CN111343973A - 用于治疗一些肉瘤的il-8抑制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及可用于治疗和/或预防一些肉瘤(优选地可用于治疗和/或预防骨肉瘤、尤因肉瘤、横纹肌肉瘤，或与其相关的肺转移)的IL‑8抑制剂化合物(优选双重CXCR1/CXCR2受体抑制剂)。
Description
技术领域
本发明涉及用于预防和/或治疗一些肉瘤(优选骨肉瘤、尤因肉瘤(Ewingsarcoma)、横纹肌肉瘤，或与其相关的肺转移)的IL-8抑制剂。本发明还涉及包含IL-8抑制剂与IL-6抑制剂或与化学治疗剂的药物组合物、产品/药盒(kit)。
背景技术
骨和软组织肉瘤是一组罕见的异质性形式的癌症，其总计占诊断出的所有恶性肿瘤的约1％。肉瘤对于临床医师是一个挑战，因为其罕见而且诊断通常被延迟。
肉瘤存在超过一百种不同的形态亚型。骨肉瘤的最常见类型是骨肉瘤、软骨肉瘤、尤因肉瘤和脊索瘤(chordoma)。软组织肉瘤从以下发生：软组织细胞，包括平滑肌细胞(平滑肌肉瘤)、脂肪细胞(脂肪肉瘤)；纤维结缔组织(纤维肉瘤)；骨骼肌(横纹肌肉瘤)；滑膜(滑膜肉瘤)；血管(血管肉瘤)；乳腺导管(叶状肿瘤(phyllode tumor))和神经(神经鞘瘤(nerve sheath tumor))。
骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是一种侵袭性恶性肿瘤，其起源于间充质来源的原始转化细胞(并且因此是肉瘤)并且表现出成骨细胞分化并产生恶性类骨质(osteoid)。
其是原发性骨癌最常见的组织学形式，并且其在青少年(teenager)和年轻人(young adult)中最普遍。
癌症的彻底根治性切除、手术切除、整块(en bloc)切除是骨肉瘤中的治疗选择。尽管约90％的患者能够进行肢-挽救手术，但是并发症(特别是感染、假体松动和不愈合(non-union)或局部肿瘤复发)可导致需要进一步手术或截肢术。
标准治疗是在可能时进行肢-挽救矫形手术(或在一些情况下为截肢术)和化学治疗的组合。
尤因肉瘤(Ewing sarcoma，ES)是一种高度侵袭性骨肿瘤，其中在青少年群体(adolescent population)中发病率最高。其具有高转移倾向，这与约25％的不良存活率(dismal survival rate)相关(Satterfield，L.et al，Int.J.Cancer，141：2062-2075；2017；Beverly A.Teicher et al，Ann Saudi Med.，31(2)：174-182；2011)。
肿瘤的尤因肉瘤家族(Ewing sarcoma family oftumor，ESFT)的成员包含产生致癌转录因子(最常见的是EWS/FLI1)的肿瘤相关易位。EWS/FLI1通过调节数百种靶基因的表达在肿瘤进展中发挥主导作用。在此，EWS/FLI1抑制(其通过RNAi介导的敲低进行)对细胞信号传导的影响如下进行研究：使用基于质谱的磷酸化蛋白质组学以对磷酸化的整体变化进行定量。这种无偏差的方法鉴定了在过程例如细胞周期和细胞骨架组构的调节中富含的数百种独特的磷酸肽(phosphopeptide)。特别地，磷酸酪氨酸谱分析(phosphotyrosineprofiling)揭示在EWS/FLI1敲低之后STAT3磷酸化的较大上调。然而，单细胞分析表明这不是EWS/FLI1缺乏的细胞自主效应，而是在其中不发生敲低的细胞中发生的信号传导效应。来自敲低细胞的条件培养基(conditioned media)足以在对照细胞中诱导STAT3磷酸化，这验证了存在可激活STAT3的可溶性因子。细胞因子分析和配体/受体抑制实验确定这种激活部分地通过IL6依赖性机制发生。综上所述，数据支持其中EWS/FLI1缺乏导致分泌可溶性因子(例如IL6)的模型，所述可溶性因子在维持EWS/FLI1表达的旁邻细胞(bystander cell)中激活STAT信号传导。此外，示出了这些可溶性因子针对凋亡提供保护(JenniferL.Anderson et al；Mol Cancer Res；12(12)；2014；Andrej Lissat et al，BMC Cancer，15：552；2015)。
横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma，RMS)是一种侵袭性和高度恶性形式的癌症，其从无法完全分化的骨骼(横纹)肌细胞发生。其通常被认为是儿童疾病，因为绝大多数病例在低于18岁的那些中发生。
尽管是相对罕见的癌症，但是其占所有记录的软组织肉瘤的约40％。RMS可发生在身体的任何部位，但主要见于头、颈、眶(orbit)、泌尿生殖道、生殖器和四肢。
横纹肌肉瘤的治疗是多学科的实践，其涉及使用手术、化学治疗、辐射以及可能的免疫治疗。手术通常是组合治疗方法中的第一步。可切除性取决于肿瘤部位而变化，并且RMS通常出现于不允许完全手术切除而无显著病态和功能丧失的部位中。少于20％的RMS肿瘤用阴性切缘完全切除。幸运的是，横纹肌肉瘤通常是化学敏感的，其中约80％的病例响应于化学治疗。多药剂化学治疗适用于患有横纹肌肉瘤的所有患者。在使用涉及化学治疗剂的辅助和新辅助治疗之前，仅通过手术手段进行治疗的存活率＜20％。具有辅助治疗的近期存活率(modern survival rate)为约60％至70％。
转移杀伤患有实体瘤的患者。这在骨肉瘤中最明显。致命的骨癌骨肉瘤(OS)主要通过转移扩散至肺而进行杀伤。导致这种肺向性(lung tropism)的机制依然未知。无论是在诊断时出现严重转移性疾病的患者或者在完成治疗之后多年出现转移的患者，患有局限性疾病的患者的5年总存活率都相对良好为70％，而患有肺转移的患者的2年存活率则为糟糕的15％(Allison D.C.et al；Sarcoma 2012，704872；2012)。
尽管进行了多种尝试来增强治疗或寻找新治疗用于转移性疾病，但在超过40年里，没有已显著改善结局的治疗。显然，将需要新方法以便介入转移性骨肉瘤的治疗(Luetke A.et al.；Cancer Treat.Rev.40，523-32；2014)。本领域中的大批研究人员提出，对转移之生物学没有更好的了解，以及对靶向这些途径的药物的开发，将不可能取得骨肉瘤治疗中的进一步进展(Khanna C.et al；Clin Cancer Res；20(16)；1-10；2014)。
一些现有技术涉及在患有转移性横纹肌肉瘤的儿童中鉴定与结局相关的风险因素(Oberlin O.et al；Journal of Clinical Oncology，2008May 10；26(14)：2384-2389)以及涉及在患有横纹肌肉瘤(RMS)和仅肺转移性疾病的儿童中鉴定与结局相关的风险因素(J.Pediatr.Surg.，2005Jan.；40(1)：256-62)。
在患有骨肉瘤的儿童和青少年中预防出现肺转移的治疗可挽救目前死于其疾病的那些中的超过70％的生命。
白介素-8(IL-8；CXCL8)被认为是PMN(多形核嗜中性粒细胞)募集的主要介质，并且参与数种病理状况，包括银屑病、类风湿性关节炎、慢性阻塞性肺疾病和移植器官中的再灌注损伤(Griffin et al，Arch Dermatol 1988，124：216；Fincham et al，J Immunol1988，140：4294；Takematsu et al，Arch Dermatol 1993，129：74；Liu et al，1997，100：1256；Jeffery，Thorax 1998，53：129；Pesci et al，Eur Respir J.1998，12“380；Lafer etal，Br J Pharmacol.1991，103：1153；Romson et al，Circulation 1993，67：1016；Welboumet al，Br J Surg.1991，78：651；Sekido et al，Nature 1993，365，654)。IL-8的生物活性通过与属于在人PMN表面上表达的7TM-GPCR家族的两种受体CXCR1和CXCR2相互作用来介导。虽然CXCR1是选择性的，以高亲和力仅结合两种趋化因子CXCL6和IL-8，并显示出对IL-8高得多的亲和力(Wolf et al，Eur J Immunol 1998，28：164)，但人CXCR2是更混杂(promiscuous)的受体，结合许多不同的细胞因子和趋化因子。因此，CXCR2介导许多不同生物分子的活性。
白介素-6(IL-6)是在免疫调节、炎症和肿瘤发生中具有多种功能的一种多效细胞因子。IL-6与IL-6受体(IL-6R)的结合诱导糖蛋白130(gp130)的同二聚化和募集，这导致下游信号传导的激活。
Gp130是至少8种细胞因子(IL-6、IL-11、IL-27、LIF、CNTF、OSM、CT-1和CLC)的受体信号传导复合体的一部分。配体结合诱导gp130与细胞因子特异性受体a链缔合，随后激活下游信号传导级联反应，包括JAK/STAT、RAS/RAF/MAPK和PI3K/AKT途径。已经显示gp130在Ser782的磷酸化下调了gp130的细胞表面表达。作为普遍表达的受体，gp130参与广泛的重要生物过程，包括炎症、自身免疫、癌症、干细胞维持和胚胎发育(Mol Cancer Ther；12(6)；937-49；2013)。
发明概述
本发明人出人意料地发现IL-8的抑制能够降低或预防与骨肉瘤、尤因肉瘤或横纹肌肉瘤相关的肺转移的发生。特别地，IL-8抑制剂与IL-6抑制剂的组合的结果更有效。
本发明人还出人意料地发现IL-8抑制剂可用于预防和/或治疗原发性肿瘤骨肉瘤、尤因肉瘤或横纹肌肉瘤。优选地，当IL-8抑制剂与化学治疗剂组合时。
因此，本发明的第一目的是IL-8抑制剂(优选抗体或小分子量分子，优选CXCR1抑制剂，更优选双重CXCR1/CXCR2抑制剂)，其用于预防和/或治疗骨和软组织肉瘤，优选骨肉瘤、尤因肉瘤、横纹肌肉瘤，或与其相关的肺转移。
本发明的第二目的是如上所限定的所述IL-8抑制剂用于制备用于预防和/或治疗骨和软组织肉瘤(优选骨肉瘤、尤因肉瘤、横纹肌肉瘤，或与其相关的肺转移的药物)的用途。
本发明的第三目的是用于预防和/或治疗骨和软组织肉瘤(优选骨肉瘤、尤因肉瘤、横纹肌肉瘤，或与其相关的肺转移)的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗有效量的所述IL-8抑制剂的步骤。
本发明的第四目的是用于预防和/或治疗骨和软组织肉瘤(优选骨肉瘤、尤因肉瘤、横纹肌肉瘤，或与其相关的肺转移)的药物组合物，其包含根据本发明的IL-8抑制剂以及可药用赋形剂和/或稀释剂。
根据一个优选实施方案，用于预防和/或治疗骨和软组织肉瘤(优选骨肉瘤、尤因肉瘤、横纹肌肉瘤，或与其相关的肺转移，更优选肺转移)的所述药物组合物还包含至少一种IL-6抑制剂和/或至少一种gp130抑制剂。
根据另一个优选实施方案，用于预防和/或治疗骨和软组织肉瘤(优选骨肉瘤、尤因肉瘤、横纹肌肉瘤，或与其相关的肺转移，更优选原发性肿瘤)的所述药物组合物还包含至少一种化学治疗剂。
本发明的第五和第六目的是用于治疗和/或预防骨和软组织肉瘤(优选骨肉瘤、尤因肉瘤、横纹肌肉瘤，或与其相关的肺转移)的产品或药盒，其包含用于同时、分开或依次使用的如上所限定的IL-8抑制剂和一种或更多种药物活性化合物。
附图说明
-图1示出了在转移的异种移植物模型中IL6和IL8表达与转移效率和转移行为相关。将接种有1×106个OS细胞的CB17-SCID小鼠在接种之后49天进行安乐死。a)从那些小鼠中取得的肺块的总体外观表明，OS-17相对于其他细胞系的定植效率显著更高。b)对来自经石蜡包埋的左叶切片的H&E染色进行计数以对每个切片的转移数目进行定量。c)定量揭示相对于OHS在OS-17切片中的转移数目显著更高。d)来自每种细胞系的培养物中在72小时上清液中IL-6和II-8浓度的确定揭示了相对于任一非转移性细胞系在转移性OS-17细胞中这两种细胞因子的显著表达。e)至f)使用transwell迁移测定评价响应于IL-6和IL-8信号的能力。
-图2示出了单独的或与sc144组合的DF2156A在OS-17细胞中降低针对血清的趋化应答的作用。将OS细胞在transwell室膜上进行培养，然后将其转移至包含具有2.5％FBS的RPMI(pos ctl)或单独的RPMI(neg ctl)的室中。将下室中包含2.5％FBS的另一些孔用1uMsc144、10nM DF2156A或二者进行处理。在24小时之后，将上室划净，对膜进行染色并对细胞进行计数。
-图3示出了IL-6和IL-8途径抑制对转移性肺定植的作用。将接种有1×106OS-17-1uc细胞的小鼠用IL-6的药理抑制剂(sc144)、IL-8的药理抑制剂(DF2156A)或二者进行处理。A)在接种之后28天完成生物发光成像。B)A)中示出的小鼠的生存分析。
-图4示出了在用DF2156A和sc144处理的小鼠的肺组织中的PD分析。将每天用DF2156A或sc144的注射剂处理的小鼠在其药物的第14剂量之后24小时进行安乐死。从这些小鼠中收获的肺使用标准FFPE进行处理，然后进行切片并用IHC针对pFAK(IL-8的下游)或pSTAT3(IL-6的下游)进行染色。受体阻滞降低了见到的激活量和浸润细胞的数目，即使在谷浓度(trough concentration)下也是如此。
-图5示出了在多种OS模型中DF2156A与sc144的组合在预防肺转移中的作用。在接种OS细胞之后，小鼠接受载剂处理或用sc144和DF2156A二者进行处理持续42天的时期。在任一组中的一只小鼠符合终点标准时，将该研究内的所有小鼠进行安乐死并收获肺，对转移性病变进行计数。
发明详述
如将在实验部分中详细公开的那样，本发明人已经发现在肉瘤的动物模型中用作IL-8活性抑制剂的分子具有治疗效力。此外，本发明人还已发现IL-8抑制能够抵消肺转移的发作。特别地，组合的IL-8和IL-6抑制预防转移。
因此，本发明的第一目的是IL-8抑制剂，其用于治疗和/或预防骨和软组织肉瘤，优选骨肉瘤、尤因肉瘤或横纹肌肉瘤。
根据一个优选实施方案，所述IL-8抑制剂用于预防和/或治疗与骨肉瘤、尤因肉瘤或横纹肌肉瘤相关的肺转移。
根据本申请的术语“IL-8抑制剂”是指能够部分或完全地抑制IL-8生物活性的任何化合物。这样的化合物可通过降低IL-8的表达或活性或者通过抑制由IL-8受体激活的胞内信号传导的触发而发挥作用。优选地，所述IL-8抑制剂能够以等于或低于500nM(优选低于100nM)的浓度在PMN中抑制由IL-8诱导的至少50％(优选至少60％)的趋化性。
根据一个优选实施方案，本发明所有目的的IL-8抑制剂抑制由CXCR1受体介导的或由CXCR1和CXCR2的受体二者介导的IL-8的活性。
优选地，根据该实施方案，所述IL-8抑制剂是CXCR1受体或CXCR1和CXCR2的受体二者的别构抑制剂(allosteric inhibitor)或正构拮抗剂(orthosteric antagonist)。
优选地，所述IL-8抑制剂对CXCR1受体具有选择性或针对CXCR1和CXCR2受体同等强效。
根据本发明的“对CXCR1具有选择性”意指针对CXCR1的log高于针对CXCR2的log显示IC50值为至少2(优选3)的化合物。(Bertini R.et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA(2004)，101(32)，pp.11791-11796)。
“针对CXCR1和CXCR2同等高效”意指针对CXCR1和CXCR2显示IC50值为10皮摩尔(10-11M)至1微摩尔(10-6M)的化合物。(Bertini R.et al.，Br.J.Pharm.(2012)，165，pp.436-454)。
更优选地，根据本发明的IL-8抑制剂针对CXCR1受体的IC50值在低纳摩(nanomolar)范围内，优选地为0.02至5纳摩。
根据一个优选实施方案，也与前述实施方案组合，所述IL-8抑制剂选自小分子量分子和抗体，更优选地其是小分子量分子。
根据上述限定的能够抑制由CXCR1受体介导的或由CXCR1和CXCR2的受体二者介导的IL-8的活性的IL-8抑制剂是本领域中已知的。
根据本发明的优选IL-8抑制剂选自1，3-噻唑-2-基氨基苯基丙酸衍生物、2-苯基-丙酸衍生物，及其可药用盐。
在上述化合物中，所述1，3-噻唑-2-基氨基苯基丙酸衍生物优选地是式(I)化合物或其可药用盐：
其中：
-R1是氢或CH3；
-R2是氢或直链C1-C4烷基，优选地，其是氢；
-Y是选自S、O和N的杂原子；优选地，其是S；
-Z选自卤素、直链或支链的C1-C4烷基、C2-C4烯基、C2-C4炔基、C1-C4烷氧基、羟基、羧基、C1-C4酰氧基、苯氧基、氰基、硝基、氨基、C1-C4酰氨基、卤代C1-C3烷基、卤代C1-C3烷氧基、苯甲酰基、直链或支链的C1-C8链烷磺酸酯(C1-C8 alkanesulfonate)、直链或支链的C1-C8链烷磺酰胺(C1-C8 alkanesulfonamide)、直链或支链的C1-C8烷基磺酰基甲基；优选地，其是三氟甲基；
-X是OH或式NHR3的残基；其中R3选自：
-氢、羟基、直链或支链的C1--C6烷基、C3-C6环烷基、C2--C6烯基、C1-C5烷氧基，
或C1-C6苯基烷基，其中烷基、环烷基或烯基可被COOH残基取代-式SO2R4的残基，其中R4是C1-C2烷基、C3-C6环烷基、C1-C3卤代烷基。
优选地，在上述化合物中，X是OH。
在上述化合物中，特别优选的是所述式(I)化合物或其可药用盐，其中：
R1是CH3；
R2是氢或直链C1-C4烷基，优选地，其是氢；
Y是选自S、O和N的杂原子；优选地，其是S；
Z选自卤素、直链或支链的C1-C4烷基、C2-C4烯基、C2-C4炔基、C1-C4烷氧基、羟基、羧基、C1-C4酰氧基、苯氧基、氰基、硝基、氨基、C1-C4酰氨基、卤代C1-C3烷基、卤代C1-C3烷氧基、苯甲酰基、直链或支链的C1-C8链烷磺酸酯、直链或支链的C1-C8链烷磺酰胺、直链或支链的C1-C8烷基磺酰基甲基；优选地，其是三氟甲基；
X是OH或式NHR3的残基；其中R3选自：
-氢、羟基、直链或支链的C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C2-C6烯基、C1-C5烷氧基，
或C1-C6苯基烷基，其中烷基、环烷基或烯基可被COOH残基取代-式SO2R4的残基，其中R4是C1-C2烷基、C3-C6环烷基、C1-C3卤代烷基。
优选地，在这些化合物中，X是OH。
在上述化合物中，还特别优选的是所述式(I)化合物或其可药用盐，其中：
R1是氢；
R2是氢或直链C1-C4烷基，优选地，其是氢；
Y是选自S、O和N的杂原子；优选地，其是S；
Z选自卤素、直链或支链的C1-C4烷基、C2-C4烯基、C2-C4炔基、C1-C4烷氧基、羟基、羧基、C1-C4酰氧基、苯氧基、氰基、硝基、氨基、C1-C4酰氨基、卤代C1-C3烷基、卤代C1-C3烷氧基、苯甲酰基、直链或支链的C1-C8链烷磺酸酯、直链或支链的C1-C8链烷磺酰胺、直链或支链的C1-C8烷基磺酰基甲基；优选地，其选自三氟甲基；
X是OH或式NHR3的残基；其中R3选自：
-氢、羟基、直链或支链的C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C2-C6烯基、C1-C5烷氧基，
或C1-C6苯基烷基，其中烷基、环烷基或烯基可被COOH残基取代；
-式SO2R4的残基，其中R4是C1-C2烷基、C3-C6环烷基、C1-C3卤代烷基。更优选地，X是NH2。
优选地，在上述化合物中，X是OH。
在上述化合物中，还特别优选的是所述式(I)化合物或其可药用盐，其中：
R1是氢或CH3；
R2是氢或直链C1-C4烷基，优选地，其是氢；
Y是选自S、O和N的杂原子；优选地，其是S；
Z选自直链或支链的C1-C4烷基、直链或支链的C1-C4烷氧基、卤代C1-C3烷基和卤代C1-C3烷氧基；优选地，其选自甲基、甲氧基、三氟甲氧基、三氟甲基，更优选地，其是三氟甲基；
X是OH。
在上述化合物中，还特别优选的是所述式(I)化合物或其可药用盐，其中：
R1是CH3；
R2是氢或直链C1-C4烷基，优选地，其是氢。
Y是选自S、O和N的杂原子；优选地，其是S。
Z选自直链或支链的C1-C4烷基、直链或支链的C1-C4烷氧基、卤代C1-C3烷基和卤代C1-C3烷氧基；优选地，其选自甲基、甲氧基、三氟甲氧基、三氟甲基，更优选地，其是三氟甲基。
在上述化合物中，还特别优选的是所述式(I)化合物或其可药用盐，其中：
R1是氢；
X是OH；
R2是氢或直链C1-C4烷基，优选地，其是氢；
Y是选自S、O和N的杂原子；优选地，其是S；
Z选自直链或支链的C1-C4烷基、直链或支链的C1-C4烷氧基、卤代C1-C3烷基和卤代C1-C3烷氧基；优选地，其是三氟甲基。
优选地，在所有上述式(I)化合物中，其中R1是氢，苯基丙酸基团的手性碳原子处于S构型。
特别优选的是根据本发明的式(I)化合物，其选自2-甲基-2-(4-{[4-(三氟甲基)-1，3-噻唑-2-基]氨基}苯基}丙酸(本文中也表示为DF2726Y)及其可药用盐，优选其钠盐(在本文中也表示为DF2726A)；以及2-(4-{[4-(三氟甲基)-1，3-噻唑-2-基]氨基}苯基)丙酸及其可药用盐，优选(2S)-2-(4-{[4-(三氟甲基)-1，3-噻唑-2-基]氨基}苯基)丙酸(也称为DF2755Y)和其钠盐，也称为DF2755A。
式(I)化合物公开于WO2010/031835中，其还公开了其合成方法，其作为IL-8抑制剂的活性以及其在治疗IL-8依赖性病理状况(例如短暂性脑缺血、大疱性类天疱疮、类风湿性关节炎、特发性纤维化、肾小球肾炎以及由缺血和再灌注引起的损伤)中的用途。
在上述IL-8抑制剂中，所述2-苯基-丙酸衍生物优选地是式(II)化合物或其可药用盐：
其中：
R4是直链或支链的C1-C6烷基、苯甲酰基、苯氧基、三氟甲磺酰氧基；优选地，其选自苯甲酰基、异丁基和三氟甲磺酰氧基。同样，根据一个优选实施方案，R4在苯环的3或4位上，更优选地，其是3-苯甲酰基、4-异丁基或4-三氟甲磺酰氧基。
R5是H或者直链或支链的C1-C3烷基，优选地，其是H。
R6是直链或支链的C1-C6烷基或三氟甲基；优选地，其是直链或支链的C1-C6烷基，更优选地，其是CH3。
在上述化合物中，优选的是式(II)化合物或其可药用盐，其中：
R4是C1-C6烷基或苯甲酰基；优选地，其在3和4位上，更优选地，其是3-苯甲酰基或4-异丁基。
R5是H或者直链或支链的C1-C3烷基，优选地，其是H，
R6是直链或支链的C1-C6烷基或三氟甲基；优选地，其是直链或支链的C1-C6烷基，更优选地，其是CH3。
在上述化合物中，优选的是式(II)化合物或其可药用盐，其中：
R4是三氟甲磺酰氧基，优选4-三氟甲磺酰氧基，
R5是H或者直链或支链的C1-C3烷基，优选地，其是H，
R6是直链或支链的C1-C6烷基或三氟甲基；优选地，其是直链或支链的C1-C16烷基，更优选地，其是CH3。
在上述化合物中，还优选的是式(III)化合物或其可药用盐：
其中：
R’是氢；
R是式SO2Ra的残基，其中Ra是直链或支链的C1-C4烷基或卤代C1-C3烷基，优选地，其是CH3。
优选地，在上述式(II)或(III)化合物中，苯基丙酸基团的手性碳原子处于R构型。
特别优选的根据本发明的式(II)化合物选自R-(-)-2-(4-异丁基苯基)丙酰基甲磺酰胺(也称为瑞帕利辛(Reparixin))及其可药用盐。优选地，所述化合物是R(-)-2-(4-异丁基苯基)丙酰基甲磺酰胺的赖氨酸原位盐(在本文中也表示为DF1681B)。
还特别优选的根据本发明的式(II)或(III)化合物是2-(4-三氟甲磺酰氧基)苯基]-N-甲磺酰基丙酰胺及其可药用盐，优选其钠盐，优选R(-)-2-(4-三氟甲磺酰氧基)苯基]-N-甲磺酰基丙酰胺(也称为DF2156Y)及其钠盐(也称为Ladarixin或DF2156A)。
式(II)和(III)的IL-8抑制剂公开于WO0024710和WO2005/090295中，其还公开了其合成方法，其作为IL-8抑制剂的活性以及其作为由IL-8诱导的嗜中性粒细胞趋化性和脱颗粒的抑制剂以及在治疗以下IL-8依赖性病理状况中的用途：例如银屑病、溃疡性结肠炎、黑素瘤、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)、大疱性类天疱疮、类风湿性关节炎、特发性纤维化、肾小球肾炎以及由缺血和再灌注引起的损伤。
本发明的第二目的是IL-8抑制剂用于制备用于治疗和/或预防骨和软组织肉瘤(优选骨肉瘤、尤因肉瘤或横纹肌肉瘤)的药物的用途。
根据本发明的一个优选实施方案，所述药物用于治疗和/或预防与骨和软组织肉瘤(优选骨肉瘤、尤因肉瘤或横纹肌肉瘤)相关的肺转移。
本发明的第三目的是用于治疗和/或预防骨和软组织肉瘤(优选骨肉瘤、尤因肉瘤或横纹肌肉瘤)的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗有效量的如上所限定的IL-8抑制剂的步骤。
根据本发明的一个优选实施方案，所述方法用于治疗和/或预防与骨和软组织肉瘤(优选骨肉瘤、尤因肉瘤或横纹肌肉瘤)相关的肺转移。
本文中使用的“治疗有效量”是指足以实现治疗或预防疾病的量。基于实现所期望效果时，有效量的确定完全在本领域中技术人员的能力之内。有效量将取决于包括但不限于以下的因素：对象的体重和/或对象患有的疾病或不期望病症的程度。
本文中使用的术语“治疗”和“预防”分别是指所治疗障碍或与其相关的一种或更多种症状的发作的根除/改善或预防/延迟，尽管事实是患者仍然可受到潜在障碍的困扰。
本发明的第四目的是用于治疗和/或预防骨和软组织肉瘤(优选骨肉瘤、尤因肉瘤、横纹肌肉瘤，或与其相关的肺转移的药物组合物)，其包含与可药用赋形剂和/或稀释剂缔合的如上限定的IL-8抑制剂。
根据一个优选实施方案，用于预防和/或治疗骨和软组织肉瘤(优选骨肉瘤、尤因肉瘤、横纹肌肉瘤，或与其相关的肺转移，更优选肺转移)的所述药物组合物还包含至少一种IL-6抑制剂和/或至少一种gp130抑制剂。
根据本申请的术语“IL-6抑制剂”是指能够部分或完全地抑制IL-6生物活性的任何化合物。
根据本申请的术语“gp130抑制剂”是指能够部分或完全地抑制gp130生物活性的任何化合物。
根据另一个优选实施方案，用于预防和/或治疗骨和软组织肉瘤(优选骨肉瘤、尤因肉瘤、横纹肌肉瘤，或与其相关的肺转移，更优选原发性肿瘤)的所述药物组合物还包含至少一种化学治疗剂。
本发明的第五目的是一种产品或药盒，其包含：A)如上限定的IL-8抑制剂，其用于治疗和/或预防骨和软组织肉瘤，优选骨肉瘤、尤因肉瘤、横纹肌肉瘤，或与其相关的肺转移，或者如上限定的药物组合物，以及B)至少一种IL-6抑制剂和/或至少一种gp130抑制剂，A)和B)是用于同时使用、分开或依次使用的两种分开的制剂。优选地，用于治疗和/或预防与骨肉瘤、尤因肉瘤或横纹肌肉瘤相关的肺转移。
根据一个优选实施方案，所述gpl30抑制剂选自包含以下的组：2-(7-氟吡咯并[1，2-a]喹喔啉-4-基)2-吡嗪羧酸酰肼(SC144)、雷洛昔芬(Raloxifene)和(4R)-3-((2S，3S)-3-羟基-2-甲基-4-亚甲基壬酰基)-4-异丙基二氢呋喃-2(3H)-酮(LMT-28)(Tae-Hwe Heoet al.；Oncotarget，Vol.7，No.13，15460-15473；2016)。
根据一个优选实施方案，所述IL-6抑制剂选自包含以下的组：SC144、伏巴利珠单抗(Vobarilizumab)、西妥昔单抗(Siltuximab)、西卢卡单抗(Sirukumab)、奥洛基单抗(Olokizumab)、克拉扎齐单抗(Clazakizumab)、MAb 1339、托珠单抗(Tocilizumab)和沙里鲁单抗(Sarilumab)(Tae-Hwe Heo et al.；Oncotarget，Vol.7，No.13，15460-15473；2016)。
优选地，所述IL-6抑制剂是SC144。
本发明的第六目的是产品或药盒，其包含：A’)如上限定的IL-8抑制剂，其用于治疗和/或预防骨和软组织肉瘤，优选骨肉瘤、尤因肉瘤、横纹肌肉瘤，或与其相关的肺转移，或者如上限定的药物组合物，以及B’)至少一种化学治疗剂，A’)和B’)是用于同时、分开或依次使用的两种分开的制剂。优选地，用于治疗和/或预防原发性肿瘤骨肉瘤、尤因肉瘤或横纹肌肉瘤。
优选地，所述化学治疗剂选自包含以下的组：多柔比星(doxorubicin)、顺铂、甲氨蝶呤、异环磷酰胺、表柔比星(epirubicin)、依托泊苷(etoposide)、环磷酰胺、长春新碱和放线菌素D。
出于本发明的目的，将根据本发明的IL-8抑制剂配制成适合通过经口制剂(例如片剂、胶囊剂、糖浆剂)，优选地以控释制剂形式，或通过肠胃外施用，优选地以适合静脉内或肌内施用的无菌溶液剂形式使用的药物组合物。药物组合物可根据常规方法，例如如在Remington，“The Science and Practice of Pharmacy”21st ed.(Lippincott Williamsand Wilkins)中所公开的进行制备。
平均日剂量取决于多种因素，例如疾病、病症的严重程度，患者的年龄、性别和体重。剂量将通常为每日从1至1500mg式(I)化合物变化，任选地分成多次施用。
在以下实验部分中将更详细地进一步举例说明本发明。
实验部分
方法
细胞系和初级细胞培养。OS-17来源于OS-17异种移植物，并获自IstitutiOrtopedici Rizzoli，Bologna，Italy。OS-25和OHS由在Oslo的Radium医院Fodstad博士实验室惠赠。将所有这些均维持在补充有10％FBS(Atlanta Biologicals#S11150H)的RPMI(Coming#10-040-CV)中。143B和K7M2细胞获自ATCC(ATCC#CRL
8303和#CRL2836)，并在补充有10％FBS的DMEM(Coming#10-013-CV)中培养。OSCA-8和OSCA-16由Jamie Modiano和明尼苏达大学(University of Minnesota)提供，并在含有10％FBS的RPMI中培养。肺平滑肌细胞(ATCC#PCS-130-10)在补充有血管平滑肌细胞生长试剂盒(ATCC#PCS-100-042)的血管细胞基础培养基(ATCC#PCS-100-030)中培养。HUVEC细胞(Lonza CC-2517)在补充有EGM-plussingle quote(Lonza#CC-4542)的内皮基础培养基(Lonza#CC-5036)中培养。人肺成纤维细胞(ATCC#PCS-201-013)在补充有10％FBS的EMEM(ATCC#30-2003)中培养。HBEC3-KT细胞(ATCC#CRL-4051)在补充有支气管上皮细胞生长试剂盒(ATCC#PCS-300-040)的气道上皮细胞基础培养基(ATCC#PCS-300-030)中培养。巨噬细胞来源于使用CD14磁珠选择系统(Miltenyi#130-050-201)从全血(通过机构IRB批准的用于获取新鲜人血的方案获得)中分离的单核细胞，随后将其在每日补充有20ng/ml重组人M-CSF(BioLegend#574802)的XVIVO无血清培养基(Lonza#04-380Q)中培养72小时。对于共培养实验，每组(共培养和相关单培养)内的培养使用两种相应生长培养基的1∶1混合物以控制培养基组分的差异来进行。
IL-6和IL-8ELISA。使用R&D DuoSet ELISA开发试剂盒(#DY206和#DY208)根据制造商的推荐使用，评价在24孔板中的来自每种细胞系72小时培养物的无细胞上清液的IL-6和IL-8浓度。
划伤(“伤口愈合”)测定。使用Essen Incucyte WoundMaker(Essen CellMigration Kit#4493)划破OS-17或OHS细胞系的单层培养物。然后使用Essen IncucyteZoom对单独孔进行连续成像。使用Essen的集成细胞迁移分析模块(Essen#9600-0012)进行分析并对伤口宽度进行定量。
transwell迁移和侵袭测定。将1×104OS细胞平板接种到包含合适趋化因子的transwell插入物(用于迁移的Falcon#353097或用于基质胶侵袭测定的Coming#354483)中。在孵育24小时之后，使transwell排干，并使用聚酯拭子划破上室/膜上表面。将膜使用Dif-Quik染色组(Stain Set)(Siemens#B4132-1A)进行染色并干燥，然后在倒置显微镜上成像。使用Adobe Photoshop计数工具对细胞进行定量。对于涉及IL-6和IL-8趋化性的实验，在这两个室中的培养基均包含1％FBS，其中向下室添加重组蛋白以制成50ng/ml IL6(BioLegend#570804)或100ng/ml IL-8(BioLegend#574204)。对于使用血清作为化学引诱物的实验，上室仅包含RPMI，而下室包含1％或2.5％血清。其中注意，向上室和下室二者添加针对IL6(Abcam#AB6672)、IL-8(Abcam#AB18672)或二者的20ug/ml中和抗体。在测试小分子阻断血清诱导的迁移/侵袭能力的实验中，向培养基添加1μM sc144(Sigma#SML0763)和/或100nM DF2156A(Dompe Pharmaceuticals，Milan，Italy)。
OS细胞增殖。将以20％汇合平板接种的细胞在如上所述包含如每幅图中所示的抑制剂的生长培养基中进行培养。使用Essen Biosciences Incucyte Zoom在每幅图中所示的时间段中对增殖进行连续定量。
集落形成。将1×104OS细胞平板接种在6孔板中的1.5ml 1％软琼脂床上方的1.5ml 0.5％软琼脂(Lonza SeaPlaque GTG琼脂糖，Gibco粉状RPMI#430-1800中的#50111)中，然后覆盖有500ml RPMI。其中注意，向RPMI层添加药物使其在遍及培养基和琼脂二者中扩散时足以产生规定的浓度。
异种移植物存活研究。将通过尾静脉接种有1×106OS-17细胞(第0天)的6至8周龄CB17-SCID(Envigo C.B-17/IcrHsd-Prkdcscid)小鼠在接种之后24小时开始每天接受sc144(10mg/kg SC每日一次，Sigma#SML0763)、DF2156A(30mg/kg IP每日一次)或二者的注射剂。sc144通过在温热的同时将其溶解在DMSO中以制成40mg/kg溶液，将其立即使用在水中的40％丙二醇/1％吐温20稀释至2mg/kg进行制备。平均20g小鼠接受100ul/剂量。每天新制备sc144剂量。DF2156A通过将其溶解在PBS中以产生6mg/ml溶液进行制备，用于在20g小鼠中的相似100mg剂量。处理持续42天，然后停止。每周两次监测小鼠体重以及增强的身体状况评分(enhanced body condition scoring，eBCS(28))。对显示体重减轻＞10％或eBCS＜8的小鼠进行安乐死，并收获组织，对肺充气，在10％中性缓冲福尔马林中进行固定，然后如上所述进行包埋和处理。将在生存分析中未显示转移性疾病负荷(可能因其他原因死亡)的小鼠删减。这包括接受组合治疗的2只小鼠，一只接受sc144的小鼠和一只对照小鼠。
时间点处理研究。将6至8周龄CB17-SCID小鼠接种有1×106143B、OSCA-8、OSCA-16或K7M2细胞(对于K7M2细胞，使用免疫活性Balb/c小鼠)。在接种之后24小时，小鼠开始每天用sc144和/或DF2156A进行处理，这如上所述持续42天。然后如上所述观察小鼠，直至来自任何给定细胞系组的一只小鼠达到终点。如果取自该前哨小鼠的肺显示出转移性疾病的体征，则将来自该组的所有小鼠进行安乐死，收获肺，充气，固定，包埋和染色。用H&E染色的左叶中央切片由经验丰富的不知情评审者使用显微镜对转移性病变计数进行评审。
统计分析。使用Graphpad Prism 7对数据进行图形化和分析。在每幅图的标题中标识使用的具体统计学检验和进行的比较。其中必要时，使用Benjamini-Hochberg法进行多次比较的调整，以将错误发现率控制为0.05。
实施例1
在鼠肺定植异种移植物模型中IL-6和IL-8的产生与转移潜能相关。
本发明人测试了骨肉瘤细胞系组其定植小鼠肺的能力。本发明人发现OS-17细胞当通过尾静脉引入循环中时以非常高的效率发生转移灶，而OHS细胞系显示出低得多的转移效率(图1)。该效果在多次传代细胞和多次测定中保持一致。本发明人通过对无细胞上清液进行ELISA测试这些细胞系产生IL-6和IL-8的能力(图1d)，这揭示了这两种细胞因子的肿瘤细胞产生与所述细胞系定植鼠肺的能力之间存在强相关性。
IL-6和IL-8在OS细胞中刺激化学促动(chemokinesis)和定向迁移，无论是否具有转移潜能
为了示出这些高转移性和差转移性细胞系是否维持响应于这些细胞因子的特征，我们进行了划伤测定(伤口愈合测定)和transwell迁移测定二者以评估应答。在补充有IL-6和/或IL-8的培养基中培养时，在OS-17和OHS细胞单层二者中形成的标准化伤口更有效地闭合，表明任一种细胞因子在任一种细胞系中均可刺激化学促动(提高的细胞运动性)，而与该细胞因子的任何基础产生无关。这些细胞在测试定向迁移的测定中显示出相似的结果。在transwell系统的上室中培养的OS-17和OHS细胞二者均显示出响应于IL-6或IL-8的趋化梯度的强定向迁移。
单独的或与sc144组合的DF2156A防止OS细胞定向迁移和侵袭的作用
为了在可能趋化因子的更广泛范围内确定这些细胞因子对OS细胞迁移的重要性，本发明人检查了当使用血清作为化学引诱物时IL-6和/或IL-8阻滞可能具有的作用。这两种细胞系均显示出响应于血清趋化梯度的非常强的transwell迁移和通过基质胶屏障的侵袭二者(图1e至f)。当向培养基添加IL-6或IL-8阻断抗体时，趋化应答中的一些降低是明显的，尽管当将抗体组合时看到了显著得多的作用。在类似实验中使用IL-6和IL-8的受体的小分子抑制剂(sc144，其通过新机制刺激gp130降解；以及DF2156A，CXCR1和CXCR2的别构抑制剂)看到了更显著作用。通过在受体水平上的抑制，阻断任一种途径就足以防止定向迁移和侵袭(图2)，表明OS细胞可能需要通过非IL-6和非IL-8细胞因子使这些途径一定水平的激活以产生这些行为。这两种抑制剂均显著降低了OS细胞的迁移量。
实施例2
单独的或与sc144组合的DF2156A在预防肺转移中的作用
为了评价IL-6和IL-8途径对OS肺转移的功能重要性，本发明人使用了异种移植物模型。将通过尾静脉接种有1×106萤光素酶标记的OS-17细胞的Balb-SCID小鼠接受用sc144(gp130抑制剂)、DF21 56A(CXCR1/2抑制剂)或二者的处理。小鼠持续接受处理42天，在此之后停止处理。在14天和24天使用标准生物发光技术进行活体成像用于体内评估肿瘤负荷。生物发光成像表明在接受组合治疗的小鼠肺中肿瘤负荷相对于未接受治疗或接受单一药剂治疗的那些显著降低(图3A)。重要的是，成像并未显示出肿瘤细胞向其他器官中的迁移，而是生物发光的整体丧失，表明循环肿瘤细胞的总存活降低。在药物的第14剂量之后24小时，将来自每个单一药剂处理组的两只小鼠进行安乐死，以进行靶标抑制的药效学(pharmacodynamics，PD)评估。来自用IHC针对pFAK(DF2156A)或pSTAT3(gp130)染色的那些小鼠的肺在给药谷时显示出持续的靶标抑制(即持续的药物活性)(图4)。
在处理之后，观察小鼠直至显示临床恶化的体征，即体重减轻＞10％或提高的身体状况评分(eBCS)＜8(我们限定的终点)。在终点，将小鼠使用批准的方法进行安乐死，并收获肺，充气，固定，包埋，切片以及染色。生存分析(图3B)显示几乎所有未接受药物或单一药剂治疗的小鼠到60天时均发生致命的肺转移。特别地，未接受药物的小鼠比接受单一药剂的小鼠更容易地发生致命的肺转移。然而接受组合治疗(gp130抑制剂+CXCR1/2抑制剂)的大多数小鼠在＞100天时仍保持健康。将在肺切片上未显示出明显肺转移的小鼠从生存分析中删减(n＝2)。
实施例3
在多种OS模型中DF2156A与sc144的组合在预防肺转移中的作用
为了确保在这些研究中获得的结果可广泛应用，并且不是独特的针对免疫缺陷异种移植物或针对OS-17细胞，本发明人使用许多不同的模型重复了与处理相关的实验。这些包括使用来源于在Balb/c小鼠中自发产生OS的细胞系(K7M2)的同基因免疫活性模型、犬OS(OSCA-8和OSCA-16)的异种移植物模型以及人OS(143B)的另外的异种移植物模型。接种有肿瘤细胞的小鼠用无药物或者组合的sc144和DF2156A进行处理持续42天。在来自任意组(任何细胞系)中的至少一只小鼠达到确定有肺转移的终点时，将来自该组的所有小鼠进行安乐死，收获肺，并对转移病变进行定量。用于预防转移性肺病变发生的双重gp130-CXCR1/2抑制的能力在模型之间保持一致(图5)。
Claims (18)
1.IL-8抑制剂，其用于预防和/或治疗骨和软组织肉瘤，优选骨肉瘤、尤因肉瘤或横纹肌肉瘤，更优选地用于预防和/或治疗与骨肉瘤、尤因肉瘤或横纹肌肉瘤相关的肺转移。
2.根据权利要求1所述应用的IL-8抑制剂，其选自小分子量分子和抗体，优选地，所述IL-8抑制剂是由CXCR1受体或由所述CXCR1和CXCR2受体二者介导的IL-8活性的抑制剂。
3.根据权利要求1或2所述应用的IL-8抑制剂，其选自1，3-噻唑-2-基氨基苯基丙酸衍生物、2-苯基-丙酸衍生物，及其可药用盐。
4.根据权利要求3所述应用的IL-8抑制剂，其中所述1，3-噻唑-2-基氨基苯基丙酸衍生物是式(I)化合物
其中：
-R1是氢或CH3；
-R2是氢或直链C1-C4烷基，优选地，其是氢；
-Y是选自S、O和N的杂原子；优选地，其是S；
-Z选自卤素、直链或支链的C1-C4烷基、C2-C4烯基、C2-C4炔基、C1-C4烷氧基、羟基、羧基、C1-C4酰氧基、苯氧基、氰基、硝基、氨基、C1-C4酰氨基、卤代C1-C3烷基、卤代C1-C3烷氧基、苯甲酰基、直链或支链的C1-C8链烷磺酸酯、直链或支链的C1-C8链烷磺酰胺、直链或支链的C1-C8烷基磺酰基甲基；优选地，其是三氟甲基；
-X是OH或式NHR3的残基；其中R3选自：
-氢、羟基、直链或支链的C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C2-C6烯基、C1-C5烷氧基，
或C1-C6苯基烷基，其中烷基、环烷基或烯基可被COOH残基取代
-式SO2R4的残基，其中R4是C1-C2烷基、C3-C6环烷基、C1-C3卤代烷基。
5.根据权利要求4所述应用的IL-8抑制剂，其中：R1是氢或CH3；
X是OH；
R2是氢或直链C1-C4烷基，
Y是选自S、O和N的杂原子；
Z选自直链或支链的C1-C4烷基、直链或支链的C1-C4烷氧基、卤代C1-C3烷基和卤代C1-C3烷氧基。
6.根据权利要求4所述应用的IL-8抑制剂，其中R1是氢，苯基丙酸基团的手性碳原子处于S构型。
7.根据权利要求3、4或5所述应用的IL-8抑制剂，其选自2-甲基-2-(4-{[4-(三氟甲基)-1，3-噻唑-2-基]氨基}苯基)丙酸及其可药用盐，优选其钠盐。
8.根据权利要求3至6中任一项所述应用的IL-8抑制剂，其中所述化合物是(2S)-2-(4-{[4-(三氟甲基)-1，3-噻唑-2-基]氨基}苯基)丙酸及其可药用盐，优选其钠盐。
9.根据权利要求3所述应用的IL-8抑制剂，其中所述2-苯基-丙酸衍生物是式(II)化合物或其可药用盐，
其中：
R4是直链或支链的C1-C6烷基、苯甲酰基、苯氧基、三氟甲磺酰氧基；优选地，其选自苯甲酰基、异丁基和三氟甲磺酰氧基，同样，根据一个优选实施方案，R4在苯环的3或4位上，更优选地，其是3-苯甲酰基、4-异丁基或4-三氟甲磺酰氧基；
R5是H或者直链或支链的C1-C3烷基，优选地，其是H；
R6是直链或支链的C1-C6烷基或三氟甲基；优选地，其是直链或支链的C1-C6烷基，更优选地，其是CH3。
10.根据权利要求3所述应用的IL-8抑制剂，其中所述2-苯基-丙酸衍生物是式(III)化合物或其可药用盐，
其中：
R’是氢；
R是式SO2Ra的残基，其中Ra是直链或支链的C1-C4烷基或卤代C1-C3烷基，优选地，其是CH3。
11.根据权利要求9或10所述应用的IL-8抑制剂，其中所述苯基丙酸基团的手性碳原子处于R构型。
12.根据权利要求9所述应用的IL-8抑制剂，其中所述化合物选自R-(-)-2-(4-异丁基苯基)丙酰基甲磺酰胺及其可药用盐，优选赖氨酸原位盐。
13.根据权利要求9至11中任一项所述应用的IL-8抑制剂，其中所述化合物是R(-)-2-(4-三氟甲磺酰氧基)苯基]-N-甲磺酰基丙酰胺及其可药用盐，优选其钠盐。
14.药物组合物，其包含根据前述权利要求中任一项所述应用的IL-8抑制剂以及可药用赋形剂和/或稀释剂。
15.根据权利要求14所述应用的药物组合物，其还包含至少一种IL-6抑制剂和/或至少一种gp130抑制剂。
16.根据权利要求14所述应用的药物组合物，其还包含至少一种化学治疗剂，所述化学治疗剂优选地选自包含以下的组：多柔比星、顺铂、甲氨蝶呤、异环磷酰胺、表柔比星、依托泊苷、环磷酰胺、长春新碱和放线菌素D。
17.根据权利要求1至13中任一项应用的产品或药盒，其包含：
A)根据权利要求1至13中任一项所述的IL-8抑制剂或根据权利要求14所述的药物组合物，以及
B)至少一种IL-6抑制剂和/或至少一种gp130抑制剂，
A)和B)是用于同时、分开或依次使用的两种分开的制剂。
18.根据权利要求1至13中任一项所述应用的产品或药盒，其包含：
A’)根据权利要求1至13中任一项所述的IL-8抑制剂或根据权利要求14所述的药物组合物，以及
B’)至少一种化学治疗剂，其优选地选自包含以下的组：多柔比星、顺铂、甲氨蝶呤、异环磷酰胺、表柔比星、依托泊苷、环磷酰胺、长春新碱和放线菌素D，
A’)和B’)是用于同时、分开或依次使用的两种分开的制剂。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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