WO2008147168A1 - Uso de la 5-metil-l-fenil-2-(lh)-piridona para el tratamiento de los efectos nocivos, inflamación, contracción de la cápsula y fibrosis, que acompañan a los implantes de mama. - Google Patents
Uso de la 5-metil-l-fenil-2-(lh)-piridona para el tratamiento de los efectos nocivos, inflamación, contracción de la cápsula y fibrosis, que acompañan a los implantes de mama. Download PDFInfo
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Definitions
- the present invention relates to a new use and pharmaceutical composition of 5-methyl-l-phenyl-2- (IH) -pyridone-
- Pirfenidone is itself a known compound and its pharmacological effects have been described in, for example, Japanese applications KOKAI Nos. 87677/1974 and 1284338/1976, as an anti-inflammatory agent that includes anti-inflammatory effects.
- -Pyretic and analgesic The Dnidos States patents Nos. 3,839,346, published on October 1, 1974, 3,974,281, published on August 10, 1976, 4,042,699, published on August 16, 1977, and 4,052,509, published on October 4, 1977, describe methods to obtain Pirfenidone, as well as its use as an anti-inflammatory agent.
- Mexican patent 182,266 describes the anti-fibrotic activity of S-methyl-l-phenyl- ⁇ lH) -pyridone.
- the causes of these complications may be fluid accumulation in tissue in the implant pocket, intense inflammatory response, sub-clinical infection, patient age, foreign materials and alteration of cellular and molecular mechanisms in the area of the implantation.
- the body reacts by encapsulating it and initiating a rejection reaction ⁇ 3.4 ⁇ with the formation of a hypertrophic scar (5.6).
- This immune response produces cytokines and growth factors such as IL-I, IL-6, TNF- ⁇ , PDGF and TGF- ⁇ 1 (7, 8).
- Pirfenidone (5 methyl-1- phenyl-2- (lH) pyridone) (PFD), which is a new anti-fibrotic agent, which has proven effective in prevent fibrosis formation, both in vitro and in vivo. Inhibits lung fibrosis (20), peritoneal adhesion (21), liver cirrhosis (22), uterine fibromiomas (23), kidney fibrosis (24), keloid scars and tumor development in the nervous system central. Pirfenidone can also inhibit FGF, FDP and TGF- ⁇ in human fibroblast by blocking the Gl phase of the cell cycle.
- a second object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition whose active component is Pirfenidone, as an active agent in the treatment and prevention of the presence of harmful effects in breast implants, such as inflammation, capsule contraction and fibrosis.
- Pirfenidone active component
- it is our objective to demonstrate the pharmacological properties of a pharmaceutical composition of Pirfenidone, for complications after breast implants, such as inflammation, capsule contraction and fibrosis.
- Figure 1 illustrates the placement of the implant in the chest; A) smooth and textured implants; B) mammary gland selection; C) subglandular incision; D) implant placement.
- Figure 2 illustrates a macroscopic view of the breast implants showing an increase in the capsule and opacity in the control animals without differences between the smooth and textured implants and between 4 and 8 weeks: A) smooth implant in the control animals the 4 weeks; B) textured implant in control animals at 4 weeks; . C) smooth implant in control animals at 8 weeks; D) Textured implant in control animals at 8 weeks.
- the PFD treatment reduces the thickness of the capsule around the submammary tissue without differences between the smooth and textured implants and in 4 and 8 weeks.
- Figures 3 and 3 ' show the staining with Hematoxylin-eosin of the tissues after the positioning of the silicone implants.
- the control group presented an abundant infiltration of mononuclear cells and xibroblast cells. In animals treated with PFD, a smaller number of fibroblast cells and a decreased infiltration of inflammatory cells were observed, a) Smooth implants in control rats' b) Textured implant in control rats " c) Smooth implants in rats treated with PFD, d) Textured implants in rats treated with PFD.
- Figure 5 shows: A) Innmnohistochemistry with an anti- ⁇ -sma (alpha smooth muscle actin) antibody in multiple sections of mammary gland tissue, a) Smooth implants in control rats b) Textured implant in control rats c) Smooth implants in rats treated with PFD, d) Textured implants in rats treated with PFD; and B) Quantitative analysis of the tissue sections shown in Panel A ..
- Twenty female wistar rats were used in this study, obtained from Charles Rivers Inc., weighing approximately 25Og each and treated according to the principles and procedures of the "GUIDE OF THE NATIONAL INSTITUTE OF IA TO HEALTH FOR THE CARE AND USE OF LABORATORY ANIMALS ".
- the rats were divided into two groups of ten rats each and smooth and textured silicone breast submammary implants were implanted in each one (NAGOR GFX).
- a group of animals was administered in doses of 200 to 400 mg / kg body weight, of pirfenidone in ImI of solution per day, orally starting the day of surgery. The same vehicle volume was administered to the other group as a control group.
- Five animals from each group were sacrificed at 4 weeks and five animals at 8 weeks. The capsular tissue of both implants was removed and stored properly for subsequent histological and molecular analysis.
- the rats were anesthetized by administering O.lcc / lOOg by weight of a mixture of Droperidol and Ketamine intramuscularly.
- the abdominal paramediate incision was made next to the mammary glands and the submammary pockets were cut.
- a smooth implant was inserted on the right side while the textured was placed on the left side. Both incisions were closed with 3 sutures of silk thread. After surgery, the animals were allowed to recover from anesthesia naturally.
- the tissue was fixed in formaldehyde in buffer solution of a phosphate solution (0.1M, pH 7.4) at room temperature. Sections 4 ⁇ m thick were obtained and the lamellae were stained with Hematoxylin-eosin. Histological evaluation was determined using a computer-aided automated image analyzer (Image-Pro Plus 4.0 Media Cybernetics Inc., MD, USA) by analyzing ten randomly selected areas of fields per lamella with the 200X magnification of the microscope.
- a computer-aided automated image analyzer Image-Pro Plus 4.0 Media Cybernetics Inc., MD, USA
- the capsular immunohistochemical sections of tissue were mounted on silane-coated lamellae and dewaxed.
- the endogenous peroxidase activity was interrupted with 3% H2O2 in absolute methanol.
- These lamellae were incubated overnight at room temperature with mouse monoclonal antibodies against alpha smooth muscle actin- (Boeringer Manheim, Germany).
- the antibody was detected with antibodies labeled rabbit polyclonal peroxidase against mouse immunoglobulins, staining with diaminobenzidine and contrasted with Hematoxylin.
- ten random fields were evaluated in 400X magnification.
- the positive and negative Immunohistochemical cells were counted by an automated image analyzer (Image Pro-Plus) and the data expressed as a percentage of positive cells.
- RNA extracted from all samples was added to 240 ng of random primers, 5mM DTT, mixture of dMTP ImM, 40 units of inhibitor-free RNAse, 200 units of RT-MMLV and incubated for 10 minutes at 25 ° C, for 60 minutes at 37 ° C and 10 minutes at 95 0 C. After incubation the samples were stored at 70 0 C until the PCR reaction in real time was done.
- REAL-TIME PCR The real-time PCR reaction was performed using a rotor RG 3000 gene sequence detector. (Corbett Research, Sydney Australia) under the following conditions: 1 cycle of 50 0 C for 2 minutes, 1 cycle at 95 0 C for 10 minutes and 40 cycles at 95 ° C for 30 seconds and 60 0 C for 40 seconds. The total reaction was done in 10 ⁇ M containing 2 ⁇ l of DNA, IX of the universal master PCR mix (Applied Biosystems) and IX of the final concentration of the first and the experimental TaqMan test, controlling the genes synthesized by Biosystems Applied Real time multiplex PCR for collagen i ⁇ and TGF- ⁇ l were performed in duplicate for each animal using GAPDH as the constitutive gene.
- the data analysis was performed according to the bulletin number 2 of the user of the Applied Biosystems (28). Using software for sequence detection we calculate the threshold cycle (Ct) for each reaction that is used to quantify the reaction amount of the initial template. A difference in Ct values was calculated for each gene in duplicate. The amount of the white gene was normalized against the constitutive gene GAPDH.
- Ct threshold cycle
- the fibroblasts in the group of animals treated with pirfenidone were decreased, as well as the proliferation of the cells and the reestablishment of the inflammatory cells in contrast to the control group where we observed the abundant mononuclear infiltration of the cells and fibroblasts as well as the proliferation of the cells.
- Total cells counted per field were dramatically reduced when the animals were treated with Pirfenidone (Fig. 3A-H).
- the total collagen content observed when the tissue was stained with Masson's trichrome in the Pirfenidone group was 50% less compared to the control group without PFD, where we can observe thick and irregular collagen fibers without vascularization. Again, we do not observe a difference in the collagen content when we compare with respect to the smooth implant and the textured implant and between 4 and 8 weeks (Fig. 4A-
- FIG. 6 shows a series of experiments based on real-time PCR at 4 weeks for the two groups of animals, to know the effect of PFD on the expression of key genes involved in fibrogenesis.
- the Collagen I gene decreased 60% in animals treated with PFD compared to untreated animals (p ⁇ 0.05).
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Abstract
La presente invención se relaciona con un nuevo uso de 5-metil-1-fenil-1 (H)-piridona, para el tratamiento y prevención de la presencia de efectos nocivos en los implantes de mama, tales como son la inflamación, contracción de la cápsula y fibrosis.
Description
Uso de la 5-metil-l-fenil-2-(lH)-piridona para el tratamiento de los efectos nocivos, inflamación, contracción de la cápsula y fibrosis, que acompañan a los implantes de mama.
CAMPO DE LA INVENCIÓN.
La presente invención se relaciona con un nuevo uso y composición farmacéutica de 5-metil-l-fenil-2- (IH) - piridona-
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La S-metil-l-fenil-ílHJ-piridona, de fórmula;
es un fármaco que ha sido aplicado en la restauración de los tejidos con lesiones fibróticas y para la prevención de lesiones fibróticas. Este compuesto, llamado Pirfenidona, es por si mismo un compuesto conocido y sus efectos farmacológicos han sido descritos en, por ejemplo, las solicitudes Japonesas KOKAI Nos. 87677/1974 y 1284338/1976, como un agente anti-inflamatorio que incluye los efectos anti-piréticos y analgésicos. Las
patentes de los Estados Dnidos Nos. 3,839,346, publicada el 1 de octubre de 1974, 3,974,281, publicada el 10 de agosto de 1976, 4,042,699, publicada el 16 de agosto de 1977, y 4,052,509, publicada el 4 de octubre de 1977, describen métodos para la obtención de Pirfenidona, asi como su uso como agente anti-inflamatorio. En la patente mexicana 182,266 se describe la actividad anti-fibrótica de la S-metil-l-fenil-{lH)-piridona.
Se han descubierto nuevas aplicaciones de pirfenidona, las cuales son objeto de la presente invención, demostrando que el compuesto tiene actividad en la disminución de los efectos nocivos observados después la implantación quirúrgica de implantes mamarios.
La vida moderna se caracteriza especialmente por un culto a la vanidad y a la autoestima en las mujeres. Por esta razón, la cirugía estética es demandada ampliamente en estos tiempos, una de las modalidades más solicitadas en cirugía estética es sin duda el implante de mama . Aunque cada vez esta clase de cirugía es más segura de realizar, la presencia de efectos indeseados y adversos continúa siendo evidente. Los efectos nocivos observados después de la colocación de los implantes de mama son inflamación, contracción de la cápsula y desarrollo de fibrosis. Diversos materiales han sido probados para disminuir estos efectos indeseables.
Los conceptos actuales sobre belleza han aumentado la demanda de la cirugía mamaria con objetivos reconstructivos y de belleza. Sin embargo, a pesar de la
gran utilidad de este procedimiento médico, una de las complicaciones mas frecuentes de post-cirugia es la hinchazón y la contracción de la cápsula alrededor del implante. Estas complicaciones causan la malformación, dureza, y dolor en la mama con alteraciones físicas y psicológicas en los pacientes. Las causas y la histopatogénesis de la contracción capsular no se han entendido totalmente- Diversas publicaciones mencionan una incidencia variable desde 0 hasta 74% (1) , dependiendo de la implantación del tipo de cubierta del xmplante, de la textura superficial y del sitio anatómico (2) (subglandular o subpectoral) . Las causas de estas complicaciones pueden ser acumulación de líquidos en tejido en el bolsillo del implante, la respuesta inflamatoria intensa, la infección sub- clinica, la edad del paciente, los materiales extraños y la alteración de mecanismos celulares y moleculares en el área de la implantación. Cuando se coloca un implante, el cuerpo reacciona encapsulándolo e iniciando una reacción de rechazo {3.4} con la formación de una cicatriz hipertrófica (5.6). Esta respuesta inmunológica produce citocinas y factores de crecimiento como IL-I, IL-6, TNF-α, PDGF y TGF-βl (7, 8) . Se ha reportado la presencia de miofibroblastos en la estructura de la capsula con la producción de α-SMA (actina de músculo liso alfa), donde las cápsulas más seriamente deformes tienen una producción más alta de α-SMA que sugiere un papel directo de los miofibroblastos activados en el desarrollo de la contracción (8) . También se ha demostrado que el número de los miofibroblastos
presentes en el tejido es proporcional al grueso de la contracción (9) . En un informe anterior usando ratas wistar, previa instilación del bolsillo del implante, estos se trataron con sulfonato de sodio de 2- Mercaptoetano (Mesna) y Mitoπtycin C con lo cual se redujo el grueso de la cápsula, el número de fibroblastos y el depósito de colágena (10) . Para reducir la activación de ios fibroblastos y la contracción de la herida, se ha utilizado la infiltración de esteroides en la herida y en el interior de los implantes con complicaciones de menor importancia. Estas complicaciones se presentan como piel delgada, atrofia del tejido fino, estratificación, piel azul y la exposición del implante.
Por otra parte, se han encontrado nuevas drogas antifibróticas, entre ellas la Pirfenidona (5 metil-1- fenil-2-(lH) piridona) (PFD), la cual es un nuevo agente anti-fibrótico, que ha demostrado ser eficaz en prevenir la formación de fibrosis, tanto in vitro como in vivo. Inhibe la fibrosis del pulmón (20) , la adherencia peritoneal (21) , la cirrosis del higado (22) , los fibromiomas uterinos (23) , la fibrosis del riñon (24) , cicatrices queloide y en el desarrollo de tumor en sistema nervioso central. La Pirfenidona puede también inhibir FGF, FDP y TGF-β en el fibroblasto humano bloqueando la fase Gl del ciclo celular. Puesto que el implante mamario induce fibrosis e inflamación, considerando que Pirfenidona ha demostrado poseer características anti-fibroticas y anti-infiamatorias, en la presente invención se propuso demostrar el efecto de
la Pirfenidona en la cicatriz y contracción capsular en implante mamario en un modelo animal de ratas. Asi las cosas, el uso de Pirfenidona durante cuatro y ocho semanas después de colocado el implante de silicón, demostró una disminución en la activación del fibroblasto, del depósito de colágena y de la expresión de genes pro-fibrogénicos permitiéndonos proponer a la Pirfenidona como una droga eficaz contra los efectos nocivos de los implantes de pecho, con lo cual se asegura el éxito de esta clase de cirugias.
OBJETO DE LA INVENCIÓN
Es un objeto de la presente invención describir un nuevo uso de pirfenidona para el tratamiento y prevención de la presencia de efectos nocivos en los implantes de mama, tales como son la inflamación, contracción de la cápsula y fibrσsis. ün segundo objeto de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica cuyo componente activo es Pirfenidona, como agente activo en el tratamiento y prevención de la presencia de efectos nocivos en los implantes de mama, tales como son la inflamación, contracción de la cápsula y fibrosis. También, es nuestro objetivo demostrar las propiedades farmacológicas de una composición farmacéutica de Pirfenidona, para las complicaciones después de implantes de mama, tales como son la inflamación, contracción de la cápsula y fibrosis .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La figura 1 ilustra la colocación del implante en el pecho; A) implantes liso y texturizado; B) selección de la glándula mamaria; C) incisión subglandular; D) colocación del implante.
La figura 2 ilustra una vista macroscópica de los implantes en el pecho mostrando un incremento en la cápsula y opacidad en ios animales control sin diferencias entre ios implantes liso y texturizado y entre las 4 y 8 semanas: A) implante liso en los animales control a las 4 semanas; B) implante texturizado en los animales control a las 4 semanas; . C) implante liso en los animales control a las 8 semanas; D) implante texturi∑ado en los animales control a las 8 semanas. El tratamiento con PFD reduce el grueso de la capsula alrededor del tejido submamario sin diferencias entre los implantes liso y texturizado y en 4 y 8 semanas. E) implante liso tratado a las 4 semanas; F) implante texturizado tratado con a las 4 semanas; G) implante liso tratado a las 8 semanas; H) implante texturizado tratado con a las 8 semanas;
Las Figuras 3 y 3' , muestra la tinción con Hematoxilina-eosina de los tejidos después del posicionamiento de los implantes de silicón. El grupo control presentó una infiltración abundante de células mononucleares y de células xibroblásticas. En los animales tratados con PFD se observó un número menor de células fibroblásticas y una infiltración disminuida de células inflamatorias, a) Implantes lisos en ratas control' b) Implante texturizado en ratas control"
c) Implantes lisos en ratas tratadas con PFD, d) Implantes texturizados en ratas tratadas con PFD.
En las Figuras 4 y 4' , se muestra la tinción tricrómica de Masson de tejido de glándula mamaria de animales controles y tratados con PFD. El contenido total de colágena en el tejido de las ratas tratadas con PFD fue 50% menos con respecto al grupo de ratas control tratadas con solución salina. a> Implantes lisos en ratas control b) Implante texturizado en ratas control c) Implantes lisos en ratas tratadas con PFD, d) Implantes texturizados en ratas tratadas con PFD.
La Figura 5 muestra: A) Innmnohistoquimica con un anticuerpo anti-α-sma (actina de músculo liso alfa) en múltiples secciones de tejido de glándula mamaria, a) Implantes lisos en ratas control b) Implante texturizado en ratas control c) Implantes lisos en ratas tratadas con PFD, d) Implantes texturizados en ratas tratadas con PFD; y B) Análisis cuantitativo de las secciones de tejido mostradas en el Panel A.. En las Figuras 6 y 6' se muestran: A) PCR en tiempo real para el gen de TGF-β en animales control y tratados con PFD. Barras blancas: grupo control. Barras negras: animales tratados con PFD (p< 0.05); y B) PCR en tiempo real para el gen de colágena I en animales control y tratados con PFD. Barras blancas: grupo control. Barras negras: animales tratados con PFD (p< 0.05) .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
En este estudio probamos dos diferentes texturas de
implantes, liso y texturizado en un periodo comprendido entre cuatro y ocho semanas en un modelo animal de ratas. Después del análisis histológico, no se observaron ninguna diferencia entre los dos materiales . El estudio no demostró ninguna diferencia significativa en la contracción entre estos dos diferentes implantes aunque la mayoría de las pacientes prefirió los implantes lisos (30) . Aunque nuevos materiales se están introduciendo continuamente para los implantes de mama, el riesgo de efectos nocivos ha sido difícil de evitar. Por esta razón, varias drogas se han estado utilizando para disminuir las complicaciones de la post-cirugía. La Pirfenidona (PFD) es una nueva droga con características anti-inflamatorias y anti-fibróticas, demostrando que puede prevenir la contracción y la inflamación del implante con buenos resultados. Con la administración de PFD seguida a la implantación mamaria y durante todo el experimento, podemos prevenir la inflamación, la contracción y el grueso de la cápsula. PFD también demostró que reduce la expresión de agentes que favorecen la fibrogénesis como la colágena y el TGF-β entre el 85% y el 60% respectivamente. Estos resultados están en concordancia con el efecto de PFD en otras enfermedades fibróticas divulgadas por otros autores y por nosotros, donde PFD inhibió la expresión de TGF-βl y de colágena e índice reducido de la fibrosis en el 70%. Musters observó la proliferación de células mamarias estromales en la glándula mamaria tratada con TGF-βl a las 4 y 22 horas después de la implantación de la pelotilla del implante que sugería un efecto de TGF en
la proliferación de las células productoras de colágena
(S. Musters y otros. American Dairy Science Association
2004). Por la técnica de Inmunohistoquimica con el anticuerpo contra α-SMA detectamos la baja proliferación de fibroblastos con la administración de PFD que sugeria su efecto anti-fibrotico vía la inhibición de la proliferación/activación de fibroblastos. Nuestros resultados demuestran un efecto anti-ffibrótico y anti- inflamatorio de PFD, administrado en dosis de 200 a 400 mg/Kg de peso corporal, en los implantes de cirugía a los divulgados previamente por otros investigadores en varias enfermedades fibrogénicas que demuestran el alto potencial como droga preventiva de la fibrosis en implante mamario. Los resultados aqui obtenidos nos permxten proponer el uso de PFD en cirugía de implante post-mamario y asi prevenir los efectos nocivos indeseables.
ANIMALES y MÉTODOS
Veinte ratas wistar femeninas fueron usadas en este estudio, obtenidas de Charles Rivers Inc., con un peso de aproximadamente 25Og cada una y tratadas según los principios y procedimientos de la "GUÍA DEL INSTITUTO NACIONAL DE IA A SALUD PARA EL CUIDADO Y USO DE LOS ANIMALES DE LABORATORIO". Las ratas fueron divididas en dos grupos de diez ratas cada uno y se les implantaron implantes submamarios de gel de silicón lisos y texturizados a cada uno (NAGOR GFX) . A un grupo de animales le fue administrado en dosis de 200 a 400 mg/Kg de peso corporal, de pirfenidona en ImI de solución por
dia, via oral iniciando el dia de la cirugía. Se administraron el mismo volumen de vehículo al otro grupo como grupo de control. Cinco animales de cada grupo fueron sacrificados a las 4 semanas y cinco animales a las 8 semanas. El tejido fino capsular de ambos implantes fue retirado y almacenado adecuadamente para el análisis histológico y molecular posterior.
PROCEDIMIENTO QUIRÚRGICO
Las ratas fueron anestesiadas administrando O.lcc/lOOg por peso de una mezcla de Droperidol y Ketamine vía intramuscular. La incisión paramediana abdominal fue hecha al lado de las glándulas mamarias y los bolsillos submamarios fueron cortados. Un implante liso fue insertado en el lado derecho mientras que el texturizado fue colocado en el lado izquierdo. Ambas incisiones fueron cerradas con 3 suturas de hilo de seda. Después de la cirugía, a los animales se les dejó recuperarse de la anestesia de manera natural.
ANÁLISIS HISTOLÓGICO (H-E)
Para la evaluación histológica, el tejido fue fijado en formaldehído en solución buffer de una solución de fosfato (0.1M, pH 7.4) a temperatura ambiente. Secciones de 4 μm de grosor fueron obtenidas y las laminillas fueron teñidas con Hematoxilina-eosina. La evaluación histológica fue determinada usando un analizador de imagen automatizado auxiliado por computadora (Image-Pro Plus 4.0 Media Cybernetics Inc., MD, E. E.U.U.) analizando diez áreas de campos seleccionados al azar
por laminilla con la ampliación 200X del microscopio.
DETERMINACIÓN del ÍNDICE de FIBROSIS Las secciones capsulares de tejido fueron fijadas inmediatamente por inmersión en para-formaldehido diluido al 10%r en un buffer salino de fosfato (PBS) , deshidratado en alcohol etílico destilado y embebido en parafina. Las secciones (5μm de grueso) fueron teñidas con tricrómico de Masson. En estas laminillas el porcentaje de tejido capsular afectado por fibrosis fue determinado usando un analizador de imagen automatizado auxiliado por computadora (Image Pro-Plus) analizando 15 campos al azar por laminilla y calculando el cociente de tejido conectivo al área total de la cápsula (26) .
INMÜNOHISTOQDIMICA
Las secciones inmunohistoquimicas capsulares de tejido fino fueron montadas en laminillas cubiertas con silano y desparafinadas. La actividad endógena de la peroxidase fue interrumpida con H2O2 al 3% en metanol absoluto. Estas laminillas fueron incubadas toda la noche a temperatura ambiente con anticuerpos monoclonales de ratón contra actina- de músculo liso alfa (Boeringer Manheim, Alemania) . El anticuerpo fue detectado con anticuerpos etiquetados de peroxidasa policlonal de conejo contra las inmunoglobulinas de ratón, la tinción con diaminobenzidina y contrastada con Hematoxilina . Para el análisis de cuantificación, diez campos al azar fueron evaluados en ampliación 400X. Las células positivas y negativas de Inmunohistoquimica fueron
contadas por un analizador de imagen automatizado (Image Pro-Plus) y los datos expresados como porcentaje de células positivas.
EXTRACCIÓN DE ARN TOTAL
El aislamiento de ARN total del hígado de la rata fue realizado según el método modificado descrito por Chomczynski y otros (27) . Brevemente, el tejido fino mamario fue obtenido y homogeneizado usando un sistema de Polytron (Brinkmann, Suiza) en presencia de Trizol (Invitrogen) . Se agregó cloroformo, la fase acuosa fue obtenida y el RNA fue precipitado con isopropanol a 40C durante la noche. La cantidad y el RNA intacto fueron determinados por absorbancia a 260/280 y por fluorescencia de bromuro de etidio en electroforesis de RNA en geles de azarosa al 10 por ciento.
RETROTRANSCRIPCION Dos microgramos del RNA extraído de todas las muestras fue agregado a 240 ng de primers al azar, 5mM DTT, mezcla de dNTP ImM, 40 unidades de RNAsa libre de inhibidor, 200 unidades de RT- MMLV e incubado por 10 minutos a 25°C, durante 60 minutos a 37°C y 10 minutos a 950C. Después de la incubación las muestras fueron almacenadas a 700C hasta que la reacción de PCR en tiempo real se llevó a cabo.
PCR EN TIEMPO REAL La reacción de PCR en tiempo real fue realizada usando un detector de secuencia de genes RG 3000 de rotor
(Corbett Research, Sydney Australia) bajo las condiciones siguientes: 1 ciclo de 500C por 2 minutos, 1 ciclo a 950C por 10 minutos y 40 ciclos a 95°C por 30 segundos y a 600C por 40 segundos. La reacción total fue hecha en 10 μM que contenia 2 μl de DNA, del IX de mezcla universal maestra de PCR (Biosistemas Aplicados) y del IX de la concentración final del primer y de la prueba de TaqMan experimental, controlando los genes sintetizados por Biosistemas Aplicados. Tiempo real múltiplex de PCR para el colágeno iβ y TGF-βl fueron realizados por duplicado para cada animal usando GAPDH como gene constitutivo. El análisis de datos fue realizado según el boletín número 2 del usuario de los Biosistemas Aplicados (28). Usando software para la detección de la secuencia calculamos el ciclo de umbral (Ct) para cada reacción que se utiliza para cuantificar la cantidad de reacción de la plantilla inicial. Una diferencia en los valores de Ct se calculó para cada gene por duplicado. La cantidad del gene blanco fue normalizada contra el gene constitutivo GAPDH.
ANÁLISIS ESTADÍSTICOS
Los resultados se expresan como desviación media estándar ±. La prueba t de Student fue utilizada. P<0.05 fue considerada para indicar una diferencia significativa entre los grupos.
RESULTADOS En este trabajo, colocamos implantes de silicón submamarios en el pecho de ratas wistar femeninas, para
evaluar el efecto de la pirfenidona en el desarrollo de la contracción y de la fibrosis después de cuatro y ocho semanas de tratamiento con pirfenidona (Fig 1) . Después de 4 semanas con el implante los animales presentaron una cápsula aumentada alrededor del implante con el aumento de la opacidad en los tejidos adyacentes que impedia visualizar la morfologia del tejido. Ninguna diferencia significativa se observó entre los implantes texturizado y liso ni tampoco entre 4 y 8 semanas después de que el implante de silicón se colocó (Fig 2A- D) . Sin embargo, la pirfenidona indujo una reducción importante en el grueso de la cápsula alrededor del tejido submamario, sin diferencia entre los implantes texturizados y lisos y entre 4 y 8 semanas (Fig. 2 E-H) . Los fibroblastos en el grupo de animales tratados con pirfenidona fueron disminuidos, asi como la proliferación de las células y el restablecimiento de las células inflamatorias en contraste con el grupo de control donde observamos la infiltración mononuclear abundante de las células y fibroblastos asi como la proliferación de las células. Las células totales contadas por campo fueron reducidas dramáticamente cuando los animales fueron tratados con Pirfenidona (Fig. 3A-H) . El contenido total de colágena observado cuando el tejido se tiñe con tricromo de Masson en el grupo de Pirfenidona era del 50% menos respecto al grupo de control sin PFD, donde podemos observar fibras gruesas e irregulares de colágena sin vascularización. Una vez más no observamos diferencia en el contenido de colágena cuando comparamos respecto al implante liso y
el implante texturizado y entre 4 y 8 semanas (Fig. 4A-
H) . Luego, buscamos por el número de células fibroblasticas productoras de colágena. Encontramos escasos fibroblastos con fenotipo activado en los animales tratados con Pirfenidona, los cuales disminuian alrededor del 45% comparado con los animales no tratados sin diferencia entre los implantes lisos y texturizados
(p<0.05). Además, en los animales no tratados con PFD, la enorme mayoría de las células fibroblásticas presentaron un fenotipo activado (Figura 5) .
En la Figura 6 se muestran una serie de experimentos basados en el PCR de tiempo real a las 4 semanas para los dos grupos de animales, para conocer el efecto de PFD sobre la expresión de genes claves involucrados en la fibrogenesis. La expresión del gen TGF-β en las ratas tratadas con PFD disminuyó significativamente en 85% (P<0.05) comparado con el grupo control (n=3) . El gen de Colágena I decreció 60% en los animales tratados con PFD respecto a los animales no tratados (p<0.05).
Claims
1.- El uso de pirfenidona para la fabricación de un medicamento, en donde dicho medicamento comprende de aproximadamente 200 a 400 mg de pirfenidona/Kg de peso corporal y un portador farmacéuticamente aceptable para su administración oral, caracterizado además porque el medicamento disminuye y previene la presencia de efectos nocivos en los implantes de mama, tales como son la inflamación, contracción de la cápsula y fibrosis.
2. - El uso de pirfenidona para la fabricación de un medicamento según la reivindicación 1, en donde dicho medicamento reduce la expresión de agentes que favorecen la fibrogenesis como colágena I y el TGF-β entre el 85% y el 60% respectivamente.
3.- El uso de pirfenidona para la fabricación de un medicamento según la reivindicación 1, en donde dicho medicamento está en forma de una dosis unitaria que se administra al paciente al menos a partir del dia de la cirugia de implantación.
4.- El uso de pirfenidona para la fabricación de un medicamento según la reivindicación 1, en donde dicho medicamento se encuentra en forma de dosis oral sólida o liquida.
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