KR920005751B1 - 새로운 색소를 생산하는 미생물 및 그의 한국 재래식 간장의 제조에의 이용 - Google Patents

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내용 없음.

Description

새로운 색소를 생산하는 미생물 및 그의 한국 재래식 간장의 제조에의 이용

제1도는 본 발명의 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) SSA3균이 생성하는 색소의 색을 균을 접종하지 않은 대조구와 비교한 사진이다.

제2도는 본 발명의 바실루스 리케니포르미스 SSA3가 티로신과 알라닌의 존재하에 생성한 색소의 색을 보여주는 사진이다.

제3도는 5종류의 아미노산에 배양시킨 바실루스 리케니포르미스 SSA3-M1의 색소생성을 나타내는 사진이다.

제4도는 얇은막 크로마토그래피를 이용하여 재래식 간장의 색소와 바실루 리케니포르이스 SSA3가 생성한 색소를 각각 분리한 TLC이다.

제5도는 바실루스 리케니포르미스 SSA3를 순수 대두 배지에 배양한 배양물의 전체 휘발성분의 GC-관능검사상의 가스 크로마토그램이다.

제6도는 바실루스 리케니포르미스 SSA3를 순수 대두 배지에 배양한 배양물의 전체 휘발성분 중 중성획분의 GC-관능검사상의 가스 크로마토그램이다.

제7도는 바실루스 리케니포르미스 SSA3를 순수 대두 배지에 배양한 배양물의 전체 휘발성분의 가스 크로마토그램이다.

제8도는 바실루스 리케니포르미스 SSA3를 순수 대두 배지에 배양한 배양물의 전체 휘발성분 중 중성획분의 가스 크로마토그램이다.

제9도 및 제15도는 각각 티로신과 알라닌이 0.5%(W/V) 첨가된 기본 액체 배지 (pH5)의 흡광도이다.

제10도 및 제16도는 각각 티로신과 알라닌이 0.5%(W/V) 첨가된 기본 액체 배지 (pH5)에서 바실루스 리케니포르미스 SSA3를 배양시킨 배양물의 흡광도이다.

제11도 및 제17도는 각각 티로신과 알라닌이 0.5%(W/V) 첨가된 기본 액체 배지 (pH5)에서 바실루스 리케니포르미스 SSA3-M1을 배양시킨 배양물의 흡광도이다.

제12도 및 제18도는 각각 티로신과 알라닌이 0.5%(W/V) 첨가된 기본 액체 배지 (pH8)의 흡광도이다.

제13도 및 제19도는 각각 티로신과 알라닌이 0.5%(W/V) 첨가된 기본 액체 배지 (pH8)에서 바실루스 리케니포르미스 SSA3를 배양시킨 배양물의 흡광도이다.

제14도 및 제20도는 각각 티로신과 알라닌이 0.5%(W/V) 첨가된 기본 액체 배지 (pH8)에서 바실루스 리케니포르미스 SSA3-M1를 배양시킨 배양물의 흡광도이다.

본 발명은 티로신에서 수용성 흑갈색의 색소를 알라닌에서 갈색의 수용성 색소를 생성할 수 있는 능력을 가지고 있는 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) 및 돌연변이주 바실루스 리케니포르미스, 그리고 그 균주가 생성하는 색소에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 이균이 한국 재래식 장의 풍미를 생성할 수 있으므로 한국 재래식 간장의 주분해 및 발효균으로 이용하는 것에 관한 것이다.

종래의 간장의 제조방법에 따르면, 재래식 메주나 개량식 메주에 염수를 가하여 일차발효를 2-3개월시킨후 액체부분을 분리하여 그대로 방치한 상태에서 5개월이상 이차 발효를 시켜 간장을 제조한다. 이렇게 제조하면 메주나 발효과정 중에 공기로부터 유입되는 균의 성질에 따라 갈색 혹은 흑갈색의 색소를 생성한다.

또한 자연상태에서 비효소적 갈변반응(non-enzymatic browning reaction=Maillard reaction)에 의해서도 갈색을 나타낸다. 즉 메주에서 유래하는 균이나 재래식 간장 발효 중 공기에서 유입되는 균에 의해 색소와 맛과 향기가 생성되는 점과 더불어 자연적 화학반응에 의해 색, 맛, 향기가 생성되기도 한다. 이러한 종래 간장의 제조방법은 다음과 같은 문제점을 갖는다.

첫째 : 간장색의 생성정도를 인위적으로 조정함이 불가능하다. 즉 간장 발효중 환경상태에 따라 유입되는 다양한 균들의 성질에 의해 재래식 간장의 색이 엷은 갈색에서 흑갈색까지 다양하게 생성되므로, 일정한 색을 인위적으로 조정하여 생성치 못한다. 그러므로 재래식 간장의 공장생산이 어렵다.

둘째 : 재래식 간장의 풍미를 생성하는 균이 메주와 공기중에서 자연 유입되어야 하므로 재래식 간장의 생산을 위한 발효기간이 길다.

세째 : 재래식 간장을 생산할 때 풍미를 인위적으로 조정하기가 어렵다.

네째 : 일정한 품질을 지닌 제품을 생산키 어렵다.

이에 본 발명자는 이러한 문제점을 해결하고자 예의 연구한 결과, 재래의 간장으로부터 분리한 균주가 새로운 색소를 생성함을 발견해내고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 즉, 재래식 간장의 풍미를 생성할 수 있고 갈색색소와 흑갈색 색소를 생성할 수 있는 본 발명의 균을 이용함으로써 색소를 조정할 수 있고 풍미를 조정하여 빠른 시간내에 재래식 간장의 제조가 가능하고 품질의 규격화가 가능하므로 공장생산이 가능해진다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 새로운 색소를 생성하는 균주는, 일반가정에서 재래식 방법으로 담근 숙성된 간장으로부터 상용의 방법 [예를들면, C.H.Collins et al., Microbial Methods. 4th, (1976) ; 및 W.F.Harriigan et al., Laboratory Methods in food and diary microbiology(1976)]에 따라 분리한 후, 분리한 균들을 대두즙 배지에서 배양한 후, 공지방법[예를들면, 공업진흥원 : 한국공업규격 KSA-7001, 관능검사일반법(1976) 및 공업진흥원 : 관능에 의한 풍미검사법 한국공업규격 KSA-7002(1976)]에 따라 재래식 간장향을 내는 균을 선별하여 수득할 수 있다. 이때 사용되는 대두즙 배지 및 균의 배양에 사용되는 삶은 대두배지는 본 발명에 의해 최초로 제공되는 것으로서, 이에 의해 본 발명에 따른 균주중 하나인 바실루스 리케니포르미스 SSA3의 배양 및 선별이 가능할 수 있었다. 대두즙 배지는 다음 도식 1에 따라 제조할 수 있다.

도식 1.

또한 , 삶은 대두배지는 후술한 도식 3에 따라 제조할 수 있다.

이렇게 하여 선별한, 짜고 약단 재래식 간장향을 생성하는 SSA3균의 배양학적, 형태학적, 생리학적 특징을 관찰하여 공지방법[(N.S.Mair 등 Bergey's Manual of systematic bacterilogy Volumn 2(1986)와 R.E.Gord등 : The Genus Bacillus) Agricultural Hand book No. 427, (1973)]에 준하여 동정하였다.

그 결과 표 1에 제시한 바와 같이 Bergey's manual의 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis)성질과 비교시 V-P 브로쓰(pH＞7)에서 생육도, 글루코스로부터 가스생산, 티로신 분해능, 난황 레시티나제, 디히드록시아세톤 생성능, 10℃에서 생성능을 제외한 나머지 성질은 유사하고, 바실루스속(The Genus Bacillus)의 바실루스 리케니포르미스 성질과 비교시 , 티로신 분해능, 난황 레시티나제, 리소자임 존재시 생육도를 제외한 여러가지 성질이 유사하므로 이 선별균은 바실루스 리케니포르미스임이 확인된다.

본 발명의 균주 바실루스 리케니포르미스 SSA3는 1990년 5월 23일자로 한국 과학기술 연구원에 수탁번호 ACTC 8488P로 기탁되었다.

선별균의 특징

[표 1]

+ : 양성 - : 음성 +/ - : 양성 또는 음성

본 발명의 균주 바실루스 리케니포르미스 SSA3를 표 2와 같은 기본 액체 배지(pH 8)에 각종 아미노산(글리신, L-프롤린, L-아스파르트산, L-히스티딘, L-시스틴, L-알라닌, L-발린, L-트립토판, L-글루탐산, L-류신, L-아스파라긴, L-글루타민, L-세린, L-메티오닌, 히드록시- L-프롤린, L-이소류신, L-티로신, L-리신, S-카르복시메틸- L-시스틴, L-트레오닌, L-페닐알라닌, L-아르기닌)을 각각 1%(W/V) 첨가하여 37℃, 12일간 진탕배양하면 티로신, 알라닌, 히스틴이 첨가된 배지에서 갈색 계통의 색소가 생성된다.

[표 2]

색소 생성능을 조사하기 위한 기본 액체배지의 조성

바실루스 리케니포르미스 SSA3는 제2도에서 보는 바와 같이 티로신이 첨가된 (0.5%) 기본 액체배지(pH8)에서 흑갈색 색소를 생성하였고 알라닌이 첨가된 (0.5%) 기본 액체배지에서 (pH5) 갈색색소를 형성하였다. 나머지 다른 배지의 경우는 균을 접종하지 않은 대조구(제1도)와 비교해 보면, 배지 자체의 마일라를 반응이 일어난 것 이외의 색소는 생성되지 않았다.

바실루스 리케니포르미스 SSA3를 NTG로 일차 돌연변이시킨 티로신에서 흑갈색 색소를 생성하지 않은 바실루스 리케니포르미스 SSA3-M1을 다시 UV호 이차 돌연변이를 시켜 간장 발효 기간을 단축시킬 수 있는 아밀라제, 프로테아제 효소의 생성능은 증가되고 암모니아취로 품질저하의 원인이 되는 데아미나제와 아민생성의 원인이 되는 데카르복실라제의 효소 생성능은 저하된 우량변이주 바실루스 리케니포르미스 SSA3-2M1을 육종하였다[참고문헌 : W.K.Ki, J.K.Kim, D.H.Kang ＆ Y.U.Cho ; Kor.J.Appl.Micribiol.Bioeng., 15(1), 21-28(1987) 및 J.K.Kim ＆ S.D.Kim; J.Korean Agric.Chem.soc.,31(4), 346-350(1988)]. 이 바실루스 리케니포르미스 SSA3-2M1은 1990년 5월 23일자로 한국 과학 기술연구원에 수탁번호 KCTC 8489P로 기탁되었다.

바실루스 리케니포르미스 SSA3-M1의 색소생성능을 조사한 결과 제3도에 제시한 바와같이 티로신 (pH8) 첨가 배지에서는 흑갈색 색소를 생성하지 않으며 알라닌 (pH5)이 첨가된 배지에서는 엷은 갈색 색소가 생성되었다.

티로신이 첨가된 배지에서 생성된 새로운 색소의 성질은 다음과 같다.

(1) 용해도

티로신이 첨가된 (0.1%) 기본 액체배지(표2. pH8)에서 바실루스 리케니포르미스 SSA3를 37℃, 14일동안 배양한 흑갈색 색소가 생성된 배양액을 먼저 원심분리(8×10rpms, 10min)하여 균체를 제거시킨 후, 다시 상등액을 세균여과기 (0.45μm 공극크기)로 여과하여 동결건조시킨 흑갈색 색소와 재래식으로 담근 흑갈색과 갈색을 나타내는 두종의 간장을 각각 에틸알콜(99%)로써 염을 제거하면서 감압농축하여 동결건조시켜 모은 간장의 색소와 용해도를 비교한 결과는 표 3과 같다.

(2) 얇은막 크로마토그래피를 이용한 색소의 분리

실리카 겔 60H 지지체를 사용하여 상법[Erich Heftmann : Chromatography (A laboratory handbook of Chromatographic and electrophoretic methods) 165-188,3rd. (1985) 참조]에 따라 만든 얇은막 크로마토 그래피를 이용하여 (1)에서 설명한 바와 같이 만든 흑갈색 간장색소, 갈색 간장색소, 바실루스 리케니포르미스 SSA3가 생성한 흑갈색 색소를 각각 5μl씩 점적한 다음 전개용매(1-프로판올 : 25% NH₄OH : 물=6 : 3 : 1)로써 전개시켜 색소를 분리하였다.

그 결과 제4도에 나타난 바와같이 바실루스 리케니포르미스 SSA3의 흑갈색 색소의 경우 흑갈색을 나타내는 간장의 색소와 비교해 보면 3종류의 색소(Rf : 0.47, 0.57, 0.74)가 같은 부위에서 관찰되었으나, 흑갈색 간장에서 나타난 Rf 0.22의 색소는 없었다. 갈색을 나타내는 간장의 색소는 두종류의 색소(Rf 0.57, 0.74)가 같은 부위에서 관찰되었으나 바실루스 리케니포르미스 SSA3의 흑갈색 색소와는 달리 두종류의 다른 색소가 (Rf :0.28, 0.68) 관찰되었다.

[표 3]

선별균을 순수 대두배지에 배양하여 생성하는 향기성분을 동정하고 각 향기성분이 어떠한 방향을 나타내는지를 밝히고저 다음과 같이 먼저 선별균이 생성하는 전체 휘발성분을 추출하여 농축하였다. 한편 추출된 향기성분 중 특징적인 재래식 간장향을 나타내는 중성의 획분을 얻어 이를 농축 후 GC-관능검사로 각 피크성분의 방향성을 조사하고 이들 향기 성분의 가스 크로마토그램을 일정하게 하면서 동정하였다.

(1) 휘발성분의 추출

휘발성분의 추출에는 닉커손과 리켄스방법[G. B. Nickerson, S. T. Likens. Proc. Am. Soc. Brew. Chem. ,5(1964)]의 개량형인 연속수증기 증류 추출(Simultaneous steam distillation-extraction) 장치 [T. H. Schults et al., J. Agric. Food Chem., 25(3), 446-449(1977) 참조]를 사용하였다.

실시예 3의 도식 3과 같이 조제한 삶은 대두배지에 분리균을 30℃, 40일간 배양한 배양물 (300g)에 증류수를 같은량 가하여 시료 용기에 넣고, 디에틸 에테르(100ml)를 용매 용기에 넣어 40℃ 항온을 유지하며, 먼저 용매를 순활시킨 후 시료가 끓을때까지 시료 용기의 온도를 상승시켜 2시간 동안 추출하여 전체 휘발성분을 얻고 이를 GC-관능검사 및 동정용 시료로 사용하였다.

한편 추출된 휘발성분들은 도식2와 같은 과정으로 분획하여 중성획분을 얻었다. 즉, 디에틸 에테르에 추출된 전체 휘발성분을 분액여두에 넣고 5% HCl(100ml)을 첨가하여 격렬하게 흔들고 잠시 방치하여 수용액층과 에테르층을 분리한 후 분리된 수용액층에 NaCl이 포화될때까지 첨가하고 디에틸 에테르(500ml)를 가하여 결렬하게 흔들고 잠시 방치하여 수용액층과 에테르층을 분리하여 수용액층은 버리고 에테르층은 먼저 분리하여 둔 에테르층과 합하였다. 이러한 과정을 5% NaOH(100ml)를 첨가하여 반복하여 에테르층을 얻어 무수 Na₂SO₄를 가하여 하루동안 방치하여 수분을 제거하여 중성획분을 얻었다.

(2) 전체 휘발성분과 중성획분의 GC-관능검사

전체 휘발성분과 중성획분을 상압에서 회전증발기로 약 2ml까지 농축하고 다시 질소가를 통과시키며 약 150μl까지 최종 농축한 후 조제 가스 크로마토그래프로 가스 크로마토그램을 얻으면서 조제 가스 크로마토그래프로부터 유출되는 가스 크로마토그맹상의 각 피크성분의 방향을 관능검사하였다. 이때 사용한 조제 가스 크로마토그래프의 조건은 표4와 같고 관능검사 결과는 제5도 및 제6도와 같다.

도식 2

전체 휘발성분의 분획

[표 4]

(3) 전체 휘발성분과 중성획분의 동정

GC-관능검사의 조제 가스 크로마토그래프로 얻은 가스 크로마토그램과 휘발성분의 GC패턴을 일정하게 하면서 향기 성분을 동정하기 위해 표 5와 같은 GC-질량분광측정 조건으로 하여 질량 스펙트럼을 얻고 이를 컴퓨터로 라이브러리 조사하고 KOVATS의 The Sadtler standard gas chromatography retention index library와 머무름 지수를 바탕으로 동정하였다. 가스 크로마토그램은 제 7도 및 제 8도와 같고 동정 결과는 표6, 표7과 같다.

[표 5]

[표 6]

[표 7]

바실루스 리케니포르미스 SSA3를 순수 대두배지에 배양한 배양물의 전체 휘발성분중 중성획분의 GC-관능검사에 머무른 시간(Retention time) 4.588, 5.192, 6.583부위의 각 피크에서 간장향을 나타내었는데 이는 제9도의 피크번호8(7-옥테-4-올)과 9(2-데카논) 및 12(미지)에 해당되는 방향물질이었다. 한편 제8도의 피크번호 7에 해당되는 디메틸 트리술피드는 함량이 많으면 간장의 변패취를 나타내지만 벤즈아세트알데히드와 혼합하면 한국 재래식 간장향을 나타내었다.(J.K.Kim, W.D.Ji, S.M.Park ＆ E.J.Lee ; Aroma Characteristis of Dimethyl Trisulfide and It's Producing Microorganisms in Traditional Korean Soy Sauce, 5th.The Federation of Asian and Oceanian Biochemists Congress, Abstract 242(1989))

이하, 비한정적인 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

[실시예 1]

(1)균 분리

상용적인 방법에 따라 일반 가정에서 재래식 방법으로 담근 숙성된 간장을 일정량 멸균수로 3단계 희석하여 표8과 같은 분배용 배지로 순수분리 하였다.

[표 8]

(2)균의 선별

재래식 간장으로부터 분리한 세균을 전술한 방법에 따라 제조한 대두즙 배지에서 37℃, 7일간 배양한 결과 짜고 약단 재래식 간장향을 생성하는 SSA3를 선별하였다.

[실시예 2]

색소생성

다양한 조건하[pH : 5, 6, 7, 8 ; 온도 : 30℃, 40℃ ; 아미노산 종류(티로신, 트립토판, 글리신, 리신, 알라닌) 및 양(0.1%, 0.5%)]에서 표 2와 같은 기본 액체배지에 바실루스 리케니포르미스 SSA3를 7일동안 진탕배양한 후 원심분리(1.2×10rpms, 15min)시켜 균체를 제거한 배양여액을 분광광도계(420mm)의 흡광도로서 색소 생성능을 측정한 결과는 표 9와 같다.

티로신, 알라닌이 각각 0.5%(W/V)첨가된 기본 액체배지(표 3. pH5, pH8)에서 바실루스 리케니포르미스 SSA3, 바실루스 리케니포르미스 SSA3-M1을 각각 37℃, 17일간 진탕배양시킨 배양여액을 증류수로 보정한 분광광도계(200-900nm)로 흡광도를 측정한 결과 티로신이 첨가된 (0.5%) 기본 액체배지(pH5, pH8)에서 균을 접종하지 않은 대조구는 제9도, 제12도이고, 바실루스 리케니포르미스 SSA3를 접종한 구는 제10도, 제13도이고, 바실루스 리케니포르미스 SSA3-M1을 접종한 구는 제11도, 제14도이며, 알라닌이 0.5% 첨가된 기본 액체배지(pH5, pH8)에서 균을 접종하지 않은 대조구는 제15도, 제18도이고 바실루스 리케니포르미스 SSA3를 접종한 구는 제16도, 제19도이고 바실루스 리케니포르미스 SSA3-M1를 접종한 구는 제17도, 제20도이다.

[실시예 3]

액체배지에서 풍미생성

표 10과 같은 조성의 향기 생성용 배지에 바실루스 리케니포르미스 SSA3를 37℃, 5일, 8일, 10일, 12일 15일, 25일간 배양하여 통상의 방법 [공업진흥원, 한국공업규격 KSA-7001, 관능검사 일반법(1978) ; 및 공업진흥원, 관능에 의한 풍미검사번, 한국공업규격 KAS-7002(1977)]에 따라 상부간격 상의 향기를 관능검사한 결과를 표 11과 같다.

[표 9]

[표 10]

대두즙은 도식 1의 대두즙배지 조제방법에서 NaCl을 첨가하지 않은 것이다.

[표 11]

순수삶은 대두배지에서 배양한 바실루스 리케니포르미스 SSA3의 향기 관능검사

바실루스 리케니포르미스 SSA3를 순수삶은 대두배지에 접종하여 35℃, 7일간 배양후 NaCl을 수분 함량의 15%를 첨가한 다음 재배양하였다. 배양하면서 기간별로 배양물의 상부 간격의 향기를 관능검사한 결과는 표 12와 같고 순수삶은 대두배지의 조제방법은 도식 3과 같다.

도식 3

[표 12]

이상 기술한 바와 같이 본원 발명은 종래의 간장 제조법과 비교할때, 새로운 색소를 생성하는 바실루스 리케니포르미스와 돌연변이주 바실루스 리케니포르미스를 사용하여 재래식 간장을 제조하므로써 색을 조정할 수 있고, 재래식 간장의 발효기간을 단축할 수 있으며, 재래식 간장의 풍미의 조정이 가능하다는 여러가지 장점를 갖는다.

Claims (5)

1. 티로신 존재하에서 수용성 흑갈색 색소를 그리고 알라닌 존재하에서 수용성 갈색 색소를 생성할 수있는 능력을 갖고 재래식 간장의 풍미를 생성하는 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis).
2. 티로신의 존재하에서 흑갈색 색소를 생성하는 능력이 상실되고, 아밀라제 및 프로테아제의 생성능은 증가되고 데아미나제 및 데카르복실라제의 효소 생성능이 저하된 재래식 간장의 풍미를 생성하는 돌연변이 주 바실루스 리케니포르미스.
3. 한국 재래식 간장의 독특한 풍미(맛과 향기)를 생성하는 균인 바실루스 리케니포르미스 또는 돌연변이주 바실루스 리케니포르미스 또는 이들 균과 동일한 미생물학적 특성을 갖는 균주를 이용하는 재래식 간장의 제조방법.
4. 제1항에 있어서, 바실루스 리케니포르미스 SSA3(KCTC 8488P)인 바실루스 리케니포르미스.
5. 제2항에 있어서, 바실루스 리케니포르미스 SSA3-2M1(KCTC 8489P)인 돌연변이주 바실루스 리케니포르미스.

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