KR20250028362A - 카파 경쇄-결합 대류 매트릭스 - Google Patents

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로니 팜그렌
키한 에스판디아파드
타니아 아마드
토마스 비요크만
리사 마르크스
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씨티바 바이오프로세스 알＆디 에이비
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Abstract

본 발명은 카파 경쇄-함유 단백질의 단리 및 분리에 관한 것이다.　 보다 구체적으로, 본 발명은 다공성 지지체에 공유 결합된 카파 경쇄-결합 리간드를 포함하는 분리 매트릭스에 관한 것이며, 여기서 상기 카파 경쇄-결합 리간드는 알칼리-안정화된 피네골디아 마그나(이전에는 펩토스트렙토코쿠스 마그누스) 단백질 L 도메인의 다량체를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어지고; 상기 다공성 지지체는 대류-기반 크로마토그래피 매트릭스이다.

Description

카파 경쇄-결합 대류 매트릭스
본 발명은 생체 분자의 분리 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 면역글로불린 및 면역글로불린 분획과 같은 카파 경쇄의 존재에 기반한 생체 분자의 친화성 크로마토그래피 및 분리를 위한 분리 매트릭스에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 분리 매트릭스의 사용 방법에 관한 것이다.
면역글로불린 및 면역글로불린 단편은 전세계적으로 제조 또는 개발에서 가장 널리 사용되는 바이오 의약품이다. 상기 특정 치료제 시장에 대한 높은 상업적 수요 및 그 가치로 인해 제약회사들은 관련 비용을 통제하면서 각 제조 공정의 생산성을 극대화하는데 중점을 두고 있다.
일반적으로 포도상구균 단백질 A 또는 그 변이체를 포함하는 매트릭스 상에서의 친화성 크로마토그래피는 무손상 면역글로불린 분자의 정제에 있어 주요 단계 중 하나로 사용된다. 단백질 A의 면역글로불린 Fc 쇄에 대한 고도로 선택적인 불순물 및 오염물질의 제거율이 매우 높은 일반적인 단계를 제공한다.
Fc 쇄가 결여되어 있으나 서브클래스 1, 3 또는 4 카파 경쇄를 갖는 Fab, 단일쇄 가변 단편 (scFv), 이중-특이적 T-세포 연관체 (BiTE), 도메인 항체 등의 면역글로불린 단편 또는 항체 단편의 경우 피네골디아 마그나(Finegoldia magna, 이전에는 펩토스트렙토코쿠스 마그누스(Peptostreptococcus Magnus))로부터 유래된 단백질 L을 포함하는 매트릭스(B Akerstrom, L Bjorck: J. Biol. Chem. 264, 19740-19746, 1989; W Kastem et al: J. Biol. Chem. 267, 12820-12825, 1992; B HK Nilson et al: J. Biol. Chem. 267, 2234-2239, 1992 and US Pat. 6,822,075)는, 필요한 높은 선택성을 제공하는 정제 플랫폼으로서의 큰 가능성을 보여준다.
단백질 L 매트릭스는 예를 들어 씨티바TM(CytivaTM)에서 캅토TM(CaptoTM) L로서 상업적으로 구매 가능하며, 예컨대 무손상 항체, Fab 단편, scFv 단편, 도메인 항체 등과 같은 카파 경쇄-함유 단백질을 분리하는 데 사용될 수 있다. 건강한 인간이 생산하는 항체의 약 75%는 카파 경쇄를 갖고 있으며, 치료용 모노클로날(monoclonal) 항체 및 항체 단편의 약 90%는 카파 경쇄를 함유한다(Carter, P., Lazar, G. Next generation antibody drugs: pursuit of the 'high-hanging fruit'. Nat Rev Drug Discov 17, 197-223 (2018). https://doi.org/10.1038/nrd.2017.227).
모든 생물공정 크로마토그래피 적용은 불순물 및/또는 오염물질의 확실한 제거를 위하여 전반적인 주의를 요구한다. 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지질, 세균 및 바이러스를 포함하는 바람직하지 않은 생체분자 또는 미생물과 같은 불순물 및/또는 오염물질은 크로마토그래피적 과정에서 고정상(stationary phase) 또는 매트릭스에 흡착된 용리되지 않은 분자일 수 있다. 매트릭스로부터 불순물 및/또는 오염물질을 제거하는 것은 일반적으로 목적하는 생성물의 첫 번째 용리 후에 후속 사용 전에 매트릭스 재생을 위해 수행된다. 이러한 제거는 일반적으로 CIP(clean-in-place)라고 불리는 과정을 포함하며, 고정상으로부터 불순물을 불활성화 또는 용리할 수 있는 작용매가 사용된다. 크로마토그래피 매체와 함께 자주 사용되는 작용매의 부류 중 하나는 매트릭스 위를 통과하는 알칼리 용액이다. 현재 가장 광범위하게 사용되는 세정 및 소독제는 NaOH이며, 오염 및 불순물의 정도 및 특성에 따라 0.05에서 예를 들어 최대 1 M 범위 농도로 사용하는 것이 바람직하다. 그러나 단백질 L은 예를 들어 단백질 A와 비교하여 다소 알칼리-감수성 단백질이며, 다수의 사이클에 걸쳐 단지 최대 약 15 mM NaOH가 허용된다. 이는 충분한 세정을 보장하기 위해 요소 또는 구아니디늄 염과 같은 추가의 덜 바람직한 세정 용액이 사용되어야 할 수 있음을 의미한다.
따라서 이 분야에서는 알칼리성 세정 과정에 대한 안정성이 개선된 단백질 L 유래 리간드를 함유하는 분리 매트릭스를 확보할 필요성이 여전히 존재한다.
요약
본 발명자들은 다공성 지지체에 공유 결합된 카파 경쇄-결합 리간드를 포함하는 분리 매트릭스를 제공함으로써 상기 문제를 해결하였고 여기서 상기 카파 경쇄-결합 리간드는 알칼리-안정화된 피네골디아 마그나 (이전에는 펩토스트렙토코쿠스 마그누스) 단백질 L 도메인의 다량체를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 그로 이루어지며; 상기 다공성 지지체는 대류 기반 크로마토그래피 매트릭스이다.
대류 기반 크로마토그래피 매트릭스는 섬유성 기재일 수 있다. 상기 섬유성 기재는 전기방사된 중합체 섬유 또는 셀룰로스 섬유, 임의로 부직 섬유를 기재로 할 수 있다.
중합체는 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 폴리술폰, 폴리아미드, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리아크릴로니트릴, 폴리스티렌, 폴리에틸렌 옥시드, 및 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일 실시양태에 따르면, 섬유성 기재는 섬유성 부직(non-woven) 중합체 매트릭스이다.
상기 섬유성 기재에 포함된 섬유는 10-1000nm, 예컨대 200-800nm, 200-400nm 또는 300-400nm의 단면 직경을 가질 수 있다.
리간드는 섬유성 기재 상에 그라프팅된(grafted) 글리시돌 기에 결합된 디비닐 술폰 작용기에 결합될 수 있다.
상기 카파 경쇄 결합 리간드는 적어도 2개의 알칼리-안정화된 단백질 L 도메인을 포함할 수 있다. 알칼리-안정화된 단백질 L 도메인은 피네골디아 마그나(이전에는 펩토스트렙토코쿠스 마그누스) 단백질 L의 B1 도메인, B2 도메인, B3 도메인, B4 도메인, B5 도메인, C2 도메인, C3 도메인, C4 도메인 및 D1 도메인의 기능적 변이체를 포함하는 군에서 선택될 수 있으며, 여기서 정렬 시에 B2 도메인(서열식별번호 1)에서의 위치 10 및 45에 상응하는 위치는 히스티딘이고, 정렬 시에 B2 도메인(서열식별번호 1)에서의 위치 60에 상응하는 위치는 티로신 또는 글루타민이다. 일 실시양태에서, 알칼리-안정화된 단백질 L 도메인은 B2 도메인, B3 도메인, B4 도메인, C2 도메인, C3 도메인, C4 도메인 및 D1 도메인을 포함하는 군으로부터 선택된다.
알칼리-안정화된 단백질 L 도메인은 갭 개방 페널티(gap open penalty) 12, 갭 확장 페널티(gap extension penalty) 3을 사용한, 75의 BLOSUM 매트릭스에 의해 결정 시에, 서열식별번호 2, 서열식별번호 3, 서열식별번호 4, 서열식별번호 5, 서열식별번호 6, 서열식별번호 7, 서열식별번호 8, 서열식별번호 9, 서열식별번호 10, 서열식별번호 11, 서열식별번호 12, 서열식별번호 13, 서열식별번호 14, 서열식별번호 15, 서열식별번호 16, 서열식별번호 17, 서열식별번호 18 또는 서열식별번호 19의 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성(identity) 또는 77.5 %의 서열 유사성(similarity)을 가질 수 있으며, 여기서 정렬 시에 서열식별번호 1에서의 위치 10 및 45에 상응하는 위치 및 정렬 시에 서열식별번호 1 내의 위치 60에 상응하는 위치는 가변적이지 않다.
알칼리-안정화된 단백질 L 도메인은 갭 개방 페널티 12, 갭 확장 페널티 3을 사용한, 75의 BLOSUM 매트릭스에 의해 결정된 바와 같이, 서열식별번호 20, 서열식별번호 21, 서열식별번호 22, 서열식별번호 23, 서열식별번호 24, 서열식별번호 25, 서열식별번호 26: 서열식별번호 27, 서열식별번호 28, 서열식별번호 29, 서열식별번호 30, 서열식별번호 31, 서열식별번호 32, 서열식별번호 33, 서열식별번호 34, 서열식별번호 35, 서열식별번호 36 또는 서열식별번호 37 중 어느 하나와 적어도 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성 또는 77.5% 서열 유사성을 가질 수 있다.
분리 매트릭스에 대한 리간드 밀도는 적어도 20 mg/ml 다공성 지지체, 또는 적어도 25 mg/ml 다공성 지지체, 또는 적어도 30 mg/ml 다공성 지지체, 또는 적어도 35 mg/ml 다공성 지지체, 또는 적어도 40 mg/ml 다공성 지지체, 또는 적어도 45 mg/ml 다공성 지지체, 또는 적어도 50 mg/ml 다공성 지지체일 수 있다.
분리 매트릭스는 0.4 mL 하이트랩TM 장치에서 10 mL/분의 유량으로 실행 시, 예컨대 트라스투주맙과 같은 카파 경쇄-포함 항체의 동적 결합 용량 (DBC)은 10% 파과에서 25 g/mL일 수 있다.
분리 매트릭스는 0.4 mL 하이트랩TM 기기에서 10 mL/분의 유량으로 실행 시, 예컨대 트라스투주맙과 같은 카파 경쇄-포함 항체의, 동적 결합 용량 (DBC)은 10% 파과에서 45 g/mL일 수 있다.
또한, 카파 경쇄 함유 단백질을 분리하는 방법을 제공하며, 이는 a) 카파 경쇄 함유 단백질을 포함하는 액체 샘플을 분리 매트릭스와 접촉시키는 단계; b) 1종 또는 여러 종의 조합의 세척액으로 상기 분리 매트릭스를 세척하는 단계; c) 용리액을 이용해 분리 매트릭스로부터 카파 경쇄-함유 단백질을 용리하는 단계; 및 d) 분리 매트릭스를 세정액으로 세정하는 단계를 포함하고; 여기서 분리 매트릭스는 0.4 mL 하이트랩TM 기기에서 10 mL/분의 유량으로 실행 시, 예컨대 트라스투주맙과 같은 카파 경쇄-포함 항체의 동적 결합 용량 (DBC)이 10% 파과에서 25 g/mL일 수 있다.
또한, 람다 경쇄-함유 단백질로부터 카파 경쇄-결합 단백질을 단리하는 방법을 제공하며, 이는 a) 카파 경쇄-함유 단백질을 포함하는 액체 샘플을 분리 매트릭스와 접촉시키는 단계; b) 1종 또는 여러 종의 조합의 세척액으로 상기 분리 매트릭스를 세척하는 단계; c) 용리액을 이용해 분리 매트릭스로부터 카파 경쇄-함유 단백질을 용리하는 단계; 및 d) 분리 매트릭스를 세정액으로 세정하는 단계를 포함하고; 여기서 분리 매트릭스는 0.4 mL 하이트랩TM 기기에서 10 mL/분의 유량으로 실행 시, 예컨대 트라스투주맙과 같은 카파 경쇄-포함 항체의 동적 결합 용량 (DBC)이 10% 파과에서 25 g/mL일 수 있다.
또한, 단일-특이적 항체로부터 이중특이적 항체를 분리하는 방법을 제공하며, 이는 a) 이중특이적 항체를 포함하는 액체 샘플을 분리 매트릭스와 접촉시키는 단계; b) 1종 또는 여러 종의 조합의 세척액으로 상기 분리 매트릭스를 세척하는 단계; c) 용리액을 이용해 분리 매트릭스로부터 이중특이적 항체를 용리하는 단계; 및 d) 분리 매트릭스를 세정액으로 세정하는 단계를 포함하고, 여기서 분리 매트릭스는 0.4 mL 하이트랩TM 기기에서 10 mL/분의 유량으로 실행 시, 예컨대 트라스투주맙과 같은 카파 경쇄-포함 항체의 동적 결합 용량 (DBC)이 10% 파과에서 25 g/mL일 수 있다.
상기 개시된 분리 방법 모두에서, 분리는 단계 c)에서 부피 구배 또는 pH 구배를 적용하여 수행된다.
상기에 따른 방법 모두에서, 분리 매트릭스는 상기에 따른 것일 수 있다.
도 1은 실시예 1에서의 프로토타입과 상업제품 사이의 DBC를 비교하는데 사용되는 하이트랩TM 기기(씨티바TM)를 개략적으로 도시하고 있다.
도 2는 20 mL의 pH 구배 기울기에 대한 Fab 및 트라스투주맙에 대한 크로마토그램을 도시한다.
도 3은 40 mL의 pH 구배 기울기에 대한 Fab 및 트라스투주맙에 대한 크로마토그램을 도시한다.
도 4는 60 mL의 pH 구배 기울기에 대한 Fab 및 트라스투주맙에 대한 크로마토그램을 도시한다.
도 5는 88 mL의 pH 구배 기울기에 대한 Fab 및 트라스투주맙에 대한 크로마토그램을 도시한다.
정의
본원에서 용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 상호교환가능하게 사용될 수 있으며, 두 개의 중쇄 (H)와 두 개의 경쇄 (L)로 이루어진, 기본적으로 네 개의 폴리펩타이드 쇄 구조를 갖고 상기 쇄들은 쇄간 또는 쇄내 이황화 결합으로 안정화되는 것인 항원 결합 단백질을 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 HCVR 또는 VH로 약칭됨)과 중쇄 불변 영역 (CH)으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3의 3개의 도메인으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (VL)과 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 단일 도메인인 CL로 이루어진다. 인간에게는 카파 쇄와 람다 쇄의 두 가지 형태의 경쇄가 있다. 해당 용어는 모노클로날 항체 및 이중-특이적 항체를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 항체뿐만 아니라 항체의 단편, 항체 또는 항체 단편을 포함하는 융합 단백질 및 항체 또는 항체 단편을 포함하는 접합체(conjugates)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에서 용어 "카파 경쇄-결합 폴리펩티드" 및 "카파 경쇄-결합 단백질"은 항체의 서브클래스 1, 3 또는 4 카파 경쇄((B H K Nilson et al: J. Bio. Chem. 267, 2234-2239, 1992)에서와 같이 VκI, VκIII 및 VκIV 라고도 불림)에 결합할 수 있는 폴리펩티드 또는 단백질을 각각 의미하며, 상기 결합 특성을 유지하는 예컨대 단백질 L 및 그의 임의의 변이체, 단편 또는 융합 단백질을 포함한다.
용어 "카파 경쇄-함유 단백질"은 "면역글로불린 카파 경쇄-함유 단백질"의 동의어로 사용되며, 본원에서 항체로부터 유래한 서브클래스 1, 3 또는 4 카파 경쇄((B H K Nilson et al: J.Biol. Chem. 267, 10 2234-2239, 1992)에서와 같이 VκI, VκIII 및 VκIV 라고도 불림)를 포함하는 단백질을 의미하고, 서브클래스 1, 3 또는 4 카파 경쇄를 함유하는 임의의 무손상 항체, 항체 단편, 융합 단백질, 접합체 또는 재조합 단백질을 포함한다.
"mAb"이라는 용어는 모노클로날 항체를 의미한다.
"Fab"이라는 용어는 카파 경쇄 또는 람다 경쇄를 포함하는 면역글로불린으로부터의 항원 결합 단편을 의미한다.
"이중-특이적 항체"라는 용어는 두 가지 다른 종류의 항원 또는 동일한 항원 상의 두 가지 다른 에피토프(epitope)에 결합할 수 있는 항체를 의미한다. 마찬가지로, 삼중 특이적 항체는 3가지 다른 종류의 항원 또는 동일한 항원 상의 3가지 다른 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 의미한다.
"DBC"는 동적 결합 용량(Dynamic binding capacity)을 의미하며, 실행 조건하에 즉, 샘플 적용 동안 팩킹된 친화성 크로마토그래피 칼럼에서의 결합용량이다. 크로마토그래피 수지의 DBC는 비결합 단백질의 유의한 파과가 발생하기 전에 주어진 유량 조건 하에서 수지에 결합하는 표적 단백질의 양이다. DBC는 알려진 농도의 표적 단백질이 함유된 샘플을 로딩하고 유동 통과액(flow through)을 모니터링함으로써 결정된다. 단백질은 특정 중단점(break point)까지 수지에 결합한 후에 비결합 단백질이 칼럼을 통과하게 된다.
DBC는 파과 곡선 상에서 예를 들어 10% 단백질 손실 시 결정될 수 있다. 이를 Qb10% 값이라고 하거나 또는 단순히 Qb10%라 부른다. 샘플은 특정 체류 시간(residence time) 동안 크로마토그래피 수지 칼럼에 적용되며, 각 수지에 대한 동적 결합 용량은 단백질 파과 10%로 계산되며, 즉 칼럼 유출물 중 표적 샘플 농도가 액체 샘플 중 표적 샘플 농도의 10%일 때까지 칼럼에 로드되는 표적 샘플의 양으로 계산된다. 각 수지에 대한 동적 결합 용량을 파과 용량 80%로 계산하는 경우, 이를 Qb80% 값이라고 한다.
본원에서 사용되는 용어 "액체 샘플"이란 존재하는 다른 물질로부터도 정제하고자 하는 적어도 1종의 표적 물질을 함유하는 액체를 의미한다. 액체 샘플은 예를 들어 수성 용액, 유기 용매 시스템, 수성/유기 용매 혼합물 또는 용액일 수 있다. 소스 액체란 많은 생물학적 분자(예를 들어 단백질, 항체, 호르몬 및 바이러스), 소분자(예를 들어 염, 당류, 지질 등) 및 심지어 입자상 물질을 함유하는 복합 혼합물 또는 용액이다. 생물학적 기원의 전형적인 소스 액체가 수용액 또는 현탁액으로 시작될 수 있지만, 용매 침전, 추출 등과 같은 초기 분리 단계에서 사용된 유기 용매도 함유할 수 있다. 본 발명의 다양한 실시양태에 의한 정제에 적합한 가치 있는 생물학적 물질을 포함할 수 있는 액체 샘플의 예로는 생물 반응기로부터의 배양 상청액, 균질화 세포 현탁액, 혈장, 혈장 분획 및 유액를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 대안적으로, 액체 샘플은 "정화된 세포 배양 피드" 또는 "CCF"라고 할 수 있다.
"완충제"는 용액 내에 존재함으로써 pH 단위 변화를 일으키기 위해 첨가되어야 하는 산 또는 알칼리의 양을 증가시키는 물질이다. 완충용액은 산-염기 공액 성분의 작용에 의해 pH 변화에 저항한다. 생물학적 시약에 사용하기 위한 완충 용액은 일반적으로 수소 이온의 농도를 일정하게 유지하여 용액의 pH가 생리적 범위 내에 있게 한다. 용어 "생리적 pH"란 포유류 혈액의 pH 즉, 7.38 또는 약 7.4를 지칭한다. 따라서, 생리적 pH 범위는 약 7.2 내지 7.6이다. 전통적인 완충제 성분은 유기 및 무기 염, 산 및 염기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 생물학적 분자(예를 들어, 단백질 분자)의 정제에 사용되는 예시적인 완충제는 쯔비터 이온성(zwitterionic) 또는 "좋은" 완충제([Good et al. (1966) Biochemistry 5:467 and Good and Izawa (1972) Methods Enzymol. 24:62] 등을 참조)를 포함한다.
"평형 완충제"는 표적 단백질을 함유하는 소스 액체의 로딩에 사용되는 결합 시약, 고체상 또는 둘 모두를 제조하는 데 사용되는 완충제이다. 평형 완충제는 바람직하게 등장성이며, 통상적으로 약 6 내지 약 8의 범위의 pH를 갖는다. "로딩 완충제"는 결합제가 고정된 고체상에, 결합 영역 함유 단백질 및 불순물을 함유하는 소스 액체 또는 액체 샘플을 로딩하기 위해 사용되는 완충제이다. 흔히 평형 완충제와 로딩 완충제는 동일하다.
본원에서 사용되는 "세척액" 또는 "세척 완충제"는 모두 표적 물질과 결합된 크로마토그래피 수지로부터 불순물을 운반하는 데 사용되는 액체를 의미한다. 1종 초과의 세척액은 순차적으로, 예를 들어 크로마토그래피 수지와 비특이적으로 회합된 다양한 종류의 불순물을 해리시키고 제거하도록 설계된 pH, 전도도, 용매 농도 등 다양한 특성을 가진 연속 세척액으로, 사용될 수 있다.
본원에서 상호교환가능하게 사용되는 "용리액" 또는 "용리 완충제"는 1종 이상의 세척액으로 세척한 후 크로마토그래피 수지로부터 표적 물질을 해리시켜, 고정된 결합제로부터 결합 영역 함유 단백질을 용리하는 데 사용되는 액체를 의미한다. 용리액은 표적 물질을 비가역적으로 변성시키지 않고 해리시키는 작용을 한다. 전형적인 용리액은 크로마토그래피 기술분야에서 잘 알려져 있으며 상이한 pH (일반적으로 낮은 pH), 고농도의 염, 자유 친화성 리간드 또는 유사체, 또는 크로마토그래피 수지로부터 표적 물질의 해리를 촉진하는 다른 물질을 가질 수 있다. "용리 조건"이란 표적물질-결합 크로마토그래피에 작용되는 공정 조건을 의미하며, 예컨대 표적 물질-결합 크로마토그래피 수지를 용리액 또는 용리 완충제와 접촉시켜 이러한 해리를 일으키는 조건을 지칭한다.
바람직하게는, 용리 완충제는 pH가 낮아 카파 경쇄 결합 분리 매트릭스와 관심 단백질 간의 상호작용을 방해한다. 바람직하게는, 낮은 pH 용리 완충제는 약 2내지 약 5 범위의 pH를 가지며, 가장 바람직하게는 약 3 내지 약 4 범위의 pH를 갖는다. 이 범위 내에서 pH를 제어하는 완충제의 예로는 글리신, 포스페이트, 아세테이트, 및 시트레이트 완충제 및 이들의 조합을 포함한다. 바람직한 상기 완충제는 시트레이트 및 아세테이트 완충제, 가장 바람직하게는 시트레이트 또는 아세트산나트륨 완충제이다.
세정액은 표적 물질의 용리 후에 수지 잔여물을 제거하기 위한 산성 용액 또는 알칼리 용액일 수 있다. 예를 들어, 침전 단백질, 소수성 단백질, 핵산, 내독소 및 바이러스는 세정액에 의해 제거될 수 있다. 가장 일반적으로 알칼리 용액이 이러한 목적을 위해 사용된다.
크로마토그래피 칼럼의 효율적인 사용을 위해서는 CIP가 중요한 공정이다. 칼럼을 재사용할 수 있는 사이클의 수를 최대화하기 위해서는 크로마토그래피 수지에 해를 끼치지 않고 불순물을 효율적으로 제거하는 세정 과정이 필요하다.
본원에서 사용된 "포함한다", "포함하는", "함유하는", "갖는" 등의 용어는 "포함한다", "포함하는" 등을 의미할 수 있으며, "본질적으로 이루어지는" 또는 "본질적으로 이루어진다"는 개방형 용어로서, 언급된 기본적 또는 신규 특성이, 언급된 특성 이외의 것의 존재에 의해 변화되지 않는 한 언급된 특성 이외의 것의 존재를 허용하지만, 선행 기술의 실시양태는 배제한다.
본 발명자들은 알칼리성 세정 과정에 대해 안정성을 개선하면서 크로마토그래피 설정에서 결합 용량 및 유량 특성이 만족할만한 효율성을 유지하도록 하고, 바람직하게는 현재 상업적으로 구매 가능한 분리 매트릭스보다 더 우수한 단백질 L 유래 리간드를 함유하는 분리 매트릭스를 발명하는 것을 표적로 했다.
일 양태에 따르면, 이러한 표적은 다공성 지지체에 공유 결합된 카파 경쇄-결합 리간드를 포함하는 분리 매트릭스를 제공함으로써 달성되었으며, 여기서 상기 카파 경쇄-결합 리간드는 알칼리-안정화된 피네골디아 (이전에는 펩토스트렙토코쿠스) 단백질 L 도메인의 다량체(multimer)를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어지며, 상기 다공성 지지체는 대류 기반 크로마토그래피 매트릭스이다.
본 발명의 분리 매트릭스에 포함되는 카파 경쇄-결합 리간드는 알칼리-안정화된 피네골디아 단백질 L 도메인의 다량체를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어져있거나, 또는 그로 이루어진다. 단백질 L 도메인은 알칼리 안정화가 되어 있는 한 임의의 기능적 단백질 L 유래 도메인일 수 있다. 단백질 L 도메인은 B1 도메인, B2 도메인, B3 도메인, B4 도메인, B5 도메인, C2 도메인, C3 도메인, C4 도메인 및 D1 도메인의 기능적 변이체로부터 선택되며, 여기서 정렬 시에 B2 도메인 (서열식별번호 1)에서의 위치 10 및 45에 상응하는 위치는 히스티딘이며, 정렬 시에 B2 wt 도메인 (서열식별번호 1)에서의 위치 60에 상응하는 위치는 티로신 또는 글루타민이다. 따라서, B2 wt 도메인(서열식별번호 1)에서의 위치 10, 45 및 60에 상응하는 상기 언급된 위치는 기능적 단백질 L 도메인 내에서 가변적이지 않다.
서열식별번호 1 (wt B2)
PKEEVTIKANLIYADGKTQTAEFKGTFEEAAAEAYRYADALKKDNGEYTVDVADKGYTLNIKFAGKEKTPEE
상기 기능적 단백질 L 도메인의 예는 다음과 같다.
서열식별번호 2 (B2: N10H, N45H, N60Y 돌연변이)
PKEEVTIKAHLIYADGKTQTAEFKGTFEEAAAEAYRYADALKKDHGEYTVDVADKGYTLYIKFAGKEKTPEE
서열식별번호 3 (B2: N10H, N45H, N60Q 돌연변이)
PKEEVTIKAHLIYADGKTQTAEFKGTFEEAAAEAYRYADALKKDHGEYTVDVADKGYTLQIKFAGKEKTPEE
서열식별번호 4 (B3: N10H, N45H, N60Y 돌연변이)
PKEEVTIKAH LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKEHGKYTV DVADKGYTLY IKFAGKEKTP EE
서열식별번호 5 (B3: N10H, N45H, N60Q 돌연변이)
PKEEVTIKAH LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKEHGKYTV DVADKGYTLQ IKFAGKEKTP EE
서열식별번호 6 (B1: N10H, N45H, N60Y 돌연변이)
SEEEVTIKAHLIFANGSTQTAEFKGTFEKATSEAYAYADTLKKDHGEYTVDVADKGYTLYIKFAGKEKTPEE
서열식별번호 7 (B1: N10H, N45H, N60Q 돌연변이)
SEEEVTIKAHLIFANGSTQTAEFKGTFEKATSEAYAYADTLKKDHGEYTVDVADKGYTLQIKFAGKEKTPEE
서열식별번호 8 (B4: N10H, N45H, N60Y 돌연변이)
PKEEVTIKAHLIYADGKTQTAEFKGTFAEATAEAYRYADLLAKEHGKYTADLEDGGYTIYIRFAGKKVDEKPEE
서열식별번호 9 (B4: N10H, N45H, N60Q 돌연변이)
PKEEVTIKAHLIYADGKTQTAEFKGTFAEATAEAYRYADLLAKEHGKYTADLEDGGYTIQIRFAGKKVDEKPEE
서열식별번호 10 (B5: N9H, N44H, N59Y 돌연변이)
KEQVTIKEHIYFEDGTVQTATFKGTFAEATAEAYRYADLLSKEHGKYTADLEDGGYTIQIRFAGKEEPEE
서열식별번호 11 (B5: N9H, N44H, N59Q 돌연변이)
KEQVTIKEHIYFEDGTVQTATFKGTFAEATAEAYRYADLLSKEHGKYTADLEDGGYTIQIRFAGKEEPEE
서열식별번호 12 (C2b N57Y: N10H, N45H, N60Y 돌연변이)
PKEEVTIKVHLIFADGKTQTAEFKGTFEEATAKAYAYADLLAKEHGEYTADLEDGGYTIYIKFAGKETPETPEE
서열식별번호 13 (C2b N57Y: N10H, N45H, N60Q 돌연변이)
PKEEVTIKVHLIFADGKTQTAEFKGTFEEATAKAYAYADLLAKEHGEYTADLEDGGYTIQIKFAGKETPETPEE
서열식별번호 14 (C3b N39D, N57Y: N10H, N45H, N60Y 돌연변이)
PKEEVTIKVHLIFADGKIQTAEFKGTFEEATAKAYAYADLLAKEHGEYTADLEDGGYTIYIKFAGKETPETPEE
서열식별번호 15 (C3b N39D, N57Y: N10H, N45H, N60Q 돌연변이)
PKEEVTIKVHLIFADGKIQTAEFKGTFEEATAKAYAYADLLAKEHGEYTADLEDGGYTIQIKFAGKETPETPEE
서열식별번호 16 (C4: N10H, N45H, N60Y 돌연변이)
PKEEVTIKVHLIFADGKTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADLLAKVHGEYTADLEDGGYTIYIKFAGKEQPGENPG
서열식별번호 17 (C4: N10H, N45H, N60Q 돌연변이)
PKEEVTIKVHLIFADGKTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADLLAKVHGEYTADLEDGGYTIQIKFAGKEQPGENPG
서열식별번호 18 (D1: N10H, N45H, N60Y 돌연변이)
PKEEVTIKAHLIFADGKTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADLLAKVHGEYTADLEDGGYTIYIKFAGKEQPGEN
서열식별번호 19 (D1: N10H, N45H, N60Q 돌연변이)
PKEEVTIKAHLIFADGKTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADLLAKVHGEYTADLEDGGYTIQIKFAGKEQPGEN
바람직하게, 단백질 L 도메인은 B3 도메인, C2 도메인, C3 도메인 및 D 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 정렬 시에 B2 wt 도메인(서열식별번호 1)에서의 위치 10 및 45에 상응하는 위치는 히스티딘이고, 정렬 시에 B2 wt 도메인(서열식별번호 1) 위치 60에 상응하는 위치는 티로신 또는 글루타민이다. B2 wt 도메인(서열식별번호 1)에서의 위치 10, 45 및 60에 상응하는 상기 언급된 위치는 기능적 단백질 L 도메인 내에서 가변적이지 않다.
상기 기능적 단백질 L 도메인의 나머지 위치는 3차원 구조가 B2 wt 도메인(서열식별번호 1)에 비해 변경되지 않는 한, 그리고 적어도 카파 경쇄 결합 용량이 유지되고 B2 wt 도메인(서열식별번호 1)에 비해 알칼리-안정화된 상태인 한 가변적일 수 있다. 이러한 변이는 유사하거나 동일한 전하, 소수성 등을 갖는 아미노산에 대한 보존적인 아미노산 치환일 수 있고, 통상의 기술자는 이러한 아미노산 변이가 무엇인지 결정할 수 있다.
단백질 L 도메인은 갭 개방 페널티 12, 갭 확장 페널티 3 을 사용한, 75의 BLOSUM 매트릭스에 의해 결정 시에, 서열식별번호 2, 서열식별번호 3, 서열식별번호 4, 서열식별번호 5, 서열식별번호 6, 서열식별번호 7, 서열식별번호 8, 서열식별번호 9, 서열식별번호 10, 서열식별번호 11, 서열식별번호 12, 서열식별번호 13, 서열식별번호 14, 서열식별번호 15, 서열식별번호 16, 서열식별번호 17, 서열식별번호 18 또는 서열식별번호 19 중 어느 하나와 적어도 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성 또는 77.5% 서열 유사성을 가질 수 있다.
기능적 단백질 L 도메인은 말단 절단된 서열일 수 있다. 예를 들어, B2 wt 도메인(서열식별번호 1)에서의 위치 1-4에 상응하는 위치는 결실될 수 있다. 예를 들어, B2 wt 도메인 (서열식별번호 1)에서의 위치 65의 위치들에 상응하는 위치는 결실될 수 있다.
서열식별번호 20 (B1_trunc, N6H, N41H, N56Y 돌연변이)
VTIKAHLIFANGSTQTAEFKGTFEKATSEAYAYADTLKKDHGEYTVDVADKGYTLYIKFAG
서열식별번호 21 (B1_trunc, N6H, N41H, N56Q 돌연변이)
VTIKAHLIFANGSTQTAEFKGTFEKATSEAYAYADTLKKDHGEYTVDVADKGYTLQIKFAG
서열식별번호 22 (B2_trunc, N6H, N41H, N56Y 돌연변이)
VTIKAHLIYADGKTQTAEFKGTFEEAAAEAYRYADALKKDHGEYTVDVADKGYTLYIKFAG
서열식별번호 23 (B2_trunc, N6H, N41H, N56Q 돌연변이)
VTIKAHLIYADGKTQTAEFKGTFEEAAAEAYRYADALKKDHGEYTVDVADKGYTLQIKFAG
서열식별번호 24 (B3_trunc, N6H, N41H, N56Y 돌연변이)
VTIKAHLIYADGKTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADLLAKEHGKYTVDVADKGYTLYIKFAG
서열식별번호 25 (B3_trunc, N6H, N41H, N56Q 돌연변이)
VTIKAHLIYADGKTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADLLAKEHGKYTVDVADKGYTLQIKFAG
서열식별번호 26 (B4_trunc, N6H, N41H, N56Y 돌연변이)
VTIKAHLIYADGKTQTAEFKGTFAEATAEAYRYADLLAKEHGKYTADLEDGGYTIYIRFAG
서열식별번호 27 (B4_trunc, N6H, N41H, N56Q 돌연변이)
VTIKAHLIYADGKTQTAEFKGTFAEATAEAYRYADLLAKEHGKYTADLEDGGYTIQIRFAG
서열식별번호 28 (B5_trunc, N6H, N41H, N56Y 돌연변이)
VTIKEHIYFEDGTVQTATFKGTFAEATAEAYRYADLLSKEHGKYTADLEDGGYTIYIRFAG
서열식별번호 29 (B5_trunc, N6H, N41H, N56Q 돌연변이)
VTIKEHIYFEDGTVQTATFKGTFAEATAEAYRYADLLSKEHGKYTADLEDGGYTIQIRFAG
서열식별번호 30 (C2b N57Y _trunc, N6H, N41H, N56Y 돌연변이)
VTIKVHLIFADGKTQTAEFKGTFEEATAKAYAYADLLAKEHGEYTADLEDGGYTIYIKFAG
서열식별번호 31 (C2b N57Y _trunc, N6H, N41H, N56Q 돌연변이)
VTIKVHLIFADGKTQTAEFKGTFEEATAKAYAYADLLAKEHGEYTADLEDGGYTIQIKFAG
서열식별번호 32 (C3b N39D, N57Y trunc, N6H, N41H, N56Y 돌연변이)
VTIKVHLIFADGKIQTAEFKGTFEEATAKAYAYADLLAKEHGEYTADLEDGGYTIYIKFAG
서열식별번호 33 (C3b N39D, N57Y_trunc, N6H, N41H, N56Q 돌연변이)
VTIKVHLIFADGKIQTAEFKGTFEEATAKAYAYADLLAKEHGEYTADLEDGGYTIQIKFAG
서열식별번호 34 (C4_trunc, N6H, N41H, N56Y 돌연변이)
VTIKVHLIFADGKTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADLLAKVHGEYTADLEDGGYTIYIKFAG
서열식별번호 35 (C4_trunc, N6H, N41H, N56Q 돌연변이)
VTIKVHLIFADGKTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADLLAKVHGEYTADLEDGGYTIQIKFAG
서열식별번호 36 (D1_trunc, N6H, N41H, N56Y 돌연변이)
VTIKAHLIFADGKTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADLLAKVHGEYTADLEDGGYTIYIKFAG
서열식별번호 37 (D1_trunc, N6H, N41H, N56Q 돌연변이)
VTIKAHLIFADGKTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADLLAKVHGEYTADLEDGGYTIQIKFAG
단백질 L 도메인은 갭 개방 페널티 12, 갭 확장 페널티 3을 사용한, 75의 BLOSUM 매트릭스에 의해 결정 시에, 서열식별번호 20, 서열식별번호 21, 서열식별번호 22, 서열식별번호 23, 서열식별번호 24, 서열식별번호 25, 서열식별번호 26, 서열식별번호 27, 서열식별번호 28, 서열식별번호 29, 서열식별번호 30, 서열식별번호 31, 서열식별번호 32, 서열식별번호 33, 서열식별번호 34, 서열식별번호 35, 서열식별번호 36 또는 서열식별번호 37 중 어느 하나와 적어도 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성 또는 77.5% 서열 유사성을 가질 수 있다.
상기에서 알 수 있는 바와 같이, C2 도메인 및 C3 도메인은 추가적인 돌연변이를 포함한다. C2 도메인 스캐폴드는 추가적인 N57Y 돌연변이를 포함하고, 본원에서 C2b로 명명된다. C3 도메인 스캐폴드는 추가적인 N39D 및 N57Y 돌연변이를 포함하고, 본원에서 C3b로 명명된다.
상기 설명된 바와 같이, 분리 매트릭스에 포함되는 카파 경쇄-결합 리간드는 알칼리-안정화된 단백질 L 도메인의 다량체를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어진다. 다량체는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 9개의 알칼리-안정화된 단백질 L 도메인을 포함할 수 있다. 달리 말하면, 다량체는 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체, 칠량체, 팔량체 또는 구량체일 수 있다. 바람직하게 리간드는 4개, 5개, 6개 또는 7개의 알칼리-안정화된 단백질 L 도메인, 예컨대 5개 또는 6개의 알칼리-안정화된 단백질 L 도메인을 포함한다.
다량체는 링커(linker), 스페이서(spacer) 또는 추가 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. 추가 아미노산(들)은 예를 들어, 리간드의 복제(cloning) 과정 및 발현으로부터 유래하거나, 절단된 신호전달 서열로부터의 잔기를 구성할 수 있다. 통상의 기술자는 상기 추가 아미노산(들)이 다량체의 카파 경쇄 결합 기능에 영향을 미치지 않고 변할 수 있음을 이해하고, 인지할 것이다.
다공성 지지체는 대류 기반 크로마토그래피 매트릭스를 포함한다. 상기 대류 기반 크로마토그래피 매트릭스는 섬유성 기재일 수 있다. 상기 섬유성 기재는 전기방사된 중합체 섬유 또는 셀룰로스 섬유, 임의로 부직 섬유를 기재할 수 있으며, 이는 사용 시에 이동상이 투과할 수 있는 복수의 공극을 포함하는 고정상을 형성한다. 따라서 섬유성 기재는 섬유성 부직 중합체 매트릭스일 수 있다. 상기 섬유성 기재는 씨티바TM의 하이트랩 피브로TM(FibroTM) 유닛에서 찾아볼 수 있다.
대류 기반 크로마토그래피 지지체 물질은 높은 유량과 높은 결합 용량의 조합을 가능하게 하고, 따라서, 예를 들어 mAb 정제에 사용하기 위한 관심 대상이다.
중합체 섬유는 부직 섬유일 수 있다. 무작위로 침착된 섬유 매트(부직) 구조를 사용하면 유동 지연을 촉진시켜 채널링(channeling)을 막을 수 있다.
중합체 섬유는 전기방사된 것일 수 있다. 전기방사는 일관된 치수의 섬유를 제공하며, 상이한 비율의 섬유를 만들기 위해 쉽게 조정(예를 들어, 방사하는 동안 대기 특성을 변화시킴으로써)될 수 있다. 전기방사는 특히 층상 멤브레인을 만들 때 유용한, 우수한 분배 특성을 보여주는 기술이다. 섬유 물질 전달 특성은 유량 비의존성 분리를 가능하게 하는 모노리스(monolith) 구조의 특성과 유사한 것으로 나타났다.
본 발명에 사용되는 중합체는 임의의 특정 중합체에 국한되지 않고, 구체적인 용도에 맞추어 사용될 수 있다. 중합체는 예를 들어 나일론, 폴리(아크릴산), 폴리아크릴로니트릴, 폴리스티렌, 폴리술폰, 폴리아크릴로니트릴, 폴리카프로락톤, 콜라겐, 키토산, 아가로스 및 폴리에틸렌 옥시드 및 그의 조합일 수 있다. 중합체는 전기방사 적합성을 개선하기 위해 중합체의 용해도 및/또는 기타 특성을 개선하도록 유도체화될 수 있다. 유도체화된 중합체 (예를 들어, 폴리에테르 술폰, 셀룰로스 아세테이트 또는 폴리(아크릴로니트릴-코-아크릴산)를 전기방사 후 처리하여 원래의 중합체를 재생하거나 유도체화하여 새로운 기능을 추가로 생성할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 중합체는 전형적으로 셀룰로스이다. 셀룰로스는 용이하게 입수가능하고, 저렴하고, 생분해성이고, 생물학적으로 적합성이며, 낮은 비-특이적 결합을 유발하는 친수성 표면을 갖기 때문에 종종 사용된다.
중합체 섬유는 공유 결합으로 가교될 수 있다. 섬유의 전기방사 네트워크가 만들어지면, 섬유가 열, 화학 또는 다른 방법에 의해 서로 교차하는 지점에서 섬유는 함께 융합될 수 있다. 이는 수동 조작 특성을 개선한다.
섬유는 10nm 내지 1000nm의 직경을 가질 수 있다. 섬유는 200nm 내지 800nm의 직경을 가질 수 있고, 심지어 300nm 내지 400nm의 직경을 가질 수 있다. 이 크기의 섬유는 공극 크기 및 크기 분포의 일관성을 개선한다.
섬유는 10cm 초과의 평균 길이를 가질 수 있다. 전기방사에 의해 생성된 섬유는 전형적으로 통상의 크로마토그래피 매체에서 발견되는 섬유보다 훨씬 더 길다. 더 긴 섬유는 개선된 층상 특성을 제공한다. 일부 경우에, 전기방사가 단일 소스로부터 나오는 섬유를 포함하는 경우, 단일 연속 섬유가 생성되고, 멤브레인은 이러한 섬유 단독으로부터, 또는 소수(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10)의 장섬유로부터 형성될 수 있다.
고정상의 공극은 직경이 10nm 내지 10μm일 수 있고, 보통 25nm 내지 5μm일 수 있으며 직경이 50nm 내지 2μm일 수 있다. 이러한 크기 범위 내의 공극 크기를 사용하면 크로마토그래피 매체의 오염을 최소화하고 입자 계면에서의 분극, 농축 및 거부로 인한 생성물 손실을 줄일 수 있다. 그러나 공극은 표적 성분이 매체와 접촉하지 않고 멤브레인을 통과하는 손실을 최소화하기에 충분하도록 작게 유지된다. 이러한 공극의 크기를 선택함으로써 용량의 양호한 이용 및 보다 예리한 파과 곡선이 보장된다. 유사한 공극 크기를 갖는 멤브레인 구조의 경우, 섬유 구조는 상 반전(phase inversion)에 의해 생성된 전통적인 멤브레인보다 수성 유동물에 대해 1.5 내지 2배 더 투과성임이 이전에 입증되었다. 이는 전기방사 공정에 의해 만들어지는 비교적 높은 표면 다공도에 때문이다. 이전에 평균 섬유 직경이 300nm인 부직 섬유 멤브레인이 약 500nm의 평균 공극 크기를 함유한 한편, 49%의 공극률을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 섬유 멤브레인을 전기방사함으로써, 전통적으로 형성된 멤브레인에서 기대할 수 있는 것보다 훨씬 높은 수준의 분포의 높은 표면 다공도를 달성할 수 있는데, 전통적인 경우에는 공극 크기가 감소함에 따라 표면 다공도가 감소하는 관계가 지배적이다.
공극은 좁은 크기 분포를 가질 수 있고, 여기서 공극 직경의 표준 편차는 바람직하게는 250nm 이하이다. 공극 크기 균일성은, 축방향 및 반경방향 확산 및 수착(sorption) 동역학과 같은 여러 요인 중 하나로, 크로마토그래피(특히, 친화성 크로마토그래피)에서의 주요 성능 요인, 예컨대 파과 곡선(BTC) 예리함(sharpness)에 영향을 미치는 것으로 알려져있다.
상기 개시된 섬유는 리간드가 그에 고정되기 전에 관능화된다. 대류 기반 크로마토그래피 매트릭스의 제조는 예를 들어 WO/2019/137869 및 WO/2013/068741에 개시되어 있으며, 이들은 그 전문이 참조로 포함된다.
본 개시내용에서 "멤브레인"은 흔히 다공성 지지체와 상호교환가능하게 사용된다. "멤브레인"이 사용될 때마다 강기 개시된 다공성 지지체 물질을 지칭한다는 점이 분명할 것이다. 다공성 지지체에서 달성되는 리간드 밀도는 적어도 20 mg 리간드/ml 다공성 지지체, 또는 적어도 25 mg 리간드/ml 다공성 지지체, 예컨대 적어도 30 mg 리간드/ml 다공성 지지체, 예컨대 적어도 35 mg 리간드/ml 다공성 지지체, 또는 적어도 40 mg 리간드/ml 다공성 지지체, 또는 적어도 45 mg 리간드/ml 다공성 지지체, 또는 적어도 50 mg/ml 다공성 지지체이다.
본 발명의 분리 매트릭스는 0.4 mL 하이트랩TM 기기에서 10 mL/분의 유량으로 실행 시, 예컨대 트라스투주맙과 같은 카파 경쇄-포함 항체의 동적 결합 용량 (DBC)은 10% 파과에서 25 g/mL이다. 바람직한 일 실시양태에 따르면, 본 발명의 분리 매트릭스는 0.4 mL 하이트랩TM 기기에서 10 mL/분의 유량으로 실행 시, 예컨대 트라스투주맙과 같은 카파 경쇄-포함 항체의 동적 결합 용량 (DBC)은 10% 파과에서 45 g/mL이다.
본 발명은 카파 경쇄 결합 단백질의 단리 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 바람직하게는 상기 언급된 바와 같은 분리 매트릭스와 함께 수행된다. 단리는 세포 배양물 또는 카파 경쇄 결합 단백질을 포함하는 다른 액체로부터 이루어질 수 있다.
따라서, 본 개시는 하기 단계를 포함하는, 카파 경쇄 함유 단백질을 단리하는 방법을 제공한다:
a) 카파 경쇄 함유 단백질을 포함하는 액체 샘플을 분리 매트릭스와 접촉시키는 단계;
b) 1종 또는 여러 종의 조합의 세척액으로 상기 분리 매트릭스를 세척하는 단계;
c) 용리액을 이용해 분리 매트릭스로부터 카파 경쇄-함유 단백질을 용리하는 단계; 및
d) 분리 매트릭스를 세정액으로 세정하는 단계,
분리 매트릭스는 0.4 mL 하이트랩TM 기기에서 10 mL/분의 유량으로 실행 시, 예컨대 트라스투주맙과 같은 카파 경쇄-포함 항체, 동적 결합 용량 (DBC)은 10% 파과에서 28g/mL이다. 일 실시양태에 따르면, 상기 개시된 분리 매트릭스가 상기 방법에 사용된다.
이중특이적 항체 또는 IgG 분자의 생성은 경쇄 및 중쇄의 쌍형성으로 어렵고 결과적으로 가변 도메인(VL; VH)은 뒤섞일 수 있다. 일반적으로 단지 하나의 특이적 비대칭 조합을 필요로 하기 때문에 두 개의 상이한 경쇄와 두 개의 상이한 중쇄를 쌍형성하는 것은 다수의 쌍형성 오류로 이어질 수 있고, 달성된 다수의 조합은 비-기능적 또는 원치 않는 분자, 예를 들어 단일특이적 동종이량체(homodimer)가 될 수 있다. 따라서, 단일특이적 항체로부터 이중특이적 항체를 분리하고, 잘못 매칭된 항체를 정확히 매칭된 이중특이적 항체로부터 분리하기 위한 개선된 도구 및 방법의 필요성이 증가하고 있다. 이는 이중특이적 항체에 포함된 상이한 경쇄에 기반하여 분리함으로써 수행될 수 있다.
또 다른 양태에 따르면, 하기 단계를 포함하는 이중특이적 항체 분리 방법이 본원에 제공된다:
a) 카파 경쇄-함유 단백질을 포함하는 액체 샘플을 분리 매트릭스와 접촉시키는 단계,
b) 1종 또는 여러 종의 조합의 세척액으로 상기 분리 매트릭스를 세척하는 단계,
c) 용리액을 이용해 분리 매트릭스로부터 카파 경쇄-함유 단백질을 용리하는 단계, 및
d) 분리 매트릭스를 세정액으로 세정하는 단계.
분리 매트릭스는 0.4 mL 하이트랩TM 기기에서 10 mL/분의 유량으로 실행 시, 예컨대 트라스투주맙과 같은 카파 경쇄-포함 항체의 동적 결합 용량 (DBC)은 10% 파과에서 28 g/mL일 수 있다.
일 실시양태에서 따르면, 상기 개시된 분리 매트릭스가 상기 방법에서 사용된다.
용리 단계는 부피 구배를 사용하여 수행될 수 있다. 이는 실시예 X에 제시되어 있다. 또는 용리 단계는 pH 구배를 사용하여 수행될 수 있다.
이 방법은 카파 경쇄의 존재를 기반으로 단일특이적 항체, 또는 잘못 매칭된 항체로부터 이중특이적 항체를 분리할 수 있다. 모노클로날 항체는 두 개의 동일한 카파 경쇄를 갖는다. 이중특이적 항체는 두 개의 상이한 카파 경쇄를 포함하도록 설계될 수 있다.
카파 경쇄를 포함하지 않는 항체, 예를 들어 두 개의 람다 경쇄는 분리 매트릭스에 결합하지 않을 것이고, 결과적으로 단계 a) 동안 유출 유동물에 존재하거나 단계 b) 동안 세척 제거될 것이다. 적어도 하나의 카파 경쇄를 갖는 임의의 항체는 분리 매트릭스에 결합한다. 용리 시, 단지 하나의 카파 경쇄를 갖는 항체는 두 개의 카파 경쇄를 갖는 항체보다 먼저 용리될 것이다.
서브클래스 1, 3 또는 4 카파 경쇄에 결합하는 상기 개시된 바와 같은 분리 매트릭스를 사용함으로써, 서브클래스 1, 3 또는 4의 1 또는 2개의 카파 경쇄를 포함하는 항체 또는 항체 단편으로부터 서브클래스 2의 1 또는 2개의 카파 경쇄를 포함하는 항체 또는 항체 단편을 분리하는 것이 또한 가능하다. 상기와 동일한 원리에 의해, 서브클래스 2의 2개의 카파 경쇄, 또는 서브클래스 2의 1개의 카파 경쇄 및 람다 경쇄를 포함하는 항체는 분리 매트릭스에 결합하지 않을 것이고, 따라서 단계 a) 동안 유출 유동물에 존재하거나 단계 b) 동안 세척 제거될 것이다. 서브클래스 2의 하나의 카파 경쇄 및 서브클래스 1, 3 또는 4 중 어느 하나의 카파 경쇄를 갖는 항체는 서브클래스 1, 3 및 4 중 어느 하나의 2개의 카파 경쇄를 갖는 항체보다 먼저 용리될 것이다.
실시예
아래 실시예에 사용된 물질의 일반적인 제조 방법은 다음과 같다.
1: 하나 이상의 중합체 섬유(셀룰로스 아세테이트(CA))로 형성된 기재를 수득하는 단계
2: CA를 글리시돌 중합 및 비누화(saponification)에 적용하는 단계
3: 디비닐 술폰 (DVS)을 사용하여 단계 2로부터의 물질을 관능화하는 단계
4: 하기 단계를 포함하는, 단계 3에서 수득된 물질 상에 카파 경쇄-결합 리간드를 고정하는 단계;
● 카파 경쇄-결합 리간드의 환원 및 탈염;
● 진탕 테이블(shaking table) 상에서 단계 3으로부터 수득된 물질 위 상에 환원된 카파 경쇄-결합 리간드를 고정;
● 카파 경쇄-결합 리간드-고정 물질의 세척
5: 1-티오글리세롤을 사용하여 잔류 비닐 기를 불활성화 하는 단계
6: 상기 물질을 세척하여 비결합된 카파 경쇄-결합 리간드를 가능한 한 많이 제거하는 단계.
본원에 달리 명시되지 않는 한, 단계는 WO/2019/137869 및 WO/2018/011600의 실시예 6에 개시된 방법에 따라 수행되었다.
단백질 환원
단백질 용액에, 황산나트륨 (1.4 M)을 첨가하고, 모두 용해되었을 때, 디티오트레이톨 (DTT, 0.1 M)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 진탕 테이블 (23℃, 500 rpm)에 넣고, 밤새 환원되도록 두었다.
탈염
탈염은 세파덱스-G-25 매체를 함유하는 사전-패킹된 PD10 칼럼을 사용하여 수행하였다. 칼럼은 단백질(최대 2.5 mL)을 로딩하기 전에 4 칼럼 부피의 탈기된 탈염 용액 (0.15 NaCl, 1 mM EDTA)으로 평형화시켰다. 용리된 분획을 수집하고 합하였다.
탈염된 용액을 탈염 용액으로 20배 희석하고 276 nm에서의 흡광도를 측정하여 탈염 완충제의 블랭크에 의해 보정하였다. 결정된 단백질 농도를 사용함으로써, 고정화 동안 사용될 탈염된 단백질 용액의 목적하는 양을 계산하는 것이 가능하였다.
고정을 위해, 25-30 mg 리간드/ml의 농도를 갖는 용액을 사용하고, 상기 언급된 방법에 따라 활성화된 물질에 첨가하였다. 리간드의 고정을 위한 온도, pH 및 반응 시간에 따라, 다공성 지지체 물질 1 ml당 20 mg 리간드 내지 적어도 50 mg 리간드까지 고정될 수 있다. WO/2019/137869 및 WO/2018/011600의 실시예 6에서와 같이 더 긴 반응 시간은 일반적으로 동일한 개시내용의 실시예 5에서와 같이 더 짧은 반응 시간보다 더 높은 리간드 밀도를 유도할 것이다.
실시예 1 - 동적 결합 용량
본 발명에 따른 분리 매트릭스를 상기와 같이 제조하고, 동적 결합 용량을 분석하였다.
샘플 제조
20 mM 트리스-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5 (결합 완충제) 중에 0.5 mg/mL로 500 mL 또는 250 mL IgG를, 결합 완충제에 1.515 mL 또는 0.758 mL의 감마놈 (Gammanorm, 165 mg/mL)을 희석하고 부피 플라스크에서 500 mL 또는 250 mL로 부피를 조정함으로써 조제하였다. 분석 직전에, 감마놈 용액을 스테리벡스(Sterivex) 필터를 사용하여 여과하였다. 여과 후 280 nm에서 UV 흡광도를 측정하여 농도를 확인하였다. IgG 농도의 계산은 비어의 법칙에 따라 수행하였다:
A = ε L c
여기서 A는 280 nm에서의 UV 흡광도이고, ε은 흡광 계수이다 (폴리클로날 IgG에 대해 ε은 1.38 ml/(mg x cm)이다). L은 셀 홀더의 경로 길이이다. c는 용액의 농도이다.
3.4 mL의 정제된 트라스투주맙 (30 g/L)을 200 mL의 총 부피로 20 mM 포스페이트 150 mM NaCl pH 7.2로 희석하였다. 농도는 96 웰 UV 플레이트, 200 μL/웰을 사용하여 280 nm에서 UV 측정에 의해 결정했다. 블랭크는 20 mM 포스페이트 150 mM NaCl pH 7.2였다. 트라스투주맙 농도는 흡광 계수 1.48을 사용하여 계산하였다.
dAB는 가변 경쇄를 포함하는 도메인 항체이고, 문헌 ["Recombinant production of a V L single domain antibody in Escherichia coli and analysis of its interaction with Peptostreptococcal protein L " (Protein Expression and Purification, Volume 51, Issue 2, February 2007, Pages 253-259]에 기재된 방법에 따라 생산하였다.
3.45 mL의 dAb (14.5 g/L)를 100 mL의 총 부피로 20 mM 포스페이트 150 mM NaCl pH 7.2로 희석하였다. 농도는 96 웰 UV 플레이트, 200 μL/웰을 사용하여 280 nm에서 UV 측정에 의해 결정하였다. 블랭크는 20 mM 포스페이트 150 mM NaCl pH 7.2였다. dAb 농도는 흡광 계수 1.6을 사용하여 계산하였다.
리간드를 WO/2019/137869 및 WO/2013/068741의 실시예 6에 개시된 바와 같이 다공성 지지체에 결합시켰다.
리간드와 결합된 다공성 지지체의 멤브레인 단일 디스크를 장치에 설치하고, 크로마토그래피 시스템, 악타반트(AKTAavant) 25 IP31154, 10 mm 셀에 연결하였다. 멤브레인은 각각 감마놈 또는 트라스투주맙으로 단백질 샘플 로드 전에 평형/결합 완충제로 평형화하였다. 10% 파과에서의 용량(Qb10%)을 계산하고 기록하였다. 멤브레인을 평형화하고 세척하는 동안 사용된 유량은 20 mL/분이었다. 단백질 로드 동안 유량은 10 mL/분으로 감소되었다. 분석은 이중 멤브레인 디스크 상에서 수행되고, 각 디스크는 2회 분석되었다. 첫 번째 실행은 단백질 로드가 없는 블랭크였고, 이후 단백질을 사용한 2회의 전단 분석 실행이 이어졌다.
파과 용량은 악타반트 25 IP31154와 함께 사용되는 유니콘(Unicorn) 소프트웨어의 평가 도구인 엑스트렉션스-DBC 계산-분석(Exctensions-DBC Calculations- Analyze)을 사용하여 계산하였다.
10%에서의 파과 용량 (Qb10)의 계산을 위해, 하기 방정식을 사용하였다. 즉, 칼럼 유출물 중 트라스투주맙의 농도가 액체 샘플 중 트라스투주맙 농도의 10%가 될 때까지 칼럼 상에 로딩되는 트라스투주맙의 양이다.
A100% = 100% UV 신호
Asub = 비-결합 mAb로부터의 흡광도 기여
A(V) = 주어진 적용된 부피에서의 흡광도
VC = 칼럼 부피
Vapp = 10% 파과까지 적용된 부피
Vsys = 시스템 불용 부피
C0 = 액체 샘플 농도
모든 실험에 대해, 샘플 용액은 0.5 mg 단백질을 포함하였다.
DBC는 실행 1과 2 사이에서 감소하고, 실행 3에서 다시 증가한 다음, 실행 4에서 다시 하락한다. 이는 각각 분석 1과 2 사이 및 3과 4 사이에 블랭크 실행이 수행되지 않았다는 사실 때문이다.
이 실험에서 실행 1과 2 사이에 블랭크 실행이 추가되었다. 이는 각각의 실행 사이에 블랭크 실행이 수행되어야 함을 보여준다.
어떠한 이론에 얽매이지는 않지만, 시험 2에서 달성된 더 높은 DBC는 시험 2 이전에 물질에 대해 0.1 M NaOH를 사용한 CIP가 수행된 반면, 시험 1은 선행 CIP 세척 없이 수행되었다는 사실 때문인 것으로 보인다.
다음으로, 본 발명에 따른 프로토타입의 DBC를 동일한 대류-기반 매트릭스를 갖는 상업용 제품과 비교하였다. 매트릭스는 도 1에 도시된 바와 같이 하이트랩TM 장치에 포함되었다. 하이트랩TM 프로토타입 장치(1)는 0.4 mL의 부피를 갖는다. 이 장치(1)는 충전 물질로서 그 사이에 부직 물질 층(3)을 갖는 2개의 적층된 피브로 프로토타입 멤브레인(2)을 포함한다. 디스크 직경은 26.4 mm이다. 프로토타입 1은 52 mg 리간드/ml 멤브레인을 갖는 분리 매트릭스를 포함하였다. 프로토타입 2는 34 mg 리간드/ml 멤브레인을 갖는 분리 매트릭스를 포함하였다.
위에서 볼 수 있듯이 프로토타입은 Qb5와 Qb10 모두에서 상업용 제품인 피브로™ 프리즘 A만큼 우수한 DBC를 나타낸다.
실시예 2 - 부피 구배에 기반한 Fab-단편과 트라스투주맙 사이의 분해능
Fab-단편과 트라스투주맙 사이의 분해가 본 발명에 따른 프로토타입 상에서 달성될 수 있는지를 추가로 조사하였다.
Fab 단편 (Fab)은 파파인(papain) 절단에 의해 트라스투주맙으로부터 생성되었다. 트라스투주맙 용액을 0.5 M 인산나트륨의 첨가에 의해 pH 7.4로 조정한 다음, 소화 완충제 (25 mM Na-포스페이트, 1 mM EDTA, 5 mM 메르캅토-에탄올, pH 7.5) 중에 1+1로 희석하였다. 최종 부피는 대략 100 mL 였다. 파파인 결정을 용액에 첨가하였다. 용액을 37°C에서 밤새 인큐베이션하였다. 그 후, 안티페인(파파인 억제제)을 소화된 트라스투주맙에 첨가하였다. 용액을 실온에서 30분 동안 방치한 후, 캅토TM L 하이스케일 26 칼럼 상에 적용하여 Fc-함유 분자 (Fc 또는 부분적으로 소화된 트라스투주맙은, 유동 통과액 중에 수집됨)를 제거하였다. Fab는 용리 동안 수집되었다.
50 mM 시트레이트 완충제를 사용한 pH 5.0 에서 2.3의 선형 pH 구배를 사용하여 Fab 및 트라스투주맙을 분리하였다. 분해 실험을 20 mL에서 100 mL 선형 구배로 수행하였으며, 예를 들어 5.5분에서 13.5분의 실행 시간으로 구배를 20 mL에서 40, 60 및 100 mL로 증가시켰다. 결과를 도 2-5에 나타내었다.
결과는 pH 구배 기울기가 20 mL일 때 Fab 및 트라스투주맙이 공동-용리된다는 것을 보여준다 (도 2).
피크 상의 숄더는 구배가 평탄화되고 프로토타입 상에서 Fab와 트라스투주맙 사이의 분리를 위해 40 mL로 증가될 때 증가한다 (도 3).
pH 구배 기울기가 60 mL일 때 Fab와 트라스투주맙 사이의 보다 우수한 분리가 획득된다 (도 4).
그리고, Fab와 트라스투주맙 사이의 0.88의 분해능을 갖는 훨씬 더 우수한 분리가 피브로 상에서 pH 구배 기울기 100 mL에서 달성된다.　 도 5를 참조하면 Fab 피크가 크로마토그램의 좌측에 위치하고 트라스투주맙 피크가 크로마토그램의 우측에 위치한다.
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Claims (20)

  1. 다공성 지지체에 공유 결합된 카파 경쇄-결합 리간드를 포함하는 분리 매트릭스이며, 여기서
    상기 카파 경쇄-결합 리간드는 알칼리-안정화된 피네골디아 마그나(Finegoldia magna) (이전에는 펩토스트렙토코쿠스 마그누스(Peptostreptococcus Magnus)) 단백질 L 도메인의 다량체를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어지고;
    상기 다공성 지지체는 대류-기반 크로마토그래피 매트릭스인, 분리 매트릭스.
  2. 제1항에 있어서, 대류-기반 크로마토그래피 매트릭스가 섬유성 기재인 분리 매트릭스.
  3. 제2항에 있어서, 섬유성 기재가 전기방사된 중합체 섬유 또는 셀룰로스 섬유, 임의로 부직 섬유를 기재로 하는 것인 분리 매트릭스.
  4. 제3항에 있어서, 중합체가 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 폴리술폰, 폴리아미드, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리아크릴로니트릴, 폴리스티렌, 폴리에틸렌 옥시드, 및 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 분리 매트릭스.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 섬유성 기재가 섬유성 부직 중합체 매트릭스인 분리 매트릭스.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 섬유성 기재에 포함된 섬유가 10-1000 nm, 예컨대 200-800 nm, 200-400 nm 또는 300-400 nm의 단면 직경을 갖는 것인 분리 매트릭스.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 리간드가 섬유성 기재 상에 그라프팅된 글리시돌 기에 결합된 디비닐 술폰 작용기에 결합된 것인 분리 매트릭스.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 카파 경쇄-결합 리간드가 적어도 2개의 알칼리-안정화된 단백질 L 도메인을 포함하는 것인 분리 매트릭스.
  9. 제8항에 있어서, 알칼리-안정화된 단백질 L 도메인이 피네골디아 마그나(이전에는 펩토스트렙토코쿠스 마그누스) 단백질 L의 B1 도메인, B2 도메인, B3 도메인, B4 도메인, B5 도메인, C2 도메인, C3 도메인, C4 도메인 및 D1 도메인의 기능적 변이체를 포함하는 군으로부터 선택되며, 여기서 정렬 시에 B2 도메인 (서열식별번호 1)에서의 위치 10 및 45에 상응하는 위치는 히스티딘이고, 정렬 시에 B2 도메인 (서열식별번호 1)에서의 위치 60에 상응하는 위치는 티로신 또는 글루타민인 분리 매트릭스.
  10. 제9항에 있어서, 알칼리-안정화된 단백질 L 도메인이 B2 도메인, B3 도메인, B4 도메인, C2 도메인, C3 도메인, C4 도메인 및 D1 도메인을 포함하는 군으로부터 선택된 것인 분리 매트릭스.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 알칼리-안정화된 단백질 L 도메인이 갭 개방 페널티(gap open penalty) 12, 갭 확장 페널티(gap extension penalty) 3을 사용한, 75의 BLOSUM 매트릭스에 의해 결정 시에, 서열식별번호 2, 서열식별번호 3, 서열식별번호 4, 서열식별번호 5, 서열식별번호 6, 서열식별번호 7, 서열식별번호 8, 서열식별번호 9, 서열식별번호 10, 서열식별번호 11, 서열식별번호 12, 서열식별번호 13, 서열식별번호 14, 서열식별번호 15, 서열식별번호 16, 서열식별번호 17, 서열식별번호 18 또는 서열식별번호 19의 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성 또는 77.5% 서열 유사성을 갖고, 여기서 정렬 시에 서열식별번호 1에서의 위치 10 및 45에 상응하는 위치 및 정렬 시에 서열식별번호 1에서의 위치 60에 상응하는 위치는 가변적이지 않은 것인 분리 매트릭스.
  12. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 알칼리-안정화된 단백질 L 도메인이 갭 개방 페널티 12, 갭 확장 페널티 3을 사용한, 75의 BLOSUM 매트릭스에 의해 결정 시에, 서열식별번호 20, 서열식별번호 21, 서열식별번호 22, 서열식별번호 23, 서열식별번호 24, 서열식별번호 25, 서열식별번호 26, 서열식별번호 27, 서열식별번호 28, 서열식별번호 29, 서열식별번호 30, 서열식별번호 31, 서열식별번호 32, 서열식별번호 33, 서열식별번호 34, 서열식별번호 35, 서열식별번호 36 또는 서열식별번호 37의 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성 또는 77.5% 서열 유사성을 갖는 것인, 분리 매트릭스.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 리간드 밀도가 적어도 20 mg/ml 다공성 지지체, 또는 적어도 25 mg/ml 다공성 지지체, 또는 적어도 30 mg/ml 다공성 지지체, 또는 적어도 35 mg/ml 다공성 지지체, 또는 적어도 40 mg/ml 다공성 지지체, 또는 적어도 45 mg/ml 다공성 지지체, 또는 적어도 50 mg/ml 다공성 지지체인 분리 매트릭스.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 0.4 mL 하이트랩TM 기기에서 10 mL/분의 유량으로 실행 시, 예컨대 트라스투주맙과 같은 카파 경쇄-포함 항체의 동적 결합 용량 (DBC)이 10% 파과에서 25 g/mL인 분리 매트릭스.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 0.4 mL 하이트랩TM 기기에서 10 mL/분의 유량으로 실행 시, 예컨대 트라스투주맙과 같은 카파 경쇄-포함 항체의 동적 결합 용량 (DBC)이 10% 파과에서 45 g/mL인 분리 매트릭스.
  16. 카파 경쇄-함유 단백질을 단리하는 방법이며,
    a) 카파 경쇄-함유 단백질을 포함하는 액체 샘플을 분리 매트릭스와 접촉시키는 단계;
    b) 1종 또는 여러 종의 조합의 세척액으로 상기 분리 매트릭스를 세척하는 단계;
    c) 용리액을 이용해 분리 매트릭스로부터 카파 경쇄-함유 단백질을 용리하는 단계; 및
    d) 분리 매트릭스를 세정액으로 세정하는 단계를 포함하고,
    여기서 분리 매트릭스는 0.4 mL 하이트랩TM 기기에서 10 mL/분의 유량으로 실행 시, 예컨대 트라스투주맙과 같은 카파 경쇄-포함 항체의 동적 결합 용량 (DBC)이 10% 파과에서 25 g/mL인 방법.
  17. 람다 경쇄-함유 단백질로부터 카파 경쇄-결합 단백질을 단리하는 방법이며,
    a) 카파 경쇄-함유 단백질을 포함하는 액체 샘플을 분리 매트릭스와 접촉시키는 단계;
    b) 1종 또는 여러 종의 조합의 세척액으로 상기 분리 매트릭스를 세척하는 단계;
    c) 용리액을 이용해 분리 매트릭스로부터 카파 경쇄-함유 단백질을 용리하는 단계; 및
    d) 분리 매트릭스를 세정액으로 세정하는 단계를 포함하고,
    여기서 분리 매트릭스는 0.4 mL 하이트랩TM 기기에서 10 mL/분의 유량으로 실행 시, 예컨대 트라스투주맙과 같은 카파 경쇄-포함 항체의 동적 결합 용량 (DBC)이 10% 파과에서 25 g/mL인 방법.
  18. 단일특이적 항체로부터 이중특이적 항체를 분리하는 방법이며,
    a) 이중특이적 항체를 포함하는 액체 샘플을 분리 매트릭스와 접촉시키는 단계;
    b) 1종 또는 여러 종의 조합의 세척액으로 상기 분리 매트릭스를 세척하는 단계;
    c) 용리액을 이용해 분리 매트릭스로부터 이중특이적 항체를 용리하는 단계; 및
    d) 분리 매트릭스를 세정액으로 세정하는 단계를 포함하고,
    여기서 분리 매트릭스는 0.4 mL 하이트랩TM 기기에서 10 mL/분의 유량으로 실행 시, 예컨대 트라스투주맙과 같은 카파 경쇄-포함 항체의 동적 결합 용량 (DBC)이 10% 파과에서 25 g/mL인 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 분리가 단계 c)에서 부피 구배 또는 pH 구배를 적용하여 수행되는 것인 방법.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 분리 매트릭스가 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 것인 방법.

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