KR20240067615A - 생분해성 고분자 마이크로입자의 제조 방법 - Google Patents
생분해성 고분자 마이크로입자의 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 특정 입자 크기와 치밀한 내부 구조를 갖는 구형의 생분해성 고분자 마이크로입자의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 상기 방법에 의해 제조된 생분해성 고분자 마이크로입자와 이를 포함하는 조직수복용 재료에 관한 것이다.
Description
본 발명은 특정 입자 크기와 치밀한 내부 구조를 갖는 구형의 생분해성 고분자 마이크로입자의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 상기 방법에 의해 제조된 생분해성 고분자 마이크로입자와 이를 포함하는 조직수복용 재료에 관한 것이다.
외모 및 안티에이징 등과 관련된 시장이 성장함에 따라 미용 시술의 수요가 꾸준히 증가하고 있다. 미용 시술 중 특히 빠르게 성장하는 분야는 주름 개선, 탄력 개선 등 피부 노화를 개선하고 완화하는 효과를 줄 수 있는 시술이다. 예를 들어, 보톨리눔 톡신, 히알루론산 등을 주입하는 최소 침습 시술이 확대되고 있으며, 최근에는 생분해성 고분자가 이러한 시술에 사용되는 조직수복용 재료로 관심을 받고 있다.
생분해성 고분자는 독성이 없으며 생체적합성이 우수하고 생체 내에서 천천히 분해되어 천연 부산물로 전환되므로 안전한 물질로 인정받고 있다. 생분해성 고분자 필러 등 조직수복용 제품이 국내외 임상에서 사용되고 있다. 초기 제품들의 경우, 육아종, 결절 생성 등 부작용 문제로 사용 방법에 제한이 있었으나, 농도 조절, 수화 방법 변경 등을 통해 부작용을 개선하고 안정성과 효과를 증가시켜 왔다.
고분자 마이크로입자를 제조하는 방법으로는 분무 건조법(spray-drying method)과 용매 증발법(solvent-evaporation method) 등이 있다.
분무 건조법은 에어로졸 형태의 용액을 분사시킨 후 건조시켜 마이크로입자를 얻는 방법이다. 분무 건조법으로 제조한 마이크로입자는 입자의 크기가 균일하지 않아 크기 분포가 넓으며, 비교적 침상 구조의 입자 모양을 나타내는 단점이 있다. 따라서 원하는 크기, 밀도, 사이즈의 마이크로입자를 얻기 위해서는 별도의 정제 과정이 필요하다. 게다가, 침상 입자가 조직수복용 재료로 사용되는 경우 피부결절, 틴달, 피부 속 찢어짐과 같은 문제를 초래한다.
용매 증발법은 유기용매 내에 고분자를 용해시킨 후, 이를 유화제가 함유된 수성 용액에 유화시키고 교반을 통해 유기용매를 증발시켜 마이크로입자를 형성시키는 방법으로, 분산 형태에 따라 O/W, W/O, W/O/W형 등이 있다. 이 중 W/O/W형은 두 번의 유화 단계를 거치는데 첫 번째 유화단계인 W/O 유화액의 안정성에 따라 마이크로입자의 구조가 결정된다. 유화액은 열역학적으로 불안정한 상태이기 때문에 뭉침(coalescence), 융합(fusion), 상분리(creaming) 등의 과정을 거쳐 수상과 유기상이 서로 분리되려고 하는 경향이 있어 제조가 어려운 단점이 있다.
따라서, 마이크로입자의 크기 조절이 용이하고, 밀도가 차 있는 구 형태를 생성할 수 있으며, 수율을 증가시키고 공정 시간을 단축할 수 있는, 보다 개선된 생분해성 고분자 마이크로입자의 제조 방법이 필요하다.
상기 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 생체 조직 활용에 적합한 크기와 구조를 가지는 생분해성 고분자 마이크로입자를 높은 수율로 제조할 수 있는 방법을 제공하고자 한다. 구체적으로, 특정 범위의 균일한 입자 크기를 가지면서 내부에 기공이 없이 치밀한 구조를 갖는 구형의 생분해성 고분자 마이크로입자의 제조 방법을 제공하고자 한다.
따라서, 본 발명의 목적은 구형이면서 균일한 입자 크기 및 치밀한 내부 구조를 갖는 생분해성 고분자 마이크로입자의 제조 방법을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 상기 방법으로 제조된 생분해성 고분자 마이크로입자와 이를 포함하는 조직수복용 생분해성 재료를 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 생분해성 고분자 마이크로입자의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은
(a) 생분해성 고분자를 유기용매에 용해시켜 유기용매-고분자 용액을 형성하는 단계;
(b) 계면활성제 및 물을 혼합하여 계면활성제 수용액을 형성하는 단계;
(c) 상기 유기용매-고분자 용액과 상기 계면활성제 수용액을 혼합하고 500 rpm 이상 2000 rpm 미만으로 교반하여 마이크로에멀젼을 형성하는 단계; 및
(d) 상기 단계 (c)의 마이크로에멀젼으로부터 생분해성 고분자 마이크로입자를 분리하는 단계
를 포함하며,
상기 생분해성 고분자 마이크로입자는 균일한 입자 크기 및 내부 치밀 구조를 갖는 구형의 마이크로입자이다.
또한, 본 발명은 상기 제조 방법에 따라 제조된 생분해성 고분자 마이크로입자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 생분해성 고분자 마이크로입자를 포함하는 조직수복용 재료를 제공한다.
본 발명의 생분해성 고분자 마이크로입자의 제조 방법에 의하면 다음 효과가 달성된다.
1. 구형이면서, 균일한 특정 범위의 입자 크기 및 치밀한 내부 구조를 갖는 생분해성 고분자 마이크로입자를 제조할 수 있다.
2. 장기간 보관 시에도 구형의 형태가 무너지지 않는 제형 안정성이 향상된 생분해성 고분자 마이크로입자를 제조할 수 있다.
3. 일정 시간 후 생분해되며, 생체 부작용을 감소시키기 위한 농도 조절이 용이하고, 특정한 형태와 균일한 크기를 안정적으로 보장하는 화장품 재료 또는 의료 시술용 재료, 예를 들어 조직수복용 재료를 제공할 수 있다.
4. 종래 기술과 비교하여 높은 수율로 특정 입자 크기를 갖는 생분해성 고분자 마이크로입자를 제조할 수 있으며, 공정 시간을 단축할 수 있다.
도 1은 실시예 1에서 제조된 생분해성 고분자 마이크로입자의 분리 후 0주, 1주, 2주, 3주 및 4주 지난 시점에서 관찰된 고분자 입자의 주사전자현미경 이미지를 (a)~(e)의 순서대로 나타낸 것이다.
도 2는 참고예 1-1, 1-2, 및 비교 참고예 1-1, 1-2, 1-3, 1-4에서 분리된 생분해성 고분자 마이크로입자의 주사전자현미경 이미지를 (a)~(f)의 순서대로 나타낸 것이다.
도 3은 참고예 2, 및 비교 참고예 2-1, 2-2, 2-3에서 분리된 생분해성 고분자 마이크로입자의 주사전자현미경 이미지를 (a)~(d)의 순서대로 나타낸 것이다.
도 4a는 히알루론산(HA), 저분자 PLLA(실시예 3), 및 고주파(RF) 처리한 고분자 PLLA(비교예 2) 주입 후의 시간 경과에 따른 피부 탄력도 측정 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4b는 히알루론산(HA), 저분자 PLLA(실시예 3), 및 고주파(RF) 처리한 고분자 PLLA(비교예 2) 주입 후의 시간 경과에 따른 콜라겐 섬유 밀도 측정 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4c는 히알루론산(HA), 저분자 PLLA(실시예 3), 및 고주파(RF) 처리한 고분자 PLLA(비교예 2) 주입 후의 시간 경과에 따른 새로 합성된 콜라겐 섬유 밀도 측정 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4d는 히알루론산(HA), 저분자 PLLA(실시예 3), 및 고주파(RF) 처리한 고분자 PLLA(비교예 2) 주입 후의 시간 경과에 따른 M1 대식세포 발현 및 M2 대식세포 발현 정도의 측정 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4e는 히알루론산(HA), 저분자 PLLA(실시예 3), 및 고주파(RF) 처리한 고분자 PLLA(비교예 2) 주입 후의 시간 경과에 따른 염증성 사이토카인(IL-1β) 분비 및 항염증성 사이토카인(IL-10) 분비 정도의 측정 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4f는 히알루론산(HA), 저분자 PLLA(실시예 3), 및 고주파(RF) 처리한 고분자 PLLA(비교예 2) 주입 후의 시간 경과에 따른 bFGF(섬유아세포 성장인자) 발현 및 TGF-β(전환성장인자-β) 발현 정도의 측정 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4g는 히알루론산(HA), 저분자 PLLA(실시예 3), 및 고주파(RF) 처리한 고분자 PLLA(비교예 2) 주입 후의 시간 경과에 따른 진피 섬유아세포 전구체 및 유두진피 섬유아세포 전구체의 발현 정도의 측정 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4h는 히알루론산(HA), 저분자 PLLA(실시예 3), 및 고주파(RF) 처리한 고분자 PLLA(비교예 2) 주입 후의 시간 경과에 따른 MMPs(기질금속단백질분해효소)의 발현 정도의 측정 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는 참고예 1-1, 1-2, 및 비교 참고예 1-1, 1-2, 1-3, 1-4에서 분리된 생분해성 고분자 마이크로입자의 주사전자현미경 이미지를 (a)~(f)의 순서대로 나타낸 것이다.
도 3은 참고예 2, 및 비교 참고예 2-1, 2-2, 2-3에서 분리된 생분해성 고분자 마이크로입자의 주사전자현미경 이미지를 (a)~(d)의 순서대로 나타낸 것이다.
도 4a는 히알루론산(HA), 저분자 PLLA(실시예 3), 및 고주파(RF) 처리한 고분자 PLLA(비교예 2) 주입 후의 시간 경과에 따른 피부 탄력도 측정 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4b는 히알루론산(HA), 저분자 PLLA(실시예 3), 및 고주파(RF) 처리한 고분자 PLLA(비교예 2) 주입 후의 시간 경과에 따른 콜라겐 섬유 밀도 측정 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4c는 히알루론산(HA), 저분자 PLLA(실시예 3), 및 고주파(RF) 처리한 고분자 PLLA(비교예 2) 주입 후의 시간 경과에 따른 새로 합성된 콜라겐 섬유 밀도 측정 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4d는 히알루론산(HA), 저분자 PLLA(실시예 3), 및 고주파(RF) 처리한 고분자 PLLA(비교예 2) 주입 후의 시간 경과에 따른 M1 대식세포 발현 및 M2 대식세포 발현 정도의 측정 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4e는 히알루론산(HA), 저분자 PLLA(실시예 3), 및 고주파(RF) 처리한 고분자 PLLA(비교예 2) 주입 후의 시간 경과에 따른 염증성 사이토카인(IL-1β) 분비 및 항염증성 사이토카인(IL-10) 분비 정도의 측정 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4f는 히알루론산(HA), 저분자 PLLA(실시예 3), 및 고주파(RF) 처리한 고분자 PLLA(비교예 2) 주입 후의 시간 경과에 따른 bFGF(섬유아세포 성장인자) 발현 및 TGF-β(전환성장인자-β) 발현 정도의 측정 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4g는 히알루론산(HA), 저분자 PLLA(실시예 3), 및 고주파(RF) 처리한 고분자 PLLA(비교예 2) 주입 후의 시간 경과에 따른 진피 섬유아세포 전구체 및 유두진피 섬유아세포 전구체의 발현 정도의 측정 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4h는 히알루론산(HA), 저분자 PLLA(실시예 3), 및 고주파(RF) 처리한 고분자 PLLA(비교예 2) 주입 후의 시간 경과에 따른 MMPs(기질금속단백질분해효소)의 발현 정도의 측정 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
이하에서는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 본 발명을 더욱 상세히 기술한다.
본 발명의 첫 번째 목적은 생분해성 고분자 마이크로입자의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 구체예에서, 생분해성 고분자 마이크로입자의 제조 방법은
(a) 생분해성 고분자를 유기용매에 용해시켜 유기용매-고분자 용액을 형성하는 단계;
(b) 계면활성제 및 물을 혼합하여 계면활성제 수용액을 형성하는 단계;
(c) 상기 유기용매-고분자 용액과 상기 계면활성제 수용액을 혼합하고 500 rpm 이상 2000 rpm 미만으로 교반하여 마이크로에멀젼을 형성하는 단계; 및
(d) 상기 단계 (c)의 마이크로에멀젼으로부터 생분해성 고분자 마이크로입자를 분리하는 단계
를 포함하며, 상기 생분해성 고분자 마이크로입자는 균일한 입자 크기 및 내부 치밀 구조를 갖는 구형의 마이크로입자이다.
본 발명의 제조 방법은 분무 건조법으로 제조한 마이크로입자에 비해, 별도의 정제 공정을 거치지 않고도, 입자의 크기가 균일하며 내부에 기공이 없이 밀도가 차 있는 치밀 구조를 갖는 구형의 마이크로입자를 제공할 수 있다. 조직수복용 재료로 사용되는 마이크로입자는 균일한 크기의 구형인 것이 유리하다. 종래의 방법으로 제조 시 흔히 나타나는 침상 입자의 경우 피부결절, 틴달, 피부 속 찢어짐과 같은 문제를 방지할 수 있기 때문이다. 또한, 상기 마이크로입자는 내부 치밀 구조인 것이 유리하다. 내부 치밀 구조이면, 시간 경과에 따른 생분해 과정에서도 구형을 오랫동안 유지할 수 있기 때문이다.
또한, 본 발명의 제조 방법은 종래의 용매 증발법에 비해 o/w상의 한 번의 교반만으로 에멀젼 상태를 만들어내고 유화액의 안정성이 높아지므로 뭉침이나 융합 상분리가 발생하지 않아 공정시간이 훨씬 단축되는 효과를 지닌다.
일 구체예에서, 상기 (a) 단계에 사용되는 생분해성 고분자는 폴리-L-락트산(Poly-L-Lactic acid), 폴리-D-락트산(Poly-D-Lactic acid), 폴리글리콜산(PGA), 폴리디옥사논 및 이들의 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 생분해성 고분자의 수평균 분자량(Mn)은 3,000 내지 60,000 Dalton일 수 있으며, 바람직하게는 3,000 내지 40,000 Dalton, 더 바람직하게는 3,000 내지 11,000 Dalton일 수 있다. 수평균 분자량이 3,000 Dalton 미만이면 분해 속도가 너무 빨라 조직수복용 재료로서 부적합하고, 60,000 Dalton 초과이면 생체에 적용 시 피부 탄력, 콜라겐 생성, 항염증, 조직수복 등과 관련된 지표에서 원하는 만큼 충분한 효능을 얻을 수 없다.
일 구체예에서, 상기 유기용매는 디클로로메탄(DCM), 아세톤, 아세트산, 디옥산, 에탄올, 메탄올, 이소프로필 알코올(IPA), 프로판올 및 테트라하이드로퓨란(THF)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 (a) 단계에서 상기 생분해성 고분자의 배합량은 상기 유기용매-고분자 용액 전체 중량에 대하여 5 내지 20 중량%일 수 있으며, 바람직하게는 5 내지 15 중량%일 수 있다. 생분해성 고분자의 배합량이 5 중량% 미만이면 내부 치밀도가 충분하지 않을 수 있으며, 20 중량% 초과이면 균일한 크기의 구 형태를 얻기 어려울 수 있다.
일 구체예에서, 상기 (b) 단계에 사용되는 계면활성제는 폴리옥시에틸렌소르비탄의 지방산 에스테르, 폴리비닐알코올, 폴리옥시에틸렌, 소르비탄 및 폴리에틸렌옥사이드(PEO)-폴리프로필렌옥사이드(PPO) 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 (b) 단계에서 상기 계면활성제의 배합량은 계면활성제 수용액 전체 중량에 대하여 0.5 초과 내지 2 중량%, 바람직하게는 1 내지 2 중량%일 수 있다. 생분해성 고분자의 배합량이 0.5 중량% 이하이거나 2 중량% 초과이면, 입자 크기가 균일하지 않으며, 입자 크기가 너무 크거나 또는 너무 작아서 원하는 범위의 생분해성 고분자 마이크로입자를 제조하기 어렵다.
일 구체예에서, 상기 (c) 단계의 교반 속도는 500 rpm 이상 2000 rpm 미만이며, 바람직하게는 500 내지 1500 rpm일 수 있다. 교반 속도가 500 rpm 미만이거나 2000 rpm 이상이면 입자 크기가 균일하지 않거나 원하는 크기의 생분해성 고분자 마이크로입자를 제조하기 어렵다.
일 구체예에서, 상기 (c) 단계에서 교반 시간은 1~10분, 바람직하게는 2~8분일 수 있다. 교반 시간이 2분 미만이면 내부 치밀 구조를 생성하는 구형 입자를 얻기 어렵고, 8분 초과이면 제조 효율이 낮아질 수 있다.
일 구체예에서, 상기 단계 (d)는, (d-1) 상기 단계 (c)의 마이크로에멀젼을 원심분리한 후 상층액을 제거하고, 이어서 증류수를 첨가하여 분산시키는 단계; 및 (d-2) 상기 단계 (d-1)의 분산액을 다시 원심분리한 후 상층액을 제거하고, 이어서 30~80℃의 오븐에서 건조시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 (d-1) 단계에서, 단계 (c)의 마이크로에멀젼을 원심분리하는 것은 1000~5000 rpm, 바람직하게는 1000~4000 rpm, 더욱 바람직하게는 1000~3000 rpm으로 5 내지 20분 동안 수행할 수 있다. 또한, 이 단계는 증류수를 첨가, 분산함으로써 잔류 유기용매를 제거할 수 있다는 점에서 종래 기술에 비해 유리하다.
또한, 상기 (d-2) 단계에서 단계 (d-1)의 분산액을 다시 원심분리하는 것은 1000~5000 rpm, 바람직하게는 1000~4000 rpm, 더욱 바람직하게는 1000~3000 rpm으로 5 내지 20분 동안 수행할 수 있다. 또한, 이 단계는 오븐 건조를 통해 적당한 범위의 열을 통해 건조함으로써 성상에 변화를 주지 않으면서 일정 가수분해 반응을 저지할 수 있다는 점에서 유리하다.
일 구체예에서, 상기 제조된 생분해성 고분자 마이크로입자의 평균 입자 직경은 바람직하게는 10 내지 50 ㎛이고, 더 바람직하게는 20 내지 50 ㎛일 수 있다. 평균 입자 직경이 10 ㎛ 미만이면 입자가 생체에 주입된 후 대식세포에게 잡아먹혀 효능을 발휘할 수 없으며, 50 ㎛ 초과이면 원하는 기간 내에 생분해가 이루어지기 어렵다.
본 발명의 두 번째 목적은 본 발명의 생분해성 고분자 마이크로입자의 제조 방법에 따라 제조된 생분해성 고분자 마이크로입자를 제공하는 것이다.
상기 제조된 생분해성 고분자 마이크로입자는 화장품 재료 또는 의료 시술용 재료, 예를 들어 조직수복용 재료로 사용될 수 있다.
본 발명의 세 번째 목적은 본 발명의 제조 방법에 따라 제조된 생분해성 고분자 마이크로입자를 포함하는 조직수복용 재료를 제공하는 것이다.
상기 조직수복용 재료는 상기 생분해성 고분자 마이크로입자에 더하여, 정제수 및/또는 생체적합성 담체를 포함하는 조성물일 수 있다.
상기 생체적합성 담체는 셀룰로오스, 키토산, 덱스트란, 히알루론산, 펙틴, 알긴산, 아가, 잔탄, 베타-사이클로덱스트린, 아밀로스, 이들의 염, 이들의 유도체 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 조직수복용 재료는 미용 또는 의료 목적의 필러용 주사제 등에 사용될 수 있다.
실시예
이하, 본 발명의 내용을 실시예를 들어 보다 구체적으로 설명한다. 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1
수평균 분자량(Mn)이 4,000 Dalton인 폴리-L-락트산 15g을 메틸렌 클로라이드 85g에 용해시켜 유기용매-고분자 용액을 제조하였다.
폴리비닐알코올(PVA) 4g을 물 196g과 혼합하여 계면활성제 수용액을 제조하였다.
상기 유기용매-고분자 용액과 상기 계면활성제 수용액을 혼합하고 1100 rpm으로 4분 동안 교반하였다.
교반된 혼합액을 원심분리기로 3000 rpm으로 15분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거하고, 이어서 증류수 200 ml를 첨가한 후 볼텍스를 사용하여 최대 3500 rpm으로 10분 동안 분산시켰다. 이어서, 분산액을 다시 원심분리기를 사용하여 3000 rpm으로 10분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거하였다. 이어서, 40℃의 건조 드라이오븐에 넣어 24시간 건조시켜 최종 생분해성 고분자 마이크로입자를 얻었다.
[시험예 1] 생분해성 고분자 마이크로입자의 생분해에 따른 경시적 변화
실시예 1에서 제조된 생분해성 고분자 마이크로입자를 4주 동안 약 50℃의 가혹 조건에 두고 생분해에 따른 고분자 입자의 형상 변화를 관찰하였다. 생분해성 고분자 마이크로입자 분리 후 0주, 1주, 2주, 3주 및 4주 지난 시점에서 고분자 입자의 주사전자현미경 이미지를 순서대로 도 1의 (a)~(e)에 나타내었다.
도 1을 참조하면, 본 발명에 따라 제조된 고분자 입자는 4주 동안의 생분해 후에도 구형을 우수하게 유지함을 확인할 수 있다. 이는 본 발명에 따라 제조된 고분자 입자가 내부 밀도가 고르게 높아 치밀한 구조를 가지기 때문에 가능한 것으로 여겨진다.
참고예 1-1
수평균 분자량(Mn)이 4,000 Dalton인 폴리-L-락트산 30g을 메틸렌 클로라이드 170g에 용해시켜 유기용매-고분자 용액을 제조하였다.
폴리비닐알코올(PVA) 8g을 물 392g과 혼합하여 계면활성제 수용액을 제조하였다.
상기 유기용매-고분자 용액과 상기 계면활성제 수용액을 혼합하고 1100 rpm으로 4분 동안 교반하여, 중간 단계의 생분해성 고분자 마이크로입자를 생성하였다.
참고예 1-2
폴리비닐알코올 2g을 물 198g과 혼합하여 계면활성제 수용액을 제조한 것 이외에는 참고예 1-1과 동일하게 하여, 중간 단계의 생분해성 고분자 마이크로입자를 생성하였다.
비교 참고예 1-1
폴리비닐알코올 1g을 물 199g과 혼합하여 계면활성제 수용액을 제조한 것 이외에는 참고예 1-1과 동일하게 하여, 생분해성 고분자 입자를 생성하였다.
비교 참고예 1-2
폴리비닐알코올 0.4g을 물 199.6g과 혼합하여 계면활성제 수용액을 제조한 것 이외에는 참고예 1-1과 동일하게 하여, 생분해성 고분자 입자를 생성하였다.
비교 참고예 1-3
폴리비닐알코올 8g을 물 192g과 혼합하여 계면활성제 수용액을 제조한 것 이외에는 참고예 1-1과 동일하게 하여, 생분해성 고분자 입자를 생성하였다.
비교 참고예 1-4
폴리비닐알코올 16g을 물 184g과 혼합하여 계면활성제 수용액을 제조한 것 이외에는 참고예 1-1과 동일하게 하여, 생분해성 고분자 입자를 생성하였다.
[시험예 2] 계면활성제 배합량 변화에 따른 입자 형태 및 평균 직경
참고예 1-1, 1-2, 및 비교 참고예 1-1, 1-2, 1-3, 1-4에서 분리된 생분해성 고분자 마이크로입자의 광학현미경 이미지를 상기 순서대로 도 2의 (a)~(f)에 나타내었다. 또한, 광학현미경을 통해 관찰된 입자의 평균 직경을 하기 표 1에 나타내었다.
|
참고예
1-1 |
참고예
1-2 |
비교 참고예
1-1 |
비교 참고예
1-2 |
비교 참고예
1-3 |
비교 참고예
1-4 |
|
| PVA (중량%) |
2 | 1 | 0.5 | 0.2 | 4 | 8 |
| 평균 입자 직경(㎛) | 14.2 | 47.7 | 83.7 | 115 | 4.98 | 2.42 |
도 2 및 표 1을 참조하면, 참고예 1-1 및 참고예 1-2는 입자의 3차원 형태가 구형이었으며, 내부에 기공이 거의 없는 치밀한 구조를 갖는 것으로 나타났다. 또한, 조직수복용 재료에 적합한 입자 직경을 가짐을 확인하였다.
비교 참고예 1-1 및 비교 참고예 1-2는 구형이었으나 입자의 직경이 균일하지 않았으며, 평균 입자 직경은 50 ㎛를 초과하였다. 비교 참고예 1-3 및 비교 참고예 1-4는 구형이었으나, 평균 입자 직경은 10 ㎛ 미만이었다.
상기 결과를 종합하면, 참고예 1-1 및 1-2는 계면활성제 수용액 중 계면활성제의 배합량이 본 발명에 따른 범위임에 따라 조직수복용 재료로서 적합한 평균 입자 직경을 갖는 반면, 비교 참고예 1-1 내지 1-4는 입자 직경이 지나치게 크거나 지나치게 작았다. 또한, 참고예 1-1 및 1-2는 거의 완전한 구형이면서 입자의 직경이 균일한 데 비해, 비교 참고예 1-1 내지 1-4는 입자의 직경이 비교적 균일하지 않거나 입자 내부도 고르게 치밀하지 않아 조직수복용 재료로 부적합하였다.
참고예 2
교반 속도를 1500 rpm으로 변경하여 제조한 것 이외에는 참고예 1-1과 동일하게 하여, 중간 단계의 생분해성 고분자 마이크로입자를 생성하였다.
비교 참고예 2-1
교반 속도를 2000 rpm으로 변경하여 제조한 것 이외에는 참고예 1-1과 동일하게 하여, 생분해성 고분자 입자를 생성하였다.
비교 참고예 2-2
교반 속도를 6000 rpm으로 변경하여 제조한 것 이외에는 참고예 1-1과 동일하게 하여, 생분해성 고분자 입자를 생성하였다.
비교 참고예 2-3
교반 속도를 8000 rpm으로 변경하여 제조한 것 이외에는 참고예 1-1과 동일하게 하여, 생분해성 고분자 입자를 생성하였다.
[시험예 3] 교반 속도 변화에 따른 입자 형태 및 평균 직경
참고예 2, 및 비교 참고예 2-1, 2-2, 2-3에서 분리된 생분해성 고분자 마이크로입자의 광학현미경 이미지를 상기 순서대로 도 3의 (a)~(d)에 나타내었다. 또한, 광학현미경을 통해 관찰된 입자의 평균 직경을 하기 표 2에 나타내었다.
|
참고예
2 |
비교 참고예
2-1 |
비교 참고예
2-2 |
비교 참고예
2-3 |
|
| 교반 속도 (rpm) |
1500 | 2000 | 6000 | 8000 |
| 평균 입자 직경(㎛) | 19.8 | 9.13 | 5.46 | 2.96 |
도 3 및 표 2를 참조하면, 참고예 2는 입자의 3차원 형태가 구형이었으며, 내부에 기공이 거의 없는 치밀한 구조를 갖는 것으로 나타났다. 또한, 조직수복용 재료에 적합한 입자 직경을 가짐을 확인하였다. 비교 참고예 2-1, 2-2, 2-3는 구형이었으나, 평균 입자 직경은 10 ㎛ 미만이었다.
상기 결과를 종합하면, 참고예 2는 교반 속도가 본 발명에 따른 범위임에 따라 조직수복용 재료로서 적합한 평균 입자 직경을 갖는 반면, 비교 참고예 2-1 내지 2-3는 입자 직경이 작아서 부적합하였다.
실시예 2
실시예 1과 동일한 방법으로, 18g 스케일의 최종 생분해성 고분자 마이크로입자를 제조하였다.
비교예 1
수평균 분자량(Mn)이 4,000 Dalton인 폴리-L-락트산 15g을 메틸렌 클로라이드 85g에 용해시켜 유기용매-고분자 용액을 제조하였다.
상기 유기용매-고분자 용액을 분무건조하여 18g 스케일의 최종 생분해성 고분자 입자를 제조하였다.
[시험예 4] 본 발명에 따른 제조 방법과 분무 건조법의 입자 직경 및 수율 비교
실시예 2와 비교예 1에서 제조된 고분자 입자에 대해 광학현미경을 통해 입자 직경 범위를 측정하고 수율을 계측하여 아래 표 3에 나타내었다.
| 입자 직경 | 수율 | |
| 실시예 2 | 25~50μm | 95% |
| 비교예 1 | 100~300μm | 82% |
표 3을 참조하면, 본 발명에 따른 제조 방법(실시예 2)이 분무 건조법을 사용한 경우(비교예 1)보다 입자 직경의 범위가 생체 수복용 재료에 사용하기 적합하고 수율도 높음을 알 수 있다.
실시예 3
수평균 분자량(Mn)이 3,000 내지 11,000 Dalton인 폴리-L-락트산 18g을 메틸렌 클로라이드 232g에 용해시켜 유기용매-고분자 용액을 제조한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 생분해성 고분자 마이크로입자를 제조하였다.
비교예 2
수평균 분자량(Mn)이 11,000 Dalton 초과 내지 60,000 Dalton인 폴리-L-락트산 18g을 메틸렌 클로라이드 232g에 용해시켜 유기용매-고분자 용액을 제조한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 생분해성 고분자 마이크로입자를 제조하였다.
[시험예 5] 생분해성 고분자의 분자량 변화에 따른 효능 실험
실시예 3에서 제조한 생분해성 고분자 마이크로입자를 증류수와 혼합하여 11월령 암컷 마우스에게 주사하였다. 또한, 비교예 2에서 제조한 생분해성 고분자 마이크로입자를 증류수와 혼합하고 고주파(RF)로 처리한 후, 다른 11월령 암컷 마우스에게 주사하였다. 또한, 히알루론산(HA)을 또 다른 11월령 암컷 마우스에게 주사하였다.
주사 후 1일차, 3일차, 28일차, 56일차 및 84일차에 조직을 채취하였다. 채취된 시료를 대상으로 피부 탄력도, 콜라겐 섬유 밀도와, 대식세포, 사이토카인, 성장 인자, 섬유아세포 및 MMPs의 발현 정도를 측정하였으며, 그 결과를 도 4a~4g에 나타내었다.
도 4a를 참조하면, 생분해성 고분자 마이크로입자를 주입한 경우 히알루론산을 주입한 경우보다 피부 탄력도가 상당히 증가한 것으로 나타났다. 또한, 저분자 PLLA를 사용한 실시예 3을 주입한 경우의 피부 탄력도는 고분자 PLLA를 사용한 비교예 2에 고주파 처리를 하여 주입한 경우와 유사한 수준으로 높게 나타났다.
도 4b를 참조하면, 생분해성 고분자 마이크로입자를 주입한 경우 4주 후의 콜라겐 섬유 밀도가 상당히 증가한 것으로 나타났다. 또한, 저분자 PLLA를 사용한 실시예 3을 주입한 경우의 콜라겐 섬유 밀도는 고분자 PLLA를 사용한 비교예 2에 고주파 처리를 하여 주입한 경우와 유사하거나 4주 후에는 약간 더 높은 수준이었다.
도 4c를 참조하면, 생분해성 고분자 마이크로입자를 주입한 경우 4주 후의 새로 합성된 콜라겐 섬유 밀도가 상당히 증가한 것으로 나타났다. 또한, 저분자 PLLA를 사용한 실시예 3을 주입한 경우의 새로 합성된 콜라겐 섬유 밀도는 고분자 PLLA를 사용한 비교예 2에 고주파 처리를 하여 주입한 경우보다 약간 더 증가하였다.
도 4d를 참조하면, 생분해성 고분자 마이크로입자를 주입한 경우 전체 기간에 걸쳐 M1 대식세포 발현이 낮고 이는 만성염증의 위험성이 낮으며 M2 대식세포 발현은 상당히 높았다가 일정 시점부터 낮아졌다. 이는 과도한 혈관생성을 막아 홍조의 위험성을 낮춘다. 또한, 실시예 3을 주입한 경우의 M1 대식세포 발현 정도 및 M2 대식세포 발현 정도는 비교예 2에 고주파 처리를 하여 주입한 경우와 유사하게 우수하였다.
도 4e를 참조하면, 생분해성 고분자 마이크로입자를 주입한 경우 전체 기간에 걸쳐 염증성 사이토카인(IL-1β) 분비 정도는 낮고 이는 만성염증의 위험성이 낮으며 항염증성 사이토카인(IL-10) 분비 정도는 높았다. 특히, 실시예 3을 주입한 경우의 항염증성 사이토카인 분비 정도는 비교예 2에 고주파 처리를 하여 주입한 경우에 비해서도 현저히 높았다.
도 4f를 참조하면, 생분해성 고분자 마이크로입자를 주입한 경우 3일 후의 성장 인자 발현 정도는 상당히 높았다. 특히, 실시예 3을 주입한 경우의 bFGF(섬유아세포 성장인자) 발현 정도는 비교예 2에 고주파 처리를 하여 주입한 경우에 비해서도 높았으며, 실시예 3을 주입한 경우의 TGF-β(전환성장인자-β) 발현 정도는 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3 모두 비교예 2에 고주파 처리를 하여 주입한 경우에 비해서도 현저히 높았다.
도 4g를 참조하면, 생분해성 고분자 마이크로입자를 주입한 경우 4주 후의 진피 섬유아세포 전구체 및 유두진피 섬유아세포 전구체의 발현 정도는 상당히 높았다. 특히, 실시예 3을 주입한 경우의 섬유아세포 전구체의 발현 정도는 비교예 2에 고주파 처리를 하여 주입한 경우에 비해 28일차에 매우 높았고, 또한 높은 수준이 84일차까지도 비교적 감소되지 않고 지속되었다.
도 4h를 참조하면, 생분해성 고분자 마이크로입자를 주입한 경우 4주 후의 MMPs(기질금속단백질분해효소)의 발현 정도는 상당히 낮았고 시간이 지남에 따라 더 낮아졌다. 또한, 실시예 3을 주입한 경우의 MMPs의 발현 정도는 비교예 2에 고주파 처리를 하여 주입한 경우와 유사하게 낮았으며, 특히, MMP9와 MMP13의 발현 정도가 더 낮았다.
상기 결과를 종합하면, 실시예 3은 고주파 처리를 하지 않았음에도, 일부 지표에서 비교예 2에 고주파 처리한 경우와 동등하게 우수한 효능을 나타내거나, 다수의 지표에서 비교예 2에 고주파 처리한 경우보다 더 높은 효능을 나타내었다. 따라서, 본 발명의 방법에 따라 특정 범위의 저분자량을 갖는 생분해성 고분자를 사용하여 제조한 생분해성 고분자 마이크로입자는, 이보다 분자량이 더 큰 고분자량을 갖는 생분해성 고분자를 사용하여 제조한 생분해성 고분자 마이크로입자보다 전체적으로 우수한 효능을 가짐을 알 수 있다.
Claims (11)
- 생분해성 고분자 마이크로입자의 제조 방법으로서,
(a) 생분해성 고분자를 유기용매에 용해시켜 유기용매-고분자 용액을 형성하는 단계;
(b) 계면활성제 및 물을 혼합하여 계면활성제 수용액을 형성하는 단계;
(c) 상기 유기용매-고분자 용액과 상기 계면활성제 수용액을 혼합하고 500 rpm 이상 2000 rpm 미만으로 교반하여 마이크로에멀젼을 형성하는 단계; 및
(d) 상기 단계 (c)의 마이크로에멀젼으로부터 생분해성 고분자 마이크로입자를 분리하는 단계
를 포함하며,
상기 생분해성 고분자 마이크로입자는 균일한 입자 크기 및 내부 치밀 구조를 갖는 구형의 마이크로입자인, 생분해성 고분자 마이크로입자의 제조 방법. - 제1항에 있어서,
상기 단계 (d)는,
(d-1) 상기 단계 (c)의 마이크로에멀젼을 원심분리한 후 상층액을 제거하고, 이어서 증류수를 첨가하여 분산시키는 단계; 및
(d-2) 상기 단계 (d-1)의 분산액을 다시 원심분리한 후 상층액을 제거하고, 이어서 30~80℃의 오븐에서 건조시키는 단계
를 포함하는, 생분해성 고분자 마이크로입자의 제조 방법. - 제1항에 있어서,
상기 생분해성 고분자 마이크로입자의 평균 입자 직경은 10 내지 50 ㎛인, 생분해성 고분자 마이크로입자의 제조 방법. - 제1항에 있어서,
상기 생분해성 고분자의 수평균 분자량(Mn)은 3,000 내지 40,000 Dalton인, 생분해성 고분자 마이크로입자의 제조 방법. - 제1항에 있어서,
상기 생분해성 고분자는 폴리-L-락트산(Poly-L-Lactic acid), 폴리-D-락트산(Poly-D-Lactic acid), 폴리글리콜산(PGA), 폴리디옥사논 및 이들의 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 생분해성 고분자 마이크로입자의 제조 방법. - 제1항에 있어서,
상기 유기용매는 디클로로메탄(DCM), 아세톤, 아세트산, 디옥산, 에탄올, 메탄올, 이소프로필 알코올(IPA), 프로판올 및 테트라하이드로퓨란(THF)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 생분해성 고분자 마이크로입자의 제조 방법. - 제1항에 있어서,
상기 (a) 단계에서 상기 생분해성 고분자의 배합량은 상기 유기용매-고분자 용액 전체 중량에 대하여 5 내지 20 중량%인, 생분해성 고분자 마이크로입자의 제조 방법. - 제1항에 있어서,
상기 계면활성제는 폴리옥시에틸렌소르비탄의 지방산 에스테르, 폴리비닐알코올, 폴리옥시에틸렌, 소르비탄 및 폴리에틸렌옥사이드(PEO)-폴리프로필렌옥사이드(PPO) 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 생분해성 고분자 마이크로입자의 제조 방법. - 제1항에 있어서,
상기 (b) 단계에서 상기 계면활성제의 배합량은 계면활성제 수용액 전체 중량에 대하여 1 내지 2 중량%인, 생분해성 고분자 마이크로입자의 제조 방법. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 생분해성 고분자 마이크로입자.
- 제10항의 생분해성 고분자 마이크로입자를 포함하는 조직수복용 재료.
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