RU2018532C1 - Питательная среда для культивирования человек/человеческой гибридомы (ее варианты) - Google Patents

Питательная среда для культивирования человек/человеческой гибридомы (ее варианты) Download PDF

Info

Publication number
RU2018532C1
RU2018532C1 SU884356208A SU4356208A RU2018532C1 RU 2018532 C1 RU2018532 C1 RU 2018532C1 SU 884356208 A SU884356208 A SU 884356208A SU 4356208 A SU4356208 A SU 4356208A RU 2018532 C1 RU2018532 C1 RU 2018532C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
human
nutrient medium
medium
retinoic acid
serum
Prior art date
Application number
SU884356208A
Other languages
English (en)
Inventor
Хидеаки Хагивара
Масафуми Наито
Хидео Юаса
Original Assignee
Есихиде Хагивара
Хидеаки Хагивара
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Есихиде Хагивара, Хидеаки Хагивара filed Critical Есихиде Хагивара
Application granted granted Critical
Publication of RU2018532C1 publication Critical patent/RU2018532C1/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/385—Hormones with nuclear receptors of the family of the retinoic acid recptor, e.g. RAR, RXR; Peroxisome proliferator-activated receptor [PPAR]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/863—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving IgM
    • Y10S530/864—Monoclonal
    • Y10S530/865—Human

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Использование: биотехнология, иммунология, медицина. Сущность изобретения: разработана бессывороточная питательная среда для культивирования человек/человеческий гибридомы, позволяющая увеличить продукцию моноклональных антител. Новая бессывороточная среда содержит основную питательную среду RDF, инсулин, трансферрин, этаноламин, β -меркаптоэтанол, селенит натрия, человеческий альбумин или L-аргинин и дополнительно ретиноевую кислоту в концентрации 10-12 - 10-6 М. 2 с.п. ф-лы, 2 табл., 3 ил.

Description

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для культивирования человек/человеческой гибридомы.
Для культивирования животных клеток обычно используют питательные среды, содержащие 5-10% сыворотки. Однако сыворотка содержит гетерогенные факторы, например высокоплотные и низкоплотные липолипиды, присутствие которых в питательных средах может вызвать нежелательные осложнения при изучении биохимических процессов культивируемых клеток. В таких случаях целесообразно использование бессыворотных питательных сред, в состав которых включаются факторы роста и другие добавки.
Примером такой бессывороточной среды, используемой при культивировании человеческой гибридомы, может служить питательная среда, не содержащая сыворотку, но включающая значительные концентрации аминокислот и особенно L-аргинина.
Недостатком данных сред является низкая продуцирующая способность культивируемых клеток.
Цель изобретения - получение бессывороточной среды для культивирования человек/человеческой гибридомы, продуцирующей человеческое моноклеточное антитело.
Указанная цель достигается включением в бессывороточную среду ретиноевой кислоты, известной как витамин А-кислота. Включение ретиноевой кислоты в концентрации 10-12-10-16 М заметно усиливает способность к продуцированию данного антитела человек/человеческой гибридомой (фиг. 1). Наибольшее увеличение продукции антитела происходит при концентрации 10-10-10-9 М и достигает максимума при 10-8 М, при дальнейшем увеличении концентрации ретиноевой кислоты продукция антитела идет на спад.
Предлагаемые бессывороточные среды, содержащие ретиноевую кислоту готовят на основе питательной среды RDF (смесь RPМ1 1640, ДМЕ и F12 в соотношении 2: 1:1) с включением соответствующих количеств инсулина, трансферрина, селена, этаноламина, β -меркаптоэтанола, человеческого альбумина, L-аргинина и воды).
Бессывороточная культуральная среда, содержащая определенное количество ретиноевой кислоты, преимущественно использована для культивирования человек/человеческой гибридомы, продуцирующей человеческое моноклональное антитело. Культивирование проводят при температуре около 37 ± 3оС в присутствии ≈ 5% СО2.
Следующие примеры иллюстрируют приготовление бессывороточной среды, описанной в настоящем изобретении, и культивирование продуцирующей человеческое антитело человек/человеческой гибридомы в данной среде.
На фиг. 1 показано отношение между количеством ретиноевой кислоты и количеством антитела, соответствующее примерам 1-5; на фиг. 2 - результаты субкультивирования в примере 6; на фиг. 3 - результаты, полученные в примерах 7-9.
П р и м е р ы 1-5. Ретиноевую кислоту используют в виде 0,4 N водного раствора гидроксида натрия.
Бессывороточная среда N 1:
RDF - основная среда 13,433 кг на мл среды Трансферрин 10 мкг на мл среды Инсулин 10 мкг на мл среды Селенит натрия 1 нМ Этаноламин 1 мкМ β-меркапто- этанол 1 мкМ
Альбумин человека 100 мкг на мл среды Вода До 1 мл
Бессывороточную среду готовят путем добавки ретиноевой кислоты в указанную бессывороточную наполненную среду в каждой концентрации, из приведенных в табл. 1.
Человек/человеческую гибридому SLNF10 дважды промывают бессывороточной наполненной средой путем центрифугирования при небольшой скорости и затем инокулируют в каждую из бессывороточных наполненных (контрольных) сред (примеры 1-5) со скоростью 105 кл./мл и культивируют в инкубаторе при 37оС в присутствии 5% СО2. Шесть дней спустя после начала культивирования число клеток измеряют гемоцитометром, а количество антител измеряют следующим способом.
Антитело к человеческому иммуноглобулину (100 μл) добавляют по капле в микролитровую чашку и адсорбируют в чашке при 37оС в течение 30 миг. Содержимое 3 раза промывают 10 мМ РВS, содержащим 0,3% буферного раствора, а затем по капле добавляют 1%-й раствор (200 μл) бычьей сыворотки альбумина и адсорбируют в чашке при 37оС в течение 1 ч. Каждый раз промывают буферным раствором для удаления неадсорбированного вещества. Затем добавляют по капле пробный образец (культура-супернатант) (50 мл) и вызывают реакцию при 37оС в течение 1 ч. Чашку с содержимым промывают 3 раза буферным раствором. Пероксидазосопряженное козлиное антитело к человеку Ig (50 μл) добавляют по капле, а затем вызывают реакцию при 37оС в течение 30 мин для того, чтобы связать его с человеческим Ig в пробном образце (иммуносорбент с иммобилизированными ферментами).
Чашку промывают 3 раза буферным раствором и туда добавляют раствор вещества, содержащего перекись водорода и о-фенилендиамин, затем вызывают реакцию в темной комнате в течение 10 мин. Реакцию останавливают добавлением 5N H2SO4 (50 μл). Количество получающегося в результате желтого вещества, имеющего абсорбцию 492 нм, пропорциональное количеству человеческого Ig в пробном образце, измеряют при помощи абсорбционного фотометра. Концентрация человеческого Ig в пробном образце может быть определена путем сравнения оптической плотности этой концентрации с уже известной концентрацией человеческого Ig.
Число клеток и количество антител представлены в табл. 1.
П р и м е р 6. Субкультивирование.
Бессывороточную среду 2 приготовляют в следующем составе:
RDF основная среда 12,433 мг/мл среды Трансферрин 10 мкг/мл среды Инсулин 10 мкг/мл среды Селенит натрия 1 нМ
β-меркапто- этанол 1 мкМ L-аргинин 1 мкг/мл среды
Ретиноевая кислота 10-7 М
Человек/человеческую гибридому SLF10 инокулируют в бессывороточной среде со скоростью 105 кл./мл и ее культивирование начинают при 37оС в присутствии 5% СО2. Через 6 дней первое поколение клеток отделяют от культуральной жидкости и инокулируют в свежей бессывороточной среде в том же составе со скоростью 105 кл./мл и культивируют при тех же условиях. Через 6 дней после начала второй культивации второе поколение клеток отделяют от жидкой среды, инокулируют в свежую бессывороточную среду в том же составе со скоростью 105 кл./мл и культивируют при тех же условиях культивации.
Таким образом, субкультивирование и результаты, представленные на фиг. 2, показывают, что человек/человеческая гибридома, продуцирующая человеческое моноклональное антитело IgG, может культивироваться до нескольких поколений в течение долгого периода времени без заметного уменьшения ее способности к пролиферации клеток и продуцированию антитела.
П р и м е р ы 7-9. Способом по примеру 4 готовят среду, не содержащую ретиноевую кислоту (контрольная), и среду, содержащую 10-7 М ретиноевой кислоты (бессывороточная среда, описанная в настоящем изобретении.
Гибридому SLNF10, используемую в примере 4, и гибридому TOS/H и CoLN E10 культивируют в среде, описанной в примере 4. Через 6 дней после начала культивирования измеряют количество антител. Результаты представлены в табл. 2 и на фиг. 3. Из этих результатов видно, что бессывороточная среда, содержащая ретиноевую кислоту, может быть использована для культивирования различных человек/человеческих гибридом, способных продуцировать человеческие моноклональные антитела, при этом можно достичь заметного увеличения количества продуцируемых антител по сравнению с тем количеством, которое получается при использовании среды, не содержащей ретиноевую кислоту.

Claims (1)

1. Питательная среда для культивирования человек/человеческой гибридомы, содержащая основную питательную среду RDF, трансферрин, инсулин, натрий-селенит, бетамеркаптоэтанол, этаноламин, человеческий альбумин, воду, отличающаяся тем, что дополнительно содержит ретиноевую кислоту при следующем соотношении компонентов:
Ретиноевая кислота 10-6 - 10-12 моль;
Основная питательная среда RDF 13,433 мг;
Трансферрин 10 мг;
Инсулин 10 мкг;
Натрий-селенит 1 нмоль;
Бетамеркаптоэтанол 1 мкмоль;
Этаноламин 1 мкмоль;
Человеческий альбумин 100 мкг;
Вода До 1 мл
2. Питательная среда для культивирования человек/человеческой гибридомы, содержащая основную питательную среду RDF, трансферрин, инсулин, натрий-селенит, бетамаркаптоэтанол, L-аргинин, воду, отличающаяся тем, что дополнительно содержит ретиноевую кислоту при следующем соотношении компонентов:
Ретиноевая кислота 10-6 - 10-2 моль;
Основная питательная среда RDF 13,433 мг;
Трансферрин 10 мкг;
Инсулин 10 мкг;
Натрий-селенит 1 нмоль;
Бетамеркаптоэтанол 1 мкмоль;
L-аргинин 1 мг;
Вода До 1 мл.
SU884356208A 1987-08-21 1988-08-19 Питательная среда для культивирования человек/человеческой гибридомы (ее варианты) RU2018532C1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP206569/87 1987-08-21
JP62206569A JPH0634713B2 (ja) 1987-08-21 1987-08-21 ヒト／ヒト・ハイブリドーマの培養方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2018532C1 true RU2018532C1 (ru) 1994-08-30

Family

ID=16525567

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SU884356208A RU2018532C1 (ru) 1987-08-21 1988-08-19 Питательная среда для культивирования человек/человеческой гибридомы (ее варианты)

Country Status (10)

Country Link
US (1) US5155036A (ru)
EP (1) EP0304150B1 (ru)
JP (1) JPH0634713B2 (ru)
KR (1) KR940003651B1 (ru)
AU (1) AU615918B2 (ru)
CA (1) CA1299509C (ru)
DE (1) DE3887030T2 (ru)
ES (1) ES2061655T3 (ru)
IL (1) IL86830A0 (ru)
RU (1) RU2018532C1 (ru)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2123094C (en) * 1991-11-06 1999-08-10 Paulo N. Correa Cell culture medium
US5846529A (en) * 1993-08-23 1998-12-08 Nexell Therapeutics, Inc. Infusion of neutrophil precursors for treatment of neutropenia
US6037174A (en) * 1993-08-23 2000-03-14 Nexell Therapeutics, Inc. Preparation of serum-free suspensions of human hematopoietic cells or precursor cells
US20030077757A1 (en) * 2000-01-11 2003-04-24 Andrews William H. Method of treating aging-related disorders
JP2006500931A (ja) * 2002-09-30 2006-01-12 ファイザー・プロダクツ・インク 高レベルのヒト配列抗体を産生するハイブリドーマ
CN107099508A (zh) * 2017-06-23 2017-08-29 曲宝赤 一种无血清杂交瘤细胞培养基

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4205126A (en) * 1978-01-01 1980-05-27 Cartaya Oscar A Serum-free cell culture media

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
1. Выложенная заявка на патент Японии N 51983, кл. C 12N 5/02, 1987. *

Also Published As

Publication number Publication date
EP0304150B1 (en) 1994-01-12
ES2061655T3 (es) 1994-12-16
EP0304150A2 (en) 1989-02-22
CA1299509C (en) 1992-04-28
JPS6451079A (en) 1989-02-27
EP0304150A3 (en) 1989-08-30
KR890003944A (ko) 1989-04-19
IL86830A0 (en) 1988-11-30
KR940003651B1 (ko) 1994-04-25
DE3887030D1 (de) 1994-02-24
AU1842188A (en) 1989-02-23
AU615918B2 (en) 1991-10-17
US5155036A (en) 1992-10-13
DE3887030T2 (de) 1994-04-28
JPH0634713B2 (ja) 1994-05-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0014519B1 (en) Cell lines, process for preparing them and process for producing antibodies
RU2015164C1 (ru) Способ периодического культивирования клеток-продуцентов моноклональных антител и биологически активных веществ
US5232848A (en) Basal nutrient medium for cell culture
CS262822B1 (en) Synthetic medium for the cultivation of myelomic cells
RU2018532C1 (ru) Питательная среда для культивирования человек/человеческой гибридомы (ее варианты)
Kovář et al. Serum-free medium for hybridoma and parental myeloma cell cultivation: a novel composition of growth-supporting substances
Takazawa et al. High‐Density culture of mouse–human hybridoma in serum‐free defined medium
US5147783A (en) Methods to screen for ovarian cancer and myocardial infarction
Hokama et al. Cross‐reactivity of ciguatoxin, okadaic acid, and polyethers with monoclonal antibodies
Blasey et al. Low protein serum-free medium for antibody-production in stirred bioreactors
WO1988000240A1 (en) Preparation of monoclonal antibodies
Shinmoto et al. Long term culture of mouse hybridoma HB8852 cells in a protein free medium
AU663144B2 (en) In vitro antibody production
SU1631434A1 (ru) Способ иммуноферментного определени антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота
SU1744107A1 (ru) Штамм гибридных культивируемых клеток животных мUS мUSсULUS - продуцент моноклональных антител против эритроцитарного антигена V F-системы крупного рогатого скота и родственных ему видов
JPH04316483A (ja) 浮遊細胞用無血清合成培地
SU1560549A1 (ru) Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS, используемый дл получени моноклональных антител к J @ М рогатого скота
JP3375140B2 (ja) モノクローナル抗体生産用培地の作製法及びそのキット
SU1527260A1 (ru) Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS, используемый дл получени моноклональных антител к @ - тимозину
RU2002803C1 (ru) Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS MUSCULUS L., используемый дл получени моноклональных антител к JGG 1, 3, 4 человека
RU2008350C1 (ru) Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus l., используемый для получения моноклональных антител к jgg человека
Darfler In Vitro Immunization for the Generation of Hybridomas Using Serum-Free Medium
RU1776691C (ru) Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L, - продуцент моноклональных антител против J @ Е человека
Shirai et al. Effects of conditioned medium on the growth kinetics and the monoclonal antibody productivity of hybridoma cells
SU1652339A1 (ru) Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L - продуцент моноклональных антител к мембранному антигену МYсорLаSма aRGININI

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20050820