JP3536076B2 - 融合細胞株とその取得方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、融合細胞株とその
取得方法に関する。詳しくは、ヒト細胞株を用いた免疫
系の諸現象、すなわちアレルギー、ガンなどのメカニズ
ム解明、それらの疾病の予防、診断、治療等を目的とし
た食品機能の検索、新規医薬品の探索、製造に使用する
ためのヒト免疫担当細胞株の取得に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】一般に、ヒトの体内から分離した細胞を
体外で培養するには、困難を伴うことが多い。例えば、
ヒトの体内から分離したリンパ球などの細胞を体外で無
限増殖させることは困難である。通常、これら細胞を培
養液中で培養しても、２週間から数ヶ月程度で死滅して
しまう。ガン細胞や上皮細胞のある種のものは、培地組
成によっては体外での継代培養が可能であるが、研究等
に用いるために必要十分な量を確保することは難しい。
さらに、体内細胞を体外において増殖させるには、細胞
に何らかの刺激を与える必要がある。そのために、培養
液に種々の生理活性物質を添加しなければならないが、
その適切な物質の選択等に問題があり、かなりの労力を
要する。

【０００３】近年では、このような問題点を解消する方
法として、目的とする細胞に発ガン物質等の薬剤を添加
したり、紫外線や放射線を照射する等の処理を行い、目
的の細胞に突然変異を生じさせる（トランスフォーム）
方法が提案されている。このような処理を行うことによ
り、無限増殖が可能な細胞株（変異株）を取得すること
ができる。また、遺伝子導入法（細胞に特定の遺伝子を
導入する方法）を用いて、株化したい細胞に、不死化遺
伝子を導入して形質転換を生じさせ、無限増殖する細胞
を取得する方法も報告されている。

【０００４】さらに、このようにトランスフォームを利
用した方法のほかに、リンパ球などのように体内で抗体
や免疫調節因子（リンフォカイン）を産生する細胞を、
無限増殖する細胞と融合して、体外でもその抗体や免疫
調節因子を産生する融合細胞（ハイブリドーマ）として
樹立する方法も知られている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
の従来の方法では、次のような問題点があった。まず、
薬剤を添加する方法や紫外線等の照射を利用する方法に
おいては、獲得した変異形質およびその他の細胞機能が
安定した細胞株として樹立するために、数カ月から数年
もの長期間を要し、樹立した細胞株が利用できるように
なるまでにかなりの期間が必要であった。また、処理に
供した細胞数あたりの取得される変異株数（変異効率）
が低く、目的細胞を容易に株化することが困難であっ
た。

【０００６】また、細胞融合によって株化する方法は、
モノクローナル抗体やリンフォカイン等の細胞由来物質
の安定生産系としては有用である。しかしながら、この
方法で得られる融合細胞株は、生体内で生じる種々の免
疫反応に対しては、その細胞応答が低下もしくは消失し
ていると言われている。したがって、これらの方法を用
いても、生体内での細胞の相互作用を生体外でも再現可
能な樹立細胞系として用いるためには多くの困難が伴っ
た。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、株化細胞
の取得法について検討を重ね、細胞融合法による株化が
その他の方法に比較して、細胞をトランスフォームさせ
る効率が比較的高い点に着目した。ただし、細胞融合し
て得られる株細胞の性質は、融合に供した生体由来の免
疫担当細胞ばかりでなく、他方のパートナーであるヒト
親細胞株に大きく依存していることが知られている。

【０００８】そこで、種々のヒト由来の免疫担当細胞を
細胞機能を保持したまま効率よく株化するために、本発
明者らは親細胞株について研究し、変異株であるヒトＴ
細胞性白血病細胞株ＩＣＬＵ−Ｔを樹立した。このヒト
親細胞株を用いて、生体内の各種ヒト免疫担当細胞と細
胞融合することにより得られる融合細胞は、該細胞が生
体内で有していたと考えられる細胞機能を保持する性質
を残していることが分かった。

【０００９】また、この細胞融合用親細胞株であるＩＣ
ＬＵ−Ｔは、よく知られている細胞融合促進剤（ポリエ
チレングリコール、以下ＰＥＧと記載する。）および融
合細胞のみを増殖させる融合細胞選択培地（ＨＡＴ培
地）では、効率的な細胞融合を行うことは不可能である
ことが判明した。そこで、本発明者らは、ＩＣＬＵ−Ｔ
を親細胞株として利用し、融合細胞を得るための手段に
ついて検討した結果、ＰＥＧとリン脂質であるレシチン
を混合した融合促進剤を開発すると共に、ヒポキサンチ
ンとアメソプテリンで構成される選択培地を開発した。
その結果、これらを用いることにより、効率よく細胞融
合を行うことができることを見出した。なお、本発明で
用いるヒト細胞融合用親細胞株ＩＣＬＵ−Ｔは、必ずし
も免疫担当細胞とのみ融合可能なわけではなく、その他
の組織由来の細胞とも融合可能である。

【００１０】請求項１記載の本発明は、ヒトＴ細胞性白
血病細胞株ＰＥＥＲから、８−アザグアニン耐性クロー
ンを選択し、さらに無血清培養可能にした変異株である
ＩＣＬＵ−Ｔを親細胞株とするヒト免疫担当融合細胞株
である。

【００１１】また、請求項２記載の本発明は、ヒト細胞
融合用親細胞株ＩＣＬＵ−Ｔとヒト免疫担当細胞を用い
て融合細胞を作成する際に、ＰＥＧとレシチンの存在下
に行うことを特徴とするヒト免疫担当融合細胞株の取得
方法である。

【００１２】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
融合細胞の性質は、前記したように、融合に供した生体
由来の免疫細胞だけでなく、親細胞株にも大きく依存し
ている。そこで、本発明者らは、種々のヒト由来の免疫
担当細胞を細胞機能を保持したまま効率よく株化するた
めに用いることができるヒト細胞融合用親細胞株を樹立
した。すなわち、ヒト免疫細胞由来細胞から、次のよう
にして親細胞株を取得した。ヒトＴ細胞性白血病細胞株
（ＰＥＥＲ）は８−アザグアニン（終濃度２０μg/ml）
を含む１０％牛胎児血清（以下、ＦＢＳと記載する。）
を含むＥＲＤＦ培地（極東製薬工業（株）製）で培養し
た。なお、１０％の濃度でＦＢＳを添加したＥＲＤＦ培
地を、以下１０ ％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地と記載する。

【００１３】３週間程度培養した後、増殖してきたクロ
ーンを分取し、クローニングを行った。クローニング
は、９６穴培養プレートの１穴につき１個の細胞が入る
ように、１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地を用いて細胞懸濁
液を稀釈して巻き込む限界稀釈法に従った。９６穴培養
プレートに細胞をまきこんで２４〜３０時間後に、プレ
ートの各穴を検鏡し、細胞が２個になっている穴に印を
いれた。さらに、２４〜３０時間後（すなわち、まきこ
んでから４８〜６０時間後）に、印がついている穴を検
鏡し、細胞が４個になっている穴に印をいれた。まきこ
んでから２０日後に、２つの印がついている穴を検鏡
し、細胞が増殖していることを確認して細胞数を血球計
算板で計測した。最も細胞数が多かった穴の細胞を、さ
らに上記と同様の方法で再クローニングした。

【００１４】親細胞株が樹立された後、細胞融合で得ら
れる融合細胞が無血清培養可能となるように、クローニ
ングで得られたクローンをインスリン（終濃度１０μg/
ml）、トランスフェリン（終濃度２０μg/ml）、エタノ
ールアミン（終濃度２０μＭ）、亜セレン酸ナトリウム
（終濃度２５ｎＭ）を含むＥＲＤＦ培地（極東製薬工業
（株）製）で、９６穴培養プレートに、１穴につき１個
の細胞が入るように稀釈して２週間程度培養した。増殖
してきた各穴の細胞数を計測し、最も細胞数が多かった
順に各穴の細胞の一部をアミノプテリン（終濃度０．４
ｍＭ）を含む１５％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地で培養した。
培養後３日目〜５日目に検鏡し、細胞が死滅したクロー
ンの３、４株を親細胞株の候補として樹立した。

【００１５】得られた親細胞株の候補となるクローンを
用いて実際に細胞融合した。その結果、使用した各クロ
ーンの細胞数を１０⁵ 細胞としたときの取得した融合細
胞数（融合効率）を指標として、この値が最も高いクロ
ーンを樹立親細胞株とした。このようにして樹立した親
細胞株、すなわちＰＥＥＲ由来の親細胞株をヒトＴ細胞
性白血病細胞株（ＩＣＬＵ−Ｔ）と命名した。このよう
にして樹立された親細胞株は、工業技術院生命工学工業
技術研究所に寄託されており、その受託番号は、ＩＣＬ
Ｕ−ＴがＦＥＲＭ ＢＰ−６２５５である。この親細胞
株を、ヒト末梢血リンパ球のようなヒト免疫担当細胞と
融合操作を行うことにより、請求項１記載の融合細胞株
を得ることができる。

【００１６】親細胞株とヒト免疫担当細胞との融合操作
は、例えば以下のようにして行うことができる。まず、
上記の親細胞株とヒト免疫担当細胞とを混合する。ここ
で、親細胞株と融合させる他方のヒト免疫担当細胞とし
ては、ヒトリンパ球などのヒトの生体内で免疫機能を有
する細胞であればいずれも使用できる。親細胞株に対す
るヒト免疫担当細胞の使用割合は、例えば親細胞株とし
てＩＣＬＵ−Ｔを使用する場合は０．８〜１．２倍とす
るのが好ましい。

【００１７】また、ヒト免疫担当細胞の代わりに、その
他のヒト組織由来の細胞、例えばヒトガン細胞などを用
いて融合させることも可能である。ガン細胞を用いる場
合、該細胞の由来する組織の種類は特に限定されず、例
えば胃ガン細胞や乳ガン細胞など、いずれも同じように
使用することができる。この場合、親細胞株に対するこ
れら細胞の使用割合は、上記と同様でよい。

【００１８】親細胞株とヒト免疫担当細胞等の混合物を
遠心分離することにより、培養上清と細胞ペレットとに
分離し、このうちの培養上清を除去する。残った細胞ペ
レットに、融合促進剤であるＰＥＧを基本合成培地で希
釈したもの（通常は、４０〜５０％に希釈）を添加す
る。ここで用いる培地としては、例えば基本合成培地と
してＥＲＤＦ培地、ＲＰＭ１１６４０培地、ダルベッコ
変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）などが使用可能である。
これらの培地と共に、成長因子として牛胎児血清（ＦＢ
Ｓ）を併用したり、インスリン、トランスフェリン、エ
タノールアミン、亜セレン酸ナトリウムなどの無血清培
養用成長因子を併用することもできる。また、融合促進
剤であるＰＥＧとしては、平均分子量が4,０００〜6,０
００程度のものを使用できるが、融合効率の点から平均
分子量4,０００程度のものが好ましく、ＩＣＬＵ−Ｔの
場合は平均分子量4,０００程度のものが特に好ましい。

【００１９】ところで、親細胞株としてＩＣＬＵ−Ｔ細
胞を用いた場合は、融合促進剤としてＰＥＧにレシチン
を混合したものを使用する必要がある。ＰＥＧにレシチ
ンを混合せずに、ＩＣＬＵ−Ｔ細胞の細胞融合操作を行
った場合、ＩＣＬＵ−Ｔの細胞膜破壊が顕著に生じ、残
存する生細胞数が減少する上に、目的とする融合細胞を
効率よく得ることができない。レシチンは、細胞膜の主
たる構成成分であるリン脂質の一種である。このレシチ
ンを混合すると、ＩＣＬＵ−Ｔ細胞を用いた融合操作を
行った場合に、細胞膜の主成分であるリン脂質を保護
し、ＰＥＧによる細胞膜破壊を極力抑えることができ
る。

【００２０】培地で希釈された融合促進剤を添加した細
胞ペレットを遠心分離した後、該細胞ペレットの中から
融合細胞を選択する。

【００２１】ＩＣＬＵ−Ｔを親細胞株として用いた場合
の融合細胞の選択は、ヒポキサンチンおよびアミノプテ
リン（代わりに、アメソプテリンでもよい。以下、同
じ）を含むが、チミジンを含まない培地で構成された選
択培地を使用する。ＩＣＬＵ−Ｔ細胞を親細胞とする場
合、選択培地にチミジンが存在すると、増殖阻害が生じ
るため、チミジンの添加を避けるべきである。融合後２
４〜３０時間経過した後、懸濁液にヒポキサンチンとア
ミノプテリンを含有した選択培地（例えば、１５％ＦＢ
Ｓ−ＥＲＤＦ培地）を添加する。この培地は、上記と同
様に、数日おきに半量ずつ交換する。このようにして２
週間程度培養することにより、融合細胞を取得すること
ができる。親細胞から融合操作を経て得られる融合細胞
は、生体内において当該免疫担当細胞が発現していた特
定の免疫反応（細胞機能）を、生体外でもそのまま保持
することができる。

【００２２】

【実施例】次に、本発明を詳細に説明するために代表的
な実施例を挙げるが、本発明はこれらに限定されるもの
ではない。実施例１〔ＩＣＬＵ−Ｔを用いたヒトリンパ
球の株化〕ＩＣＬＵ−Ｔ（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２５５）
を４×１0⁶個、ヒト末梢血リンパ球を４×１0⁶個で混合
した。この混合物を遠心分離し、培養上清と細胞ペレッ
トとに分離した後、培養上清を除去した。細胞ペレット
に基本培地であるＥＲＤＦ培地（極東製薬工業（株）
製）と１％レシチンで調製した４０％ＰＥＧ（平均分子
量：４０００）を１ｍｌ添加した。さらに、ＥＲＤＦ培
地９ｍｌを添加して、全量を１０ｍｌとした。これを再
び遠心分離して得られた細胞のペレットを、ＥＲＤＦ培
地８５％、ＦＢＳ１５％になるように調製された１５％
ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地２５ｍｌで懸濁した。懸濁液は、
９６穴培養プレートの各穴に１００μｌずつ添加した。
この融合操作の４日後に、１３３μＭヒポキサンチン、
0.２６μＭアメソプテリン含有１５％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ
培地を９６穴培養プレートの各穴に１００μｌずつ添加
した。次いで、４、５日おきに、６７μＭヒポキサンチ
ン、0.１３μＭアメソプテリン含有１５％ＦＢＳ−ＥＲ
ＤＦ培地と半量ずつ培地交換した。培養開始から２週間
程度経過後に、形成されたＩＣＬＵ−Ｔとヒト末梢血リ
ンパ球との融合細胞の出現ウェル数および融合効率を測
定した。結果を第１表に示す。また、ＩＣＬＵ−Ｔ（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−６２５５） ５×１0⁶個とヒト末梢血リ
ンパ球５×１0⁶個とを用いたこと以外は、上記と同様の
条件で細胞融合を行った。その結果も第１表に示す。

【００２３】次に、得られた融合細胞株の性質を、下記
のようにして検討した。まず、蛍光標識した抗Ｂ細胞抗
体、抗Ｔ細胞抗体および抗単球抗体を用いて、融合細胞
がいずれの抗体に反応するかを検討した。この判別結果
により、融合細胞が、Ｂ細胞性、Ｔ細胞性および単球性
のいずれであるかを知ることができる。 この抗体によ
る検討の結果、融合細胞がＢ細胞性であった場合は、抗
体（Ｉｇ）産生能を有するか否かについてさらに検討し
た。また、融合細胞がＴ細胞性であった場合は、さらに
どのようなサブクラスに分類されるかについて検討し
た。融合細胞が単球性であった場合は、食細胞作用等を
有するかについても検討した。上記２回の融合操作によ
り得られた融合細胞の細胞種とその比率等の平均値を第
２表に示す

【００２４】

【表１】第 １ 表

【００２５】

【表２】第 ２ 表

【００２６】第１表より、親細胞株としてＩＣＬＵ−Ｔ
を用いた場合、２週間程度の培養で、高い効率のヒト末
梢血リンパ球との融合細胞を得ることができることがわ
かる。また、第２表より、以下のことがわかる。まず、
親細胞株は生体内の各種の免疫担当細胞を株化すること
ができることが明らかである。ＩＣＬＵ−Ｔを細胞融合
の親細胞株として使用した場合、主としてＴ細胞系の融
合細胞を得ており、これらのＴ細胞種の融合細胞は、ヘ
ルパー型を示す。したがって、細胞融合に供した末梢血
リンパ球のうち、Ｔリンパ球の性質を受け継いでいるこ
とが明らかである。

【００２７】実施例２〔親細胞株ＩＣＬＵ−Ｔを用いて
細胞融合を行う場合の融合促進剤の検討〕ＩＣＬＵ−Ｔ
細胞（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２５５）とヒト末梢血リンパ
球とを、細胞数が約１：１（具体的な数値は第３表に示
した）となるように混合した。この混合物を遠心分離
し、培養上清と細胞ペレットとに分離し、培養上清を除
去した。次に、細胞ペレットに基本培地であるＥＲＤＦ
培地（極東製薬工業（株）製）と１％レシチンで調製し
た１％レシチン−４０％ＰＥＧ（平均分子量：４００
０）を１ｍｌ添加した。さらに、ＥＲＤＦ培地９ｍｌを
添加して全量を１０ｍｌとした。これを再び遠心分離し
て得られた細胞のペレットを、ＥＲＤＦ培地８５％、Ｆ
ＢＳ１５％になるように調製された１５％ＦＢＳ−ＥＲ
ＤＦ培地５０ｍｌで懸濁した。懸濁液は、９６穴培養プ
レートの各穴に１００μｌずつ添加した。この融合操作
の４日後に、１３３μＭヒポキサンチン、0.２６μＭア
メソプテリン含有１５％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地を９６穴
培養プレートの各穴に１００μｌずつ添加した。次い
で、４、５日おきに、６７μＭヒポキサンチン、0.１３
μＭアメソプテリン含有１５％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地と
半量ずつ培地交換した。培養開始から２週間程度経過後
に、形成されたＩＣＬＵ−Ｔとヒト末梢血リンパ球との
融合細胞の出現ウェル数および融合効率を測定した。結
果を第３表に示す。一方、対照として、レシチンを添加
しないＥＲＤＦ培地で希釈して調製した４０％ＰＥＧ
（平均分子量：４０００）を用いた他は上記と同様に細
胞融合を行った。その結果も第３表に併せて示す。

【００２８】

【表３】第 ３ 表 ^* 親細胞１0⁵個当たり

【００２９】第３表より、融合促進剤としてＰＥＧのみ
を用いても、融合細胞が全く得られないか、あるいは得
られる場合でもその効率は非常に低いことがわかる。一
方、レシチンとＰＥＧの両方を用いた場合は、融合細胞
を効率よく得ることができることが明らかである。この
結果から、ＩＣＬＵ−Ｔを親細胞として細胞融合を行う
際は、融合促進剤としてＰＥＧの他にレシチンも添加す
る必要があることがわかる。

【００３０】

【発明の効果】ＩＣＬＵ−Ｔを親細胞株として用いて作
成された本発明のヒト免疫担当融合細胞株は、生体内に
おいて当該免疫担当細胞が元来有していた免疫機能、そ
の他の性質を生体外においてそのまま発現するものであ
る。また、請求項２記載の本発明方法のように、ポリエ
チレングリコールとレシチンの存在下において、ＩＣＬ
Ｕ−Ｔとヒト免疫担当細胞から融合細胞を作成すると、
生体内における免疫機能をそのまま保持した融合細胞を
効率よく株化することができる。本発明の融合細胞株
は、生体内での細胞間相互作用を、生体外で研究するた
めに好適に利用することができる。本件は、（旧）独立
行政法人農業技術研究機構と（旧）生物系特定産業技術
研究推進機構との共同出願でありましたが、平成１５年
１０月１日付けで両者が統合され、特許出願人欄に記載
の名称となりました。なお、（旧）生物系特定産業技術
研究推進機構の名称変更届は関係書類が整い次第提出い
たします。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 長田 和浩 静岡県島田市8704−１ 葵ハイツ101号 (72)発明者 川原 浩治 静岡県島田市横井２−12−61 サンライ ズ横井301号 (56)参考文献 特開 昭61−234778（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−271986（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−271984（ＪＰ，Ａ) Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒ ｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ（1988），Ｖｏｌ. 152，Ｎｏ．３，ｐ．1401−1409 日本農芸化学会誌（1997），Ｖｏｌ. 71，臨時創刊号，ｐ．274 ４ｌａ２ Ｋｉｔａｓａｔｏ Ａｒｃｈ． ｏｆ Ｅｘｐ． Ｍｅｄ（1988），Ｖｏｌ. 61，Ｎｏ．４，ｐ．225−235 日本臨床免疫学会会誌（1988），Ｖｏ ｌ．11，Ｎｏ．４，ｐ．346−356 Ｊ． Ｆａｃ． Ａｇｒ． Ｋｙｕｓ ｙｕ Ｕｎｉｖ．（1995），Ｖｏｌ. 40，Ｎｏ．１−２，ｐ．223−231 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 5/00 ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＳＴＰｌｕｓ（ＳＴＮ)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトＴ細胞性白血病細胞株ＰＥＥＲか
   ら、８−アザグアニン耐性クローンを選択し、さらに無
   血清培養可能にした変異株であるＩＣＬＵ−Ｔを親細胞
   株とするヒト免疫担当融合細胞株。
2. 【請求項２】 ヒト細胞融合用親細胞株ＩＣＬＵ−Ｔと
   ヒト免疫担当細胞を用いて融合細胞を作成する際に、ポ
   リエチレングリコールとレシチンの存在下に行うことを
   特徴とするヒト免疫担当融合細胞株の取得方法。