JPH11187867A - 融合細胞株とその取得方法 - Google Patents
融合細胞株とその取得方法Info
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- JPH11187867A JPH11187867A JP10061889A JP6188998A JPH11187867A JP H11187867 A JPH11187867 A JP H11187867A JP 10061889 A JP10061889 A JP 10061889A JP 6188998 A JP6188998 A JP 6188998A JP H11187867 A JPH11187867 A JP H11187867A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヒト細胞株を用いた免疫系の諸現象、すなわ
ちアレルギー、ガンなどのメカニズム解明、それらの疾
病の予防、診断、治療等を目的とした食品機能の検索、
新規医薬品の探索、製造に使用するためのヒト免疫担当
細胞株を取得すること。 【解決手段】 ヒトバーキットリンパ腫由来細胞株Ｒａ
ｊｉ、ヒトＴ細胞性白血病細胞株ＰＥＥＲおよびヒト好
酸球白血病細胞株ＥｏＬｌのいずれかの細胞株から、８
−アザグアニンもしくは６−チオグアニン耐性クローン
を選択し、さらに無血清培養可能にした変異株であるＩ
ＣＬＵ−Ｂ、ＩＣＬＵ−ＴおよびＩＣＬＵ−Ｅのいずれ
かを親細胞株とするヒト免疫担当融合細胞株並びにヒト
細胞融合用親細胞株ＩＣＬＵ−Ｔとヒト免疫担当細胞を
用いて融合細胞を作成する際に、ポリエチレングリコー
ルとレシチンの存在下に行うことを特徴とするヒト免疫
担当融合細胞株の取得方法。
ちアレルギー、ガンなどのメカニズム解明、それらの疾
病の予防、診断、治療等を目的とした食品機能の検索、
新規医薬品の探索、製造に使用するためのヒト免疫担当
細胞株を取得すること。 【解決手段】 ヒトバーキットリンパ腫由来細胞株Ｒａ
ｊｉ、ヒトＴ細胞性白血病細胞株ＰＥＥＲおよびヒト好
酸球白血病細胞株ＥｏＬｌのいずれかの細胞株から、８
−アザグアニンもしくは６−チオグアニン耐性クローン
を選択し、さらに無血清培養可能にした変異株であるＩ
ＣＬＵ−Ｂ、ＩＣＬＵ−ＴおよびＩＣＬＵ−Ｅのいずれ
かを親細胞株とするヒト免疫担当融合細胞株並びにヒト
細胞融合用親細胞株ＩＣＬＵ−Ｔとヒト免疫担当細胞を
用いて融合細胞を作成する際に、ポリエチレングリコー
ルとレシチンの存在下に行うことを特徴とするヒト免疫
担当融合細胞株の取得方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、融合細胞株とその
取得方法に関する。詳しくは、ヒト細胞株を用いた免疫
系の諸現象、すなわちアレルギー、ガンなどのメカニズ
ム解明、それらの疾病の予防、診断、治療等を目的とし
た食品機能の検索、新規医薬品の探索、製造に使用する
ためのヒト免疫担当細胞株の取得に関するものである。
取得方法に関する。詳しくは、ヒト細胞株を用いた免疫
系の諸現象、すなわちアレルギー、ガンなどのメカニズ
ム解明、それらの疾病の予防、診断、治療等を目的とし
た食品機能の検索、新規医薬品の探索、製造に使用する
ためのヒト免疫担当細胞株の取得に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】一般に、ヒトの体内から分離した細胞を
体外で培養するには、困難を伴うことが多い。例えば、
ヒトの体内から分離したリンパ球などの細胞を体外で無
限増殖させることは困難である。通常、これら細胞を培
養液中で培養しても、２週間から数ヶ月程度で死滅して
しまう。ガン細胞や上皮細胞のある種のものは、培地組
成によっては体外での継代培養が可能であるが、研究等
に用いるために必要十分な量を確保することは難しい。
さらに、体内細胞を体外において増殖させるには、細胞
に何らかの刺激を与える必要がある。そのために、培養
液に種々の生理活性物質を添加しなければならないが、
その適切な物質の選択等に問題があり、かなりの労力を
要する。
体外で培養するには、困難を伴うことが多い。例えば、
ヒトの体内から分離したリンパ球などの細胞を体外で無
限増殖させることは困難である。通常、これら細胞を培
養液中で培養しても、２週間から数ヶ月程度で死滅して
しまう。ガン細胞や上皮細胞のある種のものは、培地組
成によっては体外での継代培養が可能であるが、研究等
に用いるために必要十分な量を確保することは難しい。
さらに、体内細胞を体外において増殖させるには、細胞
に何らかの刺激を与える必要がある。そのために、培養
液に種々の生理活性物質を添加しなければならないが、
その適切な物質の選択等に問題があり、かなりの労力を
要する。
【０００３】近年では、このような問題点を解消する方
法として、目的とする細胞に発ガン物質等の薬剤を添加
したり、紫外線や放射線を照射する等の処理を行い、目
的の細胞に突然変異を生じさせる（トランスフォーム）
方法が提案されている。このような処理を行うことによ
り、無限増殖が可能な細胞株（変異株）を取得すること
ができる。また、遺伝子導入法（細胞に特定の遺伝子を
導入する方法）を用いて、株化したい細胞に、不死化遺
伝子を導入して形質転換を生じさせ、無限増殖する細胞
を取得する方法も報告されている。
法として、目的とする細胞に発ガン物質等の薬剤を添加
したり、紫外線や放射線を照射する等の処理を行い、目
的の細胞に突然変異を生じさせる（トランスフォーム）
方法が提案されている。このような処理を行うことによ
り、無限増殖が可能な細胞株（変異株）を取得すること
ができる。また、遺伝子導入法（細胞に特定の遺伝子を
導入する方法）を用いて、株化したい細胞に、不死化遺
伝子を導入して形質転換を生じさせ、無限増殖する細胞
を取得する方法も報告されている。
【０００４】さらに、このようにトランスフォームを利
用した方法のほかに、リンパ球などのように体内で抗体
や免疫調節因子（リンフォカイン）を産生する細胞を、
無限増殖する細胞と融合して、体外でもその抗体や免疫
調節因子を産生する融合細胞（ハイブリドーマ）として
樹立する方法も知られている。
用した方法のほかに、リンパ球などのように体内で抗体
や免疫調節因子（リンフォカイン）を産生する細胞を、
無限増殖する細胞と融合して、体外でもその抗体や免疫
調節因子を産生する融合細胞（ハイブリドーマ）として
樹立する方法も知られている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
の従来の方法では、次のような問題点があった。まず、
薬剤を添加する方法や紫外線等の照射を利用する方法に
おいては、獲得した変異形質およびその他の細胞機能が
安定した細胞株として樹立するために、数カ月から数年
もの長期間を要し、樹立した細胞株が利用できるように
なるまでにかなりの期間が必要であった。また、処理に
供した細胞数あたりの取得される変異株数（変異効率）
が低く、目的細胞を容易に株化することが困難であっ
た。
の従来の方法では、次のような問題点があった。まず、
薬剤を添加する方法や紫外線等の照射を利用する方法に
おいては、獲得した変異形質およびその他の細胞機能が
安定した細胞株として樹立するために、数カ月から数年
もの長期間を要し、樹立した細胞株が利用できるように
なるまでにかなりの期間が必要であった。また、処理に
供した細胞数あたりの取得される変異株数（変異効率）
が低く、目的細胞を容易に株化することが困難であっ
た。
【０００６】また、細胞融合によって株化する方法は、
モノクローナル抗体やリンフォカイン等の細胞由来物質
の安定生産系としては有用である。しかしながら、この
方法で得られる融合細胞株は、生体内で生じる種々の免
疫反応に対しては、その細胞応答が低下もしくは消失し
ていると言われている。したがって、これらの方法を用
いても、生体内での細胞の相互作用を生体外でも再現可
能な樹立細胞系として用いるためには多くの困難が伴っ
た。
モノクローナル抗体やリンフォカイン等の細胞由来物質
の安定生産系としては有用である。しかしながら、この
方法で得られる融合細胞株は、生体内で生じる種々の免
疫反応に対しては、その細胞応答が低下もしくは消失し
ていると言われている。したがって、これらの方法を用
いても、生体内での細胞の相互作用を生体外でも再現可
能な樹立細胞系として用いるためには多くの困難が伴っ
た。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、株化細胞
の取得法について検討を重ね、細胞融合法による株化が
その他の方法に比較して、細胞をトランスフォームさせ
る効率が比較的高い点に着目した。ただし、細胞融合し
て得られる株細胞の性質は、融合に供した生体由来の免
疫担当細胞ばかりでなく、他方のパートナーであるヒト
親細胞株に大きく依存していることが知られている。
の取得法について検討を重ね、細胞融合法による株化が
その他の方法に比較して、細胞をトランスフォームさせ
る効率が比較的高い点に着目した。ただし、細胞融合し
て得られる株細胞の性質は、融合に供した生体由来の免
疫担当細胞ばかりでなく、他方のパートナーであるヒト
親細胞株に大きく依存していることが知られている。
【０００８】そこで、種々のヒト由来の免疫担当細胞を
細胞機能を保持したまま効率よく株化するために、本発
明者らは親細胞株について研究し、変異株であるヒトバ
ーキットリンパ腫由来細胞株ＩＣＬＵ−Ｂ、ヒトＴ細胞
性白血病細胞株ＩＣＬＵ−Ｔおよびヒト好酸球白血病細
胞株ＩＣＬＵ−Ｅの３種を樹立した。これらのヒト親細
胞株を用いて、生体内の各種ヒト免疫担当細胞と細胞融
合することにより得られる融合細胞は、それらの細胞が
生体内で有していたと考えられる細胞機能を保持する性
質を残していることが分かった。
細胞機能を保持したまま効率よく株化するために、本発
明者らは親細胞株について研究し、変異株であるヒトバ
ーキットリンパ腫由来細胞株ＩＣＬＵ−Ｂ、ヒトＴ細胞
性白血病細胞株ＩＣＬＵ−Ｔおよびヒト好酸球白血病細
胞株ＩＣＬＵ−Ｅの３種を樹立した。これらのヒト親細
胞株を用いて、生体内の各種ヒト免疫担当細胞と細胞融
合することにより得られる融合細胞は、それらの細胞が
生体内で有していたと考えられる細胞機能を保持する性
質を残していることが分かった。
【０００９】また、これらの細胞融合用親細胞株のう
ち、ＩＣＬＵ−Ｔは、よく知られている細胞融合促進剤
（ポリエチレングリコール、以下ＰＥＧと記載する。）
および融合細胞のみを増殖させる融合細胞選択培地（Ｈ
ＡＴ培地）では、効率的な細胞融合を行うことは不可能
であることが判明した。そこで、本発明者らは、ＩＣＬ
Ｕ−Ｔを親細胞株として利用し、融合細胞を得るための
手段について検討した結果、ＰＥＧとリン脂質であるレ
シチンを混合した融合促進剤を開発すると共に、ヒポキ
サンチンとアメソプテリンで構成される選択培地を開発
した。その結果、これらを用いることにより、効率よく
細胞融合を行うことができることを見出した。なお、本
発明で用いるヒト細胞融合用親細胞株ＩＣＬＵ−Ｂ、Ｉ
ＣＬＵ−ＴおよびＩＣＬＵ−Ｅは、必ずしも免疫担当細
胞とのみ融合可能なわけではなく、その他の組織由来の
細胞とも融合可能である。
ち、ＩＣＬＵ−Ｔは、よく知られている細胞融合促進剤
（ポリエチレングリコール、以下ＰＥＧと記載する。）
および融合細胞のみを増殖させる融合細胞選択培地（Ｈ
ＡＴ培地）では、効率的な細胞融合を行うことは不可能
であることが判明した。そこで、本発明者らは、ＩＣＬ
Ｕ−Ｔを親細胞株として利用し、融合細胞を得るための
手段について検討した結果、ＰＥＧとリン脂質であるレ
シチンを混合した融合促進剤を開発すると共に、ヒポキ
サンチンとアメソプテリンで構成される選択培地を開発
した。その結果、これらを用いることにより、効率よく
細胞融合を行うことができることを見出した。なお、本
発明で用いるヒト細胞融合用親細胞株ＩＣＬＵ−Ｂ、Ｉ
ＣＬＵ−ＴおよびＩＣＬＵ−Ｅは、必ずしも免疫担当細
胞とのみ融合可能なわけではなく、その他の組織由来の
細胞とも融合可能である。
【００１０】請求項１記載の本発明は、ヒトバーキット
リンパ腫由来細胞株Ｒａｊｉ、ヒトＴ細胞性白血病細胞
株ＰＥＥＲおよびヒト好酸球白血病細胞株ＥｏＬｌのい
ずれかの細胞株から、８−アザグアニンもしくは６−チ
オグアニン耐性クローンを選択し、さらに無血清培養可
能にした変異株であるＩＣＬＵ−Ｂ、ＩＣＬＵ−Ｔおよ
びＩＣＬＵ−Ｅのいずれかを親細胞株とするヒト免疫担
当融合細胞株である。
リンパ腫由来細胞株Ｒａｊｉ、ヒトＴ細胞性白血病細胞
株ＰＥＥＲおよびヒト好酸球白血病細胞株ＥｏＬｌのい
ずれかの細胞株から、８−アザグアニンもしくは６−チ
オグアニン耐性クローンを選択し、さらに無血清培養可
能にした変異株であるＩＣＬＵ−Ｂ、ＩＣＬＵ−Ｔおよ
びＩＣＬＵ−Ｅのいずれかを親細胞株とするヒト免疫担
当融合細胞株である。
【００１１】また、請求項２記載の本発明は、ヒト細胞
融合用親細胞株ＩＣＬＵ−Ｔとヒト免疫担当細胞を用い
て融合細胞を作成する際に、ＰＥＧとレシチンの存在下
に行うことを特徴とするヒト免疫担当融合細胞株の取得
方法である。
融合用親細胞株ＩＣＬＵ−Ｔとヒト免疫担当細胞を用い
て融合細胞を作成する際に、ＰＥＧとレシチンの存在下
に行うことを特徴とするヒト免疫担当融合細胞株の取得
方法である。
【００１２】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
融合細胞の性質は、前記したように、融合に供した生体
由来の免疫細胞だけでなく、親細胞株にも大きく依存し
ている。そこで、本発明者らは、種々のヒト由来の免疫
担当細胞を細胞機能を保持したまま効率よく株化するた
めに用いることができるヒト細胞融合用親細胞株を樹立
した。すなわち、ヒト免疫細胞由来細胞から、次のよう
にして親細胞株を取得した。既に樹立されているヒト細
胞株であるヒトバーキットリンパ腫由来細胞株（Ｒａｊ
ｉ）およびヒト好酸球白血病細胞株（ＥｏＬ−１）を、
６−チオグアニン（終濃度３０μg/ml）と１０％牛胎児
血清（以下、ＦＢＳと記載する。）を含むＥＲＤＦ培地
（極東製薬工業（株）製）で培養した。なお、１０％の
濃度でＦＢＳを添加したＥＲＤＦ培地を、以下１０％Ｆ
ＢＳ−ＥＲＤＦ培地と記載する。ヒトＴ細胞性白血病細
胞株（ＰＥＥＲ）は８−アザグアニン（終濃度２０μg/
ml）を含む１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地で培養した。
融合細胞の性質は、前記したように、融合に供した生体
由来の免疫細胞だけでなく、親細胞株にも大きく依存し
ている。そこで、本発明者らは、種々のヒト由来の免疫
担当細胞を細胞機能を保持したまま効率よく株化するた
めに用いることができるヒト細胞融合用親細胞株を樹立
した。すなわち、ヒト免疫細胞由来細胞から、次のよう
にして親細胞株を取得した。既に樹立されているヒト細
胞株であるヒトバーキットリンパ腫由来細胞株（Ｒａｊ
ｉ）およびヒト好酸球白血病細胞株（ＥｏＬ−１）を、
６−チオグアニン（終濃度３０μg/ml）と１０％牛胎児
血清（以下、ＦＢＳと記載する。）を含むＥＲＤＦ培地
（極東製薬工業（株）製）で培養した。なお、１０％の
濃度でＦＢＳを添加したＥＲＤＦ培地を、以下１０％Ｆ
ＢＳ−ＥＲＤＦ培地と記載する。ヒトＴ細胞性白血病細
胞株（ＰＥＥＲ）は８−アザグアニン（終濃度２０μg/
ml）を含む１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地で培養した。
【００１３】３週間程度培養した後、増殖してきたクロ
ーンを分取し、クローニングを行った。クローニング
は、９６穴培養プレートの１穴につき１個の細胞が入る
ように、１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地を用いて細胞懸濁
液を稀釈して巻き込む限界稀釈法に従った。９６穴培養
プレートに細胞をまきこんで２４〜３０時間後に、プレ
ートの各穴を検鏡し、細胞が２個になっている穴に印を
いれた。さらに、２４〜３０時間後（すなわち、まきこ
んでから４８〜６０時間後）に、印がついている穴を検
鏡し、細胞が４個になっている穴に印をいれた。まきこ
んでから２０日後に、２つの印がついている穴を検鏡
し、細胞が増殖していることを確認して細胞数を血球計
算板で計測した。最も細胞数が多かった穴の細胞を、さ
らに上記と同様の方法で再クローニングした。
ーンを分取し、クローニングを行った。クローニング
は、９６穴培養プレートの１穴につき１個の細胞が入る
ように、１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地を用いて細胞懸濁
液を稀釈して巻き込む限界稀釈法に従った。９６穴培養
プレートに細胞をまきこんで２４〜３０時間後に、プレ
ートの各穴を検鏡し、細胞が２個になっている穴に印を
いれた。さらに、２４〜３０時間後（すなわち、まきこ
んでから４８〜６０時間後）に、印がついている穴を検
鏡し、細胞が４個になっている穴に印をいれた。まきこ
んでから２０日後に、２つの印がついている穴を検鏡
し、細胞が増殖していることを確認して細胞数を血球計
算板で計測した。最も細胞数が多かった穴の細胞を、さ
らに上記と同様の方法で再クローニングした。
【００１４】親細胞株が樹立された後、細胞融合で得ら
れる融合細胞が無血清培養可能となるように、クローニ
ングで得られたクローンをインスリン（終濃度１０μg/
ml）、トランスフェリン（終濃度２０μg/ml）、エタノ
ールアミン（終濃度２０μＭ）、亜セレン酸ナトリウム
（終濃度２５ｎＭ）を含むＥＲＤＦ培地（極東製薬工業
（株）製）で、９６穴培養プレートに、１穴につき１個
の細胞が入るように稀釈して２週間程度培養した。増殖
してきた各穴の細胞数を計測し、最も細胞数が多かった
順に各穴の細胞の一部をアミノプテリン（終濃度０．４
ｍＭ）を含む１５％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地で培養した。
培養後３日目〜５日目に検鏡し、細胞が死滅したクロー
ンの３、４株を親細胞株の候補として樹立した。
れる融合細胞が無血清培養可能となるように、クローニ
ングで得られたクローンをインスリン（終濃度１０μg/
ml）、トランスフェリン（終濃度２０μg/ml）、エタノ
ールアミン（終濃度２０μＭ）、亜セレン酸ナトリウム
（終濃度２５ｎＭ）を含むＥＲＤＦ培地（極東製薬工業
（株）製）で、９６穴培養プレートに、１穴につき１個
の細胞が入るように稀釈して２週間程度培養した。増殖
してきた各穴の細胞数を計測し、最も細胞数が多かった
順に各穴の細胞の一部をアミノプテリン（終濃度０．４
ｍＭ）を含む１５％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地で培養した。
培養後３日目〜５日目に検鏡し、細胞が死滅したクロー
ンの３、４株を親細胞株の候補として樹立した。
【００１５】得られた親細胞株の候補となるクローンを
用いて実際に細胞融合した。その結果、使用した各クロ
ーンの細胞数を１０5 細胞としたときの取得した融合細
胞数（融合効率）を指標として、この値が最も高いクロ
ーンを樹立親細胞株とした。このようにして樹立した３
種の親細胞株、すなわちＲａｊｉ由来の親細胞株をヒト
バーキットリンパ腫由来細胞株（ＩＣＬＵ−Ｂ）、ＰＥ
ＥＲ由来の親細胞株をヒトＴ細胞性白血病細胞株（ＩＣ
ＬＵ−Ｔ）、ＥｏＬ−１由来の親細胞株をヒト好酸球白
血病細胞株（ＩＣＬＵ−Ｅ）と命名した。このようにし
て樹立された親細胞株は、工業技術院生命工学工業技術
研究所に寄託されており、それらの受託番号は、ＩＣＬ
Ｕ−ＢがＦＥＲＭ ＢＰ−６２５３、ＩＣＬＵ−ＴがＦ
ＥＲＭ ＢＰ−６２５５、ＩＣＬＵ−ＥがＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−６２５４である。これらの親細胞株を、ヒト末梢血
リンパ球のようなヒト免疫担当細胞と融合操作を行うこ
とにより、請求項１記載の融合細胞株を得ることができ
る。
用いて実際に細胞融合した。その結果、使用した各クロ
ーンの細胞数を１０5 細胞としたときの取得した融合細
胞数（融合効率）を指標として、この値が最も高いクロ
ーンを樹立親細胞株とした。このようにして樹立した３
種の親細胞株、すなわちＲａｊｉ由来の親細胞株をヒト
バーキットリンパ腫由来細胞株（ＩＣＬＵ−Ｂ）、ＰＥ
ＥＲ由来の親細胞株をヒトＴ細胞性白血病細胞株（ＩＣ
ＬＵ−Ｔ）、ＥｏＬ−１由来の親細胞株をヒト好酸球白
血病細胞株（ＩＣＬＵ−Ｅ）と命名した。このようにし
て樹立された親細胞株は、工業技術院生命工学工業技術
研究所に寄託されており、それらの受託番号は、ＩＣＬ
Ｕ−ＢがＦＥＲＭ ＢＰ−６２５３、ＩＣＬＵ−ＴがＦ
ＥＲＭ ＢＰ−６２５５、ＩＣＬＵ−ＥがＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−６２５４である。これらの親細胞株を、ヒト末梢血
リンパ球のようなヒト免疫担当細胞と融合操作を行うこ
とにより、請求項１記載の融合細胞株を得ることができ
る。
【００１６】親細胞株とヒト免疫担当細胞との融合操作
は、例えば以下のようにして行うことができる。まず、
上記の親細胞株のいずれかと、ヒト免疫担当細胞とを混
合する。ここで、親細胞株と融合させる他方のヒト免疫
担当細胞としては、ヒトリンパ球などのヒトの生体内で
免疫機能を有する細胞であればいずれも使用できる。親
細胞株に対するヒト免疫担当細胞の使用割合は、例えば
親細胞株としてＩＣＬＵ−Ｂを使用する場合は１．５〜
２倍程度、ＩＣＬＵ−Ｔを使用する場合は０．８〜１．
２倍、ＩＣＬＵ−Ｅを使用する場合は１〜１．５倍程度
とするのが好ましい。
は、例えば以下のようにして行うことができる。まず、
上記の親細胞株のいずれかと、ヒト免疫担当細胞とを混
合する。ここで、親細胞株と融合させる他方のヒト免疫
担当細胞としては、ヒトリンパ球などのヒトの生体内で
免疫機能を有する細胞であればいずれも使用できる。親
細胞株に対するヒト免疫担当細胞の使用割合は、例えば
親細胞株としてＩＣＬＵ−Ｂを使用する場合は１．５〜
２倍程度、ＩＣＬＵ−Ｔを使用する場合は０．８〜１．
２倍、ＩＣＬＵ−Ｅを使用する場合は１〜１．５倍程度
とするのが好ましい。
【００１７】また、ヒト免疫担当細胞の代わりに、その
他のヒト組織由来の細胞、例えばヒトガン細胞などを用
いて融合させることも可能である。ガン細胞を用いる場
合、該細胞の由来する組織の種類は特に限定されず、例
えば胃ガン細胞や乳ガン細胞など、いずれも同じように
使用することができる。この場合、親細胞株に対するこ
れら細胞の使用割合は、上記と同様でよい。
他のヒト組織由来の細胞、例えばヒトガン細胞などを用
いて融合させることも可能である。ガン細胞を用いる場
合、該細胞の由来する組織の種類は特に限定されず、例
えば胃ガン細胞や乳ガン細胞など、いずれも同じように
使用することができる。この場合、親細胞株に対するこ
れら細胞の使用割合は、上記と同様でよい。
【００１８】親細胞株とヒト免疫担当細胞等の混合物を
遠心分離することにより、培養上清と細胞ペレットとに
分離し、このうちの培養上清を除去する。残った細胞ペ
レットに、融合促進剤であるＰＥＧを基本合成培地で希
釈したもの（通常は、４０〜５０％に希釈）を添加す
る。ここで用いる培地としては、例えば基本合成培地と
してＥＲＤＦ培地、ＲＰＭ１１６４０培地、ダルベッコ
変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）などが使用可能である。
これらの培地と共に、成長因子として牛胎児血清（ＦＢ
Ｓ）を併用したり、インスリン、トランスフェリン、エ
タノールアミン、亜セレン酸ナトリウムなどの無血清培
養用成長因子を併用することもできる。また、融合促進
剤であるＰＥＧとしては、平均分子量が4,０００〜6,０
００程度のものを使用できるが、融合効率の点から平均
分子量4,０００程度のものが好ましく、ＩＣＬＵ−Ｔの
場合は平均分子量4,０００程度のものが特に好ましい。
遠心分離することにより、培養上清と細胞ペレットとに
分離し、このうちの培養上清を除去する。残った細胞ペ
レットに、融合促進剤であるＰＥＧを基本合成培地で希
釈したもの（通常は、４０〜５０％に希釈）を添加す
る。ここで用いる培地としては、例えば基本合成培地と
してＥＲＤＦ培地、ＲＰＭ１１６４０培地、ダルベッコ
変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）などが使用可能である。
これらの培地と共に、成長因子として牛胎児血清（ＦＢ
Ｓ）を併用したり、インスリン、トランスフェリン、エ
タノールアミン、亜セレン酸ナトリウムなどの無血清培
養用成長因子を併用することもできる。また、融合促進
剤であるＰＥＧとしては、平均分子量が4,０００〜6,０
００程度のものを使用できるが、融合効率の点から平均
分子量4,０００程度のものが好ましく、ＩＣＬＵ−Ｔの
場合は平均分子量4,０００程度のものが特に好ましい。
【００１９】ところで、親細胞株としてＩＣＬＵ−Ｔ細
胞を用いた場合は、融合促進剤としてＰＥＧにレシチン
を混合したものを使用する必要がある。ＰＥＧにレシチ
ンを混合せずに、ＩＣＬＵ−Ｔ細胞の細胞融合操作を行
った場合、ＩＣＬＵ−Ｔの細胞膜破壊が顕著に生じ、残
存する生細胞数が減少する上に、目的とする融合細胞を
効率よく得ることができない。レシチンは、細胞膜の主
たる構成成分であるリン脂質の一種である。このレシチ
ンを混合すると、ＩＣＬＵ−Ｔ細胞を用いた融合操作を
行った場合に、細胞膜の主成分であるリン脂質を保護
し、ＰＥＧによる細胞膜破壊を極力抑えることができ
る。
胞を用いた場合は、融合促進剤としてＰＥＧにレシチン
を混合したものを使用する必要がある。ＰＥＧにレシチ
ンを混合せずに、ＩＣＬＵ−Ｔ細胞の細胞融合操作を行
った場合、ＩＣＬＵ−Ｔの細胞膜破壊が顕著に生じ、残
存する生細胞数が減少する上に、目的とする融合細胞を
効率よく得ることができない。レシチンは、細胞膜の主
たる構成成分であるリン脂質の一種である。このレシチ
ンを混合すると、ＩＣＬＵ−Ｔ細胞を用いた融合操作を
行った場合に、細胞膜の主成分であるリン脂質を保護
し、ＰＥＧによる細胞膜破壊を極力抑えることができ
る。
【００２０】培地で希釈された融合促進剤を添加した細
胞ペレットを遠心分離した後、該細胞ペレットの中から
融合細胞を選択する。ＩＣＬＵ−ＢまたはＩＣＬＵ−Ｅ
を親細胞株として用いた場合の融合細胞の選択は、一般
に良く知られているヒポキサンチン、アミノプテリン
（代わりにアメソプテリンでもよい。以下、同じ）、チ
ミジンを含む培地で構成された選択培地（例えば、１５
％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地）で行うことができる。融合開
始から２４〜３０時間後に、ヒポキサンチン、アミノプ
テリン、チミジンを含む選択培地を添加する。この場合
に限り、選択培地中のこれら物質の濃度を２倍とする。
その後は、数日おきに、当初の選択培地と同濃度の培地
を半量ずつ交換する。このようにして２週間程度培養す
ることにより、融合細胞を取得することができる。
胞ペレットを遠心分離した後、該細胞ペレットの中から
融合細胞を選択する。ＩＣＬＵ−ＢまたはＩＣＬＵ−Ｅ
を親細胞株として用いた場合の融合細胞の選択は、一般
に良く知られているヒポキサンチン、アミノプテリン
（代わりにアメソプテリンでもよい。以下、同じ）、チ
ミジンを含む培地で構成された選択培地（例えば、１５
％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地）で行うことができる。融合開
始から２４〜３０時間後に、ヒポキサンチン、アミノプ
テリン、チミジンを含む選択培地を添加する。この場合
に限り、選択培地中のこれら物質の濃度を２倍とする。
その後は、数日おきに、当初の選択培地と同濃度の培地
を半量ずつ交換する。このようにして２週間程度培養す
ることにより、融合細胞を取得することができる。
【００２１】一方、ＩＣＬＵ−Ｔを親細胞株として用い
た場合の融合細胞の選択も、基本的には上記の手順と同
じである。しかし、この場合は、ヒポキサンチンおよび
アミノプテリンを含むが、チミジンを含まない培地で構
成された選択培地を使用する点で、ＩＣＬＵ−Ｂまたは
ＩＣＬＵ−Ｅの場合とは異なる。ＩＣＬＵ−Ｔ細胞を親
細胞とする場合、選択培地にチミジンが存在すると、増
殖阻害が生じるため、チミジンの添加を避けるべきであ
る。融合後２４〜３０時間経過した後、懸濁液にヒポキ
サンチンとアミノプテリンを含有した選択培地（例え
ば、１５％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地）を添加する。この培
地は、上記と同様に、数日おきに半量ずつ交換する。こ
のようにして２週間程度培養することにより、融合細胞
を取得することができる。各親細胞から融合操作を経て
得られる融合細胞は、生体内において当該免疫担当細胞
が発現していた特定の免疫反応（細胞機能）を、生体外
でもそのまま保持することができる。
た場合の融合細胞の選択も、基本的には上記の手順と同
じである。しかし、この場合は、ヒポキサンチンおよび
アミノプテリンを含むが、チミジンを含まない培地で構
成された選択培地を使用する点で、ＩＣＬＵ−Ｂまたは
ＩＣＬＵ−Ｅの場合とは異なる。ＩＣＬＵ−Ｔ細胞を親
細胞とする場合、選択培地にチミジンが存在すると、増
殖阻害が生じるため、チミジンの添加を避けるべきであ
る。融合後２４〜３０時間経過した後、懸濁液にヒポキ
サンチンとアミノプテリンを含有した選択培地（例え
ば、１５％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地）を添加する。この培
地は、上記と同様に、数日おきに半量ずつ交換する。こ
のようにして２週間程度培養することにより、融合細胞
を取得することができる。各親細胞から融合操作を経て
得られる融合細胞は、生体内において当該免疫担当細胞
が発現していた特定の免疫反応（細胞機能）を、生体外
でもそのまま保持することができる。
【００２２】
【実施例】次に、本発明を詳細に説明するために代表的
な実施例を挙げるが、本発明はこれらに限定されるもの
ではない。 実施例１〔ＩＣＬＵ−Ｂを用いたヒトリンパ球の株化〕 親細胞株ＩＣＬＵ−Ｂ（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２５３）
１×１07個と、ヒト末梢血リンパ球２×１07個とを混合
した。この混合物を遠心分離し、培養上清と細胞ペレッ
トとに分離した後、培養上清を除去した。残った細胞ペ
レットに、ＥＲＤＦ培地（極東製薬工業（株）製）で希
釈した５０％ＰＥＧ（平均分子量4,０００）を１ｍｌ添
加した。さらに、ＥＲＤＦ培地９ｍｌを添加して全量を
１０ｍｌとした。これを再び遠心分離し、得られた細胞
のペレットをＥＲＤＦ培地８５％、牛胎児血清１５％に
なるように調製された１５％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地５０
ｍｌで懸濁した。懸濁液は、９６穴培養プレートの各穴
に１００μｌずつ添加した。融合操作の翌日に、４００
μＭヒポキサンチン、0.８μＭアメソプテリン、３２μ
Ｍチミジン含有１５％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地を、９６穴
培養プレートの各穴に１００μｌずつ添加した。この
後、２、３日おきに、２００μＭヒポキサンチン、0.４
μＭアメソプテリン、１６μＭチミジン含有１５％ＦＢ
Ｓ−ＥＲＤＦ培地と半量ずつ培地交換した。培養を開始
してから２週間程度経過後に、形成されたＩＣＬＵ−Ｂ
とヒト末梢血リンパ球との融合細胞の出現ウェル数およ
び融合効率を測定した。結果を第１表に示す。また、Ｉ
ＣＬＵ−Ｂ（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２５３） ３×１06個
と、ヒト末梢血リンパ球６×１06個とを用いたこと以外
は、上記と同様にして細胞融合を行った。この結果も第
１表に示す。
な実施例を挙げるが、本発明はこれらに限定されるもの
ではない。 実施例１〔ＩＣＬＵ−Ｂを用いたヒトリンパ球の株化〕 親細胞株ＩＣＬＵ−Ｂ（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２５３）
１×１07個と、ヒト末梢血リンパ球２×１07個とを混合
した。この混合物を遠心分離し、培養上清と細胞ペレッ
トとに分離した後、培養上清を除去した。残った細胞ペ
レットに、ＥＲＤＦ培地（極東製薬工業（株）製）で希
釈した５０％ＰＥＧ（平均分子量4,０００）を１ｍｌ添
加した。さらに、ＥＲＤＦ培地９ｍｌを添加して全量を
１０ｍｌとした。これを再び遠心分離し、得られた細胞
のペレットをＥＲＤＦ培地８５％、牛胎児血清１５％に
なるように調製された１５％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地５０
ｍｌで懸濁した。懸濁液は、９６穴培養プレートの各穴
に１００μｌずつ添加した。融合操作の翌日に、４００
μＭヒポキサンチン、0.８μＭアメソプテリン、３２μ
Ｍチミジン含有１５％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地を、９６穴
培養プレートの各穴に１００μｌずつ添加した。この
後、２、３日おきに、２００μＭヒポキサンチン、0.４
μＭアメソプテリン、１６μＭチミジン含有１５％ＦＢ
Ｓ−ＥＲＤＦ培地と半量ずつ培地交換した。培養を開始
してから２週間程度経過後に、形成されたＩＣＬＵ−Ｂ
とヒト末梢血リンパ球との融合細胞の出現ウェル数およ
び融合効率を測定した。結果を第１表に示す。また、Ｉ
ＣＬＵ−Ｂ（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２５３） ３×１06個
と、ヒト末梢血リンパ球６×１06個とを用いたこと以外
は、上記と同様にして細胞融合を行った。この結果も第
１表に示す。
【００２３】次に、得られた融合細胞株の性質を、下記
のようにして検討した。まず、蛍光標識した抗Ｂ細胞抗
体、抗Ｔ細胞抗体および抗単球抗体を用いて、融合細胞
がいずれの抗体に反応するかを検討した。この判別結果
により、融合細胞が、Ｂ細胞性、Ｔ細胞性および単球性
のいずれであるかを知ることができる。この抗体による
検討の結果、融合細胞がＢ細胞性であった場合は、抗体
（Ｉｇ）産生能を有するか否かについてさらに検討し
た。また、融合細胞がＴ細胞性であった場合は、さらに
どのようなサブクラスに分類されるかについて検討し
た。融合細胞が単球性であった場合は、食細胞作用等を
有するかについても検討した。上記２回の融合操作によ
り得られた融合細胞の細胞種とその比率等の平均値を第
２表に示す
のようにして検討した。まず、蛍光標識した抗Ｂ細胞抗
体、抗Ｔ細胞抗体および抗単球抗体を用いて、融合細胞
がいずれの抗体に反応するかを検討した。この判別結果
により、融合細胞が、Ｂ細胞性、Ｔ細胞性および単球性
のいずれであるかを知ることができる。この抗体による
検討の結果、融合細胞がＢ細胞性であった場合は、抗体
（Ｉｇ）産生能を有するか否かについてさらに検討し
た。また、融合細胞がＴ細胞性であった場合は、さらに
どのようなサブクラスに分類されるかについて検討し
た。融合細胞が単球性であった場合は、食細胞作用等を
有するかについても検討した。上記２回の融合操作によ
り得られた融合細胞の細胞種とその比率等の平均値を第
２表に示す
【００２４】実施例２〔ＩＣＬＵ−Ｔを用いたヒトリン
パ球の株化〕 ＩＣＬＵ−Ｔ（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２５５）を４×１06
個、ヒト末梢血リンパ球を４×１06個で混合した。この
混合物を遠心分離し、培養上清と細胞ペレットとに分離
した後、培養上清を除去した。細胞ペレットに基本培地
であるＥＲＤＦ培地（極東製薬工業（株）製）と１％レ
シチンで調製した４０％ＰＥＧ（平均分子量：４００
０）を１ｍｌ添加した。さらに、ＥＲＤＦ培地９ｍｌを
添加して、全量を１０ｍｌとした。これを再び遠心分離
して得られた細胞のペレットを、ＥＲＤＦ培地８５％、
ＦＢＳ１５％になるように調製された１５％ＦＢＳ−Ｅ
ＲＤＦ培地２５ｍｌで懸濁した。懸濁液は、９６穴培養
プレートの各穴に１００μｌずつ添加した。この融合操
作の４日後に、１３３μＭヒポキサンチン、0.２６μＭ
アメソプテリン含有１５％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地を９６
穴培養プレートの各穴に１００μｌずつ添加した。次い
で、４、５日おきに、６７μＭヒポキサンチン、0.１３
μＭアメソプテリン含有１５％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地と
半量ずつ培地交換した。培養開始から２週間程度経過後
に、形成されたＩＣＬＵ−Ｔとヒト末梢血リンパ球との
融合細胞の出現ウェル数および融合効率を測定した。結
果を第１表に示す。また、ＩＣＬＵ−Ｔ（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−６２５５） ５×１06個とヒト末梢血リンパ球５×
１06個とを用いたこと以外は、上記と同様の条件で細胞
融合を行った。その結果も第１表に示す。さらに、得ら
れた融合細胞株の性質について、実施例１と同様にして
検討した結果を第２表に示す。
パ球の株化〕 ＩＣＬＵ−Ｔ（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２５５）を４×１06
個、ヒト末梢血リンパ球を４×１06個で混合した。この
混合物を遠心分離し、培養上清と細胞ペレットとに分離
した後、培養上清を除去した。細胞ペレットに基本培地
であるＥＲＤＦ培地（極東製薬工業（株）製）と１％レ
シチンで調製した４０％ＰＥＧ（平均分子量：４００
０）を１ｍｌ添加した。さらに、ＥＲＤＦ培地９ｍｌを
添加して、全量を１０ｍｌとした。これを再び遠心分離
して得られた細胞のペレットを、ＥＲＤＦ培地８５％、
ＦＢＳ１５％になるように調製された１５％ＦＢＳ−Ｅ
ＲＤＦ培地２５ｍｌで懸濁した。懸濁液は、９６穴培養
プレートの各穴に１００μｌずつ添加した。この融合操
作の４日後に、１３３μＭヒポキサンチン、0.２６μＭ
アメソプテリン含有１５％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地を９６
穴培養プレートの各穴に１００μｌずつ添加した。次い
で、４、５日おきに、６７μＭヒポキサンチン、0.１３
μＭアメソプテリン含有１５％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地と
半量ずつ培地交換した。培養開始から２週間程度経過後
に、形成されたＩＣＬＵ−Ｔとヒト末梢血リンパ球との
融合細胞の出現ウェル数および融合効率を測定した。結
果を第１表に示す。また、ＩＣＬＵ−Ｔ（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−６２５５） ５×１06個とヒト末梢血リンパ球５×
１06個とを用いたこと以外は、上記と同様の条件で細胞
融合を行った。その結果も第１表に示す。さらに、得ら
れた融合細胞株の性質について、実施例１と同様にして
検討した結果を第２表に示す。
【００２５】実施例３〔ＩＣＬＵ−Ｅを用いたヒトリン
パ球の株化〕 ＩＣＬＵ−Ｅ（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２５４） １×１07
個とヒト末梢血リンパ球１×１07個とを混合した。この
混合物を遠心分離し、培養上清と細胞ペレットとに分離
した後、培養上清を除去した。残った細胞ペレットに、
ＥＲＤＦ培地で希釈した４０％ＰＥＧ（平均分子量：４
０００）を１ｍｌ添加した。さらに、ＥＲＤＦ培地（極
東製薬工業（株）製）９ｍｌを添加して全量を１０ｍｌ
とした。これを再び遠心分離し、得られた細胞のペレッ
トを、ＥＲＤＦ培地８５％、ＦＢＳ１５％となるように
調製した１５％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地５０μｌで懸濁し
た。懸濁液は、９６穴培養プレートの各穴に１００μｌ
ずつ添加した。融合操作の翌日に、４００μＭヒポキサ
ンチン、0.８μＭアメソプテリン、３２μＭチミジン含
有１５％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地を、９６穴培養プレート
の各穴に１００μｌずつ添加した。２、３日おきに、２
００μＭヒポキサンチン、0.４μＭアメソプテリン、１
６μＭチミジン含有１５％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地と半量
ずつ培地交換した。培養開始から２週間程度経過後に、
形成されたＩＣＬＵ−Ｂとヒト末梢血リンパ球との融合
細胞の出現ウェル数および融合効率を測定し、その結果
を第１表に示した。また、ＩＣＬＵ−Ｅ（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−６２５４）の数を７×１06個、ヒト末梢血リンパ球
７×１06個としたこと以外は同様に融合操作を行った。
結果を第１表に示す。さらに、得られた融合細胞株の性
質を、実施例１と同様にして検討した結果を第２表に示
す。
パ球の株化〕 ＩＣＬＵ−Ｅ（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２５４） １×１07
個とヒト末梢血リンパ球１×１07個とを混合した。この
混合物を遠心分離し、培養上清と細胞ペレットとに分離
した後、培養上清を除去した。残った細胞ペレットに、
ＥＲＤＦ培地で希釈した４０％ＰＥＧ（平均分子量：４
０００）を１ｍｌ添加した。さらに、ＥＲＤＦ培地（極
東製薬工業（株）製）９ｍｌを添加して全量を１０ｍｌ
とした。これを再び遠心分離し、得られた細胞のペレッ
トを、ＥＲＤＦ培地８５％、ＦＢＳ１５％となるように
調製した１５％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地５０μｌで懸濁し
た。懸濁液は、９６穴培養プレートの各穴に１００μｌ
ずつ添加した。融合操作の翌日に、４００μＭヒポキサ
ンチン、0.８μＭアメソプテリン、３２μＭチミジン含
有１５％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地を、９６穴培養プレート
の各穴に１００μｌずつ添加した。２、３日おきに、２
００μＭヒポキサンチン、0.４μＭアメソプテリン、１
６μＭチミジン含有１５％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地と半量
ずつ培地交換した。培養開始から２週間程度経過後に、
形成されたＩＣＬＵ−Ｂとヒト末梢血リンパ球との融合
細胞の出現ウェル数および融合効率を測定し、その結果
を第１表に示した。また、ＩＣＬＵ−Ｅ（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−６２５４）の数を７×１06個、ヒト末梢血リンパ球
７×１06個としたこと以外は同様に融合操作を行った。
結果を第１表に示す。さらに、得られた融合細胞株の性
質を、実施例１と同様にして検討した結果を第２表に示
す。
【００２６】
【表１】
【００２７】
【表２】
【００２８】第１表より、いずれの親細胞株を用いた場
合も、２週間程度の培養で、高い効率のヒト末梢血リン
パ球との融合細胞を得ることができることがわかる。ま
た、第２表より、以下のことがわかる。まず、３種の親
細胞株がいずれも生体内の各種の免疫担当細胞を株化す
ることができることが明らかである。ＩＣＬＵ−Ｂを細
胞融合の親細胞株として使用した場合は、３種のいずれ
の免疫担当細胞をも得ることができるが、主として得ら
れるのはＢ細胞である。ＩＣＬＵ−Ｂから得たＢ細胞種
の融合細胞株は、Ｉｇ産生能を有することから、融合に
供した末梢血リンパ球のうち、抗体産生細胞であるＢリ
ンパ球の性質をそのまま受け継いでいることが明らかで
ある。また、ＩＣＬＵ−Ｔを細胞融合の親細胞株として
使用した場合も、主としてＴ細胞系の融合細胞を得てお
り、これらのＴ細胞種の融合細胞は、ヘルパー型を示
す。したがって、細胞融合に供した末梢血リンパ球のう
ち、Ｔリンパ球の性質を受け継いでいることが明らかで
ある。
合も、２週間程度の培養で、高い効率のヒト末梢血リン
パ球との融合細胞を得ることができることがわかる。ま
た、第２表より、以下のことがわかる。まず、３種の親
細胞株がいずれも生体内の各種の免疫担当細胞を株化す
ることができることが明らかである。ＩＣＬＵ−Ｂを細
胞融合の親細胞株として使用した場合は、３種のいずれ
の免疫担当細胞をも得ることができるが、主として得ら
れるのはＢ細胞である。ＩＣＬＵ−Ｂから得たＢ細胞種
の融合細胞株は、Ｉｇ産生能を有することから、融合に
供した末梢血リンパ球のうち、抗体産生細胞であるＢリ
ンパ球の性質をそのまま受け継いでいることが明らかで
ある。また、ＩＣＬＵ−Ｔを細胞融合の親細胞株として
使用した場合も、主としてＴ細胞系の融合細胞を得てお
り、これらのＴ細胞種の融合細胞は、ヘルパー型を示
す。したがって、細胞融合に供した末梢血リンパ球のう
ち、Ｔリンパ球の性質を受け継いでいることが明らかで
ある。
【００２９】ただし、ＩＣＬＵ−Ｅを細胞融合の親細胞
株として使用した場合、得られる融合細胞は、主として
Ｔ細胞種の性質を示す。しかしながら、ＩＣＬＵ−Ｂや
ＩＣＬＵ−Ｔ細胞を親細胞株とした場合と比較して、多
くの単球系融合細胞が得られている。これらの単球系の
融合細胞株は、食細胞作用があることから、単球系の細
胞の特徴をそのまま有していることが確認された。
株として使用した場合、得られる融合細胞は、主として
Ｔ細胞種の性質を示す。しかしながら、ＩＣＬＵ−Ｂや
ＩＣＬＵ−Ｔ細胞を親細胞株とした場合と比較して、多
くの単球系融合細胞が得られている。これらの単球系の
融合細胞株は、食細胞作用があることから、単球系の細
胞の特徴をそのまま有していることが確認された。
【００３０】実施例４〔親細胞株ＩＣＬＵ−Ｔを用いて
細胞融合を行う場合の融合促進剤の検討〕ＩＣＬＵ−Ｔ
細胞（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２５５）とヒト末梢血リンパ
球とを、細胞数が約１：１（具体的な数値は第３表に示
した）となるように混合した。この混合物を遠心分離
し、培養上清と細胞ペレットとに分離し、培養上清を除
去した。次に、細胞ペレットに基本培地であるＥＲＤＦ
培地（極東製薬工業（株）製）と１％レシチンで調製し
た１％レシチン−４０％ＰＥＧ（平均分子量：４００
０）を１ｍｌ添加した。さらに、ＥＲＤＦ培地９ｍｌを
添加して全量を１０ｍｌとした。これを再び遠心分離し
て得られた細胞のペレットを、ＥＲＤＦ培地８５％、Ｆ
ＢＳ１５％になるように調製された１５％ＦＢＳ−ＥＲ
ＤＦ培地５０ｍｌで懸濁した。懸濁液は、９６穴培養プ
レートの各穴に１００μｌずつ添加した。この融合操作
の４日後に、１３３μＭヒポキサンチン、0.２６μＭア
メソプテリン含有１５％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地を９６穴
培養プレートの各穴に１００μｌずつ添加した。次い
で、４、５日おきに、６７μＭヒポキサンチン、0.１３
μＭアメソプテリン含有１５％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地と
半量ずつ培地交換した。培養開始から２週間程度経過後
に、形成されたＩＣＬＵ−Ｔとヒト末梢血リンパ球との
融合細胞の出現ウェル数および融合効率を測定した。結
果を第３表に示す。一方、対照として、レシチンを添加
しないＥＲＤＦ培地で希釈して調製した４０％ＰＥＧ
（平均分子量：４０００）を用いた他は上記と同様に細
胞融合を行った。その結果も第３表に併せて示す。
細胞融合を行う場合の融合促進剤の検討〕ＩＣＬＵ−Ｔ
細胞（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２５５）とヒト末梢血リンパ
球とを、細胞数が約１：１（具体的な数値は第３表に示
した）となるように混合した。この混合物を遠心分離
し、培養上清と細胞ペレットとに分離し、培養上清を除
去した。次に、細胞ペレットに基本培地であるＥＲＤＦ
培地（極東製薬工業（株）製）と１％レシチンで調製し
た１％レシチン−４０％ＰＥＧ（平均分子量：４００
０）を１ｍｌ添加した。さらに、ＥＲＤＦ培地９ｍｌを
添加して全量を１０ｍｌとした。これを再び遠心分離し
て得られた細胞のペレットを、ＥＲＤＦ培地８５％、Ｆ
ＢＳ１５％になるように調製された１５％ＦＢＳ−ＥＲ
ＤＦ培地５０ｍｌで懸濁した。懸濁液は、９６穴培養プ
レートの各穴に１００μｌずつ添加した。この融合操作
の４日後に、１３３μＭヒポキサンチン、0.２６μＭア
メソプテリン含有１５％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地を９６穴
培養プレートの各穴に１００μｌずつ添加した。次い
で、４、５日おきに、６７μＭヒポキサンチン、0.１３
μＭアメソプテリン含有１５％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地と
半量ずつ培地交換した。培養開始から２週間程度経過後
に、形成されたＩＣＬＵ−Ｔとヒト末梢血リンパ球との
融合細胞の出現ウェル数および融合効率を測定した。結
果を第３表に示す。一方、対照として、レシチンを添加
しないＥＲＤＦ培地で希釈して調製した４０％ＰＥＧ
（平均分子量：４０００）を用いた他は上記と同様に細
胞融合を行った。その結果も第３表に併せて示す。
【００３１】
【表３】 * 親細胞１05個当たり
【００３２】第３表より、融合促進剤としてＰＥＧのみ
を用いても、融合細胞が全く得られないか、あるいは得
られる場合でもその効率は非常に低いことがわかる。一
方、レシチンとＰＥＧの両方を用いた場合は、融合細胞
を効率よく得ることができることが明らかである。この
結果から、ＩＣＬＵ−Ｔを親細胞として細胞融合を行う
際は、融合促進剤としてＰＥＧの他にレシチンも添加す
る必要があることがわかる。
を用いても、融合細胞が全く得られないか、あるいは得
られる場合でもその効率は非常に低いことがわかる。一
方、レシチンとＰＥＧの両方を用いた場合は、融合細胞
を効率よく得ることができることが明らかである。この
結果から、ＩＣＬＵ−Ｔを親細胞として細胞融合を行う
際は、融合促進剤としてＰＥＧの他にレシチンも添加す
る必要があることがわかる。
【００３３】
【発明の効果】ＩＣＬＵ−Ｂ、ＩＣＬＵ−Ｔ、ＩＣＬＵ
−Ｅのいずれかを親細胞株として用いて作成された本発
明のヒト免疫担当融合細胞株は、生体内において当該免
疫担当細胞が元来有していた免疫機能、その他の性質を
生体外においてそのまま発現するものである。また、請
求項２記載の本発明方法のように、ポリエチレングリコ
ールとレシチンの存在下において、ＩＣＬＵ−Ｔとヒト
免疫担当細胞から融合細胞を作成すると、生体内におけ
る免疫機能をそのまま保持した融合細胞を効率よく株化
することができる。本発明の融合細胞株は、生体内での
細胞間相互作用を、生体外で研究するために好適に利用
することができる。
−Ｅのいずれかを親細胞株として用いて作成された本発
明のヒト免疫担当融合細胞株は、生体内において当該免
疫担当細胞が元来有していた免疫機能、その他の性質を
生体外においてそのまま発現するものである。また、請
求項２記載の本発明方法のように、ポリエチレングリコ
ールとレシチンの存在下において、ＩＣＬＵ−Ｔとヒト
免疫担当細胞から融合細胞を作成すると、生体内におけ
る免疫機能をそのまま保持した融合細胞を効率よく株化
することができる。本発明の融合細胞株は、生体内での
細胞間相互作用を、生体外で研究するために好適に利用
することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 川原 浩治 静岡県島田市横井２−12−61 サンライズ 横井301号
Claims (2)
- 【請求項１】 ヒトバーキットリンパ腫由来細胞株Ｒａ
ｊｉ、ヒトＴ細胞性白血病細胞株ＰＥＥＲおよびヒト好
酸球白血病細胞株ＥｏＬｌのいずれかの細胞株から、８
−アザグアニンもしくは６−チオグアニン耐性クローン
を選択し、さらに無血清培養可能にした変異株であるＩ
ＣＬＵ−Ｂ、ＩＣＬＵ−ＴおよびＩＣＬＵ−Ｅのいずれ
かを親細胞株とするヒト免疫担当融合細胞株。 - 【請求項２】 ヒト細胞融合用親細胞株ＩＣＬＵ−Ｔと
ヒト免疫担当細胞を用いて融合細胞を作成する際に、ポ
リエチレングリコールとレシチンの存在下に行うことを
特徴とするヒト免疫担当融合細胞株の取得方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1998061889A JP3536076B6 (ja) | 1997-10-22 | 1998-02-27 | 融合細胞株とその取得方法 |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30636097 | 1997-10-22 | ||
| JP9-306360 | 1997-10-22 | ||
| JP1997306360 | 1997-10-22 | ||
| JP1998061889A JP3536076B6 (ja) | 1997-10-22 | 1998-02-27 | 融合細胞株とその取得方法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003353137A Division JP3662012B2 (ja) | 1997-10-22 | 2003-10-14 | 融合細胞株 |
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014030726A1 (ja) * | 2012-08-23 | 2014-02-27 | 日産化学工業株式会社 | タンパク質産生促進剤 |
| US9664671B2 (en) | 2012-07-24 | 2017-05-30 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Culture medium composition and method of culturing cell or tissue using thereof |
| US10017805B2 (en) | 2012-08-23 | 2018-07-10 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Enhancing ingredients for protein production from various cells |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9664671B2 (en) | 2012-07-24 | 2017-05-30 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Culture medium composition and method of culturing cell or tissue using thereof |
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| WO2014030726A1 (ja) * | 2012-08-23 | 2014-02-27 | 日産化学工業株式会社 | タンパク質産生促進剤 |
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Also Published As
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