Plus) analizando 15 campos al azar por laminilla y calculando el cociente de tejido conectivo al área total de la cápsula (26) .

INMUNOHISTOQUIMICA Las secciones inmunohistoquímicas capsulares de tejido fino fueron montadas en laminillas cubiertas con silano y desparafinadas . La actividad endógena de la peroxidase fue interrumpida con H?0? al 3% en metanol absoluto. Estas laminillas fueron incubadas toda la noche a temperatura ambiente con anticuerpos monoclonales de ratón contra actina- de músculo liso alfa (Boeringer Manheim, Alemania) . El anticuerpo fue detectado con anticuerpos etiquetados de peroxidasa policlonal de conejo contra las inmunoglobulinas de ratón, la tinción con diaminobenzidina y contrastada con Hematoxilina . Para el análisis de cuantificación, diez campos al azar fueron evaluados en ampliación 400X. Las células positivas y negativas de Inmunohistoquimica fueron contadas por un analizador de imagen automatizado (Image Pro-Plus) y los datos expresados como porcentaje de células positivas.

EXTRACCIÓN DE ARN TOTAL El aislamiento de ARN total del hígado de la rata fue realizado según el método modificado descrito por Chomczynski y otros (27) . Brevemente, el tejido fino mamario fue obtenido y homogeneizado usando un sistema de Polytron (Brinkmann, Suiza) en presencia de Trizol (Invitrogen) . Se agregó cloroformo, la fase acuosa fue obtenida y el RNA fue precipitado con isopropanol a 4°C durante la noche. La cantidad y el RNA intacto fueron determinados por absorbancia a 260/280 y por fluorescencia de bromuro de etidio en electroforesis de RNA en geles de azarosa al 10 por ciento.

RETROTRANSCRIPCION Dos microgramos del RNA extraído de todas las muestras fue agregado a 240 ng de primers al azar, 5mM DTT, mezcla de dNTP ImM, 40 unidades de NAsa libre de inhibidor, 200 unidades de RT- MMLV e incubado por 10 minutos a 25°C, durante 60 minutos a 37ÜC y 10 minutos a 95°C. Después de la incubación las muestras fueron almacenadas a 70°C hasta que la reacción de PCR en tiempo real se llevó a cabo.

PCR EN TIEMPO REAL La reacción de PCR en tiempo real fue realizada usando un detector de secuencia de genes RG 3000 de rotor (Corbett Research, Sydney Australia) bajo las condiciones siguientes: 1 ciclo de 50°C por 2 minutos, 1 ciclo a 95°C por 10 minutos y 40 ciclos a 95°C por 30 segundos y a 60°C por 40 segundos. La reacción total fue hecha en 10 uM que contenia 2 µ? de DNA, del IX de mezcla universal maestra de PCR (Biosistemas Aplicados) y del IX de la concentración final del primer y de la prueba de TaqMan experimental, controlando los genes sintetizados por Biosistemas Aplicados. Tiempo real múltiplex de PCR para el colágeno ?ß y TGF-ß? fueron realizados por duplicado para cada animal usando GAPDH como gene constitutivo. El análisis de datos fue realizado según el boletín número 2 del Usuario de los Biosistemas Aplicados (28) . Usando software para la detección de la secuencia calculamos el ciclo de umbral (Ct) para cada reacción que se utiliza para cuantificar la cantidad de reacción de la plantilla inicial. Una diferencia en los valores de Ct se calculó para cada gene por duplicado. La cantidad del gene blanco fue normalizada contra el gene constitutivo GAPDH.

ANÁLISIS ESTADÍSTICOS Los resultados se expresan como desviación media estándar ±. La prueba t de Student fue utilizada. P<0.05 fue considerada para indicar una diferencia significativa entre los grupos.

RESULTADOS En este trabajo, colocamos implantes de silicón submamarios en el pecho de ratas wistar femeninas, para evaluar el efecto de la pirfenidona en el desarrollo de la contracción y de la fibrosis después de cuatro y ocho semanas de tratamiento con pirfenidona (Fig 1) . Después de 4 semanas con el implante los animales presentaron una cápsula aumentada alrededor del implante con el aumento de la opacidad en los tejidos adyacentes que impedia visualizar la morfología del tejido. Ninguna diferencia significativa se observó entre los implantes texturizado y liso ni tampoco entre 4 y 8 semanas después de que el implante de silicón se colocó (Fig 2A-D) . Sin embargo, la pirfenidona indujo una reducción importante en el grueso de la cápsula alrededor del tejido submamario, sin diferencia entre los implantes texturizados y lisos y entre 4 y 8 semanas (Fig. 2 E-H) . Los fibroblastos en el grupo de animales tratados con pirfenidona fueron disminuidos, así como la proliferación de las células y el restablecimiento de las células inflamatorias en contraste con el grupo de control donde observamos la infiltración mononuclear abundante de las células y fibroblastos así como la proliferación de las células. Las células totales contadas por campo fueron reducidas dramáticamente cuando los animales fueron tratados con Pirfenidona (Fig. 3A-H) . El contenido total de colágena observado cuando el tejido se tiñe con tricromo de Masson en el grupo de Pirfenidona era del 50% menos respecto al grupo de control sin PFD, donde podemos observar fibras gruesas e irregulares de colágena sin vascularización. Una vez más no observamos diferencia en el contenido de colágena cuando comparamos respecto al implante liso y el implante texturizado y entre 4 y 8 semanas (Fig. 4A-H) . Luego, buscamos por el número de células f ibroblasticas productoras de colágena. Encontramos escasos fibroblastos con fenotipo activado en los animales tratados con Pirfenidona, los cuales disminuían alrededor del 45% comparado con los animales no tratados sin diferencia entre los implantes lisos y texturizados (p<0.05) . Además, en los animales no tratados con PFD, la enorme mayoría de las células fibroblásticas presentaron un fenotipo activado (Figura 5) .

En la Figura 6 se muestran una serie de experimentos basados en el PCR de tiempo real a las 4 semanas para los dos grupos de animales, para conocer el efecto de PFD sobre la expresión de genes claves involucrados en la fibrogenesis . La expresión del gen TGF-ß en las ratas tratadas con PFD disminuyó significativamente en 85% (P<0.05) comparado con el grupo control (n=3) . El gen de Colágena I decreció 60% en los animales tratados con PFD respecto a los animales no tratados (p<0.05) .

Claims (4)

REIVINDICACIONES

1.- El uso de pirfenidona para la fabricación de un medicamento, en donde dicho medicamento comprende de aproximadamente 200 a 400 mg de pirfenidona/Kg de peso corporal y un portador farmacéuticamente aceptable para su administración oral, caracterizado además porque el medicamento disminuye y previene la presencia de efectos nocivos en los implantes de mama, tales como son la inflamación, contracción de la cápsula y fibrosis.

2.- El uso de pirfenidona para la fabricación de un medicamento según la reivindicación 1, en donde dicho medicamento reduce la expresión de agentes que favorecen la fibrogenesis como colágena I y el TGF-ß entre el 85% y el 60% respectivamente.

3.- El uso de pirfenidona para la fabricación de un medicamento según la reivindicación 1, en donde dicho medicamento está en forma de una dosis unitaria que se administra al paciente al menos a partir del día de la cirugía de implantación.

4.- El uso de pirfenidona para la fabricación de un medicamento según la reivindicación 1, en donde dicho medicamento se encuentra en forma de dosis oral sólida o líquida .