JPH084518B2 - モノクロナル抗体生産性ヒト／ヒトハイブリド−マの無血清培養法 - Google Patents
モノクロナル抗体生産性ヒト／ヒトハイブリド−マの無血清培養法Info
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- JPH084518B2 JPH084518B2 JP61202753A JP20275386A JPH084518B2 JP H084518 B2 JPH084518 B2 JP H084518B2 JP 61202753 A JP61202753 A JP 61202753A JP 20275386 A JP20275386 A JP 20275386A JP H084518 B2 JPH084518 B2 JP H084518B2
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、モノクロナル抗体生産性ヒト／ヒトハイブ
リドーマの無血清培養法に関し、とくに該ハイブリドー
マ（融合細胞）もしくは該ハイブリドーマの融合パート
ナーであるヒトＢリンパ芽球細胞の無血消培養物であつ
て且つ該ハイブリドーマの増殖促進能を示すのに適切な
培養時期の培養物の適量を、例えば適切な培養時期の培
養上清の適量を、添加含有させた無血清培地において、
該ハイブリドーマを培養することによつて、改善された
細胞増殖の増大或は細胞増殖の増大及び抗体生産量の増
大を達成できるモノクロナル抗体生産性ヒト／ヒトハイ
ブリドーマの無血清培養法に関する。
リドーマの無血清培養法に関し、とくに該ハイブリドー
マ（融合細胞）もしくは該ハイブリドーマの融合パート
ナーであるヒトＢリンパ芽球細胞の無血消培養物であつ
て且つ該ハイブリドーマの増殖促進能を示すのに適切な
培養時期の培養物の適量を、例えば適切な培養時期の培
養上清の適量を、添加含有させた無血清培地において、
該ハイブリドーマを培養することによつて、改善された
細胞増殖の増大或は細胞増殖の増大及び抗体生産量の増
大を達成できるモノクロナル抗体生産性ヒト／ヒトハイ
ブリドーマの無血清培養法に関する。
更に詳しくは、本発明は、自己増殖能を有するが抗体
生産能を実質的に欠如するヒトＢリンパ芽球細胞株の無
血清培養物もしくは該細胞株を融合パートナーとするヒ
ト癌患者由来のヒトＢ細胞とのモノクロナル抗体生産性
ヒト／ヒトハイブリドーマの無血清培養物であつて、そ
の培養開始後、加速期前から対数増殖期初期にいたる培
養物の適量を添加含有させた無血清培地において、上記
モノクロナル抗体生産性ヒト／ヒトハイブリドーマを培
養することを特徴とするヒト／ヒトハイブリドーマの無
血清培養法に関する。
生産能を実質的に欠如するヒトＢリンパ芽球細胞株の無
血清培養物もしくは該細胞株を融合パートナーとするヒ
ト癌患者由来のヒトＢ細胞とのモノクロナル抗体生産性
ヒト／ヒトハイブリドーマの無血清培養物であつて、そ
の培養開始後、加速期前から対数増殖期初期にいたる培
養物の適量を添加含有させた無血清培地において、上記
モノクロナル抗体生産性ヒト／ヒトハイブリドーマを培
養することを特徴とするヒト／ヒトハイブリドーマの無
血清培養法に関する。
従来、細胞培養に際して、細胞培養物たとえば培養上
清の一部を次の培養に用いる培地に添加して培養を行な
う態様について、いくつかの報告が知られている。
清の一部を次の培養に用いる培地に添加して培養を行な
う態様について、いくつかの報告が知られている。
例えば、Growth and Differentiation of Cells in D
efined Environment、P.281−284、Kodansha/Springer
−Verlag（1985）には、ヒト肝癌株化細胞HepG2及びPLC
/PRF/5を無血清培地WAJC101（MCDB107培地中に痕跡量の
他成分を含有するMEM培地）に於て培養する際には、該
培地にウシ脳下垂体抽出物を含有させないと培養できな
いが、この抽出物含有培地で該株化細胞を培養した培養
物の培養上清の一部を添加した該無血清培地を用いる
と、ウシ脳下垂体抽出物を更に添加含有させなくても培
養可能であつたことが報告されている。
efined Environment、P.281−284、Kodansha/Springer
−Verlag（1985）には、ヒト肝癌株化細胞HepG2及びPLC
/PRF/5を無血清培地WAJC101（MCDB107培地中に痕跡量の
他成分を含有するMEM培地）に於て培養する際には、該
培地にウシ脳下垂体抽出物を含有させないと培養できな
いが、この抽出物含有培地で該株化細胞を培養した培養
物の培養上清の一部を添加した該無血清培地を用いる
と、ウシ脳下垂体抽出物を更に添加含有させなくても培
養可能であつたことが報告されている。
しかしながら、この報告には、ヒト／ヒトハイブリド
ーマの培養に関しては全く言及されていないし、示唆も
されていない。更に、該株化細胞の増殖や抗体生産との
関連については、全然、言及されていない。
ーマの培養に関しては全く言及されていないし、示唆も
されていない。更に、該株化細胞の増殖や抗体生産との
関連については、全然、言及されていない。
又、Nature、310、145−147（1984）には、牛血清ア
ルブミン含有無血清培地中でヒトＢリンパ芽球細胞LCL
RMを培養した無血清培養物の上清33％を添加した無血清
培地（牛血清アルブミン含有）において、該ヒトＢ細胞
LCLRMを37℃で72時間培養すると、トリチウムチミジン
の吸収によつて検知されるDNA合成の促進がみられたこ
とが報告されている。
ルブミン含有無血清培地中でヒトＢリンパ芽球細胞LCL
RMを培養した無血清培養物の上清33％を添加した無血清
培地（牛血清アルブミン含有）において、該ヒトＢ細胞
LCLRMを37℃で72時間培養すると、トリチウムチミジン
の吸収によつて検知されるDNA合成の促進がみられたこ
とが報告されている。
しかしながら、この報告にも、ヒト／ヒトハイブリド
ーマの培養に関しては、何等、記載も示唆もされていな
い。更に、DNA合成の促進について言及しているだけ
で、該芽球細胞LCLRMの増殖や状体生産との関連につい
ては全く記載も示唆もしていない。
ーマの培養に関しては、何等、記載も示唆もされていな
い。更に、DNA合成の促進について言及しているだけ
で、該芽球細胞LCLRMの増殖や状体生産との関連につい
ては全く記載も示唆もしていない。
従来、多数の動物細胞培養基礎培地（血清や血清アル
ブミン成分の如き血清成分を含有しない培地）が知られ
ており、約50種類に及ぶ基礎培地が市場で入手可能であ
る。そして、動物細胞の培養に際しては、細胞の実用に
供し得る生育、増殖能を維持するために、これらの基礎
培地に例えば仔牛血清、ヒト血清などの如き血清や血清
から分離された血清アルブミンやその複合体などの血清
成分を、たとえば約５〜約10％（vol/vol−培地）程度
配合して完全培地となして使用するのが普通である。
ブミン成分の如き血清成分を含有しない培地）が知られ
ており、約50種類に及ぶ基礎培地が市場で入手可能であ
る。そして、動物細胞の培養に際しては、細胞の実用に
供し得る生育、増殖能を維持するために、これらの基礎
培地に例えば仔牛血清、ヒト血清などの如き血清や血清
から分離された血清アルブミンやその複合体などの血清
成分を、たとえば約５〜約10％（vol/vol−培地）程度
配合して完全培地となして使用するのが普通である。
一方、血清は挾雑脂質、高密度リポ脂質（HDL）、低
密度リポ脂質（LDL）などの挾雑因子を含有し、これら
の不都合な異種因子の混入を回避することができない。
更に血清アルブミンやその複合体の場合にも精製が煩雑
である上に、注意深い精製を行つても、血清由来の不都
合な異種因子の混入を完全に回避することは至難であ
る。このため、例えば診断、予防、治療などの医薬用途
に有用なバイオ製品の製造に際して、不都合な異種因子
の混入から解放された高純度の有用物質を容易な操作を
もつて且つ高品質で製造することができなくなる等々の
技術的トラブルを生ずる。
密度リポ脂質（LDL）などの挾雑因子を含有し、これら
の不都合な異種因子の混入を回避することができない。
更に血清アルブミンやその複合体の場合にも精製が煩雑
である上に、注意深い精製を行つても、血清由来の不都
合な異種因子の混入を完全に回避することは至難であ
る。このため、例えば診断、予防、治療などの医薬用途
に有用なバイオ製品の製造に際して、不都合な異種因子
の混入から解放された高純度の有用物質を容易な操作を
もつて且つ高品質で製造することができなくなる等々の
技術的トラブルを生ずる。
このようなトラブルを回避するために、本発明者等の
一人によつて血清や血清から分離された血清アルブミン
やその複合体などの血清成分の配合を必要としない真正
のヒト／ヒトハイブリドーマ培養用無血清培地が開発さ
れた（特願昭60−192145）。
一人によつて血清や血清から分離された血清アルブミン
やその複合体などの血清成分の配合を必要としない真正
のヒト／ヒトハイブリドーマ培養用無血清培地が開発さ
れた（特願昭60−192145）。
本発明者らは、モノクロナル抗体生産性ヒト／ヒトハ
イブリドーマの培養にとくに望まれる無血清培地及び無
血清培養法について、更に研究を行つてきた。
イブリドーマの培養にとくに望まれる無血清培地及び無
血清培養法について、更に研究を行つてきた。
その結果、自己増殖能を有するが抗体生産能を実質的
に欠如するヒトＢリンパ芽球細胞株の無血清培養物もし
くは該細胞株を融合パートナーとするヒト癌患者由来の
ヒトＢ細胞とのモノクロナル抗体生産性ヒト／ヒトハイ
ブリドーマの無血清培養物であつて、その培養開始後、
加速期前から対数増殖期初期にいたる培養物の適量を添
加含有させた無血清培地において、該モノクロナル抗体
生産性ヒト／ヒトハイブリドーマを培養することによつ
て、細胞増殖の増大或は細胞増殖の増大及び抗体生産量
の増大が達成できることを発見した。
に欠如するヒトＢリンパ芽球細胞株の無血清培養物もし
くは該細胞株を融合パートナーとするヒト癌患者由来の
ヒトＢ細胞とのモノクロナル抗体生産性ヒト／ヒトハイ
ブリドーマの無血清培養物であつて、その培養開始後、
加速期前から対数増殖期初期にいたる培養物の適量を添
加含有させた無血清培地において、該モノクロナル抗体
生産性ヒト／ヒトハイブリドーマを培養することによつ
て、細胞増殖の増大或は細胞増殖の増大及び抗体生産量
の増大が達成できることを発見した。
従つて、本発明の目的は改善された細胞増殖増大、更
には抗体生産増大を達成できるモノクロナル抗体生産性
ヒト／ヒトハイブリドーマの無血清培養法を提供するに
ある。
には抗体生産増大を達成できるモノクロナル抗体生産性
ヒト／ヒトハイブリドーマの無血清培養法を提供するに
ある。
本発明においては、（イ）自己増殖能を有するが抗体
生産能を実質的に欠如するヒトＢリンパ芽球細胞株の無
血清培養物、もしくは（ロ）該細胞株を融合パートナー
とするヒト癌患者由来のヒトＢ細胞、たとえば該患者の
癌組織周辺のリンパ部から採取されたヒトＢ細胞、との
モノクロナル抗体生産性ヒト／ヒトハイブリドーマの無
血清培養物の適量を添加含有させた無血清培地を使用す
る。
生産能を実質的に欠如するヒトＢリンパ芽球細胞株の無
血清培養物、もしくは（ロ）該細胞株を融合パートナー
とするヒト癌患者由来のヒトＢ細胞、たとえば該患者の
癌組織周辺のリンパ部から採取されたヒトＢ細胞、との
モノクロナル抗体生産性ヒト／ヒトハイブリドーマの無
血清培養物の適量を添加含有させた無血清培地を使用す
る。
その際、無血清培地に添加含有させる上記（イ）もし
くは（ロ）の無血清培養物としては、培養開始後、加速
期前から対数増殖期初期にいたる培養物が利用される。
培養物は、その一部をそのまま利用することもできる
が、培養物上清液相、さらにはその精製液相などの形で
利用するのが好ましく、例えば、遠心、塩析、濃縮、透
析、ゲル過クロマトグラフイー、イオン交換クロマト
グラフイー、電気泳動法など、それ自体公知の手法を単
独で、もしくは適宜に組みあわせて処理した培養物液相
成分を利用することができる。
くは（ロ）の無血清培養物としては、培養開始後、加速
期前から対数増殖期初期にいたる培養物が利用される。
培養物は、その一部をそのまま利用することもできる
が、培養物上清液相、さらにはその精製液相などの形で
利用するのが好ましく、例えば、遠心、塩析、濃縮、透
析、ゲル過クロマトグラフイー、イオン交換クロマト
グラフイー、電気泳動法など、それ自体公知の手法を単
独で、もしくは適宜に組みあわせて処理した培養物液相
成分を利用することができる。
本発明の無血清培養法において、モノクロナル抗体生
産性ヒト／ヒトハイブリドーマの培養に用いる無血清培
地に添加含有させる上記（イ）もしくは（ロ）の無血清
培養物の利用時期には制約があり、培養開始後、加速期
前の適当な時期たとえば誘導期中期から対数増殖期初期
にいたる培養物が利用できる。
産性ヒト／ヒトハイブリドーマの培養に用いる無血清培
地に添加含有させる上記（イ）もしくは（ロ）の無血清
培養物の利用時期には制約があり、培養開始後、加速期
前の適当な時期たとえば誘導期中期から対数増殖期初期
にいたる培養物が利用できる。
なお、本発明において、誘導期、加速期、対数増殖期
と称するのは、上記（イ）におけるヒトＢリンパ芽球細
胞株もしくは上記（ロ）におけるヒト／ヒトハイブリド
ーマを無血清培地に接種培養したとき、細胞分裂がおこ
るまでの期間を誘導期、次いで細胞分裂がしだいに早く
なる期間を加速期、さらに細胞分裂が早くなつて細胞集
団の細胞数の対数が時間に対して直線的に増加する期間
を対数増殖期（対数期ともいう）を呼称する。対数増殖
期を経過すると減速期、増殖が停止した定常期を経て、
さらに生細胞数が減少する死滅期に至る。
と称するのは、上記（イ）におけるヒトＢリンパ芽球細
胞株もしくは上記（ロ）におけるヒト／ヒトハイブリド
ーマを無血清培地に接種培養したとき、細胞分裂がおこ
るまでの期間を誘導期、次いで細胞分裂がしだいに早く
なる期間を加速期、さらに細胞分裂が早くなつて細胞集
団の細胞数の対数が時間に対して直線的に増加する期間
を対数増殖期（対数期ともいう）を呼称する。対数増殖
期を経過すると減速期、増殖が停止した定常期を経て、
さらに生細胞数が減少する死滅期に至る。
このような細胞の増殖曲線は、使用する上記（イ）に
おけるヒトＢリンパ芽球細胞株もしくは上記（ロ）にお
けるヒト／ヒトハイブリドーマの種類、それらを培養す
る無血清培地の種類、培養条件などによつても変化し得
るが、使用する細胞の種類、その培養に用いる無血清培
地の種類、その培養条件などに応じて、予め実験的に容
易に、適切な培養時間を選択設定しておくことができ
る。多くの場合、加速期前後から対数増殖期初期にいた
る培養時間の採用が好ましく例示できる。
おけるヒトＢリンパ芽球細胞株もしくは上記（ロ）にお
けるヒト／ヒトハイブリドーマの種類、それらを培養す
る無血清培地の種類、培養条件などによつても変化し得
るが、使用する細胞の種類、その培養に用いる無血清培
地の種類、その培養条件などに応じて、予め実験的に容
易に、適切な培養時間を選択設定しておくことができ
る。多くの場合、加速期前後から対数増殖期初期にいた
る培養時間の採用が好ましく例示できる。
更に、本発明方法の実施に際しては、無血清培地に添
加含有させる上記（イ）もしくは（ロ）の無血清培養
物、たとえば、培養物上清液相の使用量も適宜に選択さ
れる。その使用量は、上記（イ）もしくは（ロ）におけ
る細胞の種類、その培養に用いる無血清培地の種類、そ
の培養条件などによつても変化し得るが、使用するそれ
らの種類、条件などに応じて適当な添加量を予め実験的
に容易に選択設定しておくことができる。一般には、本
発明方法に従つてモノクロナル抗体生産性ヒト／ヒトハ
イブリドーマを培養するのに用いる無血清培地の重量に
基いて約１〜約50重量％、多くの場合、約５〜約45重量
％程度、更には約10〜約40重量％程度の範囲を例示でき
る。このような例示範囲において、上述したように、実
施条件に応じて、予め実験的に好適添加量を選択利用す
るのがよい。
加含有させる上記（イ）もしくは（ロ）の無血清培養
物、たとえば、培養物上清液相の使用量も適宜に選択さ
れる。その使用量は、上記（イ）もしくは（ロ）におけ
る細胞の種類、その培養に用いる無血清培地の種類、そ
の培養条件などによつても変化し得るが、使用するそれ
らの種類、条件などに応じて適当な添加量を予め実験的
に容易に選択設定しておくことができる。一般には、本
発明方法に従つてモノクロナル抗体生産性ヒト／ヒトハ
イブリドーマを培養するのに用いる無血清培地の重量に
基いて約１〜約50重量％、多くの場合、約５〜約45重量
％程度、更には約10〜約40重量％程度の範囲を例示でき
る。このような例示範囲において、上述したように、実
施条件に応じて、予め実験的に好適添加量を選択利用す
るのがよい。
本発明方法において、前記（イ）における自己増殖能
を有するが抗体生産能を実質的に欠如するヒトＢリンパ
芽球細胞株および前記（ロ）における上記細胞株を融合
パートナーとするヒト癌患者由来のヒトＢ細胞とのモノ
クロナル抗体生産性ヒト／ヒトハイブリドーマにとくべ
つな制約はないが、上記（イ）のヒトＢリンパ芽球細胞
株の例としては、同一出願人の出願に係わる特願昭60−
293595号に詳しく開示されているHIH/TO1〔微工研寄託
受託拒否通知書、通知番号:60微寄文第1198号〕、更にU
C729−６〔ATCC CRL 8061;微工研寄託受託拒否通知書、
通知番号:57微寄文第664号〕などを例示できる。又更
に、NC−37〔ATCC CCL214〕、IM−９〔ATCC CCL159〕、
CCRF−SB〔ATCC CCL120〕、WI−LCL2〔微工研寄託受託
拒否通知書、通知番号:60微寄文第1621号〕などの公知
株化細胞を、それ自体公知の手法を利用してクローニン
グして得られる抗体生産能を実質的に欠如するサブクロ
ーンなどを例示することができる。
を有するが抗体生産能を実質的に欠如するヒトＢリンパ
芽球細胞株および前記（ロ）における上記細胞株を融合
パートナーとするヒト癌患者由来のヒトＢ細胞とのモノ
クロナル抗体生産性ヒト／ヒトハイブリドーマにとくべ
つな制約はないが、上記（イ）のヒトＢリンパ芽球細胞
株の例としては、同一出願人の出願に係わる特願昭60−
293595号に詳しく開示されているHIH/TO1〔微工研寄託
受託拒否通知書、通知番号:60微寄文第1198号〕、更にU
C729−６〔ATCC CRL 8061;微工研寄託受託拒否通知書、
通知番号:57微寄文第664号〕などを例示できる。又更
に、NC−37〔ATCC CCL214〕、IM−９〔ATCC CCL159〕、
CCRF−SB〔ATCC CCL120〕、WI−LCL2〔微工研寄託受託
拒否通知書、通知番号:60微寄文第1621号〕などの公知
株化細胞を、それ自体公知の手法を利用してクローニン
グして得られる抗体生産能を実質的に欠如するサブクロ
ーンなどを例示することができる。
更に、上記例示の如き株化細胞もしくはそのサブクロ
ーンをそれ自体公知の手法により公知変異剤で処理した
抗体生産能を実質的に欠如するヒトＢリンパ芽球細胞株
も利用することができる。このような公知変異剤の例と
しては、MNMG（Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロ
ソグアニジン）、EMS（メチルスルホン酸エチル）、AAB
（４−アミノアゾベンゼン）、AAF（２−アセチルアミ
ノフルオレン）、AF−２（２−フリル）−３−（５−ニ
トロ−２−フリル）アクリルアミド）、BPox（ベンゾピ
レンオキシド）、BZD（ベンチジン）、DAB（N,N′−ジ
メチルアミノアゾベンゼン）、DAN（ジアミンアニソー
ル）、DBA（ジベンズアントラセン）、DBE（ジブロモエ
タン）、DBP（ジブロモクロロプロパン）、DMN（ジメチ
ルニトロサミン）、ENNG（Ｎ−エチル−Ｎ′−ニトロ−
Ｎ−ニトロソグアニジン）、ENU（エチルニトロソウレ
ア）、HFA（Ｎ−ハイドロオキシ−２−アセチル−アミ
ノフルオレン）、3MCA（３−メチルコランスレン）、MM
S（メチルスルホン酸メチル）、2NA（２−ナフチルアミ
ン）、NAAAF（Ｎ−アセトオキシアセチルアミノフルオ
レン）、NBA（Ｎ−ニトロソジブチルアミン）、4NQO
（４−ニトロキノリン−１−オキシド）、OAT（ｏ−ア
ミノアゾトルエン）、PI（プロピレンイミン）、TCE
（トリクロロエチレン）、TDS（トルエンジアミノスル
フエイト）、TOX（トキサフエン）、VC（ビニルクロラ
イド）などの公知変異剤を例示することができる。
ーンをそれ自体公知の手法により公知変異剤で処理した
抗体生産能を実質的に欠如するヒトＢリンパ芽球細胞株
も利用することができる。このような公知変異剤の例と
しては、MNMG（Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロ
ソグアニジン）、EMS（メチルスルホン酸エチル）、AAB
（４−アミノアゾベンゼン）、AAF（２−アセチルアミ
ノフルオレン）、AF−２（２−フリル）−３−（５−ニ
トロ−２−フリル）アクリルアミド）、BPox（ベンゾピ
レンオキシド）、BZD（ベンチジン）、DAB（N,N′−ジ
メチルアミノアゾベンゼン）、DAN（ジアミンアニソー
ル）、DBA（ジベンズアントラセン）、DBE（ジブロモエ
タン）、DBP（ジブロモクロロプロパン）、DMN（ジメチ
ルニトロサミン）、ENNG（Ｎ−エチル−Ｎ′−ニトロ−
Ｎ−ニトロソグアニジン）、ENU（エチルニトロソウレ
ア）、HFA（Ｎ−ハイドロオキシ−２−アセチル−アミ
ノフルオレン）、3MCA（３−メチルコランスレン）、MM
S（メチルスルホン酸メチル）、2NA（２−ナフチルアミ
ン）、NAAAF（Ｎ−アセトオキシアセチルアミノフルオ
レン）、NBA（Ｎ−ニトロソジブチルアミン）、4NQO
（４−ニトロキノリン−１−オキシド）、OAT（ｏ−ア
ミノアゾトルエン）、PI（プロピレンイミン）、TCE
（トリクロロエチレン）、TDS（トルエンジアミノスル
フエイト）、TOX（トキサフエン）、VC（ビニルクロラ
イド）などの公知変異剤を例示することができる。
更に、上記（イ）の自己増殖能を有するが抗体生産能
を実質的に欠如するヒトＢリンパ芽球細胞株を融合パー
トナーとする前記（ロ）の該ヒトＢリンパ芽球細胞株と
ヒト癌患者由来のヒトＢ細胞とのモノクロナル抗体生産
性ヒト／ヒトハイブリドーマの例としては、たとえば、
ヒト／ヒトハイブリドーマCLN/SUZH5〔微工研寄託受託
拒否通知番号、57微寄文第637号；ヒト／ヒトハイブリ
ドーマCLNH5、ATCC HB8206〕、ヒト／ヒトハイブリドー
マCLN/SUZH11〔微工研寄託受託拒否通知番号、57微寄文
第638号：ヒト／ヒトハイブリドーマCLNH11、ATCC HB83
07〕、TOS/H8〔微工研寄託受託拒否通番号、61微寄文第
844号〕、TOS/G5〔微工研寄託受託拒否通知番号、61微
寄文第1196号〕、SLNF10〔微工研寄託受託拒否通知番
号、60微寄文第1197号〕、CoLNE10〔微工研寄託受託拒
否通知番号、61微寄文第794号〕などを例示することが
できる。
を実質的に欠如するヒトＢリンパ芽球細胞株を融合パー
トナーとする前記（ロ）の該ヒトＢリンパ芽球細胞株と
ヒト癌患者由来のヒトＢ細胞とのモノクロナル抗体生産
性ヒト／ヒトハイブリドーマの例としては、たとえば、
ヒト／ヒトハイブリドーマCLN/SUZH5〔微工研寄託受託
拒否通知番号、57微寄文第637号；ヒト／ヒトハイブリ
ドーマCLNH5、ATCC HB8206〕、ヒト／ヒトハイブリドー
マCLN/SUZH11〔微工研寄託受託拒否通知番号、57微寄文
第638号：ヒト／ヒトハイブリドーマCLNH11、ATCC HB83
07〕、TOS/H8〔微工研寄託受託拒否通番号、61微寄文第
844号〕、TOS/G5〔微工研寄託受託拒否通知番号、61微
寄文第1196号〕、SLNF10〔微工研寄託受託拒否通知番
号、60微寄文第1197号〕、CoLNE10〔微工研寄託受託拒
否通知番号、61微寄文第794号〕などを例示することが
できる。
本発明において、前記（イ）もしくは（ロ）の無血清
培養物、それら培養物の適量を添加含有させて本発明無
血清培養法を行なうのに用いる無血清培地としては、例
えば、 （１）動物細胞培養基礎培地、 （２）インシユリン及びトランスフエリンより成る群か
ら選ばれた成長因子の少なくとも一種 （３）エタノールアミン、 （４）メルカプトエタノール及び （５）亜セレン酸塩（たとえばNa塩、Ｋ塩） を含有してなる動物細胞培養完全培地であつて、更に （６）約1000mg/l−完全培地を越え、 約4500mg/l−完全培地以下の高濃度量のＬ−アルギニ
ン を含有する無血清培地、該（６）のＬ−アルギニンの他
に、或は該（６）のＬ−アルギニンの代りに、血清アル
ブミンの適量たとえば約0.1〜約1mg/ml−完全培地を含
有する無血清培地を例示できる。また、（２）〜（５）
成分の配合量は適宜に選択変更でき、たとえば培養目的
や培養するヒト／ヒト・ハイブリドーマなどによつて、
実験的に容易に好ましい配合量を選択設定できるが、例
えば、約２〜約50mg/l−完全培地の（２）成分、約10-8
モル〜約10-4モル/l−完全培地の（３）成分、約10-8モ
ル〜約10-4モル/l−完全培地の（４）成分及び約10-11
モル〜約10-7モル/l−完全培地の（５）成分の如き配合
量を例示することができる。
培養物、それら培養物の適量を添加含有させて本発明無
血清培養法を行なうのに用いる無血清培地としては、例
えば、 （１）動物細胞培養基礎培地、 （２）インシユリン及びトランスフエリンより成る群か
ら選ばれた成長因子の少なくとも一種 （３）エタノールアミン、 （４）メルカプトエタノール及び （５）亜セレン酸塩（たとえばNa塩、Ｋ塩） を含有してなる動物細胞培養完全培地であつて、更に （６）約1000mg/l−完全培地を越え、 約4500mg/l−完全培地以下の高濃度量のＬ−アルギニ
ン を含有する無血清培地、該（６）のＬ−アルギニンの他
に、或は該（６）のＬ−アルギニンの代りに、血清アル
ブミンの適量たとえば約0.1〜約1mg/ml−完全培地を含
有する無血清培地を例示できる。また、（２）〜（５）
成分の配合量は適宜に選択変更でき、たとえば培養目的
や培養するヒト／ヒト・ハイブリドーマなどによつて、
実験的に容易に好ましい配合量を選択設定できるが、例
えば、約２〜約50mg/l−完全培地の（２）成分、約10-8
モル〜約10-4モル/l−完全培地の（３）成分、約10-8モ
ル〜約10-4モル/l−完全培地の（４）成分及び約10-11
モル〜約10-7モル/l−完全培地の（５）成分の如き配合
量を例示することができる。
上記（１）動物細胞培養基礎培地は種々知られてお
り、公知文献（例えば、「細胞培地マニユアル」、第３
版、1984年７月20日講談社サイエンテイフイツク発行）
に従つて調製でき、その多くのものはまた市場で入手可
能であり本発明で利用することができる。
り、公知文献（例えば、「細胞培地マニユアル」、第３
版、1984年７月20日講談社サイエンテイフイツク発行）
に従つて調製でき、その多くのものはまた市場で入手可
能であり本発明で利用することができる。
このような基礎培地の例としては、下記の如き公知の
基礎培地及びその公知改質培地を例示することができ
る。
基礎培地及びその公知改質培地を例示することができ
る。
BME培地（Basal Medium Eagle）〔イーグル・エイ
チ，サイエンス（Eagle,H.,Science）、122:501（195
5）；イーグル・エイチ，ジヤーナル オブ エクスペ
リメンタルメデイスン（Eagle,H.,J.Exp.Med.）,102,37
（1955）及び102,595（1955）；イーグル．エイチ，ジ
ヤーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Eagl
e,H.,J.Biol.Chem.）,214,839（1955）；イーグル．エ
イチ，エトアール，サイエンス（Eagle,H.,Science）,1
23,845（1956）；ハンクス・ジエイ・エイチ，ワランス
・アール・イー，プロシーデイング オブ ザ ソサイ
エテイー フオー イクスペリメンタル バイオロジー
アンド メデイスン（Hanks,J.H.,Wallace,R.E.,Pro
c.Soc.Exp.Biol.Med）,71,196（1949）；ヤマネ・ア
イ，プロシーデイング オブ ザ ソサイエテイー フ
オー イクスペリメンタル バイオロジー アンド メ
デイスン（Yamane,I.,Proc.Soc.Exp.Biol.Med）,127,33
5（1968）；モートン・エイチ・ジエイ，インビトロ（M
orton,H.J.,InVitro）,6,89（1970）；イーグル・エイ
チ，プロシーデイング オブ ザ ソサイエテイー フ
オー イクスペリメンタル バイオロジー アンド メ
デイスン（Eagle,H.,Proc.Soc.Exp.Biol.Med）,89,362
（1955）；等〕、MEM培地（Minimum Essential Mediu
m）〔例えば、イーグル・エイチ，サイエンス（Eagle,
H.,Science）,130,432（1959）；ストーカー・エム，マ
ツク フアーソン・アイ，バイロロジー（Stoker,M.,Ma
cPherson,I.,Virology）,14,359（1961）；マツクフア
ーソン・アイ，ストーカー・エム，バイロロジー（MacP
herson,I.,M.,Virology）,16,147（1962）；ストーカー
・エム，マツクフアーソン・アイ，ネイチヤー（Stoke
r,M.,MacPherson,I.,Stoker,Nature,203,1355（196
4）；ダルベツコー・アール，フリーマン・ジー，バイ
ロロジー（Dulbecco,R.,Freeman,G.,Virology）,8,396
（1959）；スミス・ジエイ・デイー，エトアール，バイ
ロロジー（Smith,J.D.,et al.,Virology）,12,185（196
0）；スタンナーズ・シー・ピー，エト アール，ネイ
チヤー ニユー バイオロジー（Stanners,C.P.,et a
l.,Nature New Biology）,230,52（1971）；スタンナー
ズ・シー・ピー，スチユアート・シー，パーソナル コ
ミユニケーシヨン（Stannrs,C.P.,Stewart.C.,Personal
Communication.（1972）；等〕、199培地〔モーガン・
ジエイ・エフ，エト アール，ジヤーナル オブ キヤ
ンサー インステイチユート（Morgan,J.F.,et al.,J.N
at.Cancer Inst）,16,557（1955）；モートン・エイチ
・シエイ，インビトロ（Morton,H.J.,In Vitro）,6,89
（1970）：等〕、Ｌ−15培地（Ｌ−15 Medium〔リーボ
ビツツ・エイ，アメリカン（Leibvitz,A.,Amer,J.Hy
g）,78,173（1963）；等〕、ハム培地（Ham's Medium）
〔ハム・アール・ジー，イクスペリメンタル セル リ
サーチ（Ham,R.G.,Exp.Cell Res）,29,515（1963）；ハ
ム・アール・ジー，プロシーデイング オブ ナシヨナ
ル アカデミー オブ サイエンス オブ ザ ユナイ
テツド ステート オブ アメリカ（Ham,R.G.,Proc.Na
t.Acad.Sci）,53,288（1965）：等〕、マツコイ5A培地
〔ノイマン・ −ル・イー，マツコイ・テイー・エー，
プロシーデイング オブ エクスペリメンタル バイオ
ロジー アンド メデイスン（Neuman,R.E.,McCoy.T.
A.,Proc.Exp.Biol.Med）,98,303（1958）；マツコイ・
テイー・エイ，エトアール，プロシーデイング オブ
エクスペリメンタル バイオロジー アンド メデイス
ン（McCoy.T.A.,et al.,Proc.Exp.Biol.Med）,100,115
（1959）；スー・テイー・シー，ケロツグ・デイー・エ
ス，（Hsu,T.C.,Kellogg,D.S.,J,Nat.Cancer Inst.,2
5,221（1960）：等〕、RPMI培地（RPMI Medium）〔ムー
ア・ジー・イー，エトアール，ジエイ・エー・エム・エ
ー（Moore,G.E.,et al.,J.A.M.A.）199,519（1967）；
ムーア・ジー・イー，エト アール，ジヤーナル オブ
ナシヨナル キヤンサー インステイチユート（Moor
e,G.E.,ct al.,J.Nat.Cancer Inst）,36,405（196
6）；等〕、ウイリアムスＥ培地（Williams' MediumE）
〔ウイリアムス・ジー・エム，ワイスバーガー・イー・
ケイ，ワイスバーガー・ジエイ・エイチ，エクスペリメ
ンタル セル リサーチ（Williams,G.M.,Weisburger,
E.K.,Weisburger,J.H.,Exp.Cell.Res）,69,106〜112（1
971）；等〕。
チ，サイエンス（Eagle,H.,Science）、122:501（195
5）；イーグル・エイチ，ジヤーナル オブ エクスペ
リメンタルメデイスン（Eagle,H.,J.Exp.Med.）,102,37
（1955）及び102,595（1955）；イーグル．エイチ，ジ
ヤーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Eagl
e,H.,J.Biol.Chem.）,214,839（1955）；イーグル．エ
イチ，エトアール，サイエンス（Eagle,H.,Science）,1
23,845（1956）；ハンクス・ジエイ・エイチ，ワランス
・アール・イー，プロシーデイング オブ ザ ソサイ
エテイー フオー イクスペリメンタル バイオロジー
アンド メデイスン（Hanks,J.H.,Wallace,R.E.,Pro
c.Soc.Exp.Biol.Med）,71,196（1949）；ヤマネ・ア
イ，プロシーデイング オブ ザ ソサイエテイー フ
オー イクスペリメンタル バイオロジー アンド メ
デイスン（Yamane,I.,Proc.Soc.Exp.Biol.Med）,127,33
5（1968）；モートン・エイチ・ジエイ，インビトロ（M
orton,H.J.,InVitro）,6,89（1970）；イーグル・エイ
チ，プロシーデイング オブ ザ ソサイエテイー フ
オー イクスペリメンタル バイオロジー アンド メ
デイスン（Eagle,H.,Proc.Soc.Exp.Biol.Med）,89,362
（1955）；等〕、MEM培地（Minimum Essential Mediu
m）〔例えば、イーグル・エイチ，サイエンス（Eagle,
H.,Science）,130,432（1959）；ストーカー・エム，マ
ツク フアーソン・アイ，バイロロジー（Stoker,M.,Ma
cPherson,I.,Virology）,14,359（1961）；マツクフア
ーソン・アイ，ストーカー・エム，バイロロジー（MacP
herson,I.,M.,Virology）,16,147（1962）；ストーカー
・エム，マツクフアーソン・アイ，ネイチヤー（Stoke
r,M.,MacPherson,I.,Stoker,Nature,203,1355（196
4）；ダルベツコー・アール，フリーマン・ジー，バイ
ロロジー（Dulbecco,R.,Freeman,G.,Virology）,8,396
（1959）；スミス・ジエイ・デイー，エトアール，バイ
ロロジー（Smith,J.D.,et al.,Virology）,12,185（196
0）；スタンナーズ・シー・ピー，エト アール，ネイ
チヤー ニユー バイオロジー（Stanners,C.P.,et a
l.,Nature New Biology）,230,52（1971）；スタンナー
ズ・シー・ピー，スチユアート・シー，パーソナル コ
ミユニケーシヨン（Stannrs,C.P.,Stewart.C.,Personal
Communication.（1972）；等〕、199培地〔モーガン・
ジエイ・エフ，エト アール，ジヤーナル オブ キヤ
ンサー インステイチユート（Morgan,J.F.,et al.,J.N
at.Cancer Inst）,16,557（1955）；モートン・エイチ
・シエイ，インビトロ（Morton,H.J.,In Vitro）,6,89
（1970）：等〕、Ｌ−15培地（Ｌ−15 Medium〔リーボ
ビツツ・エイ，アメリカン（Leibvitz,A.,Amer,J.Hy
g）,78,173（1963）；等〕、ハム培地（Ham's Medium）
〔ハム・アール・ジー，イクスペリメンタル セル リ
サーチ（Ham,R.G.,Exp.Cell Res）,29,515（1963）；ハ
ム・アール・ジー，プロシーデイング オブ ナシヨナ
ル アカデミー オブ サイエンス オブ ザ ユナイ
テツド ステート オブ アメリカ（Ham,R.G.,Proc.Na
t.Acad.Sci）,53,288（1965）：等〕、マツコイ5A培地
〔ノイマン・ −ル・イー，マツコイ・テイー・エー，
プロシーデイング オブ エクスペリメンタル バイオ
ロジー アンド メデイスン（Neuman,R.E.,McCoy.T.
A.,Proc.Exp.Biol.Med）,98,303（1958）；マツコイ・
テイー・エイ，エトアール，プロシーデイング オブ
エクスペリメンタル バイオロジー アンド メデイス
ン（McCoy.T.A.,et al.,Proc.Exp.Biol.Med）,100,115
（1959）；スー・テイー・シー，ケロツグ・デイー・エ
ス，（Hsu,T.C.,Kellogg,D.S.,J,Nat.Cancer Inst.,2
5,221（1960）：等〕、RPMI培地（RPMI Medium）〔ムー
ア・ジー・イー，エトアール，ジエイ・エー・エム・エ
ー（Moore,G.E.,et al.,J.A.M.A.）199,519（1967）；
ムーア・ジー・イー，エト アール，ジヤーナル オブ
ナシヨナル キヤンサー インステイチユート（Moor
e,G.E.,ct al.,J.Nat.Cancer Inst）,36,405（196
6）；等〕、ウイリアムスＥ培地（Williams' MediumE）
〔ウイリアムス・ジー・エム，ワイスバーガー・イー・
ケイ，ワイスバーガー・ジエイ・エイチ，エクスペリメ
ンタル セル リサーチ（Williams,G.M.,Weisburger,
E.K.,Weisburger,J.H.,Exp.Cell.Res）,69,106〜112（1
971）；等〕。
これら（１）動物細胞培養基礎培地は、複数種を適当
な割合で配合して利用することもできる。
な割合で配合して利用することもできる。
前述したように、前記（イ）もしくは（ロ）における
細胞培養時間は、細胞の種類などによつて、予め実験的
に容易に選択設定できるが、前記例示の細胞の数例につ
いて例示すると、例えばヒトＢリンパ芽球株細胞UC729
−６では培養開始後約10〜30時間、ヒトＢリンパ芽球細
胞HIH/TO1では培養開始後約10〜40時間、ヒトＢリンパ
芽球細胞由来ヒト／ヒトハイブリドーマCLN/SUZH11では
培養開始後約10〜80時間、ヒトＢリンパ芽球細胞由来ヒ
ト／ヒトハイブリドーマTOS/H8では培養開始後約10〜80
時間の無血清培地培養物を例示することができる。
細胞培養時間は、細胞の種類などによつて、予め実験的
に容易に選択設定できるが、前記例示の細胞の数例につ
いて例示すると、例えばヒトＢリンパ芽球株細胞UC729
−６では培養開始後約10〜30時間、ヒトＢリンパ芽球細
胞HIH/TO1では培養開始後約10〜40時間、ヒトＢリンパ
芽球細胞由来ヒト／ヒトハイブリドーマCLN/SUZH11では
培養開始後約10〜80時間、ヒトＢリンパ芽球細胞由来ヒ
ト／ヒトハイブリドーマTOS/H8では培養開始後約10〜80
時間の無血清培地培養物を例示することができる。
本発明方法の実施に際して、培養条件それ自体は適宜
に選択できるが、例えば、５％CO2雰囲気下で約37℃±
３℃の如き条件を例示することができる。
に選択できるが、例えば、５％CO2雰囲気下で約37℃±
３℃の如き条件を例示することができる。
以下、実施例により、本発明の数態様について更に詳
しく説明する。なお、以下の実施例１、２、３、４、５
における各細胞の無血清培地培養物（培養上清）を調製
する際の細胞の増殖曲線を第１図に示した。図中、−は
ヒトＢリンパ芽球細胞株UC729−６、＊はヒトＢリンパ
芽球細胞株HIH/TO1、＊はヒト／ヒトハイブリドーマCLN
/SUZH11、＊はヒト／ヒトハイブリドーマTOS/H8につい
ての増殖曲線を示す。
しく説明する。なお、以下の実施例１、２、３、４、５
における各細胞の無血清培地培養物（培養上清）を調製
する際の細胞の増殖曲線を第１図に示した。図中、−は
ヒトＢリンパ芽球細胞株UC729−６、＊はヒトＢリンパ
芽球細胞株HIH/TO1、＊はヒト／ヒトハイブリドーマCLN
/SUZH11、＊はヒト／ヒトハイブリドーマTOS/H8につい
ての増殖曲線を示す。
実施例１ ヒトＢリンパ芽球細胞HIH/TO1の無血清培養物の調製は
次のように行つた。ヒトＢリンパ芽球株HIH/TO1細胞を
インシユリン、トランスフエリン、メルカプトエタノー
ル、亜セレン酸ナトリウム、血清アルブミン、エタノー
ルアミンを含むRDF基礎培地中で初期細胞濃度105/mlで
培養を開始し、その24時間後及び48時間後の培養液を集
めた。24時間後及び48時間後の培養液を遠心処理（1000
rpm、10分間）することによつて細胞を除き、遠心処理
後の上清をフイルター（0.22μｍ）を通して、無血清培
地培養物を調製した。これは使用するまで−20℃で保存
した。
次のように行つた。ヒトＢリンパ芽球株HIH/TO1細胞を
インシユリン、トランスフエリン、メルカプトエタノー
ル、亜セレン酸ナトリウム、血清アルブミン、エタノー
ルアミンを含むRDF基礎培地中で初期細胞濃度105/mlで
培養を開始し、その24時間後及び48時間後の培養液を集
めた。24時間後及び48時間後の培養液を遠心処理（1000
rpm、10分間）することによつて細胞を除き、遠心処理
後の上清をフイルター（0.22μｍ）を通して、無血清培
地培養物を調製した。これは使用するまで−20℃で保存
した。
ヒト／ヒト・ハイブリドーマTOS/H8を、調製したHIH/
TO1細胞の無血清培地培養物０〜50％添加した上記無血
清培地で初期細胞濃度５×104細胞/mlで培養し、５日後
細胞数及び抗体量を測定した。細胞数測定にはヘモサイ
トメーターを、抗体量測定には酵素抗体法を用いた。以
下に酵素抗体法の説明を行う。
TO1細胞の無血清培地培養物０〜50％添加した上記無血
清培地で初期細胞濃度５×104細胞/mlで培養し、５日後
細胞数及び抗体量を測定した。細胞数測定にはヘモサイ
トメーターを、抗体量測定には酵素抗体法を用いた。以
下に酵素抗体法の説明を行う。
シクロタイタープレートの中に抗ヒト免疫グロブリン
抗体を滴下（50μｌ）し、37℃で１時間プレートに吸着
させる。0.3％のゼラチンを含む10mMリン酸緩衝液（ゼ
ラチン緩衝液）で３回洗浄した後、５％牛血清アルブミ
ン溶液を滴下し（200μｌ）、37℃で１時間吸着させ
る。ゼラチン緩衝液で３回洗浄し未吸着のものを除去す
る。次に検液（無血清培養物）を滴下（50μｌ）して、
37℃で１時間反応後、ゼラチン緩衝液で３回洗浄する。
ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒト免疫グロブリン抗体を
滴下（50μｌ）して、37℃で30分間反応させ、検液中の
ヒト免疫グロブリンと結合させる。ゼラチン緩衝液で３
回洗浄後、過酸化水素とｏ−フエニレンジアミンを含む
基質溶液を加え、暗室で10分間反応させる。５〜H2SO4
（50μｌ）を加え、反応を止める。ヒト免疫グロブリン
の量に比例して490nmに吸収をもつ黄色の基質反応物が
生産される。この量を吸光光度計を用いて測定し、予め
濃度のわかつたヒト免疫グロブリンの吸光度と比較する
ことによつて、検液のヒト免疫グロブリン濃度を知るこ
とができる。
抗体を滴下（50μｌ）し、37℃で１時間プレートに吸着
させる。0.3％のゼラチンを含む10mMリン酸緩衝液（ゼ
ラチン緩衝液）で３回洗浄した後、５％牛血清アルブミ
ン溶液を滴下し（200μｌ）、37℃で１時間吸着させ
る。ゼラチン緩衝液で３回洗浄し未吸着のものを除去す
る。次に検液（無血清培養物）を滴下（50μｌ）して、
37℃で１時間反応後、ゼラチン緩衝液で３回洗浄する。
ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒト免疫グロブリン抗体を
滴下（50μｌ）して、37℃で30分間反応させ、検液中の
ヒト免疫グロブリンと結合させる。ゼラチン緩衝液で３
回洗浄後、過酸化水素とｏ−フエニレンジアミンを含む
基質溶液を加え、暗室で10分間反応させる。５〜H2SO4
（50μｌ）を加え、反応を止める。ヒト免疫グロブリン
の量に比例して490nmに吸収をもつ黄色の基質反応物が
生産される。この量を吸光光度計を用いて測定し、予め
濃度のわかつたヒト免疫グロブリンの吸光度と比較する
ことによつて、検液のヒト免疫グロブリン濃度を知るこ
とができる。
以上の方法を用いて測定した結果、ヒトＢリンパ芽球
細胞HIH/TO1の対数増殖期以前である培養開始後24時間
の無血清培養物；対数増殖初期である培養開始後48時間
の無血清培養物ともに０〜50％添加することによつてヒ
ト／ヒトハイブリドーマTOS/F8の細胞増殖及び抗体産生
を促進した（第２図参照）。第２図において、図中、実
線（−）は上記の24時間培養物の上清を添加した場合、
又、破線（‐‐‐）は上記の48時間培養物の上清を添加
した場合についてのグラフである。
細胞HIH/TO1の対数増殖期以前である培養開始後24時間
の無血清培養物；対数増殖初期である培養開始後48時間
の無血清培養物ともに０〜50％添加することによつてヒ
ト／ヒトハイブリドーマTOS/F8の細胞増殖及び抗体産生
を促進した（第２図参照）。第２図において、図中、実
線（−）は上記の24時間培養物の上清を添加した場合、
又、破線（‐‐‐）は上記の48時間培養物の上清を添加
した場合についてのグラフである。
実施例２ ヒトＢリンパ芽球細胞UC729−６の無血清培養物の調
製は次のように行つた。
製は次のように行つた。
ヒトＢリンパ芽球株UC729−６細胞をインシユリン、
トランスフエリン、メルカプトエタノール、エタノール
アミン、亜セレン酸ナトリウム、血清アルブミンを含む
RDF基礎培地中で初期細胞濃度105/mlで培養を開始し、
その24時間後及び48時間後の培養液を集めた。24時間後
及び48時間後の培養液を遠心処理（1000rpm、10分間）
することによつて細胞を除き、遠心処理後の上清をフイ
ルター（0.22μｍ）を通して、無血清培養物を調製し
た。
トランスフエリン、メルカプトエタノール、エタノール
アミン、亜セレン酸ナトリウム、血清アルブミンを含む
RDF基礎培地中で初期細胞濃度105/mlで培養を開始し、
その24時間後及び48時間後の培養液を集めた。24時間後
及び48時間後の培養液を遠心処理（1000rpm、10分間）
することによつて細胞を除き、遠心処理後の上清をフイ
ルター（0.22μｍ）を通して、無血清培養物を調製し
た。
調製されたVC729-6の無血清培養物０〜50％添加した
上記無血清培地で、ヒト／ヒトハイブリドーマCLN/SUZH
11を初期濃度５×104/mlで培養した。５日後、実施例１
と同様の方法を用いて、細胞数、抗体量を測定した。
上記無血清培地で、ヒト／ヒトハイブリドーマCLN/SUZH
11を初期濃度５×104/mlで培養した。５日後、実施例１
と同様の方法を用いて、細胞数、抗体量を測定した。
この結果、ヒトＢリンパ芽球細胞UC729−６の対数増
殖初期である培養開始後24時間の培養物０〜50％を添加
することによつてヒト／ヒトハイブリドーマCLN/SUZH11
の細胞増殖、及び抗体産生を促進した。対数増殖中期で
ある培養開始後48時間の培養物は、CLN/SUZH11の細胞増
殖及び抗体産生を阻害した（第３図参照）。第３図にお
いて、図中、実線（−）は上記の24時間培養物の上清を
添加した場合、又、破線（‐‐‐）は上記の48時間培養
物の上清を添加した場合についてのグラフである。
殖初期である培養開始後24時間の培養物０〜50％を添加
することによつてヒト／ヒトハイブリドーマCLN/SUZH11
の細胞増殖、及び抗体産生を促進した。対数増殖中期で
ある培養開始後48時間の培養物は、CLN/SUZH11の細胞増
殖及び抗体産生を阻害した（第３図参照）。第３図にお
いて、図中、実線（−）は上記の24時間培養物の上清を
添加した場合、又、破線（‐‐‐）は上記の48時間培養
物の上清を添加した場合についてのグラフである。
実施例３ 実施例２と同様に作られたヒトＢリンパ芽細胞UC729
−６の無血清培養物０〜50％添加した実施例２と同様の
無血清培地でヒト／ヒトハイブリドーマSLNF10を初期細
胞濃度105/mlで培養した。５日後、実施例１と同様の方
法を用いて細胞数、抗体量を測定した。
−６の無血清培養物０〜50％添加した実施例２と同様の
無血清培地でヒト／ヒトハイブリドーマSLNF10を初期細
胞濃度105/mlで培養した。５日後、実施例１と同様の方
法を用いて細胞数、抗体量を測定した。
この結果、24時間後の無血清培地培養物10〜50％を添
加した培地において細胞増殖、抗体産生量を促進した。
対数増殖初期〜中期である培養開始後48時間の無血清培
地培養物はSLNF10の細胞増殖及び抗体産生を改善しなか
つた（第４図参照）。第４図において、図中、実線
（−）は上記の24時間、培養物の上清を添加した場合、
又、破線（‐‐‐）は上記の48時間培養物の上清を添加
した場合についてのグラフである。
加した培地において細胞増殖、抗体産生量を促進した。
対数増殖初期〜中期である培養開始後48時間の無血清培
地培養物はSLNF10の細胞増殖及び抗体産生を改善しなか
つた（第４図参照）。第４図において、図中、実線
（−）は上記の24時間、培養物の上清を添加した場合、
又、破線（‐‐‐）は上記の48時間培養物の上清を添加
した場合についてのグラフである。
実施例４ ヒト／ヒトハイブリドーマTOS/F8の無血清培養物の調
製は次のように行つた。TOS/F8をインシユリン、トラン
スフエリン、亜セレン酸Na、Ｂ−メルカプトエタノー
ル、Ｌ−アルギニンを含むRDF無血清培地中で初期細胞
濃度105/mlで培養を開始し、０、24、72、120、140時間
後の培養液を集めた。各培養液を遠心処理（1000rpm、1
0分間）することによつて細胞を除き、遠心処理後の上
清をフイルター（0.22μｍ）を通して無血清培地培養物
を調製した。これは使用するまで−20℃で保存した。
製は次のように行つた。TOS/F8をインシユリン、トラン
スフエリン、亜セレン酸Na、Ｂ−メルカプトエタノー
ル、Ｌ−アルギニンを含むRDF無血清培地中で初期細胞
濃度105/mlで培養を開始し、０、24、72、120、140時間
後の培養液を集めた。各培養液を遠心処理（1000rpm、1
0分間）することによつて細胞を除き、遠心処理後の上
清をフイルター（0.22μｍ）を通して無血清培地培養物
を調製した。これは使用するまで−20℃で保存した。
上記ヒト／ヒトハイブリドーマTOS/F8を、調製した各
時間ごとの無血清培地培養物０〜50％添加した無血清培
地で初期細胞濃度５×104/mlで培養し、５日後の細胞数
及び抗体量を測定した。細胞数測定にはヘモサイトメー
ターを、抗体量測定には実施例１に示した酵素抗体法を
用いた。
時間ごとの無血清培地培養物０〜50％添加した無血清培
地で初期細胞濃度５×104/mlで培養し、５日後の細胞数
及び抗体量を測定した。細胞数測定にはヘモサイトメー
ターを、抗体量測定には実施例１に示した酵素抗体法を
用いた。
この結果、24時間後の無血清培地培養物を０〜50％添
加した培地においてTOS/F8の細胞増殖、抗体産生を促進
した。又、72時間後の無血清培地培養物を０〜15％添加
した培地においてTOS/F8の細胞増殖を促進した（第５図
及び第６図参照）。
加した培地においてTOS/F8の細胞増殖、抗体産生を促進
した。又、72時間後の無血清培地培養物を０〜15％添加
した培地においてTOS/F8の細胞増殖を促進した（第５図
及び第６図参照）。
実施例５ ヒト／ヒトハイブリドーマCLN/SUZH11の無血清培養物
の調製は次のように行つた。CLN/SUZH11細胞を実施例４
と同様の無血清培地中で初期細胞濃度105/mlで培養を開
始し、０、25、48、72、144時間後の培養液を集めた。
各培養液を遠心処理（1000rpm、10分間）することによ
つて細胞を除き、遠心処理後の上清をフイルター（0.22
μｍ）を通して無血清培養物を調製した。この培養物を
使用するまで−20℃で保存した。
の調製は次のように行つた。CLN/SUZH11細胞を実施例４
と同様の無血清培地中で初期細胞濃度105/mlで培養を開
始し、０、25、48、72、144時間後の培養液を集めた。
各培養液を遠心処理（1000rpm、10分間）することによ
つて細胞を除き、遠心処理後の上清をフイルター（0.22
μｍ）を通して無血清培養物を調製した。この培養物を
使用するまで−20℃で保存した。
上記ヒト／ヒトハイブリドーマCLN/SUZH11を、調製し
た各時間ごとの無血清培地培養物20％添加した無血清培
地で初期細胞濃度105/mlで培養し、４日後の細胞数を測
定した。細胞数測定にはヘモサイトメーターを用いた。
た各時間ごとの無血清培地培養物20％添加した無血清培
地で初期細胞濃度105/mlで培養し、４日後の細胞数を測
定した。細胞数測定にはヘモサイトメーターを用いた。
この結果、25時間、48時間、72時間後の無血清培地培
養物を添加した培地において細胞増殖を促進した（第７
図参照）。
養物を添加した培地において細胞増殖を促進した（第７
図参照）。
第１図は実施例１、２、３、４、５における各細胞の無
血清培養物（培養上清）を調製する際の細胞の増殖曲線
を示す図であり、第２図は実施例１におけるHIH/TO1培
養物（培養上清）のヒト／ヒトハイブリドーマTOS/F8に
対する効果を示す図であり、第３図は実施例２における
UC729−６培養物のヒト／ヒトハイブリドーマCLN/SUZH1
1に対する効果を示す図であり、第４図は実施例３にお
けるUC729−６培養物のヒト／ヒトハイブリドーマSLNF1
0に対する効果を示す図であり、第５図及び第６図は実
施例４におけるヒト／ヒトハイブリドーマTOS/F8培養物
のヒト／ヒトハイブリドーマTOS/F8に対する効果を示す
図であり、そして第７図は実施例５におけるヒト／ヒト
ハイブリドーマCLN/SUZH11培養物のCLN/SUZH11に対する
効果を示す図である。
血清培養物（培養上清）を調製する際の細胞の増殖曲線
を示す図であり、第２図は実施例１におけるHIH/TO1培
養物（培養上清）のヒト／ヒトハイブリドーマTOS/F8に
対する効果を示す図であり、第３図は実施例２における
UC729−６培養物のヒト／ヒトハイブリドーマCLN/SUZH1
1に対する効果を示す図であり、第４図は実施例３にお
けるUC729−６培養物のヒト／ヒトハイブリドーマSLNF1
0に対する効果を示す図であり、第５図及び第６図は実
施例４におけるヒト／ヒトハイブリドーマTOS/F8培養物
のヒト／ヒトハイブリドーマTOS/F8に対する効果を示す
図であり、そして第７図は実施例５におけるヒト／ヒト
ハイブリドーマCLN/SUZH11培養物のCLN/SUZH11に対する
効果を示す図である。
Claims (1)
- 【請求項１】自己増殖能を有するが抗体生産能を実質的
に欠如するヒトＢリンパ芽球細胞株の無血清培養物もし
くは該細胞株を融合パートナーとするヒト癌患者由来の
ヒトＢ細胞とのモノクロナル抗体生産性ヒト／ヒトハイ
ブリドーマの無血清培養物であつて、その培養開始後、
加速期前から対数増殖期初期にいたる培養物の適量を添
加含有させた無血清培地において、上記モノクロナル抗
体生産性ヒト／ヒトハイブリドーマを培養することを特
徴とするヒト／ヒトハイブリドーマの無血清培養法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61202753A JPH084518B2 (ja) | 1986-08-30 | 1986-08-30 | モノクロナル抗体生産性ヒト／ヒトハイブリド−マの無血清培養法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61202753A JPH084518B2 (ja) | 1986-08-30 | 1986-08-30 | モノクロナル抗体生産性ヒト／ヒトハイブリド−マの無血清培養法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6359882A JPS6359882A (ja) | 1988-03-15 |
| JPH084518B2 true JPH084518B2 (ja) | 1996-01-24 |
Family
ID=16462594
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61202753A Expired - Fee Related JPH084518B2 (ja) | 1986-08-30 | 1986-08-30 | モノクロナル抗体生産性ヒト／ヒトハイブリド−マの無血清培養法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH084518B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0787799B2 (ja) * | 1988-03-30 | 1995-09-27 | 森永製菓株式会社 | モノクローナル抗体生産増強法 |
-
1986
- 1986-08-30 JP JP61202753A patent/JPH084518B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6359882A (ja) | 1988-03-15 |
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