JP3662012B2 - 融合細胞株 - Google Patents

Description

本発明は、融合細胞株に関する。詳しくは、ヒト細胞株を用いた免疫系の諸現象、すなわちアレルギー、ガンなどのメカニズム解明、それらの疾病の予防、診断、治療等を目的とした食品機能の検索、新規医薬品の探索、製造に使用するためのヒト免疫担当細胞株の取得に関するものである。

一般に、ヒトの体内から分離した細胞を体外で培養するには、困難を伴うことが多い。例えば、ヒトの体内から分離したリンパ球などの細胞を体外で無限増殖させることは困難である。通常、これら細胞を培養液中で培養しても、２週間から数ヶ月程度で死滅してしまう。ガン細胞や上皮細胞のある種のものは、培地組成によっては体外での継代培養が可能であるが、研究等に用いるために必要十分な量を確保することは難しい。
さらに、体内細胞を体外において増殖させるには、細胞に何らかの刺激を与える必要がある。そのために、培養液に種々の生理活性物質を添加しなければならないが、その適切な物質の選択等に問題があり、かなりの労力を要する。

近年では、このような問題点を解消する方法として、目的とする細胞に発ガン物質等の薬剤を添加したり、紫外線や放射線を照射する等の処理を行い、目的の細胞に突然変異を生じさせる（トランスフォーム）方法が提案されている。
このような処理を行うことにより、無限増殖が可能な細胞株（変異株）を取得することができる。
また、遺伝子導入法（細胞に特定の遺伝子を導入する方法）を用いて、株化したい細胞に、不死化遺伝子を導入して形質転換を生じさせ、無限増殖する細胞を取得する方法も報告されている。

さらに、このようにトランスフォームを利用した方法のほかに、リンパ球などのように体内で抗体や免疫調節因子（リンフォカイン）を産生する細胞を、無限増殖する細胞と融合して、体外でもその抗体や免疫調節因子を産生する融合細胞（ハイブリドーマ）として樹立する方法も知られている（例えば、非特許文献１）。

J．Fac．Agr．Kyusyu Univ．(1995), Vol．40, No．1-2，ｐ．223-231

しかしながら、これらの従来の方法では、次のような問題点があった。
まず、薬剤を添加する方法や紫外線等の照射を利用する方法においては、獲得した変異形質およびその他の細胞機能が安定した細胞株として樹立するために、数カ月から数年もの長期間を要し、樹立した細胞株が利用できるようになるまでにかなりの期間が必要であった。また、処理に供した細胞数あたりの取得される変異株数（変異効率）が低く、目的細胞を容易に株化することが困難であった。

また、細胞融合によって株化する方法は、モノクローナル抗体やリンフォカイン等の細胞由来物質の安定生産系としては有用である。しかしながら、この方法で得られる融合細胞株は、生体内で生じる種々の免疫反応に対しては、その細胞応答が低下もしくは消失していると言われている。
したがって、これらの方法を用いても、生体内での細胞の相互作用を生体外でも再現可能な樹立細胞系として用いるためには多くの困難が伴った。

本発明者らは、株化細胞の取得法について検討を重ね、細胞融合法による株化がその他の方法に比較して、細胞をトランスフォームさせる効率が比較的高い点に着目した。ただし、細胞融合して得られる株細胞の性質は、融合に供した生体由来の免疫担当細胞ばかりでなく、他方のパートナーであるヒト親細胞株に大きく依存していることが知られている。

そこで、種々のヒト由来の免疫担当細胞を細胞機能を保持したまま効率よく株化するために、本発明者らは親細胞株について研究し、変異株であるヒト好酸球白血病細胞株ＩＣＬＵ−Ｅを樹立した。
このヒト親細胞株を用いて、生体内の各種ヒト免疫担当細胞と細胞融合することにより得られる融合細胞は、該細胞が生体内で有していたと考えられる細胞機能を保持する性質を残していることが分かった。

なお、本発明で用いるヒト細胞融合用親細胞株ＩＣＬＵ−Ｅは、必ずしも免疫担当細胞とのみ融合可能なわけではなく、その他の組織由来の細胞とも融合可能である。

請求項１記載の本発明は、ヒト好酸球白血病細胞株ＥｏＬｌから、６−チオグアニン耐性クローンを選択し、さらに無血清培養可能にした変異株であるＩＣＬＵ−Ｅを親細胞株とするヒト免疫担当融合細胞株である。

ＩＣＬＵ−Ｅを親細胞株として用いて作成された本発明のヒト免疫担当融合細胞株は、生体内において当該免疫担当細胞が元来有していた免疫機能、その他の性質を生体外においてそのまま発現するものである。
本発明の融合細胞株は、生体内での細胞間相互作用を、生体外で研究するために好適に利用することができる。

以下、本発明を詳細に説明する。
融合細胞の性質は、前記したように、融合に供した生体由来の免疫細胞だけでなく、親細胞株にも大きく依存している。そこで、本発明者らは、種々のヒト由来の免疫担当細胞を細胞機能を保持したまま効率よく株化するために用いることができるヒト細胞融合用親細胞株を樹立した。すなわち、ヒト免疫細胞由来細胞から、次のようにして親細胞株を取得した。
既に樹立されているヒト細胞株であるヒト好酸球白血病細胞株（ＥｏＬ−１）を、６−チオグアニン（終濃度３０μg/ml）と１０％牛胎児血清（以下、ＦＢＳと記載する。）を含むＥＲＤＦ培地（極東製薬工業（株）製）で培養した。なお、１０％の濃度でＦＢＳを添加したＥＲＤＦ培地を、以下１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地と記載する。

３週間程度培養した後、増殖してきたクローンを分取し、クローニングを行った。クローニングは、９６穴培養プレートの１穴につき１個の細胞が入るように、１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地を用いて細胞懸濁液を稀釈して巻き込む限界稀釈法に従った。９６穴培養プレートに細胞をまきこんで２４〜３０時間後に、プレートの各穴を検鏡し、細胞が２個になっている穴に印をいれた。さらに、２４〜３０時間後（すなわち、まきこんでから４８〜６０時間後）に、印がついている穴を検鏡し、細胞が４個になっている穴に印をいれた。まきこんでから２０日後に、２つの印がついている穴を検鏡し、細胞が増殖していることを確認して細胞数を血球計算板で計測した。最も細胞数が多かった穴の細胞を、さらに上記と同様の方法で再クローニングした。

親細胞株が樹立された後、細胞融合で得られる融合細胞が無血清培養可能となるように、クローニングで得られたクローンをインスリン（終濃度１０μg/ml）、トランスフェリン（終濃度２０μg/ml）、エタノールアミン（終濃度２０μＭ）、亜セレン酸ナトリウム（終濃度２５ｎＭ）を含むＥＲＤＦ培地（極東製薬工業（株）製）で、９６穴培養プレートに、１穴につき１個の細胞が入るように稀釈して２週間程度培養した。
増殖してきた各穴の細胞数を計測し、最も細胞数が多かった順に各穴の細胞の一部をアミノプテリン（終濃度０．４ｍＭ）を含む１５％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地で培養した。培養後３日目〜５日目に検鏡し、細胞が死滅したクローンの３、４株を親細胞株の候補として樹立した。

得られた親細胞株の候補となるクローンを用いて実際に細胞融合した。その結果、使用した各クローンの細胞数を１０⁵ 細胞としたときの取得した融合細胞数（融合効率）を指標として、この値が最も高いクローンを樹立親細胞株とした。
このようにして樹立した親細胞株、すなわちＥｏＬ−１由来の親細胞株をヒト好酸球白血病細胞株（ＩＣＬＵ−Ｅ）と命名した。
このようにして樹立された親細胞株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されており、その受託番号は、ＩＣＬＵ−ＥがＦＥＲＭ ＢＰ−６２５４である。
この親細胞株を、ヒト末梢血リンパ球のようなヒト免疫担当細胞と融合操作を行うことにより、請求項１記載の融合細胞株を得ることができる。

親細胞株とヒト免疫担当細胞との融合操作は、例えば以下のようにして行うことができる。
まず、上記の親細胞株とヒト免疫担当細胞とを混合する。ここで、親細胞株と融合させる他方のヒト免疫担当細胞としては、ヒトリンパ球などのヒトの生体内で免疫機能を有する細胞であればいずれも使用できる。
親細胞株に対するヒト免疫担当細胞の使用割合は、親細胞株としてＩＣＬＵ−Ｅを使用する場合は１〜１．５倍程度とするのが好ましい。

また、ヒト免疫担当細胞の代わりに、その他のヒト組織由来の細胞、例えばヒトガン細胞などを用いて融合させることも可能である。ガン細胞を用いる場合、該細胞の由来する組織の種類は特に限定されず、例えば胃ガン細胞や乳ガン細胞など、いずれも同じように使用することができる。この場合、親細胞株に対するこれら細胞の使用割合は、上記と同様でよい。

親細胞株とヒト免疫担当細胞等の混合物を遠心分離することにより、培養上清と細胞ペレットとに分離し、このうちの培養上清を除去する。残った細胞ペレットに、融合促進剤であるＰＥＧを基本合成培地で希釈したもの（通常は、４０〜５０％に希釈）を添加する。
ここで用いる培地としては、例えば基本合成培地としてＥＲＤＦ培地、ＲＰＭ１１６４０培地、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）などが使用可能である。これらの培地と共に、成長因子として牛胎児血清（ＦＢＳ）を併用したり、インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウムなどの無血清培養用成長因子を併用することもできる。
また、融合促進剤であるＰＥＧとしては、平均分子量が4,０００〜6,０００程度のものを使用できるが、融合効率の点から平均分子量4,０００程度のものが好ましい。

培地で希釈された融合促進剤を添加した細胞ペレットを遠心分離した後、該細胞ペレットの中から融合細胞を選択する。
ＩＣＬＵ−Ｅを親細胞株として用いた場合の融合細胞の選択は、一般に良く知られているヒポキサンチン、アミノプテリン（代わりにアメソプテリンでもよい。以下、同じ）、チミジンを含む培地で構成された選択培地（例えば、１５％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地）で行うことができる。
融合開始から２４〜３０時間後に、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む選択培地を添加する。この場合に限り、選択培地中のこれら物質の濃度を２倍とする。その後は、数日おきに、当初の選択培地と同濃度の培地を半量ずつ交換する。
このようにして２週間程度培養することにより、融合細胞を取得することができる。

親細胞から融合操作を経て得られる融合細胞は、生体内において当該免疫担当細胞が発現していた特定の免疫反応（細胞機能）を、生体外でもそのまま保持することができる。

次に、本発明を詳細に説明するために代表的な実施例を挙げるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１〔ＩＣＬＵ−Ｅを用いたヒトリンパ球の株化〕
ＩＣＬＵ−Ｅ（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２５４） １×１0⁷個とヒト末梢血リンパ球１×１0⁷個とを混合した。この混合物を遠心分離し、培養上清と細胞ペレットとに分離した後、培養上清を除去した。
残った細胞ペレットに、ＥＲＤＦ培地で希釈した４０％ＰＥＧ（平均分子量：４０００）を１ｍｌ添加した。さらに、ＥＲＤＦ培地（極東製薬工業（株）製）９ｍｌを添加して全量を１０ｍｌとした。
これを再び遠心分離し、得られた細胞のペレットを、ＥＲＤＦ培地８５％、ＦＢＳ１５％となるように調製した１５％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地５０μｌで懸濁した。懸濁液は、９６穴培養プレートの各穴に１００μｌずつ添加した。

融合操作の翌日に、４００μＭヒポキサンチン、0.８μＭアメソプテリン、３２μＭチミジン含有１５％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地を、９６穴培養プレートの各穴に１００μｌずつ添加した。２、３日おきに、２００μＭヒポキサンチン、0.４μＭアメソプテリン、１６μＭチミジン含有１５％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地と半量ずつ培地交換した。
培養開始から２週間程度経過後に、形成されたＩＣＬＵ−Ｅとヒト末梢血リンパ球との融合細胞の出現ウェル数および融合効率を測定し、その結果を第１表に示した。
また、ＩＣＬＵ−Ｅ（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２５４）の数を７×１0⁶個、ヒト末梢血リンパ球７×１0⁶個としたこと以外は同様に融合操作を行った。結果を第１表に示す。

次に、得られた融合細胞株の性質を、下記のようにして検討した。
まず、蛍光標識した抗Ｂ細胞抗体、抗Ｔ細胞抗体および抗単球抗体を用いて、融合細胞がいずれの抗体に反応するかを検討した。この判別結果により、融合細胞が、Ｂ細胞性、Ｔ細胞性および単球性のいずれであるかを知ることができる。
この抗体による検討の結果、融合細胞がＢ細胞性であった場合は、抗体（Ｉｇ）産生能を有するか否かについてさらに検討した。
また、融合細胞がＴ細胞性であった場合は、さらにどのようなサブクラスに分類されるかについて検討した。融合細胞が単球性であった場合は、食細胞作用等を有するかについても検討した。
上記２回の融合操作により得られた融合細胞の細胞種とその比率等の平均値を第２表に示す

第１表より、親細胞株を用いた場合、２週間程度の培養で、高い効率のヒト末梢血リンパ球との融合細胞を得ることができることがわかる。
また、第２表より、以下のことがわかる。
まず、親細胞株が生体内の各種の免疫担当細胞を株化することができることが明らかである。
ＩＣＬＵ−Ｅを細胞融合の親細胞株として使用した場合、得られる融合細胞は、主としてＴ細胞種の性質を示す。しかしながら、多くの単球系融合細胞が得られている。
この単球系の融合細胞株は、食細胞作用があることから、単球系の細胞の特徴をそのまま有していることが確認された。

本発明のヒト免疫担当融合細胞株は、生体内において当該免疫担当細胞が本来有していた免疫機能、その他の性質を生体外において、そのまま発現することができるので、生体内での細胞間相互作用を生体外で研究するために利用できる。

Claims (1)

1. ヒト好酸球白血病細胞株ＥｏＬ１から、６−チオグアニン耐性クローンを選択し、さらに無血清培養可能にした変異株であるＩＣＬＵ−Ｅを親細胞株とするヒト免疫担当融合細胞株。