KR900004069B1 - 형질전환 인삼세포에 의한 사포닌의 생산방법 - Google Patents

형질전환 인삼세포에 의한 사포닌의 생산방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]
형질전환 인삼세포에 의한 사포닌의 생산방법
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 아그로박테리움 리조게네스(Agrobacterium rhizogenes)를 이용한 인삼세포의 형질전환함에 있어서 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol)과 같은 세포 융합유도 물질과 인돌초산(Indoleacetic acid), 나프탈렌초산(Naphthalene acetic acid) 인돌부티린산(Indolebutyric acid)와 같은 식물호르몬을 첨가한 배지를 이용하여 부정근인 모상근을 유도하고, 이 부정근을 이용하여 사포닌을 생산하는 방법에 관한것이다.
인삼은 피로회복, 강장, 항염, 항궤양, 신경항진 및 안정, 혈압강하등의 각종 약리작용이 알려져 유용 한방약제로 이용되어 오고 있는 오가피과의 다년생 초본 식물로 그 근을 수삼, 백삼, 홍삼으로 약용한다. 그 유연생약으로 광동, 삼칠, 죽절인삼등이 있으며 지금까지 알려진 약용 인삼의 주요 유효성분으로 사포닌, 사포게닌, 폴리아세틸렌, 피라진 유도체, 말톨등이 알려져 있다.
천연 약용 인삼은 배수가 양호하고 서늘한 고지에서 4-6년간에 걸쳐 장기간 재배되며 천연기후에 영향을 받을 뿐만 아니라 동일장소에서 연작이 불가능한 비경제적 생산 산물이다.
따라서, 고가의 약용인삼을 기후에 장애를 받지않고 연중 대량생산을 위한 방법으로 식물조직 배양이 활발히 이루어져 왔다. 지금까지는 천연 약용인삼의 뿌리조직을 배양하여 부정형의 세포괴인 칼루스를 얻고 이를 각종 영양배지 및 환경조건하에서 대량배양하여 천연 약용인삼과 동일한 유효주성분을 다량으로 함유한 인삼조직물의 제조연구가 행해졌다.
그러나, 고등식물의 2차 대사계는 분화된 특정 조직이나 기관에서 발현되므로 탈분화 조직인 세포에서 고수율의 천연 약용 인삼성분의 생산은 한계가 있다. 이에 각종 배양조건에 따른 식물대사계의 조절, 식물세포의 고정화 및 식물세포 배양용 반응기의 개발에 박차를 가하고 있으나 그 문제점을 아직 해결치 못하고있다.
최근 식물세포의 형질전환 수단으로 연구되고 있는 아그로박테리움 리조게네스는 식물의 상처부위를 감염했을때 감염부위에 왕성한 부정근을 유기하며 제균시에도 계속 성장한다는 것이 알려짐으로써, 이런 현상을 이용하여 목적물질이 뿌리에 다량 존재하는 경우, 아그로박테리움 리조게네스를 감염시켜 다량의 부정근을 유도, 배양하여 고수율의 2차대사 산물을 생산하고자 하는 연구가 이루어지고 있다.
아그로박테리움 리조게네스의 감염시 일어나는 왕성한 부정근은 이 미생물이 갖고있는 유전자의 일부가 식물세포로 전이되어 형질 발현되는 데에서 일어나는데, 이 뿌리는 식물성장에 필요한 호르몬의 부재에서도 왕성히 성장하며 특이적인 아미노산 유도체인 오파인(opine) 화합물을 생산하는 것이 특징이다.
그러나, 식물체에 대한 이균의 감염은 숙주성이 있어서 모든 식물에 부정근을 발생하지 않을 뿐만 아니라, 감염성의 약화로 부정근의 유기에 상당한 시간과 노력이 소요되어 감염이 어려운 식물체로 존재한다. 특히, 인삼의 경우에서 이런 현상을 관찰할 수 있다.
이에 본 발명자등은 식물에 대한 균의 감염성의 증대수단을 연구하던중, 균의 식물세포에 대한 부착과 전이 유전자의 발현촉진을 일으켜 부정근을 유도하는 방법을 발명하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명을 보다 상세히 설명하면, 파낙스속에 속하는 인삼의 신생근을 알콜 및 차아염소산소다 용액으로 멸균하고 멸균증류수로 세척한 후 3mm 두께의 절편으로 한다음, 와이.이.비 배지(yeast ext 1g/l, peptone5g/l, Beef ext 5g/l, Sucrose 5g/l, MgSO4, 7H2O 0.4g/l)에서 일정시간전에 미리 배양한 아그로박테리움조게네스 균주 배양액(108/ml)에 본 발명의 폴리에틸렌글리콜과 식물호르몬을 적정농도로 함께 첨가하여 놓고 27℃암소에서 120rpm으로 회전 배양하였다.
본 실험에 사용한 플리에틸렌글리콜(PEG 4000)의 농도는 5-40%(W/V)로 하였으며 식물호르몬인 인돌초산, 나프탈렌초산, 인돌부틸산의 농도는 10-4M에서 10-8M로 사용하였다.
3-24시간 배양후 조직절편을 멸균증류수로 3회 세척한 다음, 1% 한천 배지상에 치상하여 27℃, 암소에서 3일간 배양하고 이를 다시 상용의 무라시게-스쿡(MS) 한천배지상에 치상하여 27℃, 암소에서 배양하였다. 일정기간 배양후 유도되는 부정근을 1cm 크기로 잘라 카베니실린 300ppm과 암피실린 200ppm함유한 식물호르몬 무첨의 무라시게-스쿡 배지에서 3주마다 계대 배양하며 제균하였다.
이 부정근은 식물호르몬이 첨가되지 않은 배지에서 왕성히 성장을 계속하였으며, 아그로박테리움 리조게네스로 형질절환된 세포의 특징인 오파인 화합물을 전기영동으로 확인하였던바, 형질전환이 이루어진 세포임을 알 수 있었다. 한편, 본 발명으로 얻은 부정근은 정상 식물체의 뿌리에서 얻은 사포닌보다 함량이 매우 높았으며 박층크로마토그라피로 성분에 차이가 없음을 확인하였다. 본 발명의 상세한 실시예는 다음과같다.
[실시예 1,2,3]
파낙스속의 5년생 인삼근은 70% 알콜 및 2% 치아염소산소다 용액으로 멸균하고 멸균증류수로 3회 세척한 후, 3cm 두께의 절편으로 한 다음, 와이.이.비 배지에서 36시간전에 미리 배양한 아그로박테리움 리조게네스 ATCC 18534 배양액에 본 발명의 화합물을 표 1과 같이 함께 넣고 27℃ 암소에서 120rpm으로 회전 배양하였다.
10시간 배양후 조직절편을 멸균증류수로 3회 세척하고 1% 한천 배지상에 치상하여 27℃, 광소(1000lux)에서 3일간 배양한 다음 이를 다시 상용의 무라시게-스쿡(MS) 한천배지상에서 동일방법으로 배양하였다. 일정기간 배양 후 유도되는 부정근을 1cm 크기로 잘라 카베니실린 300ppm과 암피실린 200ppm 함유한 식물호르몬 무첨의 무라시게-스쿡 배지에서 27℃, 암소로 3주마다 계대 배양하며 제균하였다. 실험결과를 요약하면 다음과 같다(표 1).
[비교실시예]
아그로박테리움 리조게네스 ATCC 18534 배양액에 본 발명에서의 화합물을 첨가하지 않은 이외는 실시예 1, 2, 3과 동일하게 실시하였다. 결과는 표 1과 같았다.
[표 1] 첨가물질에 따른 모상관의유도효과
Figure kpo00001
* PEG : 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol 4000)
IAA : 인돌초산(Indoleacetic acid)
NAA : 나프탈렌초산(Naphthalene acetic acid)
IBA : 인돌부틸산(Indolebutyric acid)
표 1에서 모상근의 유기율은 실험한 조직절편에 대해 모상근이 유도된 절편의 수로 계산하였다.
[실시예 4]
실시예 1, 2, 3 및 비교예 1에서 얻은 1cm정도 크기의 모상근을 식물호르몬을 첨가하지 않은 상용의 무라시게-스쿡 액체배지 70ml 들어있는 300ml 삼각플라스크에 넣고, 27℃ 암소에서 3주간 배양하여 부정근을 얻고 냉동건조 시킨 후 상법에 따라 사포닌을 추출하였다. 또한 5년생 인삼을 동일방법으로 사포닌을 추출하였다. 그 결과를 요약하면 다음과 같다 (표 2).
[표 2] 모상근 및 재배 인삼근의 조사포닌의 함량
Figure kpo00002

Claims (2)

  1. 인삼근 절편을 아그로박테리움 리조게네스 ATCC 18534와 세포융합 유도물질 및 식물호르몬을 첨가한 배지에서 배양하여 모상근을 유도하고 모상근을 제균한 다음 다시 배양하여 통상의 방법으로 사포닌을 추출하는 형질전환 인삼세포에 의한 사포닌 생산방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 세포융합 유도물질이 폴리에틸렌글리콜이고, 식물호르몬이 인돌초산, 나프탈렌초산, 인돌부틸산인 형질전환 인삼세포에 의한 사포닌 생산방법.
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