MD3700514T2 - Combinație de inhibitori ai IL-8 și inhibitori ai IL-6/GP-130 pentru utilizare în tratamentul metastazelor pulmonare asociate cu osteosarcomul - Google Patents

Abstract

Prezenta invenţie se referă la compuşi inhibitori ai IL-8, de preferinţă inhibitori duali ai receptorului CXCR1/CXCR2, utili în tratamentul şi/sau prevenirea unor sarcoame, de preferinţă în tratamentul şi/sau prevenirea osteosarcomului, sarcomului Ewing, rabdomiosarcomului sau metastazei pulmonare asociate cu acesta.

Description

DOMENIUL TEHNIC

Prezenta invenţie se referă la un produs sau kit pentru utilizare în prevenirea şi/sau tratamentul metastazelor pulmonare asociate cu osteosarcomul, produsul sau kitul cuprinzând: A) un inhibitor al IL-8 şi B) cel puţin un inhibitor al IL-6 şi/sau cel puţin un inhibitor al gp130, A) şi B) fiind două formulări separate pentru utilizare simultană, separată sau secvenţială. Invenţia se referă, de asemenea, la o compoziţie farmaceutică pentru utilizare în prevenirea şi/sau tratamentul metastazelor pulmonare asociate cu osteosarcomul, cuprinzând un inhibitor al IL-8 şi excipienţi şi/sau diluanţi acceptabili farmaceutic, în care compoziţia farmaceutică cuprinde în plus cel puţin un inhibitor al IL-6 şi/sau cel puţin un inhibitor al gp130.

STADIUL TEHNICII

Sarcoamele osoase şi ale ţesuturilor moi reprezintă un grup de forme rare şi eterogene de cancer, care reprezintă împreună aproximativ 1% din totalul malignităţilor diagnosticate. Sarcoamele reprezintă o provocare pentru medici, întrucât sunt rare, iar diagnosticul este adesea întârziat.

Există peste o sută de subtipuri morfologice diferite de sarcom. Cele mai frecvente tipuri de sarcom osos sunt osteosarcomul, condrosarcomul, sarcomul Ewing şi cordomul. Sarcoamele ţesuturilor moi se dezvoltă din celulele ţesuturilor moi, inclusiv celule musculare netede (leiomiosarcoame), celule adipoase (liposarcoame), ţesut conjunctiv fibros (fibrosarcoame), muşchi scheletici (rabdomiosarcoame), sinoviale (sarcoame sinoviale), vase de sânge (angiosarcoame), canale mamare (tumori filoide) şi nervi (tumori ale tecii nervoase).

Osteosarcomul (OS) este un neoplasm malign agresiv care apare din celule primitive transformate de origine mezenchimală (şi, prin urmare, un sarcom) şi care prezintă diferenţiere osteoblastică şi produce osteoid malign.

Este cea mai frecventă formă histologică de cancer osos primar şi este cel mai răspândit la adolescenţi şi adulţi tineri.

Rezecţia chirurgicală completă, radicală, în bloc a cancerului este tratamentul de elecţie în osteosarcom. Deşi aproximativ 90% dintre pacienţi pot fi supuşi unei intervenţii chirurgicale de salvare a membrului, complicaţiile, în special infecţia, slăbirea protezei şi pseudartroza, sau recurenţa tumorii locale pot determina necesitatea unei intervenţii chirurgicale suplimentare sau a amputării.

Terapia standard este o combinaţie de chirurgie ortopedică de salvare a membrului, atunci când este posibil (sau amputare în unele cazuri) şi chimioterapie.

Sarcomul Ewing (ES) este o tumoră osoasă extrem de agresivă, cu o incidenţă maximă în populaţia adolescentă. Are o predispoziţie ridicată la metastaze, care este asociată cu rate de supravieţuire scăzute de aproximativ 25% (Satterfield, L. şi colab., Int. J. Cancer, 141: 2062‑2075; 2017; Beverly A. Teicher şi colab., Ann Saudi Med., 31(2): 174‑182; 2011).

Membrii familiei de tumori din sarcomul Ewing (ESFT) conţin translocaţii asociate tumorii care dau naştere factorilor de transcripţie oncogenici, cel mai frecvent EWS/FLI1. EWS/FLI1 joacă un rol dominant în progresia tumorii prin modularea expresiei a sute de gene ţintă. Aici, impactul inhibării EWS/FLI1, prin reducerea expresiei mediată de ARNi, asupra semnalizării celulare a fost investigat utilizând fosfoproteomica bazată pe spectrometrie de masă pentru a cuantifica modificările globale ale fosforilării. Această abordare imparţială a identificat sute de fosfopeptide unice îmbogăţite în procese precum reglarea ciclului celular şi organizarea citoscheletului. În special, profilarea fosfotirozinei a relevat o creştere semnificativă a fosforilării STAT3 la reducerea expresiei EWS/FLI1. Cu toate acestea, analiza pe celule individuale a demonstrat că acesta nu a fost un efect autonom celular al deficienţei EWS/FLI1, ci mai degrabă un efect de semnalizare care apare în celulele în care nu are loc reducerea expresiei. Mediile condiţionate din celulele cu expresie scăzută (knockdown) au fost suficiente pentru a induce fosforilarea STAT3 în celulele de control, verificând prezenţa unui factor solubil care poate activa STAT3. Analiza citokinelor şi experimentele de inhibare a ligandului/receptorului au determinat că această activare a avut loc, în parte, printr-un mecanism dependent de IL6. Luate împreună, datele susţin un model în care deficienţa de EWS/FLI1 are ca rezultat secreţia de factori solubili, cum ar fi IL6, care activează semnalizarea STAT în celulele activate nespecific ce menţin expresia EWS/FLI1. În plus, s-a demonstrat că aceşti factori solubili protejează împotriva apoptozei (Jennifer L. Anderson si colab.; Mol Cancer Res; 12(12); 2014; Andrej Lissat şi colab., BMC Cancer, 15: 552; 2015).

Rabdomiosarcomul (RMS) este o formă agresivă şi extrem de malignă de cancer care se dezvoltă din celulele musculare scheletice (striate) care nu s-au diferenţiat complet. În general, este considerată o boală a copilăriei, întrucât marea majoritate a cazurilor apar la persoanele sub 18 ani.

Deşi este un cancer relativ rar, acesta reprezintă aproximativ 40% din toate sarcoamele de ţesut moale înregistrate. RMS poate să apară în orice loc al corpului, însă se găseşte în principal în cap, gât, orbită, tract genitourinar, organe genitale şi extremităţi.

Tratamentul rabdomiosarcomului este o practică multidisciplinară care implică utilizarea chirurgiei, chimioterapiei, radioterapiei şi, eventual, imunoterapiei. Chirurgia este, în general, primul pas într-o abordare terapeutică combinată. Rezecabilitatea variază în funcţie de locul tumorii, iar RMS se prezintă adesea în locuri care nu permit rezecţia chirurgicală completă fără morbiditate semnificativă şi pierderea funcţiei. Mai puţin de 20% din tumorile RMS sunt complet rezecate cu margini negative. Din fericire, rabdomiosarcoamele sunt în general chemosensibile, aproximativ 80% din cazuri răspunzând la chimioterapie. Chimioterapia cu mai mulţi agenţi este indicată pentru toţi pacienţii cu rabdomiosarcom. Înainte de utilizarea terapiei adjuvante şi neoadjuvante care implică agenţi chimioterapeutici, tratamentul exclusiv prin mijloace chirurgicale avea o rată de supravieţuire de <20%. Ratele moderne de supravieţuire cu terapie adjuvantă sunt de aproximativ 60-70%.

Metastazele ucid pacienţii cu tumori solide. Acest lucru este mai evident decât în ​​cazul osteosarcomului. Osteosarcomul (OS), cancer osos mortal, ucide în principal prin răspândirea metastatică la plămâni. Mecanismele care determină acest tropism pulmonar rămân necunoscute. Indiferent dacă pacienţii prezintă metastaze macroscopice la momentul diagnosticării sau metastazele apar la mulţi ani după finalizarea terapiei, pacienţii cu boală localizată se bucură de o rată de supravieţuire generală la 5 ani relativ favorabilă, de 70%, în timp ce cei cu metastaze pulmonare suferă de o supravieţuire la 2 ani extrem de slabă, de 15% (Allison D. C. si colab.; Sarcoma 2012, 704872; 2012).

În ciuda nenumăratelor încercări de a îmbunătăţi terapia sau de a găsi tratamente noi pentru boala metastatică, niciun tratament nu a îmbunătăţit semnificativ rezultatele în ultimii 40 de ani. În mod evident, vor fi necesare abordări noi pentru a face progrese în tratamentul osteosarcomului metastatic (Luetke A. şi colab.; Cancer Treat. Rev. 40, 523‑32; 2014). Mari consorţii de cercetători din domeniu au sugerat că progresele suplimentare în tratamentul osteosarcomului nu vor apărea probabil fără o mai bună înţelegere a biologiei metastazelor şi odată cu dezvoltarea de medicamente care vizează aceste căi (Khanna C. şi colab.; Clin Cancer Res; 20(16); 1‑10; 2014).

Unele dintre domeniile anterioare se referă la identificarea factorilor de risc asociaţi cu rezultatul la copiii cu rabdomiosarcom metastatic (Oberlin O. şi colab.; Journal of Clinical Oncology, 10 mai 2008; 26(14): 2384‑2389) şi la rezultatele la copiii cu rabdomiosarcom (RMS) şi boală metastatică exclusiv pulmonară (J. Pediatr. Surg., ianuarie 2005; 40(1):256‑62).

O terapie care previne apariţia metastazelor pulmonare la copiii şi adolescenţii cu osteosarcom ar salva vieţile a peste 70% dintre cei care mor în prezent din cauza bolii lor.

US2017/0165363A1 descrie metode de tratare sau prevenire a cancerului la pacienţi prin administrarea inhibitorului de interleukină 6 (IL-6) şi a inhibitorului de interleukină 8 (IL-8), într-un interval de raport de concentraţie pentru a inhiba migrarea celulelor canceroase. Compuşii sunt testaţi pe celule de fibrosarcom (HT1080WT). Interleukina-8 (IL-8; CXCL8) este considerată un mediator major al recrutării PMN (neutrofilelor polimorfonucleare) şi este implicată în mai multe patologii, inclusiv psoriazis, artrita reumatoidă, boala pulmonară obstructivă cronică şi leziunile de reperfuzie la organele transplantate (Griffin şi colab., Arch Dermatol 1988, 124: 216; Fincham şi colab., J Immunol 1988, 140: 4294; Takematsu şi colab., Arch Dermatol 1993, 129: 74; Liu şi colab., 1997, 100:1256; Jeffery, Thorax 1998, 53: 129; Pesci şi colab., Eur Respir J. 1998, 12: 380; Lafer şi colab., Br J Pharmacol. 1991, 103: 1153; Romson şi colab., Circulation 1993, 67: 1016; Welbourn şi colab., BrJ Surg. 1991, 78: 651; Sekido şi colab., Nature 1993, 365, 654). Activitatea biologică a IL-8 este mediată de interacţiunea cu doi receptori, CXCR1 şi CXCR2, aparţinând familiei 7TM-GPCR, care sunt exprimaţi pe suprafaţa PMN-urilor umane. În timp ce CXCR1 este selectiv, legându-se cu afinitate ridicată doar de două chemokine, CXCL6 şi IL-8, şi prezentând o afinitate mult mai mare pentru IL-8 (Wolf şi colab., Eur J Immunol 1998, 28: 164), CXCR2 uman este un receptor mai promiscuu, legând o serie de citokine şi chemokine diferite. Prin urmare, CXCR2 mediază activitatea unui număr de molecule biologice diferite.

Interleukina-6 (IL-6) este o citokină pleiotropică cu funcţii multiple în reglarea imunităţii, inflamaţiei şi oncogenezei. Legarea IL-6 la receptorul IL-6 (IL-6R) induce homodimerizarea şi recrutarea glicoproteinei 130 (gp130), ceea ce conduce la activarea semnalizării din aval.

Gp130 face parte din complexele de semnalizare a receptorilor pentru cel puţin 8 citokine (IL-6, IL-11, IL-27, LIF, CNTF, OSM, CT-1 şi CLC). Legarea ligandului induce asocierea gp130 cu un lanţ receptor-α specific citokinelor, urmată de activarea cascadelor de semnalizare din aval, inclusiv căile JAK/STAT, RAS/RAF/MAPK şi PI3K/AKT. S-a demonstrat că fosforilarea gp130 la Ser782 reglează negativ expresia gp130 la suprafaţa celulară. Fiind un receptor exprimat ubicuitar, gp130 este implicată într-o gamă largă de procese biologice importante, inclusiv inflamaţia, autoimunitatea, cancerul, păstrarea celulelor stem şi dezvoltarea embrionară (Mol Cancer Ther; 12(6); 937-49; 2013).

REZUMATUL INVENŢIEI

Prezenta invenţie este definită în revendicările anexate. Variantele de realizare care nu se încadrează în domeniul de aplicare al revendicărilor anexate nu fac parte din invenţie. Orice referinţe din descriere la metode de tratament se referă la compuşii, compoziţiile farmaceutice şi medicamentele prezentei invenţii pentru utilizare într-o metodă de tratament al corpului uman (sau animal) prin terapie.

Prezenţii inventatori au descoperit în mod surprinzător că inhibarea IL-8 este capabilă să reducă sau să prevină apariţia metastazelor pulmonare asociate cu osteosarcomul, sarcomul Ewing sau rabdomiosarcomul. În special, combinarea unui inhibitor al IL-8 cu un inhibitor al IL-6 este mai eficientă.

Prezenţii inventatori au descoperit, de asemenea, în mod surprinzător că un inhibitor al IL-8 este util în prevenirea şi/sau tratamentul osteosarcomului tumoral primar, sarcomului Ewing sau rabdomiosarcomului. De preferinţă, atunci când inhibitorul de IL-8 este combinat cu un agent chimioterapeutic.

Prin urmare, un prim obiectiv al prezentei invenţii este un produs sau kit pentru utilizare în prevenirea şi/sau tratamentul metastazelor pulmonare asociate cu osteosarcomul, produsul sau kitul cuprinzând: A) un inhibitor al IL-8 şi B) cel puţin un inhibitor al IL-6 şi/sau cel puţin un inhibitor al gp130, A) şi B) fiind două formulări separate pentru utilizare simultană, separată sau secvenţială.

Al doilea obiectiv al invenţiei este o compoziţie farmaceutică pentru utilizare în prevenirea şi/sau tratamentul metastazelor pulmonare asociate cu osteosarcomul, cuprinzând un inhibitor al IL-8 şi excipienţi şi/sau diluanţi acceptabili farmaceutic, în care compoziţia farmaceutică cuprinde în plus cel puţin un inhibitor al IL-6 şi/sau cel puţin un inhibitor al gp130.

DESCRIEREA FIGURILOR

- Figura 1 prezintă corelaţia dintre expresia IL6 şi IL8 şi eficienţa metastatică şi comportamentele metastatice în modelele xenograft de metastaze. Şoarecii CB17-SCID inoculaţi cu 1 x 10⁶ celule OS au fost eutanasiaţi la 49 de zile după inoculare. a) Aspectul macroscopic al blocurilor pulmonare prelevate de la aceşti şoareci sugerează o eficienţă semnificativ mai mare a colonizării de către OS-17 în raport cu celelalte linii celulare. b) Coloraţiile H&E din secţiunile lobilor stângi încorporaţi în parafină au fost numărate pentru a cuantifica numărul de metastaze per secţiune. c) Cuantificarea relevă un număr semnificativ mai mare de metastaze în secţiunile OS-17 în raport cu OHS. d) Determinarea concentraţiilor de IL-6 şi II-8 în supernatantele de 72 de ore din culturile fiecărei linii celulare relevă o expresie semnificativă a ambelor citokine în celulele OS-17 metastatice în raport cu oricare dintre liniile celulare nemetastatice. e)-f) Evaluarea capacităţii de a răspunde la semnalele IL-6 şi IL-8 utilizând testul de migrare transwell.

- Figura 2 prezintă efectul DF2156A singur sau în combinaţie cu sc144 pentru reducerea răspunsurilor chemotactice la ser în celulele OS-17. Celulele OS au fost cultivate pe o membrană a camerei transwell, apoi transferate într-o cameră care conţine RPMI cu 2,5% FBS (ctl pozitiv) sau RPMI singur (ctl negativ). Alte godeuri care conţin 2,5% FBS în camera inferioară au fost tratate cu 1 uM sc144, 10 nM DF2156A sau ambele. După 24 de ore, camerele superioare au fost răzuite, membranele colorate şi celulele numărate.

- Figura 3 prezintă efectele inhibării căilor IL-6 şi IL-8 asupra colonizării pulmonare metastatice. Şoarecii inoculaţi cu 1 x 10⁶ celule OS-17-luc au fost trataţi cu inhibitori farmacologici ai IL-6 (sc144), IL-8 (DF2156A) sau ambelor. A) Imagistica bioluminescentă finalizată la 28 de zile după inoculare. B) Analiza supravieţuirii şoarecilor prezentaţi în A).

- Figura 4 prezintă analiza farmacodinamicii (PD) în ţesutul pulmonar al şoarecilor trataţi cu DF2156A şi sc144. Şoarecii trataţi zilnic cu injecţii fie cu DF2156A, fie cu sc144, au fost eutanasiaţi la 24 de ore după administrarea celei de-a 14-a doze de medicament. Plămânii recoltaţi de la aceşti şoareci au fost procesaţi utilizând FFPE standard, apoi secţionaţi şi coloraţi cu IHC fie pentru pFAK (în aval de IL-8), fie pentru pSTAT3 (în aval de IL-6). Blocarea receptorilor a redus cantitatea de activare observată şi numărul de celule infiltrate, chiar şi la concentraţii minime.

- Figura 5 prezintă efectul combinaţiei DF2156A cu sc144 în prevenirea metastazelor pulmonare în mai multe modele de OS. Ulterior inoculării celulelor OS, şoarecii au primit fie tratament cu substanţă placebo, fie tratament cu ambele substanţe, sc144 şi DF2156A, timp de 42 de zile. În momentul în care un şoarece din oricare dintre grupuri a îndeplinit criteriile finale, toţi şoarecii din studiul respectiv au fost eutanasiaţi, li s-au recoltat plămânii şi leziunile metastatice au fost numărate.

DESCRIEREA DETALIATĂ A INVENŢIEI

După cum va fi dezvăluit în detaliu în Secţiunea Experimentală, inventatorii de faţă au descoperit că moleculele care acţionează ca inhibitori ai activităţii IL-8 au eficacitate terapeutică în modelele animale de sarcom. În plus, inventatorii de faţă au descoperit, de asemenea, că inhibarea IL-8 este capabilă să contracareze apariţia metastazelor pulmonare. În mod special, inhibarea combinată a IL-8 şi IL-6 previne metastazele.

Prin urmare, un prim obiect al prezentei invenţii este un produs sau kit pentru utilizare în prevenirea şi/sau tratamentul metastazelor pulmonare asociate cu osteosarcomul, produsul sau kitul cuprinzând: A) un inhibitor al IL-8 şi B) cel puţin un inhibitor al IL-6 şi/sau cel puţin un inhibitor al gp130, A) şi B) fiind două formulări separate pentru utilizare simultană, separată sau secvenţială.

Termenul „inhibitor al IL-8», conform prezentei cereri, se referă la orice compus capabil să inhibe, parţial sau total, activitatea biologică a IL-8. Un astfel de compus poate acţiona prin scăderea expresiei sau activităţii IL-8 sau prin inhibarea declanşării semnalizării intracelulare activate de receptorii IL-8. Este de preferat ca inhibitorul IL-8 menţionat să fie capabil să inhibe cel puţin 50%, de preferinţă cel puţin 60%, din chemotaxia indusă de IL-8 în PMN-uri la o concentraţie egală sau mai mică de 500 nM, de preferinţă sub 100 nM.

Conform unei variante de realizare preferate, inhibitorul IL-8 al tuturor obiectelor prezentei invenţii inhibă activitatea IL-8 mediată de receptorul CXCR1 sau mediată de receptorii CXCR1 şi CXCR2.

De preferinţă, conform acestei variante de realizare, inhibitorul IL-8 menţionat este fie un inhibitor alosteric, fie un antagonist ortosteric al receptorului CXCR1, fie al ambilor receptori CXCR1 şi CXCR2.

De preferinţă, inhibitorul IL-8 menţionat este selectiv pentru receptorul CXCR1 sau este la fel de potent faţă de receptorii CXCR1 şi CXCR2.

Prin „selectiv pentru CXCR1», conform prezentei invenţii, se înţelege un compus care prezintă o valoare IC50 cu cel puţin 2, de preferinţă 3 logaritmi mai mare faţă de CXCR1 decât faţă de CXCR2. (Bertini R. şi colab., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (2004), 101 (32), pag. 11791-11796).

Prin „la fel de puternic împotriva CXCR1 şi CXCR2» se înţelege un compus care prezintă o valoare IC50 în intervalul 10 picomolar (10‑11M) - 1 micromolar (10‑6M) împotriva CXCR1 şi CXCR2. (Bertini R. şi colab., Br. J. Pharm. (2012), 165, pp. 436‑454).

Mai preferat, inhibitorul IL-8 conform invenţiei are o valoare IC50 faţă de receptorul CXCR1 în intervalul nanomolar scăzut, de preferinţă în intervalul 0,02‑5 nanomolar.

Conform unei variante de realizare preferate, tot în combinaţie cu varianta de realizare precedentă, inhibitorul IL-8 menţionat este selectat dintre molecule cu greutate moleculară mică şi anticorpi, mai preferat este o moleculă cu greutate moleculară mică.

Sunt cunoscuţi în domeniu inhibitori ai IL-8 conform definiţiei de mai sus, capabili să inhibe activitatea IL-8 mediată de receptorul CXCR1 sau mediată atât de receptorii CXCR1, cât şi de receptorii CXCR2.

Inhibitorii IL-8 preferaţi conform invenţiei sunt selectaţi dintre derivaţii acidului 1,3-tiazol-2-ilaminofenilpropionic, derivaţii acidului 2-fenil-propionic şi sărurile lor acceptabile farmaceutic.

Printre compuşii de mai sus, derivatul acidului 1,3-tiazol-2-ilaminofenilpropionic este de preferinţă un compus cu formula (I):

sau o sare farmaceutic acceptabilă a acestuia, în care

- R1 este hidrogen sau CH3;

- R2 este hidrogen sau alchil C1-C4 liniar, de preferinţă este hidrogen;

- Y este un heteroatom selectat dintre S, O şi N; de preferinţă este S;

- Z este selectat dintre halogen, alchil C1-C4 liniar sau ramificat, alchenil C2-C4, alchinil C2-C4, alcoxi C1-C4, hidroxil, carboxil, aciloxi C1-C4, fenoxi, ciano, nitro, amino, acilamino C1-C4, haloalchil C1-C3, haloalcoxi C1-C3, benzoil, alcansulfonat C1-C8 liniar sau ramificat, alcansulfonamidă C1-C8 liniar sau ramificat, alchilsulfonilmetil C1-C8 liniar sau ramificat; de preferinţă este trifluorometil;

- X este OH sau un rest cu formula NHR3; în care R3 este selectat dintre:

- hidrogen, hidroxil, alchil C1-C6 liniar sau ramificat, cicloalchil C3-C6, alchenil C2-C6, alcoxi C1-C5, sau fenilalchil C1-C6, în care gruparea alchil, cicloalchil sau alchenil poate fi substituită cu un rest COOH

- un rest cu formula SO2R4 în care R4 este alchil C1-C2, cicloalchil C3-C6, haloalchil C1-C3.

De preferinţă, în compuşii de mai sus, X este OH.

Printre compuşii de mai sus, sunt deosebit de preferaţi compuşii cu formula (I) sau sărurile acestora acceptabile farmaceutic, în care:

R1 este CH3;

R2 este hidrogen sau alchil C1-C4 liniar, de preferinţă este hidrogen;

Y este un heteroatom selectat dintre S, O şi N; de preferinţă este S;

Z este selectat dintre halogen, alchil C1-C4 liniar sau ramificat, alchenil C2-C4, alchinil C2-C4, alcoxi C1-C4, hidroxil, carboxil, aciloxi C1-C4, fenoxi, ciano, nitro, amino, acilamino C1-C4, haloalchil C1-C3, haloalcoxi C1-C3, benzoil, alcansulfonat C1-C8 liniar sau ramificat, alcansulfonamide C1-C8 liniare sau ramificate, alchilsulfonilmetil C1-C8 liniar sau ramificat; de preferinţă este trifluorometil;

X este OH sau un rest cu formula NHR3; în care R3 este selectat dintre:

- hidrogen, hidroxil, alchil C1-C6 liniar sau ramificat, cicloalchil C3-C6, alchenil C2-C6, alcoxi C1-C5,

sau fenilalchil C1-C6, în care gruparea alchil, cicloalchil sau alchenil poate fi substituită cu un rest COOH

- un rest cu formula SO2R4 în care R4 este alchil C1-C2, cicloalchil C3-C6, haloalchil C1-C3.

De preferinţă, în aceşti compuşi X este OH.

Dintre compuşii de mai sus, sunt preferaţi în mod deosebit compuşii cu respectiva formulă (I) sau săruri acceptabile farmaceutic ale acestora, în care

R1 este hidrogen;

R2 este hidrogen sau alchil C1-C4 liniar, de preferinţă acesta este hidrogen;

Y este un heteroatom selectat dintre S, O şi N; de preferinţă acesta este S;

Z este selectat dintre halogen, alchil C1-C4 liniar sau ramificat, alchenil C2-C4, alchinil C2-C4, alcoxi C1-C4, hidroxil, carboxil, aciloxi C1‑C4, fenoxi, ciano, nitro, amino, acilamino C1‑C4, haloalchil C1-C3, haloalcoxi C1-C3, benzoil, alcansulfonat C1-C8 liniar sau ramificat, alcansulfonamidă C1-C8 liniară sau ramificată, alchilsulfonilmetil C1-C8 liniar sau ramificat; de preferinţă acesta este selectat dintre trifluoro-metil;

X este OH sau un rest cu formula NHR3; în care R3 este selectat dintre

- hidrogen, hidroxil, alchil C1-C6 liniar sau ramificat, cicloalchil C3-C6, alchenil C2-C6, alcoxi C1-C5,

sau fenilalchil C1-C6, în care gruparea alchil, cicloalchil sau alchenil poate fi substituită cu un rest COOH;

- un rest cu formula SO2R4 în care R4 este alchil C1‑C2, cicloalchil C3-C6, haloalchil C1‑C3. Mai preferat X este NH2.

De preferinţă, în compuşii de mai sus X este OH.

Dintre compuşii de mai sus, sunt preferaţi în mod deosebit compuşii cu respectiva formulă (I) sau sărurile acceptabile farmaceutic ale acestora, în care:

R1 este hidrogen sau CH3;

R2 este hidrogen sau alchil C1-C4 liniar, de preferinţă acesta este hidrogen;

Y este un heteroatom selectat dintre S, O şi N; de preferinţă acesta este S;

Z este selectat dintre alchil C1-C4 liniar sau ramificat, alcoxi C1-C4 liniar sau ramificat, haloalchil C1-C3 şi haloalcoxi C1-C3; de preferinţă acesta este selectat dintre metil, metoxi, trifluorometoxi, trifluorometil, mai preferat acesta este trifluorometil;

X este OH.

Dintre compuşii de mai sus, sunt preferaţi în mod deosebit compuşii cu respectiva formulă (I) sau sărurile acceptabile farmaceutic ale acestora, în care:

R1 este CH3;

R2 este hidrogen sau alchil C1-C4 liniar, de preferinţă acesta este hidrogen.

Y este un heteroatom selectat dintre S, O şi N; de preferinţă acesta este S.

Z este selectat dintre alchil C1-C4 liniar sau ramificat, alcoxi C1-C4 liniar sau ramificat, haloalchil C1-C3 şi haloalcoxi C1-C3; de preferinţă acesta este selectat dintre metil, metoxi, trifluorometoxi, trifluorometil, mai preferat acesta este trifluorometil.

Dintre compuşii de mai sus, sunt preferaţi în mod deosebit compuşii cu respectiva formulă (I) sau sărurile acceptabile farmaceutic ale acestora, în care

R1 este hidrogen;

X este OH;

R2 este hidrogen sau alchil C1-C4 liniar, de preferinţă acesta este hidrogen;

Y este un heteroatom selectat dintre S, O şi N; de preferinţă acesta este S;

Z este selectat dintre alchil C1-C4 liniar sau ramificat, alcoxi C1-C4 liniar sau ramificat, haloalchil C1-C3 şi haloalcoxi C1-C3; de preferinţă acesta este trifluoro-metil.

De preferinţă, în toţi compuşii de mai sus cu formula (I) în care R1 este hidrogen, atomul de carbon chiral al grupării fenilpropionice este în configuraţie S.

Sunt deosebit de preferaţi compuşii cu formula (I) conform invenţiei, selectaţi dintre acidul 2-metil-2-(4-{[4-(trifluorometil)-1,3-tiazol-2-il]amino}fenil)propanoic (indicat aici şi ca DF2726Y) şi sărurile sale acceptabile farmaceutic, de preferinţă sarea sa de sodiu (indicată aici şi ca DF2726A) şi acidul 2-(4-{[4-(trifluorometil)-1,3-tiazol-2-il]amino}fenil)propanoic şi sărurile sale acceptabile farmaceutic, de preferinţă acidul (2S)-2-(4-{[4-(trifluorometil)-1,3-tiazol-2-il] amino} fenil) propanoic (cunoscut şi ca DF2755Y) şi sarea sa de sodiu, cunoscută şi ca DF2755A.

Compuşii cu formula (I) sunt descrişi în WO2010/031835, care descrie, de asemenea, metoda lor de sinteză, activitatea lor ca inhibitori ai IL-8, precum şi utilizarea lor în tratamentul patologiilor dependente de IL-8, cum ar fi ischemia cerebrală tranzitorie, pemfigoidul bulos, artrita reumatoidă, fibroza idiopatică, glomerulonefrita şi leziunile cauzate de ischemie şi reperfuzie.

Drintre inhibitorii IL-8 de mai sus, derivatul acidului 2-fenilpropionic este de preferinţă un compus cu formula (II):

sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia,

în care,

R4 este alchil C1-C6 liniar sau ramificat, benzoil, fenoxi, trifluorometansulfoniloxi; de preferinţă acesta este selectat dintre benzoil, izobutil şi trifluorometansulfoniloxi. De asemenea, conform unei variante de realizare preferate R4 este în poziţia 3 sau 4 pe inelul fenil, mai preferat acesta este 3-benzoil, 4-izobutil sau 4‑ trifluorometansulfoniloxi.

R5 este H alchil C1-C3 liniar sau ramificat, de preferinţă acesta este H.

R6 este alchil C1-C6 liniar sau ramificat sau trifluorometil; de preferinţă, acesta este alchil C1-C6 liniar sau ramificat, mai preferat acesta este CH3.

Dintre compuşii de mai sus, sunt preferaţi compuşii cu formula (II) sau sărurile acceptabile farmaceutic ale acestora, în care:

R4 este alchil C1-C6 sau benzoil; de preferinţă acesta este în poziţiile 3 şi 4, şi mai preferat, acesta este 3-benzoil sau 4-izobutil.

R5 este H, alchil C1-C3 liniar sau ramificat, de preferinţă acesta este H,

R6 este alchil C1-C6 liniar sau ramificat or trifluormetil; de preferinţă acesta este a alchil C1-C6 liniar sau ramificat, mai preferat acesta este CH3.

Dintre compuşii de mai sus, sunt preferaţi compuşii cu formula (II) sau sărurile acceptabile farmaceutic ale acestora, în care:

R4 este trifluorometansulfoniloxi, de preferinţă 4-trifluorometansulfoniloxi,

R5 este H sau alchil C1‑C3 liniar sau ramificat, de preferinţă acesta este H,

R6 este alchil C1-C6 liniar sau ramificat sau trifluormetil; de preferinţă acesta este un alchil C1‑C16 liniar sau ramificat, mai preferat acesta este CH3.

Dintre compuşii de mai sus, sunt, de asemenea, preferaţi compuşii cu formula (III):

sau sărurile acceptabile farmaceutic ale acestora, în care

R' este hidrogen;

R este un rest cu formula SO2Ra, în care Ra este alchil C1-C4 liniar sau ramificat sau haloalchil C1-C3, de preferinţă acesta este CH3.

De preferinţă, în compusul de mai sus cu formula (II) sau (III), atomul de carbon chiral al grupării fenilpropionice este în configuraţia R.

Compuşii cu formula (II) deosebit de preferaţi, conform invenţiei, sunt selectaţi dintre R-(-)-2-(4-izobutilfenil)propionil metansulfonamidă (cunoscută şi sub numele de Reparixin) şi sărurile acesteia acceptabile farmaceutic. De preferinţă, respectivul compus este sarea de lizină in situ a R(-)-2-(4-izobutilfenil)propionil metansulfonamidei (indicată aici şi ca DF1681B).

Alţi compuşi cu formula (II) sau (III) în mod deosebit preferaţi, conform invenţiei, sunt 2-(4-trifluorometansulfoniloxi)fenil]-N-metansulfonil propionamida şi sărurile farmaceutice ale acesteia, de preferinţă sarea sa de sodiu, R(-)-2-(4-trifluorometansulfoniloxi)fenil]-N-metansulfonil propionamida (cunoscută şi sub numele de DF2156Y) şi sarea sa de sodiu (cunoscută şi sub numele de Ladarixin sau DF2156A).

Inhibitorii IL-8 cu formula (II) şi (III) sunt descrişi în WO0024710 şi WO2005/090295, care descriu şi metoda lor de sinteză, activitatea lor ca inhibitori ai IL-8, precum şi utilizarea lor ca inhibitori ai chemotaxiei şi degranulării neutrofilelor induse de IL-8 şi în tratamentul patologiilor dependente de IL-8, cum ar fi psoriazisul, colita ulcerativă, melanomul, bolile pulmonare obstructive cronice (BPOC), pemfigoidul bulos, artrita reumatoidă, fibroza idiopatică, glomerulonefrita şi leziunile cauzate de ischemie şi reperfuzie.

Aşa cum este utilizat aici, o „cantitate eficientă terapeutic» se referă la o cantitate suficientă pentru a realiza tratamentul sau prevenirea bolii. Determinarea cantităţilor eficiente este la îndemâna persoanelor de specialitate în domeniu, pe baza obţinerii unui efect dorit. O cantitate eficientă va depinde de factori precum, însă fără a se limita la, greutatea unui subiect şi/sau gradul bolii sau al afecţiunii nedorite de care suferă un subiect.

Termenii „tratament» şi „prevenire», aşa cum se utilizează aici, se referă la eradicarea/ameliorarea sau prevenirea/întârzierea debutului tulburării tratate sau a unuia sau mai multor simptome asociate acesteia, indiferent de faptul că pacientul poate fi încă afectat de afecţiunea subiacentă.

Al doilea obiect al prezentei invenţii este o compoziţie farmaceutică pentru utilizare în prevenirea şi/sau tratamentul metastazelor pulmonare asociate cu osteosarcomul, care cuprinde un inhibitor al IL-8 şi excipienţi şi/sau diluanţi acceptabili farmaceutic, în care compoziţia farmaceutică cuprinde în plus cel puţin un inhibitor al IL-6 şi/sau cel puţin un inhibitor al gp130.

Termenul „inhibitor al IL-6», conform prezentei cereri, se referă la orice compus capabil să inhibe, parţial sau total, activitatea biologică a IL-6.

Termenul „inhibitor al gp130», conform prezentei cereri, se referă la orice compus capabil să inhibe, parţial sau total, activitatea biologică a gp130.

Conform unei alte variante de realizare preferate, compoziţia farmaceutică menţionată pentru prevenirea şi/sau tratamentul metastazelor pulmonare asociate cu osteosarcomul cuprinde în plus cel puţin un agent chimioterapeutic.

Conform unei variante de realizare preferate, inhibitorul gp130 menţionat este selectat din grupul care cuprinde hidrazida acidului 2-(7-fluoropirolo[1,2-a]chinoxalin-4-il) 2-pirazincarboxilic (SC144), Raloxifen şi (4R)-3-((2S,3S)-3-hidroxi-2-metil-4-metilenonanoil)-4-izopropildihidrofuran-2(3H)-onă (LMT-28) (Tae-Hwe Heo şi colab.; Oncotarget, Vol. 7, Nr. 13, 15460-15473; 2016).

Conform unei variante de realizare preferate, respectivul inhibitor al IL-6 este selectat din grupul format din SC144, Vobarilizumab, Siltuximab, Sirukumab, Olokizumab, Clazakizumab, MAb 1339, Tocilizumab şi Sarilumab (Tae-Hwe Heo şi colab.; Oncotarget, Vol. 7, Nr. 13, 15460-15473; 2016).

De preferinţă, respectivul inhibitor al IL-6 este SC144.

În scopul prezentei invenţii, inhibitorii IL-8 conform prezentei invenţii sunt formulaţi în compoziţii farmaceutice adecvate pentru utilizare prin formulare orală, cum ar fi tablete, capsule, siropuri, de preferinţă sub formă de formulări cu eliberare controlată sau prin administrare parenterală, de preferinţă sub formă de soluţii sterile adecvate pentru administrare intravenoasă sau intramusculară. Compoziţiile farmaceutice pot fi preparate conform metodelor convenţionale, de exemplu aşa cum este descris în Remington, „The Science and Practice of Pharmacy», ediţia a 21-a (Lippincott Williams şi Wilkins).

Doza zilnică medie depinde de mai mulţi factori, cum ar fi gravitatea bolii, afecţiunea, vârsta, sexul şi greutatea pacientului. Doza va varia în general de la 1 la 1500 mg de compuşi cu formula (I) pe zi, opţional împărţită în administrări multiple.

Invenţia va fi ilustrată în detaliu în secţiunea experimentală următoare.

SECŢIUNEA EXPERIMENTALĂ

Metode

Linii celulare şi culturi celulare primare. OS-17 a fost derivat din xenogrefa OS-17 şi s-a obţinut de la Istituti Ortopedici Rizzoli, Bologna, Italia. OS-25 şi OHS au fost oferite cadou de laboratorul Dr. Fodstad de la Spitalul Radium din Oslo. Toate au fost menţinute în RPMI (Corning #10-040-CV) suplimentat cu 10% FBS (Atlanta Biologicals #S11150H). Celulele 143B şi K7M2 au fost obţinute de la ATCC (ATCC #CRL8303 şi #CRL2836) şi crescute în DMEM (Corning #10-013-CV) suplimentat cu 10% FBS. OSCA-8 şi OSCA-16 au fost furnizate de Jamie Modiano şi Universitatea din Minnesota şi crescute în RPMI cu 10% FBS. Celulele musculare netede pulmonare (ATCC #PCS‑130‑10) au fost cultivate în mediu bazal pentru celule vasculare (ATCC #PCS‑100‑030) suplimentat cu kitul de creştere a celulelor musculare netede vasculare (ATCC #PCS‑100‑042). Celulele HUVEC (Lonza CC‑2517) au fost cultivate în mediu bazal endotelial (Lonza #CC‑5036) suplimentat cu EGM-plus single quote (Lonza #CC‑4542). Fibroblastele pulmonare umane (ATCC #PCS‑201‑013) au fost cultivate în EMEM (ATCC #30‑2003) suplimentat cu 10% FBS. Celulele HBEC3-KT (ATCC #CRL‑4051) au fost cultivate în mediu bazal pentru celule epiteliale ale căilor respiratorii (ATCC #PCS‑300‑030) suplimentat cu kitul de creştere a celulelor epiteliale bronşice (ATCC #PCS‑300‑040). Macrofagele au fost derivate din monocite izolate din sânge integral (obţinut printr-un protocol aprobat de IRB pentru obţinerea de sânge uman proaspăt) utilizând un sistem de selecţie cu sfere magnetice CD14 (Miltenyi #130‑050‑201), urmat de 72 de ore de cultură în mediu XVIVO fără ser (Lonza #04‑380Q) suplimentat zilnic cu 20 ng/ml de M-CSF uman recombinant (BioLegend #574802). Pentru experimentele de co-cultură, culturile din cadrul fiecărui grup (co-cultură şi monoculturi înrudite) au fost efectuate utilizând un amestec 1:1 din cele două medii de creştere corespunzătoare pentru a controla diferenţele dintre componentele mediului.

ELISA IL‑6 şi IL‑8. Supernatantele fără celule din culturile de 72 de ore ale fiecărei linii celulare, efectuate pe plăci cu 24 de godeuri, au fost evaluate pentru concentraţiile de IL-6 şi IL-8 utilizând kiturile de dezvoltare ELISA R&D DuoSet (#DY206 şi #DY208), utilizate conform recomandărilor producătorului.

Teste de cicatrizare („vindecarea rănilor»). Culturile în monostrat ale liniilor celulare OS-17 sau OHS au fost întrerupte utilizând un Essen Incucyte WoundMaker (Essen Cell Migration Kit #4493). Godeurile individuale au fost apoi vizualizate în serie utilizând un Essen Incucyte Zoom. Analiza a fost efectuată, iar lăţimea plăgii a fost cuantificată utilizând Modulul Integrat de Analiză a Migrării Celulare de la Essen (Essen # 9600-0012).

Teste de migrare şi invazie Transwell. 1 x 104 celule OS s-au depus pe plăci în inserţii transwell (fie Falcon #353097 pentru migrare, fie Corning #354483 pentru teste de invazie Matrigel) conţinând factori chemotactici corespunzători. După 24 de ore de incubare, godeurile transwell au fost drenate, iar suprafeţele superioare ale camerelor/membranelor au fost răzuite utilizând un tampon din poliester. Membranele au fost colorate utilizând un set de colorare Dif-Quik (Siemens #B4132‑1A) şi uscate, apoi vizualizate la un microscop inversat. Celulele au fost cuantificate utilizând instrumente de numărare Adobe Photoshop. Pentru experimentele care implică chemotaxia IL-6 şi IL-8, mediul conţinea 1% FBS în ambele camere, cu proteină recombinantă adăugată în camera inferioară pentru a obţine 50 ng/ml IL-6 (BioLegend #570804) sau 100 ng/ml IL-8 (BioLegend #574204). Pentru experimentele care au utilizat serul ca şi chemoatractant, camerele superioare au conţinut doar RPMI, în timp ce camerele inferioare au conţinut 1% sau 2,5% ser. Acolo unde s-a menţionat, în ambele camere, superioară şi inferioară, s-au adăugat 20 ug/ml de anticorpi neutralizanţi fie împotriva IL6 (Abcam #AB6672), fie împotriva IL-8 (Abcam #AB18672), fie împotriva ambelor. În experimentele care testează capacitatea moleculelor mici de a bloca migrarea/invazia indusă de ser, s-a adăugat în mediu 1 µM sc144 (Sigma #SML0763) şi/sau 100 nM DF2156A (Dompe Pharmaceuticals, Milano, Italia).

Proliferarea celulelor OS. Celulele depuse pe placă la o confluenţă de 20% au fost cultivate în mediu de creştere conform celor de mai sus, conţinând inhibitori, aşa cum se menţionează în fiecare figură. Proliferarea a fost cuantificată în serie utilizând un aparat Essen Biosciences Incucyte Zoom pe perioada de timp menţionată în fiecare figură.

Formarea coloniei. 1 x 104 celule OS s-au depus pe plăci în 1,5 ml de agar moale 0,5% (Lonza SeaPlaque GTG Agarose, #50111 în Gibco pulbere RPMI #430‑1800) pe un pat de 1,5 ml de agar moale 1%, în plăci cu 6 godeuri, apoi acoperite cu 500 ml RPMI. Acolo unde s-a menţionat, medicamentul a fost adăugat în stratul de RPMI suficient pentru a genera concentraţia indicată atunci când a fost difuzat atât în ​​mediu, cât şi în agar.

Studii de supravieţuire a xenogrefelor. Şoareci CB17-SCID (Envigo C.B‑17/IcrHsd-Prkdcscid) în vârstă de 6‑8 săptămâni, inoculaţi prin vena caudală cu 1 x 10⁶ celule OS-17 (ziua 0), au primit injecţii zilnice cu sc144 (10 mg/kg SC o dată pe zi, Sigma #SML0763), DF2156A (30 mg/kg IP o dată pe zi) sau ambele, începând cu 24 de ore după inoculare. sc144 s-a preparat prin dizolvare cu încălzire în DMSO pentru a obţine o soluţie de 40 mg/kg, care a fost imediat diluată la 2 mg/kg utilizând 40% propilenglicol/1% Tween‑20 în apă. Un şoarece mediu de 20 g a primit 100 ul per doză. Dozele de sc144 s-au preparat proaspăt în fiecare zi. DF2156A s-a preparat prin dizolvare în PBS pentru a crea o soluţie de 6 mg/ml pentru doze similare de 100 ul la un şoarece de 20 g. Tratamentele au continuat timp de 42 de zile, apoi au fost oprite. Şoarecii au fost monitorizaţi cu greutăţi de două ori pe săptămână şi scor îmbunătăţit al stării corporale (eBCS (28)). Şoarecii care au demonstrat o pierdere în greutate >10% sau eBCS <8 au fost eutanasiaţi, iar ţesuturile au fost recoltate, plămânii insuflaţi, fixaţi în formalină tamponată neutră 10%, apoi incluşi şi procesaţi conform celor de mai sus. Şoarecii care nu demonstrează o povară metastatică a bolii (probabil decedaţi din alte cauze) sunt eliminaţi în analiza supravieţuirii. Aceasta include 2 şoareci care au primit terapie combinată, unul care a primit sc144 şi un şoarece de control.

Studii de tratament în timp. Şoareci CB17-SCID în vârstă de 6-8 săptămâni au fost inoculaţi cu 1 x 10⁶ celule 143B, OSCA-8, OSCA-16 sau K7M2 (pentru celulele K7M2, s-au utilizat şoareci Balb/c imunocompetenţi). La 24 de ore după inoculare, şoarecii au început tratamentul cu sc144 şi/sau DF2156A zilnic, care a continuat timp de 42 de zile, ca mai sus. Şoarecii au fost apoi observaţi ca mai sus, până când un şoarece din orice grup de linie celulară dată a atins punctul final. Dacă plămânii prelevaţi de la acest şoarece santinelă au prezentat semne de boală metastatică, toţi şoarecii din acel grup au fost eutanasiaţi, plămânii au fost recoltaţi, insuflaţi, fixaţi, incluşi şi coloraţi. O secţiune centrală a lobului stâng colorată cu H&E a fost vizualizată din nou utilizând microscopia pentru a număra leziunile metastatice de către un recenzent experimentat, orb. Analiză statistică. Datele au fost reprezentate grafic şi analizate utilizând Graphpad Prism 7. Testele statistice specifice utilizate şi comparaţiile efectuate sunt identificate în legenda fiecărei figuri. Acolo unde a fost necesar, s-au efectuat ajustări pentru comparaţii multiple utilizând metoda Benjamini-Hochberg pentru a controla o rată de descoperire falsă de 0,05.

Exemplul 1

Producţia de IL-6 şi IL-8 se corelează cu potenţialul metastatic în modelele murine de xenogrefă de colonizare pulmonară.

Prezenţii inventatori au testat un grup de linii celulare de osteosarcom pentru a determina capacitatea lor de a coloniza plămânul de şoarece. Prezenţii inventatori au descoperit că celulele OS-17, atunci când sunt introduse în circulaţie prin vena caudală, dezvoltă loci metastatici cu o eficienţă foarte mare, în timp ce liniile celulare OHS demonstrează o eficienţă metastatică mult mai mică (Figura 1). Acest efect a rămas constant pe parcursul mai multor pasaje ale celulelor şi al mai multor teste. Prezenţii inventatori au testat aceste linii celulare pentru producerea de IL-6 şi IL-8 prin supunerea supernatantului fără celule la testul ELISA (Figura 1d), care a relevat o corelaţie puternică între producerea ambelor citokine din celulele tumorale şi capacitatea liniei celulare de a coloniza plămânul murin.

IL-6 şi IL-8 stimulează chemokineza şi migrarea direcţională în celulele OS, indiferent de potenţialul metastatic.

Pentru a demonstra dacă aceste linii celulare cu metastaze înalte şi slabe menţin caracteristici care răspund la aceste citokine, am efectuat atât teste de cicatrizare (teste de vindecare a rănilor), cât şi teste de migrare transwell pentru a evalua răspunsul. Plăgile standardizate create atât în ​​monostraturi de celule OS-17, cât şi OHS s-au închis mai eficient atunci când au fost cultivate în medii suplimentate cu IL-6 şi/sau IL-8, demonstrând că oricare dintre citokine poate stimula chemokineza (creşterea motilităţii celulare) în oricare dintre liniile celulare, indiferent de orice producţie bazală a citokinei respective. Aceste celule prezintă rezultate similare în testele care testează migrarea direcţională. Atât celulele OS-17, cât şi cele OHS cultivate în camera superioară a unui sistem transwell prezintă o migrare direcţională puternică ca răspuns la gradienţii chemotactici ai IL-6 sau IL-8.

Efectul DF2156A singur sau în combinaţie cu sc144 pentru a preveni migrarea direcţională şi invazia celulelor OS

Pentru a determina importanţa acestor citokine pentru migrarea celulelor OS într-un mediu mult mai larg de posibili factori chemotactici, inventatorii de faţă au examinat efectul pe care blocarea IL-6 şi/sau IL-8 l-ar putea avea atunci când se utilizează serul ca chemoatractant. Ambele linii celulare au demonstrat o migrare transwell foarte puternică, cât şi o invazie printr-o barieră matrigel, ca răspuns la un gradient chemotactic al serului (Figura 1e-f). O oarecare scădere a răspunsului chemotactic a fost evidentă atunci când anticorpii blocanţi ai IL-6 sau IL-8 au fost adăugaţi în mediul de cultură, deşi s-a observat un efect mult mai profund atunci când anticorpii au fost combinaţi. Un efect mai profund a fost observat în experimente similare utilizând inhibitori cu molecule mici ai receptorilor pentru IL-6 şi IL-8 (sc144, care stimulează degradarea gp130 printr-un mecanism nou şi DF2156A, un inhibitor alosteric al CXCR1 şi CXCR2). Prin inhibarea la nivel de receptor, blocarea oricăreia dintre căi este suficientă pentru a preveni migrarea direcţională şi invazia (Figura 2), ceea ce sugerează că un anumit nivel de activare a acestor căi, probabil prin citokine non-IL-6 şi non-IL-8 este necesar pentru ca celulele OS să producă aceste comportamente. Ambii inhibitori au redus semnificativ cantitatea de migrare a celulelor OS.

Exemplul 2

Efectul DF2156A singur sau în combinaţie cu sc144 în prevenirea metastazelor pulmonare

Pentru a evalua importanţa funcţională a căilor IL-6 şi IL-8 la metastazele pulmonare OS, inventatorii de faţă au utilizat modele de xenogrefă. Şoarecii Balb-SCID inoculaţi prin vena caudală cu 1x106 celule OS-17 marcate cu luciferază au primit tratament cu sc144 (inhibitorul gp130), DF2156A (inhibitorul CXCR1/2) sau ambele. Şoarecii au continuat să primească tratament timp de 42 de zile, după care tratamentul s-a oprit. Imagistica intravitală pentru evaluarea in vivo a încărcăturii tumorale a fost efectuată la 14 şi 24 de zile utilizând tehnici bioluminescente standard. Imagistica bioluminescentă a sugerat o scădere semnificativă a încărcăturii tumorale în plămânii şoarecilor care au primit terapie combinată în comparaţie cu cei care nu au primit niciun tratament sau au primit terapie cu un singur agent (Figura 3 A). Este important de menţionat că imagistica nu a arătat migrarea celulelor tumorale în alte organe, ci o pierdere generală a bioluminescenţei, sugerând o supravieţuire generală scăzută a celulelor tumorale circulante. Doi şoareci din fiecare grup de tratament cu un singur agent au fost eutanasiaţi la 24 de ore după a 14-a doză de medicament pentru a efectua o evaluare farmacodinamică (PD) a inhibării ţintei. Plămânii de la aceşti şoareci coloraţi cu IHC fie pentru pFAK (DF2156A), fie pentru pSTAT3 (gp130) au prezentat o inhibare susţinută a ţintei (adică activitate susţinută a medicamentului) la nivelul minim de dozare (Figura 4).

După tratament, şoarecii au fost observaţi până la demonstrarea semnelor de deteriorare clinică, fie pierdere în greutate >10%, fie scor îmbunătăţit al stării corporale (eBCS) <8, criteriile noastre finale definite. La momentul final, şoarecii au fost eutanasiaţi utilizând metode aprobate, iar plămânii au fost recoltaţi, insuflaţi, fixaţi, incluşi, secţionaţi şi coloraţi. Analiza supravieţuirii (Figura 3 B) a arătat că aproape toţi şoarecii care nu au primit terapie medicamentoasă sau cu agent unic au dezvoltat metastaze pulmonare letale în decurs de 60 de zile. În special, şoarecii care nu au primit niciun medicament au dezvoltat metastaze pulmonare letale mai devreme decât şoarecii care au primit un agent unic. În timp ce majoritatea şoarecilor care au primit terapie combinată (inhibitor gp130 + inhibitor CXCR1/2) au rămas sănătoşi la >100 de zile. Şoarecii care nu au demonstrat metastaze pulmonare evidente pe secţiunile pulmonare au fost eliminaţi din analiza supravieţuirii (n=2).

Exemplul 3

Efectul combinaţiei DF2156A cu sc144 în prevenirea metastazelor pulmonare în modele multiple de OS

Pentru a se asigura că rezultatele obţinute în aceste studii au fost aplicabile pe scară largă şi nu sunt specifice xenogrefelor imunodeficiente sau celulelor OS-17, inventatorii de faţă au repetat experimentele legate de tratament utilizând o serie de modele diferite. Acestea au inclus un model singenic, imunocompetent, utilizând o linie celulară derivată dintr-o OS apărută spontan la un şoarece Balb/c (K7M2), modele de xenogrefă de OS canină (OSCA-8 şi OSCA-16) şi modele suplimentare de xenogrefă de OS umană (143B). Şoarecii inoculaţi cu celule tumorale au fost trataţi fie fără medicament, fie cu sc144 şi DF2156A combinate timp de 42 de zile. În momentul în care cel puţin un şoarece din orice grup (orice linie celulară) a atins punctul final cu metastaze pulmonare confirmate, toţi şoarecii din acel grup au fost eutanasiaţi, plămânii au fost recoltaţi, iar leziunile metastatice au fost cuantificate. Capacitatea inhibării duale a gp130-CXCR1/2 de a preveni dezvoltarea leziunilor pulmonare metastatice a rămas constantă în toate modelele (Figura 5).

Claims (14)

1. Produs sau kit pentru utilizare în prevenirea şi/sau tratamentul metastazelor pulmonare asociate cu osteosarcomul, produsul sau kitul cuprinzând: A) un inhibitor al IL-8 şi B) cel puţin un inhibitor al IL-6 şi/sau cel puţin un inhibitor al gp130, A) şi B) fiind două formulări separate pentru utilizare simultană, separată sau secvenţială.

2. Produs sau kit pentru utilizare conform revendicării 1, în care respectivul inhibitor al IL-8 este un compus cu formula (1)

în care, - R1 este hidrogen sau CH3; - R2 este hidrogen sau alchil C1-C4 liniar, de preferinţă este hidrogen; - Y este un heteroatom selectat dintre S, O şi N; de preferinţă este S; - Z este selectat dintre halogen, alchil C1-C4 liniar sau ramificat, alchenil C2-C4, alchinil C2-C4, alcoxi C1-C4, hidroxil, carboxil, aciloxi C1-C4, fenoxi, ciano, nitro, amino, acilamino C1-C4, haloalchil C1-C3, haloalcoxi C1-C3, benzoil, alcansulfonat C1-C8 liniar sau ramificat, alcansulfonamidă C1-C8 liniară sau ramificată, alchilsulfonilmetil C1-C8 liniar sau ramificat; de preferinţă este trifluorometil; - X este OH sau un rest cu formula NHR3; în care R3 este selectat dintre: - hidrogen, hidroxil, alchil C1-C6 liniar sau ramificat, cicloalchil C3-C6, alchenil C2-C6, alcoxi C1-C5, - sau fenilalchil C1-C6, în care gruparea alchil, cicloalchil sau alchenil poate fi substituită cu un rest COOH - un rest cu formula SO2R4, în care R4 este alchil C1-C2, cicloalchil C3-C6, haloalchil C1-C3.

3. Produsul sau kitul pentru utilizare conform revendicării 2, în care respectivul inhibitor al IL-8 cu formula (I): R1 este hidrogen sau CH3; X este OH; R2 este hidrogen sau alchil C1-C4 liniar, Y este un heteroatom selectat dintre S, O şi N; Z este selectat dintre alchil C1-C4 liniar sau ramificat, alcoxi C1-C4 liniar sau ramificat, haloalchil C1-C3 şi haloalcoxi C1-C3.

4. Produs sau kit pentru utilizare conform revendicării 2, în care în respectivul inhibitor al IL-8 cu formula (1) R1 este hidrogen, atomul de carbon chiral al grupării fenilproprionice este în configuraţie S.

5. Produs sau kit pentru utilizare conform revendicărilor 2 sau 3, în care respectivul inhibitor al IL-8 cu formula (I) este selectat dintre acid 2-metil-2-(4-{[4-(trifluorometil)-1,3-tiazol-2-il]amino}fenil) propanoic şi sărurile farmaceutic acceptabile ale acestuia, de preferinţă sarea sa de sodiu şi acid (2S)-2-(4-{[4-(trifluorometil)-1,3-tiazol-2-il]amino}fenil) propanoic şi sărurile farmaceutic acceptabile ale acestuia, de preferinţă sarea sa de sodiu.

6. Produs sau kit pentru utilizare conform revendicării 1, în care respectivul inhibitor al IL-8 este un compus cu formula (II)

sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, în care: R4 este alchil C1‑C6 liniar sau ramificat, benzoil, fenoxi, trifluorometansulfoniloxi; de preferinţă acesta este selectat dintre benzoil, izobutil şi trifluorometansulfoniloxi; R5 este H sau alchil C1-C3 liniar sau ramificat, de preferinţă acesta este H; R6 este alchil C1‑C6 liniar sau ramificat sau trifluorometil; de preferinţă, acesta este un alchil C1-C6 liniar sau ramificat, mai preferat acesta este CH3.

7. Produs sau kit pentru utilizare conform revendicării 6, în care R4 este în poziţia 3 sau 4 pe inelul fenil, mai preferat acesta este 3-benzoil, 4-izobutil sau 4-trifluorometansulfoniloxi.

8. Produs sau kit pentru utilizare conform revendicării 1, în care respectivul inhibitor al IL-8 este un compus cu formula (III)

sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, în care, R' este hidrogen; R este un rest cu formula SO2Ra în care Ra este alchil C1-C4 liniar sau ramificat sau haloalchil C1-C3, de preferinţă acesta este CH3.

9. Produs sau kit pentru utilizare conform revendicării 6, în care în respectivul inhibitor al IL-8 cu formula (II), atomul de carbon chiral al grupării fenilpropionice este în configuraţie R.

10. Produs sau kit pentru utilizare conform revendicării 6, în care respectivul inhibitor al IL-8 cu formula (II) este selectat dintre R-(-)-2-(4-izobutilfenil)propionil metansulfonamidă şi sărurile acceptabile farmaceutic ale acesteia, de preferinţă de lizină in situ.

11. Produs sau kit pentru utilizare conform oricăreia dintre revendicările de la 6 la 9, în care respectivul inhibitor al IL-8 este R(-)-2-(4-trifluorometansulfoniloxi)fenil]-N-metansulfonil propionamida şi sărurile acceptabile farmaceutic ale acesteia, de preferinţă sarea sa de sodiu.

12. Produs sau kit pentru utilizare conform revendicării 1, în care respectivul cel puţin un inhibitor al gp130 este selectat din grupul care cuprinde hidrazida acidului 2-(7-fluoropirolo[1,2-a]chinoxalin-4-il)-2-pirazincarboxilic, Raloxifen şi (4R)-3-((2S,3S)-3-hidroxi-2-metil-4-metilenonanoil)-4-izopropildihidrofuran-2(3H)-onă.

13. Produs sau kit pentru utilizare conform revendicării 1, în care respectivul cel puţin un inhibitor al IL-6 este selectat din grupul care cuprinde SC144, Vobarilizumab, Siltuximab, Sirukumab, Olokizumab, Clazakizumab, MAb 1339, Tocilizumab şi Sarilumab.

14. Compoziţie farmaceutică pentru utilizare în prevenirea şi/sau tratamentul metastazelor pulmonare asociate cu osteosarcomul, care cuprinde un inhibitor al IL-8 şi excipienţi şi/sau diluanţi acceptabili farmaceutic, în care compoziţia farmaceutică cuprinde în plus cel puţin un inhibitor al IL-6 şi/sau cel puţin un inhibitor al gp130.