JPH02242670A - 単球／マクロフアージ特性を有する哺乳動物連続細胞系およびインビトロにおけるそれらの樹立 - Google Patents
単球／マクロフアージ特性を有する哺乳動物連続細胞系およびインビトロにおけるそれらの樹立Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0645—Macrophages, e.g. Kuepfer cells in the liver; Monocytes
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は単球／マクロファージ特性を有する連続細胞系
および正常な哺乳動物源からインビトロでそれらを樹立
する方法に関する。
および正常な哺乳動物源からインビトロでそれらを樹立
する方法に関する。
単球およびマクロファージは造血幹細胞に由来する。か
かる幹細胞はまた赤血球、顆粒球、血小板およびリンパ
球のような他の細胞の前駆物質でもある。−旦幹細胞が
単球／マクロファージバスウェイにかけられると、それ
らはプロ単球に分化する。プロ単球は高い細胞分裂を示
しかつ組織培養７ナスコに少ししかまたは全く付着しな
い、小さく丸い細胞である。プロ半球は単球に成熟し、
このものはわずかながら大きく、細胞分裂の度合いがよ
り低くそしてより付着性が高い。最後にこの半球が成熟
してマクロファージとなり、これは細胞分裂を全く示さ
ずかつ強い付着性を示す大きな細胞である。
かる幹細胞はまた赤血球、顆粒球、血小板およびリンパ
球のような他の細胞の前駆物質でもある。−旦幹細胞が
単球／マクロファージバスウェイにかけられると、それ
らはプロ単球に分化する。プロ単球は高い細胞分裂を示
しかつ組織培養７ナスコに少ししかまたは全く付着しな
い、小さく丸い細胞である。プロ半球は単球に成熟し、
このものはわずかながら大きく、細胞分裂の度合いがよ
り低くそしてより付着性が高い。最後にこの半球が成熟
してマクロファージとなり、これは細胞分裂を全く示さ
ずかつ強い付着性を示す大きな細胞である。
単球／マクロファージ特性を有する連続細胞系は多数の
重要な用途を有する。これら細胞系は正常な単球／マク
ロファージ増殖、成熟および機能の特性化、サイトカイ
ンの大規模生産およびこれらサイトカインを特定する組
み換えＤＮＡクローン産生のためのｍＲＮＡの大規模生
産、ウィルスおよび寄生虫病原体の増殖、および場合に
よりかかるウィルスおよび寄生虫病原体用ワクチンの生
産およびかかるウィルスおよび寄生虫病原体用薬剤の評
価に使用できる。
重要な用途を有する。これら細胞系は正常な単球／マク
ロファージ増殖、成熟および機能の特性化、サイトカイ
ンの大規模生産およびこれらサイトカインを特定する組
み換えＤＮＡクローン産生のためのｍＲＮＡの大規模生
産、ウィルスおよび寄生虫病原体の増殖、および場合に
よりかかるウィルスおよび寄生虫病原体用ワクチンの生
産およびかかるウィルスおよび寄生虫病原体用薬剤の評
価に使用できる。
単球／マクロファージ特性を有する連続細胞系の使用は
かかる系を樹立するのが困難なゆえに限定されてきた。
かかる系を樹立するのが困難なゆえに限定されてきた。
連続細胞系はマウスおよびヒト源から単離されているが
、しかし使用に供することができる細胞系特にヒト源か
らの細胞系の数は少ない。
、しかし使用に供することができる細胞系特にヒト源か
らの細胞系の数は少ない。
少数の例外は別として、単球／マクロファージ特性を有
するヒトａ胞系は白血病患者からのみ樹立されてきた。
するヒトａ胞系は白血病患者からのみ樹立されてきた。
従って、かかる細胞系の細胞は悪性でありそして正常な
ヒト細胞機能の研究にとって正常なヒト細胞から樹立さ
れた細胞系の細胞よりも有用性が劣る。さらに、悪性細
胞から樹立された細胞系はサイトカインおよびワクチン
の生産にとっては正常な細胞から樹立された細胞系に比
較して望ましくない、なぜなら悪性ｍ胞は最終生成物か
ら分離するのが困難な望ましくない副生物を分泌する可
能性があるからである。２種類の最も普通に用いられる
ヒト細胞系はＵ −９３７［Ｓｕｎｄｓｔｒｏｍ他、Ｉ
ｎｉ Ｊ。
ヒト細胞機能の研究にとって正常なヒト細胞から樹立さ
れた細胞系の細胞よりも有用性が劣る。さらに、悪性細
胞から樹立された細胞系はサイトカインおよびワクチン
の生産にとっては正常な細胞から樹立された細胞系に比
較して望ましくない、なぜなら悪性ｍ胞は最終生成物か
ら分離するのが困難な望ましくない副生物を分泌する可
能性があるからである。２種類の最も普通に用いられる
ヒト細胞系はＵ −９３７［Ｓｕｎｄｓｔｒｏｍ他、Ｉ
ｎｉ Ｊ。
Ｃａｎｃｅｒ、 １７ ： ５６５−５７７（１９７
６）］ およびＴＨＰ−１［Ｔｓｈｕｃｈｉｙａ他、Ｉ
ｎｔ、 Ｊ、 Ｃａｎｃｅｒ、 ２６： １７
１− １７６（１９８０）］である。両細胞系は白血病
細胞をインビトロ増殖に適合させることにより樹立され
た。
６）］ およびＴＨＰ−１［Ｔｓｈｕｃｈｉｙａ他、Ｉ
ｎｔ、 Ｊ、 Ｃａｎｃｅｒ、 ２６： １７
１− １７６（１９８０）］である。両細胞系は白血病
細胞をインビトロ増殖に適合させることにより樹立され
た。
単球／マクロファージ生成物の生産に場合により用いら
れるもう一つのヒト細胞系はＨＬ−６０である［Ｃｏ１
１ｉｎｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、 ２７０ ： ３４７
３４９（１９７７）］ この細胞系は、用いられた刺
激剤の種類に応じ刺激されて顆粒球または単球／マクロ
ファージの性質の幾分かを発現しうるゆえあまり分化し
てない前駆細胞から樹立されたと思われる。ＨＬ−６０
もまＩ；白血病細胞から樹立された。
れるもう一つのヒト細胞系はＨＬ−６０である［Ｃｏ１
１ｉｎｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、 ２７０ ： ３４７
３４９（１９７７）］ この細胞系は、用いられた刺
激剤の種類に応じ刺激されて顆粒球または単球／マクロ
ファージの性質の幾分かを発現しうるゆえあまり分化し
てない前駆細胞から樹立されたと思われる。ＨＬ−６０
もまＩ；白血病細胞から樹立された。
マウス系においては、単球／マクロファージ特性を有す
るおよそ１５種の連続細胞系が入手できる。これらの細
胞系は自然発生的に生成した腫瘍を有するかまたは、た
いていの場合マウスをがんウィルスまたは化学的発がん
物質で処理することにより誘発された腫瘍を有するマウ
スから衝立された。
るおよそ１５種の連続細胞系が入手できる。これらの細
胞系は自然発生的に生成した腫瘍を有するかまたは、た
いていの場合マウスをがんウィルスまたは化学的発がん
物質で処理することにより誘発された腫瘍を有するマウ
スから衝立された。
複製欠損がんウィルス（ＳＶ４０）ＤＮＡを末梢血液単
球にトランス７エクシ３ンさせることによる正常マウス
からの単球／マクロファージ特性を有する連続細胞系の
樹立は記載されている［Ｓｃｈｖａｒｚｂａｕｍ他、Ｊ
、 ｔｍｍｕｎｏｌ、、 １３２ ： １１５８−
１１６２（１９８４）］。同様の方法もヒト細胞系の樹
立に用いられている［Ｎａｇａｔａ他、Ｎａｔｕｒｅ、
３０６ ：５９７−５９９（１９８３）］。この方
法で生成するヒト細胞系は増殖因子依存性であり、イン
ビトロ増殖に外因性コロニー刺激因子（Ｃ５Ｆ）の添加
を必要とする。外因性増殖因子をなんら必要としない連
続細胞系はがんウィルスからのかん遺伝子を半球に導入
することにより樹立されている［Ｐｉｅｒｃｅ他、１９
８６． Ｃｌ１ｎｉｃａｌ Ｈａｅ＋ｃａＬｏｌｏｇ
ｙ（Ｅｎｇｌａｎｄ）１５ ： ５７３−５９６］ 。
球にトランス７エクシ３ンさせることによる正常マウス
からの単球／マクロファージ特性を有する連続細胞系の
樹立は記載されている［Ｓｃｈｖａｒｚｂａｕｍ他、Ｊ
、 ｔｍｍｕｎｏｌ、、 １３２ ： １１５８−
１１６２（１９８４）］。同様の方法もヒト細胞系の樹
立に用いられている［Ｎａｇａｔａ他、Ｎａｔｕｒｅ、
３０６ ：５９７−５９９（１９８３）］。この方
法で生成するヒト細胞系は増殖因子依存性であり、イン
ビトロ増殖に外因性コロニー刺激因子（Ｃ５Ｆ）の添加
を必要とする。外因性増殖因子をなんら必要としない連
続細胞系はがんウィルスからのかん遺伝子を半球に導入
することにより樹立されている［Ｐｉｅｒｃｅ他、１９
８６． Ｃｌ１ｎｉｃａｌ Ｈａｅ＋ｃａＬｏｌｏｇ
ｙ（Ｅｎｇｌａｎｄ）１５ ： ５７３−５９６］ 。
がん遺伝子およびウィルスＤＮＡを含有する細胞系は正
常細胞の特性ではなく、従って正常な細胞機能の研究に
とっては正常な細胞から樹立された細胞系に比べ望まし
くない。加えてこれら細胞系はがん遺伝子またはウィル
ス粒子により有害な副生物が分泌される可能性があるゆ
え、ワクチンまたはサイトカインの生産にとっては正常
な細胞から樹立された細胞系よりも有用性が低い。
常細胞の特性ではなく、従って正常な細胞機能の研究に
とっては正常な細胞から樹立された細胞系に比べ望まし
くない。加えてこれら細胞系はがん遺伝子またはウィル
ス粒子により有害な副生物が分泌される可能性があるゆ
え、ワクチンまたはサイトカインの生産にとっては正常
な細胞から樹立された細胞系よりも有用性が低い。
単球／マクロファージ特性を有する連続細胞系は幾つか
の正常な哺乳動物源から樹立されている。 Ｗａｒｄｌ
ｅｙ他［１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、 ３９ ： ６７
７３（１９８０）１はヤギ、ブタ、モルモット、ヒツジ
、ウサギ、イヌおよびネコを含めた種々の種類の末梢血
液単球からの単球／マクロファージ連続細胞系の樹立に
ついて記載している。この細胞系を樹立するには非常に
しばしば、およそ毎日、培地全部の交換が必要であった
。ヒト、ウマおよびウシから細胞系を樹立する試みはう
まくゆかなかった。
の正常な哺乳動物源から樹立されている。 Ｗａｒｄｌ
ｅｙ他［１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、 ３９ ： ６７
７３（１９８０）１はヤギ、ブタ、モルモット、ヒツジ
、ウサギ、イヌおよびネコを含めた種々の種類の末梢血
液単球からの単球／マクロファージ連続細胞系の樹立に
ついて記載している。この細胞系を樹立するには非常に
しばしば、およそ毎日、培地全部の交換が必要であった
。ヒト、ウマおよびウシから細胞系を樹立する試みはう
まくゆかなかった。
Ｓａ １ａｈｕｄｄ ｉｎ他［Ｊ、 Ｅｘｐ、 Ｍｅｄ
、、 １５５：１８４２−１８５７（１９８２）］は
浮遊液中における復製性ヒト単球／マクロファージおよ
び付着性非複製性マクロファージからなる長期間（約５
か月）細胞系の樹立について記載している。これら細胞
系はすべてエプスタイン−バールウィルス（ＥＢＶ）−
血清陰性個体の末梢血液から樹立された。結局、大部分
の細胞系は非複製性成熟マクロファージとして終わって
いる。しかしながら、培地中で数年間増殖した２種の細
胞系は１個体の末梢血液単核細胞から樹立された［５ａ
ｌａｈｕｄｄｉｎ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、
５ （５） ： ４３２−４４３（１９８７）］ 、か
かる細胞系の製法は補添された不連続性パーコールグラ
ジェントでの細胞分離、ヒドロコルチゾンおよびビタミ
ンＤ３を含有する培地での増殖、毎週の全培地交換、穏
やかな連続的撹拌、およびＥＢＶ−血清陰性個体からの
末梢血液を必要とした。５ａｌａｈｕｄｄｉｎ等により
記載された方法は成功および失敗に関する何等明らかな
説明、またはＦＢＩ／−血清陰性であること以外の出発
細胞に関する選択基準に関する説明なく試行された約２
８例の２種の場合においてのみなされたと思われる。か
かる細胞系を産生させるための信頼しうる製法がない事
態においては、５ａｌａｈｕｄｄｉｎ等による研究を再
現したい人々にとって偶然によるこの２細胞系の創造は
可能なことではない。
、、 １５５：１８４２−１８５７（１９８２）］は
浮遊液中における復製性ヒト単球／マクロファージおよ
び付着性非複製性マクロファージからなる長期間（約５
か月）細胞系の樹立について記載している。これら細胞
系はすべてエプスタイン−バールウィルス（ＥＢＶ）−
血清陰性個体の末梢血液から樹立された。結局、大部分
の細胞系は非複製性成熟マクロファージとして終わって
いる。しかしながら、培地中で数年間増殖した２種の細
胞系は１個体の末梢血液単核細胞から樹立された［５ａ
ｌａｈｕｄｄｉｎ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、
５ （５） ： ４３２−４４３（１９８７）］ 、か
かる細胞系の製法は補添された不連続性パーコールグラ
ジェントでの細胞分離、ヒドロコルチゾンおよびビタミ
ンＤ３を含有する培地での増殖、毎週の全培地交換、穏
やかな連続的撹拌、およびＥＢＶ−血清陰性個体からの
末梢血液を必要とした。５ａｌａｈｕｄｄｉｎ等により
記載された方法は成功および失敗に関する何等明らかな
説明、またはＦＢＩ／−血清陰性であること以外の出発
細胞に関する選択基準に関する説明なく試行された約２
８例の２種の場合においてのみなされたと思われる。か
かる細胞系を産生させるための信頼しうる製法がない事
態においては、５ａｌａｈｕｄｄｉｎ等による研究を再
現したい人々にとって偶然によるこの２細胞系の創造は
可能なことではない。
多種類の正常細胞源および哺乳動物種から単球／マクロ
ファージ特性を有する連続細胞系をインビトロで樹立す
る方法が必要とされている。
ファージ特性を有する連続細胞系をインビトロで樹立す
る方法が必要とされている。
単球／マクロファージ特性を有する哺乳動物連続細胞系
をインビトロにおいて樹立するための本発明方法は下記
工程すなわち、 ａ）正常な出発細胞の浮遊液を調製し、ｂ）該出発細胞
の浮遊液を培地中で培養する、但しこの出発細胞がヒト
細胞である場合は培地にインシュリン、トランスフェリ
ンおよび亜セレン酸塩を含有する血清代替物を補添する
ものとし、 Ｃ）該出発細胞の浮遊液を付着細胞が生成するに十分な
時間インキュベージコンし、 ｄ）培地を取り変えることにより非付着細胞を除去し、 ｅ）付着細胞をそれが増殖表面上で集密的またはほとん
ど集密的となるまで周期的に培地を部分交換しながら培
地中で培養し、そしてｆ）前記集密的またはほとんど集
密的な細胞を十分な時間培養して、速やかに分裂しかつ
希釈後に培地中で集密となるまで増殖できる均一な形態
を有する細胞を生成させる 工程を包含するものである。
をインビトロにおいて樹立するための本発明方法は下記
工程すなわち、 ａ）正常な出発細胞の浮遊液を調製し、ｂ）該出発細胞
の浮遊液を培地中で培養する、但しこの出発細胞がヒト
細胞である場合は培地にインシュリン、トランスフェリ
ンおよび亜セレン酸塩を含有する血清代替物を補添する
ものとし、 Ｃ）該出発細胞の浮遊液を付着細胞が生成するに十分な
時間インキュベージコンし、 ｄ）培地を取り変えることにより非付着細胞を除去し、 ｅ）付着細胞をそれが増殖表面上で集密的またはほとん
ど集密的となるまで周期的に培地を部分交換しながら培
地中で培養し、そしてｆ）前記集密的またはほとんど集
密的な細胞を十分な時間培養して、速やかに分裂しかつ
希釈後に培地中で集密となるまで増殖できる均一な形態
を有する細胞を生成させる 工程を包含するものである。
本発明はまＩ；実質的に悪性細胞および悪性細胞の生産
物を含有しない、単球／マクロファージ特性を有するヒ
ト連続細胞系をも包含する。
物を含有しない、単球／マクロファージ特性を有するヒ
ト連続細胞系をも包含する。
本発明はさらに、正常な哺乳動物細胞から樹立された単
球／マクロファージ特性を有するヒトまたはマウス連続
細胞系をも包含する。本発明は細胞系それ自体に限定さ
れるものではなく、かかる細胞系のすべてのクローン、
突然２７４体、修飾体または遺伝子物質をも包含するも
のである。
球／マクロファージ特性を有するヒトまたはマウス連続
細胞系をも包含する。本発明は細胞系それ自体に限定さ
れるものではなく、かかる細胞系のすべてのクローン、
突然２７４体、修飾体または遺伝子物質をも包含するも
のである。
本発明は正常な哺乳動物細胞から単球／マクロファージ
特性を有する哺乳動物連続細胞系をインビトロで樹立す
る方法に関する。本発明の細胞系を包含する細胞は単球
／マクロファージの前駆体であると考えられている。こ
れらの細胞は表面マーカーを有しそして単球／マクロフ
ァージに特徴的なサイトカインを産生するが、単球／マ
クロファージ前駆体に特徴的な細胞形態および細胞増殖
パターンを有する。正常な哺乳動物細胞から樹立された
のであるから、本発明の細胞系を包含するヒト細胞は非
悪性であると考えられており、そしてそれゆえその細胞
系は悪性細胞および悪性細胞の生産物を含有しないと考
えられており、一方マウス細胞系の幾つかは悪性細胞を
含有すると思われる。連続細胞系とは、かかる細胞系を
包含する細胞が均一な形態をしており、迅速に分裂し、
そして希釈後に培地中で集密となるまで増殖できること
を意味する。
特性を有する哺乳動物連続細胞系をインビトロで樹立す
る方法に関する。本発明の細胞系を包含する細胞は単球
／マクロファージの前駆体であると考えられている。こ
れらの細胞は表面マーカーを有しそして単球／マクロフ
ァージに特徴的なサイトカインを産生するが、単球／マ
クロファージ前駆体に特徴的な細胞形態および細胞増殖
パターンを有する。正常な哺乳動物細胞から樹立された
のであるから、本発明の細胞系を包含するヒト細胞は非
悪性であると考えられており、そしてそれゆえその細胞
系は悪性細胞および悪性細胞の生産物を含有しないと考
えられており、一方マウス細胞系の幾つかは悪性細胞を
含有すると思われる。連続細胞系とは、かかる細胞系を
包含する細胞が均一な形態をしており、迅速に分裂し、
そして希釈後に培地中で集密となるまで増殖できること
を意味する。
本発明はここに記載される方法により樹立された細胞系
に限定されないのみならず、かかる細胞系のすべてのク
ローン、突然変異体、修飾体および遺伝子物質をも包含
するものである。
に限定されないのみならず、かかる細胞系のすべてのク
ローン、突然変異体、修飾体および遺伝子物質をも包含
するものである。
修飾とはその細胞系を包含する細胞に外米遺伝子物質を
導入することを意味する。
導入することを意味する。
かかる細胞系の樹立に用いられうる出発細胞には哺乳動
物の正常な牌臓、リンパ節および胸腺細胞が包含される
。正常とは、悪性でない細胞を意味する。さらに、遠心
分離したヒト血漿検体の軟膜からの細胞のような、末梢
血液から得られた単核細胞も使用できる。骨髄を含む単
球／マクロファージ系統の細胞を含有する任意の組織ま
たは体液が本発明の出発細胞源として使用されうａこと
が予想される。
物の正常な牌臓、リンパ節および胸腺細胞が包含される
。正常とは、悪性でない細胞を意味する。さらに、遠心
分離したヒト血漿検体の軟膜からの細胞のような、末梢
血液から得られた単核細胞も使用できる。骨髄を含む単
球／マクロファージ系統の細胞を含有する任意の組織ま
たは体液が本発明の出発細胞源として使用されうａこと
が予想される。
必要な場合は出発細胞を処理して単個細胞浮遊液を調製
することができる。例えば、牌臓細胞をホモジナイズし
て篩に通すことができる。
することができる。例えば、牌臓細胞をホモジナイズし
て篩に通すことができる。
末梢血液細胞は単一細胞として存在し処理する必要はな
い。
い。
ヒト牌臓を細胞源として用いる場合は、幾つかの異なる
調製法が用いられうる。新鮮な牌臓組織はｌＯ％ウシ胎
児血清（ＦＣＳ）を含有するイスコープ培地で１日間貯
蔵でき次にホモジナイズすることができる。生成する細
胞は直接Ｔ−２５またはＴ−７５組織培養フラスコに塗
布できる。
調製法が用いられうる。新鮮な牌臓組織はｌＯ％ウシ胎
児血清（ＦＣＳ）を含有するイスコープ培地で１日間貯
蔵でき次にホモジナイズすることができる。生成する細
胞は直接Ｔ−２５またはＴ−７５組織培養フラスコに塗
布できる。
あるいはまた、牌臓をホモジナイズし、得られる牌臓細
胞をフィコールーハイペク（ＦｉｃｏｌｌＨｙｐａｑｕ
ｅ）グラジェントでの遠心分離により分別しそして液体
窒素中で凍結させることもできる。これら凍結された細
胞は解凍しそして連続細胞系樹立のための出発細胞とし
て使用できる。
胞をフィコールーハイペク（ＦｉｃｏｌｌＨｙｐａｑｕ
ｅ）グラジェントでの遠心分離により分別しそして液体
窒素中で凍結させることもできる。これら凍結された細
胞は解凍しそして連続細胞系樹立のための出発細胞とし
て使用できる。
単個細胞浮遊液は組織培養フラスコに入れ、そして標準
的な組織培養用培地例えばグルタミンおよび２−メルカ
プトエタノールを含有するイスコープ培地に１０％（ｖ
／ｖ）ＦＣＳを補添したものの中で培養することができ
る。他の組織培養基も満足できると予想される。
的な組織培養用培地例えばグルタミンおよび２−メルカ
プトエタノールを含有するイスコープ培地に１０％（ｖ
／ｖ）ＦＣＳを補添したものの中で培養することができ
る。他の組織培養基も満足できると予想される。
ＦＣ５以外の動物血清も本発明において使用できるが、
ＦＣＳが好ましい。ＦＣＳの異なる製造者ａットは異な
る増殖因子を含有する可能性があるので、それゆえＦＣ
Ｓの全ロットが使用できるわけではない、検査されそし
てミエローマおよびハイプリドーマ細胞の増殖に有効で
あることが判明したＦＣＳロットも本発明における細胞
増殖に有効である。
ＦＣＳが好ましい。ＦＣＳの異なる製造者ａットは異な
る増殖因子を含有する可能性があるので、それゆえＦＣ
Ｓの全ロットが使用できるわけではない、検査されそし
てミエローマおよびハイプリドーマ細胞の増殖に有効で
あることが判明したＦＣＳロットも本発明における細胞
増殖に有効である。
本発明に用いられる培地は培地にリポポリサッカライド
（ｔ、ｐｓ）が混入するのを阻止するためにパイロジエ
ン不含水を用いて調製されるのが好ましい。ＬＰＳは細
胞分化を刺激して成熟した非分裂性マクロファージを生
成することができる。リポポリサッカライドを含有しな
い水および培地を本発明の実施において使用するのが好
ましい。
（ｔ、ｐｓ）が混入するのを阻止するためにパイロジエ
ン不含水を用いて調製されるのが好ましい。ＬＰＳは細
胞分化を刺激して成熟した非分裂性マクロファージを生
成することができる。リポポリサッカライドを含有しな
い水および培地を本発明の実施において使用するのが好
ましい。
ヒト細胞から細胞系を樹立するのに用いられる培地はイ
ンシュリン、トランスフェリン、亜セレン酸塩例えば亜
セレン酸ナトリウム、および場合により他の増殖因子例
えば１％ Ｎｕｔｒｉ−ｄｏｍａ −ＳＰ （Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含有する血清代替
物を補添された標準的な組織培養基である。かかる血清
代替物の添加はヒト連続細胞系の樹立にとって重要であ
る。かかる細胞系はインシュリン、トランスフェリンお
よび亜セレン酸塩を含有する血清代替物の非存在下では
樹立できなかった。
ンシュリン、トランスフェリン、亜セレン酸塩例えば亜
セレン酸ナトリウム、および場合により他の増殖因子例
えば１％ Ｎｕｔｒｉ−ｄｏｍａ −ＳＰ （Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含有する血清代替
物を補添された標準的な組織培養基である。かかる血清
代替物の添加はヒト連続細胞系の樹立にとって重要であ
る。かかる細胞系はインシュリン、トランスフェリンお
よび亜セレン酸塩を含有する血清代替物の非存在下では
樹立できなかった。
培養を開始するに必要な出発細胞濃度は出発細胞源の如
何による。例えば、肺臓細胞が出発細胞として用いられ
る場合は、Ｔ−７５組織培養フラスコ中の細胞２゜ＯＸ
１０’−７，５Ｘ １０＠個／培地２０ｍ ｌの濃度
が用いられうる。末梢血液細胞を用いる場合は、Ｔ−２
５組織培養フラスコ中の細胞層１．ｏｘ１０’ｌ’ｌ／
培地１０ｍ１またはＴ−７５組織培養フラスコ中の細胞
２．Ｏｘ ｌＯ’ｌｉ／培地２０ｍ１なるより高い濃度
が必要である。
何による。例えば、肺臓細胞が出発細胞として用いられ
る場合は、Ｔ−７５組織培養フラスコ中の細胞２゜ＯＸ
１０’−７，５Ｘ １０＠個／培地２０ｍ ｌの濃度
が用いられうる。末梢血液細胞を用いる場合は、Ｔ−２
５組織培養フラスコ中の細胞層１．ｏｘ１０’ｌ’ｌ／
培地１０ｍ１またはＴ−７５組織培養フラスコ中の細胞
２．Ｏｘ ｌＯ’ｌｉ／培地２０ｍ１なるより高い濃度
が必要である。
本発明を実施するための工程は完全なかつ明白な用語で
記載できるが、各工程で起こる出来事は詳述困難である
。異なる種類の出発細胞は異なる増殖パターンを示し、
記載された工程間に重複がありうるしそして操作中に起
きる事象がそれぞれの出発細胞に関し重複する可能性が
ある。
記載できるが、各工程で起こる出来事は詳述困難である
。異なる種類の出発細胞は異なる増殖パターンを示し、
記載された工程間に重複がありうるしそして操作中に起
きる事象がそれぞれの出発細胞に関し重複する可能性が
ある。
出発細胞浮遊液を培養用に塗布した後、細胞を付着細胞
が生成されるに十分な時間静かに放置する。これには約
２日間を要しうる。付着細胞とは増殖表面に付着した細
胞を指す。これら付着細胞を培養すると単球／マクロフ
ァージ特性を有する連続細胞系を得ることができる。
が生成されるに十分な時間静かに放置する。これには約
２日間を要しうる。付着細胞とは増殖表面に付着した細
胞を指す。これら付着細胞を培養すると単球／マクロフ
ァージ特性を有する連続細胞系を得ることができる。
この期間に続き、組織培養フラスコを穏やかに揺り動か
して全ての非付着細胞を再懸濁させそして培地を例えば
吸引により除去してＴ−２５フラスコ中の新鮮な培地約
１０ｍ１およびＴ−７５フラスコ中の新鮮な培地２０〜
２５ｍ１と置換する。非付着細胞とは増殖表面に付着し
ていないが上溝中に浮遊したままである細胞を指す。こ
れら非付着細胞は増殖して上清中で死に、栄養分を消耗
させ、新たな細胞の増殖を阻止しうる有毒物質を産生し
うるのでその除去は重要である。
して全ての非付着細胞を再懸濁させそして培地を例えば
吸引により除去してＴ−２５フラスコ中の新鮮な培地約
１０ｍ１およびＴ−７５フラスコ中の新鮮な培地２０〜
２５ｍ１と置換する。非付着細胞とは増殖表面に付着し
ていないが上溝中に浮遊したままである細胞を指す。こ
れら非付着細胞は増殖して上清中で死に、栄養分を消耗
させ、新たな細胞の増殖を阻止しうる有毒物質を産生し
うるのでその除去は重要である。
次に、周期的好ましくは毎週の培地交換が行われ、培地
の約半分が取り出されて同量の新たな培地と置換される
。末梢血液細胞は比較的高い細胞濃度を必要とするので
、取り出された培地は遠心分離して、消費された培地か
ら細胞を分離する。これら細胞は新たな培地と一緒に組
織培養フラスコに再導入されうる。部分的な培地置換が
本発明の決定的に重要な工程であると考えられる。部分
的な培地置換により、細胞により分泌された増殖因子が
組織培養フラスコ中に累積できると考えられる。これら
増殖因子が細胞の増殖を刺激する。周期的、部分的な培
地交換はその細胞が増殖表面上で集密的またはほとんど
集密的となるまで必要である。細胞は増殖表面上に実質
的に連続した細胞単層が観察されうる場合に集密的また
はほとんど集密的といえる。−旦細胞が集密的またはほ
とんど集密的となれば、周期的で部分的な培地交換はも
はや必要ない、なぜなら細胞はたとえ全ての培地が取り
去られても迅速に増殖因子を再補充できるに十分に濃度
が高いからである。
の約半分が取り出されて同量の新たな培地と置換される
。末梢血液細胞は比較的高い細胞濃度を必要とするので
、取り出された培地は遠心分離して、消費された培地か
ら細胞を分離する。これら細胞は新たな培地と一緒に組
織培養フラスコに再導入されうる。部分的な培地置換が
本発明の決定的に重要な工程であると考えられる。部分
的な培地置換により、細胞により分泌された増殖因子が
組織培養フラスコ中に累積できると考えられる。これら
増殖因子が細胞の増殖を刺激する。周期的、部分的な培
地交換はその細胞が増殖表面上で集密的またはほとんど
集密的となるまで必要である。細胞は増殖表面上に実質
的に連続した細胞単層が観察されうる場合に集密的また
はほとんど集密的といえる。−旦細胞が集密的またはほ
とんど集密的となれば、周期的で部分的な培地交換はも
はや必要ない、なぜなら細胞はたとえ全ての培地が取り
去られても迅速に増殖因子を再補充できるに十分に濃度
が高いからである。
一旦細胞が集密的まｔ；はほとんど集密的となれば、培
地の全交換を必要としうる他の状況が出て来る。例えば
、培養を開始するのに比較的高い細胞濃度を用いた場合
は種々の種類の付着細胞が迅速に増殖しうる。細胞のか
かる増殖オーバーは栄養分を枯渇させそして新しい細胞
の増殖および付着に必要なスペースを失わせうる。
地の全交換を必要としうる他の状況が出て来る。例えば
、培養を開始するのに比較的高い細胞濃度を用いた場合
は種々の種類の付着細胞が迅速に増殖しうる。細胞のか
かる増殖オーバーは栄養分を枯渇させそして新しい細胞
の増殖および付着に必要なスペースを失わせうる。
幾つかの付着細胞は薄めて細胞かきおとし器を用いて穏
やかにかきおとすことにより除去できる。かきおとし後
、細胞層はすべての培地を新鮮な培地と置換することに
より除去せねばならない６残存する細胞は周期的に部分
的または全培地交換を行いながら培養を継続できる。
やかにかきおとすことにより除去できる。かきおとし後
、細胞層はすべての培地を新鮮な培地と置換することに
より除去せねばならない６残存する細胞は周期的に部分
的または全培地交換を行いながら培養を継続できる。
通常、個々の細胞培養物の種類に応じ細胞の塗布から１
〜５か月で均一な形態を有する迅速に分裂する細胞が上
溝中に観察できる。中程度に分裂する細胞は連続細胞系
の樹立に先立ちしばしば観察できるが、かかる細胞は寸
法および形態が多様であろう。
〜５か月で均一な形態を有する迅速に分裂する細胞が上
溝中に観察できる。中程度に分裂する細胞は連続細胞系
の樹立に先立ちしばしば観察できるが、かかる細胞は寸
法および形態が多様であろう。
連続細胞系は、迅速に分裂しかつ希釈後に培地中で集密
となるまで増殖しうる均一な形態を有する細胞が生成さ
れた場合に樹立される。迅速に分裂する細胞は世代時間
２４〜４８時間を有する。連続細胞系の細胞は低細胞濃
度、例えば細胞ｉ、ｏｘ ｔｏ３個／ｍｌまで希釈でき
、そしてかかる希釈後に培地中で集密となるまで増殖し
うる。
となるまで増殖しうる均一な形態を有する細胞が生成さ
れた場合に樹立される。迅速に分裂する細胞は世代時間
２４〜４８時間を有する。連続細胞系の細胞は低細胞濃
度、例えば細胞ｉ、ｏｘ ｔｏ３個／ｍｌまで希釈でき
、そしてかかる希釈後に培地中で集密となるまで増殖し
うる。
本発明方法により樹立された連続細胞系はホモジニアス
な細胞系ではない。しかしながら、−旦連続細胞系が樹
立されると、細胞をクローン化してホモジニアスなりロ
ーン化細胞系を生成させることができる。幾つかの場合
には、ある種の細胞は単個細胞が産生しうる量より多い
増殖因子を必要とし、そしてそれゆえかかる細胞はクロ
ーン化できない。しかしながら、かかる細胞は非クロー
ン化細胞系として維持でき、次にインビトロで長期間増
殖後にクローン化できる。
な細胞系ではない。しかしながら、−旦連続細胞系が樹
立されると、細胞をクローン化してホモジニアスなりロ
ーン化細胞系を生成させることができる。幾つかの場合
には、ある種の細胞は単個細胞が産生しうる量より多い
増殖因子を必要とし、そしてそれゆえかかる細胞はクロ
ーン化できない。しかしながら、かかる細胞は非クロー
ン化細胞系として維持でき、次にインビトロで長期間増
殖後にクローン化できる。
本発明のクローン化および非クローン化細胞系のいずれ
も外因性増殖因子を添加することなく培地中で連続的に
増殖しそして無血清培地中での増殖に速やかに適応する
。これら細胞系はそれらが単球／マクロファージ系統で
あることを示す表面抗原を発現する。例えば、マウス細
胞系はＭａｃ −１、Ｍａｃ −２およびＭａｃ−３の
ような表面抗原を発現し、ヒト細胞系はＭｏｌおよびＭ
ｌのような表面抗原を発現する。これら細胞系はまた、
単球／マクロファージにより分泌される特徴的なサイト
カインであるＩＬ−１およびハイブリドーマ増殖因子（
ＨＧＦ）のような種々のサイトカインをも合成し分泌す
る。サイトカインは他の種類の細胞を調節するタンパク
分子である。本発明の細胞系を無血清増殖に用いてＨＧ
Ｆを産生させることおよびＢ細胞ハイブリドーマにより
モノクローナル抗体をインビトロ産生させることはＥ、
１．ｄｕ ＰｏｎＬ ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ社の米国特
許用Ｗｉ第１１４０５４号（１９８７年１０月２６日出
＠）に記載されている。
も外因性増殖因子を添加することなく培地中で連続的に
増殖しそして無血清培地中での増殖に速やかに適応する
。これら細胞系はそれらが単球／マクロファージ系統で
あることを示す表面抗原を発現する。例えば、マウス細
胞系はＭａｃ −１、Ｍａｃ −２およびＭａｃ−３の
ような表面抗原を発現し、ヒト細胞系はＭｏｌおよびＭ
ｌのような表面抗原を発現する。これら細胞系はまた、
単球／マクロファージにより分泌される特徴的なサイト
カインであるＩＬ−１およびハイブリドーマ増殖因子（
ＨＧＦ）のような種々のサイトカインをも合成し分泌す
る。サイトカインは他の種類の細胞を調節するタンパク
分子である。本発明の細胞系を無血清増殖に用いてＨＧ
Ｆを産生させることおよびＢ細胞ハイブリドーマにより
モノクローナル抗体をインビトロ産生させることはＥ、
１．ｄｕ ＰｏｎＬ ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ社の米国特
許用Ｗｉ第１１４０５４号（１９８７年１０月２６日出
＠）に記載されている。
単球／マクロファージ特性を有する本発明の細胞系はＩ
Ｌ−１、ＨＧＦ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、およびイン
ターフェロンを含む種々のサイトカインを産生しうる。
Ｌ−１、ＨＧＦ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、およびイン
ターフェロンを含む種々のサイトカインを産生しうる。
下記実施例に示される通り、ＩＬ−１およびＨＧＦは本
発明の少なくとも幾種類かの細胞系により産生される。
発明の少なくとも幾種類かの細胞系により産生される。
本発明の幾種類かの細胞系はそれら自身でＩＬ−１およ
びＨＧＦを産生しうるが、他の細胞系はそれらが［Ｌ−
１８よびＨＧＦを産生しうるに先立ち、リポポリサッカ
ライドのような刺激剤での刺激を必要とする可能性があ
る。本発明の細胞系は何等外因性増殖因子を必要とせず
無血清合成培地中で増殖しうるので、分泌されたｌ−１
８よびＨＧＦの精製を単純化できる。従って、本発明の
細胞系は精製容易な特定の分泌産物ならびにこれら産物
をコードするｍＲＮＡを大量に提供しうるホモジニアス
源である。
びＨＧＦを産生しうるが、他の細胞系はそれらが［Ｌ−
１８よびＨＧＦを産生しうるに先立ち、リポポリサッカ
ライドのような刺激剤での刺激を必要とする可能性があ
る。本発明の細胞系は何等外因性増殖因子を必要とせず
無血清合成培地中で増殖しうるので、分泌されたｌ−１
８よびＨＧＦの精製を単純化できる。従って、本発明の
細胞系は精製容易な特定の分泌産物ならびにこれら産物
をコードするｍＲＮＡを大量に提供しうるホモジニアス
源である。
多数の異なるウィルスおよび寄生虫が一般に単球／マク
ロファージ中および単球／マクロファージ特性を有する
本発明の細胞系中で複製できる。かかるウィルスの一つ
はヒト免疫不全ウィルスｌ （ＨＩＶ−１）である。こ
のウィルスは１９２３球および単球／マクロファージの
両方中で複製する。表面抗［ＣＤ４はこのウィルスが結
合するレセプターの少なくとも一部分である。
ロファージ中および単球／マクロファージ特性を有する
本発明の細胞系中で複製できる。かかるウィルスの一つ
はヒト免疫不全ウィルスｌ （ＨＩＶ−１）である。こ
のウィルスは１９２３球および単球／マクロファージの
両方中で複製する。表面抗［ＣＤ４はこのウィルスが結
合するレセプターの少なくとも一部分である。
下記実施例に示される通り、本発明の細胞系の大部分は
表面ＣＤ４発現陽性である。
表面ＣＤ４発現陽性である。
ＨＩＶ−１は細胞をウィルスで感染させそしてそのウィ
ルスを細胞内で複製させることにより産生されうる。こ
の感染は、細胞をＯＥＭ３Ｂのような既知ＨＩＶ−１産
生性細胞系から得られた上清と感染を起こすに十分な時
間である約７２時間インキュベージコンすることにより
達成できる。
ルスを細胞内で複製させることにより産生されうる。こ
の感染は、細胞をＯＥＭ３Ｂのような既知ＨＩＶ−１産
生性細胞系から得られた上清と感染を起こすに十分な時
間である約７２時間インキュベージコンすることにより
達成できる。
この感染した細胞はそのウィルスを細胞内で複製させる
に十分な時間である約１週間インキュベージ１ンさせる
ことができる。細胞を例えば界面活性剤を用いて溶菌さ
せてウィルスを放出させ、これは溶菌した細胞から容易
に単離できる。現代では、ＨＩＶ−１の生産には１０７
２球細胞系のウィルスによる感染が用いられる。しかし
ながら、ＨＩＶ−１の単離物の幾つか、特に神経系から
のそれはＴりンバ球におけるよりも単球／マクロファー
ジ中における方がかなり良好に複製するや従って、本発
明の細胞系はＴリンパ球におけるよりも単球／マクロフ
ァージ中における方がより良好に複製するウィルスの生
産に有用でありうる。
に十分な時間である約１週間インキュベージ１ンさせる
ことができる。細胞を例えば界面活性剤を用いて溶菌さ
せてウィルスを放出させ、これは溶菌した細胞から容易
に単離できる。現代では、ＨＩＶ−１の生産には１０７
２球細胞系のウィルスによる感染が用いられる。しかし
ながら、ＨＩＶ−１の単離物の幾つか、特に神経系から
のそれはＴりンバ球におけるよりも単球／マクロファー
ジ中における方がかなり良好に複製するや従って、本発
明の細胞系はＴリンパ球におけるよりも単球／マクロフ
ァージ中における方がより良好に複製するウィルスの生
産に有用でありうる。
ウィルスおよびウィルス性溶解物は診断目的および治療
目的例えば死滅ウィルスワクチンに使用できる。本発明
の細胞系はかかるワクチンの生産に使用できる。加えて
、本発明の細胞系は単！１２／マクロファージ中におけ
るウィルス発現調節の研究およびかかるウィルスに対す
る治療剤のインビトロ評価に使用できる。この両方の用
途共、ＨＩＶが単球／マクロファージ中において潜伏性
感染を起こしそれが活性化されると疾病を起こしうると
いう推測があるので重要である。本発明の細胞系はまた
、単球／マクロファージ内で何がウィルスを活性化させ
るかの判定、単球／マクロファージ内で潜伏状態のウィ
ルスを薬剤が不活性化する能力の評価、および薬剤がウ
ィルスを活性化できないことの確認の評価を研究するの
にも使用できる。
目的例えば死滅ウィルスワクチンに使用できる。本発明
の細胞系はかかるワクチンの生産に使用できる。加えて
、本発明の細胞系は単！１２／マクロファージ中におけ
るウィルス発現調節の研究およびかかるウィルスに対す
る治療剤のインビトロ評価に使用できる。この両方の用
途共、ＨＩＶが単球／マクロファージ中において潜伏性
感染を起こしそれが活性化されると疾病を起こしうると
いう推測があるので重要である。本発明の細胞系はまた
、単球／マクロファージ内で何がウィルスを活性化させ
るかの判定、単球／マクロファージ内で潜伏状態のウィ
ルスを薬剤が不活性化する能力の評価、および薬剤がウ
ィルスを活性化できないことの確認の評価を研究するの
にも使用できる。
単球／マクロファージ中で複製しそしてヒト以外の哺乳
動物種に病原性を有する多数のウィルスおよび寄生虫が
ある。単球／マクロファージ特性を有する細胞系がこれ
らの種から単離でさそしてかかるウィルスおよび寄生虫
の生産に使用でき、それが次に診断および治療目的に用
いられうろことは予想される。
動物種に病原性を有する多数のウィルスおよび寄生虫が
ある。単球／マクロファージ特性を有する細胞系がこれ
らの種から単離でさそしてかかるウィルスおよび寄生虫
の生産に使用でき、それが次に診断および治療目的に用
いられうろことは予想される。
大部分の個体から単球／マクロファージ特性を有する細
胞系を樹立できることにより、ヒト免疫系における細胞
性協同作用の遺伝的基礎を研究する機会が得られる。単
球／マクロファージがＴおよび８９２３球に抗原を提示
するのに遺伝的組織適合性が必要とされる。大部分の個
体からＴおよび８９７３球連続細胞系を調製できるが、
大部分の個体から単球／マクロファージ特性を有する細
胞系を調製することは今までできなかった。本発明の細
胞系を用いる研究により、究極的にはヒト免疫系におけ
る治療を促進させる機会を高めることができよう。
胞系を樹立できることにより、ヒト免疫系における細胞
性協同作用の遺伝的基礎を研究する機会が得られる。単
球／マクロファージがＴおよび８９２３球に抗原を提示
するのに遺伝的組織適合性が必要とされる。大部分の個
体からＴおよび８９７３球連続細胞系を調製できるが、
大部分の個体から単球／マクロファージ特性を有する細
胞系を調製することは今までできなかった。本発明の細
胞系を用いる研究により、究極的にはヒト免疫系におけ
る治療を促進させる機会を高めることができよう。
以下に本発明の実施例を示す。
実施例
単球／マクロファージ特性を有する連続細胞系の樹立と
利用 Ａ 、 Ｃ３Ｈ／ ＨｅＪマウスからの連続細胞系の樹
立−匹の雌Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスを殺し、その肺臓と一
方の肺を取り出した。その肺臓を＃１５０メツシュスク
リーンを通過させ、ヒボキサンチン（１３−６＋ｕ／
ｍＱ） 、チミジン（７，６ｍｇ／ｓ＋Ｑ） 、Ｌ −
グルタミン（２ｍＭ）およびウシ胎児血清１０％（ｖ／
ｖ）を補添したｌ５ｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ
Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｅｄｉｕｍ ３０＋ｑ１２
中に入れた。この肺臓細胞を含有する培地１０ｍ１２を
次に、３個のＴ−２５培養フラスコ中で各々培養した。
利用 Ａ 、 Ｃ３Ｈ／ ＨｅＪマウスからの連続細胞系の樹
立−匹の雌Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスを殺し、その肺臓と一
方の肺を取り出した。その肺臓を＃１５０メツシュスク
リーンを通過させ、ヒボキサンチン（１３−６＋ｕ／
ｍＱ） 、チミジン（７，６ｍｇ／ｓ＋Ｑ） 、Ｌ −
グルタミン（２ｍＭ）およびウシ胎児血清１０％（ｖ／
ｖ）を補添したｌ５ｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ
Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｅｄｉｕｍ ３０＋ｑ１２
中に入れた。この肺臓細胞を含有する培地１０ｍ１２を
次に、３個のＴ−２５培養フラスコ中で各々培養した。
肺は＃１５０メツシュスクリーンに通し、上記の補添培
地１．０ｍ（ｌに入れＴ−２５７ラスコ中で培養した。
地１．０ｍ（ｌに入れＴ−２５７ラスコ中で培養した。
２日間インキュベートした後、フラスコを軽く揺り動か
して非付着細胞を混ぜ合せた。各々の７ラスフから、ア
スピレータにより培地を除去し、そして新鮮な培地５＋
ｍＱと交換した。細胞を１週間培養した後、各フラスコ
に新鮮な培地５１１ａを追加し、各フラスコ内の全量を
ＬＯｍＱにした。培養１７日後、各フラスコから培地５
ｍ＋２を除去し、新鮮培地５ｍｆｆ１と交換した。２３
日目、フラスコ表面上にほぼ集密な細胞が観察された。
して非付着細胞を混ぜ合せた。各々の７ラスフから、ア
スピレータにより培地を除去し、そして新鮮な培地５＋
ｍＱと交換した。細胞を１週間培養した後、各フラスコ
に新鮮な培地５１１ａを追加し、各フラスコ内の全量を
ＬＯｍＱにした。培養１７日後、各フラスコから培地５
ｍ＋２を除去し、新鮮培地５ｍｆｆ１と交換した。２３
日目、フラスコ表面上にほぼ集密な細胞が観察された。
各７ラスコから培地１０ｍＱを除去し、新鮮培地１０ｍ
Ｑを加えた。２８日目に、フラスコの内面の一部をブス
チック製細胞スクレーパーで掻き取ることによりフラス
コ中の細胞を薄めｔ；。掻き取った細胞を含む培地１０
！ｌαを各フラスコから取り出し、１０ｍ１２の新鮮培
地を加えた。肺臓および肺臓の出発細胞を含む７ラスコ
中では単一形態の迅速に分裂する細胞が観察された。約
１カ月の後（細胞培養から２＃月目）、これらの細胞を
９６−ウェルプレート中限界稀釈法によりクローン化し
た。得られた細胞系をそれぞれ、ＳＰＬ ＨｅＪ、Ａお
よびＬ ＨａＪ、Ｂと称する。
Ｑを加えた。２８日目に、フラスコの内面の一部をブス
チック製細胞スクレーパーで掻き取ることによりフラス
コ中の細胞を薄めｔ；。掻き取った細胞を含む培地１０
！ｌαを各フラスコから取り出し、１０ｍ１２の新鮮培
地を加えた。肺臓および肺臓の出発細胞を含む７ラスコ
中では単一形態の迅速に分裂する細胞が観察された。約
１カ月の後（細胞培養から２＃月目）、これらの細胞を
９６−ウェルプレート中限界稀釈法によりクローン化し
た。得られた細胞系をそれぞれ、ＳＰＬ ＨｅＪ、Ａお
よびＬ ＨａＪ、Ｂと称する。
Ｂ、ヒト牌蔵ＰＭＣからの連続細胞系の樹立死体腎臓提
供者からのヒト牌蔵約１ ｃｍＸｌ ｃｍ切片約１５片
を死後直ちに得た。その組織切片を実施例Ａに記述した
培地中に入れ氷上で一夜貯蔵した。次の日その切片を＃
５０ワイヤメツシュスクリーンに通し、次いで＃１５０
ワイヤメツシュスクリーンに通した。この細胞を、約４
０ずつの培地を含有する５０ｍＱ滅菌遠心管２個中に入
れた。この管を約４００ＸＧで１０分間遠心分離した。
供者からのヒト牌蔵約１ ｃｍＸｌ ｃｍ切片約１５片
を死後直ちに得た。その組織切片を実施例Ａに記述した
培地中に入れ氷上で一夜貯蔵した。次の日その切片を＃
５０ワイヤメツシュスクリーンに通し、次いで＃１５０
ワイヤメツシュスクリーンに通した。この細胞を、約４
０ずつの培地を含有する５０ｍＱ滅菌遠心管２個中に入
れた。この管を約４００ＸＧで１０分間遠心分離した。
１つの管からの細胞ベレットをウシ胎児血清９ｍＱおよ
びジメチルスルホキシド１ＩＩＩＱ中に再懸濁した。こ
の再懸濁細胞を分割して１ ｍＱ凍凍結用バイアル１木 体窒素中で貯蔵した。
びジメチルスルホキシド１ＩＩＩＱ中に再懸濁した。こ
の再懸濁細胞を分割して１ ｍＱ凍凍結用バイアル１木 体窒素中で貯蔵した。
第２の管からの細胞ペレットをＬ−グルタミン（２ｍＭ
）、２−メルカプトエタノール（５．０ＸｌＯ−ｍＭ）
、ウシ胎児血ＮＩＯ％（ｖ／ｖ） 、およびＮｕｔｒｉ
ｄｏｍａ ＳＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈａ
ｉｍ） １％を含有するＩ ５ｃｏｖｅ培地を用いて
２０ｍＱ量となすことにより細胞浮遊液を調製した。細
胞の濃度は１．５Ｘ １０’個／ｒａＱであった。Ｔ−
７５フラスコにｌから９の番号を付け、各々１０ＩＩＩ
Ｑの培地を加えた。１番フラスコに細胞浮遊液１０＊（
２を加え全体容量を２０＋ｌｌｆｆ１とした。残りの細
胞浮遊液の１＝２稀釈物は、細胞浮遊液Ｉｏｎαを２番
フラスコ中の培地１０ｍＱに加え、混合し、この混合物
から１ｏｔｎ（ｌを取り出し、そしてこのｌＱｏ＋１２
を３番７ラスコに加えることにより調製した。同様にｌ
： ２１４釈物を９番フラスコまで調製した。
）、２−メルカプトエタノール（５．０ＸｌＯ−ｍＭ）
、ウシ胎児血ＮＩＯ％（ｖ／ｖ） 、およびＮｕｔｒｉ
ｄｏｍａ ＳＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈａ
ｉｍ） １％を含有するＩ ５ｃｏｖｅ培地を用いて
２０ｍＱ量となすことにより細胞浮遊液を調製した。細
胞の濃度は１．５Ｘ １０’個／ｒａＱであった。Ｔ−
７５フラスコにｌから９の番号を付け、各々１０ＩＩＩ
Ｑの培地を加えた。１番フラスコに細胞浮遊液１０＊（
２を加え全体容量を２０＋ｌｌｆｆ１とした。残りの細
胞浮遊液の１＝２稀釈物は、細胞浮遊液Ｉｏｎαを２番
フラスコ中の培地１０ｍＱに加え、混合し、この混合物
から１ｏｔｎ（ｌを取り出し、そしてこのｌＱｏ＋１２
を３番７ラスコに加えることにより調製した。同様にｌ
： ２１４釈物を９番フラスコまで調製した。
翌日、１番〜５番フラスコを軽く揺らして赤血球及び他
の付着細胞を再懸濁させた。各フラスコ内の非付着性細
胞を含有する培地を完全に除去し、新鮮な培地２０ＴＲ
Ｑで置き換えた．１番から３番フラスコ中には多くの付
着細胞が観察され Ｉこ 。
の付着細胞を再懸濁させた。各フラスコ内の非付着性細
胞を含有する培地を完全に除去し、新鮮な培地２０ＴＲ
Ｑで置き換えた．１番から３番フラスコ中には多くの付
着細胞が観察され Ｉこ 。
毎週、各フラスコから培地の半量を除去し新鮮培地と交
換した。９個のフラスコのうち、１番および７番フラス
コは酵母（ｙｅａｓｔ）汚染していたのでまた８＃およ
び９＃フラスコは生存細胞を観察できなかったので放棄
した．２８日口重２、５および６番フラスコ中で単一形
態の迅速に分裂する細胞が観察されｊ；。４番フラスコ
では細胞培養を始めて約３カ月後まで迅速に分裂する細
胞は何ら見られなかった。ＰＭＣ−２と名付けた２番フ
ラスコからの細胞を限界稀釈法によりクローン化し、そ
してこのクローンをＰＭＣ−２．１， ＰＭＣ−２．２
およびＰＩＪＣ−２．３と名付けた。
換した。９個のフラスコのうち、１番および７番フラス
コは酵母（ｙｅａｓｔ）汚染していたのでまた８＃およ
び９＃フラスコは生存細胞を観察できなかったので放棄
した．２８日口重２、５および６番フラスコ中で単一形
態の迅速に分裂する細胞が観察されｊ；。４番フラスコ
では細胞培養を始めて約３カ月後まで迅速に分裂する細
胞は何ら見られなかった。ＰＭＣ−２と名付けた２番フ
ラスコからの細胞を限界稀釈法によりクローン化し、そ
してこのクローンをＰＭＣ−２．１， ＰＭＣ−２．２
およびＰＩＪＣ−２．３と名付けた。
この連続細胞系ＰＭＣ−２をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐ
ｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ
） 、メリーランド、に１９８８年１０月７日に寄託し
ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ ９８５２を与えられた。
ｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ
） 、メリーランド、に１９８８年１０月７日に寄託し
ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ ９８５２を与えられた。
Ｃ．ヒト末梢血からの連続細胞系の樹立１人のドナーか
ら新鮮型４０ｍＱを採取した。この血液ヲヘパリンナト
リウムを含む１０ｒＲＱのＶａｃｕＬａｉｎｅｒ管（
Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、中に集めた。
ら新鮮型４０ｍＱを採取した。この血液ヲヘパリンナト
リウムを含む１０ｒＲＱのＶａｃｕＬａｉｎｅｒ管（
Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、中に集めた。
この管を５００Ｘ９で２０分間遠心分離した。淡黄褐色
被膜（軟膜）をパスツールピペットで取り出した。この
淡黄褐色被膜細胞をＬ−グルタミン（ ２ ｍＭ）およ
び２−メルカプトエタノール（５Ｘ ｔｏ−’Ｍ ）を
含むが血清もしくは代替血清を含有しないｌ５ｃｏｖａ
’ｓ培地１２ＩＩＩ２に加えた。細胞２ｍＱを種々の種
類の血清、血漿および代替血清を補添した異なる培地を
入れＩ；数個の各フラスコ中に入れて培養した。この補
添物は容量比で、ヒト血清ｌＯ％＋ＮｕＬｒｉｄｏｍａ
−ＳＰ １％；ウシ胎児血清１０％＋Ｎｕｔｒｉｄｏ
ｍａ−ＳＰ １％；ウシ胎児血清５冗＋ヒト血清５％
＋Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ−ＳＰ １％；ヒト血！５％＋
ウシ胎児血清５％；ヒト血漿１０％および合成培地（（
ＳＭ） 、 Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ
Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ ５０％（ ＤＭＥ．
ＨａｚｅｌＬｏｎ − Ｄｕｔｃｈ−ｌａｎｄ）および
１（ａｎｋ’ｓ Ｆ−１２ Ｍｅｄｉｕｍ （Ｆ−１２
，Ｈａｚｅｌ−ｔｏｎ−Ｄｕｔｃｈｌａｎｄ） ５０％
、それに２．４ｍＭ Ｌ−グルタミン、５ｕ９７ｍＱウ
シインシュリン（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌｓ） 、
３０μｇ ／ ｒｎ （ｌヒトトランスフェリン（Ｓ
ｉｇｍａ Ｃｈａｍｉｃａｌｓ） 、および２．６ｎｇ
／ｍＩ２亜セレン酸ナトリウムを補足したものである〕
＋ヒト血清ｌＯ％からなる。各フラスコ内の総量はＩＱ
ｍＱであった。培養２日後、フラスコを軽く揺らして非
付着細胞を再懸濁させた。非付着細胞を含有するすべて
の培地を取り出しそして新鮮培地と交換した。上記実施
例Ｂに述べた様にして、週毎に交換を実施した。ただし
取り出した培地を遠心分離し、この培地から細胞を集め
、それら細胞を新鮮な培養基と伴にフラスコ内に再度導
入した。
被膜（軟膜）をパスツールピペットで取り出した。この
淡黄褐色被膜細胞をＬ−グルタミン（ ２ ｍＭ）およ
び２−メルカプトエタノール（５Ｘ ｔｏ−’Ｍ ）を
含むが血清もしくは代替血清を含有しないｌ５ｃｏｖａ
’ｓ培地１２ＩＩＩ２に加えた。細胞２ｍＱを種々の種
類の血清、血漿および代替血清を補添した異なる培地を
入れＩ；数個の各フラスコ中に入れて培養した。この補
添物は容量比で、ヒト血清ｌＯ％＋ＮｕＬｒｉｄｏｍａ
−ＳＰ １％；ウシ胎児血清１０％＋Ｎｕｔｒｉｄｏ
ｍａ−ＳＰ １％；ウシ胎児血清５冗＋ヒト血清５％
＋Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ−ＳＰ １％；ヒト血！５％＋
ウシ胎児血清５％；ヒト血漿１０％および合成培地（（
ＳＭ） 、 Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ
Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ ５０％（ ＤＭＥ．
ＨａｚｅｌＬｏｎ − Ｄｕｔｃｈ−ｌａｎｄ）および
１（ａｎｋ’ｓ Ｆ−１２ Ｍｅｄｉｕｍ （Ｆ−１２
，Ｈａｚｅｌ−ｔｏｎ−Ｄｕｔｃｈｌａｎｄ） ５０％
、それに２．４ｍＭ Ｌ−グルタミン、５ｕ９７ｍＱウ
シインシュリン（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌｓ） 、
３０μｇ ／ ｒｎ （ｌヒトトランスフェリン（Ｓ
ｉｇｍａ Ｃｈａｍｉｃａｌｓ） 、および２．６ｎｇ
／ｍＩ２亜セレン酸ナトリウムを補足したものである〕
＋ヒト血清ｌＯ％からなる。各フラスコ内の総量はＩＱ
ｍＱであった。培養２日後、フラスコを軽く揺らして非
付着細胞を再懸濁させた。非付着細胞を含有するすべて
の培地を取り出しそして新鮮培地と交換した。上記実施
例Ｂに述べた様にして、週毎に交換を実施した。ただし
取り出した培地を遠心分離し、この培地から細胞を集め
、それら細胞を新鮮な培養基と伴にフラスコ内に再度導
入した。
最初の細胞培養ｉｓ月後、ウシ胎児血清ｌＯ％＋Ｎｕｔ
ｒｉｄｏｎｉａ−ＳＰ １％を補添した培地を入れた
フラスコ内には、単一の形態で、迅速に分裂する多くの
細胞があった。まｔ；ウシ胎児血清５九＋ヒト血清５％
＋Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ−ＳＰ １％：ヒト血漿５％＋
ウシ胎児血清５％；および合成培地を補添した培地を含
有するフラスコ群にはいくつかの細胞が含まれていた。
ｒｉｄｏｎｉａ−ＳＰ １％を補添した培地を入れた
フラスコ内には、単一の形態で、迅速に分裂する多くの
細胞があった。まｔ；ウシ胎児血清５九＋ヒト血清５％
＋Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ−ＳＰ １％：ヒト血漿５％＋
ウシ胎児血清５％；および合成培地を補添した培地を含
有するフラスコ群にはいくつかの細胞が含まれていた。
ヒト血清１０％＋Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ−５Ｐ １％お
よび血漿１０を補添した培地を含有するフラスコ群には
極めて小量の細胞しかなかっｔ；。
よび血漿１０を補添した培地を含有するフラスコ群には
極めて小量の細胞しかなかっｔ；。
ウシ胎児血清ｌＯ％＋ＮｕＬｒｉｄｏｍａ−９Ｐを補足
した培地を含有するフラスコ内の細胞を、最初の細胞培
養から数え大体３＃月間、すなわち細胞が上溝中で集密
となるまで培養した。得られた細胞系をＳＣと名付け、
クローン化はしなかった。
した培地を含有するフラスコ内の細胞を、最初の細胞培
養から数え大体３＃月間、すなわち細胞が上溝中で集密
となるまで培養した。得られた細胞系をＳＣと名付け、
クローン化はしなかった。
この連続細胞系ＳＣを１９８８年１０月７日にＡＴＣＣ
に寄託した。ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ ９８５５゜Ｄ、
流動細胞計測法によるヒト連続細胞系の特性化 本発明の方法により樹立された細胞系の系統の判定を行
なうため、十分に特性化されているネズミモノクローナ
ル抗体を使用し、そしてＥｐｉｃｓＣ流動細胞計測計中
で蛍光を分析することにより、工程ＢおよびＣで樹立し
たいくつかのヒト細胞系の表面表現型を判定した。モノ
クローナル抗体試薬は市販品として得られ（Ｃｏｕｌｔ
ｅｃ社およびＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ） 、
モノクローナル抗体の一群は単球／マクロファージ表面
マーカーＭｏｌ、 Ｍｏ２． Ｍｌ、 Ｍ２． Ｍ３．
Ｍｙ４． Ｍｙ７およびＭｙ９を認識するもの並びに
正常および白血病性のＢおよび１９２８球の表面マーカ
ーを認識するものを含有した。
に寄託した。ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ ９８５５゜Ｄ、
流動細胞計測法によるヒト連続細胞系の特性化 本発明の方法により樹立された細胞系の系統の判定を行
なうため、十分に特性化されているネズミモノクローナ
ル抗体を使用し、そしてＥｐｉｃｓＣ流動細胞計測計中
で蛍光を分析することにより、工程ＢおよびＣで樹立し
たいくつかのヒト細胞系の表面表現型を判定した。モノ
クローナル抗体試薬は市販品として得られ（Ｃｏｕｌｔ
ｅｃ社およびＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ） 、
モノクローナル抗体の一群は単球／マクロファージ表面
マーカーＭｏｌ、 Ｍｏ２． Ｍｌ、 Ｍ２． Ｍ３．
Ｍｙ４． Ｍｙ７およびＭｙ９を認識するもの並びに
正常および白血病性のＢおよび１９２８球の表面マーカ
ーを認識するものを含有した。
クローン化した細胞系としなかった細胞系両方共に試験
を行なった。下記表中においてクローン化した細胞系は
「、」で示し後にクローン番号を付記し、非クローン化
細胞系には「、」がない。細胞系ＰＭＣ−２およびＳＣ
はそれぞれ実施例ＩＢおよびＩＣで樹立したものである
。細胞系９０１９６Ｂ、 ｌ 、 ＩＪＤ、 ｌ 、
ＫＩＪＡ、 ｌ 、 ＰＨ，ｌおよびＥＬ １は凍結肺
臓細胞から樹立した。肺臓を工程Ｂで述べたように断片
に切り、５％（Ｖ／Ｖ）ウシ胎児血清を補添したＲＰＭ
Ｉ １６４０培地と伴に機械式組織破砕機（Ｓｔｏａ
＋ａｃｈｅｒ）中に入れた。得られた細胞浮遊液をＦｉ
ｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅグラジェントで遠心分離し、
そして、その細胞をジメチルスルホキシド１０％および
ウシ胎児血清４０％中１×１０１個／ｌａＱの濃度で凍
結貯蔵した。この凍結細胞を解凍して工程Ｂに示したよ
うなりローン化連続細胞系の樹立に用いた。非クローン
無限増殖性細胞系９０１９６Ｂ 、 ＭＤ、 ＫＭＡ、
ＰＨ，およびＥＬ １は１９８Ｂ、 １０．７にＡＴ
ＣＣに寄託し、それぞれ受託番号ＣＲＬ ９８５３．
ＣＲＬ ９８５０． ＣＲＬ ９８５６． ＣＲＬ ９
８５１゜およびＣＲＬ ９８５４を得た。
を行なった。下記表中においてクローン化した細胞系は
「、」で示し後にクローン番号を付記し、非クローン化
細胞系には「、」がない。細胞系ＰＭＣ−２およびＳＣ
はそれぞれ実施例ＩＢおよびＩＣで樹立したものである
。細胞系９０１９６Ｂ、 ｌ 、 ＩＪＤ、 ｌ 、
ＫＩＪＡ、 ｌ 、 ＰＨ，ｌおよびＥＬ １は凍結肺
臓細胞から樹立した。肺臓を工程Ｂで述べたように断片
に切り、５％（Ｖ／Ｖ）ウシ胎児血清を補添したＲＰＭ
Ｉ １６４０培地と伴に機械式組織破砕機（Ｓｔｏａ
＋ａｃｈｅｒ）中に入れた。得られた細胞浮遊液をＦｉ
ｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅグラジェントで遠心分離し、
そして、その細胞をジメチルスルホキシド１０％および
ウシ胎児血清４０％中１×１０１個／ｌａＱの濃度で凍
結貯蔵した。この凍結細胞を解凍して工程Ｂに示したよ
うなりローン化連続細胞系の樹立に用いた。非クローン
無限増殖性細胞系９０１９６Ｂ 、 ＭＤ、 ＫＭＡ、
ＰＨ，およびＥＬ １は１９８Ｂ、 １０．７にＡＴ
ＣＣに寄託し、それぞれ受託番号ＣＲＬ ９８５３．
ＣＲＬ ９８５０． ＣＲＬ ９８５６． ＣＲＬ ９
８５１゜およびＣＲＬ ９８５４を得た。
Ｔ−２５フラスコ中１ｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅ
ｄ Ｄｕｌｂｅｃ−ｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕ＋ａ （ＩＩ
ＪＤＭ）＋ウシ胎児血清１０％＋Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ−
５Ｐ １％中で工程Ｃで述べた様にして増殖させた個
々の細胞系からの細胞数を数え、そして３ Ｘ １０’
個の細胞をＴＩＬ緩衝液（ウシ胎児血清２％およびアジ
化ナトリウム０．０２％を補足したＨａｎｋの平衡塩Ｗ
！浴溶液で洗浄した。この細胞を１％ヤギ血清中に予め
吸収させて非特定的なバックグラウンド結合を減少させ
、そして４００Ｘ９で遠心分離した。得られた細胞ペレ
ットをＴＩＬ緩衝液１．５＋＋＋１２に加え、その５０
ｕ２ずつを、９６−ウェルマイクロタイタープレートの
ウェルに入れた。この細胞を表面マーカーに特異的な第
１の抗体と２０分間インキュベートした。このプレート
を遠心分離し、細胞をＴτＬ緩衝液で洗浄した。第１の
抗体に特異的なフルオレセインインチオシアネート（Ｆ
ＩＴＣ）標識第２の抗体を７レートに加え、２０分間イ
ンキュベートした後、このプレートを遠心分離しラベル
した細胞をＴｌＬｉ衝液で洗浄した。陰性対照は第２の
抗体のみとインキュベートした。ラベルした細胞をＴｌ
Ｌｉｆｆ１ｉ中バラホルムアルデヒドで固定し、直ちに
分析するか、または分析するまで４°Ｃで貯蔵しＩ；。
ｄ Ｄｕｌｂｅｃ−ｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕ＋ａ （ＩＩ
ＪＤＭ）＋ウシ胎児血清１０％＋Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ−
５Ｐ １％中で工程Ｃで述べた様にして増殖させた個
々の細胞系からの細胞数を数え、そして３ Ｘ １０’
個の細胞をＴＩＬ緩衝液（ウシ胎児血清２％およびアジ
化ナトリウム０．０２％を補足したＨａｎｋの平衡塩Ｗ
！浴溶液で洗浄した。この細胞を１％ヤギ血清中に予め
吸収させて非特定的なバックグラウンド結合を減少させ
、そして４００Ｘ９で遠心分離した。得られた細胞ペレ
ットをＴＩＬ緩衝液１．５＋＋＋１２に加え、その５０
ｕ２ずつを、９６−ウェルマイクロタイタープレートの
ウェルに入れた。この細胞を表面マーカーに特異的な第
１の抗体と２０分間インキュベートした。このプレート
を遠心分離し、細胞をＴτＬ緩衝液で洗浄した。第１の
抗体に特異的なフルオレセインインチオシアネート（Ｆ
ＩＴＣ）標識第２の抗体を７レートに加え、２０分間イ
ンキュベートした後、このプレートを遠心分離しラベル
した細胞をＴｌＬｉ衝液で洗浄した。陰性対照は第２の
抗体のみとインキュベートした。ラベルした細胞をＴｌ
Ｌｉｆｆ１ｉ中バラホルムアルデヒドで固定し、直ちに
分析するか、または分析するまで４°Ｃで貯蔵しＩ；。
ラベルした細胞の分析はＥｐｉｃｓＣ流動細胞計測計（
Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐ、）を使用し、散乱パラメー
ター角を少し前方に設定し生存しているラベルした細胞
を選択的に分析した。アッセイ中の細胞サンプル中に存
在するラベルした生存していない細胞はＦＩＴＣでラベ
ルした第２の抗体の非特異的結合のために、広い光散乱
を示す。このような光散乱により検定した結果の解釈が
妨げられる。このような妨害をなくするために光散乱を
少ししか示さない生存している細胞のみを分析した。ラ
ベルした細胞を７０−室に流入させながら、アルゴンレ
ーザーから焦点を合わせた４８８ｎｍ線を使用して蛍光
励起を起こさせた。各サンプルについて大体２ 、００
０〜５，０００のラベル化細胞をルーチンで分析した。
Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐ、）を使用し、散乱パラメー
ター角を少し前方に設定し生存しているラベルした細胞
を選択的に分析した。アッセイ中の細胞サンプル中に存
在するラベルした生存していない細胞はＦＩＴＣでラベ
ルした第２の抗体の非特異的結合のために、広い光散乱
を示す。このような光散乱により検定した結果の解釈が
妨げられる。このような妨害をなくするために光散乱を
少ししか示さない生存している細胞のみを分析した。ラ
ベルした細胞を７０−室に流入させながら、アルゴンレ
ーザーから焦点を合わせた４８８ｎｍ線を使用して蛍光
励起を起こさせた。各サンプルについて大体２ 、００
０〜５，０００のラベル化細胞をルーチンで分析した。
陰性対照の値を差し引いた後、各表面マーカー多こつい
ての陽性細胞パーセンテージを計算した。全細胞につい
て、第２の抗体試薬でのバックグラウンド染色は全細胞
の１５％またはそれ以下であった。その結果を第１表に
まとめた。陽性細胞のパーセンテージが少くとも２０％
のものを表面マーカー発現が陽性であるとみなした。単
球／マクロファージ細胞系Ｕ−９３７も対照として掲載
した。
ての陽性細胞パーセンテージを計算した。全細胞につい
て、第２の抗体試薬でのバックグラウンド染色は全細胞
の１５％またはそれ以下であった。その結果を第１表に
まとめた。陽性細胞のパーセンテージが少くとも２０％
のものを表面マーカー発現が陽性であるとみなした。単
球／マクロファージ細胞系Ｕ−９３７も対照として掲載
した。
第１表
単球／マクロファージマーカー陽性細胞％細胞系粗嗟狙
里黒風（ ９０１０６Ｂ、１ １７ ６ ９３ ２０ ７
７７ ３２ＭＤ、１ ９ ６ ７５ ５
７ ２３ １９Ｐ藺ｃ−２４２７６６１５１７２８１４
ＳＣ５５５９９２１０９７８５ ｕＡ、ｌ’ ３８ １９ ８３ ２０ ２４ ８
７ ８ＢＰ）！、１ ３３ １２ ９３ １３
１３ ８３ ５７ＥＬＩ ９１ ５ ９８
８ １４ ９８ ９９１１−９３７ ８７ ０
Ｎ０本 １ ５８ ９６ ９６＊測定せず １掲した結果より、本発明の細胞系は単球／マクロファ
ージ系統に特徴的な表面マーカーを発現したことが示さ
れる。すべての細胞系がＭｌに関して陽性であり、そし
てＰＭＣ−２およびＭＤ、ｌを除いたすべてがＭｙ４．
反ｙ７８よびＭｙ９に関して陽性であった。
里黒風（ ９０１０６Ｂ、１ １７ ６ ９３ ２０ ７
７７ ３２ＭＤ、１ ９ ６ ７５ ５
７ ２３ １９Ｐ藺ｃ−２４２７６６１５１７２８１４
ＳＣ５５５９９２１０９７８５ ｕＡ、ｌ’ ３８ １９ ８３ ２０ ２４ ８
７ ８ＢＰ）！、１ ３３ １２ ９３ １３
１３ ８３ ５７ＥＬＩ ９１ ５ ９８
８ １４ ９８ ９９１１−９３７ ８７ ０
Ｎ０本 １ ５８ ９６ ９６＊測定せず １掲した結果より、本発明の細胞系は単球／マクロファ
ージ系統に特徴的な表面マーカーを発現したことが示さ
れる。すべての細胞系がＭｌに関して陽性であり、そし
てＰＭＣ−２およびＭＤ、ｌを除いたすべてがＭｙ４．
反ｙ７８よびＭｙ９に関して陽性であった。
詳細データは上記に示さなかったが、はとんどの細胞系
がＤｒ （Ｉａ）抗原の表面発現に関して陽性であり、
そして、ＰＭＣ−２およびＭＤ、 ｌを除く細胞系が補
体成分Ｃ３に対する受容体を発現した。
がＤｒ （Ｉａ）抗原の表面発現に関して陽性であり、
そして、ＰＭＣ−２およびＭＤ、 ｌを除く細胞系が補
体成分Ｃ３に対する受容体を発現した。
Ｄｒ （Ｉａ）抗原およびＣ３の発現もまた単球／マク
ロファージ系統の細胞系の特性である。
ロファージ系統の細胞系の特性である。
発現されたマーカーのいくつかは予想外であった。Ｂ細
胞マーカーであるＢｌおよびＢ４はほとんどの細胞系に
よって発現された。Ｂ２はＭＤＩ細胞系のみにより発現
されｔ：、、 Ｂｌ、 Ｂ２およびＢ４マーカーは正常
Ｂｍ胞に特徴的であるが種々の非−Ｔ細胞白血病並びに
急性化中の白血病細胞によっても発現される。単球／マ
クロファージ系統である細胞系Ｕ−９３７もＢ１および
Ｂ４マーカーを発現した。ｕ−９３７の結果から、本発
明の細胞系は、ＭＤ、ｌおよびＰＭＣ−２細胞系を除き
、おそらく細胞分化の正常な段階に相当する細胞系であ
ると考えられ、これは単球／マクロファージ系統に関わ
るが、通常リンパ球系統のいくつかのマーカーを発現す
るものである。
胞マーカーであるＢｌおよびＢ４はほとんどの細胞系に
よって発現された。Ｂ２はＭＤＩ細胞系のみにより発現
されｔ：、、 Ｂｌ、 Ｂ２およびＢ４マーカーは正常
Ｂｍ胞に特徴的であるが種々の非−Ｔ細胞白血病並びに
急性化中の白血病細胞によっても発現される。単球／マ
クロファージ系統である細胞系Ｕ−９３７もＢ１および
Ｂ４マーカーを発現した。ｕ−９３７の結果から、本発
明の細胞系は、ＭＤ、ｌおよびＰＭＣ−２細胞系を除き
、おそらく細胞分化の正常な段階に相当する細胞系であ
ると考えられ、これは単球／マクロファージ系統に関わ
るが、通常リンパ球系統のいくつかのマーカーを発現す
るものである。
また本発明の細胞系は１９７８球系統の細胞に特徴的な
数種の異った表面マーカーをも発現した。これらのマー
カーのうち最も目立ったものはＴ４．０ＫＴ４．０ＫＴ
４Ａ、およびＬｅｕ３ａ抗体により認識されるものであ
り、これらはすべて旧Ｖ−１受容体のエピトープ、ＣＤ
４を認識する。正常な単球／マクロファージはその表面
でＣＤ４を発現し旧Ｖ−１感染を受は昌いことが知られ
ているが、本発明の細胞系による他のＴ細胞表面マーカ
ーの発現は予想外であった。しかしながらよく特性化さ
れているＵ−９３７細胞系もまたこのようなＴ細胞表面
マーカーを発現した。
数種の異った表面マーカーをも発現した。これらのマー
カーのうち最も目立ったものはＴ４．０ＫＴ４．０ＫＴ
４Ａ、およびＬｅｕ３ａ抗体により認識されるものであ
り、これらはすべて旧Ｖ−１受容体のエピトープ、ＣＤ
４を認識する。正常な単球／マクロファージはその表面
でＣＤ４を発現し旧Ｖ−１感染を受は昌いことが知られ
ているが、本発明の細胞系による他のＴ細胞表面マーカ
ーの発現は予想外であった。しかしながらよく特性化さ
れているＵ−９３７細胞系もまたこのようなＴ細胞表面
マーカーを発現した。
Ｅ、ヒト細胞系の細胞化学的特性化
ここまで述べた本発明の細胞系の系統をさらに判定する
ために、細胞を一連の細胞化学染色法６で処理し、そし
て光学顕微鏡で分析した。試薬と操作は市販キット（Ｓ
ｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａ１社）から入手した。使用し
た染料は過ヨウ素酸−３ｃｈｉｆｆ（ＰＡＳ） 、 ミ
エロペルオキシダーゼ、ナフトールＡＳ−Ｄクロロアセ
テートエステラーゼ、ナフチルＡｃ ＡＣエステラー
ゼおよびスーダンブラックＢであっＩ；。「＋」および
「−」はそれぞれ陽性および陰性染色を意味する。ｒ＋
／−」とは弱い染色を指す。「ＤＪおよび「Ｇ」とは、
それぞれ拡散したおよび粒状化した染色のことである。
ために、細胞を一連の細胞化学染色法６で処理し、そし
て光学顕微鏡で分析した。試薬と操作は市販キット（Ｓ
ｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａ１社）から入手した。使用し
た染料は過ヨウ素酸−３ｃｈｉｆｆ（ＰＡＳ） 、 ミ
エロペルオキシダーゼ、ナフトールＡＳ−Ｄクロロアセ
テートエステラーゼ、ナフチルＡｃ ＡＣエステラー
ゼおよびスーダンブラックＢであっＩ；。「＋」および
「−」はそれぞれ陽性および陰性染色を意味する。ｒ＋
／−」とは弱い染色を指す。「ＤＪおよび「Ｇ」とは、
それぞれ拡散したおよび粒状化した染色のことである。
ｒ ＮＤＪとはその試料に関して染色測定を行わなかっ
たことを指す。用いられた染料は単球／マクロファージ
系統の細胞と他の系統の細胞とを区別するのに役立てら
れた。
たことを指す。用いられた染料は単球／マクロファージ
系統の細胞と他の系統の細胞とを区別するのに役立てら
れた。
本発明細胞系全部からの細胞は、細胞系ＭＤ、２および
ＰＭＣ−２，３を除き、すべての染料に関して陽性染色
された。すべての染料に対して陽性染色性であるのは単
球／マクロファージ系統の細胞の特徴である。
ＰＭＣ−２，３を除き、すべての染料に関して陽性染色
された。すべての染料に対して陽性染色性であるのは単
球／マクロファージ系統の細胞の特徴である。
Ｆ、ヒト細胞系によるサイトカインの分泌本発明の方法
により樹立された細胞系の代表的な試料を細菌性リボ多
糖体（ＬＰＳ）およびホルボールミリステートアセテー
ト（ＰＭＡ）で刺激し、そしてＩＬ−１およびハイブリ
ドーマ増殖因子（ＨＧＦ）の産生につい゛てアッセイし
た。
により樹立された細胞系の代表的な試料を細菌性リボ多
糖体（ＬＰＳ）およびホルボールミリステートアセテー
ト（ＰＭＡ）で刺激し、そしてＩＬ−１およびハイブリ
ドーマ増殖因子（ＨＧＦ）の産生につい゛てアッセイし
た。
ａ、 ヒト細胞系によるＩＬ−１の産生合成培地中で細
胞を大体５ＸＩＯ’個／ｒｎＱに生長させ、そして刺激
を与えないか、または２０ｎｇ７／ａＱのＰＭＡまたは
ｌ Ｏ１１９／ ｒｎ （ｔのＳ、 ｍ１ｎｎｅｓｏ
Ｌａ ＲＥ５９５ ＬＰＳ（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓ）で４８時間刺激した。ＰＭＡおよび
ＬＰＳいずれも単球／マクロファージ系統の細胞中で、
ＩＬ−１の産生を刺激することが知られている。対照と
して細胞の入っていない合成培地を使用した。細胞は遠
心分離により除去し、上清を膜濾過により滅菌しＩ；。
胞を大体５ＸＩＯ’個／ｒｎＱに生長させ、そして刺激
を与えないか、または２０ｎｇ７／ａＱのＰＭＡまたは
ｌ Ｏ１１９／ ｒｎ （ｔのＳ、 ｍ１ｎｎｅｓｏ
Ｌａ ＲＥ５９５ ＬＰＳ（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓ）で４８時間刺激した。ＰＭＡおよび
ＬＰＳいずれも単球／マクロファージ系統の細胞中で、
ＩＬ−１の産生を刺激することが知られている。対照と
して細胞の入っていない合成培地を使用した。細胞は遠
心分離により除去し、上清を膜濾過により滅菌しＩ；。
上溝のＩＬ−１活性を胸腺細胞コマイトジエン検定によ
り測定した。これはＧｅｒｙら（Ｊ、 Ｅｘｐ、 Ｍｅ
ｄ。
り測定した。これはＧｅｒｙら（Ｊ、 Ｅｘｐ、 Ｍｅ
ｄ。
１３６： １２８１９７２）に記載され、Ｔ細胞マイト
ジェンである植物凝集素（ＰＨＡ）を最適量以下で用い
ることによる脚線細胞Ｃ３Ｈ／ＨｅＪの同時刺激を使用
するものである。ＩＬ−１の活性の単位は標準組み換え
ＩＬ−１と比較することにより測定しＩこ 。
ジェンである植物凝集素（ＰＨＡ）を最適量以下で用い
ることによる脚線細胞Ｃ３Ｈ／ＨｅＪの同時刺激を使用
するものである。ＩＬ−１の活性の単位は標準組み換え
ＩＬ−１と比較することにより測定しＩこ 。
第 ３
表
ＳＣ１，２３，０！２．２
ＥＬ １．３ ＜０．１ ＜０．１ １
０．４ＫＭＡ、３ ＜０．１ ＜０．１
＜０．１９０１９６８、ｌ ＜０．１ ＜
０．１ １５．１ＫＭＡ、１ ＜Ｑ、ｌ
＜０．１ ＜０．ＩＥＬ １．１ ＜０．
１ ＜０．１ ＜０．３ＰＭＣ−２，１５，３３
，５１５，９ ＭＤ、１ ９．４ ５．４
２２．ＯＰＨ，１＜０．１ ＜０．１ ＜
０．１対照 ＜０．１ 第３表かられかるように、本発明の細胞系のほとんどが
、単独または刺激を受けるかのいずれかにより、ＩＬ−
１を産生じた。ＬＰＳで刺激した場合は刺激しなかった
場合またはＰＭＡで刺激した場合よりもＩＬ−１の産生
が多い。ＬＰＳ刺激の後、ＩＬ−１の産生が増加するの
は単球／マクロファージ系統の細胞に関して一貫してい
る。ｍ胞糸ＫＭＡ、 ３ 、 ＫＭＡ、 １およびＰＨ
，ｌはＩＬ−１の産生を行なわないが、これは本発明細
胞系の個々の差異を強調しているだけであり、これらの
細胞系が単球／マクロファージ系統ではないことを示す
訳ではない。
０．４ＫＭＡ、３ ＜０．１ ＜０．１
＜０．１９０１９６８、ｌ ＜０．１ ＜
０．１ １５．１ＫＭＡ、１ ＜Ｑ、ｌ
＜０．１ ＜０．ＩＥＬ １．１ ＜０．
１ ＜０．１ ＜０．３ＰＭＣ−２，１５，３３
，５１５，９ ＭＤ、１ ９．４ ５．４
２２．ＯＰＨ，１＜０．１ ＜０．１ ＜
０．１対照 ＜０．１ 第３表かられかるように、本発明の細胞系のほとんどが
、単独または刺激を受けるかのいずれかにより、ＩＬ−
１を産生じた。ＬＰＳで刺激した場合は刺激しなかった
場合またはＰＭＡで刺激した場合よりもＩＬ−１の産生
が多い。ＬＰＳ刺激の後、ＩＬ−１の産生が増加するの
は単球／マクロファージ系統の細胞に関して一貫してい
る。ｍ胞糸ＫＭＡ、 ３ 、 ＫＭＡ、 １およびＰＨ
，ｌはＩＬ−１の産生を行なわないが、これは本発明細
胞系の個々の差異を強調しているだけであり、これらの
細胞系が単球／マクロファージ系統ではないことを示す
訳ではない。
ｂ、 ヒト細胞系によるＨＧＦの産生
ヒトハイブリドーマ細胞を標的として使用してヒトＨＧ
Ｆの存在に関するアッセイを確立しようとする試みは、
外因性ＨＧＦが存在しない場合でも、ハイブリドーマ細
胞のバックグラウンド生長が高いためうまく行かなかっ
た。したがって、ヒトハイブリドーマ増殖因子の活性は
マウスハイブリドーマ細胞を標的として使用するアッセ
イにより測定された。マウスＨＧＦは多くのマウスハイ
ブリドーマの非適合性の無血清増殖を促進することが明
らかにされている。イ旺のヒトリンフ才力インおよびモ
ノ力インによる標的細胞に対する種間刺激に基づき、マ
ウスハイブリドーマ細胞の無血清増殖の促進はヒトハイ
ブリドーマ細胞の増殖促進をも行うであろう蛋白質を示
すことが予想された。
Ｆの存在に関するアッセイを確立しようとする試みは、
外因性ＨＧＦが存在しない場合でも、ハイブリドーマ細
胞のバックグラウンド生長が高いためうまく行かなかっ
た。したがって、ヒトハイブリドーマ増殖因子の活性は
マウスハイブリドーマ細胞を標的として使用するアッセ
イにより測定された。マウスＨＧＦは多くのマウスハイ
ブリドーマの非適合性の無血清増殖を促進することが明
らかにされている。イ旺のヒトリンフ才力インおよびモ
ノ力インによる標的細胞に対する種間刺激に基づき、マ
ウスハイブリドーマ細胞の無血清増殖の促進はヒトハイ
ブリドーマ細胞の増殖促進をも行うであろう蛋白質を示
すことが予想された。
マウスハイブリドーマ細胞系を低密度で、蛋白質含量の
少ない代替血清を補足した非蛋白質基準組織培養基中で
培養した。増殖因子を含有するならし培地の試料を加え
、約７２時間のインキュベーションの後、増殖および／
または活性化を下記の如く測定し、ならし培地を添加し
ていない対照細胞と比較した。
少ない代替血清を補足した非蛋白質基準組織培養基中で
培養した。増殖因子を含有するならし培地の試料を加え
、約７２時間のインキュベーションの後、増殖および／
または活性化を下記の如く測定し、ならし培地を添加し
ていない対照細胞と比較した。
ならし培地を調製するには、ヒト細胞系を先づ工程Ｃの
記述の如く低蛋白質、合成培地（Ｓ）Ｊ）で増殖するよ
うに適応させた。あるいはまた、この細胞系を１％Ｎｕ
ｔｒｉｄｏｍａ−ＳＰ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａ
ｎｎｈｅｉｍ）を補足したｌ５ｃｏｖｅ’ｓ Ｍｅｄｉ
ｕｍ中で増殖するように適応させた。このヒト細胞系を
ＳＭまたは１ｓｃｏｖｅ’ｇ＋ Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ−
５Ｐ中で数代継代増殖させることによりいずれかの培地
で増殖するように適応させ、この時点での増殖速度はｌ
Ｏ％ＦＢＳを含有する培地中で得られた速度の約８０〜
９０％であっＩ；。この細胞系を血清のない培地中で生
長させた。というのは、血清がアッセイすべき試料中に
存在していると、）ＩＧＦ活性について陽性を与えるか
らである。この細胞系は集密近くまで（７〜ＩＯＸ ｔ
ｏ’個／ｒｎＱ）増殖し、そして、ＬＰＳ （Ｅ、 ｃ
ｏｌｉ ０５５ ： Ｂ５Ｗ、 Ｄｉｒｃｏ）を最終濃
度で０．１μｇ／ｌｌ１１２マたはＬＩＬｇ／ｒａＱ、
またはホルボールミリステートアセテートを最終濃度２
０ｎｇ／ｍｆｆで加えるか、または何も加えなかった。
記述の如く低蛋白質、合成培地（Ｓ）Ｊ）で増殖するよ
うに適応させた。あるいはまた、この細胞系を１％Ｎｕ
ｔｒｉｄｏｍａ−ＳＰ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａ
ｎｎｈｅｉｍ）を補足したｌ５ｃｏｖｅ’ｓ Ｍｅｄｉ
ｕｍ中で増殖するように適応させた。このヒト細胞系を
ＳＭまたは１ｓｃｏｖｅ’ｇ＋ Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ−
５Ｐ中で数代継代増殖させることによりいずれかの培地
で増殖するように適応させ、この時点での増殖速度はｌ
Ｏ％ＦＢＳを含有する培地中で得られた速度の約８０〜
９０％であっＩ；。この細胞系を血清のない培地中で生
長させた。というのは、血清がアッセイすべき試料中に
存在していると、）ＩＧＦ活性について陽性を与えるか
らである。この細胞系は集密近くまで（７〜ＩＯＸ ｔ
ｏ’個／ｒｎＱ）増殖し、そして、ＬＰＳ （Ｅ、 ｃ
ｏｌｉ ０５５ ： Ｂ５Ｗ、 Ｄｉｒｃｏ）を最終濃
度で０．１μｇ／ｌｌ１１２マたはＬＩＬｇ／ｒａＱ、
またはホルボールミリステートアセテートを最終濃度２
０ｎｇ／ｍｆｆで加えるか、または何も加えなかった。
４８時間インキュベートした後、上澄液を各細胞系から
取り出し、細胞および細胞くずは遠心分離を１５分間４
８，０００Ｘｙで行なうことにより除去した。更に細か
いくずを除去し、そしてその溶液を滅菌０．２２ミクロ
ンフィルターを通過させて滅菌した。
取り出し、細胞および細胞くずは遠心分離を１５分間４
８，０００Ｘｙで行なうことにより除去した。更に細か
いくずを除去し、そしてその溶液を滅菌０．２２ミクロ
ンフィルターを通過させて滅菌した。
各細胞系からの上澄液は分割して一７０℃で凍結するか
または４℃で数週間貯蔵した。
または４℃で数週間貯蔵した。
ＨＧＦ活性の検定のために、各ヒト細胞系からの上澄液
の一部２０μａを９６−ウェルを有する全面セルプレー
ト（Ｃｏａｓｔａｒ ５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のウェル
に加えた。単球／マクロファージ系統の２つの細胞系Ｕ
−９３７８よびＴＨＰ−１からの上澄液と細胞のない培
地をそれぞれ陽性および陰性対照として使用した。ネズ
ミハイブリドーマ細胞（系２４Ｅ ／ １０） ８００
０１ｍ ／ウェルを各プレートに加え、そして湿度調節
されたＣＯ２インキュベーター中３７°Ｃで７２時間増
殖させた。使用した培地は１％Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ−Ｓ
Ｐ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を補
足した１ｓｃｏｖｅ’ｓ培地でありだ。８−チャンネル
の真空マニホールドを用いて、個々のウェルがら上澄液
を除去し、そして各ウェルにＭＴＴ（３−（４，５−ジ
メチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジ７工二ルテ
トラゾリウムプロミド） （Ｓｉｇｍ−ａＣｈｅ−ｍ
ｉｃａｌ Ｃｏ、、 ｌ５ｃｏｖｅ’ｓ培地中１１１
ｇ／ｌｌ１１２）１００μαを加えた。この９６−ウェ
ルプレートを湿度調節したＣＯ，インキュベーター中３
７℃で３時間インキュベートした。インキュベート後、
各ウェルを８チヤンネル真空マニホールドを有するアス
ピレータ−で引いた。０．０４ ＮＨＣＱを含有する
インプロパツール１００μαを各ウェルに加え、そして
プレートを６０秒間激しく振とうし、生存細胞が含まれ
るウェル内で産生ずるホルマザン色素を可溶化した。ウ
ェル中の色素溶液の吸光度を試験波長５７０ｎｍおよび
参照波長６９０ｎｍで自動グレート読み取り器で測定し
た。検定は３度実施し、吸光度を平均した。平均の吸光
度を第４表に示した。陰性コントロールより５０％また
はそれ以上大きい吸光値を陽性をみなした。
の一部２０μａを９６−ウェルを有する全面セルプレー
ト（Ｃｏａｓｔａｒ ５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のウェル
に加えた。単球／マクロファージ系統の２つの細胞系Ｕ
−９３７８よびＴＨＰ−１からの上澄液と細胞のない培
地をそれぞれ陽性および陰性対照として使用した。ネズ
ミハイブリドーマ細胞（系２４Ｅ ／ １０） ８００
０１ｍ ／ウェルを各プレートに加え、そして湿度調節
されたＣＯ２インキュベーター中３７°Ｃで７２時間増
殖させた。使用した培地は１％Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ−Ｓ
Ｐ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を補
足した１ｓｃｏｖｅ’ｓ培地でありだ。８−チャンネル
の真空マニホールドを用いて、個々のウェルがら上澄液
を除去し、そして各ウェルにＭＴＴ（３−（４，５−ジ
メチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジ７工二ルテ
トラゾリウムプロミド） （Ｓｉｇｍ−ａＣｈｅ−ｍ
ｉｃａｌ Ｃｏ、、 ｌ５ｃｏｖｅ’ｓ培地中１１１
ｇ／ｌｌ１１２）１００μαを加えた。この９６−ウェ
ルプレートを湿度調節したＣＯ，インキュベーター中３
７℃で３時間インキュベートした。インキュベート後、
各ウェルを８チヤンネル真空マニホールドを有するアス
ピレータ−で引いた。０．０４ ＮＨＣＱを含有する
インプロパツール１００μαを各ウェルに加え、そして
プレートを６０秒間激しく振とうし、生存細胞が含まれ
るウェル内で産生ずるホルマザン色素を可溶化した。ウ
ェル中の色素溶液の吸光度を試験波長５７０ｎｍおよび
参照波長６９０ｎｍで自動グレート読み取り器で測定し
た。検定は３度実施し、吸光度を平均した。平均の吸光
度を第４表に示した。陰性コントロールより５０％また
はそれ以上大きい吸光値を陽性をみなした。
第 ４ 表
ヒト細胞系によるＨＧＦ産生
ＳＣ，１３３（＋） 、３３４（−） Ｎ
ＤＫＭＡ、ｔ 、１３１（＋ ） 、５５５
（＋） 、５０８（＋ ）ＰＭＣ−２，３，０９
５（−） 、２９９（−） 、１０５（−）
９０１９６Ｂ、ｌ −１８５（＋） 、４９３（
＋） 、１８７（−）ＥＬ １．３ ．０８７
（−） 、３２２（−） 、０８４（−）Ｐ
Ｈ，１，２２３（＋ ） 、６３８（＋ ）
、２９６（＋ ）ＭＤ、２ ．１７７（＋）
、４４６（＋） 、２１２（＋）Ｕ−９３７
，１９５（＋ ） 、８４６（＋ ） 、２
８９（＋ ）ＴＨＰ−１，１２７（＋ ） 、４７
４（＋） 、１２９（−）Ｎｏｎｅ
、０６９ −２７３ ＜
、１２５本＊２０ｎ９／ｍｆｆ濃度でのＰＭＡコント
ロールは検出できなかった。しかしｌμｇ／ｍＱ濃度に
したＰＭＡコントロールでは吸光度が０．１２５であっ
たので、２０ｎｇ／＋ｕ２濃度での吸光度は０．１２５
以下であるとした。
ＤＫＭＡ、ｔ 、１３１（＋ ） 、５５５
（＋） 、５０８（＋ ）ＰＭＣ−２，３，０９
５（−） 、２９９（−） 、１０５（−）
９０１９６Ｂ、ｌ −１８５（＋） 、４９３（
＋） 、１８７（−）ＥＬ １．３ ．０８７
（−） 、３２２（−） 、０８４（−）Ｐ
Ｈ，１，２２３（＋ ） 、６３８（＋ ）
、２９６（＋ ）ＭＤ、２ ．１７７（＋）
、４４６（＋） 、２１２（＋）Ｕ−９３７
，１９５（＋ ） 、８４６（＋ ） 、２
８９（＋ ）ＴＨＰ−１，１２７（＋ ） 、４７
４（＋） 、１２９（−）Ｎｏｎｅ
、０６９ −２７３ ＜
、１２５本＊２０ｎ９／ｍｆｆ濃度でのＰＭＡコント
ロールは検出できなかった。しかしｌμｇ／ｍＱ濃度に
したＰＭＡコントロールでは吸光度が０．１２５であっ
たので、２０ｎｇ／＋ｕ２濃度での吸光度は０．１２５
以下であるとした。
１４表かられかるように、本発明の細胞系のほとんど、
並びに２つのコントロール細胞系Ｕ−９３７とＴＨＰ−
１で、単独でまたは刺激を受けた場合ＨＧＦを産生した
。ＬＰＳ Ｏ，１μ９／ ｒｎＱでの刺激に関する吸光
度を第４表に示さなかったのは適当なコントロールを決
定できなかったからである。
並びに２つのコントロール細胞系Ｕ−９３７とＴＨＰ−
１で、単独でまたは刺激を受けた場合ＨＧＦを産生した
。ＬＰＳ Ｏ，１μ９／ ｒｎＱでの刺激に関する吸光
度を第４表に示さなかったのは適当なコントロールを決
定できなかったからである。
しかしながらＬＰＳ Ｏ，１μｇ／ｖａＱによる刺激に
ついての細胞系吸光度とＬＰＳ ｌμｇ／ｍＱによる刺
激についての細胞系吸光度とを比較することにより、Ｌ
ＰＳ Ｏ，１μｇ７’ｒＱのＬＰＳで刺激してもほとん
どの細胞系でＨＧＦを産生じないことが明らかにされた
。
ついての細胞系吸光度とＬＰＳ ｌμｇ／ｍＱによる刺
激についての細胞系吸光度とを比較することにより、Ｌ
ＰＳ Ｏ，１μｇ７’ｒＱのＬＰＳで刺激してもほとん
どの細胞系でＨＧＦを産生じないことが明らかにされた
。
ＨＧＦを産生じない細胞系ＰＭＣ−２，３およびＥＬ
１．３は、個々の細胞系の差異を強調する助けになるも
のであり、このらの細胞系が単球／マクロファージでは
ないことを示すものではない。
１．３は、個々の細胞系の差異を強調する助けになるも
のであり、このらの細胞系が単球／マクロファージでは
ないことを示すものではない。
Ｃ２ヒト細胞系によるリゾチーム分泌
リゾチーム分泌は単球／マクロファージの特性である。
本発明の種々の細胞系からの細胞をｌ５ｃｏｖｅ’ｓ
Ｍｅｄｉｕｍ＋ ｌＯ％ＦＣＳ中で大体ｌＸｌ０’個／
ｍＱとなるまで４〜６日間生長させた。各細胞系から細
胞を含まない上澄液試料を得て、そしてＨｅｒｓｃｏｖ
ｉｔｘら（Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍａｃｒｏｐｈａ
ｇｅＭｅｔｈｏｄｏｌｏｇ’／、 Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅ
ｋｋｅｒ、 Ｉｎｃ、、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。
Ｍｅｄｉｕｍ＋ ｌＯ％ＦＣＳ中で大体ｌＸｌ０’個／
ｍＱとなるまで４〜６日間生長させた。各細胞系から細
胞を含まない上澄液試料を得て、そしてＨｅｒｓｃｏｖ
ｉｔｘら（Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍａｃｒｏｐｈａ
ｇｅＭｅｔｈｏｄｏｌｏｇ’／、 Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅ
ｋｋｅｒ、 Ｉｎｃ、、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。
１９８１、２４０〜２４１頁）により述べられている凍
結乾燥したミクロコツカスリソデクチクス（Ｍｉｃｒｏ
ｃｏｃｃｕｓ １ｙｓｏｄｅｃｔｉｃｕｓ）細胞を使用
する分光光度分析によりリゾチームを検定した。細胞系
Ｕ−９３７およびＴＨＰ−１、これは単球／マクロファ
ージ系統である、をコントロールとして使用した。標準
曲線は鶏卵の白色リゾチームを使用して作成した。そし
てリゾチームの濃度はすべてこの標準曲線と相対的に表
わした。
結乾燥したミクロコツカスリソデクチクス（Ｍｉｃｒｏ
ｃｏｃｃｕｓ １ｙｓｏｄｅｃｔｉｃｕｓ）細胞を使用
する分光光度分析によりリゾチームを検定した。細胞系
Ｕ−９３７およびＴＨＰ−１、これは単球／マクロファ
ージ系統である、をコントロールとして使用した。標準
曲線は鶏卵の白色リゾチームを使用して作成した。そし
てリゾチームの濃度はすべてこの標準曲線と相対的に表
わした。
第 ５ 表
ヒト細胞系によるリゾチームの分泌
剤 胞 系 リゾチーム（μｙ／ｍＱ’）ＫＭ
Ａ、ｌ ＜０．００５ＭＤ、２
＜ ０．００５ＰＭＣ−２，１＜ ０．００５ ＥＬ １．３ ＜０．００５ＳＣ１，２４ ＰＨ，１２，７２ ９０１９６Ｂ、Ｉ Ｏ，５７１１−
９３７１，３９ Ｔ）ＩＰ−１０，５７ 第５表から明らかなように、細胞系ＰＨ，１，ＳＣおよ
び９０１９６Ｂ、 １並びに２つのコントロール細胞系
Ｕ−９３７３よびＴＨＰ−１のすべてがリゾチーム分泌
を行なっている。細胞系ＭＤ、 ２ 、 ＰＭＣ−２，
１゜ＥＬ １．３およびＫＭＡ、ｌではりゾチームを分
泌していないが、これも本発明の個々の細胞系の差異を
強調するものであり、これらの細胞系が単球／マクロフ
ァージ系統でないことを示すものではない。
Ａ、ｌ ＜０．００５ＭＤ、２
＜ ０．００５ＰＭＣ−２，１＜ ０．００５ ＥＬ １．３ ＜０．００５ＳＣ１，２４ ＰＨ，１２，７２ ９０１９６Ｂ、Ｉ Ｏ，５７１１−
９３７１，３９ Ｔ）ＩＰ−１０，５７ 第５表から明らかなように、細胞系ＰＨ，１，ＳＣおよ
び９０１９６Ｂ、 １並びに２つのコントロール細胞系
Ｕ−９３７３よびＴＨＰ−１のすべてがリゾチーム分泌
を行なっている。細胞系ＭＤ、 ２ 、 ＰＭＣ−２，
１゜ＥＬ １．３およびＫＭＡ、ｌではりゾチームを分
泌していないが、これも本発明の個々の細胞系の差異を
強調するものであり、これらの細胞系が単球／マクロフ
ァージ系統でないことを示すものではない。
Ｈ５ヒト細胞系における旧Ｖ−１の複製ヒト細胞系ＰＨ
，ｌ 、 ＭＤ、 １ 、 ＫＭＡ、 ｌおよび９０１
９６Ｂ、 １を集密になるまで生長させ、各細胞系から
ｌ Ｘ １０”個の細胞を遠心分離により集め、洗浄し
、これを５ Ｘ １０＠個／ｒｐｒＱの濃度で旧Ｖ−１
産生細胞系であるＯＥＭ ３Ｂ細胞の上澄液中に再懸濁
し、この細胞系を旧Ｖ−１で感染した。７２時間後、こ
の細胞を遠心分離により集め、新鮮なりｕｌ−ｂｅｃｃ
ｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍａｄｉ
ｕｍ中２ Ｘ １０’個／肩ａで再懸濁した。これらの
懸濁液の試料はＨＩＶ−１感染させる前の各細胞系から
集め、そして第６．１０．１２．１４．１６および２０
日エト後感染させた。細胞を遠心分離により除去し、細
胞上澄液は保管した。感染期間内には、細胞の形態およ
び生長パターンについて目に見えた変化はなかった。
，ｌ 、 ＭＤ、 １ 、 ＫＭＡ、 ｌおよび９０１
９６Ｂ、 １を集密になるまで生長させ、各細胞系から
ｌ Ｘ １０”個の細胞を遠心分離により集め、洗浄し
、これを５ Ｘ １０＠個／ｒｐｒＱの濃度で旧Ｖ−１
産生細胞系であるＯＥＭ ３Ｂ細胞の上澄液中に再懸濁
し、この細胞系を旧Ｖ−１で感染した。７２時間後、こ
の細胞を遠心分離により集め、新鮮なりｕｌ−ｂｅｃｃ
ｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍａｄｉ
ｕｍ中２ Ｘ １０’個／肩ａで再懸濁した。これらの
懸濁液の試料はＨＩＶ−１感染させる前の各細胞系から
集め、そして第６．１０．１２．１４．１６および２０
日エト後感染させた。細胞を遠心分離により除去し、細
胞上澄液は保管した。感染期間内には、細胞の形態およ
び生長パターンについて目に見えた変化はなかった。
各細胞上澄液を０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で処
理し、第２０目の細胞懸濁液が集まるまで凍結した。次
に細胞の試料をすべて、ｐ２４ ＥＬＩＳＡ検出キット
（ＤｕＰｏｎＬ）を使用して旧Ｖ−１ｐ２４ウィルス抗
原について検定した。未感染および慢性感染したＴ細胞
系であるＣＥＭおよびＨ９は、それぞれ陽性および陰性
コントロールとして併記した。
理し、第２０目の細胞懸濁液が集まるまで凍結した。次
に細胞の試料をすべて、ｐ２４ ＥＬＩＳＡ検出キット
（ＤｕＰｏｎＬ）を使用して旧Ｖ−１ｐ２４ウィルス抗
原について検定した。未感染および慢性感染したＴ細胞
系であるＣＥＭおよびＨ９は、それぞれ陽性および陰性
コントロールとして併記した。
第６表
ヒト細胞系のｐ２４ ＥＬＩＳＡ検定
未感染
ａｙ５
ａｙｌＯ
ａｙ１２
ａｙ１４
ａｙ１６
ａｙ２０
陰性コントロール
陽性コントロール
０５０ ．０４２ ．０５１
３８０ １．３５２ ．３００
．４００ １．４１５ ．３２８
．２１２ ２．０５４ ．２１９
．１９２ ２．３２５ ．２０２
．１７２ ２．４５５ ．１８４
．０７０ ２．６８２ ．１７０
．０６０
．３１２
．２７１
．１７５
．１８３
．１１１
．１０１
．０８７ ．０６９
２．６８２ ＞３．０
第６表で明らかなように、本発明の細胞系ＭＤ、１にお
いてＨＩＶ−１が複製しておりこれは）１１Ｖ−１構造
の蛋白質ｐ２４を産生ずることから証明される。ＭＤ、
１以外のすべての細胞系で６日目および１０日目にｐ２
４蛋白質がいくらか産生じている証拠があるがｐ２４の
レベルはその時点以降減少した。６日目と１０日目で産
生じたｐ２４がＯＥＭ ３Ｂの上澄液からの残存ｐ２４
であるか、または低レベルのｐ２４が潜在的または低レ
ベルで産生じた感染を示しているかはわかっていない。
いてＨＩＶ−１が複製しておりこれは）１１Ｖ−１構造
の蛋白質ｐ２４を産生ずることから証明される。ＭＤ、
１以外のすべての細胞系で６日目および１０日目にｐ２
４蛋白質がいくらか産生じている証拠があるがｐ２４の
レベルはその時点以降減少した。６日目と１０日目で産
生じたｐ２４がＯＥＭ ３Ｂの上澄液からの残存ｐ２４
であるか、または低レベルのｐ２４が潜在的または低レ
ベルで産生じた感染を示しているかはわかっていない。
この実験は旧ｖ−を感染を検出するように企図していな
いので、ＥＬＩＳＡによれば検出可能な隠蔽されたｐ２
４抗原が得られなかったが、本発明の細胞系によっては
細胞内ウィルスおよび／またはウィルス抗原が累積して
いる可能性が残されている。
いので、ＥＬＩＳＡによれば検出可能な隠蔽されたｐ２
４抗原が得られなかったが、本発明の細胞系によっては
細胞内ウィルスおよび／またはウィルス抗原が累積して
いる可能性が残されている。
本発明の態様を要約して示せば以下の通りである。
１）単球／マクロファージ特性を有し、悪性細胞および
悪性細胞の生産物を実質的に含まないヒト連続細胞系お
よび該細胞系のすべてのクローン、突然変異体、修飾体
および遺伝子物質。
悪性細胞の生産物を実質的に含まないヒト連続細胞系お
よび該細胞系のすべてのクローン、突然変異体、修飾体
および遺伝子物質。
２）正常なヒト細胞から樹立された、単球／マクロファ
ージ特性を有するヒト連続細胞系および該細胞系のすべ
てのクローン、突然変異体、修飾体および遺伝子物質。
ージ特性を有するヒト連続細胞系および該細胞系のすべ
てのクローン、突然変異体、修飾体および遺伝子物質。
３）正常なマウス細胞から樹立された、単球／マクロフ
ァージ特性を有するマウス連続細胞系および該細胞系の
すべてのクローン、突然変異体、修飾体および遺伝子物
質。
ァージ特性を有するマウス連続細胞系および該細胞系の
すべてのクローン、突然変異体、修飾体および遺伝子物
質。
４）単球／マクロファージ特性を有する哺乳動物連続細
胞系をインビトロにおいて樹立するに当たり、下記工程
すなわち、 ａ）正常な出発細胞の浮遊液を調製し、ｂ）該出発細胞
の浮遊液を培地中で培養する、但しこの出発細胞がヒト
細胞である場合は培地にインシュリン、トランスフェリ
ンおよび亜セレン酸塩を含有する血清代替物を補添する
ものとし、 Ｃ）該出発細胞の浮遊液を付着細胞が生成されるに十分
な時間インキュベーションし、ｄ）培地を取り変えるこ
とにより非付着細胞を除去し、 ｅ）付着細胞をそれが増殖表面上で集密的またはほとん
ど集密的となるまで周期的に培地を部分交換しながら培
地中で培養し、そして ｆ）前記集密的またはほとんど集密的な細胞を十分な時
間培養して、速やかに分裂しかつ希釈後に培地中で集密
となるまで増殖できる均一な形態を有する細胞を生成さ
せる ことを包含する方法。
胞系をインビトロにおいて樹立するに当たり、下記工程
すなわち、 ａ）正常な出発細胞の浮遊液を調製し、ｂ）該出発細胞
の浮遊液を培地中で培養する、但しこの出発細胞がヒト
細胞である場合は培地にインシュリン、トランスフェリ
ンおよび亜セレン酸塩を含有する血清代替物を補添する
ものとし、 Ｃ）該出発細胞の浮遊液を付着細胞が生成されるに十分
な時間インキュベーションし、ｄ）培地を取り変えるこ
とにより非付着細胞を除去し、 ｅ）付着細胞をそれが増殖表面上で集密的またはほとん
ど集密的となるまで周期的に培地を部分交換しながら培
地中で培養し、そして ｆ）前記集密的またはほとんど集密的な細胞を十分な時
間培養して、速やかに分裂しかつ希釈後に培地中で集密
となるまで増殖できる均一な形態を有する細胞を生成さ
せる ことを包含する方法。
５）工程ｆ）で生成された細胞のクローニ・ングを付加
的に包含することからなる前記４項記載の方法。
的に包含することからなる前記４項記載の方法。
６）出発細胞が単球／マクロファージ系統の正常マウス
細胞および単球／マクロファージ系統の正常ヒト細胞か
らなる群から選択されることからなる前記４項記載の方
法。
細胞および単球／マクロファージ系統の正常ヒト細胞か
らなる群から選択されることからなる前記４項記載の方
法。
７）出発細胞が単球／マクロファージ系統の正常マウス
細胞および単球／マクロファージ系統の正常ヒト細胞か
らなる群から選択されることからなる前記５項記載の方
法。
細胞および単球／マクロファージ系統の正常ヒト細胞か
らなる群から選択されることからなる前記５項記載の方
法。
８） ヒト細胞が末梢血液細胞および肺臓細胞からなる
群から選択されることからなる前記６項記載の方法。
群から選択されることからなる前記６項記載の方法。
９） ヒト細胞が末梢血液細胞および肺臓細胞からなる
群から選択されることからなる前記７項記載の方法。
群から選択されることからなる前記７項記載の方法。
１０） 下記工程すなわち、
ａ）正常な出発細胞の浮遊液を調製し、ｂ）該出発細胞
の浮遊液を培地中で培養する、但しこの出発細胞がヒト
細胞である場合は培地にインシュリン、トランスフェリ
ンおよび亜セレン酸塩を含有する血清代替物を補添する
ものとし、 Ｃ）該出発細胞の浮遊液を付着細胞が生成されるに十分
な時間インキュベーションし、ｄ）培地を取り変えるこ
とにより非付着細胞を除去し、 ｅ）付着細胞をそれが増殖表面上で集密的またはほとん
ど集密的となるまで周期的に培地を部分交換しながら培
地中で培養し、そして ｒ）前記集密的またはほとんど集密的な細胞を十分な時
間培養して、速やかに分裂しかつ希釈後に培地中で集密
となるまで増殖でき、均一な形態を有する細胞を生成さ
せる ことによりインビトロで樹立された、単球／マクロファ
ージ特性を有する哺乳動物連続細胞系。
の浮遊液を培地中で培養する、但しこの出発細胞がヒト
細胞である場合は培地にインシュリン、トランスフェリ
ンおよび亜セレン酸塩を含有する血清代替物を補添する
ものとし、 Ｃ）該出発細胞の浮遊液を付着細胞が生成されるに十分
な時間インキュベーションし、ｄ）培地を取り変えるこ
とにより非付着細胞を除去し、 ｅ）付着細胞をそれが増殖表面上で集密的またはほとん
ど集密的となるまで周期的に培地を部分交換しながら培
地中で培養し、そして ｒ）前記集密的またはほとんど集密的な細胞を十分な時
間培養して、速やかに分裂しかつ希釈後に培地中で集密
となるまで増殖でき、均一な形態を有する細胞を生成さ
せる ことによりインビトロで樹立された、単球／マクロファ
ージ特性を有する哺乳動物連続細胞系。
１１） 哺乳動物連続細胞系がマウス連Ｘ細胞系およ
びヒト連続細胞系からなる群から選択されることからな
る前記１０項記載の細胞系。
びヒト連続細胞系からなる群から選択されることからな
る前記１０項記載の細胞系。
１２） 下記工程すなわち、
ａ）正常な出発細胞の浮遊液を調製し、ｂ）該出発細胞
の浮遊液を培地中で培養する、但しこの出発細胞がヒト
細胞である場合は培地にインシュリン、トランスフェリ
ンおよび亜セレン酸塩を含有する血清代替物を補添する
ものとし、 Ｃ）該出発細胞の浮遊液を付着細胞が生成されるに十分
な時間インキュベーションし、ｄ）培地を取り変えるこ
とにより非付着細胞を除去し、 ｅ）付着細胞をそれが増殖表面上で集密的またはほとん
ど集密的となるまで周期的に培地を部分交換しながら培
地中で培養し、「）前記集密的またはほとんど集密的な
細胞を十分な時間培養して、速やかに分裂し、希釈後に
培地中で集密となるまで増殖でき、かつサイトカインを
生成させることができる均一な形態を有する細胞を生成
させ、ｇ）工程ｆ）で生成された細胞からサイトカイン
を含有する培地を分離し、そして ｈ）この培地からサイトカインを単離することを包含す
るサイトカインの製法。
の浮遊液を培地中で培養する、但しこの出発細胞がヒト
細胞である場合は培地にインシュリン、トランスフェリ
ンおよび亜セレン酸塩を含有する血清代替物を補添する
ものとし、 Ｃ）該出発細胞の浮遊液を付着細胞が生成されるに十分
な時間インキュベーションし、ｄ）培地を取り変えるこ
とにより非付着細胞を除去し、 ｅ）付着細胞をそれが増殖表面上で集密的またはほとん
ど集密的となるまで周期的に培地を部分交換しながら培
地中で培養し、「）前記集密的またはほとんど集密的な
細胞を十分な時間培養して、速やかに分裂し、希釈後に
培地中で集密となるまで増殖でき、かつサイトカインを
生成させることができる均一な形態を有する細胞を生成
させ、ｇ）工程ｆ）で生成された細胞からサイトカイン
を含有する培地を分離し、そして ｈ）この培地からサイトカインを単離することを包含す
るサイトカインの製法。
１３）工程Ｃ）で生成された細胞をリポポリサッカライ
ドで刺激する工程を付加的に包含することからなる前記
１２項記載の方法。
ドで刺激する工程を付加的に包含することからなる前記
１２項記載の方法。
１４） サイトカインがＩＬ−１およびＨＧＦからな
る群から選択されることからなる前記１２項記載の方法
。
る群から選択されることからなる前記１２項記載の方法
。
１５） サイトカインがＩＬ−１およびＨＧＦからな
る群から選択されることからなる前記１３項記載の方法
。
る群から選択されることからなる前記１３項記載の方法
。
１６） 下記工程すなわち、
ａ）正常な出発細胞の浮遊液を調製し、ｂ）該出発細胞
の浮遊液を培地中で培養する、但しこの出発細胞がヒト
細胞である場合は培地にインシュリン、トランスフェリ
ンおよび亜セレン酸塩を含有する血清代替物を補添する
ものとし、 Ｃ）該出発細胞の浮遊液を付着細胞が生成されるに十分
な時間インキュページ膳ンし、ｄ）培地を取り変えるこ
とにより非付着細胞を除去し、 ｅ）付着細胞をそれが増殖表面上で集密的またはほとん
ど集密的となるまで周期的に培地を部分交換しながら培
地中で培養し、ｆ）前記集密的またはほとんど集密的な
細胞を十分な時間培養して、速やかに分裂し、かつ希釈
後に培地中で上溝となるまで増殖できる均一な形態を有
する細胞を生成させ、ｇ）工程ｆ）で生成された細胞を
ウィルスに感染させ、そして ｈ）この感染された細胞をウィルスを複製せしめるに十
分な時間インキュベーションする ことを包含する、単球／マクロファージ中で複製するウ
ィルスの製法。
の浮遊液を培地中で培養する、但しこの出発細胞がヒト
細胞である場合は培地にインシュリン、トランスフェリ
ンおよび亜セレン酸塩を含有する血清代替物を補添する
ものとし、 Ｃ）該出発細胞の浮遊液を付着細胞が生成されるに十分
な時間インキュページ膳ンし、ｄ）培地を取り変えるこ
とにより非付着細胞を除去し、 ｅ）付着細胞をそれが増殖表面上で集密的またはほとん
ど集密的となるまで周期的に培地を部分交換しながら培
地中で培養し、ｆ）前記集密的またはほとんど集密的な
細胞を十分な時間培養して、速やかに分裂し、かつ希釈
後に培地中で上溝となるまで増殖できる均一な形態を有
する細胞を生成させ、ｇ）工程ｆ）で生成された細胞を
ウィルスに感染させ、そして ｈ）この感染された細胞をウィルスを複製せしめるに十
分な時間インキュベーションする ことを包含する、単球／マクロファージ中で複製するウ
ィルスの製法。
１７） 工程ｈ）の後に下記工程、すなわち、ａ）前
記感染した細胞を溶菌させてウィルスを放出させ、 ｂ） ウィルスを含有する培地を前記溶菌した細胞から
分離し、そして Ｃ）この培地からウィルスを収集する ことを付加的に包含することからなる前記１６項記載の
方法。
記感染した細胞を溶菌させてウィルスを放出させ、 ｂ） ウィルスを含有する培地を前記溶菌した細胞から
分離し、そして Ｃ）この培地からウィルスを収集する ことを付加的に包含することからなる前記１６項記載の
方法。
１８） ウィルスがＨＩ Ｖ−１であることからなる
前記１６項記載の方法。
前記１６項記載の方法。
１９） ウィルスがＨＩＶ−１であることからなる前
記１７項記載の方法。
記１７項記載の方法。
２０） ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ９８５０． ＣＲＬ
９８５１． ＣＲＬ９８５２゜ＣＲＬ９８５３． ＣＲ
Ｌ９８５４． ＣＲＬ９８５５オＪ：びＣＲＬ９８５６
を有するヒト連続細胞系および該細胞系のすべてのクロ
ーン、突然変異体、修飾体および遺伝子物質。
９８５１． ＣＲＬ９８５２゜ＣＲＬ９８５３． ＣＲ
Ｌ９８５４． ＣＲＬ９８５５オＪ：びＣＲＬ９８５６
を有するヒト連続細胞系および該細胞系のすべてのクロ
ーン、突然変異体、修飾体および遺伝子物質。
外２名
（方式）
平成２年
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）単球／マクロファージ特性を有し、悪性細胞および
悪性細胞の生産物を実質的に含まないヒト連続細胞系お
よび該細胞系のすべてのクローン、突然変異体、修飾体
および遺伝子物質。 ２）正常なヒト細胞から樹立された、単球／マクロファ
ージ特性を有するヒト連続細胞系および該細胞系のすべ
てのクローン、突然変異体、修飾体および遺伝子物質。 ３）正常なマウス細胞から樹立された、単球／マクロフ
ァージ特性を有するマウス連続細胞系および該細胞系の
すべてのクローン、突然変異体、修飾体および遺伝子物
質。 ４）単球／マクロファージ特性を有する哺乳動物連続細
胞系をインビトロにおいて樹立するに当たり、下記工程
すなわち、 ａ）正常な出発細胞の浮遊液を調製し、 ｂ）該出発細胞の浮遊液を培地中で培養する、但しこの
出発細胞がヒト細胞である場合は 培地にインシュリン、トランスフェリンお よび亜セレン酸塩を含有する血清代替物を 補添するものとし、 ｃ）該出発細胞の浮遊液を付着細胞が生成されるに十分
な時間インキュベーションし、 ｄ）培地を取り変えることにより非付着細胞を除去し、 ｅ）付着細胞をそれが増殖表面上で集密的またはほとん
ど集密的となるまで周期的に培 地を部分交換しながら培地中で培養し、そ して ｆ）前記集密的またはほとんど集密的な細胞を十分な時
間培養して、速やかに分裂しか つ希釈後に培地中で集密となるまで増殖で きる均一な形態を有する細胞を生成させ る ことを包含する方法。 ５）下記工程すなわち、 ａ）正常な出発細胞の浮遊液を調製し、 ｂ）該出発細胞の浮遊液を培地中で培養する、但しこの
出発細胞がヒト細胞である場合は 培地にインシュリン、トランスフェリンお よび亜セレン酸塩を含有する血清代替物を 補添するものとし、 ｃ）該出発細胞の浮遊液を付着細胞が生成されるに十分
な時間インキュベーションし、 ｄ）培地を取り変えることにより非付着細胞を除去し、 ｅ）付着細胞をそれが増殖表面上で集密的またはほとん
ど集密的となるまで周期的に培 地を部分交換しながら培地中で培養し、そ して ｆ）前記集密的またはほとんど集密的な細胞を十分な時
間培養して、速やかに分裂しか つ希釈後に培地中で集密となるまで増殖で き、均一な形態を有する細胞を生成させ る ことによりインビトロで樹立された、単球／マクロファ
ージ特性を有する哺乳動物連続細胞系。 ６）下記工程すなわち、 ａ）正常な出発細胞の浮遊液を調製し、 ｂ）該出発細胞の浮遊液を培地中で培養する、但しこの
出発細胞がヒト細胞である場合は 培地にインシュリン、トランスフェリンお よび亜セレン酸塩を含有する血清代替物を 補添するものとし、 ｃ）該出発細胞の浮遊液を付着細胞が生成されるに十分
な時間インキュベーションし、 ｄ）培地を取り変えることにより非付着細胞を除去し、 ｅ）付着細胞をそれが増殖表面上で集密的またはほとん
ど集密的となるまで周期的に培 地を部分交換しながら培地中で培養し、 ｆ）前記集密的またはほとんど集密的な細胞を十分な時
間培養して、速やかに分裂し、 希釈後に培地中で集密となるまで増殖でき、かつサイト
カインを生成させることができ る均一な形態を有する細胞を生成させ、 ｇ）工程ｆ）で生成された細胞からサイトカインを含有
する培地を分離し、そして ｈ）この培地からサイトカインを単離する ことを包含するサイトカインの製法。 ７）下記工程すなわち、 ａ）正常な出発細胞の浮遊液を調製し、 ｂ）該出発細胞の浮遊液を培地中で培養する、但しこの
出発細胞がヒト細胞である場合は 培地にインシュリン、トランスフェリンお よび亜セレン酸塩を含有する血清代替物を 補添するものとし、 ｃ）該出発細胞の浮遊液を付着細胞が生成されるに十分
な時間インキュベーションし、 ｄ）培地を取り変えることにより非付着細胞を除去し、 ｅ）付着細胞をそれが増殖表面上で集密的またはほとん
ど集密的となるまで周期的に培 地を部分交換しながら培地中で培養し、 ｆ）前記集密的またはほとんど集密的な細胞を十分な時
間培養して、速やかに分裂し、 かつ希釈後に培地中で上清となるまで増殖 できる均一な形態を有する細胞を生成さ せ、 ｇ）工程ｆ）で生成された細胞をウィルスに感染させ、
そして ｈ）この感染された細胞をウィルスを複製せしめるに十
分な時間インキュベーションす る ことを包含する、単球／マクロファージ中で複製するウ
ィルスの製法。 ８）ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ９８５０、ＣＲＬ９８５１
、ＣＲＬ９８５２、ＣＲＬ９８５３、ＣＲＬ９８５４、
ＣＲＬ９８５５およびＣＲＬ９８５６を有するヒト連続
細胞系および該細胞系のすべてのクローン、突然変異体
、修飾体および遺伝子物質。
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