KR940003651B1 - 인간/인간 하이브리도마 배양용 무혈청배지 - Google Patents

인간/인간 하이브리도마 배양용 무혈청배지 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

인간/인간 하이브리도마 배양용 무혈청배지
제1도는 실시예 1 내지 5에서 레티노인산의 양과 항체의 양 사이의 관계를 나타내는 그래프.
제2도는 실시예 6(2차 배양)에서 얻은 결과를 나타내는 그래프.
제3도는 실시예 7 내지 9에서 얻은 결과를 나타내는 그래프.
본 발명은 예를들면 생화학 메카니즘의 분석에 있어 인간 단일클론항체-생산 인간/인간 하이브리도마 배양에 유용한 무혈청배지 및 바이오테크놀로지 분야에서 진단, 예방 및 치료용으로 유용한 생물생성물의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 특별하게는, 인간/인간 하이브리도마를 배양하여 현저하게 개량된 인간 단일클론항체를 수득할 수 있으며 공업적으로 적당한 2차 배양을 수행할 수 있는, 인간 단일클론항체-생산 이간/인간 하이브리도마 배양용 무혈청배지에 관한 것이다.
더욱 상세하게는 본 발명은 무혈청 완전배지 및 10-12M 내지 10-6M, 바람직하게는 10-10M 내지 10-6M, 더 바람직하게는 10-9M 내지 10-7M의 레티노인산 또는 그의 염을 함유한 인간 단일클론항체 생산 인간/인간 하이브리도마 배양용 무혈청배지에 관한 것이다.
다수의 기본배지(혈청 또는 혈칭 알부민과 같은 혈청성분을 함유하지 않은 배지), 예를들면 동물세포 배양용 기본배지가 공지되어 있으며, 약 50개의 기본배지가 시판되고 있다. 동물세포의 배양에 있어서, 세포의 실제적인 정도의 성장 및 중식력을 유지하기 위해 이들 기본배지에 소혈청 또는 인간혈청과 같은 혈청 적당량, 예를들면 약 5~10%(부피/부피-배지)를 가함으로써 완전배지로 사용하는 것이 통상적이다.
그러나, 혈핑은 고밀도 리포리피드(HDL) 및 저밀도 리포리피드(LDL)을 포함한 각종 외래성의 이질적 인자들을 함유하며, 배지에 이런 바람직하지 못한 이질 인자들이 포함되는 것을 피할 수가 없다. 세포증식 메카니즘 및 항체 생산 메카니즘과 같은 생화학 메카니즘의 분석 또는 항체 또는 기타 유용한 물질과 같은 생물생성물의 제조에 혈청함유 완전배지를 사용하면 각종의 기술적 문제점을 야기시킨다. 예를들면 생화학적 메카니즘의 분석이 방해되거나, 배지에 첨가된 혈청으로부터의 이질적 인자를 포함하지 않은 고품질을 갖는 고순도의 유용한 생물적 물질을 용이한 조작에 의해 수득할 수 없다.
이러한 문제점을 피하기 위해, 동물세포를 무혈청배지에서 배양하는 것이 바람직하다. 보통, 이런 무혈청 배지를 사용하면 배양된 세포의 성장, 증식 및 항체 생산에 역효과를 미치거나, 공업용으로 바람직한 2차 배양을 불가능하게 한다. 혈청으로부터 유도된 각종 혼합이질 인자의 유해한 효과는 인간 단일클론항체 생산 인간/인간 하이브리도마의 배양에 더욱 심각한 기술적 난감을 야기시킨다.
본 발명의 발명자중의 한명은 예기치 않게, 이미 통상적으로 사용된 아미노산의 농도보다 상당히 고농도의 아미노산 성분, 특히 특이한 고농도의 L-아르기닌을 적어도 하나의 아미노산 성분으로 포함시킴으로써, 혈청 및/또는 혈청알부민을 함유하지 않으며, 인간/인간 하이브리도마의 성장, 증식 및 항체 생산등을 유지할 수 있으며, 따라서 혈청 및/또는 혈청알부민으로부터 유도된 이질인자의 유해한 영향이 없는 실제로 무혈청 완전배지를 제공할 수 있다는 것을 발견하였다. 이러한 발견을 기초로 한 발명은 일본국 특허출원 제192145/1985호(일본국 특허공개 제51983/1987호)에 출원되어 있다. 그러나, 이 특허서류에는 무혈청 완전 배지에 레티노인산의 배합이 기재되어 있지 않으며, 상기의 배지에서 인간/인간 하이브리도마의 배양시 레티노인산의 효과에 대한 설명 및 제안이 없다.
이미 하기 일반식의 레티노인산(비타민 A산으로도 공지)을 함유한 배지를 사용한 세포배양에 관한 몇가지 논문이 공개되었다.
Figure kpo00001
예를들어 프랑크 등[Frank H., Valone, and Donald G.Payan, “Cancer Research”, 45, 4128-4131(1985)]은 5×10-6M의 레티노인산을 함유한 혈청함유 배지에서, 인간 혈액시료로부터 채취되어 정제된 인간 B 림파구의 증식이 억제된다는 것을 발견하였다. 이것은 단지 레티노인산의 이용에 대해 약간의 발견만을 설명하고 있을 뿐이며, 무혈청배지에서 레티노인산의 효과 및 인간/인간 하이브리도마의 배양시 레티노인산의 효과에 대해서는 전혀 설명이 없다. 이 논문은 5×10-6M의 레티노인산을 함유한 혈청함유 배지에서 인간 B 림파구의 항체 생산에 대한 레티노인산의 효과에 대한 설명 또는 제안이 없다.
닐 시델 등[Neil Sidell et al., “Cellular Immuno-logy”, 88, 374-381(1984)]은 B 림파구의 항체-생산세포로의 분화는 10-7M, 10-6M 및 10-5M 농도의 레티노인산을 함유한 혈청 함유배지에서 편도선 림파구를 항원과 함께 배양함으로써, 또는 10-5M의 레티인노산을 함유한 혈청함유 배지에서 편도선 림파구로부터 정제된 인간 B 림파구를 항원과 함께 배양함으로써 촉진된다는 것을 보고하였다. 이 논문에서 무혈청배지의 발견에 대해서는 언급이 없으며, 인간/인간 하이브리도마 배양시 레티노인산의 효과에 대해서도 기재되어 있지 않다. 또한 이미 분화된 항체 생산 세포에 대한 레티노인산의 효과, 특히 이들 세포의 항체 생산능에 대한 효과에 대해서는 어떤 설명 또는 제안도 없다.
상기에 언급한 바와 같이, 이들 종래의 참고 문헌들은 레티노인산을 더 함유한 혈청함유 배지에 대해서만 기재되어 있으며, 무혈청배지에서 레티노인산의 작용 및 효과에 대한 설명이 없다. 더욱이, 이들 문헌에는 인간 단일클론항체 생산 인간/인간 하이브리도마의 성장, 증식 및 항체생산능에 대한 레티노인산의 효과에 대해서는 어떤 발견도 설명 또는 제안되어 있지 않다.
그러므로, 무혈청배지의 성분으로서 레티노인산 또는 그의 염의 이용 및 인간 단일클론항체 생산 인간/인간 하이브리도마의 배양에 있어서 그의 작용은 과거에 전혀 알려져 있지 않다.
본 발명자들은 인간/인간 하이브리도마, 특히 단일클론항체 생산 인간/인간 하이브리도마의 배양에 적당한 무혈청 완전배지의 개발에 대한 연구를 계속하였다.
본 발명에 있어서, 무혈청 완전배지는 혈청을 함유하지 않는 완전배지를 의미한다. 그러나 필요하다면 혈청알부민을 가할 수 있다.
이러한 연구에 의해, 무혈청 완전배지에 10-12M 내지 10-6M 농도의 레티노인산 또는 그의 염을 가함으로써 제조된 무혈청 배양배지가 인간 단일클론항체 생산 인간/인간 하이브리도마의 배양에 적당하며, 인간-인간 하이브리도마의 항체생산능을 현저하게 증가시키며, 공업적 규모의 하이브리도마의 2차 배양을 잘 수행할 수 있게 한다는 것을 발견하였다.
본 발명자들의 연구는 첨부하는 도면의 제1도에서와 같이 레티노인산을 함유한 무혈청 완전배지에서 레티노인산의 함량은 상당히 결정적인 작용을 나타내며, 본 발명의 배지에서 단일클론항체 생산 인간/인간 하이브리도마에 의해 생산된 단일클론항체의 양은 약 10-10M 내지 10-9M의 레티노인산 함량에서 급격히 증가하고, 약 10-8M 내지 10-7M의 레티노인산 함량에서 최대에 도달하며, 10-6M을 초과할때 급격히 감소한다는 것을 나타낸다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 동물세포 배양용 기본배지 및 인슐린 및 트랜스퍼린에서 선택된 적어도 하나의 성장인자로 구성되며 혈청이 없는 무혈청 완전배지가 널리 사용될 수 있다. 이 무혈청 완전배지에서 10-12M 내지 -6 바람직하게는 10-12M 내지 10-6M, 더 바람직하게는 10-9M 내지 10-7M 농도의 레티노인산을 포함시킴으로써, 인간 단일클론항체 생산 인간/인간 하이브리도마 배양용 무혈청배지가 제공될 수 있다.
그러므로, 본 발명의 목적은 인간 단일클론항체 생산 인간/인간 하이브리도마 배양용 무혈청배지를 제공하는 것이다.
본 발명의 상기 및 기타의 목적 및 이점은 하기의 설명으로부터 더욱 명백해질 것이다.
본 발명에 따른 인간 단일클론항체 생산 인간/인간 하이브리도마 배양용 무혈청배지는 무혈청 완전배지에 10-12M 내지 10-6M의 레티노인산 또는 그의 염을 함유한다.
본 발명에 사용된 무혈청 완전배지는 공지 및 시판되는 기본배지(혈청 또는 혈청알부민과 같은 혈청성분을 함유하지 않은 배지) 및 적어도 하나의 성장인자로 구성된 무혈청 완전배지일 수 있다. 이련 무혈청 완전배지의 바람직한 예는 동물세포 배양용 공지의 시판 기본배지 및 인슐린 및 트랜스퍼린의 군에서 선택된 적어도 하나의 성장인자로 구성되며, 혈청이 포함되지 않은 무혈청 완전배지이다.
무혈청 완전배지는 기본배지에 인슐린 및/또는 트랜스퍼린을 첨가함으로써 완전배지를 형성하기 위해 사용될 수 있는 완전배지 형성 첨가제(본 발명에서 혈청은 제외한다)를 함유할 수 있다. 완전배지 형성 첨가제의 예로는 배양배지를 위한 β-메르캅토에탄올, Na 또는 K 셀레나이트와 같은 셀레나이트, 에탄올아민, L-아르기닌, 알부민, 기타공지의 아미노산, 비타민, 무기질, 핵산유도체, 탄수화물, 보효소 및 지방산이 있다. 이들은 적당히 배합사용될 수 있다. 무혈청 완전배지의 예는 하기에 나타낸다. 예를들면,
(1) 동물세포 배양용 기본배지, (2) 인슐린 및 트랜스퍼린의 군에서 선택된 적어도 하나의 성장인자, (3) 에탄올아민, (4) 메르캅토에탄올, 및 (5) 셀레나이트(예, Na 또는 K 셀레나이트), 및 더욱이 (6) 약 1000mg/ℓ 완전배지 내지 약 45000mg/ℓ 완전배지의 고농도 L- 아르기니을 필수성분으로 함유하는 동물세포배양용 완전배지(본 출원과 동일 출원인이 출원한 일본국 특허 공개 제51983/1987호)로 구성된 무혈청배지, 및 L-아르기닌 (6) 대신에 약 0.1 내지 약 1mg/ml 완전배지의 (7) 혈청알부민을 함유하는 것을 제외하고는 상기와 같은 조성의 무혈청배지가 인용될 수 있다.
필수적으로 상기의 성분(1), (2), (4), (5) 및 (6)으로 구성된 무혈청배지, 필수적으로 상기의 성분(1), (2), (4), (5) 및 (7)로 구성된 무혈청배지, 필수적으로 상기의 성분(1), (2), (4) 및 (5)로 구성된 무혈청배지, 및 필수적으로 상기의 성분 (1), (2) 및 (5)로 구성된 무혈청배지도 특정량의 레티노인산 및 그의 염을 포함시킴으로써 본 발명에 사용될 수 있다.
기본배지(1)에 첨가될 성분(2) 내지 (7)의 양은 이들 필수성분의 종류, 그의 배합, 배양목적, 배양될 인간/인간 하이브리도마의 종류에 따라 적당히 변화될 수 있으며, 일반화 될 수 없다. 그러나 당업자들은 이들 인자에 따라 실험적으로 바람직한 양을 용이하게 결정할 수 있다. 필수성분으로 (1) 내지 (6)을 함유한 상기의 무혈청 완전배지의 경우, 양은 예를들면 완전배지1ℓ당 성분(2)는 약 2~5mg, 성분(3)은 약 10-8내지 10-4몰, 성분(4)는 약 10-8내지 10-4몰 및 성분(5)는 약 10-11내지 10-7몰 일 수 있다.
동물세포 배양용 기본배지(1)의 각종예는 공지되어 있으며, 공지문헌(예를들면, “Cell Culture Manual”, 3판, 1984. 7. 20, 고단샤사이언티픽 발행)에 따라 제조될 수 있다. 이들 중 많은 것이 시판되고 있으며, 본 발명에 이용될 수 있다.
이런 기본배지의 예로는 하기에 나타내는 공지의 기본배지 및 그의 공지변형배지가 있다.
BME 배지(기본배지 이글)[예를들면, Eagle, H. : Science, 122, 501(1955) ; Eagle, H. : J.Exp.Med., 102,37(1955) 및 102,595(1955) ; Eagle,H. : J.Biol.Chem., 214,839(1955) ; Eagle, H.et al. : Science, 123,845(1955) ; Hanks,J.H., Wallace,R.E. : Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,71,196(1949) ; Yamane, I. : Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,127,335(1968) ; Morton,H.J. : In Vitro,6,89(1970) ; 및 Eagle,H. : Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,89,362(1955)에 설명되어 있다].
MEM 배지(최소필수배지)[예를들면, Eagle,H. : Science,130,432(1959) ; Stoker,M.,MacPherson, I. : Virology, 14,359(1931) ; MacPherson,I.,Stoker,M. : Virology,16,147(1962) ; Stoker,M.,MacPherson,I. : Nature,203,1355(1964) ; Dulbecco,R.,Freeman,G. : Virology,8,396(1959) ; Smith J.D.,et al. : Virology,12,185(1960) ; Stanners,C.P.et al. : Nature New Biology,230,52(1971) ; 및 Stanners,C.P.,Stewart,C. : Personal Communication(1972)에 설명되어 있다].
199 배지[예를들면, Morgan J.F.et al. : J.Nat.Cancer Inst.,16,557(1955) ; 및 Morton,H.J. : In Vitro,6,89(1970)에 설명되어 있다].
L-15 배지[예를들면, Leibvitz,A. : Amer.J.Hyg.,78,173(1963)에 설명되어 있다].
Ham's 배지[예를들면, Ham,R.G. : Exp.Cell Res.,29,515(1963) ; Ham,R.G. : Proc.Nat.Acad.Sci.,53,288(1965) : 및 Morton,H.J. : In Vitro,6,89(1970)에 설명되어 있다].
맥코이 5A 배지[예를들면, Neuman,R.E.,McCoy,T.A. : Proc,Exp.Biol.Med., 98,303(1958) ; McCoy,T.A.,et al. : Proc.Exp.Biol.Med.,100,115(1959) ; 및 Hsu,T.C., Kellogg,D.S. : J.Nat.Cancr Inst.,25,221(1960)에 설명되어 있다].
RPMI 배지[예를들면, Moore,G.E.et al. : J.A.M.A.,199, 519(1967), 및 Moore,G.E.et al. : J.Nat. Concer Inst.,36,405(1966) 에 설명되어 있다].
윌리암스 배지 E[예를들면, Williams,G.M.,Weisburger,E.K. 및 Weisburger,J.H. : Exp.Cell Res., 69,106-112(1971)에 설명되어 있다].
NCTC 135배지[예를들면, Evans, V.J.et al. : Exp.Cell Res., 36,439(1968)에 설명되어 있다].
웨이마우쓰 배지 MB752/ℓ[예를들면, Waymouth,C : J.Nat.Cancer Inst.,22,1003(1959), 및 Morton, H.J. : In Vitro, 6,89(1970)에 설명되어 있다].
상기 예시된 동물세포 배야용 기본배지는 단독으로 또는 적당한 비율의 혼합물로 사용될 수 있다.
인간 단일클론항체 생산 인간/인간 하이브리도마 배양용 본 발명의 무혈청배지는 상기에 설명한 무혈청 완전배지 및 10-12M 내지 10-6M의 레티노인산 또는 그의 염으로 구성된다.
레티노인산 또는 그의 염의 양은 무혈청 완전배지를 구성하는 기본배지 및 완전배지 형성 첨가제의 종류, 그들의 배합 및 비율, 배양될 인간/인간 하이브리도마의 종류 및 배양목적과 같은 각종 인자에 따라 상기의 범위내에서 적당히 변화될 수 있다. 당업자들은 필요하다면 이들 인자에 따라 레티노인산 또는 그의 염의 바람직한 량을 선택 및 결정할 수 있다. 바람직한 양은 예를들면 10-10M 내지 10-6M, 특히 10-9M 내지 10-7M이다. 공업적인 규모의 2차 배양에서 세포수의 증가와 항체의 방출사이의 균형의 면에서, 레티노인산 또는 그의 염의 특히 바람직한 양은 예를들면 10-9M 내지 10-7M이다. 항체의 방출은 레티노인산 또는 그의 염의 함량이 상기에 지정된 범위보다 작거나 크면 상당히 감소한다. 레티노인산 또는 그의 염을 함유한 본 발명의 무혈청배지를 사용함으로써 배양될 인간 단일클론항체 생산 인간/인간 하이브리도마에는 특별한 제한이 없다. 본 발명의 무혈청배지는 인간 단일클론항체 생산능을 갖는 어떤 인간/인간 하이브리도마를 배양하기 위해 사용될 수 있다.
인간/인간 하이브리도마 및 그의 형성 방법은 본 발명의 주제가 아니다. 이런 하이브리도마의 예로는 일본국 특허공개 제201994/1983호, 제13589/1984호, 제137497/1984호 및 제70400/1987호에 기재된 방법에 의해 수득될 수 있는 이 문헌에 기재된 인간 단일클론항체 생산 인간/인간 하이브리도마 ; 및 상기의 4공개 특허공보에 기재된 기술을 이용함으로써 수득될 수 있는 일본국 특허 공개 제155083/1987호 및 1986년 8월 30일에 출원된 일본국 특허출원 제202752/1986호 및 1987년 5월 23일에 출원된 일본국 특허출원 제126687/1987호에 상세히 기재된 인간 단일클론항체 생산 인간/인간 하이브리도마가 있다.
이들 인간/인간 하이브리도마의 특정예로는 상기에 인용된 특허문헌에 기재된 인간/인간 하이브리도마 CLN/SUZH 5(FRI 수탁거부 통지번호 57-637), 인간/인간 하이브리도마 CLN H 5(ATCC HB 8206) 및 인간/인간 하이브리도마 SLN F 10(FRI, 수탁거부 통지번호 60-1197) ; 결정암 환자로부터 유도된 인간 B-세포를 사용하는 것을 제외하고 상기 특허문헌에 기재된 바와 같은 기술에 의해 수득될 수 있는 인간/인간 하이브리도마 CoLNE10(FRI 수탁거부 통지번호 61-794) ; 인간/인간 하이브리도마 TOS/G5(FRI, 수탁거부 통지번호 60-1196) ; 상기에 인용된 일본국 특허 공개 제155083/1987호에 상세히 기재되어 있고 하기에 요약되는 위암환자의 인간 B세포 및 융합적으로 인간 B세포 림파아세포변이체 HIH/TO1(FRI, 수탁거부 통지번호 60-1198)로부터 유도된 TOS/H8(FRI, 수탁거부 통지번호 61-844) ; 인간/인간 하이브리도마 TOH/B9(FRI, 수탁거부 통지번호 62-5) ; TOH/D5(FRI, 수탁거부 통지번호 62-6) ; 상술한 용합짝 및 간암환자로부터 유도된 인간 B세포로부터 형성된 TOH/G2(FRI, 수탁거부 통지번호 62-7)가 있다.
상기 융합짝의 대표적인 예로 예시된 융합짝 HIH/TO1의 형성 및 이들을 사용한 인간/인간 하이브리도마의 형성기술은 본 발명의 주제는 아니지만 하기에 간략하게 설명한다.
상기의 융합짝은 약제내성은 일으키는 기술에 따라 변이체 형성 공정에 의해 인간 B세포 림파아세포 W1-L2(FRI, 수탁거부 통지번호 60-1621)로부터 수득될 수 있다. 자가 복제성을 갖는 생성세포주는 인간 B세포 림파아세포로부터 유도된 변이주이며, 하기의 특성 (ⅰ) 내지 (Ⅴ)를 갖는다.
(ⅰ) 6-티오구아닌에 내성이 있다.
(ⅱ) 오우아바인에 내성이 있다.
(ⅲ) HATO(히포크산틴, 아메토프테린, 티미딘 및 오우아바인)을 함유한 배지에서 죽는다.
(ⅳ) 면역 글로불린 IgG 및 IgM을 실제적으로 생산하지 않는다.
(ⅴ) 기본배지 RDF 및 인슐린, 트랜스퍼린, 셀레늄, 에탄올아민, β-메르캅토에탄올 및 소혈청알부민으로 구성된 무혈청배지에서 복제할 수 있다.
더욱 특별하게는, 인간 B세포 림파아세포인 상기의 융착짝은 예를들면 무혈청배지에 인간 B세포 림파아세포를 배양 및 적응시키고, 적응된 세포를 스크린하여 면역클로불린 생산능이 실제적으로 결핍된 세포를 선택한 후, 선택된 세포를 6-티오구아닌 함유 무혈청배지에서 배양 및 적응시키고, 생성된 6-티오구아닌 내성세포를 변이 유발제로 처리한 후, 처리된 세포를 오우아바인 함유 무혈청배지에서 배양 및 적응시키고, 내성세포를 6-티오구아닌 및 오우아바인을 모두 함유한 무혈청배지에서 클로닝함으로써 제조될 수 있다.
이때 사용되는 무혈청배지의 바람직한 예는 기본배지 RDF(RPMI 1640,DME 및 F12의 2 : 1 : 1혼합물)에 적당량의 인슐린, 트랜스퍼린, 셀레늄, 에탄올아민, α-메르캅토에탄올 및 소혈청알부민을 가함으로써 제조된 무혈청배지이다. 다른 무혈청배지도 사용될 수 있으며, 배양될 인간 B세포 림파아세포와 기본배지의 종류, 기본배지에 첨가되는 첨가제의 종류 및 양 등에 따라 실험적으로 선택, 변화 또는 결정될 수 있다. 변이유발제의 예로는 MNNG, EMS, AAB, AAF, AF-2, BPOX, DAB, BZD, DAN, DBA, DBE, DBP, DMN, ENNG, ENU, HFA, 3MCA, MMS, 2NA, NAAAF, NBA, 4NQO, OAT, PI, TCE, TDS, TOX 및 VC과 같은 공지의 것이 있다.
배양 및 적응은 예를들면 37℃에서 5% CO2의 존재하에 수행될 수 있다. 클로닝은 공지방법, 예를들면 제한희석 방법에 의해 수행될 수 있다. 공지의 배양 및 적응방법, 스크린 방법 및 변이유발제 처리방법을 적당히 사용할 수 있다.
인간 B세포 림파아세포의 예로는 상기의 인간 B세포 림파아세포 WI-L2 및 기타 인간 B세포 림파아세포 IM-9(ATCC CCL 159) 인간 B세포 림파아세포 NC-37(ATCC CCL 214) 및 인간 B세포 림파아세포 CCRF-SB(ATCC CCL 120)과 같은 공지의 세포수가 있다.
인체밖에서 공업적으로 항원-특이성 인간 면역 글로불린을 생산 가능하게 하는 인간 단일클론항체 생산 인간/인간 하이브리도마는 예를들면 악성종양 환자로부터 채취된 인간 림파구(인간 B세포)를 상술한 융합짝과 융합시킴으로써 제조될 수 있다.
이런 융합세포를 제조하기 위한 융합공정은 공지이다. 융합은 예를들면 암환자의 인간 B세포를 액체 배지에서 센다이 비루스(HVJ) 또는 폴리에틸렌글리콜과 같은 융합 촉진제의 존재하에 융합짝인 인간 B세포 림파아세포의 변이체와 접촉시킴으로써 수행될 수 있다. 또한 높은 전압에서 전기적으로 수행될 수 있다(예를들면, U.Zimmerman et al. : “Electric field-Mediated Cell Fusion”, The Journal of Biological Physics, 10,43-50,1982 ; U.Zimmerman et al. : “Elec-tric Field-Induced Cell-to-Cell Fusion”, The Journal of Membrane Biology, 67, 165-182,1982 ; 및 U.Zimmerman, “Electric Field-Mediated Fusion and Related Electrical Phenomena”, Biochimica et Biophysica Acta, 694,227-277, 1982).
첫번째 언급된 구현예에서, 암환자로부터의 인간 B세포 및 융합짝인 인간 B세포 림파아세포를 융합세포를 생산하기에 충분한 기간, 예를들면 수분동안 수성매질에서 융합촉진제 존재하에 필요하다면 계를 서서히 교반하여 균질화시키면서 접촉시킨다. 수성매질의 예로는 물, 생리식염수, 5% 디메틸술폭시드 수용액 및 5% 글리세롤 수용액이 있다.
이렇게 목적하는 융합세포가 생성된 융합계를 원심분리하여 융합세포를 수거한다. 융합세포를 적당한 배지, 예를들면 10% 송아지 혈청 및 HATO가 보충된 RDF 기본배지에 분산시킨다. 지정된 양의 분산액을 마이크로타이터 플레이트의 웰에 주사하고, 플레이트를 예를들면 5% CO2존재하에 37℃에서 예를들면 2주일 동안 웰의 배양배지를 3일마다 새로 교환하면서 배양한다. 웰에서 융합세포의 존재를 현미경으로 검사한다. 융합세포의 존재가 관찰되는 군락을 선택하여, 예를들면 125I를 사용한 방사성 면역분석 또는 효소 결합 면역흡착 분석에 의해 인간면역 글로불린을 검사한다.
인간 면역글로불린의 생성이 결정된 선택 군락을 새로운 배양배지에 옮기고, 배양하여 융합세포를 증식시킴으로서 융합된 세포클론을 수득한다.
특정량의 레티노인산 또는 그의 염을 함유한 무혈청 배양배지가 인간 단일클론항체 생산 인간/인간 하이브리도마를 배양하는데 매우 유리하게 이용될 수 있다. 다른 하이브리도마를 배양하는데도 사용될 수 있다. 본발명의 무혈청배지는 지정된 량의 레티노인산을 함유할 수 있다. 그렇지 않으면, 사용시에 그의 양이 상기의 지정량에 도달할 수 있도록 레티노인산을 배지에 가할 수 있다.
본 발명의 무혈청배지에서 인간 단일클론항체 생산 인간/인간 하이브리도마를 배양하는데 있어서, 배양조건은 적당히 선택될 수 있으며, 필요하다면 예비실험을 수행함으로써 변화될 수 있다. 예를들면, 배양은 약 5%의 CO2를 함유한 대기중에서 약 37±3℃에서 수행될 수 있다.
하기의 실시예는 본 발명의 무혈청배지의 제조 및 본 발명의 무혈청배지에서의 인간 단일클론항체 생산 인간/인간 하이브리도마의 배양을 설명하는 것이다. 본 발명은 이들 실시예에 의해 제한되는 것이 아님을 이해해야 한다.
[실시예 1∼5 및 비교예 1]
레티노인산(시판)을 0.4% 수산화나트륨수용액에 용해시켜 사용한다. 동물세포 배양용 기본배지 RDF를 사용하며, 기본배지에 하기의 첨가제를 가함으로써 무혈청완전배지를 제조한다.
무혈청 완전배지
RDF 기본배지 13.433mg/ml 완전배지
트랜스퍼린 10μg/ml 완전배지
인슐린 10μg/ml 완전배지
소듐 셀레나이트 1nM
에탄올아민 1μM
β-메르캅토 에탄올 1μM
인간알부민 100μg/ml 완전배지
상기의 무혈청 완전배지에 표 1에 기재된 농도의 레티노인산을 가함으로써 무혈청배지를 제조한다.
일본국 특허공개 제70400/1987호에 상세히 기재되어 있는 인간/인간 하이브리도마 SLNF 10(FRI, 수탁 거부 통지번호 60-1197 ; 인간 단일클론항체 IgG를 생산할 수 있는 인간/인간 하이브리도마)를 저속원심분리에 의해 무혈청 완전배지로 2번 세척하고, 105세포/ml의 비율로 무혈청 완전배지(대조) 및 레티노인산 함유 무혈청배지(실시예 1∼5 및 비교예 1)에 접종시킨 후, 5% CO2존재하에 37℃의 인큐베이터에서 배양한다. 배양개시후 6일 되었을때, 헤모사이토메타에 의해 세포의 수를 측정하고, 항체의 양을 하기의 방법에 의해 측정한다.
[항체량의 측정]
항-인간 면역글로불린 항체(100μl)를 마이크로타이터 플레이트에 적가하고, 37℃에서 30분동안 플레이트에 흡착시킨다. 플레이트를 0.3%의 젤라틴을 함유한 10mM의 PBS(젤라틴 완충액)로 3번 세척하고, 1%소혈청 알부민용액(200μl)을 적가한후, 37℃에서 1시간동안 플레이트에 흡착시킨다. 플레이트를 젤라틴 완충액으로 3번 척하여 미흡착물질을 제거한다. 분석시료(배양 상층액)(50μl)를 적가하고, 37℃에서 1시간동안 반응시킨다. 플레이트를 젤라틴 완충액으로 3번 세척한다. 퍼옥시다제 접합 염소항-인간 Ig항체(50μl)를 적가하고, 37℃에서 30분동안 반응시켜 분석시료의 인간 Ig에 결합시킨다(효소결합 면역흡착분석). 플레이트를 젤라틴 완충액으로 3번 세척하고, 과산화수소 및 0-페닐렌디아민을 함유한 기질용액을 가한 후, 어두운 방에서 10분동안 반응시킨다. 5N-H2SO4(50μl)를 가함으로써 반응을 중단한다. 분석 시료에서 인간 Ig의 양에 비례하는 492nm에서 흡광도를 갖는 생성된 황색 기질반응 생물을의 양을 흡광계를 사용하여 측정한다.
공지의 농도를 갖는 인간 Ig의 흡광도와 비교함으로써 분석시료의 인간 Ig의 농도를 결정할 수 있다.
세포의 수 및 항체의 양은 표 1에 나타낸다. 제1도는 항체의 양과 레티노인산의 양 사이의 관계를 나타낸다.
[표 1]
Figure kpo00002
- : 무측정
[실시예 6]
2차 배양 :
하기 조성의 무혈청배지(본 발명의 배지)를 제조한다.
RDF 기본배지 13.433mg/ml 완전배지
트랜스퍼린 10μg/ml 완전배지
인슐린 10μg/ml 완전배지
소듐셀레나이트 1nM
β-메르캅토에탄올 1μM
L-아르기닌 1mg/ml 완전배지
레티노인산 10-7M
인간/인간 하이브리도마 SLNF 10를 105세포/ml의 비율로 상기의 무혈청배지에 접종하고, 5% CO2의 존재하에 37℃에서 배양을 시작한다. 6일후, 제1세대 세포를 배양브로스로부터 분리하고, 같은 조성의 신선한 무혈청배지에 105세포/ml의 비율로 접종시키고 동일한 배양조건하에서 배양한다. 제2세대 배양시작 후 6일 되었을 때, 배양브로스로부터 제2세대 세포를 분리하고, 같은 조성을 갖는 신선한 무혈청배지에 105세포/ml의 비율로 접종시킨후, 같은 배양 조건하에 배양한다.
그러므로, 2차 배양을 3세대에 걸쳐 수행하고, 결과는 제2도에 나타낸다. 제2도는 인간 단일클론항체 IgG 생산 인간/인간 하이브리도마가 세포증식능 및 항체 생산능의 바람직하지 못한 감소없이 여러 세대를 통해 장기간 동안 배양될 수 있다는 것을 증명한다.
[실시예 7∼9]
실시예 4와 같은 방법으로, 레티노인산을 함유하지 않은 무혈청배지(대조) 및 10-7M의 레티노인산을 함유한 무혈청배지(본 발명의 배지)를 제조한다.
실시예 4에 사용된 것과 같은 인간/인간 하이브리도마 SLNF 10 및 상기에 예시된 하이브리도마 TOS/H8 및 CoLNE10를 실시예 4에서와 같이 이들 배지에서 배양한다. 배양 개시 6일후, 항체의 양을 측정한다. 결과는 표 2 및 제3도에 나타낸다. 이들 결과로부터, 본 발명의 무혈청배지는 인간 단일클론항체를 생산할 수 있는 각종 인간/인간 하이브리도마를 배양하는데 이용될 수 있으며, 레티노인산을 함유하지 않은 대조 배지를 사용한 경우보다 생산된 항체의 양이 현저히 증가한다는 것을 알 수 있다.
[표 2]
Figure kpo00003

Claims (3)

  1. 무혈청 완전배지 및 10-12M 내지 10-6M의 레티노인산 또는 그의 염을 함유함을 특징으로 하는 인간 단일클론항체 생산 인간/인간 하이브리도마 배양용 무혈청배지.
  2. 제1항에 있어서, 레티노인산의 함량이 10-9M 내지 10-7M인 무혈청배지.
  3. 제1항에 있어서, 무혈청 완전배지가 동물세포 배양용 기본배지 및 인슐린 및 트랜스퍼린의 군에서 선택된 적어도 하나의 성장인자를 함유하며, 혈청이 없는 무혈청 완전배지인 무혈청배지.
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