LT5416B - Antikūnai, nukreipti prieš monocito chemotaksio baltymą -1, ir jų panaudojimas - Google Patents

Abstract

Išradimo įgyvendinimas susijęs su antikūnais, nukreiptais prieš monocitų chemotaksio baltymo-1 (MCP-1) antigeną, ir tokių antikūnų panaudojimu. Ypatingai, remiantis kai kuriais įgyvendinimais, numatyti pilnai žmogaus monokloniniai antikūnai, nukreipti prieš MCP-1 antigeną. Pateiktos nukleotidų sekos, koduojančios, ir aminorūgščių sekos, apimančios, imunoglobulino molekulės sunkiąją ir lengvąją grandines, ypatingai sekos, atitinkančios artimoms sunkiosios ir lengvosios grandinės sekoms, apimančioms struktūrinę sritį ir/arba komplementarumą apibrėžiančias sritis (CDR), ypatingai nuo FR1 iki FR4 arba CDR1 iki CDR3. Taip pat pateiktos hibridomos ir kitos ląstelių linijos, ekspresuojančios tokias imunoglobulinų molekules ir monokloninius antikūnus.

Description

Aprašyto išradimo įgyvendinimas susijęs su antikūnais, nukreiptais prieš monocitų chemotaksio baltymo-1 (CMP-1) antigeną ir tokių antikūnų panaudojimu. Ypatingai, pagal išradimo įgyvendinimą yra numatyti pilnai žmogaus monokloniniai antikūnai, nukreipti prieš MCP-1 antigeną Yra numatytos nukleotidų sekos, koduojančios ir aminorūgščių sekos, apimančios, imunoglobulino molekulės sunkiąją ir lengvąją grandines, ypatingai sekas atitinkančias gretimoms sunkiosios ir lengvosios grandinių sekoms, apimančioms struktūrines sritis ir/arba komplementarumą apibrėžiančias sritis (CDR), konkrečiai nuo FR1 iki FR4 arba CDR1 iki CDR3. Išradime surasti antikūnai naudojami ligą susijusių su MCP-1 perprodukcija, diagnozei ir gydymui. Taip pat numatytos hibridomos arba kitos ląstelių linijos, ekspresuojančios tokias imunoglobulinų molekules ir monokloninius antikūnus.

Technikos lygio aprašymas

Manoma, kad angiogeninių faktorių gamybos didėjimas ir vėžio ląstelių angiogenezės inhibitorią kraujagyslių endotelio ląstelių ir kitų stromos ląstelių tipų produkcijos mažėjimas indukuoja auglio angiogenezę. Štromą, apimanti tarpinį jungiamąjį audinį, bazalines plokšteles, kraujo ląsteles, fibroblastų ląsteles, apsupa beveik visas tirpias auglio ląsteles. Sąveikos tarp stromos ir vėžio ląstelių vaidina kritinį vaidmenį auglių neovaskuliarizacijoje. Be to, makrofagai, kurie yra taip pat stromos komponentai, yra svarbūs auglio angiogenezėje. (M. Ono ir kt., Cancer Chemother. Pharmacol. (1999) 43(Suppl.): S69-S71).

Makrofagai pagrindinai yra vienbranduolinės fagocitų sistemos galutinai diferencijuotų ląstelių tipas, ir taip pat yra vienos iš pagrindinių angiogenezės ląsteliųefektorių, gaminančių tam tikrą skaičių augimo stimuliatorių ir inhibitorių. Žinoma, kad tam tikras skaičius angiogeninių citokinų yra gaunami iš makrofagų, įskaitant monocitų chemotaksio baltymą-1 (MCP-1).

MCP-1 yra žinomas kaip chemotaktinis T limfocitams, bazofilams ir NK ląstelėms. MCP-1 yra vienas iš daugelio pajėgių makrofagus sutelkiančių molekulių. Sutelkti į auglio arba uždegimo vietas, makrofagai gali generuoti tam tikrą skaičių angiogeninių citokinų. tuo būdu stimuliuodami patologinę angiogenezę. Tam tikras skaičius tyrimų parodė sąryšį tarp angiogenezės, makrofagų telkimo ir prognozių pacientams su įvairiomis auglių rūšinuT( ,5 416 B Fantanini ir kt., Int. J. Cancer (1996) 67:615; N. Weidner ir kt., J. Nathl. Cancer Inst. (1992)

84:1875). Leek ir kt. papildomai pademonstravo, kad iš pagrindų didėjantis makrofagų skaičius yra glaudžiai susijęs su vaskuliarizacija ir krūties vėžio pacientų prognoze (Cancer Res. (1996) 56:4625). R. Huang ir kt., (Cancer Res. (2002) 62:2806-2812) parodė, kad Connexin 43 supresuoja glioblastomos ląstelių augimą mažėjant MCP-1 reguliacijai, kaip atrasta naudojant baltymų matricų technologiją.

Goede ir kt. (Int. J. Cancer (1999) 82: 765-770) pirma pademonstravo, kad MCP-1 turi angiogeninį gebėjimą, kuris buvo ekvivalentiškas VEGF gebėjimui, kai buvo tiriamas triušių ragenos modelis. Šiame modelyje, MCP-1 indukuotas angiogeninis aktyvumas buvo susijęs su dideliu makrofagų susitelkimu triušio ragenoje. Salcedo ir kt. pranešė, kad MCP-1 indukavo žmogaus endotelio ląstelių chemotaksį nanomoliarinėse koncentracijose. Šis chemotaktinis atsakas buvo inhibuotas polikloniniu antikūnu prieš žmogaus MCP-1 (R.

Salcedo ir kt., Blood (2000) 96(1):34-40).

MCP-1 yra dominuojantis chemokinas, ekspresuotas kiaušidžių vėžio (Negus, R. P.

M. ir kt., J. Clin. Invest. (1995) 95: 2391-96; Sica, A. Ir kt., J. Immunology (2000) 164(2):733-8). MCP-1 taip pat yra aukštesnis keletu žmogaus vėžio atvejų, įskaitant šlapimo pūslės, krūties, plaučių vėžį ir glioblastomą.

Be to, MCP-1 svarba uždegimo procese buvo parodyta eilėje tyrimų. Pavyzdžiui, H.J.

Anders ir kt. pademonstravo chemokinąir chemokino receptoriaus ekspresiją glomerunefrito imuninio komplekso iniciacijoje ir išsiskaidyme. Segerer ir kt. (J. Am. Soc. Nephrol. (2000) 11:2231-2242) taip pat tyrė MCP-1 ekspresiją ir jo receptoriaus chemokino receptoriaus-2 ekspresiją žmogaus pusmėnulinio glomerulonefrito atveju. J.A. Belperio ir kt. parodė chemokino MCP-1/CCR2 lemiamą vaidmenį bronchiolitis obliterans sindromo patogenezėje (J. Clin. Investig. (2001) 108:547-556). N.G. Frangiogiannis ir kt. aprašė MCP-1 vaidmenį uždegiminiam atsakui į miokardo infarktą (Cardiovacular Res. (2002) 53: 31-47). Gerard ir Rollins (Nature Immunol. (2001) 2:108-115) ir Reape ir Groot (Atherosclerosis (1999) 147:

213-225) diskutavo apie MCP-1 vaidmenį aterosklerozei ir kitoms ligoms. Taip pat, Schmidt ir Stem (Arterioscler. Tromb. Vasc. Biol. (2001) 21:297-299) aprašė MCP-1 sąveikas restenozėje.

Žmogaus MCP-1, 76 aminorūgščių CC chemokinas su N-galine piroglutamo rūgštimi pradžioje buvo išskirtas iš keletos šaltinių, įskaitant fitohemaglutinino stimuliuotus žmogaus limfocitus (Yoshimura, T. ir kt., J. Immunol. (1989) 142:1956-62). žmogaus gliomos ląstelių liniją (Yoshimura, T., ir kt., J. Exp. Med. (1989) 169: 1449-59), ir žmogaus mielomonocitinių ląstelių liniją THP-1 (Matsushima, K., ir kt., (1989) J. Exp. Med. (1989)

169: 1485-90). MCP-1 visų pirma buvo aprašytas kaip limfocitų kilmės chemotaktinis faktorius (LDCF). Kiti baltymo pavadinimai yra auglio ląstelių kilmės chemotaktinis faktorius (TDCF), gliomos kilmės monocitų chemotaktinis faktorius (TDCF), gliomos kilmės monocitų chemotaktinis faktorius (GDCF), lygiųjų raumenų ląstelių kilmės chemotaktinis faktorius (SMC-CF), monocitų chemotaktinis aktyvuojantis faktorius (MCAF) ir CCL2. MCP-1 koduojančios cDNR klonavimas atskleidė 99 aminorūgščių atvirą skaitymo rėmelį įskaitant 23 aminorūgščių signalinį peptidą. MCP-1 pelių homologinis genas buvo pavadintas JE (B.J. Rollins ir kt., 1989).

WO 200189565, paskelbtas 2001 lapkričio 29, atskleidė polikloninius antikūnus prieš žmogaus MCP-1 ir aprašo auglio augimo inhibiciją plikų pelių modelyje, naudojant tokius polikloninius antikūnus.

Aprašyto išradimo įgyvendinimas susijęs su pilnai žmogaus monokloniniu antikūnu prieš žmogaus MCP-1, kuris blokuoja MCP-1 indukuotą HTP-1 ląstelių chemotaksį ląstelių linijos, išvestos iš pacientų su ūmia monocitine leukemija. Šios ląstelės yra naudojamos kaip normalių žmogaus vienbranduolinių ląstelių pakaitalai judėjimo įvertinimui cirkuliacijoje. Vienbranduolinės ląstelės infiltravimas, stimuliuotas MCP-1, vaidina patologinį vaidmenį eilėje uždegiminių buklią įskaitant reumatoidinį artritą glomerulonefritą aterosklerozę, transplanto atmetimą psoriazę, restenozę ir autoimunines ligas, tokias kaip išsėtinę sklerozę. Antikūnas, kuris blokuoja MCP-1 aktyvumą ir trukdo monocitų infiltracijai, gali būti naudojamas šių ir kitų uždegiminių ligų gydymui.

Trumpas išradimo išdėstymas

Čia aprašyti išradimo įgyvendinimai susiję su monokloniniais antikūnais, kurie kaip buvo surasta, susiriša su MCP-1 ir veikia MCP-1 funkciją. Kiti įgyvendinimai susiję su žmogaus anti-MCP-1 antikūnais ir anti-MCP-1 antikūnų gamyba su norimomis savybėmis iš gydymo perspektyvos, įskaitant stiprų prisirišimo trauką prie MCP-1, sugebėjimą neutralizuoti MCP-1 in vitro, ir sugebėjimą inhibuoti viso auglio neovaskuliarizaciją.

Vienas išradimo įgyvendinimas yra pilnai žmogaus monokloninis antikūnas, kuris rišasi su MCP-1 ir turi sunkiosios grandinės aminorūgščių seką,, parinktą iš grupės, susidedančios iš SEQ ID Nr.:2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 9S, 102, 106, 110, 114, 118, 122, 126, 130, 134, 13S, 142 ir 146. Išradimo įgyvendinime antikūnas, toliau apima lengvosios grandinės aminorūgščių seką,, parinktą iš grupės, susidedančios iš SEQ ID Nr.: 4, 8, 12. 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, S0, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144 ir 148.

Taigi, čia aprašyto išradimo įgyvendinimas pateikia izoliuotus antikūnus, arba šių antikūnų fragmentus, kurie rišasi su MCP-1. Kaip yra žinoma, antikūnai sėkmingai gali būti pavyzdžiui, monokloniniai, chimeriniai ir/arba žmogaus antikūnai. Čia aprašyto išradimo įgyvendinimas taip pat pateikia ląsteles šių antikūnų gamybai.

Kitas šio išradimo įgyvendinimas yra pilnai žmogaus antikūnas, kuris rišasi su MCP1, kuris apima sunkiosios grandinės aminorūgščių seką, turinčią CDR, apimančias sekas, parodytas 7 iri 0 figūrose. Pažymima, kad CDR apibrėžimai gali būti būti atlikti nesunkiai tos srities specialistų. Apskritai, CDR pateiktos šiame išradime, yra aprašytos čia, kaip apibrėžta Kabat ir kt., in Seųuences of Proteins of Imunological Interest 1-3 tomuose (Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD 1991),

Dar kitas šio išradimo įgyvendinimas yra pilnai žmogaus antikūnas, kuris rišasi su MCP-1 ir apima lengvosios grandinės aminorūgščių seką, turinčią CDR, apimančias sekas parodytas 8 ir 9 figūrose.

Tolimesnis šio išradimo įgyvendinimas yra pilnai žmogaus antikūnas, kuris rišasi su MCP-1, kuris apima sunkiosios grandinės aminorūgšties seką, turinčią CDR, apimančias sekas, parodytas 7 irlO figūrose ir lengvosios grandinės aminorūgšties seką, turinčią CDR, apimančią sekas, parodytas 8 ir 9 figūrose.

Kitas šio išradimo įgyvendinimas yra pilnai žmogaus antikūnas, kuris rišasi su kitais MCP-1 šeimos nariais, įskaitant, bet ne limituotai, su MCP-2, MCP-3 ir MCP-4. Tolimesnis šio išradimo įgyvendinimas yra antikūnas, kuris kryžmiškai konkuruoja dėl susijungimo su MCP-1 su šio išradimo pilnai žmogaus antikūnais.

Reikia suprasti, kad išradimo įgyvendinimai nėra apriboti kuria nors daline antikūno forma, arba kilmės, arba gamybos būdu. Pavyzdžiui, anti-MCP-1 antikūnas gali būti pilno ilgio antikūnas (t.y. turintis sveiką žmogaus Fc sritį) arba antikūno fragmentas (t.y. Fab, Fab‘ arba F(ab')2). Be to, antikūnas gali būti pagamintas iš hibridomos, kuri sekretuoja antikūną, arba iš rekombinantiškai gautos ląstelės, kuri gali būti transformuota arba transfekuota genu arba genais, koduojančiais antikūną.

Kiti šio išradimo įgyvendinimai apima izoliuotas nukleino rūgšties molekules, koduojančias bet kurį čia aprašytą antikūną, vektorius, turinčius izoliuotas nukleino rūgšties molekules, koduojančias bet kurį iš tokių anti-MCP-1 antikūnų, ląstelę-šeimininkę. transformuotą kokia nors iš šių nukleino rūgšties molekulių. Be to. šio išradimo įgyvendinimas yra anti-MCP-1 antikūno gavimo būdas, auginant ląsteles-šeimininkes sąlygomis, kuriose nukleino rūgšties molekulė yra išreikšta produkuoti antikūną, išplaukiantį iš antikūno atstatymo.

_Τ1 .. ,.. LT 5416 B

Tolimesnis šio išradimo įgyvendinimas apima aukšto giminingumo antikūnų prieš MCP-1 gavimo metodą imunizuojant žinduolį su žmogaus MCP-1 arba jo fragmentu ir viena arba daugiau ortologinių sekų arba jų fragmentų.

Čia aprašyto išradimo įgyvendinimas paremtas izoliuotų antikūnų, kurie specifiškai rišasi su MCP-1, generavimu ir identifikavimu. MCP-1 ekspresuojamas aukštesniame lygyje esant neoplastinėms ligoms, tokioms kaip augliai, arba kitos uždegiminės ligos. MCP-1 biologinio aktyvumo inhibavimas galigali sutrukdyti tolimesnę vienbranduolinių ląstelių infiltraciją į audinius.

Kitas šio išradimo įgyvendinimas apima ligų diagnozavimo metodą arba sąlygas, kurioms esant antikūnai paruošiami pagal išradimo aprašymą panaudojimui MCP-1 lygio nustatymui pacientų pavyzdžiuose. Šiame įgyvendinime pacientų pavyzdžiai yra kraujas arba kraujo serumas. Tolimesniame įgyvendinime, yra rizikos faktorių identifikavimo metodai, ligų diagnozė ir ligų stadijos nustatymas, kurie apima MCP-1 superekspresiją naudojant anti-MCP-1 antikūnus.

Kitame įgyvendinime išradimas apima diagnozavimo metodą sąlygų, susijusių su MCP-1 ekspresija ląstelėje, apimančių ląstelės kontaktavimą su anti-MCP-1 antikūnu, ir MCP-1 buvimo nustatymu. Geresnės sąlygos apima , bet ne limituoja, neoplastines ligas, apimančias be apribojimų auglius, vėžį, tokį kaip krūties, kiaušidžių, skrandžio^ endometriumo, seilių liaukų, plaučių, inkstą gaubtinės žarnos, tiesiosios žarnos, skydliaukės, kepeną prostatos ir šlapimo pūslės vėžį, o taip pat ir kitas uždegimines sąlygas, įskaitant, bet nelimituojant, reumatoidinį artritą glomerulonefritą aterosklerozę, psoriazę, organų transplantus, restenozę ir autoimunines ligas.

Kitame įgyvendinime, išradimas apima reagentų rinkinį nustatymui MCP-1 ir MCP-1 šeimos narių žinduolių audinių kultūrose arba ląstelėse, atrinkimui neoplastinių ligų arba uždegiminių sąlygą apimančių antikūną kuris rišasi su MCP-1 ir būdus antikūno reakcijos su antigenu parodymui, jeigu yra. Geriau antikūnas yra monokloninis antikūnas. Viename įgyvendinime, antikūnas, kuris rišasi su MCP-1, yra žymėtas. Kitame įgyvendinime antikūnas yra nežymėtas pirmasis antikūnas ir būdas reakcijos pažymėjimui apima žymėtą antrąį antikūną kuris yra imunoglobulinas. Geriau antikūnas yra žymėtas žymeniu, parinktu iš grupės, susidedančios iš fluorochromo, fermento, radioizotopo ir nepralaidžios spindulinei energijai medžiagos.

Kitas išradimo įgyvendinimas apima farmacines kompozicijas, apimančias efektyvų kiekį šio išradimo antikūno mišinyje su farmaciškai priimtinu nešikliu arba tirpikliu. Dar kituose įgyvendinimuose anti-MCP-1 antikūnas arba jo fragmentas yra konjuguotas su terapiniu agentu. Terapinis agentas gali būti toksinas arba radioizotopas. Geriau, tokie antikūnai gali būti naudojami gydymui ligų, tokių kaip, pavyzdžiui, auglių, apimančių be apribojimo, vėžį, tokį kaip krūties, kiaušidžių, skrandžio, endometriumo, seilių liaukų, plaučių, inkstų, gaubtinės žarnos, tiesiosios žarnos, skydliaukės, kepenų, prostatos ir šlapimo pūslės vėžį, o taip pat ir kitas uždegiminius procesus, įskaitant taip pat be apribojimų, reumatoidinį artritą, glomerulonefritą, aterosklerozę, psoriazę, organų transplantus, restenozę ir autoimunines ligas.

Dar vienas išradimo įgyvendinimas pateikia ligų gydymo būdą arba sąlygas, susijusias su MCP-1 ekspresija pacientuose, apimantį anti-MPC-l antikūno efektyvaus kiekio paskyrimą pacientams. Būdas gali būti atliktas in vivo. Pacientas yra žinduolis pacientas, geriau žmogus pacientas. Rekomenduojamame įgyvendinime būdas susijęs su gydymu auglių, įskaitant be apribojimų, vėžį, tokį kaip krūties, kiaušidžių, skrandžio, endometriumo, seilių liaukų, plaučių, inkstų, gaubtinės žarnos, tiesiosios žarnos, skydliaukės, kepenų, prostatos ir šlapimo pūslės vėžį. Kitame įgyvendinime, būdas susijęs su gydymu uždegiminių būklių, įskaitant be apribojimų, reumatoidinį artritą, glomerulonefritą, aterosklerozę, psoriazę, organų transplantus, restenozę ir autoimunines ligas. Papildomi įgyvendinimai apima gydymo būdus ligų ir būklių, susijusių su MCP-1 ekspresija, kurie gali apimti identifikavimą žinduolio poreikio MCP-1 superekspresijos gydymui ir paskyrimą žinduoliui terapiškai aktyvios anti-MCP-1 antikūno dozės.

Kitame įgyvendinime, išradimas numato gamybos būdą, apimantį talpą, susidedančią iš kompozicijos, turinčios anti-MCP-1 antikūną ir įterptą arba žymėtą paketą, reiškiančius, kad kompozicija gali būti naudojama neoplastinių ir uždegiminių ligų, charakterizuojamų MCP-1 superekspresija, gydymui. Geriau žinduolis, ir dar geriau žmogus priims anti-MCP-1 antikūną. Rekomenduojamame įgyvendinime, yra gydyti augliai, įskaitant be apribojimų vėžį, tokį kaip krūties, kiaušidžių, skrandžio, endometriumo, seilių liaukų, plaučių, inkstų, gaubtinės žarnos, tiesiosios žarnos, skydliaukės, kepenų, prostatos ir šlapimo pūslės vėžį, o taip pat ir kitus uždegiminius procesus, įskaitant taip pat be apribojimų, reumatoidinį artritą, glomerulonefritą, aterosklerozę, psoriazę, organų transplantus, restenozę ir autoimunines ligas, tokias kaip išsėtinė sklerozė.

Kai kuriuose įgyvendinimuose, anti-MCP-1 antikūnas yra įvedamas pasėkoje klirinimo agento pašalinimo cirkuliuojančio antikūno iš kraujo.

Kai kuriuose įgyvendinimuose, anti-MCP-1 antikūnai gali būti modifikuoti, kad būtų sustiprintas komplemento fiksavimo sugebėjimas ir dalyvavimas nuo komplemento priklausančiame citotoksiškume (CDC). Įgyvendinime anti-MCP-1 antikūnas gali būti modifikuotas taip, kad pakeičiant aminorūgštis būtų pakeistas antikūno klirensas. Pavyzdžiui, kai kurie aminorūgščių pakeitimai gali paspartinti antikūno klirensą iš kūno.

Antraip, aminorūgščių pakeitimai gali lėtinti antikūno klirensą iš kūno. Kituose įgyvendinimuose, anti-MCP-1 antikūnas gali būti pakeistas taip, kad jis pašalinamas iš kūno mažiau sparčiai.

Dar kitas įgyvendinimas yra anti-MCP-1 antikūno naudojimas gamybai medikamento, skirto ligų, tokių kaip neoplastinės ligos ir uždegiminiai būviai, gydymui. Įgyvendinime neoplastinės ligos apima auglius ir vėžį, tokį kaip krūties, kiaušidžių, skrandžio, endometriumo, seilių liaukų, plaučių, inkstų, gaubtinės žarnos, tiesiosios žarnos, skydliaukės, kepenų, prostatos ir šlapimo pūslės vėžį. Alternatyviame įgyvendinime, uždegiminiai procesai apima, bet taip pat be apribojimų, reumatoidinį artritą, glomuronefritą, aterosklerozę, psoriazę, organų transplantuos, restenozę ir autoimunines ligas.

Trumpas figūrų aprašymas figūra rodo THP-1 monocitų migracijos tyrimo į atsaką prieš MCP-1, MCP-2, MCP-3 ir MCP-4 rezultatus.

figūra rodo THP-1 ląstelių migracijos slopinimą 3.11.2 antikūnu nuo dozės priklausomu būdu, atsakant į MCP-2.

figūra rodo THP-1 ląstelių migracijos slopinimą 3.11.2 antikūnu nuo dozės priklausomu būdu, atsakant į MCP-3.

figūra rodo anti-MCP-1 1.7.3 antikūno poveikį į kasos auglio Panc-1 didėjimą.

figūra rodo kalcio srauto, chemotaksio ir giminingumo duomenų trimačio išsisklaidymo diagramą MCP-1 antikūnams.

figūra rodo kalcio srauto, chemotaksio ir giminingumo duomenų trimačio išsisklaidymo diagramos MCP-1 antikūnams kitą orientaciją.

7A figūra rodo anti-MCP-1 sekų palyginimą Clustar W programa, naudojant VH124, pažymint CDR, CDR2 ir CDR3 sritis, ir susijusią dendrogramą (7B figūra).

8A figūra rodo anti-MCP-1 sekų palyginimą Clustar W programa, naudojant VK-B3, pažymint CDR, CDR2 ir CDR3 sritis, ir susijusią dendrogramą (8B figūra).

9A figūra rodo anti-MCP-1 sekų palyginimą Clustar W programa, naudojant VK-08, pažymint CDR, CDR2 ir CDR3 sritis, ir susijusią dendrogramą (9B figūra).

10A figūra rodo anti-MCP-1 sekų palyginimą Clustar W programa, naudojant VH61, pažymint CDR, CDR2 ir CDR3 sritis, ir susijusią dendrogramą (10B figūra).

Detalus pageidautino įgyvendinimo aprašymas

Aprašyti išradimo įgyvendinimai susiję su monokloniniais antikūnais, kurie rišasi su MCP-1. Kai kuriuose įgyvendinimuose, antikūnai rišasi su MCP-1 ir paveikia MCP-1 funkciją. Kiti įgyvendinimai pateikia pilnai žmogaus anti-MCP-1 antikūnus ir anti-MCP-1 preparatus su norimomis savybėmis, žvelgiant į gydymo perspektyvą įskaitant stiprų MCP-1 prisirišimo giminingumą sugebėjimą neutralizuoti MCP-1 in vitro ir sugebėjimą inhibuoti vientiso auglio augimą ir neovaskuliarizacijąm vivo.

Atitinkamai, išradimo įgyvendinimai pateikia izoliuotus antikūnus, arba tokių antikūnų fragmentus, kurie rišasi su MCP-1. Kaip žinoma, antikūnai gali būti palankūs, t.y. monokloniniai, chimeriniai ir/arba žmogaus antikūnai. Išradimo įgyvendinimai taip pat pateikia ląsteles šių antikūnų gavimui.

Kai kuriuose įgyvendinimuose, čia aprašyti antikūnai turi gydomąjį naudingimą. Anti-MCP-1 antikūnas gali potencialiai blokuoti arba riboti apimtį auglio neovaskuliarizacijos ir auglio augimo. Daugelis vėžio lčstelią įskaitant ląsteles iš glioblastomų ir inkstų vėžio, ekspresuoja MCP-1 ir CCR2 receptorius. Bendra ligando ir receptoriaus ekspresija toje pačioje auglio ląstelėje rodo, kad MCP-1 gali reguliuoti autokrininę augimo kilpą vėžio ląstelėse, kurios ekspresuoja abu komponentus. Huang ir kt. (Cancer Res. (2002) 62:2806-2812) neseniai paskelbė, kad MCP-1 gali tiesiogiai įtakoti auglio ląstelią kurios ekspresuoja MCP-1 receptorių CCR2, augimą ir išgyvenimą. Taigi, dar prie jo efekto į angiogenezę, MCP-1 gali taip pat tiesiogiai reguliuoti auglio ląstelių augimą migraciją ir invaziją.

Be to, išradimo įgyvendinimai pateikia naudojimui šiuos antikūnus ligų diagnozavimo ir gydymo naudojimui. Pavyzdžiui, išradimo įgyvendinimai pateikia būdus ir antikūnus MCP-1 ekspresijos inhibavimui, susijusius su augliais ir uždegiminėmis būklėmis. Geriau, antikūnai yra naudojami gydymui vėžio, tokio kaip krūties, kiaušidžių, skrandžio, endometriumo, seilių liauką plaučią inkstą gaubtinės žarnos, tiesiosios žarnos, skydliaukės, kepeną prostatos ir šlapimo pūslės vėžio, o taip pat ir kitų uždegiminių procesą įskaitant taip pat be apribojimą reumatoidinį artritą glomerulonefritą aterosklerozę, psoriazę, organų transplantus, restenozę ir autoimunines ligas. Kartu su tokiu gydymu gamybos priemonės, apimančios išradime aprašytus antikūnus, pateikiamos. Be to, bandymo rinkinys, apimantis antikūnus, aprašytus išradime yra pateikiamas auglių arba uždegiminių būklių tikrinimui.

Be to, čia aprašytos nukleino rūgštys, ir jų fragmentai, ir variantai, gali būti naudojami, kaip neribojantys pavyzdžiai, (a) valdymui biosintezės atitinkamų užkoduotų baltymų, polipeptidą fragmentų ir variantų, kaip rekombinantinių arba heterologinių genų produktų, (b) kaip pavyzdžiai nustatymui ir kvantifikavimui čia aprašytų nukleino rūgščių, (c) kaip sekų matricos antiprasmių molekulių gavimui, ir panašiai. Toks panaudojimas pilniau aprašytas sekančiame atskleidime.

Dar, čia aprašyti baltymai ir polipeptidai, jų fragmentai ir variantai gali būti naudojami būduose, kurie apima (a) atstovavimą imunogeno, skatinančio anti-MCP-1 antikūno gamybą (b) sugavimą antigeno imunologiniame bandinyje taip, kaip antikūnas, (c) kaip taikinys atrinkimui medžiagos, kuri jungiasi su MCP-1 polipeptidu, aprašytu čia, (d) kaip taikinys MCP-1 specifiniams antikūnams, taip kad elgesio su antikūnu poveikyje molekulinės ir/arba ląstelės funkcijos kinta pagal taikinį.

Stipraus efekto į ląstelių augimo moduliavimą požiūriu, MCP-1 polipeptido ekspresijos arba aktyvumo sumažėjimas gali būti naudojamas ląstelių išgyvenimo skatinimui. Priešingai, MCP-1 polipeptido ekspresijos sumažėjimas gali būti naudojamas ląstelių mirties paskatinimui.

Smulkiau įgyvendinimai, ypatybės ir kita, kas liečia šio išradimo antikūnus yra pateikiama papildomose detalėse žemiau.

Sunkiosios ir lengvosios grandinių kintamų sričių nukleotidų ir aminorūgščių sekos tipinio žmogaus anti-MCP-1 antikūno pateiktos sekų sąraše, kurio turinys susumuotas 1 lentelėje žemiau.

lentelė

mAblD Nr.	Seka	SEQ ID Nr.
1.1.1	Nukleotidų seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	1
Aminorūgščių seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	2
Nukleotidų seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	3
Aminorūgščių seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	4
1.10.1	Nukleotidų seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	5
Aminorūgščių seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	6
Nukleotidų seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	7
Aminorūgščių seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	8
1.12.1	Nukleotidų seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	9
Aminorūgščių seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	10
Nukleotidų seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	11
Aminorūgščių seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	12
1.13.1	Nukleotidų seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	13
Aminorūgščių seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	14
Nukleotidų seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	15
Aminorūgščių seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	16
1.18.1	Nukleotidų seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	17
Aminorūgščių seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	18
Nukleotidų seka. koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	19
Aminorūgščių seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	20
1.2.1	Nukleotidų seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	21
Aminorūgščių seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	22
Nukleotidų seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	23

	Aminorūgščių seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	24
1.3.1	Nukleotidų seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	25
Aminorūgščių seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	26
Nukleotidų seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	27
Aminorūgščių seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	28
1.5.1	Nukleotidų seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	29
Aminorūgščių seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	30
Nukleotidų seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	31
Aminorūgščių seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	32
1.6.1	Nukleotidų seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	33
Aminorūgščių seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	34
Nukleotidų seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	35
Aminorūgščių seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	36
1.7.1	Nukleotidų seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	37
Aminorūgščių seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	38
Nukleotidų seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	39
Aminorūgščių seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	40
1.8.1	Nukleotidų seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	41
Aminorūgščių seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	42
Nukleotidų seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	43
Aminorūgščių seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	44
1.9.1	Nukleotidų seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	45
Aminorūgščių seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	46
Nukleotidų seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	47
Aminorūgščių seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	48
2.3.1	Nukleotidų seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	49
Aminorūgščių seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	50
Nukleotidų seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	51
Aminorūgščių seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	52
2.4.1	Nukleotidų seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	53
Aminorūgščių seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	54
Nukleotidų seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	55
Aminorūgščių seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	56
3.10.1	Nukleotidų seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	57
Aminorūgščių seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	58
Nukleotidų seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	59
Aminorūgščių seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	60
3.11.1	Nukleotidų seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	61
Aminorūgščių seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	62
Nukleotidų seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	63
Aminorūgščių seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	64
3.15.1	Nukteotidų seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	65
Aminorūgščių seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	66
Nukleotidų seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	67
Aminorūgščių seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	68
3.16.1	Nukleotidų seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	69
Aminorūgščių seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	70
Nukleotidų seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	71
Aminorūgščių seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	72
3.2	Nukleotidų seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	73
Aminorūgščių seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	74
Nukleotidų seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	75
Aminorūgščių seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	76
	Nukleotidų seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	77
Aminorūgščių seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	78

II

3.4.1	Nukleotidų seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	79
Aminorūgščių seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	80
3.5.1	Nukleotidų seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	81
Aminorūgščių seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	82
Nukleotidų seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	83
Aminorūgščių seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	84
3.6.1	Nukleotidų seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	85
Aminorūgščių seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	86
Nukleotidų seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	87
Aminorūgščių seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	88
3.7.1	Nukleotidų seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	89
Aminorūgščių seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	90
Nukleotidų seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	91
Aminorūgščių seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	92
3.9	Nukleotidų seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	93
Aminorūgščių seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	94
Nukleotidų seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	95
Aminorūgščių seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	96
4.4	Nukleotidų seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	97
Aminorūgščių seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	98
Nukleotidų seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	99
Aminorūgščių seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	100
4.5.1	Nukleotidų seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	101
Aminorūgščių seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	102
Nukleotidų seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	103
Aminorūgščių seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	104
4.6.1	Nukleotidų seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	105
Aminorūgščių seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	106
Nukleotidų seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	107
Aminorūgščių seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	108
4.7.1	Nukleotidų seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	109
Aminorūgščių seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	110
Nukleotidų seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	111
Aminorūgščių seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	112
5.3.1	Nukleotidų seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	113
Aminorūgščių seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	114
Nukleotidų seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	115
Aminorūgščių seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	116
3.1	Nukleotidų seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	117
Aminorūgščių seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	118
Nukleotidų seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	119
Aminorūgščių seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	120
1.11.1	Nukleotidų seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	121
Aminorūgščių seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	122
Nukleotidų seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	123
Aminorūgščių seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	124
1.14.1	Nukleotidų seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	125
Aminorūgščių seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	126
Nukleotidų seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	127
Aminorūgščių seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	128
1.4.1	Nukleotidų seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	129
Aminorūgščių seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	130
Nukleotidų seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	131
Aminorūgščių seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	132
	Nukleotidų seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	133

3.14.1	Nukleotidų seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	133
Aminorūgščių seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	134
Nukleotidų seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	135
Aminorūgščių seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	136
3.8	Nukleotidų seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	137
Aminorūgščių seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	138
Nukleotidų seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	139
Aminorūgščių seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	140
4.8.1	Nukleotidų seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	141
Aminorūgščių seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	142
Nukleotidų seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	143
Aminorūgščių seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	144
5.1	Nukleotidų seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	145
Aminorūgščių seka, koduojanti sunkiosios grandinės kintamą sritį	146
Nukleotidų seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	147
Aminorūgščių seka, koduojanti lengvosios grandinės kintamą sritį	148

Apibrėžimai

Jeigu kitaip neapibūdinta, moksliniai ir techniniai terminai, naudojami sąryšyje su čia aprašytu išradimu, turi tokias reikšmes, kokios įprastai suprantamos kaip tokios, kaip įprasta toje srityje. Be to, jeigu kitaip nereikalaujama pagal kontekstą vienaskaitos terminai turėtų apimti daugiskaitas ir daugiskaitos terminai turėtų apimti vienaskaitą. Iš esmės, terminologija ir metodai naudojami ląstelių ir audinių kultūrą molekulinės biologijos ir baltymų ir oligoarba polinukleotidų chemijos ir hibridizacijos aprašyti čia yra gerai žinomi ir dažnai naudojami eksperimentuose. Standartinės technikos naudojamos rekombinantinei DNR, oligonukleotidų sintezei ir audinių kultūroms ir transformacijai (pvz.. elektroporacija, lipofekcija). Fermentinės reakcijos ir gryninimo metodai yra atliekami pagal gamintojų instrukcijas arba kaip bendrai eksperimentuose, arba kaip aprašyta čia. Aukščiau pateiktos metodikos ir procedūros dažniausiai atliekamos įprastiniais metodais, gerai žinomais toje srityje ir kaip aprašyta daugelyje pagrindinių ir labiau specifinių pranešimą kurie yra cituojami ir aptariami šioje paraiškoje. Žiūr. pvz. Sambrook ir kt., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989). Analizinės chemijos, organinės chemijos sintezės, medicininės ir farmacinės chemijos naudojamos terminologijos bei laboratorinės procedūros ir metodikos aprašytos čia yra gerai žinomos irdažnai naudojamos praktikoje. Cheminei sintezei, cheminei analizei, farmaciniams preparatams, kompozicijoms ir tiekimui, ir pacientų gydymui naudojamos standartinės metodikos.

Jeigu naudojama sutinkamai su įgyvendinimais, pateiktais čia, sekantys terminai, jeigu nenurodyta kitaip, turėtų būti suprantami, kaip turintys sekančias reikšmes:

Terminas „izoliuotas polinukleotidas“ jeigu naudojamas čia, turėtų reikšti, turėtų reikšti polinukleotidą genominės, cDNR, arba sintetinės kilmės, arba tam tikrą jų derinį, kuris dėka jo kilmės „izoliuotas polinukleotidas“ (1) nėra susijęs su visais arba dalimi polinukleotidų, kuriuose „izoliuotas polinukleotidas“ yra rastas gamtoje, (2) yra funkciškai susijęs su polinukleotidų, kuris nesusijęs su gamtoje, arba (3) arba neturi pasitaikyti gamtoje kaip dalis didesnės sekos.

Termias „izoliuotas baltymas“ minimas čia reiškia cDNR, rekombinantinės RNR baltymą, arba sintetinės kilmės, arba jų derinį, kuris dėka jo kilmės, arba gavimo šaltinio, „izoliuotas baltymas“ (1) yra nesusijęs su baltymais, randamais gamtoje, (2) yra neturi kitų to paties šaltinio baltymų, t.y. neturi pelių baltymų, (3) yra ekspresuojamas skirtingų rūšių ląstelėse, arba (4) nepasitaiko gamtoje.

Terminas „polipeptidas“ naudojamas čia kaip bendras terminas, nurodyti gamtinį baltymą, fragmentą, arba polipeptidinės sekos analogą. Vadinasi, gamtinis baltymas, fragmentas ir analogas yra polipeptido genties rūšys. Pageidautini polipeptidai, sutinkamai su išradimu, apima žmogaus imunoglobulino molekulės sunkiąją grandinę ir žmogaus imunoglobulino molekulės kappa lengvąją grandinę, kaip ir susiformavę antikūno molekulės, apimančios imunoglobulino molekulės sunkiąją grandinę su imunoglobulino molekulės lengvąja grandine, tokia kaip imunoglobulino molekulės kappa lengvoji grandinė, ir atvirkščiai, taip pat kaip ir jų fragmentus ir analogus.

Terminas „natūraliai pasitaikantis“ taip naudojamas čia, kaip pritaikytas objektui, remiantis tuo faktu, kad objektas gali būti randamas gamtoje. Pavyzdžiui, polipeptidų arba polinukleotidų sekos, esančios organizme (įskaitant virusus), kurie gali būti išskirti iš gamtinio šaltinio ir kurie gali būti apgalvotai modifikuoti laboratoriniu būdu arba kitaip, yra natūraliai pasitaikantys.

Terminas „funkciškai susijęs” taip naudojamas čia nurodo komponentų padėtis taip aprašytas, kad jų sąryšis leidžia jiems funkcionuoti jų numatytu būdu. Kontrolinė seka „funkciškai susijusi” su koduojančia seka liguojama tokiu būdu, kad koduojamos sekos ekspresija pasiekiama suderintai su kontrolinėmis sekomis.

Terminas „kontrolinė seka” taip naudojamas čia nurodo polipeptidų sekas, kurios yra reikalingos paveikti ekspresiją ir brendimą koduojančių sekų, su kuriomis jos yra suliguotos. Tokių kontrolinių sekų esmė skiriasi priklausomai nuo šeimininko organizmo; prokariotuose tokios kontrolinės sekos dažniausiai apima promotorių ir transkripcijos terminacijos seką. Terminas „kontrolinės sekos“ yra skirtas apimti, mažiausiai, visus komponentus, kurių buvimas yra būtinas ekspresijai ir brendimui ir taip pat gali apimti papildomus komponentus, kurių buvimas naudingas, pavyzdžiui, vedančioms sekoms ir susiliejančioms partnerių sekoms.

Terminas „polinukleotidas“, kaip nurodoma čia, reiškia mažiausiai 10 bazių ilgio nukleotido polimerinė forma, arba ribonukleotido, arba dezoksinukleotido, arba modifikuotos formos bet kurio tipo nukletido. Terminas apima viengrandę ir dvigrandę DNR formas.

Terminas „oligonukleotidas“, kaip nurodoma čia, apima natūraliai pasitaikančius ir modifikuotus nukleotidus, prijungtus kartu prie natūraliai pasitaikančių, ir ne natūraliai pasitaikančių oligonukleotidų jungtis. Oligonukleotidai yra polinukleotidų poaibis dažniausiai apimantis 200 bazių ilgį arba mažesnį. Geriau oligonukleotidai yra nuo 10 iki 60 bazių ilgio ir geriausiai 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 arba 20-40 bazių ilgio. Oligonukleotidai dažnai yra viengrandžiai, t.y. zondams; nors oligonukleotidai gali būti dvigrandžiai, t.y. naudojami genų mutantų konstravimui. Išradimo nukleotidai taip pat gali būti prasminiai ir antiprasmiai.

Terminas „natūraliai pasitaikantys oligonukleotidai“, kaip nurodoma čia, apima dezoksiribonukleotidus ir ribonukleotidus. Terminas „modifikuoti nukleotidai“, kaip nurodoma čia, apima nukleotidus su modifikuotomis arba pakeistomis cukraus grupėmis ir panašius. Terminas „oligonukleotidų sujungimas“, nurodytas čia, apima nukleotidų jungtis, tokias kaip fosforo tioatas, fosforo ditioatas, fosforo selenoatas, fosforo diselenoatas, fosforo anilotioatas, fosforo aniladatas, fosforo amidatas, ir panašias. Žiūr. pvz LaPlance ir kt., Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec ir kt., J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein ir kt., Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon ir kt., Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon ir kt., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec ir kt., U.S. Patent No. 5,151,510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990). Oligonukleotidas gali turėti, jeigu reikalinga, žymę detekcijai.

Terminas „selektyviai hibridizuotis“, kaip nurodoma čia, reiškia aptinkamai ir specifiškai surišti. Polinukleotidai, oligonukleotidai ir jų fragmentai, sutinkamai su išradimu, pasirinktinai hibridizuojasi su nukleino rūgščių grandinėmis, esant hibridizacijos ir gryninimo sąlygoms, kurios minimizuoja apčiuopiamus kiekius nustatomų prisijungusių nespecifinių nukleino rūgščių. Gali būti naudojamos aukšto griežtumo sąlygos, siekiant selektyvios hibridizacijos sąlygų, kurios žinomos šiuolaikiniame eksperimentiniame lygyje, aptariamame čia. Apskritai, nukleino rūgščių sekų homologija tarp išradimo polinukleotidą oligonukleotidų ir fragmentų ir dominančių nukleino rūgščių sekų turėtų būti mažiausiai 80 %, ir mažiau tipiškai su pageidaujamu homologijos didėjimu mažiausiai iki 85 %, 90 %, 95 %, 99 % ir 100 %. Dvi aminorūgščių sekos yra homologiškos, jeigu yra dalinis arba pilnas identiškumas tarp jų sekų. Pavyzdžiui. 85 % homologija reiškia, kad 85 % aminorūgščių yra , LT 5416 B identiškos, jeigu dvi sekos yra sulyginamos maksimaliai sutapatinant. Tarpai (kiekvienoje iš dviejų sekų, kurios buvo sutapatinamos) leistini maksimaliai sutapatinant: tarpų ilgiai 5 arba mažiau yra pageidautini su 2 arba mažiau yra labiau pageidautini. Antraip ir geriau, dvi baltymų sekos (arba polipeptidų sekos, gautos iš jų, mažiausiai 30 aminorūgščių ilgio) yra homologinės, kaip šis terminas vartojamas čia, jeigu jos turi sulyginimo apimtį 5 arba daugiau (standartiniais nuokrypio vienetais), naudojant programą ALIGN su mutacijos duomenų matrica ir tarpo paklaida 6 arba didesne. Žiūr. M.O. Dayhoff, Atlas of Protein Seųuence and Structure, Vol. 5, 101-110 ir 2 papildymas t. 5, 1-10 (NATIONAL Biomedical Research Foundation 1972). Dvi sekos arba jų dalis yra daugiau tikėtina homologiškos, jeigu jų aminorūgštys yra daugiau, negu arba lygiai 50 % identiškos, jeigu optimaliai sulyginta naudojant ALIGN programą. Terminas „atitinka”, kaip naudojamas čia, reiškia, kad polipeptido seka yra homologinė (t.y. yra identiška, ne griežtai evoliuciškai susijusi) su visa arba dalimi minėtos polinukleotidų sekos, arba kad polipeptidų seka yra identiška minėtai polipeptidų sekai. Priešingai, terminas „komplementari”, kaip naudojamas čia, reiškia, kad komplementari seka yra homologinė visai arba daliai minėtos polinukleotidų sekos. Pavyzdžiui, nukleotidų seka „TATAC” atitinka minėtai sekai „TATAC” ir komplementari sekai „GTATA”.

Sekantys terminai, kurie yra naudojami aprašyti sekų sąryšį (giminingumą) tarp dviejų arba daugiau polinukleotidų arba aminorūgšties sekų: „kontrolinė seka”, „sulyginimo langas”, „sekos identiškumas”, „procentinis sekos identiškumas” ir „esminis identiškumas”. Terminu „kontrolinė seka” apibrėžiama seka, naudojama kaip pagrindas sekų palyginimui; nurodytoji seka gali būti didesnės sekos subpopuliacija, pavyzdžiui, kaip segmentas pilno ilgio cDNR arba geno sekos, duotos sekų sąraše, arba gali apimti visą cDNR arba geno seką. Paprastai, kontrolinė seka yra mažiausiai 18 nukleotidų arba 6 aminorūgščių ilgio, dažnai 24 nukleotidų arba 8 aminorūgščių ilgio. Kadangi dvi polinukleotidų arba aminorūgščių sekos gali kiekviena (1) apimti seką (t.y. dalį pilnos polinukleotidų arba aminorūgščių sekos), kuri yra panaši tarp dviejų molekulių, ir (2) gali toliau apimti seką, kuri yra skirtinga tarp dviejų polinukleotidų ir aminorūgščių sekų, sekų palyginimas tarp dviejų (arba daugiau) molekulių yra tipiškai atliekamas palyginant dviejų molekulių sekas per „sulyginimo langą“, kad būtų nustatomos ir palyginamos sekų panašumo lokalinės sritys. Terminas „sulyginimo langas“, kaip naudojama čia, nurodo į konceptualų segmentą mažiausiai 18 gretimų nukleotidų padėčių arba 6 aminorūgščių, kuriose polinukleotidų seka arba aminorūgščių seka gali būti palyginta su mažiausiai 18 gretimų nukleotidų arba 6 aminorūgščių kontroline seka ir kurioje dalis polinukleotidų sekos sulyginimo lange gali apimti papildymus, delecijas, pakeitimus ir panašiai (t.y. trūkius) 20 % arba mažiau, palyginus su kontroline seka (kuri negali turėti papildymų ir delecijų), norint optimaliai palyginti dvi sekas. Optimalus sekų sugretinimas, sugretinant sulyginimo langą gali būti atliekamas naudojant lokalinės homologijos algoritmą Smith ir Wterman, Adv. APPL. Math. 2:482 (1981), naudojant homologijos sugretinimo algoritmą Needleman ir Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pagal atrankos pagal panašumą metodą Pearson ir Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444 (1988), pagal kompiuterinį šių algoritmų įgyvendinimą (GAP, BESTFIT, FASTA ir TFASTA Wisconsino genetikos programinės įrangos paketo versija 7.0, (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.) Geneworks, arba MacVector programinės įrangos paketai), arba tikrinant ir parenkant sukurtus įvairiais metodais geriausius sugretinimus (t.y. gaunant aukščiausią homologijos procentą iš sulyginimo lango).

Terminas „sekos identiškumas“ reiškia, kad dvi polinukleotidų arba aminorūgščių sekos yra identiškos (t.y. nukleotidas prie nukleotido arba grupė prie grupės pagrindu) pagal sulyginimo langą. Terminas „sekos identiškumo procentas“ yra išskaičiuotas palyginant dvi optimaliai sugretintas sekas pagal sulyginimo langą, nustatant padėčių skaičių, kuriose pasitaiko identiškos nukleino rūgščių bazės (t.y. A, T, C, G, U arba I) arba grupės abiejose sekose, duodančio skaičių suporintų padėčių, dalinant suporintų padėčių skaičių iš bendro padėčių skaičiaus sulyginimo lange (t.y. lango dydžio)., ir dalinant rezultatą iš 100, kad gautume sekos identiškumo procentą. Terminas „esminis identiškumas“ kaip naudojamas čia reiškia polinukleotidų arba aminorūgščių sekos charakteristiką, kur polinukleotidų arba aminorūgščių seka apima seką, kuri turi mažiausiai 85 procentus sekos identiškumą, geriau mažiausiai 90-95 procentus sekos identiškumą, dažniau mažiausiai 99 procentus sekos identiškumą, palyginus su kontroline seka virš sulyginimo lango mažiausiai 18 nukleotidų (6 aminorūgštys) padėčių, dažnai virš lango mažiausiai 24-48 nukleotidai (8-16 aminorūgščių) padėčių, kuriose sekų procentingumo identiškumas apskaičiuojamas palyginantkontrolinę seką su seka, kuri gali turėti delecijas arba pridėjimus, kurie gali būti sumoje 20 % arba mažiau virš kontrolinės sekos sulyginimo lango. Kontrolinė seka gali būti didelės sekos subpopuliacija.

Kaip naudojama čia, dvidešimt tradicinių aminorūgščių ir jų sutrumpinimų yra įprastai vartojami. Žiūr. Immunology-A Synthesis (2nd ed., Goub E.S. and Gren D.R. eds., Sinauer Associates, Sundrland, Mass. 1991). Dvidešimties tradicinių aminorūgščių stereoizomerai (t.y. D-aminorūgštys), dirbtinės aminorūgštys tokios kaip α-, α-dipakeistos aminorūgštys, Nalkilaminorūgštys, pieno rūgštis ir kitos netradicinės aminorūgštys taip pat gali būti išradime aprašytų polipeptidu tinkami komponentai. Netradicinių aminorūgščių pavyzdžiai apima : 4hidroksiproliną, γ-karboksiglutamatą. ε-Ν,Ν,Ν-trimetilsilaną. ε-Ν-acetilsilaną. O-fosfoseriną, N-acetilseriną, N-formilmetioniną, 3-metilhistidiną, σ-Ν-metilargininą ir kitas panašias aminorūgštis ir imino rūgštis (t.y. hidroksiproliną). Polipeptidų žymėjime, naudojamame Čia, kairinė kryptis yra amino-galinė kryptis ir dešininė kryptis yra karboksi-galinė kryptis, sutinkamai su standartiniu naudojimu ir įsigalėjusia tvarka.

Panašiai, išskyrus apibrėžtus kitaip, kairinis viengrandės polinukleotido sekos galas yra 5‘ galas ; kairinė dvigrandės polinukleotido sekos kryptis yra vadinama 5‘ kryptimi. Kryptimi nuo 5‘ į 3‘ atsirandančio RNR transkripto papildymas yra vadinamas transkripcijos kryptimi; sekos sritys DNR grandinėje, turinčios tą pačią seką kaip RNR ir kurios yra 5‘ į 5‘ RNR transkripto galą yra vadinamos „upstream sekomis“; DNR grandinės sekų sritys, turinčios tą pačią seką kaip RNR, ir kurios yra 3‘ į 3‘RNR transkripto galą yra vadinamos „downstream sekomis“.

Kaip taikoma polipeptidams, terminas „esminis identiškumas“ reiškia, kad dvi peptidų sekos, jeigu optimaliai išlygintos, kaip antai programomis GAP arba BESTFIT, naudojant numatytas trūkių mases, patiria mažiausiai 80 procentų sekos identiškumą geriau bent jau 90 procentų sekos identiškumą dar geriau bent jau 95 procentus sekos identiškumą ir geriausiai bent 99 procentus sekos identiškumą. Geriau, grupių padėtys, kurios yra ne identiškos, skiriasi konservatyvių aminorūgščių pakeitimais. Konservatyvių aminorūgščių pakeitimai rodo į sukeistinimą grupių, turinčių tokias pat šonines grandines. Pavyzdžiui, grupė aminorūgščių, turinti alifatines-hidroksilines šonines grandines yra glicinas, alaninas, valinas, leucinas ir izoleucinas; grupė aminorūgščių, turinti amidą turinčias šonines grandines yra asparaginas ir glutaminas; grupė aminorūgščių, turinti aromatines šonines grandines yra fenilalaninas, tirozinas ir triptofanas; grupė aminorūgščių, turinti sierą turinčias šonines grandines yra cisteinas ir metioninas. Tinkamesnės konservatyvios aminorūgščių pakaitų grupės yra: valinas-leucinas-izoleucinas, fenilalaninas-tirozinas, lizinas-argininas, alaninas-valinas, glutamino rūgštis-asparagino rūgštis ir asparaginas-glutaminas.

Kaip aptariama čia, mažos variacijos antikūnų arba imunoglobulinų aminorūgščių sekose yra manoma yra apimtos čia aprašyto išradimo, numatant, kad variacijos aminorūgščių sekoje apima mažiausiai 75 %, dar geriau mažiausiai 80 %, 90 %, 95 % ir geriausiai 99 %. Ypatingai, turima galvoje konservatyvių aminorūgščių pakeitimai. Konservatyvūs pakeitimai yra tokie, kurie vyksta aminorūgščių, susijusių šoninėmis grandinėmis, šeimoje. Genetiškai užkoduotos aminorūgštys yra paprastai dalinamos į šeimas: (1) rūgštinės=aspartatai, glutamatai; (2) bazinės=lizinas, argininas, histidinas; (3) nepolinėsalaninas, valinas, leucinas, izoleucinas, prolinas, fenilalaninas, metioninas, triptofanas; ir (4) nepakeičiamos polinės=glicinas, asparaginas, glutaminas, cisteinas, serinas, treoninas, tirozinas. Labiau rekomenduojamos šeimos yra: serinas ir treoninas yra alifatinė-hidroksi šeima; asparaginas ir glutaminas yra amidą turinti šeima; alaninas, valinas, leucinas ir izoleucinas yra alifatinė šeima; fenilalaninas, tirozinas ir triptofanas yra aromatinė šeima. Pavyzdžiui, yra pagrįsta tikėtis, kad izoliuotas pakeitimas leucino izoleucinu arba valinu, asparagino rūgšties glutamino rūgštimi arba treonino serinu, arba panašaus pakeitimo amino rūgšties panašia pagal struktūrą aminorūgštimi neturėtų turėti didesnio efekto gaunamos molekulės susirišimui arba savybėms, ypatingai, jeigu pakeitimas neliečia aminorūgšties struktūrinėje srityje. Ar aminorūgšties pakeitimas turi įtakos funkciniam peptidui, galima lengvai nustatyti, ištiriant polipeptido darinio specifinį aktyvumą. Bandymai smulkiai aprašyti čia. Antikūno fragmentai arba analogai arba imunoglobulino molekulės gali būti lengvai paruošti pagal šiuolaikinį technikos lygį. Pageidautini fragmentų arba analogų amino ir karboksi galai yra arti funkcinių domenų ribos. Struktūriniai ir funkciniai domenai gali būti identifikuoti palyginant nukleotidų ir/arba aminorūgščių sekų duomenis su viešomis arba patentuotomis sekų duomenų bazėmis. Geriausiai, naudojami kompiuterizuoti palyginimo metodai identifikavimui sekų motyvų arba numatytų baltymų konformacinių domeną kurie pasitaiko kituose baltymuose su žinoma struktūra ir/arba funkcija. Yra žinomi identifikavimo būdai baltymų seką kurios susidėsto į žinomą trimatę struktūrą. Bowie ir kt., Science 253:164 (1991). Taigi, anksčiau minėti pavyzdžiai demonstruoja, kad specialistas gali atpažinti sekų motyvus ir struktūrines konformacijas, kurios gali būti naudojamos apibrėžti struktūriniams ir funkciniams domenams pagal šį išradimą.

Pageidautini aminorūgščių pakeitimai yra tokie, kurie: (1) sumažina jautrumą proteolizei, (2) sumažina polinkį oksidacijai, (3) keičia prisirišimo giminingumą formuojant baltymų kompleksus, (4) keičia prisirišimo giminingumą ir (4) suteikia arba modifikuoja tokių analogų kitas fizikochemines arba funkcines savybes. Analogai gali apimti įvairius seką išskyrus gamtoje pasitaikančių peptidų seką mutantus. Pavyzdžiui, vienetiniai arba daugeriopi aminorūgščių pakeitimai (geriau konservatyvių amino rūgščių pakeitimai) gali būti atlikti natūraliai pasitaikančiose sekose (geriau išorinėje domeno(ų) polipeptido dalyje, formuojančioje tarpmolekulinius ryšius). Konservatyvių aminorūgščių pakeitimas gali neesminiai pakeisti motininės sekos charakteristikas (pvz., aminorūgščių pakeitimas neturi polinkio pertraukti spiralės, kuri pasitaiko motininėje sekoje, arba suardyti kitus antrinės struktūros tipus, kurie charakterizuoja motininę seką). Polipeptidu antrinės ir tretinės struktūros atpažinimo būdo pavyzdžiai yra aprašyti: Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton ed., W.H.Freeman and Company, New York 1984); Introduction to Protein Structure (Branden C. and Tooze J. eds., Garland Publishing, New York, N.Y. 1991); ir Thomton ir kt., Nature 354:105 (1991).

Terminas “polipeptido fragmentas“, kaip naudojamas čia, nurodo polipeptidą kuris turi amino-galinę ir/arba karboksi-galinę delecijas, bet likusi aminorūgščių seka, manomai, yra i9 LT 5416 B identiška atitinkamoms padėtims natūraliai pasitaikančioje sekoje, pavyzdžiui, iš pilno ilgio cDNR sekos. Fragmentai tipiškai yra mažiausiai 5, 6, 8 arba 10 aminorūgščių ilgio, geriau mažiausiai 14 aminorūgščių ilgio, žymiai geriau 20 aminorūgščių ilgio, paprastai mažiausiai 50 aminorūgščių ilgio, ir netgi geriausiai bent jau 70 aminorūgščių ilgio. Terminas „analogas“, kaip naudojamas čia, nurodo polipeptidus, kurie yra apimti mažiausiai 25 aminorūgščių, turinčių esminį identiškumą daliai nustatytos aminorūgščių sekos, fragmento ir kuris turi mažiausiai vieną iš sekančių savybių: (1) specifiškai rišasi su MCP-1, esant atitinkamoms prisirišimo sąlygoms, (2) sugebėjimą blokuoti tam tikrą MCP-1 prisirišimą arba (3) sugebėjimą inhibuoti MCP-1 ekspresuojančių ląstelių augimą in vitro arba in vivo. Tipiškai polipeptidų analogai apima konservatyvių aminorūgščių pakeitimą (arba pridėjimą arba deleciją) dėl natūraliai pasitaikančių sekų. Analogai tipiškai yra mažiausiai aminorūgščių ilgio, geriau mažiausiai 50 aminorūgščių ilgio arba ilgesni, ir dažnai gali būti tokio ilgio, kaip pilno ilgio natūraliai pasitaikantys polipeptidai.

Peptidų analogai dažnai naudojami farmacinėje pramonėje, kaip nepeptidiniai vaistai su savybėmis analogiškomis šabloniniam peptidui. Šie tipai nepeptidinių junginių yra vadinami „peptidų mimetikai“ arba „peptidomimetikai“. Fauchere J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber ir Freidinger, TINS p. 392 (1985); ir Evans ir kt., J. Med. Chem. 30:1229 (1987). Tokie junginiai dažnai gaunami kompiuterinio molekulių modeliavimo pagalba. Peptidų mimetikai, kurie yra struktūriškai panašūs į terapijoje naudojamus peptidus, gali būti naudojami ekvivalentiško terapinio arba profilaktinio efekto gavimui. Apskritai,: peptidomimetikai struktūriškai yra panašūs į pavyzdžio polipeptidus (t.y. polipeptidai, kurie turi biochemines savybes arba farmakologinį aktyvumą), tokie, kaip žmogaus antikūnai, bet turi vieną arba daugiau peptidinių jungčių, pasirinktinai pakeistų jungtimis, parinktomis iš grupės, susidedančiomis iš: -CH2NH-, -CH₂S-, -CH₂CH₂-, -CH=CH-(cis ir trans), -COCH₂-, -CH(OH)CH₂- ir -CH₂SO-, taikant įprastinius metodus. Vienos arba daugiau rūgščių sisteminiai pakeitimai pastovioje sekoje to paties tipo D-aminorūgštimi (t.y. D-lizinas vietoje L-lizino) gali būti naudojami siekiant sukurti stabilesnius peptidus. Be to, sukonstruoti peptidai, apimantys pastovias sritis, arba iš esmės identiškas pastoviųjų sričių variacijas, gali būti gauti gerai žinomais metodais (Rizo ir Gierasch ann. Rev. Biochem. 61:387(1992)); pavyzdžiui, pridedant vidines cisteino liekanas, galinčias formuoti vidinius molekulės disulfidinius tiltelius, kurie ciklizuoja peptidą.

„Antikūnas“ arba „antikūno peptidas(ai)“ nurodo į sveiką antikūną arba jo surišantį fragmentą, kuris konkuruoja su sveiku antikūnu dėl specifinio surišimo. Surišantys fragmentai gaunami rekombinantine DNR technika bei fermentiniu arba cheminiu sveiko antikūno skaldymu. Surišantys fragmentai apima Fab, Fab', Fįab'E, Fv ir viengrandžius antikūnus. Antikūnas, išskyrus „bispecifinį“ arba „bifunkcinį“ antikūną suprantamas turintis kiekvieną jį surišančių vietų identišką. Antikūnas iš esmės inhibuoja receptoriaus adhezijąsu priešingu receptoriumi, jeigu antikūno perteklius sumažina kiekį receptoriaus pririšto prie priešingo receptoriaus mažiausiai 20 %, 40 %, 60 % arba 80 % ir daugiau dažnai daugiau kaip 85 % (jeigu matuojama in vitro konkurencinio prisirišimo būdu).

Terminas „epitopas“ apima bet kurį baltymo determinantą sugebantį specifiškai prisirišti prie imunoglobulino arba T ląstelės receptoriaus. Epitopinis determinantas įprastai susideda iš chemiškai aktyvių paviršiaus molekulių grupuočių, tokių kaip aminorūgščių arba cukraus šoninės grandinės ir paprastai turi specifines trimates struktūrines charakteristikas, taip pat specifines krūvio charakteristikas. Antikūnas, kaip minėta yra specifiškai surištas su antigenu, jeigu disociacijos konstanta yra <1 pM, geriau <100nM ir geriausiai < lOnM.

Terminas „agentas“ naudojamas čia reiškia cheminį junginį, cheminių junginių mišinį, arba biologinę molekulę, arba ekstraktą, pagamintą iš biologinės medžiagos.

„Aktyvus“ arba „aktyvumas“ šio darbo tikslams nurodo MCP-1 polipeptido formą(as), kuri išlaiko biologinį ir/arba imunologinį aktyvumą gamtinio arba natūraliai pasitaikančio MCP-1 polipeptido, kurio „biologinis“ aktyvumas nurodo biologinę funkciją (arba inhibitorinę arba stimuliatorinę), sukeltą gamtinio arba natūraliai pasitaikančio MCP-1 polipeptido, išskyrus sugebėjimą indukuoti gamybą antikūno prieš antigeninį epitopą turintį gamtinį ar natūraliai pasitaikantį MCP-1 polipeptidą, ir „imunologinis“ aktyvumas nurodo sugebėjimą indukuoti gamybą antikūno prieš antigeninį epitopą turintį gamtinį ar natūraliai pasitaikantį MCP-1 polipeptidą.

„Gydymas“ nurodo ir terapinį gydymą ir profilaktines arba prevencines priemones, kurių tikslas yra sukliudyti arba sulėtinti (sumažinti) suplanuotas patologines sąlygas arba sutrikimus. Tokiu būdu reikalingumas gydyti apima kartu jau sutrikimą ir taip pat polinkį turėti sutrikimą arba tai, kad sutrikimui bus sutrukdyta.

„Žinduolis“ nurodo į bet kokį gyvūną klasifikuojamą kaip žinduolis, įskaitant žmogų, kitus primatus, tokius kaip beždžionės, šimpanzės ir gorilos, naminius ir ūkiniais tikslais auginamus gyvūnus, ir zoologijos soduose auginamus, sportinius, laboratorinius arba kambarinius gyvūnus, tokius kaip šunys, katės, galvijai, arkliai, avys, kiaulės, ožkos, triušiai, graužikai ir kt. Gydymo tikslais žinduoliai yra geriau žmonės.

„Nešiklis“, kaip naudojamas čia, apima farmaciškai priimtiną nešiklį, užpildą arba stabilizatorių, kuris yra netoksiškas ląstelei arba žinduoliui, veikiant tam tikromis naudojimo dozėmis ir koncentracijomis. Dažnai fiziologiškai priimtinas nešiklis yra vandeninis pH buferizuotas tirpalas. Fiziologiškai priimtino nešiklio pavyzdžiai apima tokius buferius, kaip fosfatus, citratus ir kt. organinių rūgščių; antioksidantus, įskaitant askorbino rūgštį; žemos

2' LT 5416 B molekulinės masės (mažiau kaip 10 liekanų) polipeptidus; baltymus, tokius kaip serumo albuminas, želatina arba imunoglobulinai; hidrofilinius polimerus, tokius kaip polivinilpirolidonas; aminorūgštis, tokias kaip glicinas, glutaminas, asparaginas, argininas arba lizinas; monosacharidus, disacharidus ir kitus karbohidratus, įskaitant gliukozę, manozę arba dekstrinus; chelatinius agentus, tokius kaip EDTA; sugar alcohols, tokius kaip manitolis arba sorbitolis; druskas formuojančius priešjonus (counterions), tokius kaip natris; ir/arba nejonines paviršinio aktyvumo medžiagas, tokias kaip TWEEN™, polietilenglikolis (PEG) ir PLURONICS™.

Antikūnų papaino skaidymas gamina du identiškus antigeno surišimo fragmentus, vadinamus „Fab“ fragmentais, kiekvienas su viena antigeną rišančia vieta ir likusiu „Fc“ fragmentu, skirtu atspindėti sugebėjimą lengvai kristalizuotis. Pepsino veikimas išskiria „F(ab')2“ fragmentą, kuris turi du antigeną jungiančias vietas ir net sugebančias kryžmiškai surišti antigeną.

„Fv“ yra mažiausias antikūno fragmentas, kuris turi antigeno atpažinimo ir antikūno prisirišimo vietą. Ši sritis susideda iš vieno sunkiosios ir vieno lengvosios grandinės kintamojo domeno dimero, susietų glaudžiai, nekovalentiškai. Tai yra šioje konfigūracijoje, kad kad kiekvieno kintamojo domero trys CDR sąveikauja, apibrėžiant ant VH-VL dimero paviršiaus antigeno prisirišimo vietą. Bendrai šešios CDR suteikia antigeno rišimosi su antikūnu specifiškumą.. Tačiau, pavyzdžiui, tik vienas kintamas domenas (t.y. Fv dimero VH arba VL dalis arba pusė Fv apimanti tik tris CDR specifines prieš antigeną) gali turėti sugebėjimą atpažinti ir prisirišti antigeną, netgi galimai su mažesniu giminingumu, negu visa prisirišimo vieta.

Fab fragmentas taip pat turi pastovų lengvosios grandinės domeną ir pirmą pastovų sunkiosios grandinės (CH1) domeną. Fab fragmentas skiriasi nuo Fab' fragmento keleto liekanų sunkiosios grandinės CH1 domeno karboksi gale pridėjimu, įskaitant vieną arba daugiau cisternų iš antikūno ašinės (hinge) srities. „Fįab’f“ antikūno fragmentas iš pradžių buvo pateiktas kaip Fab' fragmentų pora, kuri tarp savęs turi ašinius cisteinus. Taip pat žinomi ir kiti cheminiai antikūnų fragmentų susijungimai.

„Kieta fazė“ reiškia ne vandeninę matricą, prie kurios gali tvirtai laikytis čia aprašyti antikūnai. Kietos fazės pavyzdžiai apimti čia įskaito dalinai arba pilnai įgavusį formą stiklą (t.y. kontroliuojamas porėtas stiklas), polisacharidus (t.y. agarozę), poliakrilamidus, polistireną. polivinilo alkoholį ir silikoną. Kai kuriuose įgyvendinimuose, priklausomai nuo konteksto, kieta fazė gali apimti bandymo plokštelės šulinėlį, kituose tai yra valymo kolonėlė (t.y. afininės (giminingumo) chromatografijos kolonėlė). Šis terminas taip pat apima atskirų dalelių netolydžią kietą fazę, kaip tai aprašyta JAV patente Nr. 4,275,149.

Terminas „liposoma“ naudojamas čia pažymėti mažai vezikulei, susidedančiai iš įvairių tipų lipidų, fosfolipidų ir/arba paviršinių aktyvių medžiagų, kurios naudojamos gauti vaistams (tokiems, kaip MCP-1 polipeptidas ar antikūnas prie to) žinduoliams. Liposomų komponentai dažnai išsidėstę dvisluoksne struktūra, panašiai į lipidų išsidęstymą biologinėse membranose.

Terminas „maža molekulė“ čia naudojamas aprašyti molekulei su molekuline mase mažesne maždaug 500 daltonų.

Kaip naudojami čia, terminai „žymėti“ arba „žymėtas“ nurodo prijungimą susekamo žymens, t.y. prijungimą radioaktyvios aminorūgšties arba prijungimą biotinilintos grupės prie polipeptido, kuris gali būti nustatytas avidino žyme (pvz. streptavidiną turinti fluorescuojanti žymė arba fermentinis aktyvumas, kuris gali būti nustatytas optiniu arba kalorimetriniu metodais). Tam tikrose situacijose žymė gali būti gydomoji. Yra žinomi ir gali būti naudojami įvairūs polipeptidų ir glikoproteinų žymėjimo metodai. Polipeptidų žymėjimo pavyzdžiai apima, bet neapsiriboja, sekančius: radioizotopai arba radionuklidai (pvz. ³H, ¹⁴C, ¹⁵N, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ^1HIn, ¹²⁵I, ¹³¹I), fluorescentinės žymės (pvz. FITC, rodaminas, fosforo lantanoidas), fermentinės žymės (pvz. krienų peroksidaze, β-galaktozidazė, liuciferazė, šarminė fosfatazė), chemoliuminescuojančios, biotinilintos grupės, iš anksto numatyti polipeptidų epitopai atpažįstami pagal antrinius reporterius (pvz. leucino užtrauktukų porų sekos, antrinių antikūnų prisirišimo vietos, metalų prisirišimo domenai, epitopų kilpeles). Kai kuriuose įgyvendinimuose, žymės įra prijungtos per įvairaus ilgio tarpines grupes, kad būtų sumažinti galimi erdviniai trukdymai.

Terminas „farmacinis agentas arba vaistas“, kaip naudojamas čia, nurodo į cheminį junginį arba kompoziciją, sugenančią sukelti norimą gydomąjį efektą, jeigu teisingai paskirtas pacientui. Kiti cheminiai terminai čia naudojami pagal konvencinį naudojimą moksle, kaip patvirtinta pagal The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)).

Kaip naudojama čia, „iš esmės grynas“ reiškia, kad daikto rūšis yra dominuojanti rūšis (t.y. moliniu pagrindu yra gausiausia, negu bet kurios kitos individualios rūšys, esančios kompozicijoje), ir geriau iš esmės išgryninta frakcija yra kompozicija, kurioje objekto rūšis apima mažiausiai 50 procentų (moliniu pagrindu) visų esančių makromolekulių rūšių. Apskritai, iš esmės gryna kompozicija turi apimti daugiau kaip 80 procentų visų kompozicijoje esančių makromolekulių rūšių, geriau daugiau kaip 85 %, 90 %, 95 % ir 99 %. Geriausiai, objekto rūšis yra išvalyta iki esminio homogeniškumo (teršalo rūšis kompozicijoje neturi būti nustatoma įprastiniais nustatymo metodais), kur kompozicija susideda iš esmės iš vienos rūšies makromolekulių.

Terminas „pacientas“ apima žmogų ir veterinarinius subjektus.

Antikūno struktūra

Pagrindinis antikūno stuktūrinis vienetas žinoma apima tetramerą. Kiekvienas tetrameras susideda iš dviejų identiškų polipeptidinių grandinių porą kiekviena pora turi vieną „lengvąją“ (apie 25 kDa) ir vieną „sunkiąją“ grandinę (apie 50-70 kDa). Kiekvienos grandinės amino galinė dalis turi kintamąją sritį apie 100-110 arba daugiau aminorūgščių, pirmiausiai atsakingų už antigeno atpažinimą. Karboksi-galinė kiekvienos grandinės dalis charakterizuoja pastoviąją sritį, pirmiausiai atsakingą už efektorinę funkciją. Žmogaus lengvosios grandinės yra klasifikuojamos kaip kappa ir lambda lengvosios grandinės. Sunkiosios grandinės yra klasifikuojamos kaip mu, delta, gamma, alfa arba elipson ir apibrėžia antikūno tipą kaip IgM, IgD, IgG, IgA ir IgE, atitinkamai. Lengvosios ir sunkiosios grandinių viduje, kintamoji ir pastovioji sritys yra sujungtos maždaug 12 aminorūgščių „J“ sritimi su sunkiąja grandine taip pat turinčia maždaug virš 10 aminorūgščių „D“ sritį. Žr.: Fundamentai Immunology Ch. 7 (Paul W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Kiekvienos lengvosios/sunkiosios grandinės poros kintamosios sritys sudaro antikūno prisirišimo vietą. Taigi, sveikas antikūnas turi dvi prisirišimo vietas. Išskyrus dvifunkcinius arba dvispecifinius antikūnus, prisirišimo vietos yra tos pačios.

Visos grandinės turi tą pačią santykinai konservatyvios struktūrinės srities (FR) pagrindinę struktūrą sujungtą su trimis hiper kintamomis sritimis, taip pat vadinamomis komplementarumą apsprendžiančiomis sritimis arba CDR. Kiekvienos poros dviejų grandinių CDR yra išdėstytos pagal struktūrines sritis, suteikiančias galimybę susirišti su specifiniu epitopu. Nuo N-galo į C-galą abi sunkioji ir lengvoji grandinės apima domenus FRl, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 ir FR4. Aminorūgštis priskiriama kiekvienam domenui pagal Kabat apibrėžimą: Seųuences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Helth, Bethesda, Md. 1991) (1987), arba Chothia ir Lesk, J.Mol.Biol. 196:90117 (1987); Chothia ir kt., Nature 342:878-83 (1989).

Dvispecifinis arba dvifunkcinis antikūnas yra antikūno dirbtinis hibridas, turintis dvi skirtingas sunkiosios/lengvosios grandinių poras ir dvi skirtingas prisirišimo vietas. Bispecifiniai antikūnai gali būti gaunami įvairiais metodais, įskaitant hibridomų suliejimą arba Fab' fragmentų sukabinimą. Žr. Songsivilai ir Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 31521 (1990); Kostelny ir kt., J. Immunol. 148:1547-53 (1992). Dvispecifinių antikūnų gamyba galėtų būti santykinai intensyvus laboratorinis būdas, palyginus su įprastinių antikūnų gamyba, ir išeiga, ir švarumo laipsnis yra dažniausiai žemesnis dvispecifiniams antikūnams. Dvispecifiniai antikūnai negali egzistuoti fragmentą turinčių vieną prisirišimo vietą formoje (t.y. Fab, Fab' ir Fv).

Žmogaus antikūnai ir antikūnu humanizavimas

Žmogaus antikūnai išvengia tam tikrų problemų, susijusių antikūnais, kurias turi pelių arba žiurkių kintamos ir/arba pastovios sritys. Buvimas tokių iš pelių arba žiurkių kilusių baltymų gali nuvesti prie greito antikūnų klirenso arba gali nuvesti prie paciento imuninio atsako prieš antikūną sukūrimą. Siekiant išvengti iš pelių ir žiurkių išvestų antikūnų utilizavimo, pilnai žmogaus antikūnai gali būti generuojami įvedant žmogaus antikūnų funkciją į graužikų, taip kad graužikai produkuotų pilnai žmogaus antikūnus.

Žmogaus antikūnai

Visiškai žmogaus antikūnų gaminimo būdas yra naudojant pelių XenoMouse® kamieną, kuris buvo sukonstruotas taip, kad turi savo genome žmogaus sunkiosios ir lengvosios grandinių genus. Pavyzdžiui, XenoMouse® pelės turinčios 245 kb ir 190 kb žmogaus sunkiosios grandinės lokuso ir kappa lengvosios grandinės lokuso gemalo konfigūracijos fragmentus, aprašytos Green ir kt., Nature Genetics 7:13-21 (1994). Green ir kt. darbas buvo pratęstas įvedant didesnį negu vidutiniškai 80 % žmogaus antikūno rinkinį, utilizuojant megabazės dydžio žmogaus sunkiosios grandinės lokuso ir kappa lengvosios grandinės lokuso gemalo konfigūracijos YAC fragmentus atitinkamai. Žr. Mendez ir kt., Nature genetics 15:146-56 (1997) ir JAV patento paraiška serijos Nr. 08/759,620, paduota 1996 gruodžio 3d. Be to, buvo sukurtos XenoMouse® pelės, kurios turi ištisą lambda lengvosios grandinės lokusą (JAV patento paraiška, serijos Nr. 60/334,508 paduota 2001 lapkričio 30d.). Ir, buvo sukurtos XenoMouse® pelės, gaminančios daugybinius izotipus (žr. WO 00/76310). XenoMouse® pelės yra prieinamos iš Abgenix, Ine. (Fremont, JAV).

XenoMouse® pelių gamyba toliau aptariama ir apibrėžiama JAV patentų paraiškose, kurių Nr. 07/466,008 paduota 1990 sausio 12d., 07/610,515, paduota 1990 lapkričio 8, 07/919,297 paduota 1992 liepos 24, 07/922,649 paduota 1992 birželio 30, 08/031,801 paduota 1993 kovo 15, 08/112,848 paduota 1993 rugpjūčio 27, 08/234,145 paduota 1994 balandžio 28d., 08/376,279 paduota 1995 sausio 20, 08/430,938 paduota 1995 balandžio 27d., 08/464,584 paduota 1995 birželio 5d., 08/464,582 paduota 1995 birželio 5d., 08/463,191 paduota 1995 birželio 5d., 08/486,853 paduota 1995 birželio 5d., 08/486,857 paduota 1995 birželio 5d., 08/486,859 paduota 1995 birželio 5d., 08/462,513 paduota 1995 birželio 5d., 08/724,752 paduota 1996 spalio 2d., ir 08/759,620 paduota 1996 gruodžio 3d. ir JAV patentuose Nr. 6,162,963, 6,150,584, 6,114,598,6,075,181 ir 5,939,598 Japonijos patentuose Nr. 3 068 180 B2, 3 068 506 B2 ir 3 068 507 B2. Taip pat žiūr. Mendez ir kt. Nature Genetics 15:146-156 (1997) ir Green ir Jakobovits J. Exp. Med., 188:483-495 (1998). Žiūr. taip pat Europos patentą Nr. EP 463151 BĮ, paskelbtą 1996 birželio 12d., Tarptautinę patento paraišką Nr. WO 94/02602, paskelbtą 1996 spalio 31d., WO 98/24893, paskelbtą 1998 birželio 1 ld., WO 00/76310, paskelbtą 2000 gruodžio 21d.

Alternatyviu požiūriu, kiti, įskaitant GenPharm International, Ine., panaudojo „minilokuso“ traktavimą. Minilokuso požiūriu, egzogeninis Ig Iokusas yra imituojamas įtraukiant gabalus (individualius genus) iš Ig lokuso. Taigi, vienas arba daugiau V_H genų, vienas arba daugiau Dh genų, vienas arba daugiau Jh genų, mu pastovioji sritis ir antra pastovi sritis (geriau gamma pastovi sritis) yra formuojami į konstruktą, skirtą įterpti į gyvūną. Šis požiūris yra aprašytas JAV patente Nr. 5,545,807 Surani ir kt. ir JAV patentuose

Nr. 5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650, 5,814,318, 5,877,397, 5,874,299 ir 6,255,458 kiekviename Lonberg ir Kay, JAV patente Nr. 5,591,669 ir 6,023,010 Krimpenfort ir Bems, JAV patentuose Nr. 5,612,205, 5,721,367 ir 5,789,215 Bems ir kt., ir JAV patente Nr. 5,643,763 Choi ir Dunn, ir GenPharm International JAV patento paraiška, serijos Nr. 07/574,748 paduota 1990 rugpjūčio 29d., 07/575,962 paduota 1990 rugpjūčio 31d., 07/810,279 paduota 1991 gruodžio 17d., 07/853,408 paduota 1992 kovo 18d., 07/904,068 paduota 1992 birželio 23, 07/990,860 paduota 1992 gruodžio 16d., 08/053,131 paduota 1993 balandžio 26, 08/096,762 paduota 1993 liepos 22d., 08/155,301 paduota 1993 lapkričio 18d., 08/161,739 paduota 1993 gruodžio 3d., 08/165,699 paduota 1993 gruodžio 10d., 08/209,741 paduota 1994 kovo 9d. Žiūr. Taip pat Europos patentą Nr. 546,073 BĮ, Tarptautinę patento paraišką Nr. WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852 ir WO 98/24884 ir JAV patentą Nr. 5,981,175. Žiūr. Toliau Taylor ir kt., (1992), Chen ir kt., (1993), Tuaillon ir kt. (1993), Choi ir kt., (1993), Lonberg ir kt., (1994), Taylor ir kt., (1994) ir Tuaillon ir kt., (1995), Fishwild ir kt., (1996).

Kirin pademonstravo žmogaus antikūno sukūrimą iš pelės, kuriame per mikroląstelių suliejimą buvo įvestos didelės chromosomos dalys arba visos chromosomos. Žiūr. Europos patento paraiškas Nr. 773288 ir 843961.

Lidak Pharmaceuticals (dabar Xenorex) pademonstravo žmogaus antikūno sukūrimą SCID pelėje, modifikuojant nepiktybiniais subrendusiais leukocitais iš žmogaus donoro. Modifikuotos pelės demonstruoja imuninį atsaką, charakteringą žmogaus donorui, po stimuliacijos imunogenu, kuris glūdi žmogaus antikūnų gamyboje. Žiūr. JAV patentus Nr.

5,476,996 ir 5,698,767.

Žmogaus anti-pelės antikūno (HAMA) atsakas paskatino pramonę gaminti chimerinius arba kitaip humanizuotus antikūnus. Kadangi chimeriniai antikūnai turi žmogaus pastoviąją sritį ir pelių kintamąją sritį, tikimasi, kad tam tikrų žmogaus anti-chimerinių antikūnų (HACA) atsakas turėtų būti stebimas antikūno įprastiniame arba multiporcijiniame panaudojime. Taigi, turėtų būti pageidaujama iš anksto numatyti pilnai žmogaus antikūnus prieš MCP-1 tam, kad būtų sugadintas HAMA arba HACA atsako interesas ir/arba efektas.

Humanizavimo ir demonstravimo technologijos

Kaip aptarta aukščiau sąryšyje su žmogaus antikūnų generavimu, yra antikūnų su sumažintu imunogeniškumu produkavimo pranašumai. Tam tikru laipsniu tai gali būti atlikta sąryšyje su humanizavimo būdais ir būdų demonstravimas naudojant tam tikras bibliotekas.

Turėtų būti įvertinta, kad pelių antikūnai arba antikūnai iš kitų rūšių gali būti humanizuoti arba primatizuoti naudojant gerai žinomas šiuolaikines technikas. Žiūr. Winter ir Harris, Immunol Today 14:43-46 (1993). Dominantis antikūnas gali būti sukonstruotas naudojant rekombinantinės DNR techniką pakeičiant CH1, CH2, CH3, ašinius (hinge) domenus ir/arba struktūrinės srities domenus atitinkamomis žmogaus sekomis (žiūr. WO 92/02190 ir JAV patentus Nr. 5,530,101, 5,585,089, 5,693,761, 5,693,792, 5,714,350 ir 5,777,085). Be to, Ig cDNR panaudojimas chimerinio imunoglobulino genų konstravimui gerai žinomas (Liu ir kt., P.N. A. S. 84:3439 (1987) ir J. Immunol. 139:3521 (1987)). iRNR yra išskirta iš hibridomos arba kitos ląstelės, produkuojančios antikūną ir naudojama cDNR gaminti. Dominanti cDNR gali būti amplifikuota polimerazės grandinine reakcija, naudojant specifinius pradmenis (JAV patentai Nr. 4.683.195 ir 4.683.202). Kitaip, yra sudaryta biblioteka ir tikrinama, norint išskirti dominančią seką. DNR sekos, koduojančios antikūno kintamą sritį, suliejamos su žmogaus pastovios srities sekomis. Žmogaus pastovios srities genų sekos gali būti randamos Kabat ir kt., „Seąuences of Proteins of Imunological Interest“,

N.I.H. Nr. 91-3242 (1991). Žmogaus C srities genai yra lengvai gaunami iš žinomų klonų.

Izotipo pasirinkimas galėtų būti valdomas pagal norimas efektorines funkcijas, tokias kaip komplemento fiksacija, arba nuo antikūno priklausančio ląstelinio citotoksiškumo aktyvumas. Rekomenduojami izotipai yra IgGl, IgG3 ir IgG4. Gali būti naudojamos abi žmogaus lengvosios grandinės pastovios sritys: kappa ir lambda. Chimerinis, humanizuotas antikūnas tuomet ekspresuojamas įprastiniais metodais.

Antikūno fragmentai, tokie kaip Fv, F(ab').sub2 ir Fab gali būti gauti skaldant sveiką baltymą t.y. su proteaze arba cheminiu skaldymu. Kitaip, konstruojamas sutrumpintas genas. Pavyzdžiui, chimerinis genas, koduojantis dalį F(ab')2 fragmento turėtų apimti DNR sekas, koduojančias CH1 domeną ir H grandinės ašinę (hinge) sritį, paskui transliacijos stop kodonas duoda sutrumpintą molekulę.

H ir L J pastovios sekos gali būti naudojamos projektavimui oligonukleotidų, naudojamų pradmenimis, kad būtų galima įvesti naudingas restrikcijos vietas į J sritį paskesniam sujungimui V srities segmento su žmogaus C srities segmentu. C srities cDNR ²⁷ LT 5416 B gali būti modifikuota kryptingos mutagenezės būdu, patalpinant restrikcijos vietą analogiškoje padėtyje žmogaus sekoje.

Ekspresijos vektoriai apima plazmidės, retrovirusus, YAC, EBV kilmės episomas ir panašiai. Patogus vektorius yra toks, kuris koduoja funkciškai pilną žmogaus imunoglobulino CH ir CL seką su tam tikromis restrikcijos vietomis, genų inžinerijos būdu sukonstruotomis taip, kad bet kokia VH ir VL seka gali būti lengvai įterpta ir ekspresuota. Tokiuose vektoriuose sukirpimas paprastai įvyksta tarp sukirpimo donoro vietos įterptoje J srityje ir sukirpimo akceptoriaus vietos ir ankstesniosios C srities, ir taip pat prie sukirpimo sričią kurios pasitaiko žmogaus CH egzonų viduje. Poliadenilinimas ir transkripcijos terminacija natyvios chromosomos vietose įvyksta pasroviui pagal koduojančią sritį. Gaunamas chimerinis antikūnas gali būti sujungtas su bet kokiu stipriu promotoriumi, įskaitant retrovirusines LTR, pvz. SV-40 ankstyvas promotorius, (Okayama ir kt., Mol. Cell. Bio. 3:280 (1983)), Rauso sarkomos viruso LTR (Gorman ir kt., P. N. A. S. 79:6777 (1982)), Moloni pelių leukemijos viruso LTR (Grosschedl ir kt., Cell 41:885 (1985)). Taigi, turėtų būti pripažinta, kad gali būti naudojami gamtiniai lg promotoriai ir panašūs.

Be to, žmogaus antikūnai arba antikūnai iš kitų rūšių gali būti generuoti atvaizdavimo (displėjinėmis) technologijomis, įskaitant be išimčią fagų atvaizdavimą retrovirusų atvaizdavimą ribosomų atvaizdavimą naudojant praktikoje gerai žinomas metodikas ir gaunamos molekulės gali būti papildomai brandinamos, kaip antai giminingumo brandinimas, iš esmės gerai žinomos technikos. Wright ir Harris supra., Hanes ir Plutchau, PNAS USA 94:4937-4942 (1997) (ribosomų atvaizdavimas), Parmley ir Smith, Gene 73:305-318 (1988) (fagų atvaizdavimas), Scott, TIBS 17:241-245 (1992), Cwirla ir kt., PNAS USA 87:6378-6382 (1990), Russel ir kt., Nucl. Acids Res. 21:1081-1085 (1993), Hoganboom ir kt., Immunol. Reviews 130:43-68 (1992), Chriswell ir McCafferty, TIBTECH 10:80-84 (1992) ir JAV patentas Nr. 5,733,743. Jeigu atvaizdavimo technologijos naudojamos ne žmogaus antikūnų gavimui, tokie antikūnai gali būti humanizuoti, kaip aprašyta aukščiau.

Naudojant šias metodikas, gali būti generuoti antikūnai prieš MCP-1 ekspresuojančias ląsteles, patį MCP-1, MCP-1 formas, jo epitopus arba peptidus ir taip pat ekspresijos bibliotekas (žiūr. pvz., JAV patentą Nr. 5.703.057), kurios po to gali būti patikrintos kaip aprašyta aukščiau, dėl aukščiau aprašytų aktyvumų.

Antikūnu paruošimas

Sutinkamai su išradimu, antikūnai gali būti paruošti įgyvendinant XenoMouse® metodiką kaip aprašyta aukščiau. Tokios pelės tuomet sugeba produkuoti žmogaus imunoglobulino molekules ir antikūnus ir neprodukuoja pelių imunoglobulino molekulių ir antikūnų. Tam pasiekti naudojamos metodikos yra atskleistos patentuose, paraiškose ir nurodymuose, atskleistuose šiame pagrindime. Tačiau, dalinai, pasiūlytas pelių ir jų antikūnų transgeninės gamybos įgyvendinimas atskleistas JAV patento paraiškoje Nr. 08/759,620 paduotoje 1996 gruodžio 3d. ir Tarptautinėje patentinėje paraiškoje Nr. WO 98/24893, publikuotoje 1998 birželio 1 ld., ir WO 00/76310, publikuotoje 2000 gruodžio 21d. Žiūr. taip pat Mendez ir kt., Nature Genetics 15:146-156(1997).

Antikūnai, kaip čia aprašyti, yra neutralizuoti aukšto giminingumo antikūnai prieš žmogaus MCP-1. Be to, kai kuriuose įgyvendinimuose, antikūnai duoda kryžminę reakciją su žiurkių MCP-1. Istoriškai buvo naudojami kai kurie skirtingi metodai gaminimuo monokloninių arba polikloniniu antikūnų prieš žmogaus MCP-1 N-galą. Šie siūlymai apima imunizavimą su pilno ilgio žmogaus MCP-1 (hMCP-1) arba jaučio MCP-1 (bMCP-1), žmogaus MCP-1 sintetiniais peptidais (1-34 arba 1-37) (Visser ir kt., Actą Endocrinol. 90:90-102 (1979)); Logue ir kt., J. Immunol. Methods 137:159-66 (1991)) ir daugybiniais antigeniniais peptidais (MAP) hMCP-l(l-lO), hMCP-1 (9-18) ir hMCP-1 (24-37) (Magerlein ir kt., Drug Res. 48:783-87 (1998)). Šiais metodais negalima produkuoti antikūnų, tinkančių žmonių gydymui. (Dėl gydymo kriterijų žiūr. čia skyrių, pavadintą “Terapinis paskyrimas ir kompozicija”.) Didelio giminingumo hMCP-1 antikūnus yra sunku padaryti, kadangi B ląstelės yra tolerantiškos peptidui. Tačiau, Bradwell ir kt., (1999) pademonstravo, kad imunizavimas mišiniu žmogaus MCP-l(l-34) ir jaučio MCP-l(51-84) MAP sekė sumaišius žmogaus ir jaučio MAP kryptingai hMCP-l(51-84) ir bMCP-l(51-86) buvo efektyvi pažeidžiant B ląstelių toleranciją MCP-1 žmonėse su neoperuojamu prieskydinės liaukos augliu.

Čia aprašytas metodas buvo skirtas susilpninti B ląstelių toleranciją prieš hMCP-1 taip pat, kaip ir produkuoti pilnai žmogaus monokloninį antikūną, tinkantį terapiniam ir diagnostiniam naudojimui. XenoMouse® gyvūnai buvo imunizuoti MCP-1 sintetiniais peptidais (hMCP-1 (1-34) ir rMCP-l(l-34)), kadangi sintetiniai peptidai buvo sėkmingai naudojami generuoti antikūnus, specifinius endogeniniam žmogaus MCP-1 (Visser ir kt., (1979)). Be to, kadangi pelių MCP-1 N-galas yra labai tapatus su žmogaus MCP-1 (85 % identiškumas) ir žiurkių MCP-1 (91 % identiškumas), peptidų derinys buvo naudojamas kaip imunogenas susilpninti B ląstelių toleranciją prieš pelių MCP-1 per molekulinę mimikriją, tuo būdu sudarant sąlygas didelio giminingumo anti-žmogaus MCP-1 antikūnų generavimui. Šie abu peptidai kibo prie sraigių limfos hemocianino ir emulgavosi pilname Freundo adjuvante arba nepilname Freundo adjuvante, siekiant sustiprinti šių baltymų imunogeniškumą.

²⁹ LT 5416 B

Po imunizacijos limfinės ląstelės (tokios kaip B ląstelės) buvo atkurtos iš pelių, kurios ekspresuoja antikūnus, ir tokios atkurtos ląstelių linijos buvo sujungtos su mieloidinių ląstelių linija, sukuriant imortalizuotas hibridomos ląstelių linijas. Tokios hibridomos ląstelių linijos buvo patikrintos ir atrinktos identifikuoti hibridomų ląstelių linijoms, kurios produkuoja antikūnus specifinius dominančiam antigenui. Čia aprašyta gaminimas daugiariopų hibridomos ląstelių linijų, kurios produkuoja MCP-1 specifinius antikūnus. Be to, duotas tokių ląstelių linijų produkuojamų antikūnų charakterizavimas, įskaitant tokių antikūnų sunkiosios ir lengvosios grandinių nukleotidų ir aminorūgščių analizę.

Išradimo įgyvendinimai pateikia produkavimui daugiariopas hibridomos ląstelių linijas, kurios produkuoja specifinius antikūnus prieš MCP-1. Toliau įgyvendinimai susiję su antikūnais, kurie rišasi su ir neutralizuoja kitų MCP-1 šeimos narių aktyvumą, įskaitant MCP-2, MCP-3 ir MCP-4. Taip pat patikrinamas supernatantų reaktyvumas prieš MCP-1 fragmentus tolesniam epitopų žemėlapiui skirtingų antikūnų prieš susijusius žmogaus chemokinus ir prieš žiurkių MCP-1 ir pelių ortologą MCP-1, JE, siekiant nustatyti rūšių kryžminę reakciją. Tolimesni įgyvendinimai pateikia tokių ląstelių linijų produkuotų antikūnų charakterizavimą, įskaitant tokių antikūnų sunkiosios ir lengvosios grandinių nukleotidų ir aminorūgščių sekų analizę.

Antraip, vietoje to, kad būtų sulietos su mielanomos ląstelėmis, sudarant hibridomas, B ląstelės gali būti ištirtos tiesiogiai. Pavyzdžiui, CD19+ B ląstelės gali būti išskirtos iš hiperimuninių XenoMouse® pelių ir joms leidžiama daugintis ir diferencijuotis į antikūnus sekretuojančias plazmos ląsteles. Antikūnai iš ląstelių supematanto po to tikrinami ELISA dėl reaktyvumo prieš MCP-1 imunogeną. Supematantas taip pat tikrinamas prieš MCP-1 fragmentus tolesniam epitopų žemėlapiui skirtingų antikūnų prieš susijusius žmogaus chemokinus ir prieš žiurkių MCP-1 ir pelių ortologą MCP-1, JE, siekiant nustatyti rūšių kryžminę reakciją. Atskiros plazmos ląstelės, sekretuojančios antikūnus su norimomis savybėmis paskui išskiriamos, naudojant MCP-1 specifinę hemolizinę dėmelių protrūkio analizę (Babcook ir kt., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:7843-7848 (1996)). Ląstelės nukreiptos ližei yra geriau avių raudonosios kraujo ląstelės (SRBC) padengtos MCP-1 antigenu. Esant B ląstelių kultūrai, turinčiai plazmos ląsteles, sekretuojančias dominantį imunoglobulinąir komplementą, formavimasis dėmelių rodo specifinę MCP-1 indukuotąlizę avių raudonųjų kraujo ląstelių, apsuptų dominančias plazmos ląsteles. Atskiros antigenui specifinės plazmos ląstelės dėmelės centre gali būti išskirtos ir genetinė informacija, kuri koduoja antikūno specifiškumą yra išskirta iš atskiros plazmos ląstelės. Naudojant PGR atvirkštinę transkriptazę, gali būti klonuota antikūno sunkiosios ir lengvosios grandinių kintamas sritis koduojanti DNR. Tokia klonuota DNR toliau gali būti įterpta į atitinkamą ekspresijos vektorių, geriau vektoriaus kasetę, tokią kaip pcDNR, dar geriau tokį pcDNR vektorių, turintį imunoglobulino sunkiosios ir lengvosios grandinės pastovų domeną. Sukurtas vektorius paskui gali būti transfekuotas į ląsteles-šeimininkes, geriau CHO ląsteles, ir auginamos įprastinėje maitinimo terpėje, kuri tinkama promotoriaus indukcijai, transformantų atrinkimui, arba norimas sekas koduojančių genų amplifikavimui. Žemiau aprašytas išskyrimas daugeriopų atskirų plazmos ląstelių, kurios produkuoja MCP-1 specifinius antikūnus. Be to, genetinė medžiaga, kuri koduoja anti-MCP-1 antikūno specifiškumą gali būti išskirta, įvesta į atitinkamą ekspresijos vektorių, kuris gali būti transfekuotas į ląsteles-šeimininkes.

Apskritai, antikūnai produkuoti sulietų hibridomų, buvo žmogaus IgG2 sunkiosios grandinės su pilnai žmogaus kappa arba lambda lengvosiomis grandinėmis. Kai kuriuose įgyvendinimuose antikūnai, turintys žmogaus IgG4 sunkiąsias grandines kaip ir IgG2 sunkiąsias grandines. Antikūnai taip pat gali būti ir kitų izotipų, įskaitant IgGl. Antikūnai, turintys didelį giminingumą tipiškai turi Kd nuo maždaug 10'⁶ iki maždaug 10'¹² M arba žemiau, jeigu matuojama bet kurioje kietoje fazėje ir tirpalo fazėje. Antikūnai, turintys Ko mažiausiai 10'¹¹ M yra pageidautini inhibuoti MCP-1 aktyvumą.

Ryšium su giminigumo svarbumu anti MCP-1 antikūnų terapiniam naudingumui, turėtų būti suprantama, kad tai gali generuoti anti-MCP-1 antikūnai, pavyzdžiui, kombinatoriškai, ir įvertinami tokie antikūnai dėl prisirišimo giminingumo. Vienas būdas, kuris gali būti atliktas, yra paimti antikūno sunkiosios grandinės cDNR, paruoštą kaip aprašyta aukščiau, ir surasti gerą giminingumą MCP-1, ir sujungti ją su antrojo antikūno lengvosios grandinės cDNR, paruoštą kaip aprašyta aukščiau, ir taip pat surasti gerą giminingumą su MCP-1, pagaminant trečią antikūną. Gauto trečiojo antikūno giminingumai gali būti išmatuoti, kaip aprašyta čia, ir su pageidaujamomis disociacijos konstantomis išskirti ir charakterizuoti. Antraip, bet kurio aukščiau aprašyto antikūno lengvoji grandinė gali būti naudojama kaip įrankis padėti sunkiosios grandinės kūrimui, kuri, jeigu poruojama su lengvąja grandine turėtų rodyti didelį giminingumą MCP-1, ir atvirkščiai. Tokios sunkiosios grandinės kintamos sritys šioje bibliotekoje gali būti išskirtos iš paprastų gyvūnų, išskirtos iš hiperimunizuotų gyvūnų, sukurtos dirbtiniu būdu iš bibliotekos, turinčios sunkiosios grandinės kintamos srities sekas, skirtingas CDR srityse, arba sukurtas bet kokiu kitu būdu (tokiu kaip atsitiktinė arba kryptinga mutagenezė), kuris duoda įvairovę bet kurios grandinės kintamos srities geno CDR srityse. Tokios CDR sritys, ir dalinai CDR3, gali būti reikšmingai skirtingo ilgio arba sekų identiškumo nuo sunkiosios grandinės, pradžioje suporuotos su originaliu anrikūnu. Gauta biblioteka gali būti atrinkta pagal didelį prisirišimo prie MCP-1 giminingumą sukuriant terapiškai tinkamą antikūno molekulę su panašiomis

3i LT 5416 B savybėmis, kaip originalus antikūnas (didelis giminingumas ir neutralizavimas). Panašus būdas, naudojant sunkiąją grandinę arba sunkiosios grandinės kintamą sritį gali būti naudojamas sukurti terapiškai tinkamą antikūno molekulę su unikalia lengvosios grandinės kintama sritimi. Be to, nauja sunkiosios grandinės kintama sritis, arba lengvosios grandinės kintama sritis, gali būti naudijamos, kaip aprašyta aukščiau, gali būti naudojamos gepanašiu būdu, kaip aprašyta aukščiau, identifikuoti naują lengvosios grandinės kintamą sritį, arba sunkiosios grandinės kintamą sritį, kas įgalina sukurti naują antikūno molekulę.

Kitas kombinatorinis būdas, kuris gali būti atliktas, yra atlikti mutagenezę sunkiosios ir/arba lengvosios grandinių pradinėje linijoje, kaip parodyta kad atlikta antikūnuose sutinkamai su Čia aprašytu išradimu, dalinai komplementarumą apsprendžiančiose srityse (CDR). Gauto antikūno aktyvumai gali būti išmatuoti, kaip aprašyta čia, ir tokie antikūnai su pageidaujamomis konstantomis išskirti ir charakterizuoti. Po pageidaujamo rišiklio atrinkimo, seka arba sekos, koduojančios tai, gali būti naudojamos generuoti rekombinantinius antikūnus, kaip aprašyta aukščiau. Tam tikri mutagenezės atlikimo metodai su oligonukleotidais žinomi tos srities specialistams ir apima cheminę mutagenezę, pavyzdžiui, su natrio bisulfitu, fermentiniu klaidingu įjungimu ir ekspozicine radiacija. Suprantama, kad čia aprašytas išradimas apima antikūnus su esminiu identiškumu, kaip apibrėžta čia, iki antikūnų tikslaus rinkinio, kuris gaunamas mutagenezės arba bet kokiu kitu būdu. Be to, antikūnai su konservatyviais arba nekonservatyviais aminorūgščių pakeitimais, kaip apibrėžta čia, padarytais antikūnų tiksliame rinkinyje, yra įjungti į čia aprašyto išradimo įgyvendinimą.

Kitas kombinatorinis būdas, kuris gali būti naudojamas išreikšti aukščiau aprašytų antikūnų CDR sritims, ir ypatingai CDR3, aukščiau aprašytų antikūną struktūrinių sričią gautų iš kitų kintamų sričių geną kontekste. Pavyzdžiui, vieno anti-MCP-1 antikūno sunkiosios grandinės CDR1, CDR2 ir CDR3 gali būti ekspresuotos kitos sunkiosios grandinės kintamų genų struktūrinės srities kontekste. Panašiai, anti-MCP-1 antikūno lengvosios grandinės CDR1, CDR2 ir CDR3 gali būti ekspresuotos kontekste struktūrinės srities kitų kintamos srities geną Be to, šių CDR sričių pradinės sekos gali būti ekspresuotos kitų sunkiosios ir lengvosios grandinių kintamų sričių genų kontekste. Gauti antikūnai gali būti tiriami dėl specifiškumo ir giminingumo ir gali sudaryti sąlygas naujų antikūnų molekulių generavimui.

Reikėtų įvertinti, kad remiantis čia aprašytu išradimu paruošti antikūnai gali būti ekspresuoti įvairiose ląstelių linijose. Sekos, koduojančios individualius antikūnus, gali būti naudojamos atitinkamų žinduolių ląstelių transformacijai. Transformacija, įvedant polinukleotidus į ląstelę-šeimininkę, gali būti atlikta bet kokiu žinomu metodu, įskaitant.

pavyzdžiui, polinukleotido supakavimą į virusą (arba į virusinį vektorių) ir ląsteliųšeimininkių transdukciją virusu (arba vektoriumi), arba transfekcijos procedūromis, žinomomis laboratorinėje praktikoje, kaip iliustruojama pavyzdžiais JAV patentuose Nr. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 ir 4,959,455. Panaudota transformacijos procedūra priklauso nuo šeimininko, kuris yra transformuojamas. Heterologinių polinukleotidų įvedimo į žinduolių ląsteles metodas gerai žinomas praktikoje ir apima transfekciją tarpininkaujant dekstranui, nusodinimą kalcio fosfatu, transfekciją tarpininkaujant polibrenui, protoplastų suliejimą, elektroporaciją, polinukleotido(ų) supakavimą į liposomas ir tiesioginę DNR injekciją į branduolį.

Žinduolių ląstelių linijos, tinkamos kaip ekspresijos šeimininkės yra gerai žinomos praktikoje ir apima daug imortalizuotų ląstelių linijų, prieinamų Amerikos kultūrų pavyzdžių kolekcijoje (ATCC), įskaitant, bet neapsiribojant, Kinijos žiurkėno kiaušidžių (CHO) ląsteles, HeLa ląsteles, jauno žiurkėno inkstų (BHK) ląsteles, beždžionių inkstų ląsteles (COS), žmogaus hepatoceliuliarinės karcinomos ląsteles (pvz., Hep G2) ir eilę kitų ląstelių linijų. Ląstelių linijos su tam tikru pirmumu yra atrenkamos nustatant, kuri ląstelių linija turi aukštesnį ekspresijos lygį ir produkuoja antikūnus su esminėmis MCP-1 surišimo savybėmis.

Papildomi antikūnu terapijos kriterijai

Kaip aptarta čia, MCP-1 antikūno funkcija pasirodė svarbi mažiausiai daliai jo funkcionavimo būdų. Dabartinio išradimo anti-MCP-1 antikūnai gali atlikti efektorinę funkciją, įskaitant nuo komplemento priklausantį citotoksiškumą (CDC) ir nuo antikūno priklausantį ląstelinį citotoksiškumą (ADCC). Yra tam tikras skaičius antikūnų izotipų, kurie geba tą patį, įskaitant, be apribojimų, sekančius: pelių IgM, pelių IgG2a, pelių IgG2h, pelių IgG3, žmogaus IgM, žmogaus IgGl ir žmogaus IgG3. Reikėtų įvertinti, kad antikūnai yra sukurti ne pradiniam reikalingumui kaip izotipas, bet dažniau, antikūnas kaip sukurtas gali apimti bet kurį izotipą ir antikūnas gali būti izotipą pakeitęs nuo to laiko, naudojant toje srityje gerai žinomus įprastinius metodus. Tokie metodai apima tiesioginių rekombinantinių metodų panaudojimą (žiūr. pvz. JAV patentą Nr. 4,816,397 ir JAV patentą Nr. 6,331,415), ląstelių suliejimo metodus (žiūr. pvz. JAV patentus Nr. 5,916,771 ir 6,207,418) ir kitus.

Ląstelių suliejimo metoduose, paruošiama mielomos arba kita ląstelių linija, kuri apima sunkiąją grandinę su bet kuriuo norimu izotipu ir paruošiama mielomos arba kita ląstelių linija, kuri apima lengvąją grandinę. Tokios ląstelės po to gali būti suliejamos ir išskiriama ląstelių linija, ekspresuojanti sveiką antikūną.

Kaip pavyzdys, čia aptarti MCP-1 antikūnai yra žmogaus antiMCP-1 IgG2 ir IgG4 antikūnai. Jeigu tokie antikūnai turi norimą ryšį su MCP-1 molekule, jie galėtų būti lengvai izotipiškai perjungti generuoti žmogaus IgM, žmogaus IgGl, arba žmogaus IgG3, Ig A1 arba

IgGA2 izotipus, nors tik turinčius tą tą pačią kintamą sritį (kuri apibrėžia antikūno specifiškumą ir dalinai jo giminingumą). Tokia molekulė turėtų sugebėti fiksuoti komplementą ir dalyvauti CDC.

Taigi, yra generuoti kaip antikūnų kandidatai, kurie atitinka norimus „struktūrinius“ požymius, kaip aptarta aukščiau, jie gali pagrinde būti numatyti tik su mažiausiai tam tikrais „funkciniais“ požymiais izotipo perjungime.

Epitopų kartografija

Imunoblotingas

Aprašytas antikūnų prisirišimas prie MCP-1 gali būti nustatytas keletu metodų. Pavyzdžiui, MCP-1 gali būti užnešami ant SDS-PAGE ir analizuojami imunoblotingu. SDSPAGE gali būti atliekama arba nedalyvaujant arba dalyvaujant redukcijos agentui. Tokios cheminės modifikacijos gali duoti cisteino liekanų metilinimą. Taigi, yra galima nustatyti, kurie anti-MCP-1 antikūnai rišasi prie MCP-1 linijinio epitopo.

Paviršinė sustiprinta lazerio desorbija/jonizacija (ŠELPI)

Čia aprašytų MCP-1 antikūnų epitopų kartografavimas gali taip pat būti atliekamas, naudojant SELDI. SELDIProteinChip® matrica yra naudojama nustatyti baltymas-baltynas sąveikos vietas. Antigenai specifiškai sugaunami antikūnais, kovalentiškai imobilizuojami ant baltymų čipų matricos paviršiaus pradiniu inkubavimu ir plovimu. Surišti antigenai gali būti aptikti lazeriu indukuotu desorbcijos procesu ir analizuojami tiesiogiai nustatant jų masę. Tokie surišti antigeno fragmentai pavadinti kaip baltymo „epitopas“.

SELDI būdas įgalina kompleksinės molekulinės kompozicijos viduje individualius komponentus nustatyti tiesiogiai ir kartografuoti kiekybiškai atžvilgiu kitų komponentų greitu, labai jautriu ir keičiamo mąstelio būdu. SELDI naudoja įvairias paviršiaus chemijos matricas, kad galėtų sugauti ir turėti didelį skaičių individualių baltymų molekulių nustatymui lazerio indukuotu desorbcijos būdu. SELDI metodo sėkmė charakterizuojama dalinai daugybinių funkcijų ant paviršiaus („čipo“) miniatiūrizavimu ir integravimui, kiekviena priklausančių skirtingoms technologijoms. SELDI BioChips ir kiti SELDI zondai yra taip paviršiumi „sustiprinti“, kad jie tampa aktyviais dalyviais sugavime, gryninime (atskyrime), pateikime nustatyme ir charakterizavime individualių taikinio molekulių (pvz., baltymų) arba įvertinamų molekulių populiacijų.

Vienas SELDI baltymo BioChip, pakrautas tik su vienu originaliu pavyzdžiu, gali būti skaitomas tūkstančius kartų. SELDI baltymo BioChip iš LumiCyte kompanijos turi daugiau negu 10000 užrašomų baltymų susijungusių padėčių viename kvadratiniame centimetre.

Kiekviena padėtis gali atskleisti daugybės individualių baltymų buvimą. Jeigu baltymo kompozicijos informacija iš kiekvienos padėties skiriasi ir unikalus informacijos rinkinys sujungtas, gaunamas kompozicijos žemėlapis, atspindintis ypatybių rinkinį, kuris naudojamas bendrai nustatyti bendrus šablonus arba molekulinius „pirštų atspaudus“. Skirtingi pirštų atspaudai gali būti susiję su įvairiomis sveikatos stadijomis, iš vienos pusės ligos, ligos pradžios, arba su ligos regresija, susijusia su tam tikrų vaistų skyrimu.

SELDI metodas gali būti aprašytas detaliau keturiose dalyse. Pradžioje, vienas arba daugiau dominančių baltymų yra sugaunami arba „sujungiami“ ant ProteinChip gardelės, tiesiogiai iš originalaus šaltinio medžiagos, be pavyzdžio paruošimo ir be pavyzdžio žymėjimo. Antrame etape „signalo su triukšmu“ santykis yra sustiprinamas, silpninant cheminį ir biocheminį „triukšmą“. Toks „triukšmas“ yra slopinamas selektyviai sulaikant taikinį ant čipo, išplaunant nepageidaujamas medžiagas. Toliau, vienas arba daugiau taikinio baltymų, kurie yra sugauti, yra interpretuojami greitu, jautriu, lazeriu indukuotu metodu (SELDI), kuris pateikia tiesioginę informaciją apie taikinį (molekulinę masę). Galiausiai, taikinio baltymas bet kurioje vienoje arba daugiau padėčių gardelės viduje gali būti charakterizuotas in situ atliekant vieną arba daugiau pririšimo ant čipo arba modifikacijos reakcijų, kad būtų charakterizuota baltymo strukyūra ir funkcija.

Fagu displėjus (fenotipas?)

Aprašytų anti-MCP-1 antikūnų epitopai gali būti nustatyti eksponuojant ProteinChip matricą su kombinatorine biblioteka 12-narių atsitiktinių peptidų, eksponuojamų ant filamentinių fagų (New England Biolabs).

Fagų displėjus apibūdina selekcijos techniką, kurioje peptidai ekspresuojami sulieti su bakteriofago apvalkalo baltymu, pasireiškiantys sulietų baltymų ant viriono paviršiaus fenotipu. Išplovimas atliekamas fagų eksponuojamų peptidų biblioteką inkubuojant su plokštele arba mėgintuvėliu, padengtu taikiniu, išplaunant nesurištus fagus ir specifiškai išplaunant surištus fagus. Išplauti fagai po to ampiifikuojami ir papildonų surišimų ir amplifikacijos ciklų pagalba praturtinami sankaupa naudingų sekų. Po trijų ar keturių ciklų individualių klonų surišimas toliau testuojamas fagų ELISA būdu, atliekamu ant antikūnais padengtais šulinėliais ir charakterizuojamu specifiniu teigiamų klonų DNR sekvenavimu.

Po daugybinių tokių išplovimo ciklų prieš aprašytus anti-MCP-1 antikūnus, surišti fagai gali būti eliuuojami ir pateikiami tolimesniam tyrimui surištų peptidų identifikavimui ir charakterizavimui.

Buvo parodyta, kad išradimo monokloniniai antikūnai suriša svarbias liekanas su MCP1 šerdies domenu. Tirtų monokloninių antikūnų neutralizavimas išskiria dvi funkciškai svarbias vietas žmogaus MCP-1, susijusias su dviem liekanomis, kurios anksčiau buvo parodytos reikalingos surišimui su receptoriumi. Viena vieta buvo atpažįstama visais tirtais antikūnais, kurie konkuruoja su receptoriaus baltymu dėl MCP-1 susirišimo ir įtraukia Arg24. Antroji vieta buvo nustatyta šešių antikūnų grupe, kurie jungiasi konformaciniais epitopais ir jų prisijungimo vieta kaip pasirodė apima Arg24 ir Lys35, kurios yra labai arti Ngalo dėka disulfidinės jungties tarp Cl 1 ir C36.

Aprašyti MCP-1 variantai anksčiau buvo analizuojami dėl biologinio aktyvumo, fizinio receptorių surišimo ir struktūrinio vientisumo (Jarnagin ir kt., (1999) Biochemistry 38: 16167-16177; Hemmerich ir kt., (1999) Biochemistry 38: 13013-13025) ir numatytos vertingos priemonės nustatant antikūnų surišančius epitopus, kaip aprašyta žemiau.

Anti-MCP-1 3.11.2 antikūnas atpažįsta konformacinius epitopus ir skiria iš kitų antikūnų pagal sunkiosios ir lengvosios grandinių unikalias sekas ir jų sugebėjimą kryžmiškai reaguoti su ir taip pat kryžmiškai neutralizuoti kitus MCP šeimos narius, tokius kaip MCP-2, MCP-3 ir MCP-4. Kaip parodyta su mutagenezės eksperimentais, mAb 3.11.1 prisirišimo vieta buvo paveikta keičiant R24A, bet ne K35A. Šie duomenys yra patvirtinti Lys-C skaldymo ant čipo rezultatais su SELDį kuris atriboja epitopo prisirišimą esantį tarp MCP-1 20-35 liekanų.

Nustatymas, kad 3.11.1 epitopas yra tarp 20-35 liekaną buvo taip pat paremta sekų paluyginimu, parodant kad R24, bet ne K35 buvo išsaugota per kitus MCP šeimos narius, konkrečiai MCP-2, MCP-3 ir MCP-4. Surišimo analizė su SPOT peptidą susintetintų ant membranos, pagalba (Sigma-Genosys, The Woodlands, Texas) atskleidė, kad prisirišimo vieta mažiausiai astuonių mAb su linijiniais epitopais apima 20-35 liekanas ir įtraukia R24. Atsižvelgiant į šių surišimo tyrimų rezultatų panašumus ir svarbumą homologijos tarp visų mAb kintamų genų struktūrą prisirišusių prie linijinių epitopų ant MCP-1, pasirodė, kad visi antikūnai rišasi su šituo neutralizuojančiu epitopu.

Epitopų sankaupa apie R24 ir K35 paaiškina visų 36 antikūnų neutralizuojantį aktyvumą. Atpažintas MCP-1 epitopas nepasirodo pratęstas iki N-galinės Pro9 liekanos. Ši liekana pasirodė veikianti į receptoriaus signalizavimą bet ne prisirišimo giminingumą.

Panaudojimas diagnostikoje

Antikūnai, paruošti pagal čia aprašyto išradimo įgyvendinimą., naudojami tyrimams, ypatingai diagnostikos in vivo tyrimuose, pavyzdžiui, nustatant MCP-1 ir visų MCP-1 šeimos narių lygį paciento pavyzdžiuose. Paciento pavyzdžiai gali būti. pavyzdžiui, kūno skysčiai, geriau kraujas, dar geriau kraujo serumas, sinovialinis skystis, audinių lizatai ir ekstraktai, pagaminti iš nesveikų audinių. Pavyzdžių diagnostikos būdai apima MCP šeimos chemokinų lygio matavimą pavyzdžiui, žmogaus serume, sinovialiniame skystyje ir audinių lizatuose. Specifinių MCP šeimos narių lygio stebėjimas gali būti naudojamas kaip pakaitinis matas pacientų reakcijos į gydymą ir kaip ligos sunkumo stebėjimo metodas. Aukštesnis MCP-1 lygis, palyginus su kitų tirpių žymenų, turėtų reikšti uždegimo buvimą. MCP-1 antigeno koncentracija esanti paciento pavyzdžiuose yra nustatoma naudojant metodą, kuris specifiškai nustato esančio antigeno kiekį. Toks metodas yra ELISA metodas, kuriame, pavyzdžiui, išradimo antikūnai gali būti patogiai imobilizuoti ant netirpios matricos, tokios kaip polimerinė matrica. Naudojant pavyzdžių populiaciją, kurie pateikia statistiškai svarbius rezultatus kiekvienai progresijos arba gydymo stadijai, gali būti nustatytos antigeno koncentracijos ribos, kurios gali būti vertinga kiekvienos ligos stadijos charakteristika.

Norint nustatyti uždegimo lygį subjekte pagal tyrimą, arba charakterizuoti subjekto atsaką į gydymo kursą, iš subjekto imamas kraujo pavyzdys ir nustatoma pavyzdyje esančio MCP-1 antigeno koncentracija. Taip gauta koncentracija naudojama nustatyti, į kurią koncentracijos ribą reikšmė patenka. Taip nustatyta riba koreliuoja su ligos progresijos stadija arba gydymo stadija nustatyta įvairiose diagnozuotų subjektų populiacijose, tuo būdu nurodant subjekto stadiją po tyrimo.

Genų amplifikavimas ir/arba ekspresija gali būti matuojama pavyzdyje tiesiogiai, pavyzdžiui, įprastiniais Southern blotingo metodu, Northern blotingo metodu nustatant mRNR transkripcijos kiekį (Thomas, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)), dot blotingu (DNR analize) arba hibridizacija in situ, naudojant atitinkamai žymėtą bandinį, pagrįstą čia numatyta seka. Antraip, gali būti pritaikyti antikūnai, kurie gali atpažinti specifinius dupleksus, įskaitant DNR dupleksus, RNR dupleksus ir DNR-RNR hibridų dupleksus arba DNR-baltymų dupleksus. Antikūnai paeiliui gali būti žymėti ir gali būti atliktas bandymas, kuriame dupleksas yra surištas su paviršiumi taip, kad po duplekso susiformavimo ant paviršiaus, gali būti nustatytas antikūnas, prisirišęs prie duplekso.

Pavyzdžiui, antikūnai, įskaitant antikūnų fragmentus, gali būti naudojami kokybiniam ir kiekybiniam MCP-1 baltymų ekspresijos nustatymui. Kaip pažymėta aukščiau, antikūnas geriau yra pažymėtas su nustatoma, pvz. fluorescentine žyme, ir surišimas gali būti tikrinamas šviesos mikroskopija, tėkmės citometrija, fluorimetrija arba kitais gerai žinomais metodais. Šie metodai pagrinde tinkami, jeigu amplifikuotas genas koduoja ląstelės paviršiaus baltymą, pvz. augimo faktorių. Tokie surišimo tyrimai yra atliekami kaip įprasta.

Antikūnų, susirišusių su MCP-1 baltymu, nustatymas in situ gali būti atliekamas, pavyzdžiui, imunofluorescencija arba imunoelektronine mikroskopija. Šiam tikslui paimamas žmogaus audinio mėginys ir jam taikomas žymėtas antikūnas, geriau užguldant antikūną ant biologinio pavyzdžio. Ši procedūra taip pat įgalina nustatyti žymėto geno produktą tiriamame audinyje. Šios srities specialistui turėtų būti akivaizdu, kad histologinių metodų didelė įvairovė yra lengvai pritaikoma nustatymui in situ.

Vienas iš labiausiai jautrių ir labiausiai lanksčių kiekybinių metodų diferenciniam genų ekspresijos kiekybiniam nustatymui yra RT-PGR, kuris gali būti naudojamas palyginti iRNR lygiui skirtingose pavyzdžių populiacijose, esant normaliems ir auglių audiniams, esant arba nesant vaistų poveikiui, charakterizuoti genų ekspresijos būdus, atskirti artimai susijusias iRNR ir tirti RNR struktūrą.

Pirmasis žingsnis šiame procese yra iRNR išskyrimas iš objekto pavyzdžio. Pradinė medžiaga tipiškai yra suminė RNR nustatyta tvarka išskirta iš nesveiko audinio ir atitinkamų sveikų audinių. Taigi, iRNR gali būti ekstrahuota , pavyzdžiui, iš užšaldytų arba archyvuotų parafinu užlietų ir fiksuotų (pvz. formalinu fiksuotų) nesveikų audinių pavyzdžių palyginimui su to paties tipo normaliu audiniu. iRNR ekstrakcijos metodai yra gerai žinomi šioje srityje ir išdėstyti standartiniuose molekulinės biologijos vadovėliuose , įskaitant Ausubel ir kt., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997). RNR ekstrakcijos metodai iš parafinu užlietų audinių yra išdėstyti, pavyzdžiui, Rupp ir Locker, Lab Invest., 56:A67 (1987) ir De Andrės ir kt., BioTechniąues, 18:42044 (1995). Ypač, RNR išskyrimas gali būti atliekamas naudojant išvalymo rinkinį, buferių rinkinį ir proteazes iš komercinių gamintojų, tokių kaip Qiagen, pagal gamintojų instrukcijas. Pavyzdžiui, suminė RNR iš audinių pavyzdžių gali būti išskirta naudojant RNA Stat-60 (Tel-Test).

Jeigu RNR negali tarnauti kaip PGR matrica, pirmas žingsnis diferencinėje genų ekspresijos analizėje pagal RT-PGR yra atvirkštinė RNR matricos transkripcija į cDNR, sekanti iš jos eksponentinės amplifikacijos PGR reakcijoje. Dvi dažniausiai naudojamos atvirkštinės transkriptazės yra paukščių mieloblastozės viruso atvirkštinė transkriptazė (AMV-RT) ir Moloney pelių leukemijos viruso atvirkštinė transkriptazė (MMLV-RT). Atvirkštinė transkripcija yra atliekama naudojant specifinius pradmenis, atsitiktinius heksamerus arba oligo-dT pradmenis, priklausomai nuo aplinkybių ir ekspresijos atlikimo tikslo. Pavyzdžiui, ekstrahuota RNR gali būti atvirkščiai transkribuota, naudojant GeneAmp RNR PGR rinkinį (Perkin Elmer, CA, USA) pagal gamintojo instruccijas. Gautoji cDNR gali būti po to naudojama kaip matrica paskesnėse PGR reakcijose.

Taip pat PGR stadijoje gali būti naudojama daugybė termostabilių DNR priklausomų DNR polimerazių, tai tipiškai atlieka Taq DNR polimerazė, kuri turi 5-3' nukleazinį aktyvumą, bet neturi 3-5' endonukleazinio aktyvumo. Taigi, TaqMan PGR tipiškai naudojamas Taq arba Tth polimerazės 5'- nukleazinis aktyvumas hidrolizavimui hibridizacijos zondo, pririšto prie jo taikinio amplikono, bet negali būti naudojamas kitas fermentas su ekvivalentišku 5' nukleaziniu aktyvumu. Du oligonukleotidų pradmenys naudojami sukurti PGR reakcijos tipiniam amplikonui. Trečiasis oligonukleotidas. arba zondas, skirtas nustatyti tarp dviejų PGR pradmenų esančią nukleotidų seką. Zondas yra nepailginamas Taq DNR polimerazės fermentu ir žymėtas reporterio fluorescuojančiais dažais ir gesinančiaisiais fluorescuojančiais dažais. Bet kokia laserio indukuota emisija iš reporterio fluorescuojančių dažų yra gesinama gesinančiaisiais dažais, jeigu du dažai yra arti vienas kito, kaip jie yra ant zondo. Amplifikacijos reakcijos metu Taq DNR polimerazės fermentas skaldo zondą nuo matricos priklausomu būdu. Gaunami zondo fragmentai disocijuoja tirpale ir signalas iš išlaisvinto reporterinio dažo yra laisvas nuo antrojo fluoroforo gesinančiojo efekto. Viena reporterio dažų molekulė yra išlaisvinta už kiekvieną naujai susintetintą molekulę, ir neužgesintų reporterio dažų nustatymas nurodo pagrindą kiekybinei duomenų interpretacijai.

TaqMan RT-PGR gali būti atliekama, naudojant komerciškai prieinamas priemones, tokias, kaip pavyzdžiui, ABI PRIZM 7700TM Sequence Detection SystemTM (PerkinElmer-Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), arba Lightcycler (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany). Pateiktame įgyvendinime 5' nukleazės atlikimo metodika tęsiasi realiame laike, naudojant kiekybinę PGR priemonę, tokią kaip ABI PRIZM 7700TM Sequence Detection SystemTM. Sistema susideda iš termociklerio, lazerio, krūvio keitimo prietaisas (CCD), kameros ir kompiuterio. Sistema amplifikuoja pavyzdžius termocikleryje 96 šulinėlių formate. Amplifikacijos metu lazerio indukuotas fluorescentinis signalas surenkamas realiame laike per pluoštinį optinį kabelį visiems 96 šulinėliams ir detektuojamas CCD. Sistema apima programinę įrangą instrumento veiklai ir duomenų analizavimui.

5'-nukleazės analizės rezultatų duomenys pradžioje ekspresuojami kaip Ct, arba slenkstinis ciklas. Kaip aptarta aukščiau, fluorescencijos reikšmės yra fiksuojamos kiekviename cikle ir atspindi amplifikacijos reakcijoje tuo metu suamplifikuoto produkto kiekį. Taškas, kai fluorescentinis signalas yra pirma fiksuojamas kaip statistiškai svarbus, yra slenkstinis ciklas (Ct). ACt reikšmės yra naudojamos kaip kiekybinis įvertinimas santykinio skaičiaus starto kopijų konkretaus taikinio sekos nukleino rūgšties pavyzdyje, jeigu palyginti RNR ekspresiją ląstelėje iš nesveiko audinio su tuo normalioje ląstelėje.

Norint sumažinti klaidas ir iš pavyzdžio į pavyzdį perėjimo efekto pakitimus, RT-PGR atliekama naudojant vidinį standartą. Idealus vidinis standartas ekspresuojamas pastoviu lygiu skirtinguose audiniuose ir yra nepaveiktas eksperimentinio apdorojimo. RNR dažniausiai naudojamos genų ekspresijos būdams normalizuoti yra iRNR gyvybiškai svarbių funkcijų genų - gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenazės (GAPDH) ir β-aktino.

Diferencinė genų ekspresija gali būti taip pat identifikuota arba patvirtinta , naudojant mikrogardelių techniką. Šiame metode dominančios nukleotidų sekos yra paklojamos arba išdėstomos ant mikročipų substrato. Išdėstytos sekos po to hibridizuojamos si^spec^iniais DNR zondais iš dominančių ląstelių arba audinių.

Specifiniame mikrogardelių technikos įgyvendinime, PGR amplifikacijos įterpti cDNR klonai yra taikomi prie substrato dideliu rinkiniu. Geriausiai mažiausiai 10000 nukleotidų sekų yra taikomos prie substrato. Genai, išdėstyti ant mikrogardelių, imobilizuoti ant mikročipų 10000 elementų kiekvienas, yra tinkami hibridizacijai, esant griežtoms sąlygoms. Fluorescentiškai žymėti cDNR zondai gali būti generuojami inkorporuojant fluorescentinius nukleotidus iš dominančių audinių ekstrahuotos RNR atvirkštine transkripcija. Žymėti cDNR zondai pritaikyti prie čipo selektyviai hibridizuojasi su kiekvienu DNR gardelės tašku. Po privalomo plovimo, kad būtų pašalinti nespecifiškai prisijungę zondai, čipas skanuojamas konfokaline lazerio mikroskopija. Kiekvieno išdėstyto elemento hibridizacijos kiekybinis įvertinimas galimas įvertinant atitinkamos iRNR perteklių. Su dvejopa spalvos fluorescencija, atskirai žymėti cDNR zondai generuoti iš dviejų RNR šaltinių hibridizuoti poromis prie gardelės. Santykinis perteklius transkriptų iš dviejų šaltinių atitinkančių kiekvienam tiksliai apibūdintam genui tokiu būdu nustatomas vienu metu. Sumažinta hibridizacijos skalė pateikia patogų ir greitą didelio skaičiaus genų ekspresijos įvertinimo būdą. Tokie metodai parodė, kad reikia turėti jautrumą reikalingą nustatyti retai pasitaikančių genų transkriptus, kurie ekspresuojami nuo keleto kopijų iš ląstelės ir atkuriamai nustatyti mažiausiai vidutiniškai dukartinį ekspresijos lygių skirtumą (Schena ir kt., Proc. Nathl. Acad. Sci. USA, 93(2O)L106-49). Nukleino rūgščių hibridizacijos metodologija ir mikrogardelių technologija yra gerai žinoma šioje srityje.

MCP-1 agonistai ir antagonistai

Čia aprašyto išradimo įgyvendinimai taip pat susiję su MCP-1 baltymo variantais, kurie funkcionuoja kaip bet kuris MCP-1 agonistas (mimetikas) arba kaip MCP-1 antagonistas. MCP-1 baltymo variantai gali būti generuoti mutagenezės būdu, pvz. paviene taškine mutacija arba MCP-1 baltymo trumpinimu. MCP-1 baltymo agonistas gali išlaikyti iš esmės tą patį arba dalinį biologinį aktyvumą natūraliai pasitaikančios MCP-1 baltymo formos. MCP-1 baltymo antagonistas gali inhibuoti vieną arba daugiau aktyvumų natūraliai pasitaikančio MCP-1 baltymo, pavyzdžiui, pagal konkurencinį susirišimą su nariais, esančiais prieš ir už ląstelinės signalinės kaskados, kuri apima MCP-1 baltymą. Taigi, specifiniai biologiniai efektai gali būti išgauti veikiant su įvairiomis ribotomis funkcijomis. Siame įgyvendinime subjekto veikimas variantu, turinčiu natūraliai pasitaikančio baltymo formos biologinių aktyvumų dalį, turi mažesnį pašalinį efektą subjekte atitinkamai veikimui su natūraliai pasitaikančia MCP-1 baltymo forma.

MCP-1 baltymo variantai, kurie funkcionuoja arba kaip MCP-1 agonistas (mimetikas) arba kaip MCP-1 antagonistas, gali būti identifikuoti tikrinant MCP-1 baltymo mutantų kombinatorines bibliotekas, pvz. sutrumpinimo mutantų, pagal baltymo agonistinį arba antagonistinį aktyvumą. Šiame įgyvendinime MCP-1 variantų nevienalytė biblioteka yra generuojama kombinatorine mutageneze nukleino rūgščių lygyje ir yra užkoduota nevienalyte genų biblioteka. MCP-1 variantų nevienalytė biblioteka gali būti produkuota, pavyzdžiui, fermentiškai liguojant sintetinių oligonukleotidų mišinį į genų sekas, tokias kaip išsigimęs rinkinys potencialių MCP-1 sekų yra ekspresuojamas kaip individualus peptidas, arba atvirkščiai, kaip rinkinį didesnių sulietų baltymų (pvz. fagų atvaizdavimui) turinčių MCP-1 sekų rinkinį jame. Egzistuoja metodų įvairovė, kurie gali būti naudojami produkavimui potencialių MCP-1 variantų bibliotekų iš išsigimusių nukleotidų sekų. Išsigimusių genų sekų cheminė sintezė gali būti atlikta automatiniu DNR sintezatoriumi ir sintetiniai genai gali būti po to suliguoti į atitinkamą ekspresijos vektorių. Išsigimusio genų rinkinio naudojimas įgalina viename mišinyje aprūpinti visomis sekomis, koduojančiomis norimą rinkinį potencialių MCP-1 variantų sekų. Išsigimusių nukleotidų sintezės metodai yra gerai žinomi šioje srityje (žiūr. pvz. Narang, Tetrahedron 39:3 (1983); Itakura ir kt., Annu.

Rev. Biochem. 53:323 (1984); Itakura ir kt., Science 198:1056 (1984); Ike ir kt., Nucl Acid Res. 11:477(1983).

Kitu gydymo metodu numatymas ir sukūrimas

Pagal šio išradimo čia aprašytus įgyvendinimus ir remiantis aktyvumais antikūnų, kurie yra produkuoti ir charakterizuoti čia MCP-1 atžvilgiu, numatymas kitų gydomųjų modalumų, išskyrus antikūnų dalis, yra pagalbinis. Tokie modalumai apima, be išimčių, pažangią antikūnų terapiją tokius kaip dvispecifinius antikūnus, imunotoksinus ir radioizotopų terapiją peptidų terapijos generavimą genų terapiją ypač intraantikūnus, antiprasmę terapiją ir mažas molekules.

Sąryšyje su pažangios antikūnų terapijos kūrimu, kur komplemento fiksavimas yra norimas požymis, galima išvengti priklausomybės nuo komplemento ląstelių žūties naudojant, pavyzdžiui, dvispecifinius, imunotoksinus arba radioizotopus.

Pavyzdžiui, sąryšyje su dvispecifiniais antikūnais, dvispecifiniai antikūnai gali būti generuoti, kurie apima (i) du antikūnus - vieną su specifiškumu MCP-1 ir kitą su antra molekule, kurios yra konjuguotos kartu, (ii) vieną antikūną kuris turi vieną grandinę specifinę MCP-1 ir antrą grandinę, specifinę antrajai molekulei, arba (iii) vieną antikūno grandinę, kuri turi specifiškumą MCP-1 ir kitą molekulę. Tokie dvispecifiniai antikūnai gali būti generuoti naudojant gerai žinomas metodikas, pavyzdžiui, sąryšyje su (i) ir (ii) žiūr. pvz., Fanger ir kt. Immunol Methods 4:72-81 (1994) ir Wright ir Harris, aukščiau ir sąryšyje su (m) žiūr. pvz. Traunecker ir kt. Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52 (1992). Kiekvienu atveju, antrasis specifiškumas gali būti gautas sunkiosios grandinės aktyvavimo receptoriais, įskaitant, be apribojimų, CD16 arba CD64 (žiūr. pvz. Deo ir kt. 18:127 (1997)) arba CD89 (žiūr. pvz. Valerius ir kt. Blood 90:4485-4492 (1997)).

Sąryšyje su imunotoksinais, antikūnai gali būti modifikuoti taip, kad veiktų kaip imunotoksinai, naudojant gerai žinomas šioje srityje metodikas. Žiūr. pvz. Vitetta Immunol. Today 14:252 (1993). Žiūr taip pat JAV patentą Nr. 5,194,594. Sąryšyje su ruošimu radioizotopais žymėtų antikūnų, tokie modifikuoti antikūnai lengvai gali būti paruošti, naudojant gerai žinomas šioje srityje metodikas. Žiūr. pvz. Junghans ir kt. in Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2nd edition, Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven (1996)). Žiūr. taip pat JAV patentus Nr. 4,681,581, 4,735,210, 5,101,827, 5,102,990, (RE 35,500), 5,648,471 ir 5,697,902.

Terapinis skyrimas ir kompozicijos

Biologiškai aktyvūs anti-MCP-1 antikūnai paruošti pagal čia aprašytą išradimą gali būti naudojami steriliuose farmaciniuose preparatuose arba kompozicijose neutralizuoti MCP-1 produkuoto aktyvumo nesveikuose ir uždegimo paveiktuose audiniuose, tuo užkertant tolimesnį vienbranduolinių ląstelių skverbimąsi į audinius. Tokie nesveiki ir uždegimo paveikti audiniai pasitaiko daugelyje tipų žmogaus vėžio, įskaitant krūties, kiaušidžių ir plaučių vėžį ir esant sąlygoms, tokioms kaip glomuronefritas, arteriosklerozė ir išsėtinė sklerozė. Biologiškai aktyvus šio išradimo anti-MCP-1 antikūnas gali būti naudojamas vienas arba derinyje su kitais terapiniais agentais. Prieš vėžį anti-MCP-1 antikūnai gali būti derinami su tradiciniais chemoterapijos būdais, tokiais kaip taksolas, doksorubicinas, cisplatina, 5-fluoruracilas ir kitais naujais angiogenezės proceso inhibitoriais. Uždegiminių ligų gydymui MCP-1 antikūnai gali būti derinami su steroidais arba antikūnais prieš kitus citokinus ir chemokinus, kurie padeda ligos būklei.

Jeigu naudojama įvedimui in vivo, antikūno kompozicija galėtų būti sterili. Tai gali būti lengvai pasiekiama filtruojant per sterilias filtravimo membranas, prieš arba po to sekančios liofilizacijos ir atstatymo. Antikūnai įprastai turėtų būti laikomi liofilizuotoje formoje arba tirpale. Terapinės antikūnų kompozicijos dažniausiai patalpinamos į konteinerį, turintį sterilią priėjimo angą. pavyzdžiui, intraveninių tirpalų maišelis arba buteliukas, turintis kamštį praduriamą su poodinių injekcijų adata.

Antikūno įvedimo kelias gali būti įprastiniais būdais, pvz. injekcija arba intraveninė infuzija, į pilvaplėvę, į smegenis, į raumenis, į akis, į arteriją į stuburo kanalo ertmę, inhaliacija arba į pažeistus audinius arba nepertraukiamo atpalaidavimo sistemomis, kaip ehų piliulių nurodyta žemiau. Antikūnas geriau įvedamas be perstojo infuzijos būdu arba didelių piliulių injekcijomis.

Efektyvus antikūno kiekis, kuris taikomas terapiškai, turėtų priklausyti, pavyzdžiui, nuo terapinių tikslą įvedimo būdo, ir paciento būklės. Atitinkamai, terapeutui turėtų būti svarbu nustatyti dozę ir įvedimo būdą kaip reikalinga nustatyti optimalų terapinį efektą Tipiškai, gydytojas praktikas turėtų skirti antikūną iki pasiekiama dozė, kuri duoda norimą efektą. Šios terapijos progresas yra lengvai matuojamas įprastiniais būdais arba čia aprašytais būdais.

Išradimo antikūnai gali būti paruošti mišinyje su farmaciškai priimtinu nešikliu. Ši terapinė kompozicija gali būti įvesta intraveniniu būdu arba per nosį arba plaučius, geriau kaip skystis arba milteliai aerozoliniame pavidale (liofilizuoti). Kompozicija gali būti įvesta parenteraliai arba po oda, jeigu norima. Jeigu paskiriama sistemiškai, terapinė kompozicija turėtų būti sterili, apirogeninė ir parenteraliai priimtinas tirpalas turėtų turėti atitinkamą pH, izotoniškumą ir stabilumą. Šios sąlygos gerai žinomos šios srities specialistui. Trumpai tariant, čia aprašyto išradimo įgyvendinimų dozavimo kompozicijos yra paruoštos saugojimui arba įvedimui sumaišant junginį, turintį norimą švarumo laipsnį su fiziologiškai priimtinu nešikliais, užpildais arba stabilizatoriais. Tokia medžiaga yra netoksiška recipientams taikomomis dozėmis ir koncentracijomis ir apima buferius, tokius kaip Tris HCL, fosfatinį, citratinį, acetatinį ir kitų organinių druskų; antioksidantus, tokius kaip askorbininė rūgštis; žemos molekulinės masės (mažiau negu dešimt liekanų) peptidus, tokius kaip poliargininas, baltymus, tokius kaip serumo albuminas, želatina arba imunoglobulinai; hidrofilinius polimerus, tokius kaip polivinilpirolidonas,; aminorūgštis tokias kaip glicinas, glutamino rūgštis, asparagino rūgštis arba argininas; monosacharidus, disacharidus ir kitus karbohidratus, įskaitant celiuliozę arba jos darinius, gliukozę, manozę arba dekstrinus; chelatinius agentus, tokius kaip EDTA; cukraus alkoholius, tokius kaip manitolis arba sorbitolis; priešjoninius agentus tokius kaip natris ir/arba nejoninės paviršinio aktyvumo medžiagos tokios kaip TWEEN, PLURONICS arba polietilenglikolis.

Sterilios kompozicijos injekcijoms gali būti ruošiamos pagal įprastinę farmacijos praktiką kaip aprašyta Remington‘s Pharmaceutical Sciences (I8th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1990)). Pavyzdžiui, aktyvus junginys ištirpinamas arba suspenduojamas nešiklyje tokiame kaip vanduo arba natūraliai pasitaikantis augalinis aliejus, toks kaip sezamo, žemės riešutą medvilnės sėklų arba sintetiniame nešiklyje kaip etilo oleatas arba panašiame, kuris gali būti reikalingas. Buferiai, konservantai, antioksidantai gali būti įjungiami pagal priimtą farmacinę praktiką

Atitinkami ilgalaikio atpalaidavimo ruošinių pavyzdžiai apima tirpių hidrofobinių polimerų, turinčių polipeptidus, pusiau pralaidžias matricas, kur matricos yra turintys tam tikrą pavidalą daiktai, plėvelės arba mikrokapsulės. Ilgalaikio atpalaidavimo matricų pavyzdžiai apima poliesterius, hidrogelius (pvz., poli(2-hidroksietil-metakrilatas) kaip aprašyta Langer ir kt., J. Biomed Mater. Res., 15:167-277 (1981) ir Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982) arba poli(vinilalkoholis)), polilaktidus (JAV patentas Nr. 3,773,919, EP 58481), L-glutamino rūgšties kopolimerus ir gama etil-L-glutamatą (Sidman ir kt., Biopolymers, 22:547-556 (1983)), nedegraduojantį etileno vinilacetatą (Langer ir kt., aukščiau), degraduojančius pieno rūgšties - glikolio rūgšties kopolimerus, tokius kaip LUPRON Depot™ (įšvirkščiami mikrorutuliukai sudaryti iš pieno rūgšties - glikolio rūgšties kopolimero ir leuprolido acetato) ir poli-D-(-)-3-hidroksisviesto rūgšties (EP 133988).

Kadangi polimerų, tokių kaip etileno vinilacetatas ir pieno rūgštis - glikolio rūgštis negali atpalaiduoti molekulių daugiau kaip per 100 dienų, kai kurie hidrogeliai atpalaiduoja baltymus per trumpesnį laiko periodą. Jeigu įdėti į kapsulę baltymai pasilieka kūne ilgą laiko tarpą, jie gali denatūruotis arba agreguotis nuo buvimo drėgmėje prie 37 °C, rezultate prarasdami biologinį aktyvumą ir galimai pasikeičiant imunogeniškumui. Baltymų stabilizavimui gali būti surasta racionali strategija, priklausomai nuo dalyvaujančio mechanizmo. Pavyzdžiui, jeigu surasta, kad agregacijos mechanizmas yra tarpmolekulinių SS jungčių formavimasis apsikeičiant disulfidais, stabilizacija gali būti pasiekta modifikuojant sulfhidrilines grupes, liofilizuojant iš rūgštinio tirpalo, kontroliuojant drėgmės kiekį, naudojant tam tikrus priedus ir tobulinant specifines polimerinės matricos kompozicijas.

Ilgalaikio atpalaidavimo kompozicijos taip pat apima išradimo antikūnus, apgaubtus liposomų. Liposomos, turinčios tokius antikūnus, yra gaunamos pagal žinomus metodus: JAV patentas Nr. DE 3,218,121; Epštein ir kt., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030-4034 (1980); EP 52322; EP 36676; EP 88046; EP 143949; 142641; Japonijos patento paraiška 83118008; JAV patentai Nr. 4,485,045 ir 4,544,545; ir EP 102324. Antikūno dozė turėtų būti nustatyta gydančio gydytojo atsižvelgiant į įvairius faktorius, žinomai modifikuojančius vaisto veikimą, įskaitant ligos sunkumą ir tipą, kūno svorį, lytį, dietą, įvedimo laiką ir būdą, kitus medikamentus ir kitus svarbius klinikinius faktorius. Terapiškai efektyvi dozė gali būti nustatyta bet kuriais in vivo ir in vitro metodais.

Antikūno kompozicijos dozė konkrečiam pacientui turėtų būti nustatyta gydančio gydytojo, atsižvelgiant į įvairius faktorius, žinomai modifikuojančius vaisto veikimą, įskaitant ligos sunkumą ir tipą, kūno svorį, lytį, dietą, įvedimo laiką ir būdą, kitus medikamentus ir kitus svarbius klinikinius faktorius. Terapiškai efektyvi dozė gali būti nustatyta bet kuriais in vivo ir in vitro metodais.

Šioišradimo antikūno taikomas efektyvus kiekis turėtų priklausyti, pavyzdžiui, nuo terapinių tikslų, įvedimo būdo ir paciento būklės. Taigi, gydančiam gydytojui turėtų būti svarbu nustatyti dozę ir modifikuoti įvedimo būdą kaip reikalinga gauti optimalų terapinį efektą. Tipinė dienos dozė galėtų svyruoti nuo maždaug 0,001 mg/kg iki 100 mg/kg arba daugiau, priklausomai nuo aukščiau paminėtų faktorių. Tinkamos dozės koncentracijos apima 0,001 mg/kg, 0,005 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, 55 mg/kg, 60 mg/kg, 65 mg/kg, 70 mg/kg, 75 mg/kg, 80 mg/kg, 85 mg/kg, 90 mg/kg, 95 mg/kg ir 100 mg/kg arba daugiau. Tipiškai, gydantis gydytojas turi skirti terapinį antikūną kol pasiekiama dozė, duodanti norimą efektą. Šios terapijos progresas yra lengvai matuojamas įprastiniais būdais arba čia aprašytais būdais.

PAVYZDŽIAI

Sekantys pavyzdžiai, apimantys pravestus eksperimentus ir pasiektus rezultatusyra pateikti tik iliustraciniais tikslais ir neturėtų būti vertinami kaip apribojantys čia aprašyto išradimo tolimesnius įgyvendinimus.

PAVYZDYS MCP-1 antigeno paruošimas

Žmogaus MCP-1 peptidas, naudojamas kaip antigenas šiame tyrime turi sekančią aminorūgščių seką:

QPDAINAPVTCCYNFTNRKISVQRLASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEICADP

KQKWVQDSMDHLDKQTQTPKT (SEQ ID NO: 149)

Šis peptidas buvo rekombinantiškai ekspresuotas E. coli ir įsigytas iš Prepro Tech (Rocky Hill, NJ).

PAVYZDYS Anti-MCP-1 antikūnai

Antikūnu generavimas

Gyvūnų imunizavimas ir atranka surinkimui ELISA. Monokloniniai antikūnai prieš MCP-1 buvo sukurti nuosekliai imunizuojant XenoMouse® peles (XenoMouse® kamienai XMG2, XMG4 (3C-1 kamienas) ir hibridinis kamienas, sukurtas sukryžminus XMG2 su XMG4 (3C-1 kamienas) peles, Abgenix, Ine. Fremont, CA) pagal planą parodytą 2 lentelėje. Pavyzdžiui, pradinė imunizacija buvo su 10 pg antigeno sumaišyto 1:1 t/t su TiterMax Gold. Nuosekliai keliant buvo atlikta su 5 arba 10 pg antigeno, sumaišyto su 100 pg alūnų geliu apirogeniniame D-PBS. Kai kurie padidėjimai buvo pasiekti su 50 % TiterMax Gold, sekantys po trijų injekcijų su 10 pg antigeno, sumaišyto 1:1 t/t su 10 pg MCP-1 antigeno alūnų gelyje, ir po to galutinis padidėjimas 10 pg antigeno PBS. Ypatingai, kiekviena pelė buvo imunizuojama injekuojant po oda į papadę. Gyvūnai buvo imunizuojami dienomis: 0, 4, 7, 10, 14, 18, 27, 31, 35 ir 42. Gyvūnams 13 ir 26 dieną buvo nuleistas kraujas serumo išskyrimui ir selekcijos atlikimui, kaip aprašyta žemiau.

lentelė

Gru pė	Kamie nas	Pel ės Nr.	1-ma injekcija	2-as padidini mas	3-as padidini mas	4-as padidini mas	Kraujo nuleidi mas	5-as padidini mas	6-as padidini mas
1	xmg2	7	10 pg/pelei	5 pg/pelei	5 pg/pelei	5 pg/pelei		5 pg/pelei	5 pg/pelei
2	3C-1	7	10 pg/pelei	5 pg/pelei	5 pg/pelei	5 pg/pelei		5 pg/pelei	5 pg/pelei
3	3C-1 x xmg2	7	10 pg/pelei	5 pg/pelei	5 pg/pelei	5 pg/pelei		5 pg/pelei	5 pg/pelei
			TiterMa x	Alūnų gelis	Alūnų gelis	Alūnų gelis		Alūnų gelis	TiterMa X
Die nos			0	4	7	10	13	14	18

lentelės tęsinys

Gru Pė	Kamie nas	Kraujo nuleidi mas	7-as padidini mas	8-as padidini mas	9-as padidini mas	10-as padidini mas	Sulieji mas
1	xmg2		10 pg/pelei	10 pg/pelei	10	10 pg/pelei
2	3C-1		10 pg/pelei	10 pg/pelei	10 pg/pelei	10 pg/pelei
3	3C-1 x xmg2		10 pg/pelei	10 pg/pelei	10 pg/pelei	10 pg/pelei
			Alūnų gelis	Alūnų gelis	Alūnų gelis	D-PBS
Die nos		26	27	31	35	42	46

Panašiai kitos XenoMouse® pelės (XenoMouse® kamienai XMG2 ir XMG2L3) buvo nuosekliai imunizuotos pagal planą parodytą 3 lentelėje.

lentelė

Gru Pė	Kamie nas	Pel ės Nr.	l-ma injekcija	2-as padidini mas	3-as padidini mas	4-as padidini mas	Kraujo nuleidi mas	5-as padidini mas	6-as padidini mas
4	xmg2	4	10 pg/pelei	10 pg/pelei	10 pg/pelei	10 pg/pelei		10 pg/pelei	10 pg/pelei
5	Xmg2 L3	4	10 pg/pelei	10 pg/pelei	10 pg/pelei	10 pg/pelei		10 pg/pelei	10 pg/pelei
			TiterMa X	Alūnų gelis	Alūnų gelis	Alūnų gelis		Alūnų gelis	Alūnų gelis
Die nos			0	3	6	10	13	14	17

lentelės tęsinys

Gru Pė	Kamienas	Pelės Nr.	Suliejimas
4	xmg2	4
5	xmg2L3	4
Die nos			21

Anti-MCP-1 antikūno titras buvo nustatytas netiesiogine ELISA. Titro reikšmė yra atvirkštinė didžiausiam serumo praskiedimui su dvigubu OD rodmenimi, kaip pagrindas. Trumpai, MCP-1 (84 narių; 1 pg/ml) buvo padengtas ant Costar Labcoat Universal Binding Polystyrene 96 šulinėlių plokštelės per naktį prie keturių laipsnių. Tirpalas turintis nesurištą MCP-1 buvo pašalintas ir plokštelės buvo veikiamos UV šviesa (365 nm) 4 minutes (40000 mikrodžauliai). Plokštelės buvo 5 kartus plaunamos dH₂O. XenoMouse® serumas iš MCP-1 imunizuotų gyvūnų, arba sveikų XenoMouse® gyvūnų buvo titruotas 2 % pienas/PBS, esant praskiedimui 1:2 atitinkančiam iš 1:100 pradinio praskiedimo. Paskutinis šulinėlis buvo paliktas tuščias. Plokštelės buvo plautos penkis kartus dH₂O. Ožkos anti-žmogaus IgG Fc-specifinis HRP-konjuguotas antikūnas buvo pridėtas galinėje koncentracijoje 1 pg/ml 1 vai. esant kambario temperatūrai. Plokštelės buvo plautos penkis kartus dH₂O. Plokštelės buvo išryškintos pridedant TMB 30 min. Ir ELISA sustabdyta, pridedant 1 M fosforo rūgšties. Individualių XenoMouse® gyvūnų specifinis titras buvo nustatytas iš optinio tankio prie 450 nm ir parodytas 1, 5, 6, 7 ir 8 lentelėse. Titras atitinka atvirkštiniam serumo praskiedimui ir todėl aukščiausias skaičius didžiausiam humoraliniam imuniniam atsakui į MCP-1. Visų imunizuotų XenoMouse® gyvūnų limfiniai mazgai buvo surinkti suliejimui.

lentelė grupė, papadė, xmg2, 7 pelės

	Kraujo nuleidimas 13-ą dieną po 4 injekcijų	Kraujo nuleidimas 26-ą dieną po 6 injekcijų	Suliejimas 46-ą dieną po 10 injekcijų
Pelė ID	Reaktyvumas prieš MCP-1 Titrai per hlgG
N160-1	1000	73000	300000
N160-2	6500	600000	600000
N160-3	2300	250000	125000
N160-4	1400	125000	75000
N160-5	4000	200000	225000
N160-6	250	2400	18000
N160-7	60	1600	35000
NC	175	<100	200

	5 lentelė
1 erupė, papadė, 3 c-1, 7 pelės
	Kraujo nuleidimas 13-ą dieną po 6 injekcijų	Suliejimas 46-ą dieną po 10 injekcijų
Pelės ID	Reaktyvumas prieš MCP-1 Titrai per hlgG
M724-1	35000	24000
M724-3	8000	7500
M724-5	8000	20000
N600-4	9000	7500
N600-5	1800	75000
N600-6	2200	20000
N600-7	8000	25000
NC	<100	<100

lentelė grupė, papadė, 3c-l/xmg2(Fl), 7 pelės

	Kraujo nuleidimas 13-ą dieną po 4 injekcijų	Kraujo nuleidimas 26-ą dieną po 6 injekcijų	Suliejimas 46-ą dieną po 10 injekcijų
Pelės ID	Reaktyvumas prieš MCP-1 Titrai per hlgG
M219-1	50	2200	8000
M219-2	<100	9000	18000
M246-3	800	7000	18000
M246-5	850	18000	65000

M246-9	<100	18000	55000
M344-6	<100	800	12000
M344-10	<100	6000	25000
NC	200	225	175

lentelė grupė, XMG2, papadė, 4 pelės

	Kraujo nuleidimas 13-ą dieną po 4 injekcijų	Kraujo nuleidimas injekcijų	21-ą dieną po 6
Žmogaus MCP-1	Žmogaus MCP-1	Žmogaus MCP-1	Žmogaus MCP-1
Pelė ID	Reaktyvumas prieš MCP-1 Titrai per hlgG	Reaktyvumas prieš MCP-1 Titrai per hL	Reaktyvumas prieš MCP-1 Titrai per hlgG	Reaktyvumas prieš MCP-1 Titrai per hL
N493-1	<100	<100	2500	<100
N493-2	<100	<100	1000	<100
N493-3	300	<100	4500	<100
N493-4	800	<100	10000	<100
NC	900	100	600	<100
*PC	8000		3000

lentelė grupė, XMG2L3, papadė, 4 pelės

	Kraujo nuleidimas po 4 injekcijų	Kraujo nuleidimas pc	6 injekcijų
Žmogaus MCP-1	Žmogaus MCP-1	Žmogaus MCP-1	Žmogaus MCP-1
Pelė ID	Reaktyvumas prieš MCP-1 Titrai per hlgG	Reaktyvumas prieš MCP-1 Titrai per hL	Reaktyvumas prieš MCP-1 Titrai per hlgG	Reaktyvumas prieš MCP-1 Titrai per hL
N259-12	300	300	2000	700
N259-14	100	400	2500	650
N269-2	700	200	2800	500
N263-3	900	900	24000	8000
NC	900	100	600	<100
*PC	8000		3000
*4-8	entelėse, NC (neigiama	controlė) = XMG2 KLH 1 grupė, papadė L627*6

PC (teigiama kontrolė) = XMG2 MCP-1 1 grupė, papadė N160-1

Limfocitų atstatymas, B ląstelių išskyrimas, suliejimas ir hibridomų generavimas. Imunizuotos pelės buvo skerdžiamos pagal kaklo dislokaciją ir limfiniai mazgai surenkami iš kiekvienos grupės. Limfoidinės ląstelės atskiriamos sutrinant DMEM, kad ląstelės būtų išlaisvintos iš audinių ląstelės būtų suspenduotos DMEM. Ląstelės buvo suskaičiuotos, ir į ląstelių nuosėdas prideėta 0,9 ml DMEM 100-ui milijonų limfocitų, ląstelės buvo atsargiai, bet pilnai suspenduotos. Naudojant 100 μΐ CD90⁺ magnetinių rutuliukų 100-ui milijonų ląstelių, ląstelės buvo pažymėtos ., _u . LT 5416 B inkubuojant su magnetiniais rutuliukais 15 min. prie 4 C. Magnetiškai pažymėta ląstelių suspensija , turinti iki 10⁸ teigiamų ląstelių (arba iki 2x10⁸ ląstelių iš viso) buvo užnešta ant LS+ kolonėlės ir kolonėlė plauta su DMEM. Ištekantis skystis buvo surinktas kaip CD90 neigiama frakcija (dauguma šių ląstelių yra B ląstelės).

P3 mielomos ląstelės ir B ląstelėmis praturtintos limfinių mazgų ląstelės buvo sumaišytos santykiu 1:1 (mieloma : limfiniai mazgai) 50 ml kūgio pavidalo mėgintuvėlyje DMEM. Sumaišytos ląstelės buvo centrifuguojamos prie 800xg (2000 aps.) 5-7 minutes ir supematantas tuojau pašalinamas nuo susidariusių nuosėdų. Buvo pridedama du arba keturi ml pronazės tirpalo (CalBiochem, Kat. Nr.53702; 0,5 mg/ml PBS) ir ląstelių nuosėdos atsargiai resuspenduojamos. Fermentui buvo leidžiama veikti ne ilgiau, kaip dvi minutes ir reakcija stabdoma pridedant 3-5 ml FBS. Pakankamai ECF tirpalo buvo pridėta iki bendro tūrio 40 ml ir mišinys centrifuguojamas prie 800xg (2000 aps.) 5-7 minutes. Supematantas pašalintas ir ląstelių nuosėdos atsargiai resuspenduotos mažame ECF tūryje, pakankamame, kad bendras tūris būtų 40 ml. Ląstelės buvo gerai sumaišomos ir suskaičiuojamos, po to centrifuguojamos prie 800xg (2000 aps.) 5-7 minutes. Supematantas pašalintas ir ląstelės resuspenduojamos mažame ECF tirpalo tūryje. Buvo pridedamas tam tikras tūris ECF tirpalo, kad būtų suderinta koncentracija iki 2x10⁶ ląstelių/ml.

Po to ląstelės buvo patalpintos į Electro-Cell-Fusion (ECF) generatorių (Modelis ECM2001, Genetronic, Ine., San Diego, CA) ir sulietos pagal gamintojų instrukcijas. Po ECF, ląstelių suspensija atsargiai pašalinta iš suliejimo kameros, esant sterilioms sąlygoms, ir perkeltos į sterilų mėgintuvėlį, turintį tą patį tūrį Hybridoma Medium DMEM. Ląstelės buvo inkubuotos 15-30 minučių prie 37 °C, po to centrifuguotos prie 400xg (1000 aps) penkias minutes. Ląstelės buvo atsargiai resuspenduotos mažame tūryje Vi HA terpės (1 flakonas 50Χ HA Sigma, Kat. Nr. A9666 ir 1 litras Hybridoma Medium) ir tūris atitinkamai pakoreguotas su daugiau 'Λ HA terpės (remiantis tuo, kad 5x106 B ląstelių 96 šulinėlių plokštelei ir 200 μΐ/šulinėliui). Ląstelės buvo gerai sumaišomos, pipete užnešamos į 96 šulinėlių plokšteles ir auginamos. 7-tą arba 10-tą dieną pusė terpės buvo pašalinta ir ląstelės iš naujo pamaitintos /2 HA terpe.

Tiriamų antikūnų atrinkimas ELISA-ai. Po 14 dienų auginimo, hibridomos supematantas buvo tikrinamas dėl MCP-1 specifinių monokloninių antikūnų. ELISA plokštelės (Fisher, Kat. Nr. 12-565—136) buvo padengtos 50 μΐ/šulinėbui MCP-1 (2 pg/ml) padengimo buferyje (0,1 M karbonatinis buferis, pH 9,6, NaHCCb 8,4 g/1), po to inkubuojamos per naktį prie 4 °C. Po inkubavimo ląstelės buvo tris kartus plaunamos plovimo buferiu (0,05 % Tvveen 20 PBS). Buvo pridėta 200 μΐ/šulinėliui blokavimo buferio (0,5 % BSA, 0,1 % Tvveen 20, 0,01 % Thimerosal 1kartiniame PBS) ir ląstelės inkubuotos kambario temperatūroje 1 valandą. Po inkubavimo plokštelės tris kartus plaunamos plovimo buferiu. 50 μΐ/šulinėliui hibridomos supematantas ir teigiama bei neigiama kontrolė buvo pridedama ir plokštelės inkubuojamos kambario temperatūroje 2 valandas.

Teigiama kontrolė visą laiką buvo XMG2 MCP-1 1 grupė, imunizuota į papades N160-7 ir neigiama kontrolė buvo XMG2 KLH 1 grupė, imunizuota į papades L627-6. Po inkubacijos plokštelės buvo tris kartus plaunamos plovimo buferiu. 100 μΐ/šulinėliui nustatomo antikūno ožkos anti žmogaus IgGfc-HRP (Caltag, Kat. Nr. H10507), (ir ožkos anti-hlgkappa-HRP (Southern Biotechnology, Kat. Nr. 2060-05) ir ožkos anti-hlglambda (Southern Biotechnology, Kat. Nr. 2070-05) antriniame patikrinime) buvo pridėta ir plokštelės inkubuotos kambario temperatūroje 1 valandą. Antriniame patikrinime buvo patikrinti trys pavyzdžių rinkiniai (teigiami pirmame patikrinime), vienas rinkinys dėl hlgG nustatymo, vienas rinkinys dėl hKappa nustatymo ir vienas rinkinys dėl hlambda nustatymo. Po inkubavimo plokštelės tris kartus buvo plaunamos plovimo buferiu. Buvo pridėta 100 μΐ/šulinėliui TMB (BioFX Lab. Kat. Nr. TMSK-0100-01) ir plokštelėms leista vystytis maždaug 10 minučių (iki neigiamos kontrolės šulinėliai vos tik pradės rodyti spalvą), po to pridėta 50 μΐ/šulinėliui stop tirpalo (TMB Stop Solution (BioFX Lab. Kat. Nr. STPR-0100-01) ir plokštelės skaitomos ELISA plokštelių skaitytuvu esant bangos ilgiui 450 nm. Teigiamų šulinėlių OD reikšmės pateiktos 9 lentelėje.

lentelė

mAb klonas	ELISA ODMCP-1	IC50 Ca++ srautas (pg/ml)	IC50 chemotaksis (ųg/ml)	Giminingumas (pMol)	Kryžminis reaktyvumas
1.1.1	3,638	0,24+0,034	0,27+0,034	2,7
1.2.1	3,466	0,18+0,008	0,24+0,034	77
1.3.1	4	0,12+0,012	0,24+0,059	55
1.4.1	4	0,11+0,005	0,51+0,035	96
1.5.1	0,51	0,21+0,027	0,34+0,054	4,2
1.5.1	3,918	1+0,24	12+5,8	228
1.7.1	3,521	0,11+0,013	0,35+0,064	4,9
1.8.1	3,472	0,26+0,076	0,88+0,21	4
1.9.1	3,6561	1,2+0,38	35+54	96
1.10.1	3,845	0,18+0,11	1,2+0,55	9,6
1.11.1	3,905	0,098+0,008	0,81+0,24	4,2
1.12.1	4	0,13+0,02	0,35+0,039	13
1.13.1	4	0,11+0,015	0,5+0,091	71
1.14.1	2,064	0,41+0,1	0,58+0,18	6
1.18.1	0,9984	0,18+0,055	0,29+0,07	3,8
2.3.1	3,876	0,14+0,021	0,58+0,085	96
2.4.1	3,892	0,26+0,18	>5	14	pelės JE
3.2	3,96			N D	MCP-2, MCP-3, eotaksinas

3.4.1	3,86	0,24+0,019	0,51+0,1	45
3.5.1	3,765	0,58+0,29	3,1+1,1	100
3.6.1	3,593	0,17+0,04	0,52+0,18	15
3.7.1	4	0,094+0,023	0,98+0,019	4,8
3.8.1	3,603	0,27+0,0280	0,7+0,19	3,4
3.10.1	3,634	0,3+0,4	0,25+0,1	90	MCP-2, MCP-3 eotaksinas
3.11.1	4	0,092+0,023	0,33+0,47	3,3	MCP-2, MCP-3, MCP-4, eotaksinas
3.14.1	4	1,3+0,3	1,4+0,47	ND
3.15.1	4	0,12+0,034	0,89+0,1	3,4
3.16.1	3,921	0,16+0,08	0,4+0,081	25
4.5.1	3,38	0,27+0,74	0,75+0,18	61
4.6.1	3,51	0,31+0,06	0,4+0,056	330
4.7.1	3,843	0,390,063	0,45+0,11	280
4.8.1	4	0,22+0,77	0,29+0,032	102
4.9.1	3,415	0,083+,0094	0,21+0,035	ND
5.1	4	3,5+2,1	1,3+1,2	1610
5.2.1	3,714	2,5+0,66	2,1+1,7	319	rantės
5.3.1	4	1,8+0,56	2,6+0,31	450

ND = neatlikta

Anti-MCP-1 antikūnų biologinio aktyvumo charakterizavimas.

MCP-1 bioaktyvumo neutralizavimas anti- MCP-1 antikūnų-FLIPR būdu. DMSO ir pliuroninė rūgštis (20 % DMSO tirpalas) buvo pridėta į flakoną Fluo-4 (molekuliniai pavyzdžiai), kad būtų gauta galutinė 5 mM Fluo-4 koncentracija. THP-1 ląstelės buvo resuspenduotos pašildytame (37 °C) paleidimo buferyje prie 3x10 e6/ml ir pridėta 1 μΐ Fluo-4 dažų vienam ml ląstelių iki galinės dažo koncentracijos 5 μΜ. Ląstelės buvo inkubuotos tamsoje prie 37 °C 45-50 minučių. Po inkubavimo ląstelės buvo centrifuguotos prie 1000 aps. 5-10 min. Ląstelės buvo resuspenduotos prie 1,667 e6/ml. Esant 200000 ląstelių/šulinėlyje koncentracijai, ląstelės buvo dedamos ant 96 šulinėlių plokštelės ir atsargiai centrifuguojamos. Užrašius pagrindiniu parodymus, antrieji rodmenys buvo užrašyti po nuoseklaus pridėjimo 3,5 nM MCP-1 esant arba nesant anti-MCP-1 antikūnų įvairioms koncentracijoms. Pridėjus MCP-1 į THP-1 ląsteles, pakyla viduląstelinis kalcis, vedantis į Fluo-4 dažo fluorescavimo intensyvumo sustiprėjimą. Pridėjus didėjančią koncentraciją neutralizuojančio antikūno, fluorescuojančio dažo intensyvumas ląstelėje mažėjo, tuomet reiškė, kad tiriamas antikūnas buvo neutralizuojamas. Išskiriamo antikūno koncentracija 50 % sumažino MCP-1 indukuotos fluorescencijos intensyvumą, kaip pavaizduota 9 lentelėje.

MCP-1 indukuotos ląstelių migracijos nuslopinimas. 96 šulinėlių chemotaksio automatizuotas bandymas buvo išvystytas naudojant THP-1 ląsteles ir Beckman Biomek F/X automatinę sistemą. Naudojant specialiai pritaikytą 96 šulinėlių plokštelę, įrėmintas filtras su su filtro membrana, surištas su tvirtu rėmu, buvo nukreiptas į NeuroProbe 96 šulinėlių vienkartinę mikroplokštelę su šulinėlių tūriu arba 30 μΐ arba 300 μΐ ir porų diametru svyruojančiu tarp 2-14 pm. Neuroprobe 96 šulinėlių plokštelė suteikia giluminius šulinėlius MCP-1 chemotaksio ir kitų reagentų išdėstymui, tokių kaip anti-MCP-1 antikūnai, ląstelių migracijos bandyme. Viršutiniai šulinėliai nebuvo reikalingi, kadangi įrėminti filtrai buvo padengti hidrofobine kauke, kuri izoliuoja kiekvieną ląstelių suspensijos pavyzdį nuo viršutinės filtro pusės.

Optimalios sąlygos šiam bandymui buvo: 100000 ląstelių/šulinėlyje su 90 min inkubacija prie 37 °C. THP-1 ląstelių suspensijos, kurios buvo iš anksto pakrautos dažais iš Molecular Probes, buvo pipete užneštos tiesiog ant apatinės filtro pusės ir inkubuotos prie 37 °C 1-2 valandas. Po inkubacijos ląstelės, kurios migravo į filtro apačią ir į mikroplokštelę buvo suskaičiuotos ir patalpinant mikroplokštelę į FMAT, įsigytą iš Applied Biosystems.

MCP-1 indukuota ląstelių migracija prieš THP-1 ląsteles ir maksimali ląstelių migracija buvo pasiekta prie lnM esant 10-15-kartiniui signalo santykiui su triukšmu. Naudojant bet kokį hibridomos supernatantą arba šviežią hibridomos terpę buvo nustatyta MCP-1 priklausoma migracija. Bandymo variantiškumas buvo minimalus (C.V~15). Migruojančių į filtro apačią ląstelių skaičius mažėjo nuo dozės priklausomu būdu, jeigu antikūnai prieš MCP-1 buvo įtraukti su chemotaksiu.

Anti-MCP-1 antikūno giminingumo nustatymas, naudojant Biacore analizę. Antikūnas/MCP1 sąveikos analizė buvo atlikta prie 25 °C, naudojant du CM5 čipus, sujungtus į Biacore 3000 optinį biosensorių. Individualios tekančios ląstelės ant kiekvieno čipo buvo aktyvuotos 7-minute NHS/EDC injekcija, karbohidratas buvo sujungtas per NHS esterį, naudojant 7-minutę injekciją ir galutinai aktyvuotos grupės buvo blokuotos 7-minute etanolamino injekcija. Kiekvieno antikūno monosacharido liekanos buvo oksiduotos, naudojant 1 mM natrio perjodatą 100 mM-iame natrio acetate, pH 5,5 prie 4 °C 30 min. Oksiduotas antikūnas buvo demineralizuotas į 10 mM natrio acetatą, pH 5,0, kad būtų sujungtas antikūnas su karbohidrazidu modifikuotu paviršiumi. mAb paviršius buvo stabilizuotas susilpninant hidrazono jungtį su 0,1 M natrio cianoborohidratu. Antigeno/antikūno sąveika buvo tiriama injekuojant 0, 0,049, 0,15, 0,4, 1,3, 4 ir 12 nM MCP-1 (Peprotech, N. J.) elektroforezės buferyje (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,005 % paviršinio aktyvumo medžiagos, 200 pg/ml BSA, pH 7,4). Paviršius buvo regeneruotas 12-sekundiniu impulsu 15 mM H3PO4. Antigeno/antikūno sąveika buvo tiriama injekuojant dvigubus antigeno pavyzdžius, praskiestus elektroforezės buferiu (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,005 % paviršinio aktyvumo medžiagos, 200 pg/ml BSA, pH 7,4), 300-kartiniame koncentracijos diapazone. Paviršius buvo regeneruotas 12-sekundiniu impulsu 15 mM H3PO4· Norint nustatyti kiekvienos sąveikos kinetiką, duomenų rinkiniai buvo visuotinai pritaikyti prie sąveikos modelio 1:1, kuris apima masės pernešimo parametrus. Išskaičiuoti sąveikos giminingumai pateikti 9 lentelėje.

Anti-MCP-1 antikūnų kryžminio reaktyvumo nustatymas su kitais chemokinais. ELISA plokštelės (Fusher Kat. Nr. 12-565-136) buvo padengtos su 50 μΐ/šulinėliui MCP-1, MCP-2, MCP3, MCP-4, RANTĖS, GRO-alfa, MIP-1 alfa eotaxin, žiurkių MCP-1 ir pelių JE (2 pg/ml) padengimo buferyje (0,1 M karbonatinis buferis, pH 9,6, NaHCCb 8,4 g/1), po to inkubuotos per naktį prie 4 °C. Po inkubacijos plokštelės buvo praplautos plovimo buferiu (0,05 % Tween 20 PBS) tris kartus. Buvo pridėta 200 pl/šulinėliui blokuojančio buferio (0,5 % BSA, 0,1 % Tween 20, 0,01 % Thimerosal 1-kartiniame PBS) ir plokštelės inkubuotos kambario temperatūroje 1 valandą. Po inkubacijos plokštelės buvo praplautos plovimo buferiu tris kartus. 50 pl/šulinėliui hibridomos supematantas ir buvo pridėta teigiama bei neigiama kontrolės (teigiama kontrolė buvo anti-MCP-1 antikūnas, pirktas iš R&D Sciences, ir neigiama kontrolė buvo antikūnas prieš sraigės limfos hemocianiną, produkuotas Abgenix) ir plokštelės inkubuotos kambario temperatūroje 2 valandas. Po inkubacijos plokštelės buvo praplautos plovimo buferiu tris kartus. Buvo pridėta 100 pl/šulinėliui nustaomo ožkos antikūno anti-huIgGfc-HRp (Caltag, Kat. Nr. H10507), (ožkos antihlgkappa-HRP (Southern Biotechnology, Kat. Nr. 2060-05) ir ožkos anti-hlglambda (Southern Biotechnology, Kat. Nr. 2070-05) antriniame tikrinime) ir plokštelės buvo inkubuotos kambario temperatūroje 1 valandą. Po inkubacijos plokštelės buvo praplautos plovimo buferiu tris kartus ir pridėta 100 pl/šulinėliui TMB (BioFX Lab. Kat. Nr. TMSK-0100-01) ir plokštelėms leista vystytis apie 10 minučių. Tuo metu buvo pridėta 50 pl/šulinėliui stop tirpalo (TMB Stop Solution (BioFX Lab. Kat. Nr. STPR-0100-01) ir plokštelės skaitomos ELISA plokštelių skaitytuvu esant bangos ilgiui 450 nm. Rezultatai pavaizduoti 10 lentelėje rodo, kad kai kurie anti-MCP-1 antikūnai kryžmiškai reaguoja su giminigais chemokinais.

lentelė

mAb	rmJE/MCP-1 2 pg/ml	Žiurkių MCP-1 1 pg/ml	rhMCP-2 2 pg/ml	rhMCP-3 2 pg/ml	rhMCP-4 2 pg/ml
1.1.1	0,045	0,051	0,051	0,064	0,052
1.2.1	0,041	0,044	0,056	0,048	0,055
1.3.1	0,046	0,048	0,065	0,052	0,048
1.4.1	0,042	0,05	0,046	0,049	0,045
1.5.1	0,043	0,045	0,047	0,069	0,05
1.6.1	0,042	0,062	0,042	0,046	0,044
1.7.1	0,041	0,042	0,044	0,053	0,041
1.8.1	0,045	0,049	0,048	0,054	0,046
1.9.1	0,053	0,065	0,04	0,044	0,042
1.10.1	0,041	0,059	0,04	0,047	0,052
1.11.1	0,041	0,052	0,041	0,043	0,043

1.12.1	0,042	0,062	0,042	0,046	0,044
1.13.1	0,043	0,06	0,046	0,047	0,045
1.14.1	0,042	0,062	0,042	0,046	0,044
1.18.1	0,044	0,058	0,04	0045	0,045
2.3.1	0,054	0,058	0,052	0,059	0,064
2.4.1	0,129	0,077	0,045	0,066	0,06
3.4.1	0,044	0,053	0,042	0,05	0,047
3.5.1	0,042	0,053	0,042	0,045	0,044
3.6.1	0,047	0,046	0,052	0,045	0,048
3.7.1	0,046	0,048	0,043	0,048	0,048
3.8	0,042	0,062	0,042	0,046	0,044
3.10.1	0,054	0,045	0,845	0,167	0,042
3.11.1	0,063	0,057	0,336	1,317	0,981
3.14.1	0,044	0,046	0,045	0,05	0,045
3.15.1	0,041	0,05	0,043	0,046	0,051
3.16.1	0,042	0,046	0,049	0,043	0,043
4.5.1	0,049	0,055	0,042	0,046	0,046
4.6.1	0,049	0,05	0,047	0,05	0,047
4.7.1	0,042	0,062	0,042	0,046	0,044
4.8.1	0,042	0,091	0,041	0,043	0,039
4.9.1	0,05	0,05	0,046	0,049	0,05
5.1	0,044	0,054	0,051	0,05	0,043
5.2.1	0,04	0,054	0,041	0,048	0,041
5.3.1	0,05	0,047	0,043	0,045	0,043
3.2 (neat)	0,059	0,07	0,535	0,449	0,041
ne	0,042	0,134	0,045	0,084	0,074
pę	0,263	ND	ND	1,084	0,215
10 lentelės tęsinys	Teigiama kontrolė
mAb	hGRO/MGSA 1 pg/ml	hMIP-l-alfa 1 pg/ml	hŽIURKIŲ 1 pg/ml	heotaksino 1 pg/ml	hMCP- l(MCAF) 2 pg/ml
1.1.1	0,047	0,044	0,044	0,042	0,944
1.2.1	0,044	0,04	0,04	0,044	1,159
1.3.1	0,051	0,049	0,049	0,046	1,158
1.4.1	0,044	0,041	0,046	0,043	0,738
1.5.1	0,048	0,041	0,049	0,043	1,178
1.6.1	0,046	0,046	0,046	0,042	0,375
1.7.1	0,041	0,04	0,039	0,04	1,17
1.8.1	0,06	0,045	0,045	0,047	1,159
1.9.1	0,043	0,044	0,042	0,042	0,446
1.10.1	0,043	0,043	0,042	0,05	1,259
1.11.1	0,042	0,042	0,042	0,049	1,336
1.12.1	0,046	0,046	0,046	0,044	0,933
1.13.1	0,046	0,042	0,046	0,044	1,16
1.14.1	0,046	0,046	0,046	0,042	1,129
1.18.1	0,049	0,043	0,04	0,043	1,228
2.3.1	0,062	0,067	0,055	0,045	0,087

2.4.1	0,048	0,061	0,046	0,084	0,462
3.4.1	0,065	0,055	0,046	0,048	1,153
3.5.1	0,048	0,047	0,044	0,043	0,194
3.6.1	0,047	0,047	0,043	0,043	0,342
3.7.1	0,045	0,049	0,067	0,043	1,276
-3.8	0,046	0,046	0,046	0,042	0,275
3.10.1	0,042	0,043	0,04	0,306	0,71
3.11.1	0,054	0,053	0,064	0,339	0,803
3.14.1	0,046	0,046	0,045	0,043	0,549
3.15.1	0,044	0,045	0,049	0,045	0,948
3.16.1	0,043	0,043	0,042	0,043	0,633
4.5.1	0,045	0,046	0,049	0,041	0,957
4.6.1	0,046	0,055	0,053	0,049	0,686
4.7.1	0,046	0,046	0,046	0,042	0,744
4.8.1	0,042	0,041	0,044	0,043	1,136
4.9.1	0,043	0,049	0,057	0,045	0,822
5.1	0,044	0,043	0,043	0,042	0,521
5.2.1	0,045	0,043	0,262	0,043	0,663
5.3.1	0,045	0,042	0,045	0,042	0,272
3.2 (neat)	0,042	0,041	0,043	0,194	0,235
ne	0,357	0,065	0,072	0,063	0,042
Pc	1,075	0,794	1,219	0,221	0,281

Apdangalas: Ag @ 2 pg/ml arba 1 pg/ml; 0/N

Ak: MCP-1 išvalyti klonai 1:50

Pc: 1 pg/ml; ne: D39,2 IL8 @ 1 pg/ml

Nustatyti pavyzdžiai su gxhG-Fc HRP 1:2K; kontrolės su mišiniu xm!gGl, 2a, 2b, 3 1:1K

Norint nustatyti kuris anti-MCP-1 antikūnas 3.11.2 gali blokuoti kitų šeimos narių funkciją, buvo atliktas migracijos bandymas, kaip aprašyta aukščiau. Pirmiausiai buvo nustatytas THP-1 monocitų gebėjimas migruoti į atsaką prieš MCP-1, MCP-2, MCP-3 ir MCP-4. MCP-1, -2 ir -3 efektyviai indukuoja THP-1 ląstelių migraciją, bet MCP-4 buvo neaktyvus šiame bandyme (žiūr. 1 figūrą). Jeigu 3.11.2 antikūnas buvo pridėtas į šulinėlio apatinę pusę kintamomis koncentracijomis, THP-1 ląstelių sugebėjimas migruoti į atsaką prieš MCP-2 ir MCP-3 buvoinhibuotas nuo dozės priklausomu būdu (2 ir 3 figūros).

PAVYZDYS

MCP-1 epitopu kartografavimas

Monocitų chemotaksio baltymas-1 (MCP-1) yra beta chemokinų šeimos narys, kuris veikia specifinius septynis transmembraninius receptorius, kad sugautų monocitus, bazofilus ir T limfocitus uždegimo vietoje. Antigenas, 76 aminorūgščių liekana yra neglikozilinta ir turi numatytą 8,7 kD molekulinę masę. Žmogaus MCP-1, ekspresuotas E. coli, buvo pirktas iš R&D Nr. 279MC/CF. Beždžionių MCP buvo ekspresuotas 293F ląstelėse ir trys beždžionių MCP-1 variantai buvo naudojami analizuoti, kaip nustatyti aminorūgščių pakeitimai veikia susirišimo giminingumą kiekvienam individualiam mAb.

Sekų analizė parodė, kad antikūnai dalinasi į penkias klases. Didžiausia klasė apima 28 antikūnus labai susijusius pagal jų panaudojimą iš VH1-24, iš kurių 24 taip pat naudoja Vk geną B3. Klasė susidedanti iš trijų antikūnų naudoja VH6-1 geną, du iŠ kurių naudoja Vk B3. Trys kitos klasės reprezentuotos antikūnu kiekviena , naudojant VH1-2, VH3-33 ir VH4-31, iš kurių du iš jų mAb naudoja Vk08 geną. Reikėtų atkreipti dėmesį, kad antikūnų vardai prasidedantys 1, 2, 3 arba 4 atspindi skirtingus hibridomos suliejimus iš nepriklausomų XenoMouse® pelių būrių. Taigi, šie monokloniniai antikūnai atsirado iš nepriklausomų B ląstelių linijų, subrendusių nepriklausomai pirminio arba antrinio imuninio atsako metu XenoMouse® pelėse. Dėl nepriklausomybės, nukleotidų ir aminorūgščių sekos panašumo VH ir Vk antikūnų genai panašiai atspindi konverguojančią evoliuciją ir selekciją panašių kintamų sričių struktūrų, kurios gali prisirišti ir potencialiai neutralizuoti MCP-1 (žiūr. 11 lentelę).

lentelė

Pavyzdžiai	Izotipas	VH	DH	JH	VK	JK	Epitopas
1.1.1	γ2/κ	VH1-24	D3-3(17)	JH4b	VK-B3	JK1	Konform.
1.2.1	γ2/κ	VH1-24	D3-3(17)	JH4b	VK-L5	JK1	Linijinis
1.3.1	γ2/κ	VH1-24	D3-3(15)	JH4b	VK-B3	JK1	Konform.
1.4.1	γ2/κ	VH6-1	D1-26	JH4b	VK-A2	JH4	Linijinis
1.5.1	γ2/κ	VH1-24	D3-3(17)	JH4b	VK-B3	JK1	Linijinis
1.6.1	γ2/κ	VH1-24	D 1-26( 18)	JH3b	VK-A10	JK4	Konform.
1.7.1	γ2/κ	VH1-24	D3-3(17)	JH4b	VK-B3	JK1	Konform.
1.8.1	γ2/κ	VH1-24	D3-3(17)	JH4b	VK-B3	JK1	Linijinis
1.9.1	γ2/κ	VH1-24	D5-12(13)	JH4b	VK-B3	JK1	Nesurišta
1.10.1	γ2/κ	VH1-24	D3-3(17)	JH4b	VK-B3	JK1	Linijinis
1.11.1	γ2/κ	VH1-24	D3-3	JH4B	VK-B3	JK1	Linijinis
1.12.1	γ2/κ	VH1-24	D3-3(16)	JH4b	VK-B3	JK1	Konform.
1.13.1	γ2/κ	VH1-24	D3-3(17)	JH4b	VK-B3	JK1	Linijinis
1.14.1	γ2/κ	VH6-1	D1-26	JH6b	VK-B3	JK1	Linijinis
1.18.1	γ2/κ	VH1-24	D3-3(15)	JH4b	VK-B3	JK4	Linijinis
2.3.1	γ4/κ	VH1-24	D3-3(16)	JH4b	VK-B3	JK2	Nesurišta
3.2	γ2/κ	VH1-24	D3-3(17)	JH4b	VK-L16	JK4	Konform.
2.4.1	γ4/κ	VH1-2	D6-13(15)	JH4b	VK-08	JK5	Nesurišta
3.4.1	γ2/κ	VH1-24	D3-3(16)	JH4b	VK-B3	JK1	Linijinis
3.5.1	γ4/κ	VH1-24	D3-3(17)	JH4b	VK-B3	JK1	Nesurišta
3.6.1	γ4/κ	VH1-24	D3-307)	JH4b	VK-B3	JK1	Nesurišta
3.7.1	γ2/κ	VH1-24	D3-3(16)	JH4b	VK-B3	JK1	Konform.
3.8	γ4/κ	VH1-24	D3-3	JH4B	VK.-B3	JK1	Nesurišta
3.10.1	γ4/κ	VH1-24	D3-902)	JH6b	VK-A30	JK3	Konform.
3.11.1	γ4/κ	VH4-3 1	D2-210O)	JH3b	VK-08	JK2	Konform.
3.14.1	γ4/κ	VH6-1	D1-26	JH6B	VK-B3	JK1	Konform.
3.15.1	γ4/κ	VH1-24	D5-1203)	JH4b	VK-B3	JK1	Linijinis
3.16.1	γ4/κ	VH1-24	D3-3(17)	JH4b	VK-B3	JK1	Konform.

4.5.1	γ2/κ	VH1-24	D3-3(16)	JH4b	VK-B3	JK1	Konform.
4.6.1	γ2/κ	VH1-24	D3-3	JH3B	VK-B3	JK1	ND
4.7.1	γ2/κ	VH1-24	D3-3(16)	JH4b	VK-B3	JK1	Konform.
4.8.1	γ2/κ	VH1-24	D3-3	JH4b	VK-B3	JK1	Konf.
4.9.1	γ2/κ	ND	ND	ND	ND	ND	Konf.
5.1	γ2/κ	VH3-33	D6-6(15)	JH6B	V1-22	JK2	ND
5.3.1	γ2/κ	VH1-24	D5-12(13)	JH4b	VK-B3	JK1	Nesurišta

Konf. = konformacinis ND = neatlikta

Nesurišta = Nesurišta Westem blote

Kuris iš antikūnų surištas su linijiniu arba konformaciniu epitopu buvo nustatyta Western blot analize. Norint nustatyti ar molekulių vidinių ryšių suardymas redukcijos agentu pakeitė parinktų anti-MCP-1 antikūnų reaktyvumą išvalytas MCP-1 buvo užneštas ant SDS/PAGE (4-20 % gelis), esant neredukuojančioms (NR) arba redukuojančioms (R) sąlygoms. SDS/PAGE buvo atlikta pagal Laemmli metodą naudojant mini gelio sistemą. Atskirti baltymai buvo pernešti ant nitroceliuliozės membranos. Membranos buvo blokuotos, naudojant PBS, turintį 5 % (m/t) beriebalinio sauso pieno, mažiausiai 1 valandą prieš išryškinimą ir zonduotos 1 valandą su kiekvienu antikūnu. Antikūnai buvo aptikti naudojant HRP konjuguotus ožkų anti-žmogaus imunoglobulinus (praskiedimas 1:8000; Sigma Kat. Nr. A-8667). Membranos buvo išryškintos, naudojant sustiprintą chemiliuminescenciją (ECL®; Amersham Bioscience) pagal gamintojų instrukcijas.

Antikūno-MCP-1 kompleksai buvo analizuoti trimis metodais: (I) Linijinių ir konformaciniu epitopų paviršiaus sustiprinta lazerine desorbcija jonizacija (SELDI) (baltymų čipų technologija); (2) Linijinių ir konformaciniu epitopų kryptinga mutagenezė; ir (3) Linijinių epitopų SPOT peptidų matrica. SELDI yra neseniai atskleistas metodas tiksliam, greitam ir jautriam peptidų ir baltymų molekulinės masės nustatymui. Linijiniai ir konformaciniai epitopai buvo kartografuoti remiantis SELDI baltymų čipų technologija imobilizuoto antikūno surišto fragmento mase. Linijinių epitopų kartografavimas buvo atliktas pagal SELDI trimis pakopomis. Pirmoje pakopoje MCP-1 buvo suskldytas su aukšto specifiškumo proteolitiniais fermentais, generuojant polipeptidų fragmentų rinkinį. Antrojoje pakopoje, peptidų fragmentai, turintys linijinius epitopus, buvo atrinkti pagal jų specifinį susirišimą su ant baltymų čipo imobilizuotais antikūnais. Šioje pakopoje peptidai, kurie turi epitopo formos kompleksus su antikūnu, tuo tarpu kiti peptidai nesusirišę su antikūnu, buvo pašalinti griežtu plovimu. Galinėje pakopoje su antikūnu susrišto peptido identiškumas buvo nustatytas pagal jo molekulinę masę pagal SELDI ir žinomas specifinių proteazių kirpimo vietas.

Antikūnai 1.4.1, 1.8.1, 1.14,1, 1.18.1 reagavo Westem blote vienodai su natyviu ir ant Western bloto denatūruotu MCP-1, parodant, kad jos turi linijinį epitopą. Jų epitopas buvo kartografuotas SELDI metodu. Eksperimentai buvo atlikti karboksimetilinant MCP-1 antigeną kad būtų išvengta disulfidinių jungčių formavimosi tarp cisteino liekanų baltyme. Metilintas MCP-1 buvo restriktuojamas su Glu-C, endoproteinaze, kuri specifiškai skaldo peptidines jungtis glutamino rūgšties liekanos C-galinėje pusėje. mAb buvo kovalentiškai sujungti su baltymų čipų matrica PS20. Čipų paviršius buvo blokuotas su 1M etanolaminu ir praplautas su PBS, 0,5 % Triton. Metilinto MCP-1 antigeno Glu-C fragmentai buvo surišti su imobilizuotu antikūnu. Nesurišti fragmentai buvo išplauti su detergentu (PBS, 0,1 % Tween). Surišti Glu-C fragmentai buvo ir identifikuoti SELDI metodu, remiantis jų mase. 12 lentelėje susumuotos tikėtinos masės kiekvieno peptido, generuoto pilnai suskaldžius metilintą MCP-1 su Glu-C. MCP-1 buvo pilnai suskaldytas į tris fragmentus. Teorinis pi buvo: 9,39/Mw (vidutinė masė); 8685,03/Mw (monoizotopinė masė): 8679,44. Po plovimo fragmentai, kurių masė 4635, atitinkantys 1-39 liekanoms, likę surišti su antikūnu, reiškė, kad visų šių antikūnų epitopai gulėjo pirmose 39 liekanose, kadangi toks pat modelis buvo matomas su kiekvienu iš šių antikūnų.

lentelė

Masė	Padėtis SEQ ID NO: 149	Nr. MC	Dirbtinė modifikacija(os)	Peptido seka
4458,2591	1-39	, 0	Cys CM: 11, 12,36 4632.2755	QPDAINAPVTCCYNFTNRKI SVQRLASYRRITSSKCPKE
3041.4819	51-76	0	Cys CM:52 3099.4873	ICADPKQKWVQDSMDHLDKQ TQTPKT
1218.7456	40-50	0		AVIFKTIVAKE

SELDI būdas taip pat buvo naudojamas konformacinių epitopų kartografavimui. Šiuo atveju A baltymas kovalentiškai surištas su PS2 baltymo čipų gardelėmis (Cipergen Biosystems) buvo naudojamas sugauti mAb ir paskui inkubuoti su MCP-1. Pašalinus nesurištą medžiagą kompleksai buvo skaldomi su didelės koncentracijos specifinėmis proteazėmis. MCP-1 antikūnai (1.7.2, 3.11.2 ir 3.7.2) negalėjo rištis su redukuotu, denatūruotu antigenu ant Westem bloto, parodydami, kad epitopas tikėtinai yra konformacinis. Antikūnai 1.7.2 ir 3.7.2 buvo pirma kovalentiškai sukabinti su PS20 čipu. Gamtinis MCP-1 buvo surištas su antikūnu ir po to skaldytas su endoproteinaze (Lys-C pirmame eksperimente ir Asp-N kitame). Nesurišti fragmentai buvo išplauti su PBS+, 0,2 % Triton po to sekė PBS ir HPLC plovimas vandeniu. Epitopas buvo nustatytas SELDI metodu ir identifikuotas pagal fragmento masę. Abu šie antikūnai 1.7.2 ir 3.7.2 turi 5712 masės fragmentą atitinkantį liekanoms 3-53 (13 lentelė; teorinis pi: 9,39/Mw (vidutinė masė): 8685,03/M\v (monoizotopinė masė): 8679,44), surištą su juo po plovimo, rodantį, kad epitopas guli gamtiniame MCP-1 antigene tarp 3 ir 53 aminorūgščių liekanų.

lentelė

Masė	Padėtis SEQ ID NO: 149	Nr. MC	Peptido seka
57200059	3-53		DAINAPVTCCYNFTNRKISV QRLASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEICA
10465476	68-76		DKQTQTPKT
10285523	54-61		DPKQKWVQ

3.11.2 antikūno epitopo kartografavimui surišančio domeno dydis buvo minimizuotas naudojant skirtingas proteazes. A baltymas (Calbiochem, 539202) buvo imobilizuotas kovalentiškai ant PS20 čipo. Likę surišimo vietos buvo blokuotos etanolaminu, pH 8,0. 3.11.2 antikūnas buvo surištas su A baltymu. Čipas buvo plaunamas PBS ir po to 50 mM Hepes, pH 7,5. MCP-1 antigenas buvo surištas su antikūnu. Nesurištas antigenas buvo pašalintas plaunant 0,1 % Tween-PBS, po to 50 mM Hepes, pH 7,5 ir 100 mM amonio bikarbonatu. Buvo atliktas čipo MCP-1 skaldymas su endoproteinaze Lys-C. Čipas buvo plautas su 0,1 % Triton-PBS, kad būtų pašalinti nesurišti fragmentai. Surištas fragmentas, remiantis jo mase, buvo analizuotas SELDI metodu. Tik viena masės smailė 1861.8 buvo surišta su antikūnu, atvaizduota 15 aminorūgščių seka, lokalizuota tarp MCP-1 20 ir 35 liekanų (14 lentelė; teoriškai pi: 9.39/Mw (vidutinė masė): 8685.03/Mw (monoizotopinė masė): 8679,44), kurios masė 1865 ir seka ISVQRLASYRRITSSK (20-35 padėtis sekoje SEQ ID NO.: 149) buvo nustatyta kaip tvirčiausiai surištas fragmentas.

lentelė

Masė	Padėtis SEQ ID NO: 149	Nr. MC	Peptido seka
21550059	1-19	0	QPDAINAPVTCCYNFTNRK
18650715	20-35	0	ISVQRLASYRRITSSK
13736154	59-69	0	WVQDSMDHLDK
7753654	50-56	0	EICADPK
7064134	39-44	0	EAVIFK
7023781	70-75	0	QTQTPK
5313500	45-49	0	TIVAK

MCP-1 mutagenezė. Anksčiau buvo parodyta, kad du klasteriai svarbiausių pagrindinių liekanų (R24, K35, K.38, K49 ir Y13) turi didžiausią indėlį sąveikai tarp MCP-1 ir jo receptorių (Hemmerich ir kt., (1999) Biochemistry 38, 13013-13025). Surišimo duomenys atskleidė, kad Ngalinės liekanos mažai prisideda prie surišimo aktyvumo ir kad dvi svarbios liekanos yra svarbios MCP-1 signaliniam aktyvumui: K35 ir R24. K35 yra labiausiai funkciškai svarbi liekana, kadangi K35 mutacija turi žymų efektą surišimui ir aktyvumui, taip kaip ir R24 alanino mutantai (Hemmerich ir kt., (1999) Biochemistry 38, 13013-13025). Arg24 yra išsaugota per skitringas

MCP-1 rūšis, taip pat kaip ir žmogaus MCP-2-4, bet plačiai kinta kituose CC chemokinuose ir tuo būdu gali būti įtraukta į receptoriaus specifiškumą. Norint identifikuoti individualias liekanas tarp pirmųjų MCP-1 39 liekaną pateikiant Glu-C skaldymą kuris būtų svarbus antikūno surišimui, buvo generuoti trys MCP-1 mutantai: trys pagrindinės liekanos R24, K35 ir K38 buvo mutuotos kryptingos mutagenezės būdu ir mutuoti baltymai toliau analizuojami ELISA metodu dėl susirišimo su visais 36 neutralizuojančiais antikūnais. Arg24 buvo mutuota į alaniną (R24A) ir glutamino rūgštį (R24E). Lys35 ir K38 buvo mutuotos į alaniną (K35A, K38A atitinkamai). Visos mutacijos buvo įvestos į beždžionių kilmės MCP-1. Beždžionių MCP-1 konstruktas buvo generuotas atliekant RT-PGR su RNR, išskirta iš beždžionių periferinio kraujo limfocitų (cynomologus MCP-1 PGR3.1 dvikryptė). Baltymų sekos palyginimas tarp žmogaus ir beždžionių MCP-1 atskleidžia 99 % homologiją su dviejų aminorūgščių pakeitimais N-gale (71 ir 76 padėtyse). 59-76 C-galinės liekanos nėra įtrauktos į į sąveiką tarp receptoriaus ir neveikia visų 36 antikūnų surišimo.

Buvo atliktas ELISA bandymas, naudojant 293 ląstelių supematantą transfekuotą skirtingais MCP-1 mutuotais konstruktais. ELISA plokštelės buvo padengtos anti-žmogaus MCP-1 ožkos IgG polikloniniu antikūnu (R&D kat. Nr. AF279NA), praskiestu iki 1 ųg/ml ELISA plokštelių padengimo buferiu. MCP-1 mutuotų konstruktų ekspresija 293 ląstelėse buvo patvirtinta nustatant su biotinilintu ožkos anti-žmogaus MCP-1 (R&D kat. Nr. BAF279) vadovaujantis streptavidino HRP. MCP-1 mutanto surišimas su MCP-1 antikūnais buvo nustatytas su HRP konjuguotu ožkos anti-žmogaus IgG (Fc specifinis, Caltag Kat. Nr. H10507). ELISA rezultatai parodė, kad K38 pakeitimas neturėjo jokio efekto visų 36 mutantų surišimo aktyvumui. Visų antikūnų surišimas su MCP-1 R24E ir R24A mutantiniais antigenais buvo pilnai panaikintas (žiūr. 15 lentelę). Tačiau, K35A mutacija inhibavo surišimą tik šešių antikūnų (1.6.1, 1.9.1, 3.6.1, 3.10.1). Visi šie antikūnai pasirodė turintys konformacinius epitopus, susirišimas su kuriais yra veikiamas arba Arg24 arba Lys35 mutacijomis. Šie duomenys reiškia, kad šie keturi antikūnai atpažįsta konformacinius epitopus skirtingai, bet persidengiant su kitais antikūnais.

lentelė

mAb	Epitopas	Glu-C skaldy mas	Lys-C	Asp-N skaldym as	Peptidas	Liekana	R24A/E	K35A
1.1.1	Konform.	ND	ND	ND	ND	ND	Inhibicija	Inhibicija
1.2.1	Linijinis	ND	ND	ND	7 11	21-25	Inhibicija	Nėra inhib.
1.3.1	Konform.	ND	ND	ND	ND	ND	Inhibicija	Nėra inhib.
1.4.1	Linijinis	1 39	ND	ND	7 11	21-25	Inhibicija	Nėra inhib.
1.5.1	Linijinis	ND	ND	ND	7 11	21-25	Inhibicija	Nėra inhib.
1.6.1	Konform.	ND	ND	ND	ND	ND	Inhibicija	Inhibicija
1.7.1	Konform.	ND	ND	3-	ND	ND	Inhibicija	Nėra inhib.

				53/5712
1.8.1	Linijinis	1 39	ND	ND	7 11	21-25	Inhibicija	Nėra inhib.
1.9.1	Nesurištas	ND	ND	ND	ND	ND	Inhibicija	Inhibicija
1.10.1	Linijinis	ND	ND	ND	7 11	21-25	Inhibicija	Nėra inhib.
1.11.1	Linijinis	ND	ND	ND	ND	ND	Inhibicija	Nėra inhib.
1.12.1	Konform.	ND	ND	ND	ND	ND	Inhibicija	Nėra inhib.
1.13.1	Linijinis	ND	ND	ND	7 11	21-25	Inhibicija	Nėra inhib.
1.14.1	Linijinis	1 39	ND	ND	7 11	21-25	Inhibicija	Nėra inhib.
1.18.1	Linijinis	1 39	ND	ND	7 11	21-25	Inhibicija	Nėra inhib.
2.3.1	Nesurištas	ND	ND	ND	ND	ND	Inhibicija	Nėra inhib.
3.2	Konform.	ND	ND	ND	ND	ND	Inhibicija	Nėra inhib.
2.4.1	Nesurištas	ND	ND	ND	ND	ND	Inhibicija	Nėra inhib.
3.4.1	Linijinis	ND	ND	ND	ND	ND	Inhibicija	Nėra inhib.
3.5.1	Nesurištas	ND	ND	ND	ND	ND	Inhibicija	Nėra inhib.
3.6.1	Nesurištas	ND	ND	ND	ND	ND	Inhibicija	Inhibicija
3.7.1	Konform.	ND	ND	3- 53/5712	ND	ND	Inhibicija	Nėra inhib.
3.8	Nesurištas	ND	ND	ND	ND	ND	Inhibicija	Inhibicija
3.10.1	Konform.	ND	20-35 (1864)	ND	ND	ND	Inhibicija	Inhibicija
3.11.1	Konform.	ND	ND	ND	ND	ND	Inhibicija	Nėra inhib.
3.14.1	Konform.	ND	ND	ND	ND	ND	Inhibicija	Nėra inhib.
3.15.1	Linijinis	ND	ND	ND	7 11	21-25	Inhibicija	Nėra inhib.
3.16.1	Konform.	ND	ND	ND	ND	ND	Inhibicija	Nėra inhib.
4.5.1	Konform.	ND	ND	ND	ND	ND	Inhibicija	Nėra inhib.
4.6.1	ND	ND	ND	ND	ND	ND	Inhibicija	Nėra inhib.
4.7.1	Konform.	ND	ND	ND	ND	ND	Inhibicija	Nėra inhib.
4.8.1	Konform.	ND	ND	ND	ND	ND	Inhibicija	Nėra inhib.
5.1	ND	ND	ND	ND	ND	ND	Inhibicija	Nėra inhib.
5.3.1	Nesurištas	ND	ND	ND	ND	ND	Inhibicija	Nėra inhib.

ND = neatlikta

Nesurištas = Nesurišta Westem blote

Šiems antikūnams surišimas su linijiniu epitopu, jų surišimas su peptidiniu epitopu buvo detaliai ištirtas, naudojant SPOT technologiją. SPOT yra technologija, kuri leidžia šimtų peptidų kietos fazės sintezę tokiame formate, kuris tinka antikūnų epitopų sisteminei analizei. Sistema yra paprasta, ypač greita ir ekonomiška naudojamų reagentų požiūriu. Įprastai pagaminta peptidų matrica buvo gauta iš Sigma-Genosys (The Woodlands, Texas). Buvo susintetinta 32-iejų 13-narių peptidų eilė, apimanti MCP-1 sekos 1-76 liekanas. Kiekvienas nuoseklus peptidas buvo kompensuotas dviem aminorūgštimis iš ankstesniojo, gaunant įterptą vienas įkitą, persidengiančią biblioteką. Membrana, turinti 32 peptidus,buvo zonduojama su aštuoniais MCP-1 antikūnais (1 pg/ml) ir stebėta sustiprinta chemiliuminescencija (ECL). Buvo stebima reakcija su penkiais nuosekliais peptidų mėginiais (7-10) atitinkančiais MCP-1 21-25 aminorūgštims. Iš šių rezultatų pasirodė, kad visų tirtų MCP-1 antikūnų, kurie rišasi su linijiniu epitopu, epitopų pagrindas yra SVQRL(21-25). MCP-1 seka:

QPDAINAPVTCCYNFTNRKISVQRLASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEICADPKQK WVQDSMDHDLDKQTQTPKT (SEQ ID NO: 149)

Aštuoni antikūnai, kurie atpažįsta linijinį epitopą, reaguoja su tais pačiais SPOT: 1.2.1, 1.4.1, 1.5.1, 1.8.1, 1.10.1, 1.13.1, 1.14.1 ir 1.18.1.

PAVYZDYS

Kryžmiškai reaguojančiu antikūnų giminigumo nustatymas aukšo atskyrimo Biocore analize

Sąveikos analizė buvo atlikta prie 25 °C, naudojant du CM5 čipus, sujungtus Biocore 2000 optiniame biosensoriuje. Individualios tėkmės kameros kiekviename čipe buvo aktyvuotos 7minute NHS/EDC injekcija, karbohidrazidas buvo sujungtas per NHS esterį, naudojant 7-minutę injekciją, ir likusios aktyvuotos grupės buvo blokuotos etanolamino 7-minute injekcija. mAb 3.11.2 monosacharidų liekanos , praskiestos 1/50, buvo oksiduotos naudojant 1 mM natrio metaperjodatą 100 mM natrio acetate, pH 5,5 prie 4 °C 30 min. Oksiduotas antikūnas buvo nugėlintas 10 mM natrio acetate, pH 5,0, kad būtų sukabinti ant karbohidrazidu modifikuoto paviršiaus. Paviršiaus tankis 250 Ru 3.11.2 mAb buvo naudojamas išmatuoti išdėstytai MCP-1 ir MCP-4 sąveikai, kadangi 11 ORU paviršius buvo naudojamas matuoti MCP-2 ir MCP-3 antigenų sąveikai su 3.11.2 mAb. mAb paviršius buvo stabilizuotas redukuojant hidrazono jungtis 0,1 M natrio cianoborhidridu. Antigeno/antikūno sąveika buvo tirta injekuojant sudvigubintus antigeno pavyzdžius, praskiestus elektroforezės buferiu (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,005 % paviršinio aktyvumo medžiagos, 200 pg/ml BSA, pH 7,4) 300-kartiniame koncentracijos diapazone. Paviršius buvo regeneruotas 12-sekundiniu impulsu 15 mM H3PO4.

Norint nustatyti kiekvienos sąveikos kinetiką, duomenų rinkiniai buvo visuotinai pritaikyti 1:1 sąveikos modeliui, kuris apėmė masės transporto parametrus. Nustatytos greičio konstantos ir apskaičiuoti giminingumai 3.11.2 antikūnui yra išdėstyti 16 lentelėje. Duomenys kitiems antikūnams pateikti 8 lentelėje.

lentelė

Ag	KJM-'s-1)	Kjfs'1)	Kn(pMJ
MCP-1	3,0x10b	lxl0'J	3,3
MCP-2	2,6x10*	1,2x10'2	46
MCP-3	1,5x10*	7,4x10'J	49
MCP-4	1,5x108	5,5xl0'4	3,7

PAVYZDYS

Angiogenezės prevencija su antikūnais prieš MCP-1

Angiogenezė buvo indukuota pelių modelyje sumaišius Matrigel su žmogaus bFGF (10 ng/ml), žmogaus VEGF165 (100 ng/ml) ir 10 pg/ml heparino arba MCP-1 (250 ng/ml) ir MCP-3 (100 ng/ml). Maždaug 0,5 ml suspensijos buvo injekuota į dešinįjį šoną po oda 6-8 savaičių amžiaus „plikų“ pelių patelėms. Kiekvienai MCP-1 ir MCP-3 dozei buvo naudojamos penkios pelės. Be to, kaip neigiama kontrolė, buvo įjungtas vien tik Matrigel (be augimo faktorių). Matrigel implantai įtvirtinti in situ ir buvo kairėje neliečiami 7 dienas. Pasibaigus 7 dienoms, pelės buvo anestezuojamos ir Matrigel tamponai atsargiai pašalinami, naudojant mikrochirurgijos instrumentus. Peršviesti geliai buvo fotografuojami. Dalis tamponų buvo apdoroti parafine įtvirtintu skrodimu. Skrodimai buvo atliekami dviem skirtingais lygiais ir nudažomi H/E. Kita dalis gelių buvo greitai užšaldoma skystame azote ir pateikti imunocitocheminiam nudažymui su žiurkių monokloniniu antikūnu, nukreiptu, nukreiptu prieš pelių CD31 antigeną konjuguotų su fikoeritrinu. H+E nudažytos plokštelės buvo stebėti per fluorescentinį mikroskopą (raudonas filtras), sujungtą su Spot kamera. Vaizdai buvo užfiksuoti skaitmeniniu būdu, naudojant Metamorph programinę įrangą. Mikrokraujagyslių tankis buvo nustatytas Wild ir kt. (2000) paskelbtu metodu.

Buvo rasta, kad abu MCP-1 ir MCP-3 rodo lygiavertę angiogenezę, kaip gerai charakterizuoti angiogeniniai faktoriai VEGF ir bFGF. Be to, MCP-1 ir MCP-3 indukuota angiogenezė gyvūnuose ir to pasėkoje žmonių augliuose ir nesveikuose audiniuose, gali būti sutrukdyta veikiant antikūnais prieš MCP-1 antikūnais, tokiais kaip 3.11.2, kurie neutralizuoja visos MCP šeimos narių aktyvumą Todėl, turėtų būti injekuoti anti-MCP antikūnai į gyvulius skirtingomis dozėmis, apimančiomis 0,1-0,5 mg/gyvūnui, kad būtų nustatyta dozės-atsako priklausomybė gydymui.

PAVYZDYS

Auglio ląstelių produkuojamas MCP-1

Norint nustatyti, kurios auglio ląstelių linijos produkuoja MCP-1 ląstelių kultūroje, buvo tiriamas ląstelių linijų sąrašas dėl jų sugebėjimo sekretuoti MCp-1 į augimo terpę. Ląstelės buvo auginamos Dulbecco‘s Modified Eagles terpėje (DMEM), turinčioje 10 % fetalinio jaučio serumo arba ekvivalento ligi susiliejimo. Supematantas buvo pašalintas ir mėginys testuojamas dėl reaktyvumo prieš MCP-1, naudojant komerciškai prieinamą ELISA rinkinį iš R&D Sciences. 17 lentelė rodo vėžinių ląstelių linijas, kurios konstitutyviai sekretuoja MCP-1 ir jų atitinkamas lygis nustatomas ELISA.

lentelė

		Ląstelių linija	MCP-1 (pg/ml)
1	Gaubtinės žarnos karcinoma	COLO-205	<10
2	Gaubtinės žarnos karcinoma	HCT-15	60
3	Gaubtinės žarnos karcinoma	HCT-116	122
4	Gaubtinės žarnos karcinoma	HT-29	102
5	Gimdos kaklelio vėžys	HT-3	127
6	Gaubtinės žarnos karcinoma	SW707	31
7	Gaubtinės žarnos karcinoma	SW948	13
8	Gaubtinės žarnos karcinoma	KM-12	6
9	Gaubtinės žarnos karcinoma	HCC-2998	39
10	Skrandžio karcinoma	NCI-N87	37
11	Skrandžio karcinoma	NCI-SNU-1 4	0
12	Skrandžio karcinoma	NCI-SNU-5	<10
13	CNS karcinoma	SF-268	94
14	CNS karcinoma	SF-295	223
15	CNS karcinoma	SF-593	>2500
16	CNS karcinoma	SNB-19	>2500
17	CNS karcinoma	SNB-75	>2500
18	CNS karcinoma	U251	>2500
63	CNS	XF-498(Curg)	>2500
61	Glioblastoma	SF-295(Curg)	>2500
21	Medulloblastoma	TE 671 (u)	>2500
25	Leukemija	SR	25
26	Leukemija	A 673	>2501
27	Leukemija	K562	287
28	Leukemija	RPMI-8226	528
29	Leukemija	Jurkats	184
30	Leukemija	THP-1	113
31	Leukemija	HUT78	35
32	Leukemija	JY	0
33	Leukemija	CEM	0
34	Plaučių karcinoma	MV 522	74
35	Plaučių adenokarcinoma	EKVX	>2500
36	Plaučių adenokarcinoma	HOP-62	>2500
37	Plaučių karcinoma NSC	HOP-92	897
38	Plaučių karcinoma NSC	NCI-H1299	384
39	Plaučių karcinoma NSC	NCI-H2126	107
55	Plaučių adenokarcinoma	NCI-H522	0
42	Plaučių adenokarcinoma	NCI-H322M	0
40	Plaučių fibroblastų IPF	A 549	>2501
57	Plaučių adenokarcinoma	NCI-H292	245
43	Plaučių karcinoma NSC	NCI-H460	118
45	Plaučių plokščialąstelinis NSC	Skmes-1	410
44	Plaučių smulkialąstelinė karcinoma	SHP-77	1663

58	Plaučių smulkialąstelinė karcinoma	NCI-H510A	>2500
56	Plaučių smulkialąstelinė karcinoma	NCI-H69
53	Pieno liaukų karcinoma	HCC-2218	129
54	Pieno liaukų karcinoma	HCC-1954	113
46	Pieno liaukų karcinoma	ZR-75-30	357
47	Pieno liaukų karcinoma	MCF-7	0
48	Pieno liaukų karcinoma	MDA-MB-453	40
49	Pieno liaukų karcinoma	MDA-MB-231	>2501
50	Pieno liaukų karcinoma	MDA-MB-468	9
51	Pieno liaukų karcinoma	NCI/ADR	0
52	Pieno liaukų karcinoma	T47D	61
22	Pieno liaukų karcinoma	SK-BR-3	475
20	Pieno liaukų karcinoma	Hs 605T	>2500
53	Melanoma	A431	56
54	Melanoma	LOXIMVI	105
55	Melanoma	M14	786
56	Melanoma	RPMI7591	>2501
57	Melanoma	SK-MEL-28	29
58	Melanoma	UACC-62	119
59	Melanoma	UACC-257	265
41	Melanoma	Hs 936.T	15
24	Melanoma	SK-mel-5	38
25	Melanoma	Hs 940.T	>2500
26	Melanoma	A375	136
6	Melanoma	WM.266.	>2500
27	Kasos karcinoma	HPAC	73
29	Kasos karcinoma	HPAFII	47
41	Kasos karcinoma	CAPAN-1	>2500
60	Kasos karcinoma	Panc-1	>2500
30	Kiaušidžių karcinoma	ES2	322
31	Kiaušidžių karcinoma	IGROV1	199
32	Kiaušidžių karcinoma	MDAH2774	314
33	Kiaušidžių karcinoma	SK-OV-3	86
34	Kiaušidžių karcinoma	OVCAR-3	126
36	Kiaušidžių karcinoma	OVCAR-5	336
37	Kiaušidžių karcinoma	OVCAR-8	36
38	Prostatos karcinoma	22Rvl	55
39	Prostatos karcinoma	LNCaP	>2500
40	Prostatos karcinoma	DU150	>2500
42	Prostatos karcinoma	PC-3	163
28	Prostatos karcinoma	DU145	68
43	Inkstų karcinoma	A498	>2500
44	Inkstų karcinoma	786-0(35h)	>2500
45	Inkstų karcinoma	SK-RC-01	>2500

46	Inkstų karcinoma	SK-RC-10	>2500
47	Inkstų karcinoma	Caki-1	115
48	Inkstų karcinoma	Caki-2	>2500
49	Inkstų karcinoma	RXF-393	>2500
50	Inkstų karcinoma	SK-RC-52	>2500
51	Inkstų karcinoma	SN12C	>2500
52	Inkstų karcinoma	TK-10	533
62	Inkstų karcinoma	769-P	512
23	Kepenų karcinoma	C3A	0
59	Kepenų karcinoma	HepG2	>2500
19	Epiderminis gimdos kaklelio vėžys	MS 751	>2500
35	Gimdos kaklelio vėžys	Hela	>2501
	Gimdos kaklelio	C-33A	20
1	Gimdos kaklelio	Ca Ski	32
2	Gimdos kaklelio	ME-180	54
3	Gimdos	KLE	>2500
4	Gimdos	RL95-2	28
5	Gimdos	HEC-l-A	47
			MCP-1

PAVYZDYS

Anti-MCP-1 antikūnų poveikis pelių auglio modelyje

Norint nustatyti anti-MCP-1 antikūnų poveikį poodinio auglio augimui, eksponentiškai augančios Panc-1 ląstelės buvo išsodintos ir resuspenduotos 0,2 ml Hanko subalansuotame druskų tirpale (HBSS). Augliai buvo produkuoti injekuojant 5xl0⁶ Panc-1 ląsteles, sumaišytas su augimo faktoriumi redukuotu Matrigel į BALB/c „plikų“ pelių patelių šoną. Pradedant nuo implantacijos dienos, gyvūnai buvo veikiami 0,5 mg anti-MCP-1 1.7.3 antikūnu ir PK antikūnu, kuris buvo nukreiptas prieš KLH arba PBS, laiko tarpais, pažymėtais diagramoje. Auglio augimas buvo matuojamas kas savaitę ir rezultatai pateikti kaip ±SD reikšmės (4 figūra). Skirtumai tarp kontrolinių ir paveiktų gyvūnų buvo statistiškai svarbūs, jeigu palyginta naudojant Stjudento T testą (P<0,002). Atitinkamai, anti-MCP-1 antikūnai suteikė efektyvų poveikį sumažinant auglio augimą in vivo.

PAVYZDYS

MCP-1 antikūnu analizė programinės įrangos pagalba

Aukščiau aprašyti MCP-1 antikūnų kalcio srautas (pernešimas), chemotaksis ir giminingumo duomenys buvo analizuojami, naudojant Guided Analytic programinę įrangą, turimą iš Spotfire,

Ine., Somerville, MA. Rezultatai parodyti 5 ir 6 figūrose.

PAVYZDYS

Anti-MCP-1 antikūnu struktūrinė analizė

Antikūnų kintamos sunkiosios grandinės ir kintamos lengvosios grandinės, parodytos 1 lentelėje, buvo sekvenuotos, norint nustatyti jų DNR sekas. Anti-MCP-1 antikūnų sekų pilna informacija su kiekvieno gama ir kappa grandinės derinio nukleotidų ir aminorūgščių sekomis pateikta sekų sąraše.

Kintamos sunkiosios sekos buvo analizuotos, norint nustatyti VH šeimą D-srities seką ir Jsrities seką. Sekos buvo perskaičiuotos, norint nustatyti pirminę aminorūgščių seką ir palygintos su pirminėmis VH, D ir J sričių sekomis, kad būtų įvertintos somatinės hipermutacijos. 7 figūroje parodytas anti-MCP-1 sekų palyginimas Clustal W programa, naudojant VH1-24, pažymint CD, CDR1, CDR2 ir CDR3 sritis ir susijusi dendrograma. 8 figūroje parodytas anti-MCP-1 sekų palyginimas Clustal W programa, naudojant VK-B3, pažymint CD, CDR1, CDR2 ir CDR3 sritis ir susijusi dendrograma. 9 figūroje parodytas anti-MCP-1 sekų palyginimas Clustal W programa, naudojant VK-08, pažymint CD, CDR1, CDR2 ir CDR3 sritis ir susijusi dendrograma. 10 figūroje parodytas anti-MCP-1 sekų palyginimas Clustal W programa, naudojant VH6-1, pažymint CD, CDR1, CDR2 ir CDR3 sritis ir susijusi dendrograma.

PAVYZDYS

Anti-MCP-1 antikūnu, kaip diagnostikos agentu panaudojimas

A. MCP-1 antigeno nustatymas pavyzdyje

Su fermentais susijęs imunofermentinis metodas (ELISA) MCP-1 antigenų nustatymui pavyzdyje yra paprastas ir išvystytas. Šiuo metodu, mikroplokštelės šulinėliai , tokios kaip 96 šulinėlių mikroplokštelės arba 384 šulinėlių mikroplokštelės, yra adsorbuojami pirmuoju pilnai žmogaus monokloniniu antikūnu, nukreiptu prieš antigeną Imobilizuotas antikūnas tarnauja kaip sugaunantis antikūnas prieš bet kokį antigeną kuris gali būti testo pavyzdyje. Šulinėliai yra praplaunami ir paveikiami blokuojančiu agentu, tokiu pieno baltymas arba albuminas, kad butų išvengta nespecifinės analitės adsorbcijos.

Paskui šulinėliai veikiami testo pavyzdžiais, manoma turinčiais antigeną arba tirpalu, turinčiu standartinį antigeno kiekį. Toks pavyzdys gali būti, pavyzdžiui, serumo pavyzdys iš objekto, tikėtina turinčio lygį cirkuliuojančio antigeno, manomai turinčio patologinę diagnozę.

Po testo pavyzdžių arba standarto praplovimo, šulinėliai veikiami antruoju pilnai žmogaus monokloniniu anti-MCP-1 antikūnu, kuris yra pažymėtas konjuguojant biotinu. Pažymėtas antiMCP-antikūnas tarnavo kaip detektuojamas antikūnas. Po antro antikūno pertekliaus praplovimo, šulinėliai veikiami su avidinu konjuguotą krienų peroksidaze (HRP) ir atitinkamu chromogeninių substratu. Antigeno koncentracija testo pavyzdyje yra nustatoma palyginant su standartine kreive, sudaryta iš standartinių pavyzdžių.

Sis ELISA bandymas duoda didelį specifiškumą ir labai jautrų tyrimą MCP-1 antigeno testo pavyzdyje nustatymui.

B. MCP-1 koncentracijos nustatymas paciento pavyzdžiuose

Sluoksniuota ELISA yra išvystyta nustatyti MCP-1 kiekiui žmogaus serume. Du anti-MCP-1 antikūnai, naudojami sluoksniuotoje ELISA geriau atpažįsta skirtingus MCP-1 molekulės epitopus (duomenys neparodyti). ELISA atliktas sekančiai: 50 μΐ gaudančiųjų anti-MCP-1 antikūnų padengimo buferyje (0,1 M NaHCCb, pH 9,6) esant 2 pg/ml koncentracijai padengiamos ELISA plokštelės (Fisher). Po inkubacijos prie 4 °C per naktį, plokštelės veiktos 200 ml blokavimo buferio (0,5 % BSA, 0,1 % Tween 20, 0,01 % Thimerosal PBS-e) 1 vai. prie 25 °C. Plokštelės buvo išplautos (3x) naudojant 0,05 % Tween 20 PBS-e (plovimo buferis, WB). Normalus arba paciento serumas (Clinomics, Bioreclaimation) yra praskiestas blokavimo buferiu, turinčiu 50 % žmogaus serumo. Plokštelės yra inkubuotos su serumo pavyzdžiais per naktį prie 4 °C, plautos su WB ir po to inkubuotos su 100 μΐ/šulinėliui biotinilinto detektavimo anti-MCP-1 antikūno 1 vai prie 25 °C. Po plovimo plokštelės buvo inkubuotos su HRP streptavidinu 15 min., plautos kaip anksčiau, po to veiktos su 100 μΐ/šulinėliui o-fenilendiamino vandenilio perokside (Sigma išryškinimo tirpalas) spalvos generavimui. Reakcija sustabdyta su 50 μΐ/šulinėliui H2SO4 (2M) ir analizuota, naudojant ELISA plokštelių skaitytuvą prie 492 nm. PRO antigeno koncentracija serumo pavyzdžiuose apskaičiuojama palyginant išvalyto MCP-1 antigeno du skiedimus, naudojant keturių parametrų kreivių pritaikymo programą.

C. Vėžio nustatymas pacientams

Reikėtų įvertinti, kad remiantis rezultatų rinkiniu ir 10A-10B aptartais pavyzdžiais, naudojant šiame išradime aprašytus įgyvendinimus, galima nustayti objektui vėžį, remiantis MCP-1 antigeno ekspresijos lygiu. Tam tikram vėžio tipui, iš objekto imami kraujo pavyzdžiai nustatoma įvairios ligos progresavimo stadijos ir/arba vėžio gydymas įvairiu metu. MCP-1 antigeno koncentracija esanti kraujo pavyzdžiuose yra nustatoma naudojant metodą kuris specifiškai apibrėžia esančio antigeno kiekį. Toks metodas apima ELISA metodą tokius metodus, kurie aprašyti 10A-10B pavyzdžiuose. Naudojant pavyzdžių populiaciją kuri numato kiekvienai progresavimo arba gydymo pakopai statistiškai svarbų rezultatą diapazoną antigeno, kuris gali būti vertinga charakteristika nustatyta kiekvienai pakopai.

Norint nustatyti objektui vėžio stadiją po tyrimo arba charakterizuoti objekto atsaką į gydymo kursą iš objekto imamas kraujo pavyzdys ir nustatoma pavyzdyje esančio antigeno koncentracija. Taip nustatyta koncentracija naudojama identifikuoti į kokį reikšmių diapazoną krenta reikšmė. Taip identifikuotas diapazonas koreliuoja su progresijos stadija arba gydymo stadija, identifikuota įvairiose diagnozuotų subjektų populiacijose, tuo budu pateikiant subjekto stadiją po tyrimo.

PAVYZDYS

Anti-MCP-1 antikūnu naudojimas auglio gydymui

Norint nustatyti anti-MCP-1 antikūno efektą pacientų (žmonių) su augliais gydymui in vivo, tokie pacientai yra injekuojami per tam tikrą laiko tarpą efektyviu anti-MCP-1 antikūno kiekiu. Periodiškais laiko tarpais gydymo metu pacientai (žmonės) tikrinami, nustatant kuris jų auglių progresuoja, ypatingai, kurie auga ie metastazuoja.

Vėžio pacientai, veikti su anti-MCP-1 antikūnais turi žemesnį lygį auglio augimo ir metastazavimo, palyginus su vėžio pacientais, kurie buvo veikti su kontroliniais antikūnais. Kontroliniai antikūnai, kurie gali būti naudojami, apima to paties izotipo antikūnus, kaip ir testuoti anti-MCP-1 antikūnai, ir tačiau neturi sugebėjimo surišti su MCP-1 auglio antigenus.

Aukščiau aprašytas reikalavimas manoma yra svarbus šios srities specialistui įgyvendinti išradimą praktikoje. Čia aprašyti išradimo įgyvendinimai nėra limituojantys apimtį deponuoto sprendimo, kadangi deponuotas įgyvendinimas yra numatomas kaip išradimo tam tikro aspekto viena iliustracija, ir bet koks sprendimas, kuris yra funkciškai ekvivalentiškas yra šio išradimo apimtyje.

Aukščiau išdėstytas aprašymas ir pavyzdžiai detalizuoja tam tikrus pateiktus išradimo įgyvendinimus ir aprašo geriausiai išradėjų apmąstytus. Reikėtų pripažinti, tačiau, nesvarbu kiek yra detalus ankstesnis tekstas, išradimas gali būti taikomas daugeliu būdų ir išradimas turėtų būti interpretuojamas sutinkamai su pridedama apibrėžtimi ir bet kokiu jo ekvivalentu.

Claims (57)

1. Išradimo apibrėžtis

   1. Žmogaus monokloninis antikūnas, kuris rišasi su MCP-1 ir apima aminorūgščių sunkiąją grandinę, turinčią seką parinktą iš grupės, susidedančios iš SEQ ID Nr. 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86,90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 122, 126, 130, 134, 138, 142 ir 146.
2. 2. Antikūnas pagal 1 punktą besiskiriantis tuo, kad apima aminorūgščių lengvąją grandinę, turinčią seką parinktą iš grupės, susidedančios iš SEQ ID Nr. 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40,44,48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88,92,96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144 ir 148.
3. 3. Žmogaus monokloninis antikūnas pagal 2 punktą besiskiriantis tuo, kad aminorūgščių sunkioji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 2 ir aminorūgščių lengvoji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 4.
4. 4. Žmogaus monokloninis antikūnas pagal 2 punktą besiskiriantis tuo, kad aminorūgščių sunkioji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 6 ir aminorūgščių lengvoji grandinė apima sekąSEQ ID Nr. 8.
5. 5. Žmogaus monokloninis antikūnas pagal 2 punktą besiskiriantis tuo, kad aminorūgščių sunkioji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 10 ir aminorūgščių lengvoji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 12.
6. 6. Žmogaus monokloninis antikūnas pagal 2 punktą besiskiriantis tuo, kad aminorūgščių sunkioji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 14 ir aminorūgščių lengvoji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 16.
7. 7. Žmogaus monokloninis antikūnas pagal 2 punktą besiskiriantis tuo, kad aminorūgščių sunkioji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 18 ir aminorūgščių lengvoji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 20.
8. 8. Žmogaus monokloninis antikūnas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo. kad aminorūgščių sunkioji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 22 ir aminorūgščių lengvoji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 24.
9. 9. Žmogaus monokloninis antikūnas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad aminorūgščių sunkioji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 26 ir aminorūgščių lengvoji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 28.
10. 10. Žmogaus monokloninis antikūnas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo. kad aminorūgščių sunkioji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 30 ir aminorūgščių lengvoji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 32.
11. 11. Žmogaus monokloninis antikūnas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad aminorūgščių sunkioji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 34 ir aminorūgščių lengvoji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 36.
12. 12. Žmogaus monokloninis antikūnas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad aminorūgščių sunkioji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 38 ir aminorūgščių lengvoji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 40.
13. 13. Žmogaus monokloninis antikūnas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad aminorūgščių sunkioji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 42 ir aminorūgščių lengvoji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 44.
14. 14. Žmogaus monokloninis antikūnas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad aminorūgščių sunkioji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 46 ir aminorūgščių lengvoji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 48.
15. 15. Žmogaus monokloninis antikūnas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad aminorūgščių sunkioji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 50 ir aminorūgščių lengvoji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 52.
16. 16. Žmogaus monokloninis antikūnas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad aminorūgščių sunkioji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 54 ir aminorūgščių lengvoji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 56.
17. 17. Žmogaus monokloninis antikūnas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo. kad aminorūgščių sunkioji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 58 ir aminorūgščių lengvoji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 60.
18. 18. Žmogaus monokloninis antikūnas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad aminorūgščių sunkioji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 62 ir aminorūgščių lengvoji grandinė apima sekąSEQ ID Nr. 64.
19. 19. Žmogaus monokloninis antikūnas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad aminorūgščių sunkioji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 66 ir aminorūgščių lengvoji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 68.
20. 20. Žmogaus monokloninis antikūnas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad aminorūgščių sunkioji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 70 ir aminorūgščių lengvoji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 72.
21. 21. Žmogaus monokloninis antikūnas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad aminorūgščių sunkioji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 74 ir aminorūgščių lengvoji grandinė apima sekąSEQ ID Nr. 76.
22. 22. Žmogaus monokloninis antikūnas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad aminorūgščių sunkioji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 78 ir aminorūgščių lengvoji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 80.
23. 23. Žmogaus monokloninis antikūnas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad aminorūgščių sunkioji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 82 ir aminorūgščių lengvoji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 84.
24. 24. Žmogaus monokloninis antikūnas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad aminorūgščių sunkioji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 86 ir aminorūgščių lengvoji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 88.
25. 25. Žmogaus monokloninis antikūnas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad aminorūgščių sunkioji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 90 ir aminorūgščių lengvoji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 92.
26. 26. Žmogaus monokloninis antikūnas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad aminorūgščių sunkioji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 94 ir aminorūgščių lengvoji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 96.
27. 27. Žmogaus monokloninis antikūnas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad aminorūgščių sunkioji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 98 ir aminorūgščių lengvoji grandinė apima seką SEQ IDNr. 100.
28. 28. Žmogaus monokloninis antikūnas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad aminorūgščių sunkioji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 102 ir aminorūgščių lengvoji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 104.
29. 29. Žmogaus monokloninis antikūnas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad aminorūgščių sunkioji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 106 ir aminorūgščių lengvoji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 108.
30. 30. Žmogaus monokloninis antikūnas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad aminorūgščių sunkioji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 110 ir aminorūgščių lengvoji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 112.
31. 31. Žmogaus monokloninis antikūnas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad aminorūgščių sunkioji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 114 ir aminorūgščių lengvoji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 116.
32. 32. Žmogaus monokloninis antikūnas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad aminorūgščių sunkioji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 116 ir aminorūgščių lengvoji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 118.
33. 33. Žmogaus monokloninis antikūnas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad aminorūgščių sunkioji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 118 ir aminorūgščių lengvoji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 120.
34. 34. Žmogaus monokloninis antikūnas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad aminorūgščių sunkioji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 122 ir aminorūgščių lengvoji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 124.
35. 35. Žmogaus monokloninis antikūnas pagal 2 punktą besiskiriantis tuo, kad aminorūgščių sunkioji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 126 ir aminorūgščių lengvoji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 128.
36. 36. Žmogaus monokloninis antikūnas pagal 2 punktą besiskiriantis tuo, kad aminorūgščių sunkioji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 130 ir aminorūgščių lengvoji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 132.
37. 37. Žmogaus monokloninis antikūnas pagal 2 punktą besiskiriantis tuo, kad aminorūgščių sunkioji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 134 ir aminorūgščių lengvoji grandinė apima sekąSEQ ID Nr. 136.
38. 38. Žmogaus monokloninis antikūnas pagal 2 punktą besiskiriantis tuo, kad aminorūgščių sunkioji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 138 ir aminorūgščių lengvoji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 140.
39. 39. Žmogaus monoklorlinis antikūnas pagal 2 punktą besiskiriantis tuo, kad aminorūgščių sunkioji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 142 ir aminorūgščių lengvoji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 144.
40. 40. Žmogaus monokloninis antikūnas pagal 2 punktą besiskiriantis tuo, kad aminorūgščių sunkioji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 146 ir aminorūgščių lengvoji grandinė apima seką SEQ ID Nr. 148.
41. 41. Antikūnas imobilizuotas ant netirpios matricos, kur antikūnas yra antikūnas pagal 2 punktą.
42. 42. Pagerintas monocitų chemotaksio baltymo-1 (MCP-1) lygio nustatymo paciento pavyzdyje būdas, besiskiriantis tuo, kad minėtas pagerintas būdas apima panaudojimą anti-MCP-1 antikūno pagal 2 punktą MCP-1 lygio nustatymui bandinyje iš žmogaus.
43. 43. Budas pagal 42 punktą besiskiriantis tuo, kad paciento bandinys yra kraujas.
44. 44. Kompozicija, besiskirianti tuo, kad apima antikūną arba jo fragmentą pagal 2 punktą ir farmaciškai priimtiną nešiklį.
45. 45. Antikūno panaudojimas gamyboje vaisto, skirto neoplastinių ligų gydymui gyvūnuose, kur minėtas monokloninis antikūnas specifiškai rišasi su monocitų chemotaksio baltymu-1 (MCP1).
46. 46. Panaudojimas pagal 45 punktą besiskiriantis tuo, kad minėtas antikūnas yra pilnai žmogaus antikūnas.
47. 47. Panaudojimas pagal 45 punktą besiskiriantis tuo, kad minėta neoplastinė liga yra parinkta iš grupės, susidedančios iš: krūties vėžio, kiaušidžių vėžio, pūslės vėžio, plaučių vėžio, glioblastomos, skrandžio vėžio, endometriumo vėžio, inkstų vėžio, gaubtinės žarnos vėžio, kasos vėžio ir prostatos vėžio.
48. 48. Antikūno panaudojimas gamyboje vaisto, skirto uždegiminių būklių efektyviam gydymui gyvūnuose, kur minėtas monokloninis antikūnas specifiškai rišasi su monocitų chemotaksio baltymu-1 (MCP-1).
49. 49. Panaudojimas pagal 48 punktą besiskiriantis tuo, kad minėtas antikūnas yra pilnai žmogaus antikūnas.
50. 50. Panaudojimas pagal 48 punktą besiskiriantis tuo, kad minėta uždegiminė būklė parinkta iš grupės, susidedančios iš: reumatoidinio artrito, glomuronefrito, aterosklerozės, psoriazės, restenozės, autoimuninės ligos ir išsėtinės sklerozės.
51. 51. Pilnai žmogaus monokloninis antikūnas, specifiškai susiririšantis su monocitų chemotaksio baltymu-1 (MCP-1), skirtas efektyviam neoplastinių ligų gydymui gyvūnuose, kuriems reikalingas neoplastines ligos gydymas.
52. 52. Pilnai žmogaus monokloninis antikūnas pagal 51 punktą besiskiriantis tuo, kad jis skirtas neoplastinių ligų gydymui, kur neoplastinė liga parinkta iš grupės, susidedančios iš: krūties vėžio, kiaušidžių vėžio, pūslės vėžio, plaučių vėžio, glioblastomos, skrandžio vėžio, endometriumo vėžio, inkstų vėžio, gaubtinės žarnos vėžio, kasos vėžio ir prostatos vėžio.

    76 LT 5416 B
53. 53. Pilnai žmogaus monokloninis antikūnas, specifiškai susiririšantis su monocitų chemotaksio baltymu-1 (MCP-1), skirtas uždegiminių būklių gydymui gyvūnuose, kuriems reikalingas toks gydymas.
54. 54. Pilnai žmogaus monokloninis antikūnas pagal 53 punktą, besiskiriantis tuo, kad jis skirtas efektyviam uždegiminių būklių gydymui, kur uždegiminė būklė parinkta iš grupės, susidedančios iš: reumatoidinio artrito, glomuronefrito, aterosklerozės, psoriazės, restenozės, autoimuninės ligos ir išsėtinės sklerozės.
55. 55. Žmogaus monokloninis antikūnas, kuris rišasi su MCP-1 ir apima sunkiosios grandinės komplementarumą apsprendžiančią sritį (CDR) CDR1, CDR2 ir CDR3, parinktą iš grupės, susidedančios iš SEQ ID Nr. 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 50, 58, 66, 70, 74, 78, 82,

    86, 90, 94, 102, 106, 110, 114, 122, 126, 130, 134, 138 ir 142, kaip pavaizduota Fig. 7A ir 10A.
56. 56. Žmogaus monokloninis antikūnas, kuris rišasi su MCP-1 ir apima lengvosios grandinės komplementarumą apsprendžiančią sritį (CDR) CDR1, CDR2 ir CDR3, parinktą iš grupės, susidedančios iš SEQ ID Nr. 4, 8, 12, 16, 20, 28, 32, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 80, 84, 88,

    92, 96, 104, 108, 112, 116, 124, 128, 136, 140 arba 144, kaip pavaizduota Fig. 8A ir 9A.
57. 57. Žmogaus monokloninis antikūnas, kuris rišasi su MCP-1 ir apima sunkiosios grandinės komplementarumą apsprendžiančią sritį (CDR) CDR1, CDR2 ir CDR3, parinktą iš grupės, susidedančios iš SEQ ID Nr. 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 50, 58, 66, 70, 74, 78, 82,

    86, 90, 94, 102, 106, 110, 114, 122, 126, 130, 134, 138 ir 142, kaip pavaizduota Fig. 7A ir 10A ir lengvosios grandinės komplementarumą apsprendžiančią sritį (CDR) CDR1, CDR2 ir CDR3, parinktą iš grupės, susidedančios iš SEQ ID Nr. 4, 8, 12, 16, 20, 28, 32, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64,

    68, 72, 80, 84, 88, 92, 96, 104, 108, 112, 116, 124, 128, 136, 140 arba 144, kaip pavaizduota Fig.

    8A ir 9A.