KR20150083353A - 경요도적 주입용 방광암 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물 - Google Patents

경요도적 주입용 방광암 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물 Download PDF

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KR20150083353A
KR20150083353A KR1020140002991A KR20140002991A KR20150083353A KR 20150083353 A KR20150083353 A KR 20150083353A KR 1020140002991 A KR1020140002991 A KR 1020140002991A KR 20140002991 A KR20140002991 A KR 20140002991A KR 20150083353 A KR20150083353 A KR 20150083353A
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Abstract

본 발명은 경요도적 주입용 방광암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 경요도적 주입용 방광암 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

경요도적 주입용 방광암 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물{Pharmaceutical composition for prevention or treatment of bladder tumor via intravesical instillation}
본 발명은 경요도적 주입용 방광암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명에 따른 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 경요도적 주입용 방광암 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
2010년에 발표된 한국중앙암등록본부 자료에 의하면, 방광암은 2008년에 3,230건이 발생하였고, 남자에서 7번째로 흔한 암으로 보고되었다. 방광암은 진단시 약 75%는 비근침윤성(표재성) 방광암으로 진단된다. 이 경우 경요도 방광종양 절제술을 표준치료법으로 시행되나 약 70%에서 재발하고, 10 ~ 15%에서 근침윤성 방광암으로 진행하였으며, 특히 고위험군(pTa/T1 G3)의 경우 1/3에서 방광암으로 사망하는 것으로 보고되어 있다. 또한, 이를 대체할 수 있는 적절한 방광암 치료제 또한 개발이 미비한 상황이다.
방광 내 직접 주입을 통한 기존의 방광암 치료제가 있지만(예를 들면, mitomycin, Bacillus Calmette-Guerin), 치료 효능 및 부작용의 문제가 있었다. 또한, 방광 내 직접 주입을 통한 방광암 치료가 실패하면 근치적 방광절제술(radical cystectomy)가 환자의 생존을 위해 수행되었으나, 모든 환자에서 근치적 방광절제술을 수행할 수 있는 것도 아니고, 현저히 저하된 삶의 질 및 높은 치사율의 문제점이 있었다.
1. 대한민국 특허공개번호 10-2012-0079254 (2012.07.12 공개: 백혈병 치료용 약학조성물) 2. 대한민국 등록특허번호 10-0916160 (2009.09.01 공개: 약제학적 항암 조성물)
종래의 방광 내 직접 주입을 통한 기존의 방광암 치료제 및 상기 특허문헌들의 화합물의 경우, 투여시 다른 기관에 손상을 초래하는 부작용이 발생할 수 있다.
이에, 본 발명자들은 효과적인 방광암 치료제를 연구하던 중, 본 발명의 화합물을 경요도적 주입을 통해 방광투여할 경우, 다른 기관에 전혀 부작용없이 방광암을 예방 및 치료할 수 있음을 확인하여, 방광암 예방 또는 치료방법에 가장 확실한 방법임을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
이와 같이, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 경요도적 주입용 방광암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다:
Figure pat00001
화학식 1
상기 식에서, 상기 R1, R2, R3, R4, R5 및 X는 본 명세서에서 정의한 바와 같다.
본 발명은 또한 경요도적 주입용 방광암 예방 또는 치료를 위한 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 치료적 유효량의 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 경요도적 주입용 방광암 예방 또는 치료를 필요로 하는 사람을 포함한 포유동물에 투여하는 것을 포함하는 방광암의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 약제학적 조성물은 점적주사에 의해 투여될 수 있다.
또한 본 발명의 약제학적 조성물은 비근침윤성 방광암, 특히 고위험군(pTa/T1 G3) 등급의 방광암의 치료를 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물은 방광내 직접 주입을 통한 현저한 방광암 예방, 억제, 치료 효과를 나타내었다. 또한, 본 발명의 화합물의 방광 내 주입할 경우, 방광암에우수한 치료 효과를 나타내며 다른 장기에 영향이 없어, 종래의 항암제의 사용에 따른 부작용을 막을 수 있다.
도 1A는 항-c-Myc 항체를 사용하여 면역조직화학법에 의해서 분석된 방광암 조직 마이크로어레이(tissue microarray; TMA)의 수행에 있어서 환자 표본에서 c-Myc의 발현을 나타낸 도이며, 도 2B는 각 세포주에서 발현되는 c-Myc을 RT-PCR을 수행하고 역전사된 cDNA 1 ㎍을 아가로스에 전기영동한 결과를 나타낸 도이다.
도 2A는 본 발명의 29번 화합물의 화학적 구조를 나타낸 도이고, 도 2B는 본 발명의 29번 화합물의 다양한 농도를 처리하였을 때, c-Myc과 이것의 CRE(consensus response element)사이의 상호작용을 EMSA로 확인한 결과(좌측)와 *로 표기된 부분의 상대적인 밀도(우측)를 나타낸 도이며, 도 2C는 6시간 동안 29번 화합물를 처리한 방광암 세포에서 ChIP 분석 결과를 타나낸 도이다. (도 2C의 CDK4 프로모터 안에 c-Myc 결합 부위를 증폭을 위해 사용된 프라미어:5'-gtg gcc tag gtt gcc atg gca c-3'(서열번호 16) 및 5'-ctc acc atg tga cca gct gcc-3'(서열번호 17))
도 3A는 본 발명의 29번 화합물의 c-Myc-매개 전사활성의 억제 효과를 리포터 분석법으로 확인한 결과를 나타내는 도이고, 도 3B는 본 발명의 29번 화합물의 c-Myc-매개 전사활성의 억제 효과를 qRT-PCR을 통해 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 4는 본 발명의 29번 화합물의 방광암 세포의 생존을 효과적으로 억제하는 효과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 29번 화합물의 세포 주기 정지 및 세포 사멸을 유도하는 효과를 나타낸 도이다(A. EdU 삽입 분석법, B. 유세포분류기, C. 잘려진 PARP 및 caspase-3를 웨스턴 블랏으로 확인).
도 6A는 방광암 세포주에서 본 발명의 29번 화합물의 종양 성장 억제효과를 EdU 삽입 분석법을 사용하여 확인한 결과를 나타낸 도이며, 도 6B는 본 발명의 29번 화합물의 방광암 세포 증식의 억제 효과를 MTT 분석을 사용하여 확인한 결과를 나타낸 도이고, 도 6C는 동소성 방광암 동물모델에서 카테터를 통한 본 발명의 29번 화합물을 주입하여 일자별로 IVIS 플랫폼을 사용한 비-침습방법 이미지 결과를 나타낸 도이며, 도 6D는 상기 도 6C의 마우스에서 얻어진 방광 조직, 신장, 간, 폐 및 이자의 H&E 염색을 통하여 확인한 결과 및 경골(tibia)에 전체 임파구에 독성효과가 없는 것을 나타낸 도이다.
도 7은 GeneChip Human Exon 1.0 ST 어레이 플렛폼을 사용한 본 발명의 29번 화합물을 처리한 방광암 세포주의 유전자 발현 프로파일을 나타낸 도이며, A는 유전자 칩의 결과를 RT-PCR을 사용하여 확인한 결과를 나타낸 도이고, 도 7B는 본 발명의 29번 화합물 처리된 방광암 세포주에서 1.5배 이상 하향 조절된 세포 주기 및 DNA 복제와 관련하는 유전자를 선별한 결과를 나타낸 도이며, 도 7C는 본 발명의 29번 화합물과 c-Myc 억제제(GSE31365)의 선행연구와 c-Myc 표적 유전자 발현 프로파일의 변화를 나타낸 도이다.
도 8은 방광암 세포주에서 화합물 10058-F4(c-Myc 억제제)의 종양 성장 억제효과를 EdU 삽입 분석법을 사용하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 29번 화합물가 처리된 마우스의 혈중 29번 화합물의 농도를 HPLC상에서 ZORBAX Eclipse XDB-C18 컬럼을 사용하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약제학적 허용 가능한 염을 포함하는 경요도적 주입용 방광암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다:
Figure pat00002
화학식 1
여기서, R1 내지 R4는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 선형 또는 분지형 (C1-10)알킬기, 선형 또는 분지형 할로(C1-6)알킬기, 선형 또는 분지형 (C1 -10)알콕시기, 또는 니트로기이고(단, R1 내지 R4가 모두 수소인 경우는 제외);
R5는 선형 또는 분지형 (C1 -6)알킬기이며;
X는 NHR6,
Figure pat00003
또는
Figure pat00004
이고;
R6는 선형 또는 분지형 (C1 -6)알킬기, 치환 또는 비치환 페닐(여기서, 치환기는 하나 이상의 할로겐, 선형/분지형 (C1 -6)알킬기, 또는 할로겐과 선형/분지형 (C1 -6)알킬기임)이고;
R7 내지 R10은 각각 독립적으로 수소 또는 할로겐이며, n은 1 내지 10의 정수이다.
본 발명의 바람직한 일 구체예에 있어서, 상기 화학식 1에서 R1 내지 R4는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 선형 또는 분지형 (C1 -10)알킬기, 선형 또는 분지형 할로(C1-6)알킬기, 또는 니트로기이고(단, R1 내지 R4가 모두 수소인 경우는 제외); R5는 선형 또는 분지형 (C1 -6)알킬기이며; X는 NHR6이고; R6는 하나 이상의 할로겐, 선형/분지형 (C1 -6)알킬기, 또는 할로겐과 선형/분지형 (C1 -6)알킬기로 치환 된 페닐인 화합물인 것을 특징으로 하는 경요도적 주입용 방광암 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 하기 화합물로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 포함한다:
Figure pat00005
compound-01 : 3-acetyl-2-(4-tert-butylanilino)-8-chloro-6-nitro-1H-quinolin-4-one, compound-02 ; 5,8-dichloro-2-(2,5-dichloroanilino)-3-(3-methylbutanoyl)-1H-quinolin-4-one, compound-03 : 3-acetyl-2-(4-bromoanilino)-7,8-dichloro-1H-quinolin-4-one, componud-04 : 3-acetyl-5,8-dichloro-2-(2,4-dichloroanilino)-1H-quinolin-4-one, compound-05 : 3-acetyl-6-chloro-2-(2-chloro-4-methylanilino)-8-nitro-1H-quinolin-4-one, compound-06 : 3-acetyl-5-chloro-2-(3,5-dichloroanilino)-8-methyl-1H-quinolin-4-one, compound-07 : 3-acetyl-6-chloro-2-(3,5-dichloroanilino)-8-nitro-1H-quinolin-4-one, compound-08 : 3-acetyl-8-chloro-2-(2,4-dibromoanilino)-5-methyl-1H-quinolin-4-one, compound-09 : 3-acetyl-5,8-dichloro-2-(4-chloro-2-fluoroanilino)-1H-quinolin-4-one, compound-10 : 3-acetyl-5,8-dichloro-2-(3,5-dichloroanilino)-1H-quinolin-4-one, compound-11 : 3-acetyl-8-chloro-2-(4-chloroanilino)-5-fluoro-1H-quinolin-4-one, compound-12 : 3-acetyl-6-chloro-2-(2-chloro-4-fluoroanilino)-8-nitro-1H-quinolin-4-one, compound-13 : 3-acetyl-6-chloro-2-(2,4-dichloroanilino)-8-nitro-1H-quinolin-4-one, compound-14 : 3-acetyl-5-chloro-2-(3,5-dichloroanilino)-8-methyl-1H-quinolin-4-one, compound-15 : 3-acetyl-5,8-dibromo-2-(3-fluoroanilino)-1H-quinolin-4-one, compound-16 : 3-acetyl-8-chloro-2-(3,4-dichloroanilino)-5-fluoro-1H-quinolin-4-one, compound-17 : 3-acetyl-2-(4-bromoanilino)-8-chloro-5-fluoro-1H-quinolin-4-one, compound-18 : 8-chloro-2-(2,3-dichloroanilino)-3-(3-methylbutanoyl)-5-nitro-1H-quinolin-4-one, compound-19 : 3-acetyl-8-bromo-5-chloro-2-(2-chloro-4-fluoroanilino)-1H-quinolin-4-one, compound-20 : 3-acetyl-8-bromo-5-chloro-2-(4-chloro-2-fluoroanilino)-1H-quinolin-4-one, compound-21 : 3-acetyl-2-(3,5-difluoroanilino)-6,8-difluoro-1H-quinolin-4-one, compound-22 : 3-acetyl-6,7-dichloro-2-[[(4-chlorophenyl)-phenylmethyl]amino]-1H-quinolin-4-one, compound-23 : 3-acetyl-6,7-dichloro-2-[(3,4-dichlorophenyl)methylamino]-1H-quinolin-4-one, compound-24 : 3-acetyl-2-[(4-bromophenyl)methylamino]-6-chloro-8-nitro-1H-quinolin-4-one, compound-25 : 6-chloro-2-[[(4-chlorophenyl)-phenylmethyl]amino]-3-(3-methylbutanoyl)-8-(trifluoromethyl)-1H-quinolin-4-one, compound-26 : 3-acetyl-6-bromo-2-[2-(4-chlorophenyl)ethylamino]-7-(trifluoromethyl)-1H-quinolin-4-one, compound-27 : 3-acetyl-8-chloro-5-nitro-2-(octan-2-ylamino)-1H-quinolin-4-one, compound-28 : 3-acetyl-8-chloro-2-(3-methylanilino)-5-nitro-1H-quinolin-4-one 및 compound-29 : 3-acetyl-8-bromo-5-chloro-2-(4-chloroanilino)-1H-quinolin-4-one.
또한, 본 발명의 화학식 1의 화합물은 경요도적 주입(intravesical instillation)을 통하여 투여되며, 특히 용해도가 낮아 다른 장기로의 이전이 없이, 타 기관에의 부작용이 없다.
본 발명의 화합물을 정의하는 화학식 1에서, 용어 "할로겐"은 할로겐족 원소를 나타내며, 예컨대, 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오도를 포함하며, 바람직하게는 플루오로, 클로로 또는 브로모이다.
용어 "(C1 -10)알킬"은 탄소수 1-10의 직쇄 또는 분지쇄 포화 탄화수소기를 의미하며, 바람직하게는 C1-C3 선형 또는 분지형 알킬이며, 이는 저가 알킬로서 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 이소부틸, n-부틸 및 t-부틸을 포함한다.
용어, "알콕시"는 -O알킬기를 의미한다. C1-C4 치환 알킬기에 의해 치환되는 경우에는 할로, 바람직하게는 클로로 또는 플루오로, 보다 바람직하게는 플루오로 알킬기에 치환된다.
구체적인 실시예에 있어서, 방광암 세포주의 세포 사멸(apoptosis) 및 세포 주기 정지(cell cycle arrest) 효과를 통하여 방광암 세포의 세포 증식 억제 능력이 우수한 저분자 화합물을 선별하기 위하여, c-Myc/Max/DNA 복합체(complex) 형성을 억제하고 인간 방광암 세포주인 KU-7 및 KU19-19의 증식을 50% 이상 억제하는 화합물을 선별하였으며, 그 결과 29개의 화합물을 최종 선별하였다(표 1 내지 표 2 참조). 상기 29개의 화합물은 대한민국 등록특허번호 10-0916160에 개시된 제법에 의해 제조될 수 있다.
또한, c-Myc 유전자의 증폭은 방광암 환자의 30% 이상에서 발견되기 때문에, 방광암에 있어서 c-Myc 발현을 평가하기 위하여 조직 마이크로어레이의 면역조직직화학적 염색법을 수행하여 확인한 결과, 방광암 표본에서 3개 다른 염색 패턴이 확인되었고(도 1A 참조), 더욱이, 모든 방광암 세포주는 PCR에 의해서 c-Myc 전사체의 높은 수준을 나타냄을 확인하였다(도 1B 참조). 또한, c-Myc-반응성 유전자의 프로모터에 있어서 c-Myc 지속적 반응 요소(consensus response element; CRE)를 갖는 복합체 형성으로부터 c-Myc/Max을 억제할 수 있는 작은 분자들을 위한 스크리닝을 함에 있어서, c-Myc 억제제와 같은 29번 화합물을 확인하였다(도 2A). 또한, 생체 내(in vivo)에서 CDK4 프로모터 상에 c-Myc 표적 서열에 c-Myc 보충을 억제할 수 있는 29번 화합물인지를 결정하기 위해서 ChIP 분석법을 사용한 결과, CDK4 프로모터 상에 c-Myc의 보충은 MBT-2 및 Ku19-19 세포 둘 다에서 29번 화합물 처리에 의해서 철폐됨을 확인하였다(도 2C 참조). 또한, 29번 화합물이 방광암 진행의 억제를 야기하는 c-Myc 전사적 활성을 억제할 수 있는지 확인하기 위하여, c-Myc 프로모터(p4xCMYC.Luc)의 조절 아래에서 리포터 루시퍼라제 유전자를 사용해서 29번 화합물의 다른 농도의 존재하에 있어서 측정한 결과, 상기 전사는 Ku19-19 및 MBT-2 세포에 있어서 29번 화합물를 가지고 처리에 의해서 농도-의존적인 방법에 있어서 감소됨을 확인하였다(도 3A 참조). 또한, cyclin D2, hTERT 및 CDK4와 같은 c-Myc 표적 유전자의 mRNA 수준에 있어서 변화를 확인한 결과, 세포사멸 또는 세포 주기 정지(arrest)에 결과될 수 있는 29번 화합물에 의해서 c-Myc 아래쪽(downstream) 유전자의 하향-조절을 가설을 이끄는 c-Myc-의존 유전자의 발현은 대조군(0 μM 29번 화합물)에 있어서 비교된 29번 화합물-처리 세포에 있어서 감소됨을 확인하였다(도 3B 참조).
방광암 세포의 전체적인 유전자(global gene) 발현 상에 29번 화합물의 효과를 분석하기 위해서, 본 발명자들은 유전자 칩 분석 및 유전자 세트 강화 분석법(Gene Set Enrichment Analysis; GSEA)을 수행한 결과, c-Myc 표적 유전자 데이터 베이스로부터, 세포주기 진행 및 DNA 복제를 수반하는 유전자 세트는 Ku19-19 세포에 있어서 29번 화합물 처리에 의해서 하향-조절된 유전자에 유의적으로 농축된다(도 7B 참조). 또한, 본 발명자들은 c-Myc 전사 억제하는 BET 프로모도메인(bromodomain) 억제제의 연구를 앞서 보고한 것으로부터 이러한 Myc 표적 유전자 발현 프로파일을 비교했다. 각 처리에 의해서 발현에 있어서 1.5배 변화 보다 그 이상 존재하는 유전자들 가운데, 일반적으로 48 유전자들이 상향- 또는 하향-조절되었다(도 7C 참조).
본 발명의 화합물이 방광암 세포의 증식을 억제할 수 있는지를 확인하기 위하여, 방광암 세포주에 대한 세포독성 실험을 수행한 결과, c-Myc 전사 활성의 억제와 일치하는 29번 화합물은 Ku19-19 및 T24 세포 둘 다에서 3 μM에 30%에 의해서 세포 생존을 억제하였다. 세포가 48시간 동안 배양되었을 때, 이것의 억제 효과는 3 내지 10 μM의 농도에서 60 내지 75%에 이르렀다. 그러나, 다른 세포주와 달리, 불사화된 인간 방광 SV-HUC1 정상세포주의 생존은 29번 화합물에 의해서 덜 억제하였다(도 4 참조). 또한, 방광암 세포 주기 진행 및 세포사멸 유도를 분석한 결과, DNA 복제에 있어서 수반된 29번 화합물 하향-조절된 c-Myc 표적 유전자 결과로부터 기대한 것처럼, Edu 결합 분석법은 29번 화합물에 의해서 DNA 합성의 억제를 나타냈다(도 5A 참조). 또한, EdU 결합은 세포를 다른 c-Myc 억제제, 10058-F4(Sigma-Aldrich)를 가지고 처리했을 때 감소되었지만 상기 EdU 결합을 억제하기 위해 요구된 상기 농도는 29번 화합물를 위한 것보다 10배 높은 것 이상이었다(도 8 참조). 게다가, 또한, 유세포분류기 분석법은 S 단계에 세포의 분획에 있어서 동시에 sub-G0/G1 분획에 있어서 세포의 분획 증가를 가지는 29번 화합물 농도-의존적 감소를 나타냈다(도 5B 참조). 세포 주기 정지에 있어서 증가하는 것에 이외에, PARP 및 caspase-3의 절단은 세포사멸의 유도를 의미하는 웨스턴 블랏팅에 의해서 검출되었다(도 5C 참조).
화합물의 생체 내에서 방광암 억제효과를 확인하기 위하여, 동소적 방광암 모델 및 CMV 프로모터-유도 루시퍼라제 유전자를 가지는 Ku7-Luc 방광암 세포주를 사용해서 확인한 결과, 3 μM 낮은 투여량에서 29번 화합물은 형광 세포의 적은 수를 나타낸 것처럼 Ku7 및 이것의 유도체 Ku7-Luc 둘 다에 있어서 세포 주기 정지를 효과적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 6A 참조). 세포 주기 정지의 결과와 같이, 상기 Ku7 및 Ku7-Luc 세포의 증식은 Ku7-Luc 세포에 있어서 관찰된 좀더 심각한 효과를 가지고 억제된다(도 6B 참조). 또한, 동소적 방광암 Ku7-Luc을 사용해서 확립하는 방광안으로 29번 화합물의 주입에 앞서서, 29번 화합물의 0, 5, 10 및 30 ㎎/㎏가 29번 화합물의 독성을 평가하기 위한 비-종양-보유 마우스에 복강으로 투여하였다: 폐사 투여량이 되는 것에 결정된 10 ㎎/㎏ 및 30 ㎎/㎏. 게다가, 29번 화합물의 5 ㎎/㎏은 방광안으로 주입되었고 2시간 동안 29번 화합물에 노출되었을 때, 혈액에서 상기 29번 화합물의 농도는 전신적 독성을 유도하는 농도가 아닌 단지 평균적으로 0.360 ng/㎖에 이름을 확인하였다(도 9 참조). 아울러, 카테터(catheter)를 통하여 일주일에 2회, 3주 동안 방광안으로 5 ㎎/㎏ 29번 화합물의 주입 이후, 직접적 발광은 최대 발광을 나타낸 대조군으로부터 마우스에 비해 5주까지 29번 화합물-처리 그룹으로부터 대부분에 마우스에서 검출되지 않았다(도 6C 참조). 상기 발광 데이터와 일치하는 29번 화합물에 의한 종양 성장 억제는 H&E 염색 결과들에 나타난 것과 같이 방광 내부에 거대한 종양에 의해서 확인되었다. 더욱이, 이러한 투여 및 치료 식이 요법에 c-Myc 억제제의 주입은 다른 주요 기관 및 경골(tibia)에 전체 임파구에 독성을 야기하지 않는다(도 6D 참조).
따라서, 본 발명의 조성물은 c-Myc/Max/DNA 복합체(complex) 형성을 억제시켜 세포 주기 정지(cell cycle arrest)를 유도하여 다양한 방광암 세포주의 증식을 억제할 수 있어, 방광암을 예방 및 치료하는데 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 화합물들은 하나 또는 그 이상의 키랄 센터 및/또는 기하 이성질 센터를 가질 수 있으며, 이에 본 발명은 상기 화학식 1로 나타내며 방광암 세포의 증식을 억제하는 활성을 갖는 모든 입체이성질체, 즉, 광학 이성질체, 부분 입체 이성질체 및 기하 이성질체를 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 방광암의 치료 또는 예방에 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 인간 또는 다른 포유동물에 투여하기에 적합하다. 일반적으로, 약제학적 조성물은 멸균되어, 투여시 부작용을 유발하는 독성, 발암성, 또는 돌연변이성 화합물을 함유하지 않는다. 또한, 약제학적 조성물의 투여는 고체 종양 성장의 발병 전, 발병 중, 또는 발병 이후에 수행될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 "약제학적으로 허용가능한 담체"는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명에 있어서, 용어 "경요도적 주입"은 방광내의 투여를 위한 경요도관을 통한 주입을 포함하며, 점적 주사를 포함하는 모든 방광내 투입 수단 등을 이용하여 주입할 수 있다. 또한, 경요도적 주입시에 필요에 따라, 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체, 침투 촉진제 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물에 대한 치료에 요구되는 단일용량 또는 분리용량으로 일반적인 적당한 투여량은 1일 체중 1Kg당 약 0.01 내지 750mg 범위이고, 바람직하게는 0.1 내지 100mg이며, 가장 바람직하게는 0.5 내지 25mg 범위이나, 개개 환자에 대한 특이적인 용량 수준은 사용될 특정 화합물, 환자의 체중, 성, 식이, 약제의 투여시간, 투여방법, 배설률, 약제혼합, 환자의 상태 및 연령등에 따라 변화될 수 있다.
방광암 치료로서, 이전 임상시험에서, 기존 치료제들은 정맥 주사 투여하였다. 기존 치료제를 정맥 주입하여 치료한 환자들은 약물에 대해 상대적으로 우수한 내성을 보였다. 정맥 투여 후 용량 제한적인 독성은 단백뇨였다. 기존 치료제들의 대부분이 혈류 중 짧은 반감기를 가지기 때문에, 정맥 투여한 때, 이의 빠른 약동학적 소실 때문에 효과적으로 약물을 종양까지 전달하지 못한 것으로, 종양 반응의 부재에 대하여 가장 유사하게 설명된다.
방광내 투여가 전술한 정맥내 약물 전달의 문제들을 회피하기 때문에, 정맥 투여에 대해 불리하게 하는 기존 치료제들의 약동학적 특성에 대하여 본 발명의 경요도적 투여는 방광과 같이 용이하게 접근가능한 제3 컴파트먼트에서 발생하는 표피암의 치료에 유리할 수 있다. 1시간 동안 방광 내 약물의 체류는 혈류 중 이의 흡수가 유지되는 것과 달리, 종양 내로 상당한 양의 약물 전달 및 약물의 흡수를 개선할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물에서 유효 성분으로 이용되는 것은 상기 화학식 1의 화합물 자체뿐만 아니라, 그의 약제학적으로 허용 가능한 염, 수화물, 용매화물 또는 프로드러그이다.
용어, "약제학적으로 허용 가능한 염"은 원하는 약리학적 효과, 즉 방광암 세포의 증식을 억제하는 활성을 갖는 상기 화학식 1의 화합물의 염을 나타낸다. 이러한 염은 히드로클로라이드, 히드로브로마이드 및 히드로요오다이드와 같은 무기산, 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠술포네이트, p-톨루엔설포네이트, 비설페이트, 설파메이트, 설페이트, 나프틸레이트, 부티레이트, 시트레이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 시클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 푸마레이트, 글루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 2-히드록시에탄설페이트, 락테이트, 말리에이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 옥살레이트, 토실레이트 및 운데카노에이트와 같은 유기산을 이용하여 형성된다.
용어, "약제학적으로 허용 가능한 수화물"은 원하는 약리학적 효과를 갖는 상기 화학식 1의 화합물의 수화물을 나타낸다. 용어, "약제학적으로 허용 가능한 용매화물"은 원하는 약리학적 효과를 갖는 상기 화학식 1의 화합물의 용매화물을 나타낸다. 상기 수화물 및 용매화물도 상기한 산을 이용하여 제조될 수 있다.
용어, "약제학적으로 허용 가능한 프로드러그"는 상기 화학식 1의 화합물의 약리학적 효과를 발휘하기 이전에 생물전환을 하여야 하는 상기 화학식 1의 화합물의 유도체를 나타낸다. 이러한 프로드러그는 화학적 안정성, 환자 수용성, 생물학적 이용성, 기관 선택성 또는 조제의 편의를 개선하기 위하여, 작용 기간의 장기화 및 부작용의 감소를 위하여 제조된다. 본 발명의 프로드러그의 제조는 상기 화학식 1의 화합물을 이용하여 당업계의 통상적인 방법(예: Burger's Medicinal Chemistry and Drug Chemistry, 5th ed., 1:172-178 및 949-982(1995))에 따라 용이하게 제조될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다.
단 하기의 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예, 실험예 및 제조예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 인간 방광암세포에서의 증식 억제 저분자 화합물의 스크리닝
<1-1> 세포배양
방광암 T24, 마우스 방광암 MBT-2 및 불사화된 SV-HUC1 세포(ATCC, 미국)는 10% 우태아혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 RPMI 1640(Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 유지하였다. Ku19-19 및 Ku7 세포는 Ozu박사(Tokyo Medical University)에게 기증받았고 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 MEM에서 유지하였다. Ku7-Luc 세포(Caliper, Hopkinton, MA)는 상기 Ku7 세포와 같은 동일한 조건 아래에서 유지하였다.
<1-2> 스크리닝
방광암 치료용 저분자 화합물을 선별하기 위해 각기 다른 골격구조를 갖는 6480개의 저분자 화합물로 구성된 라이브러리(chemical library)를 한국화합물은행으로부터 제공받아, 상기 실시예 <1-1>의 인간 방광암 세포주(KU-7 및 KU19-19)의 성장을 50% 이상 저해하는 화합물을 선별하였다.
구체적으로, 상기 KU-7 및 KU19-19 세포주는 10% FBS가 포함된 RPMI1640 배양액에서 5% CO2, 37℃에서 배양하였다. 배양 중이던 KU-7 및 KU19-19 인간방광암세포를 96-웰 플레이트에 각 웰 당 1.0×103개씩 접종하고, 24시간 후에 본 발명의 화합물을 농도별로 처리하였다. 72시간 후에 KU-7 및 KU19-19 인간방광암세포의 상대적인 수치를 CellTiter-Glo(Promega 사)를 이용하여 측정하였으며, 상기 실험을 동일하게 독립적으로 4회 반복하여 각 농도에서 평균과 표준편차를 구하였으며, 이 수치와 SigmaPlot 프로그램(Systat Software 사)을 이용하여 IC50 값을 구하였다. 최종적으로 29종의 화합물을 선별하였으며, 선별된 화합물의 IC50 값은 하기 [표 1] 내지 [표 2]와 같았고, 그 화학구조는 하기와 같았다.
그 결과, [표 1] 내지 [표 2]에 나타낸 바와 같이, 인간 방광암 세포주에 관하여 낮은 IC50 값을 나타내었으며, 이는 본 발명의 화합물이 방광암세포의 증식을 효율적으로 억제할 수 있음을 보여주는 것이고, 특히, 화합물 3, 4, 5, 7, 8, 12, 13, 14, 17, 22 및 29가 1μM 미만의 매우 낮은 IC50 값을 나타내어 방광암 세포주의 증식을 매우 효과적으로 억제하여 방광암 치료에 유효하다는 것을 확인하였다(표 1 내지 표 2).
Figure pat00006
Figure pat00007
상기 선별된 29종 가운데 방광암 세포주 성장 억제 효과가 우수한 29번 화합물을 최종 선별하여, 동소 방광암 모델에서의 효과까지 확인하였다.
< 실시예 2> 방광암 조직에서 높은 c- Myc 발현 확인
c-Myc 유전자의 증폭은 방광암 환자의 30% 이상에서 발견되기 때문에, 방광암에 있어서 c-Myc 발현을 평가하기 위하여 조직 마이크로어레이의 면역조직직화학적 염색법을 수행하여 확인하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 방광암 표본에서 3개 다른 염색 패턴이 확인되었고(도 1A) 하기 [표 3]에 요약하였다. 상기 조직 어레이로부터 방광암 표본의 42.5% 만큼 c-Myc 발현의 낮은 수준을 나타냄을 확인하였고 앞선 보고들과 일치하는 c-Myc 단백질 응집하는 방광암의 집단을 의미하는 20.2% c-Myc 발현의 높은 수준을 나태냄을 확인하였다. 또한, 더욱이, 모든 방광암 세포주는 PCR에 의해서 c-Myc 전사체의 높은 수준을 나타냄을 확인하였다(도 1B).
Figure pat00008
<실험예 1> 선별된 화합물의 인간 방광암 세포에서의 증식 억제 효과 확인
<1-1> c-Myc 억제제 선별
방광암에서 c-Myc이 과발현되는 것을 확인한 이러한 결과는 방광암 성장에 대하여 형성될 수 있는 c-Myc 억제제를 선별해야 하는 것을 확인하였다.
이에, 본 발명자들은 c-Myc-반응성 유전자의 프로모터에 있어서 c-Myc 지속적 반응 요소(consensus response element; CRE)를 갖는 복합체 형성으로부터 c-Myc/Max을 억제할 수 있는 작은 분자들을 위한 스크리닝을 함에 있어서 c-Myc 억제제와 같은 29번 화합물을 확인하였다(도 2A).
Ku19-19 세포 파쇄물에서 c-Myc의 표적 DNA 서열에 결함으로부터 c-Myc을 억제할 수 있는 29번 화합물인지 결정하기 위해서 전기 영동 이동 분석법(electrophoretic mobility shift assay; EMSA)을 사용하였다.
구체적으로, Myc/Max 일치 올리고뉴클레오타이드(5'-gga agc aga cca cgt cgt ctg ctt cc-3'(서열번호 15))는 [γ-32P] ATP를 사용하여 표지하였다. 실온에서 5분 동안 재조합 c-Myc/Max 혼합물의 배양 다음, 화합물-포함 DMSO 수용액은 첨가되었다. 5분 더 배양한 후, 상기 표지된 DNA가 첨가되었다. 상기 단백질-DNA 복합체는 0.5X TBE 완충용액에서 6% 폴리아크릴아마이드 겔 상에서 자유한 DNA로부터 분리되었다. 각 밴드는 방사선 자동 사진법(autoradiography)에 의해서 시각화되었고 상기 밴드의 세기는 이미지 분석 소프트웨어(TotalLab, Nonlinear Dynamics, UK)를 가지고 정량화하였다.
그 결과, 도 2B에 나타낸 바와 같이, 29번 화합물는 효과적으로 농도-의존적 방법에 있어서 0.86± 0.04 μM의 IC50로 상기 복합체 형성을 효과적으로 억제함을 확인하였다(도 2B). 2 μM 29번 화합물이 완전하게 상기c-Myc/Max 및 CRE 서열 사이에 복합체 형성을 철폐하였다.
또한, 생체 내(in vivo)에서 CDK4 프로모터 상에 c-Myc 표적 서열에 c-Myc 보충을 억제할 수 있는 29번 화합물인지를 결정하기 위해서 ChIP(chromatin immunoprecipitation) 분석법을 사용하였다.
구체적으로, ChIP 분석을 위하여, 1% 포름알데하이드를 가지고 처리한 세포들은 PBS를 가지고 세척, SDS 용해 완충용액에 재희석하였고 상기 DNA를 잘라내기 위해서 초음파 처리하였다. 원심분리 이후, 상기 결과된 상층액은 연어 정자 DNA/단백질-A-아가로즈를 가지고 미리-정리하였고 c-Myc(Cell Signaling) 또는 대조군과 같은 토끼 IgG(Sigma-Aldrich)에 관한 항체를 가지고 면역침강(immunoprecipitated)하였다. 200 ㎕의 물에 희석된 DNA-단백질 복합체는 37에서 30분 동안 proteinase K 40 ㎕을 가지고 처리하였다. DNA 단편은 정제하였고 최종 부피 20 ㎕로 희석하였다. 상기 CDK4 프로모터 지역에 있어서 c-Myc 결합 부위의 PCR 증폭은 주형으로써 게놈 DNA의 100 ng과 두 개 프라이머를 사용해서 수행하였다.
그 결과, 도 2C에 나타낸 바와 같이, CDK4 프로모터 상에 c-Myc의 보충은 MBT-2 및 Ku19-19 세포 둘 다에서 29번 화합물 처리에 의해서 철폐됨을 확인하였다(도 2C). MBT-2 및 Ku19-19 세포에서 분리된 상기 염색체 DNA는 상기 CDK4 프로모터 상에 c-Myc CRE와 함께 동-침전되었다(도 2C). c-Myc 단백질의 양은 29번 화합물 처리에 의해서 영향받지 않는 것을 확인하였다(도 2C, 우측).
<1-2> c-Myc 전사 활성 억제 효과 확인
방광암에서 c-Myc 발현이 증가되고 29번 화합물이 c-Myc/Max/DNA 복합체 형성을 억제하기 때문에, 본 발명자들은 29번 화합물이 방광암 진행의 억제를 야기하는 c-Myc 전사적 활성을 억제할 수 있는지 확인하였다.
구체적으로, 첫 번재, 상기 c-Myc의 전사적 활성은 c-Myc 프로모터(p4xCMYC.Luc)의 조절 아래에서 리포터 루시퍼라제 유전자를 사용해서 29번 화합물의 다른 농도의 존재하에 있어서 측정하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 전사는 Ku19-19 및 MBT-2 세포에 있어서 29번 화합물를 가지고 처리에 의해서 농도-의존적인 방법에 있어서 감소됨을 확인하였다(도 3A). 5 μM 29번 화합물를 가지고 처리는 Ku19-19 세포에서 프로모터 활성에 있어서 거의 6배 감소하였고 MBT-2 세포에서 4.5배 감소됨을 확인하였다(도 3A).
그 다음, cyclin D2, hTERT 및 CDK4와 같은 c-Myc 표적 유전자의 mRNA 수준에 있어서 변화는 qRT-PCR에 의해서 확인하였다.
구체적으로, 총 RNA는 제조사의 지시에 따라 TRIzol Reagent(Invitrogen)를 사용하여 분리하였다. RT-PCR은 역전사 시스템(Reverse Transcription System)(Promega, Madison, WI)을 사용하여 수행하였다. QRT-PCR는 TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix kit(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하였다. 각 특정 유전자를 위한 프라이머들은 하기와 같다:
인간 CDK4를 위한 5'-gaa act ctg aag ccg acc ag-3'(서열번호 1) 및 5'-agg cag aga ttc gct tgt gt-3'(서열번호 2);
마우스 CDK4를 위한 5'-caa tgt tgt acg gct gat gg-3'(서열번호 3) 및 5'-cag gcc gct tag aaa ctg ac-3'(서열번호 4);
인간 사이클린 D2를 위한 5'-tgg gga agt tga agt gga ac-3'(서열번호 5) 및 5'-atc atc gac ggt ggg tac at-3'(서열번호 6);
마우스 사이클린 D2를 위한 5'-tta cct gga ccg ttt ctt gg-3'(서열번호 7) 및 5'-tgc tca atg aag tcg tga gg-3'(서열번호 8);
인간 텔로머라제(telomerase) 촉매 소단위체를 위한 5'-cgg aag agt gtc tgg agc aa-3'(서열번호 9) 및 5'-gga tga agc gga gtc tgg a-3'(서열번호 10);
마우스 텔로머라제 촉매 소단위체를 위한 5'-act cag caa cct cca gcc ta-3'(서열번호 11) 및 5'-cat att ggc act ctg cat gg-3'(서열번호 12); 및
마우스 및 인간 GAPDH를 위한 5'-tgc acc acc aac tgc tta-3'(서열번호 13) 및 5'-gga tgc agg gat gat gtt c-3'(서열번호 14).
그 결과, 도 3B에 나타낸 바와 같이, 세포사멸 또는 세포 주기 정지(arrest)에 결과될 수 있는 29번 화합물에 의해서 c-Myc 아래쪽(downstream) 유전자의 하향-조절을 가설을 이끄는 c-Myc-의존 유전자의 발현은 대조군(0 μM 29번 화합물)에 있어서 비교된 29번 화합물-처리 세포에 있어서 감소됨을 확인하였다(도 3B).
방광암 세포의 전체적인 유전자(global gene) 발현 상에 29번 화합물의 효과를 분석하기 위해서, 본 발명자들은 유전자 칩 분석 및 유전자 세트 강화 분석법(Gene Set Enrichment Analysis; GSEA)을 수행하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, c-Myc 표적 유전자 데이터 베이스로부터, 세포주기 진행 및 DNA 복제를 수반하는 유전자 세트는 Ku19-19 세포에 있어서 29번 화합물 처리에 의해서 하향-조절된 유전자에 유의적으로 농축된다(도 7B). 또한, 본 발명자들은 c-Myc 전자 억제하는 BET 프로모도메인(bromodomain) 억제제의 연구를 앞서 보고한 것으로부터 이러한 Myc 표적 유전자 발현 프로파일을 비교했다. 각 처리에 의해서 발현에 있어서 1.5배 변화 보다 그 이상 존재하는 유전자들 가운데, 일반적으로 48 유전자들이 상향- 또는 하향-조절되었다(도 7C). 부가적으로 116 유전자들이 29번 화합물-처리된 Ku19-19 세포에 있어서 단지 다르게 발현되는 것이 확인되었다.
<1-3> 방광암 세포 증식 억제 효과 확인
본 발명의 화합물이 방광암 세포의 증식을 억제할 수 있는지를 확인하기 위하여, <실시예 1>과 같이 배양된 세포주에 대한 세포독성 실험을 수행하였다. 구체적으로, 각각의 세포 형태는 29번 화합물의 다양한 농도에 노출되었고, 12, 24 또는 48시간 동안 배양 이후, 세포 독성 분석법에 의해서 세포 생존이 결정되었다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, c-Myc 전사 활성의 억제와 일치하는 29번 화합물은 Ku19-19 및 T24 세포 둘 다에서 3 μM에 30%에 의해서 세포 생존을 억제하였다. 세포가 48시간 동안 배양되었을 때, 이것의 억제 효과는 3 내지 10 μM의 농도에서 60 내지 75%에 이르렀다. 그러나, 다른 세포주와 달리, 불사화된 인간 방광 SV-HUC1 세포주의 생존은 29번 화합물에 의해서 덜 억제하였다(도 4).
본 발명의 화합물의 세포 주기 진행 및 세포사멸 유도를 분석하였다.
구체적으로, Ku19-19 세포는 약물 처리 1 일 전에 심었고 지시된 시간에 29번 화합물을 가지고 처리하였다. 세포는 회수 및 세척하였고 얼음-냉각 70% 에탄올을 가지고 고정하고 37에 30분 동안 100 U RNase A 존재하에서 50 ㎕/㎖ propidium iodide(PI)를 가지고 염색하였다. 세포사멸의 평가를 위하여, 유세포분류기(flow cytometer) 상어서 적어도 10,000 사건(events)을 수득하였고 결과들은 CellQuest software(Becton Dickinson, San Diego, CA)를 가지고 분석하였다.
또한, EdU 분석법을 이용한 세포 증식 분석은 Click-iT EdU 분석 키트(Invitrogen)를 사용해서 수행하였다. 세포는 96-웰 검정 플레이트에 심었고 37에서 밤새 배양하였다. 각 웰에 최종 농도 0 내지 10 μM로 29번 화합물를 첨가하였다. 6시간 배양 이후, 10 μM EdU가 첨가되었고 18시간 이후 세포는 포름알데하이드를 가지고 고정하였다. 상기 고정된 세포는 PBS에 0.1% Triton X-100를 가지고 투과화되었다. 마지막으로 삽입된 EdU는 5 μM Alexa Fluor 488-결합된 아자이드(azide)를 가지고 검출하였고 형광현미경 아래에서 시각화하였다.
또한, 웨스턴 블랏을 위하여, 세포들은 단백질 분해효소 억제제(Sigma-Aldrich, St. Lois, MO)를 포함하고 있는 RIPA 완충용액에 용해하였다. 단백질 30 내지 50 을 SDS-PAGE에 의해서 분해하였고 PVDF 막(Amersham Life Science)에 옮겼다. 막은 c-Myc, PARP, 또는 caspase 3(모두 Cell Signaling, Danvers, MA)에 관한 항체를 가지고 표지하였고 상기 다음 관련된 2차 항체(Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, MA)는 Enhanced Chemiluminescence (ECL) Plus kit(Amersham Life Science)를 사용해서 검출하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, DNA 복제에 있어서 수반된 29번 화합물 하향-조절된 c-Myc 표적 유전자 결과로부터 기대한 것처럼, Edu 결합 분석법은 29번 화합물에 의해서 DNA 합성의 억제를 나타냈다(도 5A). 또한, EdU 결합은 세포를 다른 c-Myc 억제제, 10058-F4(Sigma-Aldrich)를 가지고 처리했을 때 감소되었지만 상기 EdU 결합을 억제하기 위해 요구된 상기 농도는 29번 화합물를 위한 것보다 10배 높은 것 이상이었다(도 8). 게다가, 또한, 유세포분류기 분석법은 S 단계에 세포의 분획에 있어서 동시에 sub-G0/G1 분획에 있어서 세포의 분획 증가를 가지는 29번 화합물 농도-의존적 감소를 나타냈다(도 5B). 세포 주기 정지에 있어서 증가하는 것에 이외에, PARP 및 caspase-3의 절단은 세포사멸의 유도를 의미하는 웨스턴 블랏팅에 의해서 검출되었다(도 5C).
< 실험예 2> 동소적 방광암 모델을 이용한 종양 억제 효과 확인
<2-1> 동물 실험
본 발명에 있어서 모든 동물 실험은 국립암센터 실험동물 취급 및 사용을 위한 지침(Guideline for the Care and Use of Laboratory Animals of the National Cancer Center of the Republic of Korea (승인 번호, NCC-11-122))에 따라서 수행하였다.
동소(orthotopic) 방광암 모델을 확립하기 위해서, 7주령 암컷 BALB/c 누드 마우스 1.75% 이소플로란(isoflurane)을 가지고 마취하였다. 종양 획득 비율을 증가시키기 위해서, 0.1 ㎍/㎖ poly-L-lysine (Sigma-Aldrich)의 50 ㎕가 15분 동안 주입되었고 그 다음 상기 방광은 비워졌다. PBS안에 1X106 세포의 Ku7-Luc 세포는 2시간 동안 내재된 것을 유지한 22 게이지 동맥 구멍(puncture) 바늘 삽관(cannula)을 사용해서 방광을 통해 경요도적으로 주입되었다. 4일 후, 동물은 방광암의 존재를 확인하기 위하여 발광(luminescence)에 의해서 점검하였고 마우스는 두 그룹으로 무작위 선별하였다; 대조군 또는 실험군 동물(그룹당 n=5, 종양-보유 마우스) 대조군은 5% DMSO를 투여하였거나 실험군 동물은 c-Myc 억제제(5 mg/kg)를 3주 동안 일주일에 2회 경요도적으로 투여하였다. 발광 이미지는 INVIVO Lumina(Caliper)를 사용해서 일주일에 2회 얻었다.
<2-1> 동소적 방광암 모델을 이용한 종양 억제 효과 확인
화합물의 생체 내에서 방광암 억제효과를 확인하기 위하여, 동소적 방광암 모델 및 CMV 프로모터-유도 루시퍼라제 유전자를 가지는 Ku7-Luc 방광암 세포주를 사용해서 확인하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 3 μM 낮은 투여량에서 29번 화합물는 형광 세포의 적은 수를 나타낸 것처럼 Ku7 및 이것의 유도체 Ku7-Luc 둘 다에 있어서 세포 주기 정지를 효과적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 6A). 세포 주기 정지의 결과와 같이, 상기 Ku7 및 Ku7-Luc 세포의 증식은 Ku7-Luc 세포에 있어서 관찰된 좀더 심각한 효과를 가지고 억제된다(도 6B).
또한, 동소적 방광암 Ku7-Luc을 사용해서 확립하는 방광안으로 29번 화합물의 주입에 앞서서, 29번 화합물의 0, 5, 10 및 30 ㎎/㎏가 29번 화합물의 독성을 평가하기 위한 비-종양-보유 마우스에 복강으로 투여하였다: 폐사 투여량이 되는 것에 결정된 10 ㎎/㎏ 및 30 ㎎/㎏. 게다가, 29번 화합물의 5 ㎎/㎏은 방광안으로 주입되었고 2시간 동안 29번 화합물에 노출되었을 때, 혈액에서 상기 29번 화합물의 농도는 전신적 독성을 유도하는 농도가 아닌 단지 평균적으로 0.360 ng/㎖에 이름을 확인하였다(도 9).
아울러, 카테터(catheter)를 통하여 일주일에 2회, 3주 동안 방광안으로 5 ㎎/㎏ 29번 화합물의 주입 이후, 직접적 발광은 최대 발광을 나타낸 대조군으로부터 마우스에 비해 5주까지 29번 화합물-처리 그룹으로부터 대부분에 마우스에서 검출되지 않았다(도 6C).
조직학적 분석을 위하여, 슬라이드에 부착된 5 내지 10 ㎛의 종양 절편은 에탄올을 가지고 왁스-제거하였고, 헤마토실린 및 에오신(hematoxylin and eosin; H&E)으로 염색하였다. 종양 조직 어레이(Biomax, Rockville, MD)에 있어서 c-Myc 발현은 항-c-Myc(Cell Signaling)를 가지고 항체면역조직화학적 염색 및 상기 H&E를 가지고 교차염색에 의해서 분석하였다.
그 결과, 도 6D에 나타낸 바와 같이, 발광 데이터와 일치하는 29번 화합물에 의한 종양 성장 억제는 H&E 염색 결과들에 나타난 것과 같이 방광 내부에 거대한 종양에 의해서 확인되었다. 더욱이, 이러한 투여 및 치료 식이 요법에 c-Myc 억제제의 주입은 다른 주요 기관 및 경골(tibia)에 전체 임파구에 독성을 야기하지 않았다(도 6D).
이와 같이, 본 발명의 화합물은 방광내 직접 주입을 통한 현저한 방광암 예방, 억제, 치료 효과를 나타내었으며, 다른 장기에 영향이 없어, 종래의 항암제의 사용에 따른 부작용을 막을 수 있다.
< 제조예 1> 약제학적 제제의 제조
<1-1> 주사제의 제조
본 발명의 화합물 29 32 ㎎
아스코르브산 0.5 ㎎
디소르비톨 6.0 ㎎
푸룩토오스 2.0 ㎎
아황산나트륨 2.0 ㎎
염화나트륨 10.0 ㎎
에탄올 0.6 ㎖
주사용 증류수 적량
수산화 나트륨 적량
전량 2.0 ㎖
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 주사제의 제조방법에 따라서 혼합 및 바이알에 진공 포장하여 주사제를 제조하였다.
<1-2> 주사제의 제조
본 발명의 화합물 29 40 ㎎
에탄올 0.5 ㎖
DMSO 0.25 ㎖
폴리소르베이트 80 0.5 ㎖
폴리에틸렌글리콜 400 0.2 ㎖
주사용 증류수 적량
전량 2.0 ㎖
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 주사제의 제조방법에 따라서 혼합 및 바이알에 진공 포장하여 주사제를 제조하였다.

Claims (7)

  1. 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 경요도적 주입용 방광암 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물:
    Figure pat00009
    화학식 1
    여기서, R1 내지 R4는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 선형 또는 분지형 (C1-10)알킬기, 선형 또는 분지형 할로(C1-6)알킬기, 선형 또는 분지형 (C1 -10)알콕시기, 또는 니트로기이고(단, R1 내지 R4가 모두 수소인 경우는 제외);
    R5는 선형 또는 분지형 (C1 -6)알킬기이며;
    X는 NHR6,
    Figure pat00010
    또는
    Figure pat00011
    이고;
    R6는 선형 또는 분지형 (C1 -6)알킬기, 또는 치환 또는 비치환 페닐(여기서, 치환기는 하나 이상의 할로겐, 선형 또는 분지형 (C1 -6)알킬기, 또는 할로겐과 선형 또는 분지형 (C1 -6)알킬기임)이고;
    R7 내지 R10은 각각 독립적으로 수소 또는 할로겐이며, n은 1 내지 10의 정수이다.
  2. 제 1항에 있어서, R1 내지 R4는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 선형 또는 분지형 (C1 -10)알킬기, 선형 또는 분지형 할로(C1-6)알킬기, 또는 니트로기이고(단, R1 내지 R4가 모두 수소인 경우는 제외);
    R5는 선형 또는 분지형 (C1 -6)알킬기이며;
    X는 NHR6이고;
    R6는 하나 이상의 할로겐, 선형 또는 분지형 (C1 -6)알킬기, 또는 할로겐과 선형 또는 분지형 (C1 -6)알킬기로 치환된 페닐인 화합물인 것을 특징으로 하는 경요도적 주입용 방광암 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 중 어느 하나로 표시되는 화합물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 경요도적 주입용 방광암 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물:
    Figure pat00012
    .
  4. 제 1항에 있어서, 점적주사에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 경요도적 주입용 방광암 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물.
  5. 제 1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서, 방광암이 비근침윤성 방광암인 경요도적 주입용 방광암 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물.
  6. 제 1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서, 방광암이 고위험군(pTa/T1 G3) 등급인 경요도적 주입용 방광암 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물.
  7. 제 1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서, 이온성 또는 비이온성 계면활성제, 폴리비닐 피롤리돈, 알기네이트, 폴리아크릴산 또는 이들 임의 2종 이상의 혼합물을 추가로 포함하는 경요도적 주입용 방광암 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물.

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Cited By (3)

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WO2020080682A1 (ko) * 2018-10-15 2020-04-23 한국화학연구원 신규 퀴놀리논 유도체, 이의 제조방법, 및 이를 유효성분으로 함유하는 항바이러스용 조성물

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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101879992B1 (ko) * 2016-07-29 2018-07-19 국립암센터 c-Myc/Max/DNA 복합체 형성을 억제하는 화합물
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EP3603641A4 (en) * 2017-04-10 2020-09-02 Industry - University Cooperation Foundation Hanyang University PHARMACEUTICAL COMPOSITION WITH A DUSP1 INHIBITOR
US11147807B2 (en) 2017-04-10 2021-10-19 Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University Pharmaceutical composition containing DUSP1 inhibitor
WO2020080682A1 (ko) * 2018-10-15 2020-04-23 한국화학연구원 신규 퀴놀리논 유도체, 이의 제조방법, 및 이를 유효성분으로 함유하는 항바이러스용 조성물
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