KR950013772B1 - 혼성화에 의하여 세균 및 기타 생 유기체를 검출하기 위한 올리고뉴클레오티드 프로브의 제조 방법 - Google Patents

혼성화에 의하여 세균 및 기타 생 유기체를 검출하기 위한 올리고뉴클레오티드 프로브의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

혼성화에 의하여 세균 및 기타 생유기체를 검출하기 위한 올리고뉴클레오티드 프로브의 제조 방법
본 발명은 시료 중의 세균, 진핵 또는 원핵 생물 또는 원시 세균의 존재 여부를 검출하는 혼성화 프로브에 관한 것이다.
일반적으로 의사, 수의사, 식물 병리학자 및 생물학자들의 종종 인체, 동물, 채소, 사료 등과 같은 시료중에 세균 또는 기타 유기체가 함유되어 있는지를 확인해야만 한다. 현재, 생 유기체를 검출하는데 사용할 수 있는 방법에는 현미경(광학 또는 전자 현미경) 검사법, 배양법, 면역학적 검출법 및 특정 핵산 프로브에 의한 검출법이 있다. 면역학적 검출법 및 특정 핵산 프로브와 의한 검출법은 현재 단지 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila) 또는 살모넬라(Salmonella)속과 같은 특정 유기체에만 사용되고 있다. 하나 이상의 유기체를 검출할 수 있는 시약은 일반적으로 다른 종 또는 속의 유기체를 검출할 수 없는 것이 일반적이다(이와 같은 특이성의 원리는 이들 시약을 사용하는데에 대한 기초가 된다).
현미경 검사는 필연적으로 시료의 작은 일부로 한정되며, 세포 파편 또는 기타 입자들은 생 유기체를 그 자체로 투시하여 확인하는 것을 가능케 하지 않는다.
배양법은 일정 수의 유기체(특히, 세균)에 대하여, 이들 유기체(특정 생육 인자 등을 필요로 하는 호기성 또는 혐기성 세균 등)에 대하여 특이적인 배지 및 조건 하에서만 가능하다. 어떠한 배양 배지도 그 자체로서 배양될 수 있는 모든 세균의 생육을 허용할 수는 없다. 그들의 배양 방법이 알려져 있지 않으므로 현재 알려져 있지 않거나 검출할 수 없는 세균이 존재할 수도 있다. 1년 이상 연구한 후에나, 그들의 존재를 증명할 수 있었던 세균의 예가 다수 있다. 즉, 레지오네아 질병(legionnaire's disease, 필라델피아 전염병)에 있어서, 후에 인체 시료에 함유된 것으로 알려진 원인 세균은 통상적으로 염색시킨 후에도 현미경으로 볼 수 없었으며, 당시 알려진 세균 배지 상에서도 배양시킬 수 없었다. 이와 유사하게, 식물의 목질부를 감염시키는 세균도 오랫동안 알려지지 않았었다. 이들은 현미경을 사용하여 꾸준히 관찰한 결과 발견되었다. 상기와 같이, 이들 세균도 당시 공지된 배지 상에서 배양시킬 수 없었다. 상기한 예로부터, 전통적으로 사용되고 있는 방법에 의하여 연구되고 있는 배지 중에 세균 오염이 검출되지 않았다고 해서 그 배지중에 세균성 오염이 전혀 없다는 결론을 내릴 수는 없다는 것을 알 수 있다.
본 발명의 목적은 전통적인 검출 기법의 결점을 해결하기 위한 것으로서, 즉 현재까지 알려지지 않은 신뢰도로 인체 시료와 같은 특정 배지의 무균 특성을 확인하거나, 또는 세균 오염과 같은 오염의 존재를 나타내기 위한 방법을 제공하는 것이다.
이와 같은 방법에 의하여 시료가 세균 또는 기타 세포로 오염되었는지를 검출해낼 수 있으며, 더우기 세포의 수를 셀 수도 있으므로 상기 방법이 매우 유용함은 자명한 것이다. 이와 같은 검출 방법은 그 원인이 알려지지 않은 인체, 동물 및 식물의 감염의 경우에 있어서, 세균에 대한 연구를 효과적으로 자극할 것이다.
본 발명은 본 발명자들에 의한 리보소옴 RNA의 연구 도중에 얻어진 것이다. 생 유기체의 모든 고부자 성분들 중에서 리보소옴 리보헥산(RNA)은 생물학적 오염(즉, 생 유기체의 존재)을 나타내는 가장 확실한 지표인 것 같다. 이들 RNA는 세포 물질의 상당한 부분을 구성한다. 이들은 알려진 모든 생세포의 기능에 필수적이다.
작은 리보소옴 소단위의 RNA(슈크로오스 구배 초원심분리에서 그의 침강계수에 의하여 165 RNA로 공지됨)는 현재 20개 정도의 유기체에 대하여 뉴클레오티드 수준에서 공지되어 있다. 완전한 뉴클레오티드 서열의 에는 문헌[Weisburg et al., 1985, J. Bacterilo. 164, No. pp 230-236; Frydenberg and Christiansen, 1985, DNA, vol4, No. 2, pp 127-137]에 기재되어 있다.
뉴클레오티드는 통상적으로 165 RNA 분자의 5' 말단으로부터 3' 말단으로 번호매겨진다. 대장균의 165 RNA는 1542개의 뉴클레오티드로 이루어진다. 기타 생 유기체의 상응하는 분자들은 뉴클레오티드의 총수 및 뉴클레오티드 서열에 있어서 대장균의 그것들과 상이할 수 있다.
공지된 리보소옴 RNA의 뉴클레오티드 서열들을 비교하고 이들에 있어서 동일한 정도의 공통적인 부분을 발견(모든 경우에 있어서 예상되었던 서열 보존 수준을 넘는 극도의 유사성)함에 기인한 것이었다. 즉, 상이한 유기체 사이의 가변적 위치는 165 RNA 서열 전체에 분포되어 있는 것이 아니라, 특정 위치, 특히 구조의 코일 부분에 분포되어 있는 반면, 특정 부위, 특히 루프(loop) 부위는 고도로 보존적인 것으로 나타났다. 더우기, 이들 가변성은 일관적 방식으로 큰 계통학적 분류와도 일치한다. 따라서, 165 RNA 서열에 있어서, 공통적인 단위, 특히 진핵 생물 및 세균(원핵 생물) 단위와 보다 한정된 세균 균에 대하여 특이적인 단위들을 정의할 수 있다.
165 RNA는 뉴클레오티드 1492에서 1506(대장균의 165 RNA의 번호 체계에 의함)의 일반적 영역(즉, 진행 생물 및 원핵 생물에 공통적인 부위) 및 뉴클레오티드 1527에 1541의, 세균(진정 세균, 원시 세균, 메탄 세균 및 호염균)에 특이적인 부위를 갖는 것으로 나타났다. 이와 관련하여, 다음 페이지의 표를 참조할 수 있으며, 여기서, A, T, C 및 G는 DNA의 조성에 관여하는 4가지 표준 뉴클레오티드를 나타낸다. 또한, 주어진 번호에 의해 표시된 뉴클레오티드는 번호의 최초 숫자 아래에 위치한 염기이다. 예를 들어, 1490은 RNA에 상응하는 뉴클레오티드 서열중 우라실(U)에 상응한다.
Figure kpo00001
또한, 다수의 세균의 전령 RNA에도 공통적인 서열, 특히 서열
UCAUAACCCGAAGGUC
가 함유되어 있는 것으로 나타났다.
그러나, 이 서열은 상기 세균에 대해 특이적인 뉴클레오티드 1527 내지 1541부위보다 덜 일반적이다.
또한, 원시 세균은 이들 세균 형태 모두에 공통적인 서열을 갖는 것으로 나타났다. 그 서열은 다음과 같다.
UUCGACGAGRUGGGGCGC
(여기서, R은 A 또는 G이다).
이와 같이, 본 발명은 상기 발견으로부터 유도된 것으로서, 본 발명은 상기 서열에 상보적이며 유사한 수의 프로브를 구성하는 특이적 뉴클레오티드 서열을 제공하는데, 이들 프로브중 일부는 임의의 배지중 세포오염을 검출하는데 일반적으로 사용되며, 기타 프로브는 검출될 수 있는 세포를 특정 원시 세균, 더욱 구체적으로 메탄 생산 및 호염성 원시 세균을 포함하는 박테리아로서, 원시 세균으로서 그리고 일반 프로브를 사용한 혼성화 시험에서 양성 반응을 나타내고 검출 미생물을 상기한 범주로 분류하는 프로브를 사용할 경우 음성 반응을 나타내는 경우 기타 모든 범주의 유기체로 분류하는데 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 형태의 서열은 뉴클레오티드 합성에 의하여 용이하게 얻을 수 있다. 따라서, 본 발명은 더욱 구체적으로 165 RNA의 1492-1506 영역에 상보적인 펜타데카데옥시리보뉴클레오티드(15개 뉴클레오티드로 이루어진 데옥시리보헥산 서열, 또는 간략히 펜타데카머)에 관한 것으로, 이 펜타데카머는 모든 생 유기체의 165 RNA중에 존재하는 상동성 단편 뿐만 아니라 모든 생 유기체의 게놈중에 존재하는, 이 RNA 부분을 코딩하는 데옥시리보헥산(DNA)의 부분에 혼성화될 수 있다.
본 발명은 또한 세균으로 분류될 수 있는 미생물을 검출하기 위한, 상기 서열 UCAUAACCCGAAGGUC에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프로브, 및 그 자체로서 원시 세균의 특징이 되는 상기 서열 UUCGACGAGRUGGGGCGC에 상보적인 프로브에 관한 것이다.
최종적으로, 본 발명은 165 RNA의 1527-1541 영역에 상보적인 15개의 뉴클레오티드로 이루어진 DNA 서열(펜타데카머)에 관한 것으로, 이 펜타데카머는 세균 및 기타 원핵 생물의 165 RNA중에 존재하는 상동적 단편 뿐 아니라 이들 유기체의 DNA중에 존재하는 상응하는 유전자와 혼성화될 수 있으나, 진핵 세포(효모, 진균류, 원생 동물류, 인체, 동물 및 식물 조직)중의 상응하는 RNA 또는 이들 유기체의 DNA중의 상응하는 유전자와는 전혀 혼성화되지 않거나 단지 아주 약간만 혼성화될 수 있다.
따라서, 본 발명은 더욱 구체적으로 다음 조성에 관한 것이다.
1. "일반 프로브"로 칭한 프로브.
올리고뉴클레오티드 합성에 의하여 제조되는 프로브는 다음 서열을 갖는다.
(5')d-ACC TTG TTA CGA CTT(3')
여기서, (5') 및 (3')은 폴리머의 5' 및 3' 말단, 따라서 그의 극성)을 나타내며, 문자는 다음의 데옥시뉴클레오티드를 나타낸다. 즉, A는 아데닐 잔기; C는 시스티딜 잔기; T는 티미딜 잔기; G는 구아니딜 잔기를 나타내고, 문자 사이의 간격은 15개의 뉴클레오티드가 함유된 서열을 명로하게 하기 위한 것이다.
이 프로브는 상기 미생물의 165 RNA의 1492-1506부위(대장균에 대하여 사용된 번호임) 및 공지된 기타 세균, 원핵 세포 및 진핵 세포 RNA의 상응하는 부위에 상보적이며, 보다 덜하게는 미토콘드리아의 RNA에 상보적이다. 당업계의 전문가들은 이와 같은 사실로부터 이러한 프로브가 또한 자연에 존재하는 모든 세포들의 RNA에 나타날 수 있다는 것을 추론할 수 있을 것이다. 또한, 이와 같은 프로브는 이들 165 RNA 및 상응하는 진핵 세포 RNA를 코딩하는 유전자의 DNA의 상동적 부위와 짝을 이룰 수 있다.
본 발명은 또한 상기 "일반 프로브"에 상보적이며 다음의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브에 관한 것이다.
(5')d-AAG TCG TAA CAA GGT(3')
상기 프로브는 단지 한 가닥만을 갖는 165 RNA와 더 이상 짝지울 수는 없지만, 그의 두 가닥 특성으로 인하여 게놈성 DNA(165 RNA 및 상응하는 RNA를 코딩하는 유전자)의 동일한 부위와 짝을 이룰 수 있다.
2. "진정 세균 및 특정 원시 세균에 대하여 특이적인 조성" 또는 "진정 세균 프로브"로 기재된 프로브.
올리고뉴클레오티드 합성에 의하여 제조되는 바람직한 프로브는 다음 서열을 갖는다.
(5')d-AAG GAG GTG ATC CAG(3')
여기서, (5'), (3'), A, C, T 및 G는 상기 정의한 바와 같다.
이 서열은 세균, 더욱 구체적으로 진정 세균의 165 RNA의 1527-1541 부위(대장균에 사용된 번호 체게에 따라)인 공통 서열의 상호 서열에 상응한다. 이 서열은 현재 공지된 세균의 165 RNA 서열 모두에 대하여 완전히 상보적인 것은 아니지만, 최대로 1개 또는 2개의 뉴클레오티드에 있어서만 이들 165 RNA 서열과 상이하다. 대조적으로, 이와 같은 조성의 서열은 진핵 생물의 185 RNA와 미토콘드리아의 125 RNA(이들 RNA는 세균 165 RNA에 상응함)의 상동 영역과 단지 약하게만 짝을 이룰 수 있다.
본 발명은 또한 RNA 및(또는) 게놈성 DNA의 동일한 영역과 짝을 이룰수 있는 임의의 프로브, 특히 서열 UGGAUCACCUCCUUA와 짝을 이룬다는 점에서 상기 "진정 세균 프로브"와 관련하여 1개의 뉴클레오티드가 쉬프트된 상기한 서열에 관한 것으로서, 이 프로브는 다음 서열로 이루어진다.
(3') ACCTAGTGGAGGAAA (5'), 또는(판독 방향이 역전된 경우로서 대부분의 세균에서 나타나는)
(5')d-AAAGGAGGTGATCCA(3')
본 발명은 또한 그 서열이 상기 "진정 세균에 대하여 특이적인 프로브"중에 함유되거나 또는 "쉬프트된 서열"을 함유하는 프로브중에 함유되는 보다 작은 임의의 올리고뉴클레오티드 프로브에 관한 것이다.
그럼에도 불구하고, 이들 프로브는 뉴클레오티드 1534 내지 1541 사이의 165 RNA 영역에 상보적인 적어도 서열 TGGAGGAA (5')을 함유하는 서열, 특히
(5')d-AAGGAGGT(3')
(5')d-AAAGGAGGT(3')
(5')d-AAGGAGGTG(3')
(5')d-AAGGAGGTGA(3')
(5')d-AAGGAGGTGAT(3')
(5')d-AAGGAGGTGATC(3')
(5')d-AAGGAGGTGATCC(3')
(5')d-AAGGAGGTGATCCA(3')
을 포함한다.
상기 서열들에 대하여 상보적인 서열들도 또한 본 발명에 따른 프로브 군의 일부분이 된다.
가장 긴 프로브가 그의 큰 짝 안정성 때문에 바람직하다는 것이 강조될 수 있다. 또한, 동일 서열내 하나의 뉴클레오티드를 또 다른 뉴클레오티드로 치환시킬 경우 특정 세균 군의 165 RNA에 대하여 보다 높은 친화력을 얻을 수 있지만 대부분의 다른 세균 군에 대해서는 상보성이 약화될 것이다. 한편, 서열을 3' 말단에서 CCGCA 단위 전부 또는 일부로 연장시킬 경우, 그 서열 단위의 상보 서열이 척추 동물의 185 RNA중에 나타나므로 특이성에 있어서 이득이 없을 것이다.
3. 원시 세균에 대해 특이적인 프로브.
최종적으로, 본 발명은 보다 특히 원시 세균에 대하여 특이적인 프로브에 관한 것으로서, 이러한 프로브는 다음 서열중에 함유된 적어도 8개, 최대로 18개의 뉴클레오티드로 서열을 갖는다.
AAGCTGCTCR'ACCCCGCG
여기서, R'은 T 또는 C이다.
프로브의 사용을 위한 일반적인 조건.
일반 프로브, 진정 세균에 대하여 보다 특이적인 프로브 및 원시 세균에 대하여 보다 특이적인 프로브와 이들의 상보적 조성은 표지화시키는 것이 유리하다. 전통적인 어느 표지를 사용하여도 무방하다, 프로브는32P,35S,125I,3H 또는14C와 같은 방사성 트레이서를 사용하여 표지화시킬 수 있으며, 이들은 단지 가장 일반적으로 사용되는 트레이서를 열거한 것일 뿐이다. 방사성 표지화는, 예를 들어, 방사성 표지화된 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 키나제(포스파타제로 포스포릴기를 제거하거나 제거하지 않은 상태로) 또는 표지화시킬 말단 부위에 따라서 리가제를 사용하여 3' 또는 5' 말단에서의 말단 표지화와 같은 임의의 방법으로 행할 수 있다. 이들 경우에 있어서, 표지화된 서열 조성물은 16개의 뉴클레오티드를 가지게 된다(3' 또는 5' 말단에 첨가되는 방사성 뉴클레오티드는 어느 형태여도 무방하다). 상보적 서열 조성물을 포함하는 본 발명의 프로브중 하나는 방사성 뉴클레오티드 또는 방사성 및 비방사성 뉴클레오티드의 조합으로 되는 약 15개의 뉴클레오티드로 이루어진 짧은 가닥의 합성에 있어서 주형으로서 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 프로브는 하나 이상의 방사성 뉴클레오티드를 사용하여 화학 합성에 의하여 제조할 수 있다. 방사성 표지화의 또 다른 방법은 본 발명에 의한 프로브를 화학적으로 요오드화시키는 것으로, 이 방법에 의하여 수개의125I 원자를 올리고머에 결합시킨다. 본 발명의 프로브 또는 상보적 프로브중 하나를 비-방사성 RNA 또는 DNA와 혼성화시키는데 사용하기 위하여 방사성화시킬 경우, 혼성화를 검출하는 방법은 사용된 방사성 트레이서에 따라 변할 것이며, 이 방법은 자동 방사선 사진술, 액체 신틸레이션, 감마 카운팅 또는 방사성 트레이서에 의하여 방출되는 이온화 방사선을 검출 가능하게 하는 기타 기술에 기초할 수 있다.
또한, 비방사성 표지화도 사용될 수 있으며, 본 발명의 프로브를 면역학적 특성(항원, 합텐), 특정 시약에 대한 특이적 친화력(리간드), 검출 가능한 효소 반응을 완료시키는 특성(효소 또는 조효소, 효소 기질 또는 효소 반응에 관련된 기타 물질), 또는 물리적 특성(예, 형광(성) 또는 임의 파장의 광을 방출 또는 흡수하는 특성)을 갖는 잔기와 반응시키는 것으로서, 이는 단지 이러한 방법의 몇가지 예를 기술한 것이다. 또한, DNA/RNA 혼성물을 특이적으로 감지하는 항체도 또한 수 있다.
상기 화학적 표지화는 본 발명의 프로브의 화학적 합성 도중 수행할 수 있으며, 아데노신, 구아노신, 시스티딘 및 티미딘 잔기를, 프로브와 상보적 DNA 또는 RNA 단편 사이에 형성된 조성체 또는 혼성체가 검출될 수 있게 하는 기타 화학적 잔기와 커플링시킬 수 있다. 그러나, 기타 화학적 잔기와의 결합에 의해 변형된 뉴클레오티드를 사용한 프로브의 서열은 본 발명의 프로브중 하나의 뉴클레오티드 서열과 동일한 것이다.
또한, 본 발명은 혼성화에 의한 검출 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 그 자체로 상기한 바와 같이 미리 표지화시키거나 검출 가능하게 만든 본 발명에 따른 프로브를 사용하는 것이다.
본 발명에 따른 프로브의 선택은 추구하는 목적에 따라 달라질 것이다. 즉, 원핵 세포 및 진핵 세포의 검출(일반 프로브), 165 계열의 RNA를 코딩하는 유전자를 수반하며 원색 세포 또는 진핵 세포의 구별없이 유래하는 DNA 또는 DNA 단편의 검출 또는 위치 확인(일반 조성체 또는 이 조성체에 상보적인 프로브), 세균성 세포만의 배타적 검출(진정 세균에 대하여 특이적인 프로브), 세균성 165 RNA를 코딩하는 유전자를 갖는 DNA 또는 DNA 단편의 검출 또는 위치 확인(진정 세균에 대하여 특이적인 프로브 또는 이 프로브에 상보적인 프로브), 본 발명에 따른 하나 이상의 프로브의 용도는 특정 혼성화 기술에만 한정되지 않는다.
생 유기체로부터 유래하는 세포 또는 유기체 자체를 검출하려면, 이들 세포의 RNA 및(또는) DNA를 화학적 또는 물리적 방법을 사용하여 부분적으로 또는 전체적으로 용해시켜 검출가능하도록 해야 하며, 본 발명에 따른 그 자체로서 검출 가능하게 만든 하나 이상의 프로브와 접촉시켜야 한다. 이와 같은 접촉은 통상적예를 언급하자면 니트로셀룰로오스, 변형되거나 변형되지 않은 셀룰로오스 또는 나일론 필터와 같은 적절한 지지체 상에서 또한 조직 단편 또는 세포 스메어(smear) 상에서 또는 지지체 없이 액체 배지중에서 행할 수 있다. 이러한 접촉은 적정 또는 제한적 조건, 즉 조건이 보다 "제한적"임에 따라 서열이 크기 면에서 증가하는 길이의 분자에 걸쳐 완전히 상동적인 경우에만 혼성체의 형성이 일어나는 온도 및 이온 농도의 조건하에 핵산 짝짓기의 적정 온도를 저하시키는 물질(포름아미드, 디메틸 술폭시드, 우레아)의 존재 또는 부재하에 또한 반응 용적을 표면적으로 감소시키는 물질(덱스트란, 덱스트란 술페이트)의 존재 또는 부재하에 일어난다.
지지체 상의 프로브 분자의 미반응 분자 또는 단편의 제거는, S1뉴클레아제 또는 단일 가닥 DNA 또는 단일 가닥 RNA를 분해시키지만, DNA/RNA 혼성체 또는 이중 가닥 DNA는 분해시키지 않는 다른 효소로 처리하거나 처리함이 없이 적당한 온도에서 적당한 이온 강도를 갖는 완충 용액으로 세척하여 수행할 수 있다. 액상 배지 중에서, RNA 또는 DNA 단편과 짝을 이룬 프로브의 분자(또는 단편)은 반응하지 않은 분자들로부터 히드록시아파타이트 상에서의 크로마토그래피에 의하여 분리하거나, S1뉴클레아제로 처리한 후 유리 뉴클레오티드로부터 이중 가닥 단편을 분리시키기 위한 어느 방법(가장 보편적인 방법으로서, 히드록시아파타이트 또는 DEAE-셀룰로오스 상에서의 크로마토그래피, 배제 크로마토그래피, 선택적 침강법, 투석법)으로나 분리할 수 있다.
이어서, 사용된 프로브 분자(또는 단편)을 선태된 표지의 형태에 따라서 가장 유리한 방법으로 검출한다.
본 발명의 프로브에 대하여 각종 문헌[Maniatis et al., 1982, "Molecular cloning, A laboratory manual", Cold Spring Harbor Labiratory; Grimont et al., 1985, J. Clin. Microbiol. Vol 21, No. 3, pp 431-437] 또는 특허(프랑스 특허 제84/12,250호, 동 제78/10,975호, 동 제81/24,631호; 유럽 특허 제0,133,288호 및 동 제0,063,879호 참조)에 상세하게 기재된 기술을 유리하게 적용할 수 있다.
165 RNA를 코딩하는 유전자를 갖는 염색에 DNA 단편 또는 상응하는 RNA의 위치를 확인하고자 하는 경우, DNA를 하나 이상의 제한 효소로 처리한 후, 전기영동 또는 크로마토그래피에 의하여 단편들을 분리시키고, DNA 단편들을 변성시키고(즉, 두 가닥을 분리시킴), 본 발명에 따른 하나의 프로브를 혼성화에 적절한 조건 하에서 DNA 단편과 접촉시키고, 혼성화를 완료시키는데 필요한 시간이 경과한 후, 조성물중 혼성화되지 않은 단편들을 혼성화된 단편들로부터 분리해내고, 세포 검출에 대하여 상기한 바와 같이 표지를 가시화시킨다.
본 발명에 따른 임의의 프로브에 대하여 유럽 특허 제0,120,658호(John A. Webster Jr.) 또는 상기한 문헌들(Maniatis et al. 또는 Grimont et al.)등에 상세하게 기재된 기술을 사용할 수 있다. 165 RNA를 코딩하는 유전자를 가진 염색체 DNA 단편의 위치를 확인하는데 있어서, 본 발명에 따른 하나의 프로브 및 이 프로브에 상보적인 프로브를 사용할 경우 동일한 결과를 얻을 수 있음에 유의해야 한다.
일반적으로, 본 발명에 따른 상이한 프로브를, 이형 DNA 존재가 의도한 사용시 프로브의 특이성을 손상시키지 않는 한, 또한 클론화될 수 있는 재조합 DNA중에 함유될 수 있다.
최종적으로, 티미딘기가 우라실기에 의하여 치환된 프로브들(이들 프로브는 보다 구체적으로 청구된 프로브들과 전적으로 대등한 것으로 고려되어야 함)도 이들의 합성이 보다 어렵긴 하지만 본 발명의 일부를 구성한다.

Claims (12)

  1. 서열 (5')d-AAG GAG GTG ATC CAG(3')[여기서, (5') 및 (3')은 폴리머의 5' 및 3' 말단을 나타내며, 문자는 다음의 뉴클레오티드 잔기, 즉 A는 아데닐 잔기, C는 시티딜 잔기, T는 티미딜 잔기, G 구아니딜 잔기임]의 펜타데카데옥시리보뉴클레오티드, 또는 그의 상보적 서열
    (5')d-CTG GAT CAC CTC CTT(3')
    을 갖는 펜타데카데옥시리보뉴클레오티드를 뉴클레오티드 합성법으로 제조하는 것을 특징으로 하는, 시료중의 세균의 존재를 검출하거나, 또는 전기 영동 또는 크로마토그래피에 의하여 분리된 DNA 단편중 세균의 165 RNA를 코딩하는 유전자를 갖는 DNA 단편의 위치를 확인하기에 적합한 프로브의 제조방법.
  2. 서열 (3') ACCTAGTGGAGGAAA(5') 또는 그의 상응하는 상보적 서열을 뉴클레오티드 합성법으로 제조하는 것을 특징으로 하는, 시료중의 세균의 존재를 검출하거나, 또는 전기 영동 또는 크로마토그래피에 의하여 분리된 DNA 단편중 세균의 165 RNA를 코딩하는 유전자를 갖는 DNA 단편의 위치를 확인하기에 적합한 프로브의 제조 방법.
  3. 다음 서열 군
    (5')d-AAGGAGGT(3')
    (5')d-AAAGGAGGT(3')
    (5')d-AAGGAGGTG(3')
    (5')d-AAGGAGGTGA(3')
    (5')d-AAGGAGGTGAT(3')
    (5')d-AAGGAGGTGATC(3')
    (5')d-AAGGAGGTGATCC(3')
    (5')d-AAGGAGGTGATCCA(3')
    또는 이에 상응하는 상보적 서열로 이루어진 군중에서 선택되는 서열을 뉴클레오티드 합성법으로 제조하는 것을 특징으로 하는, 시료중의 세균의 존재를 검출하거나, 또는 전기 영동 또는 크로마토그래피에 의하여 분리된 DNA 단편중 세균의 165 RNA를 코딩하는 유전자를 갖는 DNA 단편의 위치를 확인하기에 적합한 프로브의 제조 방법.
  4. 서열 (5')d-ACC TTG TTA CGA CTT(3')[여기서, (5') 및 (3')은 폴리머의 5' 및
    3' 말단을 나타내며, 문자는 다음의 뉴클레오티드 잔기, 즉, A는 아데닐 잔기, C는 시티딜 잔기, T는 티미딜 잔기, G 구아니딜 잔기임]의 펜타데카데옥시리보뉴클레오티드, 또는 그의 상보적 서열
    (5')d-AAG TCG TAA CAA GGT(3')
    을 갖는 펜타데카데옥시리보뉴클레오티드를 뉴클레오티드 합성법으로 제조하는 것을 특징으로 하는, 시료중의 진핵 생물 또는 원핵 생물(세균 포함)의 세포를 검출하거나, 또는 전기 영동 또는 크로마토그래피에 의하여 분리된 DNA 단편중 이들 세포의 165 계열 RNA를 코딩하는 유전자를 갖는 DNA 단편의 위치를 확인하기에 적합한 프로브의 제조 방법.
  5. 서열 AAGCTGCTCR'ACCCCGCG(여기서, R'는 T 또는 C임)중에 함유된 8개 이상 18게 이하의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보적 서열을 뉴클레오티드 합성법으로 제조하는 것을 특징으로 하는, 시료중의 원시 세균의 존재를 검출하거나, 또는 전기 영동 또는 크로마토그래피에 의하여 분리된 DNA 단편중 원시 세균의 165 RNA를 코딩하는 유전자를 갖는 DNA 단편의 위치를 확인하기에 적합한 프로브의 제조 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프로브를, 특히 양 말단중 한쪽 말단 또는 양말단 모두에서 1 또는 2개의 방사성 뉴클레오티드로 방사성 표지화하거나, 특히 효소, 리간드, 발광 또는 형광 표지들로 표지화하는 것을 특징으로 하는 프로브의 제조 방법.
  7. 제 4 항에 있어서, 상기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프로브를, 특히 양 말단중 한쪽 말단 또는 양말단 모두에서 1 또는 2개의 방사성 뉴클레오티드로 방사성 표지화하거나, 또는 특히 효소, 리간드, 발광 또는 형광 표지들로 표지화하는 것을 특징으로 하는 프로브의 제조 방법.
  8. 제 5 항에 있어서, 상기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프로브를, 특히 양 말단중 한쪽 말단 또는 양말단 모두에서 1 또는 2개의 방사성 뉴클레오티드로 방사성 표지화하거나, 또는 특히 효소, 리간드, 발광 또는 형광 표지들로 표지화하는 것을 특징으로 하는 프로브의 제조 방법.
  9. 시료중에 존재할 것으로 예상되는 세균의 DNA 또는 RNA를 상보적 단일 사슬 뉴클레오티드 프로브와 혼성화될 수 있는 상태로 만들고, 상기 DNA 또는 RNA를 상기 시료중에서 혼성화 조건하에 제11항 내지 13항중 어느 하나의 항에 따른 방법으로 제조된 프로브와 접촉시키고, 혼성화가 확인되는지의 여부에 따라 상기 시료중의 세균의 존재 여부를 검출하는 것을 특징으로 하는, 시료중 세균 존재 여부의 검출 방법.
  10. 시료중에 존재할 것으로 예상되는 진행 생물 또는 원핵 생물(세균포함) 세포의 DNA 또는 RNA를 상보적 단일 사슬 뉴클레오티드 프로브와 혼성화될 수 있는 상태로 만들고, 상기 DNA 또는 RNA를 상기 시료중에서 혼성화 조건하에 제 4 항에 따른 방법으로 제조된 프로브와 접촉시키고, 혼성화가 확인되는지의 여부에 따라 상기 시료중의 진핵 생물 또는 원핵 생물(세균 포함)의 존재 여부를 검출하는 것을 특징으로 하는, 시료중 진핵 생물 또는 원핵 생물(세균 포함)의 존재의 여부의 검출 방법.
  11. 시료중에 존재할 것으로 예상되는 원시 세균 세포의 DNA 또는 RNA를 상보적 단일 사슬 뉴클레오티드 프로브와 혼성화될 수 있는 상태로 만들고, 상기 DNA 또는 RNA를 상기 시료중에서 혼성화 조건하에 제 5 항에 따른 방법으로 제조된 프로브와 접촉시키고, 혼성화가 확인되는지의 여부에 따라 상기 시료중의 원시 세균의 존재 여부를 검출하는 것을 특징으로 하는, 시료중 원시 세균의 존재여부의 검출 방법.
  12. 전기 영동 또는 크로마토그래피에 의하여 분리 및 변성시킨 165 계열 RNA를 코딩하는 유전자를 갖는 것으로 예상되는 DNA 단편들을 상보적 단일 사슬 뉴클레오티드 프로브와 혼성화될 수 있는 상태로 만들고, 이를 혼성화 조건하에 제 1 항 내지 5항중 어느 하나의 항에 따른 방법으로 제조된 프로브와 접촉시키고, 혼성화가 확인되는지의 여부에 따라 상기 단편중 상기 유전자를 코딩하는 DNA 단편의 위치를 확인하는 방법.
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