KR20240067913A - 에키노칸딘 핵의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 가교된 세포 응집체 내의 고정화된 탈아실화효소(deacylase), 에키노칸딘(Echinocandin)의 탈아실화에 있어서의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다. 가교결합된 세포 응집체에서의 탈아실화효소의 고정화는 다음 단계를 포함한다:
● 발효에 의한 탈아실화효소의 생산
● 세포의 응집
● 세포의 가교 결합
본 발명은 또한 에키노칸딘 중간체의 탈아실화에서 탈아실화효소의 가교결합된 세포 응집체의 용도에 관한 것이다.
● 발효에 의한 탈아실화효소의 생산
● 세포의 응집
● 세포의 가교 결합
본 발명은 또한 에키노칸딘 중간체의 탈아실화에서 탈아실화효소의 가교결합된 세포 응집체의 용도에 관한 것이다.
Description
관련 출원
본 출원은 2021년 9월 7일에 출원된 인도 특허 출원 IN 202141040608의 우선권을 주장하며, 이는 참조로 본 문서에 포함된다.
기술분야
본 발명은 가교결합된 세포 응집체에 고정화된 탈아실화효소(Deacylase), 제조방법 및 에키노칸딘(Echinocandin)의 탈아실화(deacylation)에 있어서의 이의 용도에 관한 것이다. 가교결합된 세포 응집체에서 탈아실화효소의 고정화는 다음 단계를 포함한다:
● 발효에 의한 탈아실화효소의 생산
● 세포의 응집
● 세포의 가교결합.
본 발명은 또한 에키노칸딘 중간체의 탈아실화에서 탈아실화효소의 가교결합된 세포 응집체의 용도에 관한 것이다.
에키노칸딘은 N-연결된 아실 지질 측쇄를 갖는 반합성 고리형 리포펩티드(lipopeptides)의 그룹이다. 에키노칸딘은 포유류에는 존재하지 않는 진균 세포벽의 필수 성분인 β- (1, 3)-D-글루칸 합성효소의 비경쟁적 억제제로 작용한다. 유기체가 β - (1, 3) - D-글루칸을 합성하지 못하면 삼투압 불안정성과 세포사멸을 초래한다. 이 부류의 약물은 카스포펀진(Caspofungin), 미카펀진(Micafungin), 아니둘라펀진(Anidulafungin)이다.
FR901379로부터 유래된 미카펀진은 고도로 선택적인 항진균제이며, 1,3-β-글루칸(1,3-β-glucan) 합성의 억제제이다. 그러나, 미카펀진 I 중간체 (FR901379)는 팔미트산(palmitic acid)의 긴 아실 측쇄로 인해 용혈 활성을 갖는 것으로 알려져 있다. 따라서, FR901379는 아실라제 효소에 의해 탈아실화되어 미카펀진 II 중간체 (FR179642)를 제공한 다음, 유리 아미노기에서 (화학적 합성 경로에 의해) 재아실화되어 대부분의 칸디다(Candida) 및 아스페르길루스(Aspergillus) 종에 대해 활성인 화학적 변형에 의해 미카펀진으로 전환되는 FR131535를 생성하였다.
에키노칸딘 B (Echinocandin B; ECB) 또는 아니둘라펀진 중간체-I는 아스페르길루스의 여러 종에 의해 생성되는 리포펩티드 항진균제이다. ECB는 리놀레오일(linoleoyl) 측쇄가 없는 고리형 헥사펩티드로의 효소적 탈아실화 및 후속 화학적 재아실화에 의해 변형되어 아니둘라펀진을 생성할 수 있다.
악티노플라네스 유타헨시스(Actinoplanes utahensis)는 생물학적 비활성 고리 펩티드 코어 또는 "핵"을 생성하기 위해 미카펀진 또는 아니둘라펀진 I 중간체의 아미노 말단에서 아실 단위를 제거하는 탈아실화효소 또는 아실 전이효소를 생성하는 것으로 알려져 있다. 악티노플라네스 유타헨시스는 페니실린(penicillins), 리포펩티드(lipopeptides), 글리코펩티드(glycopeptides) 및 캡사이신(capsaicin)과 같은 많은 항균제의 다양한 지방족 아실 측 사슬을 가수분해하는 탈아실화효소를 생성할 수 있는 그람 양성 필라멘트 박테리아다. 효소(악티노플라네스 유타헨시스에 의해 생성됨)는 63 kDa 및 18 내지 20 kDa 소단위로 구성된 막 관련 이종이량체이다.
탈아실화 분야의 기존 기술은 낮은 전환율, 높은 비용 및 대량 생산에 적합하지 않은 문제 등이 많다.
미국 특허 제 7,785,826 B2는 ECBN의 ECB 전환을 위한 공정을 개시한다. 공정의 주요 흐름은 ECB 발효, 원심분리하여 균사체를 수득하고, 물에 균사체를 재현탁한 다음, 전환을 위해 탈아실화효소를 첨가하는 단계를 포함한다. 이 방법은 ECB 탈아실라제를 단 한 번만 사용한다. 그러나, 이 방법은 작동이 복잡하고, 공정 전환 시간이 20-30 시간이며, 전환율이 낮고, 몰 전환율이 30 %에 불과하다.
CN 102618606은 방선균 전체 세포 또는 발효액을 촉매로 사용하여 에키노칸딘의 생물전환을 위한 방법을 개시한다. 상기 방법은 전환 시스템에서 기질의 용해도가 향상되고, 공용매는 베타-사이클로덱스트린(beta-cyclodextrin) 또는 이의 유도체라는 장점을 갖는다. 이 방법은 전환속도 및 전환율이 향상되고, 결함이 완전세포 형질전환이며, 시스템이 탈리(thalli)가 많고, 효소와 기질의 접촉 효율이 매우 낮으며, 이후의 분리 및 정제 단계가 복잡하여 비용이 많이 들고, 유기용매 시스템에서 효소가 불활성화되기 쉬운 문제를 이용하고 있다는 장점이 있다.
CN103387975는 고정화된 시클로지방족 펩타이드 아실트랜스퍼라제(cycloaliphatic peptide acyltransferase)를 담체에 고정화하고; 상기 시클로지방족 펩타이드 아실트랜스퍼라제는 천연 또는 인공 돌연변이, 또는 변이체로부터 유래하고, 외래의 고리형 아실트랜스퍼라제 유전자를 도입하여 형질전환된 것을 특징으로 하는 고정화된 시클로지방족 펩타이드 아실트랜스퍼라제의 제조방법을 개시한다. 고정화된 시클로지방족 펩타이드 아실트랜스퍼라제는 ECBN을 아니둘라펀진으로 전환시키는데 사용된다. 이러한 방법을 통해 전환율은 높지만 조작이 복잡하고 비용이 많이 소요되며, 고정화 과정의 화학 반응은 효소의 부분적 불활성화를 쉽게 유도한다.
2000년에 네덜란드 델프트 공과대학의 Cao et al. 은 가교결합효소와 가교결합효소 결정, 가교결합효소 응집체(cross-linked enzyme aggregates; CLEAs)를 기반으로 하는 새로운 유형의 고정화 효소 기술을 제안하였다. 이는 효소 분자를 응집체에 가깝게 만들어 용매 밖으로 침전시킨 후, 응집체를 가교결합시켜 가교결합효소 응집체를 형성하는 특성을 변화시킨다. 가교결합효소 중합체는 효소 자체를 담체로 하는 고정화 효소이다. 단위 부피당 효소 농도는 높고, 안정적이며, 재활용이 가능하고, 촉매 활성이 높고, 생산 비용이 저렴하며, 잠재적인 응용 가능성이 있다.
CLEA 기법을 사용한 CN108676831A는 에키노칸딘 B에서 에키노칸딘 B 핵으로의 전환율을 약 85%로 보고하고 있다. 이 발명의 단점은 하기와 같다:
● 미생물 세포에서 효소를 분리한 다음 가교결합 효소 응집체를 준비해야 한다.
● 발효액으로부터 분리된 효소의 정제가 수행되어야 한다.
● CLEA의 경우 효소 활성 부위의 가교결합으로 인한 효소 활성 억제가 제한된다.
● 공정에는 준비 및 정제를 위한 여러 단계가 포함되기 때문에 비용 효율적이지 않다.
● CLCA 경로에 비해 CLEA의 재사용이 제한적이다.
탈아실화효소 매개 생체변환은 다양한 항진균제 합성에 대한 흥미로운 잠재력을 가지고 있지만, 산업적으로 사용될 수 있기 전에 몇 가지 과제가 남아 있다. 특히, 이의 안정성 및 재사용성은 다른 많은 산업용 효소에 비해 상대적으로 좋지 않다. 이러한 장애는 효소의 고정화에 의해 피할 수 있다. 담체가 없는 전체 세포 고정화 방법으로서 가교결합 세포 응집체(CLCAs)는 산업적 응용에 큰 잠재력을 가지고 있다. 포획, 흡착 및 화학적 결합과 같은 담체 결합 고정화 기술과 비교하여, 담체가 없는 CLCAs의 활성은 담체에서 희석되지 않는다. 또한, 세포 용해 및 정제 단계에 대한 필요성의 결여는 고정화 비용을 감소시키고 제조 공정을 단순화할 것이다.
본 발명은 가교결합된 세포 응집체(Cross-linked cell aggregates, CLCA)에서 고정화된 탈아실화효소의 제조 및 이의 생물전환 용도를 개시한다. 본 발명의 장점은 주로 다음을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다:
● 탈아실화효소 CLCAs는 반복적으로 사용할 수 있어 생산 비용을 절감하고 산업 생산을 용이하게 할 수 있다.
● 본 발명의 탈아실화 생성물의 순도가 현저히 향상된다.
● 가격이 싸고 쉽게 구할 수 있는 원료만 고정화에 사용하고 값비싼 수지(resin)는 고정화에 사용하지 않아 경제적이다.
● CLCA는 재사용을 위해 장기간 보관할 수 있습니다.
● CLCA를 이용한 생물전환은 발효액 생물전환의 경우와 달리 멸균/무균 조건 없이 수행할 수 있다.
가교결합 효소 응집체(CLEAs)와 비교한 본 발명의 장점:
● CLEA 기술은 미생물 세포로부터 효소를 분리한 후, 가교결합 효소 응집체(CLEA)를 준비해야 한다.
● 직접 가교결합된 세포 응집체(CLCAs)를 준비할 수 있으며 발효액으로부터 효소를 분리하는 데 여러 정제 단계가 필요하지 않다.
● 가교결합 세포 응집체(CLCAs)는 여러 주기의 생물전환에 재사용될 수 있다.
● CLCAs는 세포 표면 단백질의 가교결합을 수반하기 때문에 CLEAs의 한계인 효소 활성 부위의 가교결합으로 인한 효소 활성 억제가 극복된다.
● CLCAs는 미생물 세포가 효소의 지지 매트릭스 역할을 하기 때문에 CLEA에 비해 pH, 온도, 혼합으로 인한 전단 응력 등의 반응 조건에서 효소의 안정성을 향상시킨다.
● CLEAs의 제조는 가교결합 전에 용액에서 효소의 침전을 수반하기 때문에 효소 활성의 부분적 손실은 통상적인 한계이나 CLCAs의 경우 극복할 수 있다.
약어:
PCV: 압축된 세포 부피(Packed Cell Volume)
CLCA: 가교결합된 세포 응집체(Cross-Linked Cell Aggregates)
CLEA: 가교결합된 효소 응집체(Cross-Linked Enzyme Aggregates)
DMH: 포도당 수화물(Dextrose Monohydrate)
SF: 시드 플라스크(Seed Flask)
IF: 접종 플라스트(Inoculum Flask)
K2HPO4: 인산수소이칼륨(Dipotassium hydrogen phosphate)
PEI: 폴리에틸렌이민(Polyethyleneimine)
GA: 글루타르알데히드(Glutaraldehyde)
EOF - 발효종료(End of fermentation)
EOR - 반응종료(End of Reaction)
L - 리터(Litre)
KL - 킬로리터(Kilo Litre)
본 발명의 일 실시예는 에키노칸딘이 에키노칸딘 모핵으로 전환되는 것을 개시한다. 상기 방법은 가교결합 탈아실화효소 세포 및 에키노칸딘의 처리로 원하는 에키노칸딘 모핵으로 전환하는 것을 포함한다.
상기 가교결합 탈아실화효소 세포의 제조 방법은 다음을 포함한다:
a. 탈아실화효소 세포의 응집
b. 응집된 세포의 가교결합
c. 가교결합된 세포의 분리.
본 발명의 다른 실시예는 미카펀진 I 중간체 (FR901379)를 미카펀진 II 중간체 (FR179642)로 전환하는 방법을 개시한다. 상기 방법은 가교결합 탈아실화효소 세포 및 미카펀진 I 중간체 (FR901379) 처리로 원하는 미카펀진 II 중간체 (FR179642)로 전환하는 것을 포함한다.
상기 가교결합 탈아실화효소 세포의 제조 방법은 다음을 포함한다:
a. 탈아실화효소 세포의 응집
b. 응집된 세포의 가교결합
c. 가교결합된 세포의 분리.
본 발명의 다른 실시예는 에키노칸딘 B를 에키노칸딘 B 핵으로 전환하는 방법을 개시한다. 상기 방법은 가교결합 탈아실화효소 세포 및 에키노칸딘 B처리로 원하는 에키노칸딘 B 핵으로 전환하는 것을 포함한다.
상기 가교결합 탈아실화효소 세포의 제조 방법은 다음을 포함한다:
a. 탈아실화효소 세포의 응집
b. 응집된 세포의 가교결합
c. 가교결합된 세포의 분리.
본 발명의 또 다른 실시예는 가교결합 탈아실화효소 세포를 에키노칸딘으로 처리하여 원하는 에키노칸딘 모핵을 생성함으로써 에키노칸딘을 에키노칸딘 모핵으로 전환하는 방법을 제공한다.
상기 탈아실화효소 세포의 가교결합은 다음을 포함한다:
a. 탈아실화효소 세포의 응집
b. 응집된 세포의 가교결합
c. 가교결합된 세포의 분리.
본 발명의 다른 실시예는 가교결합 탈아실화효소 세포를 에키노칸딘으로 처리하여 원하는 에키노칸딘 모핵을 생성함으로써 미카펀진 I 중간체(FR901379)를 미카펀진 II 중간체(FR179642)로 전환하는 방법을 제공한다.
상기 탈아실화효소 세포의 가교결합은 다음을 포함한다:
a. 탈아실화효소 세포의 응집
b. 응집된 세포의 가교결합
c. 가교결합된 세포의 분리.
본 발명의 다른 실시예는 가교결합 탈아실화효소 세포를 에키노칸딘으로 처리하여 원하는 에키노칸딘 모핵을 생성함으로써 에키노칸딘 B를 에키노칸딘 B 핵으로 전환하는 방법을 제공한다.
상기 탈아실화효소 세포의 가교결합은 다음을 포함한다:
a. 탈아실화효소 세포의 응집
b. 응집된 세포의 가교결합
c. 가교결합된 세포의 분리.
본 발명의 또 다른 실시예는, 상기 응집 단계는 폴리에틸렌이민(Polyethyleneimine)을 사용하여 수행되는 것인, 상기 어느 하나의 실시예에 따른 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시예는, 상기 가교결합 단계는 글루타르알데히드(Glutaraldehyde)를 이용하여 수행되는 것인, 상기 어느 하나의 실시예에 따른 방법을 제공한다.
본 발명의 실시예들은 이후에 본 명세서에서 특정 실시예들을 사용하여 추가로 기술된다. 실시예들은 본 발명의 특정 실시예들의 더 나은 이해를 위해 제공되며, 어떤 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하기 위해 제공되는 것이 아니다. 본 설명의 교시 및 본 발명 분야의 일반적인 기술을 사용하는 당업자에게 명백한 가능한 변형 및 등가물들도 본 명세서의 일부를 구성하고, 본 명세서의 범위 내에 포함되도록 의도된다.
실시예:
실시예-1:
단계-1 : 시드 발효(Seed Fermentation)
SF, IF, 시드 발효기 단계용 시드 배지 조성
시드 발효 배지는 상기 표-1에 언급된 성분을 포함한다. 모든 성분을 혼합하고 멸균 전에 20% 수산화나트륨(Sodium hydroxide, NaOH) 또는 20% 오르토인산(Orthophosphoric acid, OPA)을 사용하여 pH는 6.0 ± 0.1로 조정하였다. 접종은 발효기에서 ~10% 잘 성장된 접종물로 수행되었다. 발효 배지는 약 96±24시간, PCV ≥ 15 및 pH가 약 7.3-7.5로 상승될 때 생산 발효기로 옮겨졌다.
단계-2: 생산 발효
생산단계용 생산배지 조성
배지는 상기 표-2에 언급된 성분을 포함한다. 모든 성분을 혼합하고 10% 수산화나트륨(NaOH) 또는 20% 오르토인산(OPA)을 사용하여 pH를 6.0 ± 0.2로 조정하였다. 발효기를 25 ℃ ± 2 ℃의 온도로 냉각시켰다. 접종은 ~10% 잘 성장된 접종물로 수행되었다. 6시간부터 수크로스를 공급한 후 DMH 및 효모 추출물을 30g/h로 공급하였다. 배치는 PCV ≥ 15%로 96-120시간 동안 실행될 것으로 예상되었다.
단계-3: 세포 응집
발효 후 폴리에틸렌이민(Polyethyleneimine, PEI) (0.2%)을 일정한 혼합 하에 발효기에 직접 첨가하여 배양액의 pH를 6.8 ± 0.2로 유지하였다. 배지를 25 ± 2 ℃에서 100 rpm으로 20 - 30 분 동안 배양하였다.
단계-4: 세포 가교결합
세포 응집 단계 후, 글루타르알데히드(Glutaraldehyde, GA) (0.4%)를 일정한 혼합 하에 발효기에 직접 첨가하였다. 배지를 25 ± 2 ℃, 100 rpm에서 20 - 30 분 동안 배양하여 가교결합 세포 응집체(CLCAs)를 형성하였다.
단계-5: 가교결합된 세포 응집체(Cross-Linked Cell Aggregate; CLCAs) 여과 및 세척
CLCAs의 여과를 수행하고 CLCAs를 RO(Reverse Osmosis) 수로 2회 세척하여 과량의 PEI & GA 및 발효액을 제거하였다. CLCAs를 여과 및 건조하여 과량의 물을 제거하였다.
CLCA 활성 시험 프로토콜
pH 5.5-6.0의 K2HPO4 50 mM 용액을 준비한다. 동일한 완충용액을 사용하여 미카펀진 중간체-I 10 g/L 용액을 제조한다. 원하는 양의 CLCA 고형물을 원뿔 플라스크에 첨가한다. 상기 제조된 미카펀진 중간체-I 용액을 반응 혼합물에서 CLCA의 최종 희석액이 약 10% w/w 가 되도록 원뿔 플라스크에 옮긴다. 상기 혼합물을 40 ℃에서 약 60 분 동안 배양한다. o-인산(o-phosphoric acid)을 첨가하여 반응을 종결시킨다. 적절한 용매로 필요한 희석을 수행하고 HPLC로 미카펀진 중간체-II 함량을 분석한다. 상기 CLCA 활성은 1.5 내지 2.5 mg/g 범위일 수 있다.
단계-6a: 미카펀진 I 에서 II로의 생물전환
0.05 M K2HPO4 완충액(pH 5.8 ± 0.3) 중 20 g/L 미카펀진 I 중간체 용액(검정 기준)을 제조하였다. 탈아실화효소 CLCAs를 반응기로 옮기고 반응기 내 미카펀진 I 중간체 용액과 혼합하였다. RPM은 300 ± 50으로 유지하였고, 온도는 공정 전반에 걸쳐 25 ± 3 ℃로 유지하였다. 반응 완료 후, 반응 혼합물을 수확하고 CLCAs를 여과에 의해 분리하였다. CLCAs를 0.05 M K2HPO4 완충액(pH 5.8 ± 0.3)으로 세척하고, 여과 및 건조하였다.
(또는)
단계 -6b: 아니둘라펀진 I 에서 II로의 생물전환
탈아실화효소 CLCAs를 반응기로 옮기고 0.05 M K2HPO4 완충액(pH 5.8 ± 0.3)과 혼합하였다. 아니둘라펀진 I 중간체를 첨가하여 12 g/L를 만들었다. RPM은 300 ± 50으로 유지하였고, 온도는 공정 전반에 걸쳐 25 ± 3 ℃로 유지하였다. 반응 완료 후, 반응 혼합물을 수확하고 CLCAs를 여과하여 분리하였다. CLCAs를 0.05 M K2HPO4 완충액(pH 5.8 ± 0.3)으로 세척하고, 여과 및 건조하였다.
실시예-2:
CLCA를 이용한 CLCA의 제조, 미카펀진 I에서 II로의 생물전환 및 아니둘라펀진 I에서 II로의 생물전환을 위한 상기 과정은 킬로리터 규모로 확장되었다. 하기는 이에 대한 스케일업 데이터이다.
가교결합된 세포 응집체(CLCA)의 준비
CLCA 제조 공정은 발효기에서 1 KL 규모로 수행되었고, 공정이 검증되었다. CLCA 제조는 상기 실시예 1에서 언급된 프로토콜(단계 1 내지 단계 5)에 따라 수행되었다. 상기 CLCA 고형물에 대한 산출량 세부 정보는 하기와 같다.
미카펀진 I에서 II로의 생물학적 전환은 킬로리터 규모로 수행되었고 공정이 검증되었다. 이에 대한 결과가 하기 표로 정리되어 있다.
아니둘라펀진 I에서 II로의 생물전환은 더 큰 규모로 수행되었다. 결과는 하기 표로 정리되어 있다.
Claims (5)
- 가교결합된 탈아실화효소 세포를 에키노칸딘으로 처리하여 에키노칸딘을 에키노칸딘 모핵으로 전환하는 방법으로서,
상기 탈아실화효소 세포의 가교결합은 다음을 포함하는, 방법:
a. 탈아실화효소 세포의 응집
b. 응집된 세포의 가교결합
c. 가교결합된 세포의 분리. - 가교결합된 탈아실화효소 세포를 에키노칸딘으로 처리하여 원하는 에키노칸딘 모핵을 생성하여 미카펀진(Micafungin) I 중간체 (FR901379)를 미카펀진 II 중간체(FR179642)로 전환하는 방법으로서,
상기 탈아실화효소 세포의 가교결합은 다음을 포함하는, 방법:
a. 탈아실화효소 세포의 응집
b. 응집된 세포의 가교결합
c. 가교결합된 세포의 분리. - 가교결합된 탈아실화효소 세포를 에키노칸딘으로 처리하여 원하는 에키노칸딘 모핵을 생성함으로써 에키노칸딘 B를 에키노칸딘 B 핵으로 전환시키는 방법으로서, 상기 탈아실화효소 세포의 가교결합은 다음을 포함하는, 방법:
a. 탈아실화효소 세포의 응집
b. 응집된 세포의 가교결합
c. 가교결합된 세포의 분리. - 상기 어느 한 항에 있어서, 상기 응집 단계는 폴리에틸렌이민(Polyethyleneimine)을 사용하여 수행되는 것인, 방법.
- 상기 어느 한 항에 있어서, 상기 가교결합 단계는 글루타르알데히드(Glutaraldehyde)를 이용하여 수행되는, 방법.
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