KR20240051989A - 트랜스진 발현을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

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KR20240051989A
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셩지앙 리우
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에이버맥스 바이오파마 인크.
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Abstract

본원에는 트랜스진 발현을 조정하기 위한 조성물이 기재되어 있다. 또한, 본원에는 트랜스진 발현을 조정하기 위해 본원에 기재된 조성물을 사용하는 방법이 기재되어 있다.

Description

트랜스진 발현을 위한 조성물 및 방법
상호 참조
본 출원은 2021년 8월 23일에 출원된 미국 가출원 번호 63/236,168을 우선권 주장하며, 이 가출원의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
참조로 포함
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참조로 포함되도록 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다. 참조로 포함된 간행물 및 특허 또는 특허 출원이 본 명세서에 함유된 개시내용과 모순되는 경우, 본 명세서는 그러한 모순되는 임의의 자료를 대체하고/거나 우선시하도록 의도된다.
혈관생성, 혈관형성 및 동맥형성을 포함한 신생혈관증식은 다양한 세포 신호전달 경로에 의해 조절된다. 신호전달 경로 중 하나는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)에 의해 조절된다. VEGF에는 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, 및 VEGF-D를 포함한 4가지 주요 유형이 있다. VEGF121, VEGF145, VEGF148, VEGF162, VEGF165, VEGF165b, VEGF183, VEGF189, 및 VEGF206을 포함하여, VEGF-A로부터의 mRNA의 교대 스플라이싱으로 인해 발생하는 VEGF-A의 많은 이소형이 있다. VEGF는 내피 세포에 대한 강력한 분열 촉진 인자로서, 증식, 이동, 혈관 튜빙 형성 및 투과성을 유도한다. 이와 같이, VEGF 신호전달 변환 경로의 증가는 신생혈관증식 신호를 증가시키는 반면, VEGF 신호전달 변환 경로의 감소 또는 억제는 신생혈관증식 신호를 감소시킨다.
VEGF 억제는 신생혈관증식과 관련된 질환 또는 병태에 대한 가장 인기 있는 치료 옵션 중 하나이다. VEGF 억제제를 이용하는 현재 치료법은 VEGF 억제제의 반감기가 짧기 때문에 번거로울 수 있으며, 이로 인해 신생혈관증식의 억제를 달성하고 유지하기 위해 매월 반복 주사가 필요하다. 따라서, VEGF 억제의 잠재력을 최대한 활용하는 것은 VEGF 억제의 치료 효과를 증대시킴으로써만 실현될 수 있다는 것이 점점 더 분명해지고 있다.
신생혈관증식과 연관된 리간드 및 수용체 상호작용에서의 신호전달 변환을 조정하여, VEGF 억제와 조합될 때 상승작용적 치료 효과를 보완하거나 유도하는 생물학적 제품에 대한 필요성이 여전히 존재한다. 따라서, 본원에는 VEGF 억제제 및 VEGF 억제의 치료 효과를 증대시키고 보완하는 신호전달 변환 조절인자 (예를 들어, VEGF 신호전달과 연관된 수용체 티로신 키나제의 활성화제)를 코딩하는 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드가 기재되어 있다. 이러한 조합은 VEGF 억제의 치료 효과를 상승작용적으로 증가시키고 신생혈관증식 신호전달을 감소시킬 수 있다.
본원에는 일부 측면에서, 하기를 발현하기 위한 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드가 기재되어 있다: VEGF 억제제; 및 수용체 티로신 키나제 (RTK)/Tie2 또는 RTK/Tie2의 활성화제. 일부 실시양태에서, VEGF 억제제 및 RTK/Tie 또는 RTK/Tie2의 활성화제는 별도의 폴리펩티드로서 발현되거나 또는 VEGF 억제제, 및 RTK/Tie2 또는 RTK/Tie2의 활성화제를 포함하는 별도의 폴리펩티드로 절단가능한 인접 폴리펩티드로서 발현된다. 일부 실시양태에서, 인접 폴리펩티드는 프로테아제 절단가능 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인접 폴리펩티드는 푸린 절단가능 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인접 폴리펩티드는 자기-절단 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 자기-절단 폴리펩티드 서열은 2A 자기-절단 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 자기-절단 폴리펩티드 서열은 F2A 자기-절단 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로테아제 절단가능 서열은 푸린-F2A 절단 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, VEGF 억제제는 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, 또는 그의 조합과 결합하여 이를 억제한다. 일부 실시양태에서, VEGF 억제제는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, VEGF 억제제는 1가 Fab', 2가 Fab2, F(ab)'3 단편, 단일-쇄 가변 단편 (scFv), 비스-scFv, (scFv)2, 디아바디, 미니바디, 나노바디, 트리아바디, 테트라바디, 디술피드 안정화된 Fv 단백질 ("dsFv"), 단일-도메인 항체 (sdAb), Ig NAR, 낙타류 항체, 또는 그의 조합, 그의 결합 단편, 또는 그의 화학적으로 변형된 유도체를 포함한다. 일부 실시양태에서, VEGF 억제제는 비-항체 VEGF 억제제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-항체 VEGF 억제제는 VEGF 수용체 1 (VEGFR1), VEGF 수용체 2 (VEGFR2), VEGF 수용체 3 (VEGFR3), 그의 단편, 또는 그의 조합이다. 일부 실시양태에서, 비-항체 VEGF 억제제는 가용성 VEGFR1, 가용성 VEGFR2, 가용성 VEGFR3, 그의 가용성 단편, 또는 그의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-항체 VEGF 억제제는 VEGF-트랩 또는 그의 변형된 버전을 포함한다. 일부 실시양태에서, RTK/Tie2의 활성화제는 안지오포이에틴-1 (Ang-1), 안지오포이에틴-2 (Ang-2), 안지오포이에틴-3 (Ang-3) 또는 안지오포이에틴-4 (Ang-4)를 포함한다. 일부 실시양태에서, RTK/Tie2의 활성화제는 Ang1을 포함한다. 일부 실시양태에서, Ang1은 전체 길이의 Ang1을 포함한다. 일부 실시양태에서, Ang1은 서열식별번호(SEQ ID NO): 3과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Ang1은 Ang1의 기능적 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, Ang1의 기능적 단편은 피브로넥틴-유사 도메인 (FLD)을 포함한다. 일부 실시양태에서, FLD는 서열식별번호: 5와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, FLD는 가용성 폴리펩티드와 융합된다. 일부 실시양태에서, 가용성 폴리펩티드는 서열식별번호: 1과 최대 99%, 최대 98%, 최대 97%, 최대 96%, 최대 95%, 최대 94%, 또는 최대 93% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가용성 폴리펩티드는 서열식별번호: 2와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 그 초과로 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가용성 폴리펩티드는 서열식별번호: 2인 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, RTK/Tie2의 활성화제는 서열식별번호: 6과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일하다. 일부 실시양태에서, RTK/Tie2의 활성화제는 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, RTK/Tie2의 활성화제는 1가 Fab', 2가 Fab2, F(ab)'3 단편, 단일-쇄 가변 단편 (scFv), 비스-scFv, (scFv)2, 디아바디, 미니바디, 나노바디, 트리아바디, 테트라바디, 디술피드 안정화된 Fv 단백질 ("dsFv"), 단일-도메인 항체 (sdAb), Ig NAR, 낙타류 항체, 또는 그의 조합, 그의 결합 단편, 또는 그의 화학적으로 변형된 유도체를 포함한다. 일부 실시양태에서, RTK/Tie2의 활성화제는 Ang2와 결합하여 이를 억제한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 12와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 폴리펩티드와 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 25-27 중 어느 하나, 그의 단편, 또는 그의 조합과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, RTK/Tie2의 활성화제는 억제성 RNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 억제성 RNA는 shRNA, siRNA, miRNA, 또는 그의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 억제성 RNA는 shRNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 억제성 RNA는 안지오포이에틴을 코딩하는 내인성 핵산과 결합한다. 일부 실시양태에서, 안지오포이에틴은 Ang2를 포함한다. 일부 실시양태에서, Ang2는 서열식별번호: 13과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 발현 카세트는 하나 이상의 프로모터, 하나 이상의 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 또는 둘 다를 포함한다. 일부 실시양태에서, VEGF 억제제 및 RTK/Tie2의 활성화제 또는 RTK/Tie2는 VEGF 억제제 및 RTK/Tie2의 활성화제 또는 RTK/Tie2의 부재 하에서의 신생혈관증식 신호전달과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 또는 그 초과만큼 세포에서의 발현 시 신생혈관증식 신호전달을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, VEGF 억제제 및 RTK/Tie2의 활성화제 또는 RTK/TIE2는 2개의 상이한 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드로부터 코딩된 필적하는 VEGF 억제제 및 필적하는 RTK/Tie2의 활성화제 또는 필적하는 RTK/Tie2에 의해 감소된 신생혈관증식 신호전달과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 또는 그 초과만큼 세포에서의 발현 시 신생혈관증식 신호전달을 감소시킨다.
본원에는 일부 측면에서, 하기를 발현하기 위한 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드가 기재되어 있다: VEGF 억제제; 및 Ang1 폴리펩티드. 또한, 본원에는 특정 측면에서, 하기를 발현하기 위한 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드가 기재되어 있다: VEGF 억제제; 및 Ang2 억제제. 일부 실시양태에서, VEGF 억제제는 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, 또는 그의 조합과 결합하여 이를 억제한다. 일부 실시양태에서, VEGF 억제제는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, VEGF 억제제는 1가 Fab', 2가 Fab2, F(ab)'3 단편, 단일-쇄 가변 단편 (scFv), 비스-scFv, (scFv)2, 디아바디, 미니바디, 나노바디, 트리아바디, 테트라바디, 디술피드 안정화된 Fv 단백질 ("dsFv"), 단일-도메인 항체 (sdAb), Ig NAR, 낙타류 항체, 또는 그의 조합, 그의 결합 단편, 또는 그의 화학적으로 변형된 유도체를 포함한다. 일부 실시양태에서, VEGF 억제제는 서열식별번호: 21, 서열식별번호: 22, 서열식별번호: 23, 서열식별번호: 32, 서열식별번호: 33, 서열식별번호: 34, 서열식별번호: 35, 또는 그의 조합, 또는 그의 단편과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, VEGF 억제제는 비-항체 VEGF 억제제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-항체 VEGF 억제제는 VEGF 수용체 1, VEGF 수용체 2, VEGF 수용체 3, 그의 단편, 또는 그의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-항체 VEGF 억제제는 가용성 VEGFR1, 가용성 VEGFR2, 가용성 VEGFR3, 그의 가용성 단편, 또는 그의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-항체 VEGF 억제제는 VEGF-트랩 또는 그의 변형된 버전을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-항체 VEGF 억제제는 서열식별번호: 24, 서열식별번호: 25, 서열식별번호: 26, 또는 서열식별번호: 31, 또는 그의 조합, 또는 그의 단편과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Ang1 폴리펩티드는 전체 길이의 Ang1이다. 일부 실시양태에서, Ang1 폴리펩티드는 서열식별번호: 3과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 동일하다. 일부 실시양태에서, Ang1 폴리펩티드는 Ang1의 피브로넥틴-유사 도메인 (FLD)을 포함하는 Ang1 기능적 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, Ang1 폴리펩티드는 서열식별번호: 5와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 동일하다. 일부 실시양태에서, FLD는 서열식별번호: 6과 최대 99%, 최대 98%, 최대 96%, 최대 95%, 최대 94%, 또는 최대 93% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하는 가용성 폴리펩티드와 융합된다. 일부 실시양태에서, Ang2 억제제는 Ang2와 결합하여 이를 억제하는 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, Ang2 억제제는 1가 Fab', 2가 Fab2, F(ab)'3 단편, 단일-쇄 가변 단편 (scFv), 비스-scFv, (scFv)2, 디아바디, 미니바디, 나노바디, 트리아바디, 테트라바디, 디술피드 안정화된 Fv 단백질 ("dsFv"), 단일-도메인 항체 (sdAb), Ig NAR, 낙타류 항체, 또는 그의 조합, 그의 결합 단편, 또는 그의 화학적으로 변형된 유도체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 서열식별번호: 12와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 폴리펩티드와 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 단편은 서열식별번호: 25-27 중 어느 하나, 또는 그의 단편, 또는 그의 조합과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Ang2 억제제는 RNA 간섭 (RNAi)을 포함한다. 일부 실시양태에서, RNAi는 shRNA, siRNA, miRNA, 또는 그의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, RNAi는 Ang2를 코딩하는 내인성 핵산과 결합하는 shRNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, RNAi는 서열식별번호: 13과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 Ang2 핵산 서열과 결합한다. 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 81-86 중 어느 하나와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 31-34 및 51-77 중 어느 하나와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 발현 카세트는 하나 이상의 프로모터, 하나 이상의 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 또는 둘 다를 포함한다. 일부 실시양태에서, VEGF 억제제 및 Ang1 폴리펩티드는 VEGF 억제제 및 Ang1 폴리펩티드의 부재 하에서의 신생혈관증식 신호전달과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 또는 그 초과만큼 세포에서의 발현 시 신생혈관증식 신호전달을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, VEGF 억제제 및 Ang1 폴리펩티드는 2개의 상이한 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드로부터 코딩된 필적하는 VEGF 억제제 및 필적하는 Ang1 폴리펩티드에 의해 감소된 신생혈관증식 신호전달과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 또는 그 초과만큼 세포에서의 발현 시 신생혈관증식 신호전달을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, VEGF 억제제 및 Ang2 억제제는 VEGF 억제제 및 Ang2 억제제의 부재 하에서의 신생혈관증식 신호전달과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 또는 그 초과만큼 세포에서의 발현 시 신생혈관증식 신호전달을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, VEGF 억제제 및 Ang2 억제제는 2개의 상이한 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드로부터 코딩된 필적하는 VEGF 억제제 및 필적하는 Ang2 억제제에 의해 감소된 신생혈관증식 신호전달과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 또는 그 초과만큼 세포에서의 발현 시 신생혈관증식 신호전달을 감소시킨다.
본원에는 일부 측면에서, 본원에 기재된 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터가 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 scAAV 벡터이다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 AAV 혈청형을 포함한다.
본원에는 일부 측면에서, 본원에 기재된 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포가 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 배아 줄기 세포, 배아 줄기 세포-유래 분화된 세포, 망막 색소 상피 (RPE) 세포, 신경 전구 세포, 광수용체 전구 세포, 골수-유래 조혈 줄기 세포, 또는 골수-유래 조혈 줄기 전구 세포를 포함한다.
본원에는 일부 측면에서, 본원에 기재된 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물이 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에게 척수강내로, 안구내로, 유리체내로, 망막으로, 정맥내로, 근육내로, 심실내로, 대뇌내로, 소뇌내로, 뇌실내로, 실질내로, 피하로, 종양내로, 폐로, 기관내로, 복강내로, 방광내로, 질내로, 직장내로, 경구로, 설하로, 경피로, 흡입에 의해, 흡입 연무 형태에 의해, 관강내-GI 경로에 의해, 또는 그의 조합에 의해 투여하기 위해 제형화된다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 안구 질환 또는 병태를 치료하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 대상체에서 신생혈관증식, 혈관 누출, 염증, 또는 그의 조합을 감소시킨다.
본원에는 일부 측면에서, 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로서, 대상체에게 본원에 기재된 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드, 세포, 또는 제약 조성물의 치료상 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법이 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, VEGF 억제제 및 RTK/Tie2의 활성화제 또는 RTK/Tie2는 VEGF 억제제 및 RTK/Tie2의 활성화제 또는 RTK/Tie2의 부재 하에서의 신생혈관증식 신호전달과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 또는 그 초과만큼 세포에서의 발현 시 신생혈관증식 신호전달을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, VEGF 억제제 및 RTK/Tie2의 활성화제 또는 RTK/Tie2는 2개의 상이한 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드로부터 코딩된 필적하는 VEGF 억제제 및 필적하는 RTK/Tie2의 활성화제 또는 필적하는 RTK/Tie2에 의해 감소된 신생혈관증식 신호전달과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 또는 그 초과만큼 세포에서의 신생혈관증식 신호전달을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드, 세포, 또는 제약 조성물은 대상체에서 신생혈관증식, 혈관 누출, 염증, 또는 그의 조합을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, VEGF 억제제 및 RTK/Tie2의 활성화제 또는 RTK/Tie2는 VEGF 억제제 및 RTK/Tie2의 활성화제 또는 RTK/Tie2의 부재 하에서의 신생혈관증식과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 또는 그 초과만큼 세포에서의 신생혈관증식을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, VEGF 억제제 및 RTK/Tie2의 활성화제 또는 RTK/Tie2는 2개의 상이한 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드로부터 코딩된 필적하는 VEGF 억제제 및 필적하는 RTK/Tie2의 활성화제 또는 필적하는 RTK/Tie2에 의해 감소된 신생혈관증식과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 또는 그 초과만큼 세포에서의 신생혈관증식을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, VEGF 억제제 및 RTK/Tie2의 활성화제 또는 RTK/Tie2는 VEGF 억제제 및 RTK/Tie2의 활성화제 또는 RTK/Tie2의 부재 하에서의 혈관 누출과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 또는 그 초과만큼 세포에서의 혈관 누출을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, VEGF 억제제 및 RTK/Tie2의 활성화제 또는 RTK/Tie2는 2개의 상이한 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드로부터 코딩된 필적하는 VEGF 억제제 및 필적하는 RTK/Tie2의 활성화제 또는 필적하는 RTK/Tie2에 의해 감소된 혈관 누출과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 또는 그 초과만큼 세포에서의 혈관 누출을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, VEGF 억제제 및 RTK/Tie2의 활성화제 또는 RTK/Tie2는 VEGF 억제제 및 RTK/Tie2의 활성화제 또는 RTK/Tie2의 부재 하에서의 염증과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 또는 그 초과만큼 세포에서의 염증을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, VEGF 억제제 및 RTK/Tie2의 활성화제 또는 RTK/Tie2는 2개의 상이한 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드로부터 코딩된 필적하는 VEGF 억제제 및 필적하는 RTK/Tie2의 활성화제 또는 필적하는 RTK/Tie2에 의해 감소된 염증 신호전달과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 또는 그 초과만큼 세포에서의 염증을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 병태는 안구 허혈 증후군, 증식성 망막병증, 신생혈관 녹내장 (NG), 포도막염, 신생혈관 포도막염, 완전색맹, 연령-관련 황반 변성 (nAMD), 당뇨병성 황반 부종 (DME), 당뇨병성 황반 망막병증 (DMR), 망막 정맥 폐색증 (RVO), 녹내장, 바르데-비들 증후군, 베스트병, 맥락막결손, 레베르 선천성 흑암시, 황반 변성, 결절성 맥락막 혈관병증 (PCV), 색소성 망막염, 레프섬병, 스타르가르트병, 어셔 증후군, X-연관 망막층간분리 (XLRS), 간체-추체 이영양증, 추체-간체 이영양증, 오구치병, 말라티아 레벤티네스 (가족성 우성 드루젠) 및 청색 추체 단색형색각을 포함한다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 병태는 당뇨병성 황반 부종 (DME)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 병태는 당뇨병성 황반 망막병증 (DMR)을 포함한다.
본원에는 일부 측면에서, 하기를 포함하는 키트가 기재되어 있다: 본원에 기재된 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드, 세포, 또는 제약 조성물; 및 용기.
본 특허 출원은 컬러로 실행된 적어도 하나의 도면을 함유한다. 컬러 도면(들)이 포함된 본 특허 또는 특허 출원의 카피는 요청하고 필요한 수수료를 지불하면 특허청에 의해 제공될 것이다.
도 1은 신생혈관증식을 조정하거나 감소시키기 위해 본원에 기재된 VEGF 억제제, RTK/Tie2의 활성화제, 또는 RTK/Tie2에 의해 억제되거나 조정될 수 있는 표적을 예시한다.
도 2는 본원에 기재된 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 예시적인 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터를 예시하며, 여기서 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드는 VEGF 항체를 포함하는 VEGF 억제제와 Ang1 단편 또는 Ang2 shRNA의 조합을 코딩하는 2개의 발현 카세트를 포함한다.
도 3a는 본원에 기재된 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 예시적인 AAV 벡터 (AAV2.N54-120-136 또는 AAV2.N54-120-153)에 의해 코딩된 Ang1 단편 (Ang1-FLD) 또는 상이한 예시적인 AAV 벡터 (AAV2.N54-120-150 또는 AAV2.N54-120-148)에 의해 코딩된 Ang2 shRNA에 의해 억제된 내인성 Ang2 및 비-항체 VEGF 억제제 (아플리베르셉트 또는 VEGF-트랩)의 발현 수준 (μg/ml)을 예시한다.
도 3b는 RTK/Tie2의 활성화제가 Ang1 단편 (Ang1-FOLD 또는 Ang1-FTD) 또는 Ang2 shRNA를 포함하는 부가의 AAV 벡터를 예시한다.
도 4는 비-항체 VEGF 억제제 (아플리베르셉트 또는 VEGF-트랩) 및 Ang2 shRNA에 의해 억제된 내인성 Ang2의 발현 수준 (μg/ml)을 예시하며, 여기서 비-항체 VEGF 억제제 및 Ang2 shRNA는 본원에 기재된 예시적인 AAV 벡터 (AAV2.N54-120-150 또는 AAV2.N54-120-148)에 의해 코딩되었다.
도 5는 VEGF 억제제 (VEGF-scFv 항체) 및 Ang2 shRNA에 의해 억제된 내인성 Ang2의 발현 수준 (μg/ml)을 예시하며, 여기서 VEGF 항체 및 Ang2 shRNA는 본원에 기재된 예시적인 AAV 벡터에 의해 코딩되었다.
도 6a는 본원에 기재된 적어도 2개의 발현 카세트를 포함하는 예시적인 pFB-AAV 벡터 맵을 예시하며, 여기서 예시된 AAV 벡터는 바큘로바이러스 기반 AAV 벡터이다.
도 6b는 VEGF 항체 (상단 박스, 서열식별번호: 21 및 서열식별번호: 22), hCOMP-Ang1 (중간 박스, 서열식별번호: 6) 또는 FLAG-hCOMP-Ang1 (하단 박스, 서열식별번호: 8)을 포함하는 예시적인 pFB-AAV 벡터 (AVMX103: 항-VEGF-(Fab)2-hCOMP-Ang1)를 예시한다.
도 7a는 예시적인 pFB-AAV 벡터 (AVMX103: 항-VEGF-(Fab)2-hCOMP-Ang1)를 예시한다.
도 7b는 Ang1 단편과 융합된 VEGF 항체를 발현하기 위한 예시적인 pFB-AAV 벡터 (AVMX103: VEGF(Fab)2-링커-hCOMP-Ang-1)를 예시한다. VEGF 항체의 중쇄는 GGGGSG 링커를 통해 가용성 폴리펩티드 (hCOMP, 서열식별번호: 2) 및 Ang1 단편 (서열식별번호: 5)과 융합되어 있는 반면 (상단 박스, 서열식별번호: 41), 항-VEGF 항체의 경쇄는 상이한 발현 카세트에 의해 별도로 전사된다 (하단 박스, 서열식별번호: 43).
도 7c는 Ang1 단편과 융합된 VEGF 항체를 포함하는 예시적인 pFB-AAV 벡터 (AVMX103b: 항-VEGF-(Fab)2-링커-hCOMP-An AVMX103: VEGF(Fab)2-링커-Ang-1)를 예시한다 (상단 박스, 서열식별번호: 42 및 하단 박스, 서열식별번호: 43). VEGF 항체의 중쇄는 GGGGSG 링커를 통해 Ang1 단편 (서열식별번호: 5)과 융합되어 있는 반면 (상단 박스, 서열식별번호: 42), 항-VEGF 항체의 경쇄는 별도로 전사된다 (하단 박스, 서열식별번호: 43).
도 7d는 비-항체 VEGF 억제제 (서열식별번호: 24) 및 Ang1 단편 (서열식별번호: 6)을 코딩하는 비-제한적 예시적인 pFB-AAV 벡터 (AVMX-110: VEGF-트랩-hCOMP-Ang1)를 예시한다.
도 8a는 "4xGGGGS"로써 표시된 바와 같은 Ang1 단편 (서열식별번호: 6)과 융합된 비-항체 VEGF 억제제 (서열식별번호: 24)를 코딩하는 비-제한적 예시적인 pFB-AAV 벡터 (AVMX110-hCOMP-Ang1.FLD)를 예시한다.
도 8b는 비-항체 VEGF 억제제 (VEGF-트랩, 서열식별번호: 24) 및 ANG2 항체 (서열식별번호: 27)를 코딩하는 비-제한적 예시적인 pFB-AAV 벡터 (AVMX110-Ang2-항체)를 예시한다.
도 8c는 ANG2 항체 (서열식별번호: 27)에 연결된 ("4xGGGGS"로써 표시됨) scFv 항체 VEGF 억제제 (서열식별번호: 23)를 코딩하는 비-제한적 예시적인 pFB-AAV 벡터를 예시한다.
도 8d는 비-항체 VEGF 억제제 (VEGF-트랩, 서열식별번호: 24) 및 ANG2 침묵 서열 (예를 들어, 억제성 RNA를 코딩하는 핵산 서열)을 코딩하는 비-제한적 예시적인 pFB-AAV 벡터 (AVMX110-항-Ang2 shRNA)를 예시한다.
도 9a는 항체 VEGF 억제제 (서열식별번호: 34) 및 hCOMP-Ang1 (치료 목적의 경우, 서열식별번호: 6) 또는 FLAG-hCOMP-Ang1 (약동학적 목적의 경우, 서열식별번호: 28)을 코딩하는 비-제한적 예시적인 pFB-AAV 벡터 (AVMX104: 항-VEGF-ScFV-hCOMP-Ang1)를 예시한다.
도 9b는 가용성 VEGF 억제제 (서열식별번호: 25)를 코딩하는 비-제한적 예시적인 pFB-AAV 벡터 (AVMX105: Flt1-D2/KDR-D2)를 예시한다. AAV 벡터는 본원에 기재된 VEGF 억제제, RTK/Tie2의 활성화제, 또는 RTK/Tie2 중 어느 하나를 발현하기 위한 적어도 하나 이상의 발현 카세트를 포함할 수 있다.
도 9c는 가용성 VEGF 억제제 (서열식별번호: 25) 및 hCOMP-Ang1을 코딩하는 비-제한적 예시적인 pFB-AAV 벡터 (AVMX106: Flt1-D2/KDR-D2-COMP-Ang1)를 예시한다.
도 9d는 가용성 VEGF 억제제 (서열식별번호: 25, 상단 박스, 또는 서열식별번호: 26, 하단 박스) 및 hCOMP-Ang1을 코딩하는 비-제한적 예시적인 pFB-AAV 벡터 (Flt1-D2/KDR-D2-hCOMP-Ang1)를 예시한다.
도 9e는 scFv 항체 VEGF 억제제 (서열식별번호: 35)를 코딩하는 비-제한적 예시적인 pFB-AAV 벡터 (AVMX108: VEGF-scFv)를 예시한다. AAV 벡터는 본원에 기재된 VEGF 억제제, RTK/Tie2의 활성화제, 또는 RTK/Tie2 중 어느 하나를 발현하기 위한 적어도 하나 이상의 발현 카세트를 포함할 수 있다.
도 9f는 scFv 항체 VEGF 억제제 (서열식별번호: 35) 및 hCOMP-Ang1을 코딩하는 비-제한적 예시적인 pFB-AAV 벡터 (VEGF-ScFV-hCOMP-Ang1)를 예시한다.
도 10a는 Ang1, COMP-Ang1에 대한 예시적인 정보 및 전체 길이의 Ang1의 단점을 예시한다.
도 10b는 예시적인 이중 발현 AAV 구축물을 예시한다.
도 11은 단일 유전자 구축물과 비교 시 이중 유전자 구축물을 예시한다.
도 12는 VEGF가 누출을 촉진시켰지만 아플리베르셉트와 Ang1은 FITC 덱스트란의 누출을 감소시키는 역할을 했다는 것을 예시한다.
도 13a 및 도 13b는 Ang1 및 VEGF-트랩 구축물 비교의 결과를 막대 그래프 ± SEM으로서 보여주고 일원 ANOVA 및 던넷(Dunnett) 시험를 사용한 다중 비교를 사용한 통계 분석을 보여준다.
도 14는 상이한 그룹으로부터의 대표적인 FA 영상을 예시한다.
도 15는 안배당 아플리베르셉트의 pg 단위로 표현된 VEGF-트랩 농도를 예시한다. 안배는 망막, 공막, 맥락막 및 망막으로 이루어졌다.
본 개시내용의 신규 특색은 첨부된 청구범위에서 구체적으로 제시된다. 본 개시내용의 특색 및 이점에 대한 더 나은 이해는 예시적인 실시양태를 제시하는 하기 상세한 설명을 참조하여 수득될 것이다.
개요
VEGF의 비정상적인 발현은 망막 조직의 발병기전, 예컨대 신생혈관증식 연령-관련 황반 변성 (nAMD), 당뇨병성 망막병증 (DMR), 결절성 맥락막 혈관병증 (PCV) 등을 유발한다. VEGF 외에도, 많은 기타 요인, 예컨대 태반 성장 유래 성장 인자-B (PDGF-B), 간질-유래 인자-1 (SDF-1), 저산소증 유발 인자-1 (HIF-1), 수용체 티로신 키나제 (RTK/Tie2), 혈관 세포 부착 분자 1 (VCAM-1), 뉴로필린-1 (NP-1), 뉴로필린-2 (NP-2), 에프린, 또는 Eph (에리스로포이에틴 생산 간세포 암종)가 신생혈관증식과 연관된 것으로 밝혀졌다.
수용체 티로신 키나제 TEK 티로신 키나제 2 (RTK/Tie2) 및 그와 관련된 리간드인 안지오포이에틴 1 (Ang1) 및 안지오포이에틴 2 (Ang2)는 혈관의 내피 내벽을 어셈블리하고 디스어셈블리하는 데 가장 관련성이 높은 요인이다. 안지오포이에틴은 평활근 세포, 혈관주위세포 및 주변 혈관에 신호전달함으로써 미세혈관 투과성, 혈관 확장 및 혈관 수축을 제어하는 데 관여한다. Ang1은 배아 발생 동안 생리학적 혈관형성 프로모터이며 혈관 평활근 세포에 의해 생산된다. Ang1의 기능은 내피 세포 생존, 혈관 분기 및 혈관주위세포 모집에 필수적이다. Ang1은 498개의 아미노산 잔기와 2개의 이소형으로 구성된 당단백질이며, 이소형 2에는 글리신 269 위치 (G269)에서의 단일 아미노산 돌연변이가 누락되어 있다. Ang1 aa 1-19의 기능적 영역은 분비 신호전달 서열 (S)이고; aa 20-158은 슈퍼 클러스터링 도메인 (SCD)이며; aa159-255는 코일드-코일 올리고머성 도메인 (CCOD)이고, aa256-83; aa 284-498은 RTK/Tie2 결합 도메인인 피브리노겐-유사 도메인 (FLD)이다. Ang1은 출생 후 발달 동안 조직의 혈관과 망막 혈관 네트워크의 형성과 성숙을 촉진시킨다. 실험적으로 유도된 Ang1의 상승은 당뇨병성 망막병증 모델에서 망막 혈관 백혈구 유착, 내피 세포 손상 및 혈액-망막 장벽 파괴의 감소, 레이저 상처형성 후 CNV의 발생의 억제, 및 허혈에 대한 반응으로 혈액-망막 장벽의 VEGF 매개 파괴의 억제를 유발할 수 있다. Ang1 C-말단 FLD는 N-말단에서 래트 연골 올리고머성 매트릭스 단백질 (COMP)의 코일드-코일 도메인, 45개의 아미노산 펩티드 (hCOMP 또는 Ang1-FLD 이량체화 단위라고 함)에 정렬된 명명되지 않은 인간 단백질 서열의 이량체화 단위와 융합될 때 이량체화되어 RTK/Tie2와 결합할 수 있다. Ang2는 혈관형성에 관여하는 주요 경로 중 하나인 안지오포이에틴/Tie (Ig 및 EGF 상동성 도메인을 갖는 티로신 키나제) 신호전달 경로에 속하는 성장 인자이다. Ang2는 강력한 혈관형성 인자인 ANG1이 확인된 직후 cDNA 라이브러리 스크리닝을 통해 확인되었다. Ang2는 생체내 혈관형성에 중요하다. 496개 아미노산 길이의 단백질인 Ang2는 Ang1과 약 60%의 아미노산 상동성을 공유하며 성숙한 ANG1에서 발견되는 9개의 시스테인 중 하나가 결여된다. 이는 분비 신호전달 펩티드, NH2 말단 코일드-코일 도메인 및 COOH 말단 피브리노겐-유사 도메인을 가지고 있다. Ang1과 달리, Ang2는 자가분비 방식으로 작용하며, 그의 발현은 고도로 조절된다. Ang1과 유사하게, Ang2는 동일한 결합 친화도로 Tie2 수용체와 결합하여, Ang1에 반대하는 길항 역할을 유도한다. Ang2 발현은 염증 매개인자, 예컨대 트롬빈 축적, 저산소증, 또는 암에 의해 촉발된다. RTK/Tie2는 Ang1 또는 그의 단편을 발현하거나 Ang 2의 억제제 (예를 들어, Ang2를 표적으로 하는 억제성 RNA 또는 항체)의 발현에 의해 활성화될 수 있으며, 이는 결국 신생혈관증식 신호를 감소시킨다.
일부 경우에, 부가의 RTK/Tie2가 세포에서 발현될 수 있다. RTK/Tie2를 발현함으로써, Ang1 (예를 들어, 내인성으로 발현된 Ang1)이 RTK/Tie2와 접촉하고 이를 활성화시키려는 빈도가 증가된다. 이러한 시나리오에서는, RTK/Tie2를 발현하는 것이 Ang1을 발현하는 것 또는 Ang2의 발현을 감소시키는 것과 유사한 효과를 확고히 나타낸다.
신생혈관증식은 안구 허혈 증후군, 증식성 망막병증, 신생혈관 녹내장 (NG), 포도막염, 또는 신생혈관 포도막염을 비롯한 많은 질환의 조직 발생 및 발병기전에 중요한 역할을 한다. 유리체내 (IVT) 항-VEGF 약물의 임상 효능은 당뇨병성 황반 부종 (DMR), 신생혈관 형태의 연령-관련 황반 변성 (nAMD)을 비롯한 여러 혈관형성 구동 안구 질환의 벤치마크 치료법으로서 널리 입증되었다. 페갑타닙, 라니비주맙 [루센티스(Lucentis)], 아플리베르셉트 [아일레아(Eylea)]는 눈에 사용하도록 승인된 반면, 베바시주맙 [아바스틴(Avastin)]은 안과 의사들이 치료 비용을 제한하기 위해 "오프-라벨" 환자를 치료하기 위해 널리 사용되고 있다.
이들 약물은 나노몰 내지 피코몰 범위에서 활성을 가지지만 유효 기간은 짧다. 환자에게 4-6주마다 1회 투여해야 한다. 이들 중 대부분은 신생혈관증식과 연관되어 있으며, 환자는 이러한 항-VEGF 요법 중 하나를 매달 투여해야 한다. 이러한 안과 질환의 항-VEGF 치료에 있어 과제는 생체이용률의 짧은 지속성과 항-VEGF 약물의 빈번한 IVT 투여로 인해 환자에게 큰 불편과 재정적 부담을 안겨준다는 점이다. 일단 IVT 약물이 투여되면, 유리체액 (VH) 중의 항-VEGF 길항제가 변동하여 병태생리학의 불안정성과 시력 변화를 초래한다. 따라서, VEGF 억제의 치료 효과를 증대시킬 수 있는 치료제에 대한 필요성이 여전히 존재한다. 또한 신생혈관증식 또는 신생혈관증식 신호를 감소시킬 수 있는 치료제에 대한 필요성이 여전히 존재한다.
이러한 필요성을 해결하기 위해, 본원에는 단일 전달 비히클로서 기능하는 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드가 기재되어 있으며, 여기서 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드는 VEGF 억제제 및 RTK/Tie2의 활성화제를 코딩하는 하나 이상의 발현 카세트를 포함한다. 도 2는 VEGF 억제제 (예를 들어, VEGF 항체) 및 하기 중 하나를 포함하는 RTK/Tie2의 활성화제를 발현하기 위한 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 벡터의 비-제한적 예를 예시한다: Ang1 단편 (Ang1-FLD; RTK/Tie2의 작용제); 또는 내인성 Ang2 (RTK/Tie2 신호전달 변환 경로의 길항제) 발현을 감소시키기 위한 Ang2 shRNA.
일부 실시양태에서, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터, 예컨대 AAV 벡터의 일부일 수 있다. 하나 이상의 발현 카세트를 갖는 이러한 AAV 벡터를 활용함으로써, VEGF 억제제와 Ang1을 포함하는 RTK/Tie2의 활성화제의 상이한 조합, 예컨대 IgG, Fab, F(ab)'2, 또는 scFv를 포함하는 항-VEGF 항체 또는 그의 단편과 Ang1 전체 길이의 단백질; 가용성 Flt1 VEGF 결합 도메인을 포함하는 비-항체 VEGF 억제제와 Ang1 전체 길이 또는 단편 단백질 (예를 들어, hCOMP와 융합된 Ang1-FLD); 또는 가용성 Flt1 및 Flk1 VEGF 결합 도메인을 포함하는 비-항체 VEGF 억제제와 Ang1 전체 길이 또는 단편 단백질 (이에 제한되지는 않음)이 구축될 수 있다. 이러한 접근 방식을 사용함으로써, VEGF 신호전달 변환 경로가 VEGF 억제제에 의해 감소되는 반면, Ang1 발현 수준은 증가하여 RTK/Tie2의 활성화가 초래된다. RTK/Tie2의 활성화는 혈관주위세포의 증식을 유도하여, 혈관을 강화시키고 혈관 누출 및 혈관 누출과 연관된 염증을 감소시킨다.
대안적으로, Ang1 발현을 증가시키는 대신, Ang2 발현을 길항함으로써 RTK/Tie2를 활성화시킬 수 있다. Ang2의 길항제는 Ang2를 표적으로 하는 항체 또는 억제성 RNA를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 AAV 벡터를 사용하여, VEGF 억제제 및 Ang2를 표적으로 하는 항체 또는 억제성 RNA (예를 들어, shRNA)는 RTK/Tie2를 활성화시키는 동시에 VEGF를 억제하기 위해 세포 내로 전달될 수 있다.
또한, 본원에는 본원에 기재된 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 사용하여 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 기재되어 있다. 이러한 질환 또는 병태는 대상체에서 각막 신생혈관증식, 미숙아 망막병증, 당뇨병성 망막병증, 연령-관련 황반 변성 또는 맥락막 신생혈관증식과 같은 병리를 초래하는 증가된 신생혈관증식과 연관되어 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드는 질환 또는 병태를 치료하기 위한 상승작용적인 치료 효과를 가져올 수 있다. 예를 들어, 벡터 (예를 들어, 단일 전달 비히클)로 치료받은 대상체는 그 대상체가 VEGF 억제제 치료 단독; RTK/Tie2를 활성화시키기 위한 치료 단독; 또는 상이한 양식 (예를 들어, 상이한 시간에, 상이한 경로에 의해, 또는 상이한 전달 수단에 의해)을 통한 VEGF 억제제 치료 및 RTK/Tie2 활성화 치료를 받은 경우와 비교하여 혈관형성, 신생혈관증식, 혈관 누출, 염증, 또는 그의 조합의 감소를 나타낼 수 있다.
비-자연 발생 폴리뉴클레오티드
본원에는 VEGF 억제제; 및 RTK/Tie2 또는 RTK/Tie2의 활성화제를 발현하기 위한 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드가 기재되어 있다. VEGF 억제제 및 RTK/Tie2 또는 RTK/Tie2의 활성화제는 세포에서의 신생혈관증식 신호전달을 조정할 수 있다. 일부 실시양태에서, VEGF 억제제 및 RTK/Tie2 또는 RTK/Tie2의 활성화제는 세포에서의 신생혈관증식 신호전달을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 신생혈관증식 신호전달은 혈관생성, 혈관형성 또는 동맥형성과 연관된 신호전달 변환 경로를 포함한다. 일부 실시양태에서, 신생혈관증식 신호전달은 VEGF 신호전달 변환 경로 또는 안지오포이에틴 신호전달 변환 경로를 포함한다. 도 1은 VEGF 신호전달 변환 경로 및 안지오포이에틴 신호전달 변환 경로에 관여하는 리간드 및 수용체의 비-제한적 예를 예시한다. 예를 들어, VEGF 신호전달 변환 경로는 다중 VEGF 수용체와 결합하는 다중 VEGF 또는 VEGF 이소형에 의해 조정되는 반면, 안지오포이에틴 신호전달 변환 경로는 주로 RTK/Tie2와 결합하는 안지오포이에틴 (Ang1, Ang2, Ang3 및 Ang4)에 의해 조정된다. 도 1은 또한 신생혈관증식 신호전달을 감소시키기 위해 본원에 기재된 VEGF 억제제 및 RTK/Tie2 또는 RTK/Tie2의 활성화제에 의해 조정될 수 있는 잠재적인 VEGF 신호전달 변환 경로 또는 안지오포이에틴 신호전달 변환 경로 표적을 예시한다.
일부 실시양태에서, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드는 VEGF 억제제, RTK/Tie2 또는 RTK/Tie2의 활성화제를 포함하는 별도의 폴리펩티드로 절단가능한 하나의 인접 폴리펩티드로서 VEGF 억제제 및 RTK/Tie2 또는 RTK/Tie2의 활성화제를 발현하기 위한 하나의 발현 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인접 폴리펩티드는 프로테아제 펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로테아제 펩티드 서열은 세포에서 내인성으로 발현되는 프로테아제에 의해 절단가능하다. 프로테아제의 비-제한적 예는 세린 엔도프로테아제, 아스파르트산 엔도프로테아제, 시스테인 티올 엔도프로테아제, 메탈로엔도프로테아제, 또는 글루탐산 및 트레오닌 엔도프로테아제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로테아제 펩티드 서열은 세린 엔도프로테아제에 의해 절단가능하다. 일부 실시양태에서, 프로테아제 펩티드 서열은 푸린에 의해 절단가능하다. 일부 실시양태에서, 인접 폴리펩티드는 프로테아제 절단가능 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로테아제 절단가능 서열은 본원에 기재된 프로테아제 중 어느 하나에 의해 절단될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로테아제 절단가능 서열은 푸린에 의해 절단될 수 있다.
일부 실시양태에서, 인접 폴리펩티드는 자기-절단 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 자기-절단 폴리펩티드 서열은 2A 자기-절단 펩티드 서열을 포함한다. 2A 자기-절단 펩티드 서열의 비-제한적 예는 T2A, P2A, E2A, F2A, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 자기-절단 폴리펩티드 서열은 F2A 펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인접 폴리펩티드는 프로테아제 절단가능 서열 및 자기-절단 폴리펩티드 서열을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 인접 폴리펩티드는 푸린-F2A 융합 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드는 VEGF 억제제 및 RTK/Tie2 또는 RTK/Tie2의 활성화제에 대한 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 그 초과의 발현 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드는 2개의 발현 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, VEGF 억제제 및 RTK/Tie2 또는 RTK/Tie2의 활성화제는 각각 발현 카세트로부터 발현된다. 다른 경우에, VEGF 억제제는 2개의 발현 카세트 중 하나에 의해 융합 단백질로서 부분적으로 발현될 수 있는 반면, 다른 발현 카세트는 VEGF 억제제의 나머지 부분을 발현한다. 예를 들어, 도 7b는 Ang1 단편과 융합된 VEGF 항체를 예시한다. 이러한 예에서, VEGF 항체의 중쇄는 GGGGSG 링커를 통해 가용성 폴리펩티드 (hCOMP, 서열식별번호: 2) 및 Ang1 단편 (서열식별번호: 5)과 융합되는 반면 (상단 박스, 서열식별번호: 41), 항-VEGF 항체의 경쇄는 상이한 발현 카세트에 의해 별도로 전사된다 (하단 박스, 서열식별번호: 43). 또 다른 예는 도 7c이며, 이는 VEGF 항체의 중쇄가 GGGGSG 링커를 통해 Ang1 단편 (서열식별번호: 5)과 융합되어 있는 반면 (상단 박스, 서열식별번호: 41), 항-VEGF 항체의 경쇄는 상이한 발현 카세트에 의해 별도로 전사되는 (하단 박스, 서열식별번호: 43) 또 다른 예시적인 AAV 벡터를 예시한다.
일부 실시양태에서, 발현 카세트는 하나 이상의 프로모터 또는 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 프로모터의 발현 제어 하에 있다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 프로모터의 발현 제어 하에 있다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 적어도 하나의 IRES를 통해 발현 제어를 추가로 발휘할 수 있다. 이러한 배열에서, VEGF 억제제 및 RTK/Tie2 또는 RTK/Tie2 활성화제의 발현은 단지 하나의 발현 카세트를 사용하여 달성될 수 있다.
일부 실시양태에서, VEGF 억제제는 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, VEGF 항체는 VEGF와 결합하여 VEGF 신호전달 변환 경로를 포함하는 신생혈관증식 신호전달을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, VEGF 억제제는 항체가 아니다. 예를 들어, 본원에 기재된 VEGF 억제제는 VEGF 신호전달 변환 경로를 억제 또는 감소시키기 위해 VEGF와 결합하기 위한 VEGF 수용체, VEGF 수용체의 조합, 또는 그의 단편을 포함할 수 있다. VEGF 수용체는 VEGF 수용체 1 (FLT1), VEGF 수용체 2 (KDR/FLK1), VEGF 수용체 3 (FLT4), 그의 단편, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, VEGF 수용체는 가용성 VEGF 수용체일 수 있다. 예를 들어, 가용성 VEGF 수용체는 가용성 VEGFR1, 가용성 VEGFR2, 가용성 VEGFR3, 그의 가용성 단편, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-항체 VEGF 억제제는 FLT1, KDR/FLK1, FLT4, 그의 단편, 또는 그의 조합 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-항체 VEGF 억제제는 가용성 FLT1, 가용성 KDR/FLK1, 가용성 FLT4, 그의 단편, 또는 그의 조합 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-항체 억제제 VEGF는 VEGF-트랩을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-항체 VEGF 억제제는 서열식별번호: 24, 서열식별번호: 25, 서열식별번호: 26, 또는 서열식별번호: 31 (표 11)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 그 초과로 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-항체 VEGF 억제제는 서열식별번호: 24인 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-항체 VEGF 억제제는 서열식별번호: 25인 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-항체 VEGF 억제제는 서열식별번호: 26인 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-항체 VEGF 억제제는 서열식별번호: 31인 폴리펩티드 서열을 포함한다.
표 11. 비-항체 VEGF 억제제의 비-제한적 예
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
일부 실시양태에서, RTK/Tie2의 활성화제는 RTK/Tie2를 활성화시키기 위한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, RTK/Tie2의 활성화제는 억제제, 예컨대 항체 또는 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, RTK/Tie2의 활성화제는 RTK/Tie2를 활성화시키기 위한 비-항체 억제제를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, RTK/Tie2의 활성화제는 전체 길이의 단백질에 상응하는 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, RTK/Tie2의 활성화제는 전체 길이의 안지오포이에틴일 수 있다. 일부 경우에, 전체 길이의 단백질 대신, 단백질의 단편이 RTK/Tie2의 활성화제로서 활용될 수 있다. 예를 들어, 전체 길이의 안지오포이에틴 대신에, 안지오포이에틴의 단편을 RTK/Tie2 활성화에 활용할 수 있다.
일부 실시양태에서, RTK/Tie2의 활성화제는 전체 길이의 단백질에 상응하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, RTK/Tie2의 활성화제는 전체 길이의 Ang1 또는 Ang2 핵산 서열 (각각 서열식별번호: 4 및 서열식별번호: 13, 표 12)로부터 코딩된 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, RTK/Tie2의 활성화제는 전체 길이의 Ang1 또는 Ang2에 상응하는 폴리펩티드 (각각 서열식별번호: 3 및 서열식별번호: 12, 표 12)를 포함한다. 일부 실시양태에서, RTK/Tie2의 활성화제는 전체 길이의 Ang1을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, RTK/Tie2의 활성화제는 서열식별번호: 3과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
표 12. Ang1 및 Ang2의 폴리펩티드 및 핵산 서열
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
일부 실시양태에서, RTK/Tie2의 활성화제는 전체 길이의 단백질의 단편에 상응하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, RTK/Tie2의 활성화제는 전체 길이의 안지오포이에틴의 단편에 상응하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, RTK/Tie2의 활성화제는 적어도 10개의 아미노산, 적어도 50개의 아미노산, 적어도 100개의 아미노산, 적어도 150개의 아미노산, 적어도 200개의 아미노산, 적어도 250개의 아미노산, 적어도 300개의 아미노산, 적어도 350개의 아미노산, 또는 그 초과의 아미노산 길이를 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 안지오포이에틴의 단편에 상응하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안지오포이에틴의 단편을 포함하는 RTK/Tie2의 활성화제는 서열식별번호: 4 또는 서열식별번호: 13과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 그 초과로 동일한 핵산 서열로부터 코딩된 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안지오포이에틴의 단편을 포함하는 RTK/Tie2의 활성화제는 Ang1 (서열식별번호: 4)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 그 초과로 동일한 핵산 서열로부터 코딩된 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 안지오포이에틴의 단편을 포함하는 RTK/Tie2의 활성화제는 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 12와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 그 초과로 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, RTK/Tie2의 활성화제는 Ang1의 단편을 포함한다. Ang1의 단편은 Ang1 아미노산 1-19, 분비 신호전달 서열 (S); Ang1 aa 20-158, 슈퍼 클러스터링 도메인 (SCD); Ang1 aa 159-255, 코일드-코일 올리고머성 도메인 (CCOD), aa 256-83: 및 Ang1 aa 284-498, RTK/Tie2와 결합하는 기능적 도메인인 피브리노겐-유사 도메인 (FLD)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, RTK/Tie2의 활성화제는 Ang1 (서열식별번호: 5)의 FLD 단편 (기능적 단편)을 포함한다. 일부 실시양태에서, RTK/Tie2의 활성화제는 서열식별번호: 5와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 그 초과로 동일한 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, RTK/Tie2의 활성화제는 VEGF 억제제 및 RTK/Tie2 또는 RTK/Tie2의 활성화제의 용해도를 증가시키기 위한 가용성 펩티드와 융합된 Ang1의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가용성 펩티드는 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 그 초과로 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가용성 펩티드는 서열식별번호: 1과 최대 99%, 최대 98%, 최대 97%, 최대 96%, 최대 95%, 최대 94%, 또는 최대 93% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가용성 펩티드는 서열식별번호: 2와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 그 초과로 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가용성 펩티드는 서열식별번호: 2의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 펩티드 태그, 예컨대 FLAG 태그 (서열식별번호: 10; 서열식별번호: 11의 핵산 서열로부터 코딩됨)가 FLD 융합물에 부가될 수 있다. FLAG 태그의 부가는 약동학 목적 및 측정에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, Ang1의 단편을 포함하는 RTK/Tie2의 활성화제는 서열식별번호: 6과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 그 초과로 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하는 가용성 펩티드와 융합된다. 일부 실시양태에서, Ang1의 단편을 포함하는 RTK/Tie2의 활성화제는 서열식별번호: 6의 폴리펩티드 서열을 포함하는 가용성 펩티드와 융합된다. 일부 실시양태에서, Ang1의 단편을 포함하는 RTK/Tie2의 활성화제는 서열식별번호: 7과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 그 초과로 동일한 핵산 서열로부터 코딩된 폴리펩티드를 포함하는 가용성 펩티드와 융합된다. 일부 실시양태에서, Ang1의 단편을 포함하는 RTK/Tie2의 활성화제는 서열식별번호: 7의 핵산 서열로부터 코딩된 폴리펩티드를 포함하는 가용성 펩티드와 융합된다. 일부 실시양태에서, Ang1의 단편을 포함하는 RTK/Tie2의 활성화제는 서열식별번호: 8과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 그 초과로 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하는 가용성 펩티드와 융합된다. 일부 실시양태에서, Ang1의 단편을 포함하는 RTK/Tie2의 활성화제는 서열식별번호: 8의 폴리펩티드 서열을 포함하는 가용성 펩티드와 융합된다. 일부 실시양태에서, Ang1의 단편을 포함하는 RTK/Tie2의 활성화제는 서열식별번호: 9와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 그 초과로 동일한 핵산 서열로부터 코딩된 폴리펩티드를 포함하는 가용성 펩티드와 융합된다. 일부 실시양태에서, Ang1의 단편을 포함하는 RTK/Tie2의 활성화제는 서열식별번호: 9의 핵산 서열로부터 코딩된 폴리펩티드를 포함하는 가용성 펩티드와 융합된다. 표 13은 FLD 및 가용성 폴리펩티드 융합물을 포함하는 RTK/Tie2의 활성화제의 변이물의 핵산 및 폴리펩티드 서열을 예시한다.
표 13. FLD 및 가용성 펩티드를 포함하는 RTK/Tie2의 예시적인 활성화제의 핵산 및 폴리펩티드 서열
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Figure pct00011
항체
일부 실시양태에서, VEGF 억제제는 VEGF 항체이다. 일부 실시양태에서, VEGF 항체는 1가 Fab', 2가 Fab2, F(ab)'3 단편, 단일-쇄 가변 단편 (scFv), 비스-scFv, (scFv)2, 디아바디, 미니바디, 나노바디, 트리아바디, 테트라바디, 디술피드 안정화된 Fv 단백질 ("dsFv"), 단일-도메인 항체 (sdAb), Ig NAR, 낙타류 항체, 또는 그의 조합, 그의 결합 단편, 또는 그의 화학적으로 변형된 유도체를 포함한다.
일부 실시양태에서, VEGF 항체는 VEGF와 결합하여 VEGF 신호전달 변환 경로를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, VEGF 억제제는 본원에 기재된 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드에 의해 RTK/Tie2의 활성화제와 조합하여 전달되는 경우, VEGF 억제제와 RTK/Tie2의 활성화제를 별도로 전달 (예를 들어, VEGF 억제제와 RTK/Tie2의 활성화제는 2개의 별도의 벡터에 의해 세포 내로 전달됨)하고/거나 VEGF 억제제 또는 RTK/Tie2의 활성화제를 단독으로 전달함으로써 유도된 VEGF 신호전달 변환 경로의 감소와 비교하여 세포에서의 VEGF 신호전달 변환 경로를 상승작용적으로 감소시킨다. 일부 실시양태에서, VEGF 억제제는 본원에 기재된 벡터에 의해 RTK/Tie2의 활성화제와 조합하여 전달되는 경우, VEGF 억제제와 RTK/Tie2의 활성화제를 별도로 전달 (예를 들어, VEGF 억제제와 RTK/Tie2의 활성화제는 2개의 별도의 벡터에 의해 세포 내로 전달됨)하고/거나 VEGF 억제제 또는 RTK/Tie2의 활성화제를 단독으로 전달함으로써 유도된 RTK/Tie2 신호전달 변환 경로의 증가와 비교하여 세포에서의 RTK/Tie2 신호전달 변환 경로를 상승작용적으로 증가시킨다.
일부 실시양태에서, VEGF 항체는 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, 또는 그의 조합과 결합한다. 일부 실시양태에서, VEGF 항체는 VEGF121, VEGF145, VEGF148, VEGF162, VEGF165, VEGF165b, VEGF183, VEGF189, 또는 VEGF206을 포함한, VEGF-A의 하나 이상의 이소형과 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgG, Fab, Fa(ab)'2, 단일-쇄 단편 가변 (scFv), 그의 단편, 또는 그의 조합을 포함한다. VEGF 항체의 비-제한적 예는 라니비주맙 또는 베바시주맙을 포함한다. 일부 실시양태에서, VEGF 항체는 서열식별번호: 21, 서열식별번호: 22, 서열식별번호: 32, 서열식별번호: 33, 서열식별번호: 34, 서열식별번호: 35, 또는 그의 조합, 또는 그의 단편 (표 13)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 그 초과로 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, VEGF 항체는 scFv 항체이다. 일부 실시양태에서, VEGF scFv 항체는 서열식별번호: 23, 또는 그의 단편 (표 14)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 그 초과로 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
표 14. VEGF 항체의 폴리펩티드 서열의 비-제한적 예
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Figure pct00013
일부 실시양태에서, VEGF 항체는 적어도 하나의 중쇄 및 적어도 하나의 경쇄를 포함한다. 이러한 시나리오에서는, 적어도 하나의 중쇄 및 적어도 하나의 경쇄가 적어도 2개의 발현 카세트를 통해 별도로 발현될 수 있다. 부가적으로, 중쇄 또는 경쇄는 본원에 기재된 RTK/Tie2의 활성화제 중 임의의 것과 추가로 융합될 수 있다. 예를 들어, 도 7b는 Ang1 단편과 융합된 VEGF 항체의 비-제한적 예를 예시한다. VEGF 항체의 중쇄는 GGGGSG 링커를 통해 가용성 폴리펩티드 (hCOMP, 서열식별번호: 2) 및 Ang1 단편 (서열식별번호: 5)과 융합되어 있는 반면 (상단 박스, 서열식별번호: 41), 항-VEGF 항체의 경쇄는 상이한 발현 카세트에 의해 별도로 전사된다 (하단 박스, 서열식별번호: 43). 또 다른 예는 도 7c이며, 이는 VEGF 항체의 중쇄가 GGGGSG 링커를 통해 Ang1 단편 (서열식별번호: 5)과 융합되어 있는 반면 (상단 박스, 서열식별번호: 41), 항-VEGF 항체의 경쇄는 상이한 발현 카세트에 의해 별도로 전사되는 (하단 박스, 서열식별번호: 43) 또 다른 예시적인 AAV 벡터를 예시한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 항체는 RTK/Tie2의 활성화제이다. 일부 실시양태에서, 항체는 Ang2 항체이다. 일부 실시양태에서, Ang2 항체의 결합은 본원에 기재된 VEGF 신호전달 변환 경로를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, Ang2에 대한 Ang2 항체의 결합은 VEGF 억제제의 존재 하에 있는 경우, VEGF 억제제에 의해서만 또는 Ang2 항체에 의해서만 유도된 VEGF 신호전달 변환 경로의 감소와 비교하여 VEGF 신호전달 변환 경로를 상승작용적으로 감소시킨다.
일부 실시양태에서, Ang2 항체는 서열식별번호: 13, 또는 그의 단편 (표 15)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 그 초과로 동일한 핵산 서열로부터 코딩된 Ang2 폴리펩티드 또는 그의 단편과 결합한다. 일부 실시양태에서, Ang2 항체는 서열식별번호: 12, 또는 그의 단편 (표 15)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 그 초과로 동일한 펩티드 서열을 포함하는 Ang2 폴리펩티드 또는 그의 단편과 결합한다. 일부 실시양태에서, Ang2 항체는 서열식별번호: 25, 서열식별번호: 26, 서열식별번호: 27, 또는 그의 단편, 또는 그의 조합과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 그 초과로 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Ang2 항체는 서열식별번호: 25 및 서열식별번호: 26인 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Ang2 항체는 서열식별번호: 27인 폴리펩티드 서열을 포함한다.
표 15. Ang2 및 Ang2 항체 핵산 및 폴리펩티드 서열
Figure pct00014
Figure pct00015
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 그의 변이체 또는 유도체를 포함한다. 예를 들어, 비-인간 동물은 항체 변이체 또는 유도체를 생산하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 단일-도메인 항체 (sdAb), 예를 들어 중쇄 단독 항체 (HCAb) VHH, 또는 나노바디일 수 있다. 항원-결합 단편의 비-제한적 예는 Fab, Fab', F(ab')2, Fab IL-6R의 이량체 및 삼량체, Fv, scFv, 미니바디, 디아-, 트리아- 및 테트라바디, 및 선형 항체를 포함한다. Fab 및 Fab'는 디술피드 결합을 통해 경쇄의 VL 및 CL 도메인에 연결된 중쇄의 VH 및 CH1 도메인을 포함하는 항원-결합 단편이다. F(ab')2는 디술피드 결합에 의해 연결된 2개의 Fab 또는 Fab'를 포함한다. Fv는 비공유 상호작용에 의해 함께 결합된 VH 및 VL 도메인을 포함한다. scFv (단일-쇄 가변 단편)는 펩티드 링커에 의해 연결된 VH 및 VL 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. VH 및 VL 도메인의 배향 및 링커 길이의 조작을 사용하여 단량체, 이량체 (디아바디), 삼량체 (트리아바디) 또는 사량체 (테트라바디)일 수 있는 상이한 형태의 분자를 생성할 수 있다. 미니바디는 2가 이량체로 어셈블리되는 scFv-CH3 융합 단백질이다.
일부 실시양태에서, 항체는 그의 결합 단편이다. 일부 경우에, 항체는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편, 키메라 항체 또는 그의 결합 단편, 모노클로날 항체 또는 그의 결합 단편, 다중특이적 항체 또는 그의 결합 단편, 이중특이적 항체 또는 그의 결합 단편, 또는 그의 단일-도메인 항체 (예를 들어, 나노바디®)이다. 일부 실시양태에서, 항체는 다중특이적 항체일 수 있다. 일부 경우에, 다중특이적 항체는 2개 이상의 표적 결합 모이어티를 포함하며, 여기서 2개 이상의 표적 결합 모이어티 각각은 항원과 특이적으로 결합하고, 2개 이상의 항원은 상이하다. 일부 경우에, 다중특이적 항체는 3개 이상의 상이한 항원, 4개 이상의 상이한 항원, 또는 5개 이상의 상이한 항원과 특이적으로 결합하는 표적 결합 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 이중특이적 항체일 수 있다. 일부 경우에, 이중특이적 항체 또는 결합 단편은 노브-인투-홀 (KiH), 비대칭 재조작 기술-이뮤노글로불린 (ART-Ig), 트리오맙 쿼드로마, 이중특이적 모노클로날 항체 (BiMAb, BsmAb, BsAb, bsMab, BS-Mab 또는 Bi-MAb), FcΔAdp, XmAb, Azymetric, T-세포 수용체에 기반한 항체에 의한 이중특이적 참여 (BEAT), 이중특이적 T-세포 참여인자 (BiTE), Biclonics, Fab-scFv-Fc, 투인원/이중 작용 Fab (DAF), FinomAb, scFv-Fc-(Fab)-융합물, 독-앤-락 (DNL), Adaptir (이전명 SCORPION), 탠덤 디아바디 (TandAb), 이중-친화도-재표적화 (DART), 또는 나노바디를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 IgG 프레임워크, IgA 프레임워크, IgE 프레임워크, 또는 IgM 프레임워크를 포함한다. 일부 경우에, 항체는 IgG 프레임워크 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)를 포함한다. 일부 경우에, 항체는 IgG1 프레임워크를 포함한다. 일부 경우에, 항체는 IgG2 (예를 들어, IgG2a 또는 IgG2b) 프레임워크를 포함한다. 일부 경우에, 항체는 IgG2a 프레임워크를 포함한다. 일부 경우에, 항체는 IgG2b 프레임워크를 포함한다. 일부 경우에, 항체는 IgG3 프레임워크를 포함한다. 일부 경우에, 항체는 IgG4 프레임워크를 포함한다.
일부 경우에, 본원에 기재된 항체는 프레임워크 영역, 예를 들어 CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 힌지 영역, 또는 그의 조합에서 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 경우에, 하나 이상의 돌연변이는 항체를 안정화시키고/시키거나 반감기를 증가시키기 위한 것이다. 일부 경우에, 하나 이상의 돌연변이는 Fc 수용체 상호작용을 조정하거나, Fc 이펙터 기능, 예컨대 FcγR, 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC), 또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 감소 또는 제거하기 위한 것이다. 부가의 경우에, 하나 이상의 돌연변이는 글리코실화를 조정하기 위한 것이다.
억제성 RNA
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 RTK/Tie2의 활성화제는 RNA 또는 DNA를 포함한다. 일부 경우에, RTK/Tie2의 활성화제는 단백질의 발현을 감소시킴으로써 신호전달 변환 경로를 조정하기 위한 억제성 RNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 억제성 RNA는 VEGF의 발현을 표적으로 하고 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 억제성 RNA는 안지오포이에틴의 발현을 표적으로 하고 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 억제성 RNA는 Ang2의 발현을 표적으로 하고 감소시켜, RTK/Tie2 신호전달 변환 경로의 증가를 유도한다. 억제성 RNA는 Ang2의 핵산 서열을 표적으로 하고 이와 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제성 RNA는 서열식별번호: 13과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 그 초과로 동일한 핵산 서열을 포함하는 Ang2의 전사체를 표적으로 하고 이와 결합한다. 일부 경우에, RNA는 짧은 간섭 RNA (siRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 마이크로RNA (miRNA), 이중 가닥 RNA (dsRNA), 전달 RNA (tRNA), 리보솜 RNA (rRNA), 또는 이종 핵 RNA (hnRNA)를 포함한다. 일부 경우에, RNA는 shRNA를 포함한다. 일부 경우에, RNA는 miRNA를 포함한다. 일부 경우에, RNA는 dsRNA를 포함한다. 일부 경우에, RNA는 tRNA를 포함한다. 일부 경우에, RNA는 rRNA를 포함한다. 일부 경우에, RNA는 hnRNA를 포함한다. 일부 경우에, RNA는 siRNA를 포함한다. 일부 경우에, 신호전달 변환 조절인자는 shRNA를 포함한다.
일부 실시양태에서, 억제성 RNA를 포함하는 RTK/Tie2의 활성화제는 약 10개 내지 약 50개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 경우에, 신호전달 변환 조절인자는 약 10개 내지 약 30개, 약 15개 내지 약 30개, 약 18개 내지 약 25개, 약 18개 내지 약 24개, 약 19개 내지 약 23개, 또는 약 20개 내지 약 22개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 신호전달 변환 조절인자는 본원에 기재된 표적 서열의 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개, 또는 그 초과의 인접 염기와 혼성화한다.
일부 실시양태에서, RTK/Tie2의 활성화제는 Ang2의 내인성 발현을 표적화하고 감소시키기 위한 shRNA를 포함한다. 도 3b, 도 5, 및 표 10은 내인성 Ang2에 대한 Ang2 shRNA의 억제 효과를 예시한다. 일부 실시양태에서, Ang2 shRNA는 서열식별번호: 81-86 (표 16) 중 어느 하나와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Ang2 shRNA는 서열식별번호: 81-86 중 어느 하나인 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Ang2 shRNA는 서열식별번호: 81인 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Ang2 shRNA는 서열식별번호: 82인 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Ang2 shRNA는 서열식별번호: 83인 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Ang2 shRNA는 서열식별번호: 84인 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Ang2 shRNA는 서열식별번호: 85인 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Ang2 shRNA는 서열식별번호: 86인 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, Ang2 shRNA는 서열식별번호: 87인 핵산 서열을 포함하지 않는다.
표 16. 예시적인 Ang2 shRNA
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방법
벡터 구축 및 전달
본원에는 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 생성하는 방법이 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드는 AAV 벡터의 일부이다. 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 프로모터 또는 IRES를 포함한다. 도 6-9 및 표 17은 하나 이상의 발현 카세트의 배열을 포함하는 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 보여주는 예시적인 AAV 벡터를 예시한다.
표 17. VEGF 억제제 및 Ang1 융합물의 폴리펩티드 서열을 발현하기 위한 예시적인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드
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비-자연 발생 폴리뉴클레오티드는 관련 기술분야의 임의의 방법에 의해 숙주 세포, 예를 들어 포유동물, 박테리아, 효모 또는 곤충 세포 내로 쉽게 도입될 수 있다. 예를 들어, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드는 물리적, 화학적 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드는 물리적 방법, 예컨대 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 충격, 미세주사, 유전자총, 전기천공 등을 통해 세포 내로 전달될 수 있다.
비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하기 위한 물리적 방법은 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 충격, 미세주사, 유전자총, 전기천공 등을 포함할 수 있다. 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 한 가지 방법은 인산칼슘 형질감염이다.
비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하기 위한 화학적 수단은 콜로이드 분산 시스템, 예컨대 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구체, 비드, 및 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합 미셀, 구형 핵산 (SNA), 리포솜 또는 지질 나노입자를 비롯한 지질 기반 시스템을 포함할 수 있다. 시험관내 및 생체내 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시적인 콜로이드 시스템은 리포솜 (예를 들어, 인공 막 소포)이다. 핵산의 최첨단 표적화 전달의 다른 방법, 예컨대 표적화된 나노입자를 이용한 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드 또는 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 벡터의 전달이 이용가능하다.
비-바이러스 전달 시스템이 활용되는 경우, 예시적인 전달 비히클은 리포솜이다. 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드 또는 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 벡터를 세포 내로 (시험관내, 생체외 또는 생체내) 도입하기 위해 지질 제형의 사용이 고려된다. 또 다른 측면에서, 벡터는 지질과 연합될 수 있다. 지질과 연합된 벡터는 리포솜의 수성 내부에 캡슐화되거나, 리포솜의 지질 이중층 내에 산재되거나, 리포솜과 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드 둘 다와 연합된 연결 분자를 통해 리포솜에 부착되거나, 리포솜에 포획되거나, 리포솜과 복합체 형성되거나, 지질을 함유하는 용액에 분산되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 조합되거나, 지질 중 현탁액으로서 함유되거나, 미셀을 함유하거나 이와 복합체 형성되거나, 그 외에는 지질과 연합될 수 있다. 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 벡터 연합 조성물은 용액 중의 임의의 특정한 구조에 제한되지 않는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 이들은 이중층 구조로, 미셀로서, 또는 "접힌" 구조를 갖는 것으로 존재한다. 대안적으로, 이들은 단순히 용액에 산재되어, 크기 또는 모양이 균일하지 않은 집합체를 형성할 수도 있다. 지질은 일부 실시양태에서 자연 발생 또는 합성 지질인 지방 물질이다. 예를 들어, 지질은 세포질에서 자연 발생하는 지방 비말뿐만 아니라 장쇄 지방족 탄화수소 및 그의 유도체를 함유하는 화합물 클래스, 예컨대 지방산, 알콜, 아민, 아미노 알콜 및 알데히드를 포함한다.
사용하기에 적합한 지질은 상업적 공급원으로부터 수득된다. 클로로포름 또는 클로로포름/메탄올에 함유된 지질 스톡 용액은 종종 약 -20℃에서 저장된다. 클로로포름은 메탄올보다 쉽게 증발하므로 유일한 용매로서 사용된다. "리포솜"은 둘러싸인 지질 이중층 또는 집합체의 생성에 의해 형성된 다양한 단일 및 다중층 지질 비히클을 포괄하는 일반적인 용어이다. 리포솜은 종종 인지질 이중층 막과 내부 수성 매질을 갖춘 소포 구조를 갖는 것을 특징으로 한다. 다중층 리포솜은 수성 매질에 의해 분리된 다중 지질 층을 가지고 있다. 이들은 인지질이 과량의 수용액에 현탁될 때 자발적으로 형성된다. 지질 성분은 폐쇄 구조가 형성되기 전에 자기-재배열을 거쳐 지질 이중층 사이에 물과 용해된 용질을 포획한다. 그러나, 용액 내에서 정상적인 소포 구조와 상이한 구조를 갖는 조성물이 또한 포괄된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 지질은 미셀 구조를 취하거나 단순히 지질 분자의 불균일한 집합체로서 존재한다. 리포펙타민-핵산 복합체가 또한 고려된다.
일부 경우에, 비-바이러스 전달 방법은 리포펙션, 뉴클레오펙션, 미세주사, 바이오리스틱스, 비로솜, 리포솜, 이뮤노리포솜, 엑소솜, 다가양이온 또는 지질:카고 접합체 (또는 집합체), 네이키드 폴리펩티드 (예를 들어, 재조합 폴리펩티드), 네이키드 DNA, 인공 비리온, 및 작용제-강화된 폴리펩티드 또는 DNA 흡수를 포함한다. 일부 실시양태에서, 전달 방법은 본원에 기재된 조성물 또는 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 적어도 하나의 중합체, 에컨대 자연 중합체 또는 합성 물질과 접합시키거나 캡슐화하는 것을 포함한다. 중합체는 생체적합성이거나 생분해성일 수 있다. 적합한 생체적합성, 생분해성 합성 중합체의 비-제한적 예는 지방족 폴리에스테르, 폴리(아미노산), 코폴리(에테르-에스테르), 폴리알킬렌 옥살레이트, 폴리아미드, 폴리(이미노카르보네이트), 폴리오르토에스테르, 폴리옥사에스테르, 폴리아미도에스테르, 아민기를 함유하는 폴리옥사에스테르, 및 폴리(무수물)를 포함할 수 있다. 이러한 합성 중합체는 복수개의 상이한 단량체, 예를 들어 락트산, 락티드, 글리콜산, 글리콜리드, 엡실론-카프로락톤, 트리메틸렌 카르보네이트, p-디옥사논 등 중 2개 이상의 단독중합체 또는 공중합체 (예를 들어, 랜덤, 블록, 세그먼트화, 그래프트)일 수 있다. 예를 들어, 스캐폴드는 글리콜산과 락트산을 포함하는 중합체, 예컨대 글리콜산 대 락트산의 비율이 90/10 또는 5/95인 중합체로 구성될 수 있다. 자연 발생 생체적합성, 생분해성 중합체의 비-제한적 예는 당단백질, 프로테오글리칸, 폴리사카라이드, 글리코사미네오글리칸 (GAG) 및 이들 성분으로부터 유래된 단편, 엘라스틴, 라미닌, 데크로린, 피브리노겐/피브린, 피브로넥틴, 오스테오폰틴, 테나신, 히알루론산, 콜라겐, 콘드로이틴 술페이트, 헤파린, 헤파란 술페이트, ORC, 카르복시메틸 셀룰로스 및 키틴을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드는 패키징되어 세포외 소포를 통해 세포로 전달될 수 있다. 세포외 소포는 임의의 막-결합된 입자일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포외 소포는 적어도 하나의 세포에 의해 분비되는 임의의 막-결합된 입자일 수 있다. 일부 경우에, 세포외 소포는 시험관내에서 합성된 임의의 막-결합된 입자일 수 있다. 일부 경우에, 세포밖 소포는 세포 없이 합성된 임의의 막-결합된 입자일 수 있다. 일부 경우에, 세포외 소포는 엑소솜, 미세소포, 레트로바이러스-유사 입자, 아폽토시스 바디, 아폽토솜, 온코솜, 엑소퍼, 외피 바이러스, 엑소머, 또는 기타 매우 큰 세포외 소포일 수 있다.
일부 실시양태에서, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드는 생물학적 방법, 예컨대 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 통해 세포 내로 전달될 수 있다. 바이러스 벡터, 특히 레트로바이러스 벡터는 포유동물, 예를 들어 인간 세포 내로 유전자를 삽입하는 데 가장 널리 사용되는 방법이 되었다. 일부 실시양태에서, 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 포진 바이러스 I, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스 등으로부터 유래된다. 예시적인 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터 (AAV 벡터), 폭스 벡터, 파보바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 홍역 바이러스 벡터 또는 단순 포진 바이러스 벡터 (HSV)를 포함한다. 일부 경우에, 레트로바이러스 벡터는 감마-레트로바이러스 벡터, 예컨대 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (MoMLV, MMLV, MuLV 또는 MLV) 또는 뮤린 줄기 세포 바이러스 (MSCV) 게놈으로부터 유래된 벡터를 포함한다. 일부 경우에, 레트로바이러스 벡터는 또한 렌티바이러스 벡터, 예컨대 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 게놈으로부터 유래된 것을 포함한다. 일부 경우에, AAV는 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, 또는 그의 조합을 포함한 혈청형을 포함한다. 이러한 초기 혈청형을 기반으로 하여, 각각의 혈청형의 AAV 캡시드를 조작하여 생물학적 기능, 조직 또는 세포 선택에 더 적합하게 만들 수 있다. 일부 실시양태에서, AAV는 본 발명의 실시예에서 사용되는 AAV2 및 변이체 AAV2.N53 및 AAV2.N54이다. 적어도 2개의 AAV 혈청형을 함유할 수 있는 키메라 AAV가 또한 고려된다. 일부 경우에, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 또는 최대 8개의 상이한 혈청형이 키메라 AAV에 조합된다. 일부 경우에, AAV의 일부분만이 키메라이다. 예를 들어, 적합한 부분은 캡시드, VP1, VP2 또는 VP3 도메인 및/또는 Rep를 포함할 수 있다. 일부 경우에, VP1, VP2 및 VP3 중 적어도 하나가 그외에는 필적하는 야생형 AAV 캡시드 단백질과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 경우에, VP1과 VP2, VP1과 VP3, VP2와 VP3, 또는 VP1, VP2, 및 VP3에서 돌연변이가 발생할 수 있다. 일부 실시양태에서, VP1, VP2 및 VP3 중 적어도 하나는 야생형 AAV VP1, VP2, 및 VP3와 비교하여 1개 내지 약 25개의 아미노산 치환, 예를 들어 야생형 AAV VP1, VP2, 및 VP3와 비교하여 약 1개 내지 약 5개, 약 5개 내지 약 10개, 약 10개 내지 약 15개, 약 15개 내지 약 20개, 또는 약 20개 내지 약 25개의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 경우에, VP가 제거될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 돌연변이체 AAV는 VP1, VP2 또는 VP3 중 적어도 하나를 포함하지 않는다.
일부 경우에, 바이러스 벡터는 2개 이상의 바이러스로부터의 바이러스 부분을 포함하는 키메라 바이러스 벡터이다. 부가의 경우에, 바이러스 벡터는 재조합 바이러스 벡터이다. 일부 경우에, 벡터는 부가의 특색을 포함한다. 부가의 특색은 태그, 신호전달 펩티드, 인트론 서열, 프로모터, 스터퍼 서열 등과 같은 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 벡터는 신호전달 펩티드를 포함한다. 신호전달 펩티드는 때때로 신호전달 서열, 표적화 신호, 국재화 신호, 국재화 서열, 수송 펩티드, 리더 서열 또는 리더 펩티드로서 지칭되며, 분비 경로로 향하게 되어 있는 새로 합성된 대부분의 단백질의 N-말단에 존재하는 짧은 펩티드이다. 이러한 단백질은 특정 소기관 (소포체, 골지 또는 엔도솜) 내부에 존재하거나, 세포로부터 분비되거나, 또는 대부분의 세포막 내로 삽입되는 단백질을 포함한다. 일부 경우에, 본원에 제공된 핵산은 신호전달 펩티드를 포함할 수 있다. 신호전달 펩티드는 임의의 길이의 것이지만 전형적으로 15-30개 아미노산 길이일 수 있다. 신호전달 펩티드는 약 10-15, 10-20, 10-30, 15-20, 15-25, 15-30, 20-30, 또는 25-30개의 아미노산 길이일 수 있다. 다양한 신호전달 펩티드가 활용될 수 있으며 인간 항체 중쇄 (Vh), 인간 항체 경쇄 (Vl), 및 아플리베르셉트를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
한 실시양태에서, 벡터의 부가의 특색은 프로모터를 포함한다. 프로모터는 단백질과 결합하여 그의 하류의 DNA로부터 단일 RNA의 전사를 시작하는 DNA 서열이다. 이러한 RNA는 단백질을 코딩하거나, 또는 tRNA, mRNA 또는 rRNA와 같이 그 자체로 기능을 가질 수 있다. 프로모터는 DNA 상류 (센스 가닥의 5' 영역 방향)에 있는 유전자의 전사 시작 부위 근처에 위치한다. 프로모터는 약 100-1000개 염기쌍 길이일 수 있다. 일부 경우에, 프로모터는 유도성 프로모터일 수 있다. 다양한 프로모터가 고려되며 본 개시내용의 벡터에 이용될 수 있다. 한 실시양태에서, 프로모터는 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, 신장 인자 1 알파 (EF1α) 프로모터, 원숭이 공포형성 바이러스 (SV40) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제 (PGK1) 프로모터, 유비퀴틴 C (Ubc) 프로모터, 인간 베타 액틴 프로모터, CAG 프로모터, 테트라시클린 반응 요소 (TRE) 프로모터, UAS 프로모터, 액틴 5c (Ac5) 프로모터, 폴리헤드론 프로모터, Ca2+/칼모듈린-의존성 단백질 키나제 II (CaMKIIa) 프로모터, GAL1 프로모터, GAL 10 프로모터, TEF1 프로모터, 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제 (GDS) 프로모터, ADH1 프로모터, CaMV35S 프로모터, Ubi 프로모터, 인간 폴리머라제 III RNA (H1) 프로모터, U6 프로모터, 그의 폴리아데닐화된 구축물, 및 그의 임의의 조합이다. 일부 경우에, 프로모터는 CMV 프로모터이다.
일부 실시양태에서, 벡터는 2개의 상이한 프로모터의 발현 제어 하에 적어도 2개의 발현 카세트를 포함한다. 이러한 배열은 2개의 신호전달 변환 조절인자가 세포에서 동시에 또는 원하는 순차적 순서로 발현되도록 허용한다. 예를 들어, VEGF 억제제 및 Ang1 단백질을 포함하는 벡터는 VEGF 억제제를 구성적으로 발현하도록 조작될 수 있는 반면 (예를 들어, VEGF 억제제는 CMV 프로모터의 제어 하에 있음), Ang1 단백질은 나중에 발현될 수 있다 (예를 들어, Ang1 단백질은 유도성 프로모터의 제어 하에 있음). 일부 경우에, 2개의 프로모터를 사용하면 2개의 신호전달 변환 조절인자의 발현을 조정할 수도 있다. 예를 들어, VEGF 억제제는 특이적 세포 유형에서 강한 발현 활성을 갖는 프로모터에 의해 구동될 수 있는 반면, Ang1 단백질은 동일한 세포 유형에서 더 약한 발현 활성을 갖는 상이한 프로모터에 의해 구동된다.
한 측면에서, 본원에는 세포를 변형시킴으로써 조작된 세포를 생성하는 방법이 또한 제공된다. 세포는 1차 세포, 재조합 세포, 또는 세포주로 지칭될 수 있다. 일부 경우에, 세포는 패키징 세포이다. 패키징 세포는 몇 가지 예를 들어, HEK 293 세포, HeLa 세포, 및 Vero 세포 중 어느 하나일 수 있다. 조작된 세포는 1차 세포일 수 있다. 일부 경우에, 조작된 세포가 안구 세포일 수 있다. 적합한 안구 세포는 광수용체, 신경절 세포, RPE 세포, 무축삭 세포, 수평 세포, 뮬러 세포 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 경우에, 세포는 바이러스 입자를 생성하는데 활용되는 패키징 세포이다. AAV 비리온 또는 바이러스 입자를 생성하기 위해, AAV 벡터가 공지된 기술, 예컨대 형질감염을 사용하여 적합한 숙주 세포 내로 도입된다. 일부 경우에, 형질감염 기술, 예를 들어 CaPO4 형질감염 또는 전기천공, 및/또는 하이브리드 아데노바이러스/AAV 벡터에 의한 세포주, 예컨대 인간 배아 신장 세포주 HEK 293 (트랜스-작용 E1 단백질을 제공하는 기능적 아데노바이러스 E1 유전자를 함유하는 인간 신장 세포주)로의 감염이 사용된다. 적합한 형질감염 방법은 인산칼슘 공동-침전, 직접 미세주사, 전기천공, 리포솜 매개 유전자 전달, 및 고속 미세발사체를 사용한 핵산 전달을 포함하며, 이는 관련 기술분야에 공지되어 있다.
세포를 조작하기 위해, 복수개의 세포를 단리된 비-자연 발생 핵산과 접촉시킬 수 있다. 접촉은 임의의 시간을 포함할 수 있으며 약 5분 내지 약 5일을 포함할 수 있다. 접촉은 약 5분, 약 10분, 약 15분, 약 20분, 약 25분, 약 30분, 약 35분, 약 40분, 약 45분, 약 50분, 약 55분 또는 약 60분 동안 지속될 수 있다. 일부 경우에, 접촉은 1시간, 3시간, 5시간, 10시간, 15시간, 20시간, 1일, 2일, 3일, 4일 또는 최대 약 5일 동안 지속될 수 있다.
일부 경우에, 패키징 세포주의 상청액을 PEG 침전으로 처리하여 바이러스를 농축시킨다. 다른 경우에, 원심분리 단계를 사용하여 바이러스를 농축시킬 수 있다. 예를 들어, 원심분리 동안 바이러스를 농축시키기 위해 칼럼을 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 침전은 약 4℃ 이하 (예를 들어 약 3℃, 약 2℃, 약 1℃, 또는 약 1℃)에서 적어도 약 2시간, 적어도 약 3시간, 적어도 약 4시간, 적어도 약 6시간, 적어도 약 9시간, 적어도 약 12시간, 또는 적어도 약 24시간 동안 발생한다. 일부 실시양태에서, 재조합 AAV는 저속 원심분리에 이어 CsCl 구배에 의해 PEG-침전된 상청액으로부터 단리된다. 저속 원심분리는 약 20분, 약 30분, 약 40분, 약 50분 또는 약 60분 동안 약 4000 rpm, 약 4500 rpm, 약 5000 rpm, 또는 약 6000 rpm일 수 있다. 일부 경우에, 재조합 AAV는 약 5000 rpm에서 약 30분 동안 원심분리한 후 CsCl 구배를 수행하여 PEG-침전된 상청액으로부터 단리된다. 일부 경우에, CsCl 정제를 IDX 구배 초원심분리로 대체할 수 있다. 형질감염 후 약 12시간, 약 24시간, 약 36시간, 약 48시간, 약 72시간, 약 96시간, 약 120시간, 또는 이들 두 시점 중 임의의 것 사이의 시간에 상청액을 수집할 수 있다. 상청액은 또한 정제되거나, 농축되거나, 또는 그의 조합일 수 있다. 예를 들어, 농도 또는 바이러스 역가는 qPCR 또는 은 염색에 의해 결정될 수 있다.
한 측면에서, 조작된 세포로부터 단리된 복수개의 AAV 입자 (본원에 기재된 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 함유함)가 또한 제공된다. 바이러스 역가는 약 102 vp/mL, 약 103 vp/mL, 약 104 vp/mL, 약 105 vp/mL, 약 106 vp/mL, 약 107 vp/mL, 약 108 vp/mL, 또는 최대 약 109 vp/mL일 수 있다. 바이러스 역가는 약 102 GC/mL, 약 103 GC/mL, 약 104 GC/mL, 약 105 GC/mL, 약 106 GC/mL, 약 107 GC/mL, 약 108 GC/mL, 또는 최대 약 109 GC/mL일 수 있다. 일부 경우에, 바이러스 역가는 약 102 TU/mL, 약 103 TU/mL, 약 104 TU/mL, 약 105 TU/mL, 약 106 TU/mL, 약 107 TU/mL, 108 TU/mL, 또는 최대 약 109 TU/mL일 수 있다. 최적의 바이러스 역가는 형질도입될 세포 유형에 따라 달라질 수 있다. 바이러스의 범위는 약 1000 MOI 내지 약 2000 MOI, 약 1500 MOI 내지 약 2500 MOI, 약 2000 MOI 내지 약 3000 MOI, 약 3000 MOI 내지 약 4000 MOI, 약 4000 MOI 내지 약 5000 MOI, 약 5000 MOI 내지 약 6000 MOI, 약 6000 MOI 내지 약 7000MOI, 약 7000 MOI 내지 약 8000 MOI, 약 8000 MOI 내지 약 9000 MOI, 약 9000 MOI 내지 약 10,000 MOI일 수 있다. 예를 들어, 10,000의 MOI를 사용하여 100만 개의 세포를 감염시키려면 10,000 x 1,000,000 = 1010 GC가 필요하다.
일부 경우에, 복수개의 AAV 입자가 단위 투여 형태로 제형화될 수 있다. 다양한 제형이 성인 또는 소아 전달을 위해 고려되며, 0.5 x 109 vg, 1.0 x 109 vg, 1.0 x 1010, 1.0 x 1011 vg, 3.0 x 1011 vg, 6 x 1011 vg, 8.0 x 1011 vg, 1.0 x 1012 vg, 1.0 x 1013 vg, 1.0 x 1014 vg, 1.0 x 1015 vg, 또는 최대 1.5 x 1015 vg를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 바이러스 입자의 조성물은 냉동보존되거나 적합한 용기에 달리 저장될 수 있다.
본원에 제공된 조성물 및 방법은 그 외에는 필적하는 비변형된 핵산보다 적어도 약 3%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 최대 100%만큼 더 많이 대상 생물제제의 전달 및/또는 발현을 증강시키는데 충분할 수 있다. 일부 경우에, 그 외에는 필적하는 비변형된 핵산은 VEGF-트랩을 코딩하는 핵산이다. 일부 경우에, 변형은 그 외에는 필적하는 비변형된 핵산보다 적어도 약 1배, 약 6배, 약 11배, 약 16배, 약 21배, 약 26배, 약 31배, 약 36배, 약 41배, 약 46배, 약 51배, 약 56배, 약 61배, 약 66배, 약 71배, 약 76배, 약 81배, 약 86배, 약 91배, 약 96배, 약 101배, 약 106배, 약 111배, 약 116배, 약 121배, 약 126배, 약 131배, 약 136배, 약 141배, 약 146배, 약 151배, 약 156배, 약 161배, 약 166배, 약 171배, 약 176배, 약 181배, 약 186배, 약 191배, 약 196배, 약 201배, 약 206배, 약 211배, 약 216배, 약 221배, 약 226배, 약 231배, 약 236배, 약 241배, 약 246배, 약 251배, 약 256배, 약 261배, 약 266배, 약 271배, 약 276배, 약 281배, 약 286배, 약 291배, 약 296배, 약 301배, 약 306배, 약 311배, 약 316배, 약 321배, 약 326배, 약 331배, 약 336배, 약 341배, 약 346배, 또는 약 350배만큼 더 많이 대상 생물제제의 전달 및/또는 발현을 증강시키는데 충분할 수 있다. 한 실시양태에서, 증가된 발현은 시험관내 검정에 의해 결정된 바와 같이 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 200배, 또는 적어도 500배의 증가를 포함한다. 적합한 시험관내 검정은 ELISA, 웨스턴 블롯, 루미넥스, 현미경 검사, 영상화 및/또는 유동 세포계수법을 포함한다.
대상 AAV 비리온은 그 외에는 필적하는 WT AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의한 망막 세포 (광수용체, 신경절 세포, RPE 세포, 무축삭 세포, 수평 세포, 뮬러 세포 등)의 감염성과 비교하여 망막 세포의 적어도 1배, 적어도 6배, 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 50배, 또는 50배 초과하여 증가된 감염성을 나타낼 수 있다.
치료
본원에 기재된 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 치료 방법은 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 벡터, 또는 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV를, 치료를 필요로 하는 대상체에게 도입하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 치료를 필요로 하는 대상체에게 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 제공된다. 제약 조성물은 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 벡터, 또는 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV를 포함하는 생물제제를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여는 전신 투여 (예를 들어, 정맥내, 흡입, 유리체 등)를 포함한 임의의 적합한 투여 방식에 의해 이루어진다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
일부 실시양태에서, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 벡터, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV, 또는 제약 조성물은 일정 기간 동안 적어도 1회 (예를 들어, 2일마다, 1주에 2회, 1주에 1회, 매주마다, 1개월에 3회, 1개월에 2회, 1개월에 1회, 2개월마다, 3개월마다, 4개월마다, 5개월마다, 6개월마다, 7개월마다, 8개월마다, 9개월마다, 10개월마다, 11개월마다, 1년에 1회) 투여된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 일정 기간 동안 2회 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100회) 투여된다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 벡터, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV, 또는 제약 조성물을 치료상 유효량으로, 예를 들어, 경구 또는 국소 투여를 포함한 다양한 형태 및 경로에 의해 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 비경구, 정맥내, 피하, 근육내, 피내, 복강내, 뇌내, 지주막하, 안구내, 흉골내, 안과, 내피, 국소, 비강내, 폐내, 직장, 동맥내, 척수강내, 흡입, 병변내, 피내, 경막외, 피막내, 피막하, 심장내, 경기관, 표피하, 지주막하 또는 척수내 투여, 예를 들어 주사 또는 주입에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 상피 또는 피부 점막 내층 (예를 들어, 구강 점막, 직장 및 장 점막 투여)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 다중 투여 경로를 통해 전달된다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 벡터, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV, 또는 제약 조성물을 정맥내 주입에 의해 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 벡터, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV, 또는 제약 조성물은 장기간, 예컨대 24시간 초과에 걸쳐 느린 연속 주입에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 벡터, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV, 또는 제약 조성물은 정맥내 주사 또는 단기 주입으로서 투여된다. 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 벡터, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV, 또는 제약 조성물은 유리체 경로를 통해 투여된다. 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 벡터, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV, 또는 제약 조성물은 국소 방식으로, 예를 들어 임의로 데포 또는 지속 방출 제형 또는 임플란트로 작용제를 기관 내로 직접 주사하는 것을 통해 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 벡터, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV, 또는 제약 조성물은 다른 요법, 예를 들어, 항바이러스 요법, 화학요법, 항생제, 세포 요법, 시토카인 요법, 또는 항염증제와 함께 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드 또는 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물은 질환 또는 병태의 발생 전, 발생 동안, 또는 발생 후에 투여될 수 있고, 치료제를 함유하는 조성물의 투여 시기는 다양할 수 있다. 일부 경우에, 조성물은 예방제로서 사용될 수 있으며 코로나바이러스에 대한 감수성 또는 코로나바이러스와 연관된 병태 또는 질환에 대한 성향이 있는 대상체 (예를 들어, 면역화를 위한 대상체 또는 치료를 위한 대상체)에게 지속적으로 투여될 수 있다. 예방적 투여는 감염, 질환 또는 병태의 발생 가능성을 줄이거나, 또는 감염, 질환 또는 병태의 중증도를 감소시킬 수 있다.
비-자연 발생 폴리뉴클레오티드, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 벡터, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV, 또는 제약 조성물은 증상이 발병하기 전에 대상체에게 투여될 수 있다. 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 벡터, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV, 또는 제약 조성물은 대상체 (예를 들어, 면역화를 위한 대상체 또는 치료를 위한 대상체)에게 시험 결과, 예를 들어, 진단을 제공하는 시험 결과, 대상체 (예를 들어, 면역화를 위한 대상체 또는 치료를 위한 대상체)에서 코로나바이러스의 존재를 보여주는 시험, 또는 병태의 진행, 예를 들어 혈중 산소 수치 감소를 보여주는 시험 결과 이후 (예를 들어, 그 후 가능한 한 빨리)에 투여될 수 있다. 치료제는 질환 또는 병태의 발병이 검출되거나 의심된 후 (예를 들어, 그 후 실행 가능한 대로 빨리) 투여될 수 있다. 치료제는 코로나바이러스에 잠재적으로 노출된 후 (예를 들어, 그 후 실행가능한 대로 빨리), 예를 들어 대상체 (예를 들어, 면역화를 위한 대상체 또는 치료를 위한 대상체)가 감염된 대상체와 접촉했거나 전염될 수 있는 감염된 대상체와 접촉했다는 사실을 알게 된 후 투여될 수 있다.
본 개시내용의 작용제 (예를 들어, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드 또는 제약 조성물)의 실제 투여량 수준은 대상체 (예를 들어, 면역화를 위한 대상체 또는 치료를 위한 대상체)에게 독성이 없으면서 특정한 대상체, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 달성하기 위한 작용제의 양을 수득하도록 변화될 수 있다. 선택된 투여량 수준은 이용된 본 발명의 특정한 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 배설 속도, 치료 기간, 이용된 특정한 조성물과 조합하여 사용되는 기타 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료 중인 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 이전 병력, 및 의학 분야에 널리 공지된 유사한 요인을 포함한 다양한 약동학적 요인에 따라 달라질 수 있다.
최적의 원하는 반응 (예를 들어, 치료 및/또는 예방 반응)을 제공하기 위해 투여량 레지멘을 조정할 수 있다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있고, 시간이 지남에 따라 여러 분할 용량이 투여될 수 있거나, 치료 상황의 긴급성에 따라 용량이 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 투여의 용이성과 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 비경구 조성물을 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 바와 같은 투여 단위 형태는 대상체 (예를 들어, 면역화를 위한 대상체 또는 치료를 위한 대상체)에 대한 단위 투여량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며; 각각의 단위는 필요한 제약 담체와 연합하여 원하는 치료 효과를 초래하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성제를 함유한다. 본 개시내용의 투여 단위 형태에 대한 사양은 (a) 활성제의 고유한 특징과 달성할 특정한 치료 효과, 및 (b) 개개인의 감수성 치료를 위해 이러한 활성제를 화합하는 기술분야에 내재된 제한 사항에 의해 결정될 수 있으며 이에 직접적으로 의존할 수 있다. 용량은 원형 폴리리보뉴클레오티드 또는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 혈장 농도 또는 국소 농도를 참조하여 결정될 수 있다. 용량은 선형 폴리리보뉴클레오티드 또는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 혈장 농도 또는 국소 농도를 참조하여 결정될 수 있다.
본원에 기재된 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 벡터, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV, 또는 제약 조성물은 정확한 투여량의 단일 투여에 적합한 단위 투여 형태일 수 있다. 단위 투여 형태에서, 제형은 적절한 양의 조성물을 함유하는 단위 용량으로 나누어질 수 있다. 단위 투여 형태에서, 제형은 적절한 양의 하나 이상의 선형 폴리리보뉴클레오티드, 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및/또는 치료제를 함유하는 단위 용량으로 나누어질 수 있다. 단위 투여량은 별개의 양의 제형을 함유하는 패키지 형태일 수 있다. 비-제한적 예는 패키지된 주사제, 바이알 및 앰풀이다. 본원에 개시된 수성 현탁액 조성물은 단일 용량의 비-재밀폐가능한 용기에 패키징될 수 있다. 예를 들어, 보존제와 조합하여 또는 보존제 없이 다중 용량 재밀폐가능한 용기를 사용할 수 있다. 본원에 개시된 주사용 제형은 보존제가 부가된 단위 투여 형태, 예를 들어 앰풀 또는 다중 용량 용기에 제시될 수 있다.
일부 경우에, 대상체에서 생물제제의 증가된 수준은 진단 검정에 의해 결정된 바와 같이, 적어도 5배, 10배, 20배, 50배, 100배, 200배 또는 500배 증가된다.
적합한 진단 검정은 안구 진단 검정을 포함할 수 있다. 안구 진단 검정은 안과 검사, 예컨대 굴절 검사, 안구 스캔, 안구 간섭 단층 촬영, 판스워스-먼셀(Farnsworth-Munsell) 100 색조 시험, 컴퓨터 광학 디스크 영상화 및 신경 섬유층 분석 (GDX, HRT, OCT), 각막 형태검사법, 망막전위조영술 (ERG), 전기안구조영술 (EOG), 시각 유발 전위 (VEP), 시각 유발 반응 (VER), 플루오레세인 혈관조영술, 안구 간섭 단층 촬영 (OCT), 망막 사진 촬영, 안저 사진 촬영, 정반사 현미경 검사, 골드만, 험프리, FDT, 옥토퍼스, 생체 측정/IOL 계산, A-스캔, B-스캔, 및 그의 조합을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 망막 검사가 활용될 수 있다. 망막 기능 및 그의 변화를 평가하는 비제한적 방법은 시력 평가 (예를 들어, 최대 교정 시력 [BCVA], 보행, 탐색, 물체 검출 및 식별), 시야 평가 (예를 들어, 정적 및 운동 시야 주변 측정), 임상 검사 수행 (예를 들어, 눈의 앞부분과 뒷부분의 세극등 검사), 모든 명암의 파장에 대한 전기생리학적 반응 평가 (예를 들어, 모든 형태의 망막전위조영술 (ERG) [전시야, 다초점 및 패턴], 모든 형태의 시각 유발 전위 (VEP), 전기 안과 조영술 (EOG), 색각, 암순응 및/또는 대비 민감도)를 포함한다. 해부학적 구조와 망막 건강 및 그의 변화를 평가하는 비제한적 방법은 광학 간섭 단층 촬영 (OCT), 안저 사진 촬영, 적응형 광학 스캐닝 레이저 검안경 검사 (AO-SLO), 형광 및/또는 자가형광; 안구 운동성과 눈 운동 측정 (예를 들어, 안구진탕, 고정 선호도, 및 안정성), 보고된 결과 측정 (시각적 및 비-시각적-유도 행동 및 활동에서의 환자 보고된 변화, 환자 보고된 결과 [PRO], 삶의 질에 대한 설문지 기반 평가, 일상 활동 및 신경 기능 측정 (예를 들어, 기능적 자기 공명 영상화 (MRI))을 포함한다.
일부 실시양태에서, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 벡터, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV, 또는 제약 조성물은 이러한 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 벡터, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV, 또는 제약 조성물과 접촉되지 않은 필적하는 세포와 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 또는 그 초과만큼 세포에서의 신생혈관증식 신호전달을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 벡터, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV, 또는 제약 조성물은 2개의 상이한 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드로부터 코딩된 필적하는 VEGF 억제제 및 RTK/Tie2 또는 RTK/Tie2의 활성화제로 처리된 필적하는 세포와 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 또는 그 초과만큼 세포에서의 신생혈관증식 신호전달을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 벡터, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV, 또는 제약 조성물은 이러한 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 벡터, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV, 또는 제약 조성물과 접촉되지 않은 필적하는 세포와 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 또는 그 초과만큼 세포에서의 혈관 누출을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 벡터, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV, 또는 제약 조성물은 2개의 상이한 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드로부터 코딩된 필적하는 VEGF 억제제 및 필적하는 RTK/Tie2 또는 RTK/Tie2의 활성화제로 처리된 필적하는 세포와 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 또는 그 초과만큼 세포에서의 혈관 누출을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 벡터, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV, 또는 제약 조성물은 이러한 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 벡터, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV, 또는 제약 조성물과 접촉되지 않은 필적하는 세포와 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 또는 그 초과만큼 염증을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 벡터, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV, 또는 제약 조성물은 2개의 상이한 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드로부터 코딩된 필적하는 VEGF 억제제 및 RTK/Tie2 또는 RTK/Tie2의 활성화제로 처리된 필적하는 세포와 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 또는 그 초과만큼 염증을 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 치료 방법은 안구 질환을 치료할 수 있다. 관련 안구 질환 및 병태는 실명, 완전색맹, 연령-관련 황반 변성 (AMD), 당뇨병성 망막병증 (DR), 녹내장, 바르데-비들 증후군, 베스트병, 맥락막결손, 레베르 선천성 흑암시, 황반 변성, 결절성 맥락막 혈관병증 (PCV), 색소성 망막염, 레프섬병, 스타르가르트병, 어셔 증후군, X-연관 망막층간분리 (XLRS), 간체-추체 이영양증, 추체-간체 이영양증, 오구치병, 말라티아 레벤티네스 (가족성 우성 드루젠) 및 청색 추체 단색형색각을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, 안구 질환 또는 병태는 AMD이다. AMD는 습성 AMD 또는 건성 AMD일 수 있다.
일부 경우에, 제약 조성물의 투여는 질환 또는 병태의 적어도 특정 증상을 감소시키고/거나, 질환 또는 병태를 치료하고/거나 질환 또는 병태를 제거하는데 충분하다. 일부 경우에, 제공된 진단 검정 중 임의의 것을 통해 질환 또는 병태의 개선을 확인할 수 있다. 다른 경우에, 개선은 치료받은 대상체와의 인터뷰를 통해 수득될 수 있다. 예를 들어, 대상체는 대상 제약을 투여하기 전의 시력과 비교 시 시력이 개선되었다는 사실을 주치의와 소통할 수 있다. 다른 경우에, 치료 후 질환 또는 병태의 감소를 확인하기 위해 생체내 동물 모델을 사용할 수 있다. 적합한 동물 모델은 마우스 모델, 영장류 모델, 래트 모델, 개과 모델 등을 포함한다.
제약 조성물
본원에는 본원에 기재된 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 벡터, 또는 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV를 포함하는 제약 조성물이 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 본원에 개시된 바와 같은 2종 이상의 활성제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 벡터, 또는 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV를 포함하는 제약 조성물은 본원에 기재된 질환 또는 병태를 치료한다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 병태는 안구 질환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 병태는 안구 허혈 증후군, 증식성 망막병증, 신생혈관 녹내장 (NG), 포도막염, 신생혈관 포도막염, 완전색맹, 연령-관련 황반 변성 (nAMD), 당뇨병성 황반 부종 (DME), 당뇨병성 황반 망막병증 (DMR), 망막 정맥 폐색증 (RVO), 녹내장, 바르데-비들 증후군, 베스트병, 맥락막결손, 레베르 선천성 흑암시, 황반 변성, 결절성 맥락막 혈관병증 (PCV), 색소성 망막염, 레프섬병, 스타르가르트병, 어셔 증후군, X-연관 망막층간분리 (XLRS), 간체-추체 이영양증, 추체-간체 이영양증, 오구치병, 말라티아 레벤티네스 (가족성 우성 드루젠) 및 청색 추체 단색형색각을 포함한다.
생체내 전달을 위해, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 벡터, 또는 AAV 비리온은 제약 조성물로 제형화될 수 있고 일반적으로 유리체내로 또는 비경구로 투여될 수 있다 (예를 들어, 근육내, 피하, 종양내, 경피, 척수강내 등의 투여 경로를 통해 투여됨). 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 치료를 필요로 하는 대상체에게 척수강내로, 안구내로, 유리체내로, 망막으로, 정맥내로, 근육내로, 심실내로, 대뇌내로, 소뇌내로, 뇌실내로, 실질내로, 피하로, 종양내로, 폐로, 기관내로, 복강내로, 방광내로, 질내로, 직장내로, 경구로, 설하로, 경피로, 흡입에 의해, 흡입 연무 형태에 의해, 관강내-GI 경로에 의해, 또는 그의 조합에 의해 투여하도록 제형화된다.
일부 측면에서, 제약 조성물은 치료를 필요로 하는 대상체, 예컨대 인간 또는 포유동물을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 경우에, 대상체는 질환, 예를 들어 안구 질환으로 진단될 수 있다. 일부 측면에서, 대상 제약 조성물은 2차 요법과 공동 투여된다. 2차 요법은 안구 사용을 위한 임의의 요법을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 2차 요법은 영양 요법, 비타민, 레이저 치료, 예컨대 레이저 광응고, 광역학 요법, 비수다인(Visudyne), 항-VEGF 요법, 안경류, 안약, 마비제, 시력 교정 요법, 행동/지각 시력 요법 등을 포함한다. 일부 측면에서, 이전에 기재된 생물제제 중 임의의 것이 2차 요법으로 간주될 수 있다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물의 유효량은 망막 기능, 해부학적 완전성, 또는 망막 건강의 상실률의 감소, 예를 들어, 상실률 및 그에 따른 질환 진행의 2배, 3배, 4배, 5배 또는 그 초과의 감소, 예를 들어, 상실률 및 그에 따른 질환 진행의 10배 이상의 감소를 초래한다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물의 유효량은 이러한 제약 조성물로 처리되지 않은 세포에서의 신생혈관증식 신호전달과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 또는 그 초과만큼 세포에서의 신생혈관증식 신호전달을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 유효량의 제약 조성물은 대상체가 이러한 제약 조성물로 치료되지 않은 경우의 대상체에서의 신생혈관증식과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 또는 그 초과만큼 이를 필요로 하는 대상체에서의 신생혈관증식을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물의 유효량은 대상체가 이러한 제약 조성물로 치료되지 않은 경우의 대상체에서의 혈관 누출과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 또는 그 초과만큼 이를 필요로 하는 대상체에서의 혈관 누출을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물의 유효량은 대상체가 이러한 제약 조성물로 치료되지 않은 경우의 대상체에서의 염증과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 또는 그 초과만큼 이를 필요로 하는 대상체에서의 염증을 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 대상 rAAV 비리온의 유효량은 시각 기능, 망막 기능의 향상, 망막 해부학 또는 건강의 개선, 및/또는 안구 운동성의 개선 및/또는 신경 기능의 개선, 예를 들어, 망막 기능, 망막 해부학 또는 건강의 2배, 3배, 4배, 또는 5배 또는 그 초과의 개선, 및/또는 안구 운동성의 개선, 예를 들어, 망막 기능, 망막 해부학 또는 건강의 10배 이상의 개선, 및/또는 안구 운동성의 개선을 초래한다. 통상의 기술자에 의해 용이하게 인식되는 바와 같이, 원하는 치료 효과를 달성하는데 필요한 용량은 전형적으로 1 x 108 내지 약 1 x 1015 재조합 비리온의 범위일 것이며, 전형적으로 통상의 기술자에 의해 1 x 108 내지 약 1 x 1015 "벡터 게놈"으로서 지칭된다.
일부 측면에서, 본원에 제공된 조성물, 예컨대 제약 조성물이, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 일부 경우에, 투여는 약 0.5 x 109 vg, 1.0 x 109 vg, 1.0 x 1010, 1.0 x 1011 vg, 3.0 x 1011 vg, 6 x 1011 vg, 8.0 x 1011 vg, 1.0 x 1012 vg, 1.0 x 1013 vg, 1.0 x 1014 vg, 1.0 x 1015 vg, 1.5 x 1015 vg의 AAV 벡터 투여량을 전달하는 것을 포함한다. 예를 들어, 생체내 주사, 예를 들어 눈에 직접 주사하는 경우, 치료상 유효 용량은 약 106 내지 약 1015의 대상 AAV 비리온, 예를 들어 약 108 내지 1012의 조작된 AAV 비리온일 수 있다. 시험관내 형질도입의 경우, 세포에 전달될 조작된 AAV 비리온의 유효량은 조작된 AAV 비리온 약 108 내지 약 1013 정도일 것이다. 다른 유효 투여량은 용량 반응 곡선을 확립하는 일상적인 시도를 통해 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 쉽게 확립될 수 있다.
투여는 임의의 시간 동안 반복될 수 있다. 일부 측면에서, 투여는 매일 2회, 격일로, 주 2회, 매달 2회, 매달 3회, 월 1회, 격월로, 반년마다, 매년, 또는 2년마다 수행된다.
투여량 치료는 단일 용량 스케줄 또는 다중 용량 스케줄일 수 있다. 더욱이, 대상체에게 적절한 만큼 많은 용량이 투여될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 적절한 용량 수를 쉽게 결정할 수 있다. 일부 측면에서, 제약 조성물은 유리체내 주사, 망막하 주사, 미세주사, 또는 안구상 주사를 통해 투여된다.
일부 측면에서, 대상체는 본원에 제공된 제약 조성물의 투여 전, 투여 동안, 및/또는 투여 후에 돌연변이에 대한 유전자 검사를 통해 스크리닝될 수 있다. 돌연변이에 대해 스크리닝될 수 있는 관련 유전자는 RPE65, CRB1, AIPL1, CFH, 또는 RPGRIP를 포함한다.
본원에 제공된 치료 방법 또는 용도를 실시하는 데 있어서, 본원에 기재된 제약 조성물의 치료상 유효량이 치료할 질환, 장애 또는 병태, 예를 들어, 암을 앓고 있는 포유동물에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 치료상 유효량은 질환의 중증도, 대상체의 연령 및 상대적 건강 상태, 사용된 치료제의 효능 및 기타 요인에 따라 크게 달라질 수 있다. 본원에 기재된 치료제, 및 일부 경우에 조성물은 단독으로 또는 혼합물의 성분으로서 하나 이상의 치료제와 조합하여 사용될 수 있다.
본원에 기재된 제약 조성물은 정맥내, 동맥내, 경구, 비경구, 협측, 국소, 경피, 직장, 근육내, 피하, 골내, 경점막, 흡입 또는 복강내 투여 경로를 포함하나 이에 제한되지 않는 적절한 투여 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 본원에 기재된 조성물은 수성 액체 분산액, 자기-유화 분산액, 고형 용액, 리포솜 분산액, 에어로졸, 고체 투여 형태, 분말, 즉시 방출 제형, 제어 방출 제형, 신속 용융 제형, 정제, 캡슐, 환제, 지연 방출 제형, 연장 방출 제형, 박동성 방출 제형, 다중미립자 제형, 및 혼합 즉시 및 제어 방출 제형을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
제약 조성물은 통상적인 방식으로, 예컨대 단지 예로서, 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 분말화, 유화, 캡슐화, 포착 또는 압축 프로세스에 의해 제조될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 제약 조성물은 미생물 활성을 억제하기 위한 하나 이상의 보존제를 포함한다. 적합한 보존제는 수은 함유 물질, 예컨대 메르펜 및 티오메르살; 안정화된 이산화염소; 및 4급 암모늄 화합물, 예컨대 벤즈알코늄 클로라이드, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드 및 세틸피리디늄 클로라이드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제약 조성물은 수성 경구 분산액, 액상물, 겔, 시럽, 엘릭서제, 슬러리, 현탁액, 고체 경구 투여 형태, 에어로졸, 제어 방출 제형, 신속 용융 제형, 발포성 제형, 동결건조 제형, 정제, 분말, 환제, 당의정, 캡슐, 지연 방출 제형, 연장 방출 제형, 박동성 방출 제형, 다중미립자 제형, 및 혼합 즉시 방출 및 제어 방출 제형을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 투여 형태로 제형화된다. 한 측면에서, 본원에 논의된 바와 같은 치료제, 예를 들어 치료제는 근육내, 피하 또는 정맥내 주사에 적합한 제약 조성물로 제형화된다. 한 측면에서, 근육내, 피하 또는 정맥내 주사에 적합한 제형은 생리학상 허용되는 멸균 수성 또는 비-수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼, 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액으로 재수화하기 위한 멸균 분말을 포함한다. 적합한 수성 및 비-수성 담체, 희석제, 용매 또는 비히클의 예는 물, 에탄올, 폴리올 (프로필렌글리콜, 폴리에틸렌-글리콜, 글리세롤, 크레모포어 등), 그의 적합한 혼합물, 식물성 오일 (예컨대 올리브 오일) 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트를 포함한다. 적당한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅제의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 일부 실시양태에서, 피하 주사에 적합한 제형은 또한 부가제, 예컨대 보존제, 습윤제, 유화제 및 분배제를 함유한다. 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예컨대 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산 등을 사용하여 미생물의 성장을 방지할 수 있다. 일부 경우에, 등장화제, 예컨대 당, 염화나트륨 등을 포함하는 것이 바람직하다. 흡수 지연제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 사용하면 주사용 제약 형태의 장기간 흡수가 이루어질 수 있다.
정맥내 주사 또는 점적 또는 주입의 경우, 본원에 기재된 제약 조성물은 수용액, 바람직하게 생리학상 적합한 완충액, 예컨대 행크 용액, 링거 용액 또는 생리 식염수 완충액 중에서 제형화된다. 경점막 투여의 경우에는, 투과되는 장벽에 적절한 침투제가 제형에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 관련 기술분야에 공지되어 있다. 다른 비경구 주사의 경우, 적절한 제형은 수성 또는 비수성 용액을 포함하며, 바람직하게 생리학상 적합한 완충제 또는 부형제가 포함된다. 이러한 부형제는 공지되어 있다.
비경구 주사는 볼루스 주사 또는 연속 주입을 수반할 수 있다. 주사용 제약 조성물은 보존제가 부가된 단위 투여 형태, 예를 들어 앰풀 또는 다중 용량 용기에 제시될 수 있다. 본원에 기재된 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중 멸균 현탁액, 용액 또는 에멀젼으로서 비경구 주사에 적합한 형태일 수 있고, 제형화제, 예컨대 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 한 측면에서, 활성 성분은 사용 전 적합한 비히클, 예를 들어 주사용 멸균 증류수와 구성하기 위한 분말 형태이다.
흡입에 의한 투여의 경우, 치료제는 에어로졸, 미스트 또는 분말로서 사용하도록 제형화된다. 본원에 기재된 제약 조성물은 적합한 추진제, 예를 들어 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 기타 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 네뷸라이저로부터 에어로졸 스프레이 프리젠테이션의 형태로 편리하게 전달된다. 가압 에어로졸의 경우, 투여 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 예컨대 단지 예로서, 흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한 젤라틴의 캡슐 및 카트리지는 본원에 기재된 치료제의 분말 혼합물과 적합한 분말 기재, 예컨대 락토스 또는 전분을 함유하도록 제형화될 수 있다. 제약 조성물을 포함하는 제형은 벤질 알콜 또는 다른 적합한 보존제, 플루오로카본 및/또는 관련 기술분야에 공지된 다른 가용화제 또는 분산제를 이용하여, 식염수 중 용액으로서 제조된다. 바람직하게 이들 조성물 및 제형은 적합한 무독성의 제약상 허용되는 성분으로 제조된다. 적합한 담체의 선택은 원하는 비강 투여 형태, 예를 들어, 용액, 현탁액, 연고 또는 젤의 정확한 특성에 따라 달라진다. 비강 투여 형태는 일반적으로, 활성 성분 외에 다량의 물을 함유한다. 소량의 기타 성분, 예컨대 pH 조정제, 유화제 또는 분산제, 보존제, 계면활성제, 겔화제, 또는 완충제 및 기타 안정화제 및 가용화제가 임의로 존재한다. 바람직하게, 비강 투여 형태는 비강 분비물과 등장성이어야 한다.
경구 사용을 위한 제약 제제는 하나 이상의 고형 부형제를 본원에 기재된 하나 이상의 조성물과 혼합하고, 임의로 그 결과로 생성된 혼합물을 분쇄하고, 원하는 경우 적합한 보조제를 부가한 후 과립 혼합물을 프로세싱하여 정제 또는 당의정 코어를 수득함으로써 수득된다. 적합한 부형제는, 예를 들어 충전제, 예컨대 락토스, 수크로스, 만니톨 또는 소르비톨을 포함한 당; 셀룰로스 제제, 예컨대 예를 들어, 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸트 검, 메틸셀룰로스, 미세결정성 셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스; 또는 기타 물질, 예컨대 폴리비닐피롤리돈 (PVP 또는 포비돈) 또는 인산칼슘을 포함한다. 원하는 경우, 붕해제, 예컨대 가교된 크로스카멜로스 나트륨, 폴리비닐피롤리돈, 한천 또는 알긴산 또는 그의 염, 예컨대 알긴산 나트륨이 부가된다. 일부 실시양태에서, 활성 치료제 용량의 상이한 조합을 확인하거나 명확히 규명하기 위해 염료 또는 색소가 정제 또는 당의정 코팅에 부가된다.
또 다른 측면에서, 투여 형태는 마이크로캡슐화된 제형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 다른 양립성 물질이 마이크로캡슐화 물질에 존재한다. 물질의 비-제한적 예는 pH 조절제, 침식 촉진제, 소포제, 항산화제, 향미제, 및 담체 물질, 예컨대 결합제, 현탁화제, 붕해제, 충전제, 계면활성제, 가용화제, 안정화제, 윤활제, 습윤제, 및 희석제를 포함한다.
경구 투여를 위한 액상 제형 투여 형태는 임의로, 제약상 허용되는 수성 경구 분산액, 에멀젼, 용액, 엘릭서, 겔 및 시럽을 포함하나 이에 제한되지는 않는 군으로부터 선택된 수성 현탁액이다. 치료제 이외에, 액상 투여 형태는 임의로 부가제, 예컨대 (a) 붕해제; (b) 분산제; (c) 습윤제; (d) 적어도 하나의 보존제, (e) 점도 향상제, (f) 적어도 하나의 감미제, 및 (g) 적어도 하나의 향미제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 수성 분산액은 결정 형성 억제제를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제약 조성물은 자기-유화 약물 전달 시스템 (SEDDS)이다. 에멀젼은 서로 섞이지 않는 하나의 상이 분산되어 있는 것으로, 통상적으로 비말 형태이다. 일반적으로, 에멀젼은 격렬한 기계적 분산에 의해 생성된다. SEDDS는 에멀젼 또는 마이크로에멀젼과 달리, 과량의 물에 부가되면 외부의 임의의 기계적 분산 또는 교반 없이 자발적으로 에멀젼을 형성한다. SEDDS의 장점은 용액 전체에 비말을 분산시키기 위해 부드러운 혼합만이 필요하다는 것이다. 부가적으로, 투여 직전에 임의로 물 또는 수성 상을 부가하여, 불안정하거나 소수성인 활성 성분의 안정성을 보장한다. 따라서, SEDDS는 소수성 활성 성분의 경구 및 비경구 전달을 위한 효과적인 전달 시스템을 제공한다. 일부 실시양태에서, SEDDS는 소수성 활성 성분의 생체이용률을 개선시킨다.
협측 제형은 관련 기술분야에 공지된 다양한 제형을 사용하여 투여된다. 또한, 본원에 기재된 협측 투여 형태는 투여 형태를 협측 점막에 부착시키는 역할도 하는 생침식성 (가수분해성) 중합체성 담체를 추가로 포함할 수 있다. 협측 또는 설하 투여의 경우, 조성물은 통상적인 방식으로 제형화된 정제, 로젠지, 또는 겔의 형태를 취할 수 있다.
정맥내 주사의 경우, 제약 조성물은 임의로 수용액, 바람직하게 생리학상 적합한 완충액, 예컨대 행크 용액, 링거 용액 또는 생리 식염수 완충액 중에서 제형화된다. 경점막 투여의 경우, 투과될 장벽에 적절한 침투제를 제형에 사용한다. 다른 비경구 주사의 경우, 적절한 제형은 수성 또는 비수성 용액을 포함함며, 바람직하게는 생리학상 적합한 완충제 또는 부형제가 포함된다.
비경구 주사는 임의로 볼루스 주사 또는 연속 주입을 수반한다. 주사용 제형은 임의로, 보존제가 부가된 단위 투여 형태, 예를 들어 앰풀 또는 다중 용량 용기에 제시된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제약 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중 멸균 현탁액, 용액 또는 에멀젼으로서 비경구 주사에 적합한 형태로 존재하며, 제형화제, 예컨대 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유한다. 비경구 투여를 위한 조성물은 수용성 형태로 경동맥체의 활성을 조정하는 작용제의 수용액을 포함한다. 부가적으로, 경동맥체의 활성을 조정하는 작용제의 현탁액, 예를 들어 유성 주사 현탁액이 임의로 적절하게 제조된다.
통상적인 제형화 기술은, 예를 들어 하기 방법 중 하나 또는 조합을 포함한다: (1) 건식 혼합, (2) 직접 압축, (3) 밀링, (4) 건식 또는 비수성 과립화, (5) 습식 과립화, 또는 (6) 융합. 다른 방법은, 예를 들어 분무 건조, 팬 코팅, 용융 과립화, 과립화, 유동층 분무 건조 또는 코팅 (예를 들어, 우르스터 코팅), 접선 코팅, 상부 분무, 정제화, 압출 등을 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체에게 경구 투여하기 위한 치료제 및 적어도 하나의 분산제 또는 현탁제의 입자를 포함하는 제약 조성물이 제공된다. 제형은 현탁용 분말 및/또는 과립일 수 있으며, 물과 혼합 시, 실질적으로 균일한 현탁액이 수득된다.
더욱이, 제약 조성물은 임의로 산, 예컨대 아세트산, 붕산, 시트르산, 락트산, 인산 및 염산; 염기, 예컨대 수산화나트륨, 인산나트륨, 붕산나트륨, 시트르산나트륨, 아세트산나트륨, 락트산나트륨 및 트리스-히드록시메틸아미노메탄; 및 완충제, 예컨대 시트레이트/덱스트로스, 중탄산나트륨 및 염화암모늄을 포함한 하나 이상의 pH 조정제 또는 완충제를 포함한다. 이러한 산, 염기 및 완충제는 조성물의 pH를 허용가능한 범위로 유지하는 데 필요한 양으로 포함된다.
부가적으로, 제약 조성물은 임의로 조성물의 삼투압을 허용가능한 범위로 만드는 데 필요한 양으로 하나 이상의 염을 포함한다. 이러한 염은 나트륨, 칼륨 또는 암모늄 양이온과 염화물, 시트레이트, 아스코르베이트, 붕산염, 인산염, 중탄산염, 황산염, 티오술페이트 또는 중아황산염 음이온을 갖는 염을 포함하며; 적합한 염은 염화나트륨, 염화칼륨, 티오황산나트륨, 중아황산나트륨 및 황산암모늄을 포함한다.
키트
본원에는 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 벡터, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV, 또는 제약 조성물을 사용하기 위한 키트가 개시된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 키트는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 벡터, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 또는 제약 조성물을 제외한 물질 또는 성분의 집합체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 키트는 본원에 기재된 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 함유하는 AAV의 동종 집단을 선택하기 위한 성분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 숙주 세포에 의해 표면에서 합성되고/거나 방출 또는 발현되는 생체분자 (예를 들어, AAV)의 단위 수를 검정하기 위한 성분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 검정, 에컨대 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA), 단일-분자 어레이 (Simoa), PCR 및 qPCR을 수행하기 위한 성분을 포함한다. 키트에 구성된 성분의 정확한 특성은 의도된 목적에 따라 다르다. 예를 들어, 일부 실시양태는 대상체에서 본원에 개시된 질환 또는 병태 (예를 들어, 암)를 치료할 목적으로 구성된다. 일부 실시양태에서, 키트는 특히 포유동물 대상체를 치료할 목적으로 구성된다. 일부 실시양태에서, 키트는 특히 인간 대상체를 치료할 목적으로 구성된다.
사용 지침이 키트에 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 벡터 또는 제약 조성물을, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위한 지침을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 생체분자 (예를 들어, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 벡터, 또는 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV)를 발현하도록 세포를 추가로 조작하기 위한 지침을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 저장 또는 운송 동안 냉동보존, 동결건조 또는 냉동동면되었을 수 있는, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 벡터, 또는 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV의 생물학적 활성을 해동하거나 달리 복원하기 위한 지침을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 의도된 목적에 대한 효능 (예를 들어, 대상체를 치료하는 데 사용되는 경우 치료 효능)을 보장하기 위해 복원된 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 벡터, 또는 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV의 생육력을 측정하기 위한 지침을 포함한다.
임의로, 키트는 또한 기타 유용한 성분, 예컨대 희석제, 완충제, 제약상 허용되는 담체, 시린지, 카테터, 어플리케이터, 피펫팅 또는 측정 도구, 붕대 재료 또는 기타 유용한 도구를 함유한다. 키트에 어셈블리된 재료 또는 성분은 조작성과 유용성을 보존하는 임의의 편리하고 적합한 방식으로 저장되어 의사에게 제공될 수 있다. 예를 들어, 성분은 용해된 형태, 탈수된 형태 또는 동결건조된 형태일 수 있으며; 실온, 냉장 또는 냉동 온도에서 제공될 수 있다. 성분은 전형적으로 적합한 패키징 재료(들)에 함유되어 있다.
절대적인 또는 순차적인 용어, 예를 들어, "할 것이다", "하지 않을 것이다", "일 것이다", "이지 않을 것이다", "해야 한다", "해서는 안 된다", "먼저", "초기에는", "그 다음", "후속적으로", "이전", "이후", "마지막으로", 및 "최종적으로"의 사용은 본원에 개시된 본 실시양태의 범위를 제한하려는 것이 아니라 예시적인 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, 단수 형태는 문맥상 명백하게 달리 나타내지 않는 한, 복수 형태도 포함하도록 의도된다. 더욱이, 용어 "포함한", "포함하다", "갖는", "갖는다", "함께" 또는 그의 변형이 상세한 설명 및/또는 청구범위에 사용되는 경우, 이러한 용어는 용어 "포함하는"과 유사한 방식으로 포괄적인 것으로 의도된다.
본원에 사용된 바와 같은, 문구 "적어도 하나", "하나 이상" 및 "및/또는"은 접속사 및 분리사 모두 사용할 수 있는 개방형 표현이다. 예를 들어, "A, B 및 C 중 적어도 하나", "A, B 또는 C 중 적어도 하나", "A, B 및 C 중 하나 이상", "A, B 또는 C 중 하나 이상", 및 "A, B, 및/또는 C"라는 표현은 각각 A 단독, B 단독, C 단독, A와 B 함께, A와 C 함께, B와 C 함께, 또는 A, B 및 C 함께를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은, "또는"은 "및", "또는" 또는 "및/또는"을 지칭할 수 있으며 배타적으로 및 포괄적으로 모두 사용될 수 있다. 예를 들어, 용어 "A 또는 B"는 "A 또는 B", "A이지만 B는 아님", "B이지만 A는 아님", 및 "A 및 B"를 지칭할 수 있다. 일부 경우에, 문맥에 따라 특정한 의미가 나타날 수 있다.
본원에 기재된 임의의 시스템, 방법, 소프트웨어 및 플랫폼은 모듈식이다. 따라서, "제1" 및 "제2"와 같은 용어는 반드시 우선순위, 중요성 순서, 또는 행위 순서를 의미하는 것은 아니다.
수치 또는 수치 범위를 지칭할 때 "약"이라는 용어는 언급된 수치 또는 수치 범위가 실험적 가변성 내의 (또는 통계적 실험 오류 내의) 근사치라는 것을 의미하며, 수치 또는 수치 범위는, 예를 들어 명시된 수치 또는 수치 범위의 1% 내지 15%로 다양할 수 있다. 예에서, 용어 "약"은 명시된 수치 또는 값의 ±10%를 지칭한다.
용어 "증가된", "증가하는 것" 또는 "증가하다"는 일반적으로 통계상 유의미한 양만큼의 증가를 의미하는 것으로 본원에 사용된다. 일부 측면에서, 용어 "증가된" 또는 "증가하다"는 참조 수준과 비교 시 적어도 10%의 증가, 예를 들어, 참조 수준, 표준 또는 대조군과 비교 시 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 또는 100% 이하의 증가 또는 10 내지 100%의 임의의 증가를 의미한다. "증가하다"의 다른 예는 참조 수준과 비교 시 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 1000배 또는 그 초과의 증가를 포함한다.
용어 "감소된", "감소하는 것" 또는 "감소하다"는 일반적으로 통계상 유의미한 양만큼의 감소를 의미하기 위해 본원에 사용된다. 일부 측면에서, "감소된" 또는 "감소하다"는 참조 수준과 비교 시 적어도 10%만큼의 감소, 예를 들어, 참조 수준과 비교 시 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 또는 100% 이하만큼의 감소 (예를 들어, 참조 수준과 비교 시 수준이 없거나 검출할 수 없는 수준), 또는 10 내지 100%의 임의의 감소를 의미한다. 마커 또는 증상의 맥락에서, 이들 용어는 이러한 수준이 통계상 유의미하게 감소하는 것을 의미한다. 감소는 예를 들어, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40% 또는 그 초과일 수 있고, 바람직하게 주어진 질환이 없는 개체에 대해 정상 범위 내에서와 같이 허용되는 수준까지 낮아진다.
본 발명의 바람직한 실시양태가 본원에 제시되고 기재되었지만, 이러한 실시양태는 단지 예로서 제공된다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 본 발명은 본 명세서 내에 제공된 구체적 실시예에 의해 제한되도록 의도되지 않는다. 본 발명은 전술한 명세서를 참조하여 기재되었지만, 본원의 실시양태의 설명 및 예시는 제한적인 의미로 해석되는 것을 의미하지 않는다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이제 본 발명으로부터 벗어나지 않으면서 수많은 변이, 변화 및 치환을 발생시킬 수 있을 것이다. 더욱이, 본 발명의 모든 측면은 다양한 조건 및 변수에 따라 달라지는 본원에 제시된 구체적 묘사, 구성 또는 상대적 비율에 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 기재된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는 데 이용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 따라서 본 발명은 임의의 그러한 대안, 변형, 변이 또는 등가물도 포괄하는 것으로 고려된다. 하기 청구범위는 본 발명의 범위를 규정하고, 이들 청구범위 및 그 등가물의 범위 내의 방법 및 구조가 이에 의해 포괄되도록 의도된다.
실시예
하기 예시적인 실시예는 본원에 기재된 시뮬레이션, 시스템 및 방법의 실시양태를 대표하며 어떤 방식으로든 제한하려는 의도는 없다.
실시예 1. AAV 벡터 설계 및 발현 연구
실시예 1은 Ang1 단백질 (전체 길이 또는 단편); 또는 내인성 Ang2 발현 수준에 의해 결정되는 Ang2 억제성 RNA 억제를 갖는 Ang2 억제성 RNA (예를 들어, Ang2 shRNA) 중 하나와 조합한 VEGF 억제제의 발현 수준을 측정하기 위한 실험을 예시한다.
재료 및 방법
표준 방법이 VEGF 길항제 (아플리베르셉트, 루센티스, 항-VEGF F(ab)', 및 가변 영역의 단일 쇄 단편 (scFv), hCOMP-Ang1-FLD, 및 hCOMP-Ang1-FLD-FLAG, Ang2 항체 scFv 및 Ang2 짧은 헤어핀 RNA 단편을 코딩하는 DNA 구축물의 분자 클로닝에 사용되었다. 이러한 관심 단백질 (POI)은 표 1에 열거되어 있다. Ang1 또는 Ang2 발현을 조정하기 위한 RTK/Tie2의 활성화제와 VEGF 억제제의 상이한 조합을 포함하는 비-제한적 예시적인 AAV 벡터가 표 2에 열거되어 있다. 표 3에는 본원에 기재된 AAV 벡터 및 발현 카세트의 PCR 증폭 및 DNA 시퀀싱 분석에 사용되는 DNA 프라이머가 열거되어 있다.
표 1. 치료 단백질 및 AAV 구축을 위한 펩티드의 빌딩 블록의 요약
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표 2. VEGF 억제 및 Ang1 또는 Ang2 발현 조정을 위한 예시적인 AAV 벡터의 사용을 통한 단백질 및 조합물을 코딩하는 플라스미드의 분자 클로닝
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표 3. PCR 증폭 및 DNA 시퀀싱 분석에 사용되는 DNA 프라이머
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표 4. AAV 벡터 서열 및 각각의 조절 요소가 열거되어 있다
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Figure pct00124
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HEK293 LTV 세포의 유지
HEK293 LTV 세포주는 100 단위/mL의 페니실린과 100 μg/mL의 스트렙토마이신 (P/S) [코닝(Corning)] 및 10% FBS (ATCC)를 함유하는 DMEM 배지에서 배양되었다. 이는 통상적으로 24시간 만에 2배로 증가하였다. 정기적인 유지를 위해, 1주에 1회 세포를 1:10으로 분할하였다.
플라스미드 DNA를 이용한 HEK293 LTV 세포의 일시적인 형질감염
세포를 100 단위/mL의 페니실린 및 100 μg/mL의 스트렙토마이신 (P/S) 및 10% FBS를 함유하는 2 mL DMEM 배지에 1x10^6개 세포/웰로 6-웰 플레이트에 시딩하고 밤새 배양하였다. 형질감염 당일, 기존 배지를 제거하고 Opti-MEM 배지로 교체하였다. 일시적 형질감염은 100 μL의 Opti-MEM 중 1 μg의 shRNA 플라스미드와 1 μg의 Ang2 플라스미드를 희석하고, 100 μL의 Opti-MEM 중 4 μL의 PEI (1 μg/μL)를 희석하고, 희석된 용액 둘 다를 혼합하고 10분 동안 인큐베이션한 다음, 세포에 적가함으로써 수행되었다. 형질감염 4일 후, 검정을 위해 500 μL 배지를 수집하고 500 μL의 신선한 Opti-MEM 배지를 보충하였다. 3일 더 인큐베이션한 후, 검정을 위해 모든 배지를 수집하였다.
효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA)
ELISA 검정은 하기와 같이 수행되었다: 코팅 완충액 (1 L의 Milli Q 수 중 중탄산나트륨 3.7 g, 탄산나트륨 0.64 g, pH 9.6)에 5 μg/mL로 희석된 50 μL/웰의 포획 항체를 밀봉 커버를 사용하여 4℃에서 밤새 96-웰 플레이트에 코팅하였다. 그 다음날, 코팅 용액을 버리고 플레이트를 종이 타월로 두드려 과도한 용액을 제거하였다. 300 μL/웰의 차단 용액 (PBS + 0.1% Tween 20 중 상업용 카세인 차단 완충액)을 부가하고 플레이트를 밀봉한 후, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후 차단 완충액을 버리고, 종이 타월로 플레이트를 두드려 과도한 완충액을 제거하였다. 시험할 샘플을 코팅 완충액에 희석시키고 50 μL/웰의 희석 샘플을 부가하고 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후 용액을 버리고, 플레이트를 종이 타월로 두드려 과도한 용액을 제거하였다. 300 μL/웰의 세척 완충액 (0.1% Tween-20이 함유된 1xPBS, 제조 후 30일에 만료됨)으로 6회 세척한 후, 플레이트를 종이 타월로 두드려 과도한 용액을 제거하고 코팅 완충액에 1:100으로 희석된 검출 항체를 50μL/웰로 부가하고 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 용액을 버리고, 플레이트를 종이 타월로 두드려 과도한 용액을 제거하였다. 차단 완충액에 1:5000으로 희석한 스트렙타비딘-HRP를 50 μL/웰로 부가하고 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 용액을 버리고, 플레이트를 종이 타월로 두드려 과도한 용액을 제거하였다. 플레이트를 세척 완충액 300 μL/웰로 6회 세척한 후, 플레이트를 종이 타월로 두드려 과도한 용액을 제거하였다. 발색 반응 용액 TMB를 50 μL/웰로 부가하고 반응을 암실 하의 실온에서 15 - 20분 (또는 색이 포화된 경우 더 짧은 기간) 동안 수행하였다. 50 μL/웰 정지 용액을 부가하여 발색 반응을 정지시켰고, 450 nm에서의 OD는 정지 용액을 부가한 후 15분 동안 참조로서 600 nm에서의 OD를 이용하여 판독되었다.
AAV 생산을 위한 재조합 바큘로바이러스의 생성
제조업체의 지침 [인비트로젠 (Invitrogen; 미국 캘리포니아주 칼스배드)]에 따라 Bac-to-Bac 바큘로바이러스 발현 시스템을 사용하여 재조합 바큘로바이러스 (rBV)를 생성하였다. 간단히 언급하면, 표적 유전자를 함유하는 pFB 셔틀 플라스미드를 각각 1 ng/μL의 TE 완충액으로 희석시키고, 각각의 DNA 2 ng를, 카텝신 유전자가 결실된 백미드 DNA 분자를 함유하는 20 μL의 Δcath-DH10Bac 적격 박테리아 [비로벡 (Virovek; 미국 캘리포니아주 해이워드)]와 혼합하고 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, 42℃에서 30초 동안 열 충격을 가하였다. 얼음 위에서 2분 동안 인큐베이션한 후, 박테리아를 37℃에서 4시간 동안 배양하여 회수한 다음, 카나마이신 50 μg/mL, 겐타미신 7 μg/mL, 테트라시클린 10 μg/mL, IPTG 40 μg/mL, 및 X-gal 100 μg/mL를 함유하는 한천 플레이트 상에 플레이팅하였다. 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션한 후, 재조합 백미드 DNA를 함유하는 2개의 백색 콜로니를 골라내고, 미니프렙 백미드 DNA를 멸균 조건에서 정제하였다. 각각의 백미드 DNA 약 5μg 및 진젯(GeneJet) 시약 [시그나젠 래보러토리즈 (SignaGen Laboratories; 미국 메릴랜드주 프레드릭)] 10 μL를 각각 100 μL ESFAF 배지 (익스프레션 시스템즈; 미국 캘리포니아주 데이비스)에 희석한 다음, 약 30분 동안 함께 혼합하여 형질감염 혼합물을 형성하였다. Sf9 세포를 28℃에서 약 30분 동안 2 mL ESFAF 배지 중의 1.5e+6개 세포/웰로 6-웰 플레이트에 플레이팅하였다. Sf9 세포로부터 기존 배지를 제거한 후, 각각의 형질감염 혼합물을 800 uL ESFAF 배지에 희석한 다음 Sf9 세포에 부가하였다. 28℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 각각의 웰에 부가의 ESFAF 배지 1 mL를 부가하였다. 총 4일의 인큐베이션 시간 후, rBV를 함유하는 배지를 수집하고 1:200 비율로 증폭하여 AAV 생산 프로세스에 즉시 사용하기에 충분한 양의 rBV를 생성하였다.
AAV 생산 및 정제
AAV2 Rep 및 돌연변이체 캡시드 유전자를 보유하는 rBV 및 표적 발현 카세트를 보유하는 rBV를 각각 사용하여 AAV 생산을 위해 Sf9-V432AG 세포를 공동 감염시켰다. 간단히 언급하면, 10 moi의 rBV-Cap-Rep 및 5 moi의 rBV-표적 카세트를 사용하여, 진탕 인큐베이터에서 180 rpm의 진탕 속도로 28℃에서 3일 동안 50% 신선한 ESFAF 배지를 사용하여 ~5e+6개 세포/mL의 밀도로 Sf9 세포주를 공동 감염시켰다. 감염이 끝나면, 3,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 수집하였다. 세포를 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2 mM MgCl2, 1% 사르코실, 1% 트리톤 X-100, 및 125 단위/mL 벤조나제를 함유하는 Sf9 용해 완충액에서 격렬하게 와동시킨 다음 350 rpm, 37℃에서 1시간 동안 진탕시킴으로써 용해시켰다. 진탕이 끝나면, 와동을 통해 염 농도를 500 mM로 증가시키고, 4℃에서 20분 동안 8,000 rpm으로 원심분리시킴으로써 용해물을 청정하게 하였다. 이와 같이 청정해진 용해물을 5 mL의 1.50 g/cc 및 10 mL의 1.30 g/cc 염화세슘 용액을 함유하는 SW28 스윙 버킷 로터용 초투명 원심분리 튜브로 옮겼다. 28,000 rpm, 15℃에서 ~18시간 동안 원심분리한 후, AAV 밴드를 시린지로 수집하여 70 ti 원심분리 로터용 초투명 원심분리 튜브에 옮겼다. 원심분리 튜브를 1.38 g/cc 염화세슘 용액으로 채우고 열 밀봉하였다. AAV 샘플을 65,000 rpm, 15℃에서 ~18시간 동안 2차 초원심분리를 수행하고, 시린지를 이용하여 AAV 밴드를 수집하였다. 정제된 AAV 샘플을 0.001% 플루로닉(Pluronic) F-68을 함유하는 PBS 완충액으로 완충액 교환하고 0.22 μm 시린지 필터로 필터 멸균하였다. 멸균된 AAV 샘플은 한 달 이내에 4℃에서 저장한 다음, 장기간 저장을 위해 -80℃로 옮겼다. AAV 역가는 퀀트스튜디오(QuantStudio) 7 플렉스 실시간 PCR 시스템 (인비트로젠)을 사용하여 실시간 PCR 방법으로 결정되었다.
AAV에 의한 HEK293 형질도입 및 ELISA 정량화
HEK293 세포를 10% FBS를 함유하는 2 mL EMEM에 1.0E+6개 세포/웰로 6-웰 플레이트 상에 시딩하고 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 24시간 후, AAV를 각각의 웰에 100,000 vg/세포 (MOI)로 부가하고 인큐베이터에 넣었다. 형질도입 24시간 후, 기존 배지를 신선한 완전 배지로 교체하였다. 형질도입 4일 후, 배양 상청액을 수집하고, VEGF-트랩 및 COMP-Ang1 단백질을 정량화하기 위해 개발된 사내 ELISA를 수행하였다. 모든 형질도입은 이중으로 수행되었다. 이러한 일시적인 발현 또는 AAV 형질도입을 위한 단백질 생산을 위한 배양, HEK293 세포 배양은 초저 IgG 혈청 또는 무혈청 배지를 사용하여 시행되었다.
칼럼 크로마토그래피를 이용한 단백질 정제
POI를 코딩하는 플라스미드 DNA로 형질감염되거나 상응하는 AAV로 형질도입된 HEK293의 세포 배양 유체를 0.2 μm 필터로 여과하여 미립자를 제거하고 단백질 A 칼럼 크로마토그래피의 MabSelect prismA 칼럼 (1-mL 크기)에 1.5 ~ 2.0 mL/min의 유속으로 로딩하였다. 칼럼을 세척 완충액 (20 mM Tris-HCl, pH 7.3, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA)으로 세척하고 용출 완충액 (0.1 M 아세트산 나트륨, pH 3.0-3.6)으로 용출시킨 후, 중화 완충액 (1.0 M Tris-HCl, pH 10)의 1/10로 중화시켰다. 중화된 단백질 용액을 0.01% (w/v) 플루로닉 F68 또는 Tween 20을 함유하는 1xPBS로 완충액 교환하고 PBS로 미리 적셔 놓은 0.2 μm 시린지 필터를 통해 멸균 여과하였다. 최종 제제는 -80℃에 저장하였다.
결과 - 본 연구를 위해 구축된 플라스미드
아플리베르셉트, 안지오포이에틴 1 및 2의 기능과 신생혈관증식에 대한 그의 상승작용적 효과를 연구하기 위한 본 프로젝트를 위해 총 16개의 플라스미드가 구축되었다. 구축된 플라스미드는 AMI071, AMI077, AMI136, AMI142, AMI143, AMI144, AMI145, AMI146, AMI147, AMI148, AMI149, AMI150, AMI151, AMI152, AMI153, 및 AMI154, AMI155, AMI156, AMI157, AMI158, AMI159, AMI160, AMI161, AMI162, AMI163, AMI166, AMI167, 및 AMI169를 포함한다. 자세한 AAV 구축물 서열와 각각의 조절 요소는 표 4에 열거되어 있다.
최적화된 Ang1 코딩 서열은 단백질 발현을 개선시켰다
비-최적화된 및 최적화된 hCOMP-Ang1 서열은 각각 동일한 플라스미드 백본에 클로닝되어 AMI071 및 AMI077을 생성하였다. 재조합 바큘로바이러스를 생성하고 Sf9 세포를 감염시켜 AAV를 생산하는 데 사용하였다. 정제된 AAV2.N54 벡터를 사용하여 HEK293 세포를 형질도입하고 Ang1 단백질 수준을 ELISA 검정을 사용하여 결정하였다. 그 결과가 표 5에 나타나 있으며, 이는 최적화된 Ang1 코딩 서열이 단백질 발현 수준을 5배 초과만큼 개선시켰다는 것을 보여준다.
표 5. Ang1 발현을 증가시키기 위한 최적화된 Ang1 코딩 서열
Figure pct00126
Ang2에 대항하여 맞춤 설계된 shRNA는 Ang2 발현을 억제하였다
인간 Ang2 유전자에 대항한 일련의 shRNA가 인간 U6 프로모터의 제어 하에 클로닝되었다. 이들 shRNA를 함유하는 플라스미드는 6-웰 플레이트에서 인간 Ang2 단백질을 발현하는 플라스미드와 함께 HEK293 세포에 형질감염되었다. 형질감염 4일 후, 각각의 웰로부터 500 μL의 배지를 수거하고 동일한 용적의 신선한 배지를 웰에 부가하고 세포를 3일 더 배양하였다. 그런 다음 모든 배지를 수거하고 VEGF-트랩 및 인간 Ang2의 발현을 ELISA 검정으로 결정하였다. Ang2 shRNA의 결과가 표 6에 나타나 있다. 그 결과는 모든 shRNA가 Ang2 발현에 대한 억제 효과를 갖는 것으로 나타났으며, 그중 shRNA3 및 shRNA4가 가장 효율적인 것으로 입증되었다. 모든 플라스미드를 AAV2.N54 벡터에 패키징하고, 그 결과로 생성된 벡터를 HEK293 세포에 4일 동안 형질도입하였다. 모든 shRNA는 Ang2 발현에 대한 억제 효과를 나타낸다. shRNA3 및 shRNA4는 Ang2 발현에 대해 가장 효율적인 억제 효과를 나타낸다 (표 7).
표 6. 플라스미드 형질감염된 HEK293 세포에서의 안지오포이에틴 2 발현의 shRNA 억제
Figure pct00127
표 7. AAV2-N54 형질도입된 HEK293 세포에서의 안지오포이에틴 2 발현의 shRNA 억제
Figure pct00128
이중 카세트는 표적 유전자 발현에 대해 융합 단백질 구축물보다 더 잘 작동하였다
다중 경로를 표적화하기 위해, VEGF-트랩 및 안지오포이에틴 1 (Ang1) 유전자 둘 다는 이중 카세트 또는 융합 단백질 구성에서 두 AAV ITR에 의해 플랭킹된 하나의 플라스미드에 클로닝되었다. 이들 플라스미드는 AAV2.N54 벡터를 생산하는 데 사용되었다. 이중 카세트 구성에서, 각각의 VEGF-트랩 및 Ang1은 CMV 인핸서/프로모터에 이어 SV40 인트론에 의해 각각 구동되고 합성 폴리 A 서열에 의해 종결되었다. 융합 단백질 구성에서, VEGF-트랩 단백질은 푸린 및 F2A 서열에 의한 Ang1 또는 GGGGS 링커 4개 단위와 융합되었다. 전자의 구성은 F2A 부위에서의 절단에 의해 번역된 후 2개의 별도의 단백질을 생성하였다 (VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP, 서열식별번호: 15). 후자의 구성은 번역 후 단일 융합 단백질을 생성하였다. 그 결과는 이중 카세트가 푸린-F2A (AMI142 및 AMI154) 또는 4xGGGGS 링커 (AMI144)를 사용하는 융합 단백질 구축물보다 VEGF-트랩 (AMI136 및 AMI153)에 대해 더 높은 단백질 발현을 생성하였다는 것을 나타낸다. 푸린-F2A 절단 폴리펩티드 서열은 RRKRKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (서열식별번호: 16)의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 최적화된 Ang1 코딩 서열 (AMI153)을 갖는 이중 구축물은 임의의 다른 구축물보다 더 높은 Ang1 발현을 나타냈지만 VEGF-트랩은 감소되었다 (표 8 및 도 5). 표 9 및 표 10에는 증가된 Ang1 발현 (표 9); 또는 Ang2 shRNA를 통해 감소된 Ang2 (표 10, Ang2 shRNA 1-6)와 조합된 부가의 AAV 및 그의 VEGF 억제 효과가 요약되어 있다.
표 8. 이중 또는 융합 카세트 구성에서의 표적 단백질의 발현 수준
Figure pct00129
표 9. 이중 또는 융합 카세트 구성에서의 VEGF 및 Ang1의 발현 수준
표 10. 이중 또는 융합 카세트 구성에서의 VEGF 및 Ang2의 발현 수준
Figure pct00131
실시예 2. 마우스의 레이저 유도된 맥락막 신생혈관증식 (CNV) 모델에서 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 벡터의 치료 효능
실시예 2는 마우스 (무스 무스쿨루스(Mus musculus); C57BL/6J; 수컷; 8-12주령) 모델에서 레이저 유도된 맥락막 신생혈관증식 (CNV) 모델에서의 신생혈관증식의 억제의 평가를 예시한다.
처리
대조군 물품: 아무 가치없는 돌연변이된 AVMX-110 ("모의" 벡터)을 보유하는 AAV2.N54. Δ120은 중간 용량인 4e+8 vg/눈으로 사용될 것이다.
시험 물품: 상이한 트랜스진을 보유하는 AAV 벡터는 4e+8 vg/눈의 농도에서 평가된다. 각각의 벡터는 4e+8 vg/μl의 제형 완충액으로 희석된다.
투여: 레이저를 사용하기 28일 전에, 마우스에게 AAV를 양측으로 투여할 것이다. 비히클은 레이저를 사용하기 3일 전에 투여될 것이다. 5 μm 필터 [고무 마개가 장착된 바이알로부터 약물을 인출하거나 주사하기 위해 20 Ga. x 1 1/2 in. 얇은 벽 바늘이 있는 암형 루어 잠금 커넥터 내의 비 브라운(B Braun) 필터 니들 (FN5120) 5-마이크로미터 필터 (제품 코드: 415025)] 또는 허용가능한 동등한 필터 니들을 사용하여 AAV 제제를 바이알로부터 인출할 것이다. 표 17은 CNV 연구 실험 설계를 예시한다. 표 18에는 동물, 사육장 및 환경 조건을 포함한 시험 시스템이 요약되어 있다. 표 19는 CNV 연구에 사용된 마우스에 제공된 식이 및 물을 예시한다.
표 17. CNV 연구 실험 설계
Figure pct00132
CNV: 맥락막 신생혈관증식, IVT: 유리체내, N/A: 해당 사항 없음
표 18. 시험 시스템: 동물, 사육장 및 환경 조건
Figure pct00133
표 19. 동물 식이 및 물
Figure pct00134
동물의 건강 및 순응
동물은 최소 3일 동안 연구 환경에 순응될 것이다. 순응 기간이 끝나면, 연구 참여에 대한 적합성을 결정하기 위해 실험 동물 기술자가 각각의 동물을 물리적으로 검사한다. 검사는 피부 및 외부 귀, 눈, 복부, 행동 및 일반적인 신체 상태를 포함하나 이에 제한되지는 않을 것이다. 건강 상태가 양호한 것으로 결정된 동물이 연구에 방출될 것이다.
무작위 배정 및 연구 확인
동물은 시설 표준 운영 절차 (SOP)에 따라 연구 그룹에 무작위로 배정될 것이다. 동물은 상응하는 케이지 카드 번호, 어어 펀치 및 번호로 고유하게 식별된다.
유리체내 주사
주사 하기 전 제-28일에, 마우스에게 부프레노르핀 0.01-0.05 mg/kg을 SQ 투여할 것이다. 그런 다음 유리체내 주사를 위해 동물을 진정시키고 0.5% 프로파라카인 HCL 1 방울을 양쪽 눈에 적용한다. 대안적으로, 마우스는 흡입된 이소플루란으로 마취될 수 있다. 듀몬트 #4 겸자를 사용하여 결막을 가볍게 잡고, 33 G 바늘과 해밀튼 시린지를 사용하여 주사한다. 시린지 내용물을 투여한 후, 시린지 바늘을 천천히 빼낸다. 주사 절차 후, 오플록사신 안과용 용액 1 방울을 눈 윤활제와 함께 안구 표면에 국소적으로 적용한다.
레이저 유도된 CNV 절차
제0일에, 마우스에게 부프레노르핀 0.01-0.05 mg/kg을 SQ 투여하였다. 국소 산동제 (1.0% 트로피카미드 HCL 및 2.5% 페닐에프린 HCL)를 레이저 시술 전 적어도 15분에 도포하였다. 케타민/크실라진을 복강내 주사하여 마우스를 진정시켰다. 국소 안약을 사용하여 각막을 촉촉하게 유지하고 핫 패드를 사용하여 체온을 유지하였다. 세극등을 통해 전달된 532 nm 다이오드 레이저를 사용하여 시신경 주변에 4개의 단일 레이저 지점을 만들었다. 마우스의 양쪽 눈 모두는 제0일에 실험 설계 내의 스케줄에 따라 레이저 처리될 것이다. 레이저 후 안구 윤활제를 점안하였다.
측정할 파라미터
검사. 이환율과 사망률은 케이지 측면 관찰과 함께 매일 관찰되었으며, 특히 양쪽 눈에 주의를 기울였다.
플루오레세인 혈관조영술 (FA). FA는 레이저 후 제7일에 양쪽 눈에 수행되었다. FA에 대한 산동증은 국소 산동제 (1.0% 트로피카미드 HCL 및 2.5% 페닐에프린 HCL; 검사 15분 전에 각각의 눈에 1 방울)을 사용하여 달성되었다. 케타민/크실라진의 복강내 주사로 마우스를 진정시켰다. 망막 사진 촬영은 정맥내 나트륨 플루오레세인 주사 (12 mg/kg) 후 대략 1분에 수행되었다.
안락사. 상기 실험 설계 표의 시점에서, 동물은 이산화탄소 질식을 통해 안락사되고 사망은 경추 탈구로써 확인된다. 안락사 후, 선택된 동물의 양쪽 눈은 플랫 마운트 분석 또는 PK 조직 분석을 위해 수집된다.
균질화를 위한 안구 조직 수집. 눈을 적출하고 망막 및 RPE/맥락막 세그먼트를 신선한 눈으로부터 절개하여 급속 동결시킨다. 조직을 미리 무게가 측정된 적절히 라벨링된 분석 바이알에 놓아두고, 즉시 무게를 다시 측정하여 샘플 중량을 결정하고, 냉동고로 옮길 때까지 드라이 아이스 위에 두었다. 소수점 이하 4자리까지 측정할 수 있는 저울로 샘플의 무게를 측정하였다. 혈청 (2 mL 폴리프로필렌 스크류 캡 튜브) 및 망막/RPE/맥락막/공막 ("안배") (2 mL 프리셀리스 균질화 튜브)을 수집한다. 샘플은 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 균질화시킨다. 프리셀리스 에볼루션 탁상형 균질화기를 사용하고 (3 x 6500 rpm [각각의 주기 30초], 30초 지연), 샘플을 -80℃ 냉동고에 다시 넣는다.
실시예 3. 비-GLP AVMX-112 (Ang1)의 시험관내 및 생체내 생체분석 분석
실시예 3은 AVMX-112 (아플리베르셉트 및 Ang1을 발현하기 위한 이중 유전자 구축물)의 시험관내 발현에 대한 연구를 예시한다. FITC-덱스트란을 사용한 시험관내 투과성 검정은 Ang1의 존재 하에 누출로부터의 상당한 보호를 보여주었다. 생체내 마우스 레이저 유도된 맥락막 신생혈관증식 (CNV) 모델은 AVMX-112를 사용하여 상당한 상처 치유를 보여주었다. 표 20은 AVMX-112를 활용한 연구에 사용된 구축물을 예시한다.
표 20. AVMX-112를 활용한 연구에 사용된 구축물
Figure pct00135
본 연구에 사용된 구축물은 이중 유전자를 발현하였다. 공통 관심 유전자 (GOI)는 아플리베르셉트 (AVMX-110) 및 인간 Ang1이었다. Ang1 전체 길이의 단백질은 응집을 형성하는 경향이 있으므로; aa284-498로 이루어진 Ang1을 생산하는 데 더 짧은 서열이 사용되었다. 이러한 서열은 N-말단에 래트 연골 올리고머성 매트릭스 단백질 (COMP)의 코일드-코일 도메인의 일부를 유지한다. 도 10a는 Ang1, COMP-Ang1, 및 전체 길이의 Ang1의 단점에 관한 예시적인 정보를 예시한다. 도 10b는 예시적인 이중 발현 AAV 구축물을 예시한다. 각각의 GOI는 2개의 별도의 CMV 프로모터로 플랭킹되었기 때문에, 아플리베르셉트와 COMP-Ang1은 별도의 단백질로서 발현되었다. AMI071 및 AMI077은 아플리베르셉트가 없는 COMP-Ang1 구축물이었다. 이들은 이중 유전자 구축물이 아니었고 시험관내 발현을 위해 본 연구에서 사용되었다. AVMX-110은 아플리베르셉트만을 발현했으며 시험관내 및 생체내 효능 효과 비교에 사용되었다.
작용 메커니즘
CNV는 기존 맥락막 혈관으로부터 새로운 혈관이 병리적으로 성장하는 것이다. 이로 인해 말기에는 시력 상실이 발생한다. 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)는 CNV의 병리학적 진행에 주도적인 역할을 한다. 아플리베르셉트 (아일레아) 단백질은 CNV 치료에 사용할 수 있는 주요 단백질 약물 중 하나이다. 그러나, 아플리베르셉트 및 기타 항-VEGF 약물은 반복적이고 지속적인 투여가 필요하거나 또는 연속 투여에 대한 반응이 급격히 감소하는, 난치성/타키필락시스 등의 단점이 있다. 따라서, 아플리베르셉트 항-VEGF 활성을 지원할 수 있는 다른 메커니즘이 필요하다. 안지오포이에틴, 특히 Ang1은 비-누출성, 비-염증성, 기능적 및 안정적인 혈관을 촉진시킨다. Ang1은 세포 연접부를 강화시키고 부착 분자를 감소시킴으로써 염증 유발 혈관 누출 및 염증성 세포 침윤을 감소시킨다. 표 21에는 AVMX-112 연구에 사용된 재료가 열거되어 있다. 본 실시예의 모든 AAV 구축물은 Sf9 생산되었으며 CsCl 초원심분리의 2 주기를 거쳤다. qPCR을 사용하여 구축물의 역가를 확인하였다.
표 21. AVMX-112 연구에 사용된 재료
Figure pct00136
시험관내 발현 및 정량화
HEK293 세포를 표 20에 언급된 AAV 구축물로 형질도입하였다. 형질도입 후, 상청액을 수집하고 아플리베르셉트 및 COMP-Ang1 발현 수준을 정량화하였다.
시험관내 혈관 투과성 검정
시험관내 혈관 투과성 검정은 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)를 사용하여 수행되었다. 5.0E+04개 세포를 무혈청 배지 내 24-웰 트랜스웰 플레이트의 정점 구획에 플레이팅하였다. 트랜스웰 정점 구획은 표준 프로토콜에 따라 세포를 플레이팅하기 전에 콜라겐으로 미리 코팅되었다 (Application Note 26 "Fabrication of Collagen I Gels," ibidi USA, Inc., Fitchburg, WI). 37℃ 인큐베이터에서 72시간 동안 인큐베이션한 후, 세포를 253 ng/mL (VEGF보다 5배 더 높은 몰 농도) 아플리베르셉트 및/또는 250 ng/mL (VEGF보다 5배 더 높은 몰 농도) COMP-Ang1 단백질의 존재 및 부재 하에 20 ng/mL VEGF로 1시간 동안 처리하였다. 처리 후, 배지를 기저외측 챔버에 신선한 배지와 함께 배치하고, 정점 챔버에 1 mg/mL FITC-덱스트란을 부가하고 30분 동안 인큐베이션하였다. 30분 후, 기저외측 구획으로부터 50 μL를 채취하고 페놀 레드가 없는 DMEM 300 μL를 보충하였다. 이러한 샘플 100 μL를 흑색 96-웰 플레이트 상으로 옮겼다. 판독값은 490/520 nm 여기/방출 스펙트럼에서 형광 강도를 사용하여 3회 측정되었다.
생체내 마우스 CNV 모델
생체내 연구를 위해, 이전에 기재된 바와 같이 마우스 CNV 모델을 사용하고 상이한 구축물을 4E+08 vg/눈의 용량으로 유리체내 (IVT) 주사하였다. AAV 구축물는 ANG1 구축물의 FA 분석 28일 전에 주사되었으며, 마우스 CNV 모델에서의 효능 연구를 위해 상이한 유전자 산물을 갖는 비-GLP AAV 구축물을 유리체내 (IVT) 주사한 동물로부터 수득된 혈청 및 안구 샘플에서의 AVMX-110 및 아플리베르셉트 발현과 비교되었다. IVT 주사된 역가는 모든 그룹에 대해 4.8E+08 vg/눈이었다. 시행된 연구는 표 22에 제시된 그룹을 수반하였다.
표 22. IVT 주사된 AAV 구축물/대조군 및 투여받은 혈청/안구 샘플의 목록
Figure pct00137
안구 샘플의 균질화
안락사 후 안구 및 혈청 샘플을 수득하였다. 균질화된 조직은 샘플을 얼음 위에 유지하고 20초 간격으로 20초 동안 3회 초음파처리하여 추가로 초음파처리하였다. 그런 다음, 이와 같이 초음파처리된 안구 샘플을 13,000 rpm에서 3-4분 동안 원심분리시켰다. 그런 다음 상청액을 수집하고 도입 섹션에서 언급된 표준화된 VEGF-트랩 ELISA를 사용하여 아플리베르셉트 수준을 결정하는 데 사용하였다.
HEK293 세포에서의 시험관내 발현
이중 유전자 구축물에서의 아플리베르셉트 및 Ang1 발현을 단일 유전자 구축물과 비교하였다 (도 11). 표 23은 본 연구에 사용된 모든 구축물에서의 아플리베르셉트 및 Ang1의 발현 프로파일을 예시한다. 비-최적화된 ANG1 구축물 (AMI136)은 더 높은 농도의 아플리베르셉트와 더 낮은 농도의 Ang1을 생산했지만, AMI153은 아플리베르셉트와 ANG1을 동일하게 발현하였다. 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행하였다.
표 23. 시험관내에서의 아플리베르셉트 및 ANG1 발현
Figure pct00138
시험관내 혈관 투과성 검정
시험관내 투과성 검정은 HUVEC 세포 단층을 통과하는 FITC-덱스트란의 투과성에 대한 상이한 단백질의 효과를 보여주었다. 정제된 단백질이 AAV 구축물 대신 본 검정에 사용되었다. 도 12는 VEGF가 누출을 촉진시켰지만 아플리베르셉트와 Ang1은 FITC 덱스트란의 누출을 감소시키는 역할을 했다는 것을 예시한다. Ang1은 아플리베르셉트 단독과 비교할 때 훨씬 더 높은 누출 방지 기능을 제공하였다. 아플리베르셉트와 Aed1은 함께, VEGF 또는 아플리베르셉트와 조합된 VEGF와 비교하여 투과성을 상당히 감소시키는 작용을 하였다.
플루오레세인 혈관조영술 (FA) 분석
레이저 손상 후 FA 데이터를 그룹 간에 비교하였다. 다른 모든 그룹을 비히클 대조군과 비교함으로써 통계 분석을 수행하였다. 도 13a 및 도 13b는 막대 그래프 ± SEM으로서의 Ang1 및 VEGF-트랩 구축물 비교 및 일원 ANOVA를 사용한 통계 분석 및 던넷 시험을 사용한 다중 비교의 결과를 보여준다. 도 14는 상이한 그룹으로부터의 대표적인 FA 영상을 예시한다. 비히클을 사용하여 나머지 그룹을 비교한 경우, 예상대로 비히클 대조군과 모의 대조군 그룹 간에 유의미한 차이가 없었다. 그러나, AAV2.N54-120 그룹 동물은 상당한 레이저 손상 회복을 보여주었다. AAV2.N54-120 군 동물을 본 분석으로부터 제외했을 때, AAV2.N54-153 동물 또한 비히클 그룹 동물과 유의미한 차이를 보였다. 상이한 그룹에 대한 p 값이 있는 병변 면적이 표 24에 요약되어 있다.
표 24. 상이한 연구 그룹에 대한 병변 면적의 비교
Figure pct00139
안구 샘플에서의 VEGF-트랩 수준
VEGF-트랩 농도는 안배당 아플리베르셉트 pg로 표현되었다. 안배는 망막, 공막, 맥락막 및 망막으로 이루어졌다 (도 15). AAV2.N54-아플리베르셉트인 AVMX-110에서의 발현은 다른 그룹과 비교하여 더 높은 수준의 아플리베르셉트 발현을 나타냈다 (표 25).
표 25. 안구 샘플에서의 아플리베르셉트 발현
Figure pct00140
LoQ = 검출 한계
결론적으로, 시험관내 발현은 단일 유전자 구축물에서든 아니면 이중 유전자 구축물에서든 코돈 최적화 후의 Ang1의 발현이 유의미한 증가를 보여주었다. 시험관내 투과성 검정도 Ang1에 의한 유의미한 누출 방지 기능을 나타냈다. 아플리베르셉트와 Ang1은 상승작용적으로 작동하여 VEGF로 인한 누출을 감소시켰다. AVMX-110은 마우스 CNV 모델에서 병변 면적을 효율적으로 감소시켰다. Ang1 구축물 AMI153은 또한 AMI153의 아플리베르셉트 발현이 AVMX-110보다 훨씬 더 낮음에도 불구하고 AVMX-110에 필적하는 효능을 보여주었다. 그러나, AMI153과 비교하여 더 높은 아플리베르셉트 발현을 나타낸 AMI136은 효능을 나타내지 못하였다. 이는 이러한 모델에서 Ang1의 중요성을 예시한다.
전술한 개시내용은 명확성 및 이해를 위해 일부 상세히 기재되었지만, 본 개시내용의 판독으로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게는, 본 개시의 진정한 범위를 벗어나지 않으면서 형태 및 세부사항에 있어서 다양한 변화가 이루어질 수 있음이 명백할 것이다. 예를 들어, 상기 기재된 모든 기술과 장치는 다양한 조합으로 사용될 수 있다. 본 출원에 인용된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 및/또는 기타 문서는, 각각의 개별 간행물, 특허, 특허 출원 및/또는 기타 문서가 모든 목적을 위해 참조로 포함되도록 개별적으로 및 별도로 표시된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전체 내용이 참조로 포함된다.

Claims (95)

  1. 하기를 발현하기 위한 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드:
    a) VEGF 억제제; 및
    b) 수용체 티로신 키나제 (RTK)/Tie2 또는 RTK/Tie2의 활성화제.
  2. 제1항에 있어서, a) 및 b)가 별도의 폴리펩티드로서 발현되거나 또는 VEGF 억제제, 및 RTK/Tie2 또는 RTK/Tie2의 활성화제를 포함하는 별도의 폴리펩티드로 절단가능한 인접 폴리펩티드로서 발현되는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  3. 제2항에 있어서, 인접 폴리펩티드가 프로테아제 절단가능 서열을 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  4. 제2항에 있어서, 인접 폴리펩티드가 푸린 절단가능 서열을 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  5. 제2항에 있어서, 인접 폴리펩티드가 자기-절단 폴리펩티드 서열을 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  6. 제5항에 있어서, 자기-절단 폴리펩티드 서열이 2A 자기-절단 펩티드를 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  7. 제5항에 있어서, 자기-절단 폴리펩티드 서열이 F2A 자기-절단 펩티드를 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  8. 제2항에 있어서, 프로테아제 절단가능 서열이 푸린-F2A 절단 서열을 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, VEGF 억제제가 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, 또는 그의 조합과 결합하여 이를 억제하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, VEGF 억제제가 항체를 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, VEGF 억제제가 1가 Fab', 2가 Fab2, F(ab)'3 단편, 단일-쇄 가변 단편 (scFv), 비스-scFv, (scFv)2, 디아바디, 미니바디, 나노바디, 트리아바디, 테트라바디, 디술피드 안정화된 Fv 단백질 ("dsFv"), 단일-도메인 항체 (sdAb), Ig NAR, 낙타류 항체, 또는 그의 조합, 그의 결합 단편, 또는 그의 화학적으로 변형된 유도체를 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, VEGF 억제제가 비-항체 VEGF 억제제를 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  13. 제12항에 있어서, 비-항체 VEGF 억제제가 VEGF 수용체 1 (VEGFR1), VEGF 수용체 2 (VEGFR2), VEGF 수용체 3 (VEGFR3), 그의 단편, 또는 그의 조합인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  14. 제13항에 있어서, 비-항체 VEGF 억제제가 가용성 VEGFR1, 가용성 VEGFR2, 가용성 VEGFR3, 그의 가용성 단편, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  15. 제12항에 있어서, 비-항체 VEGF 억제제가 VEGF-트랩 또는 그의 변형된 버전을 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, RTK/Tie2의 활성화제가 안지오포이에틴-1 (Ang-1), 안지오포이에틴-2 (Ang-2), 안지오포이에틴-3 (Ang-3), 또는 안지오포이에틴-4 (Ang-4)를 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  17. 제16항에 있어서, RTK/Tie2의 활성화제가 Ang1을 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  18. 제17항에 있어서, Ang1이 전체 길이의 Ang1을 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  19. 제17항에 있어서, Ang1이 서열식별번호: 3과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  20. 제17항에 있어서, Ang1이 Ang1의 기능적 단편을 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  21. 제20항에 있어서, Ang1의 기능적 단편이 피브로넥틴-유사 도메인 (FLD)을 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  22. 제21항에 있어서, FLD가 서열식별번호: 5와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, FLD가 가용성 폴리펩티드와 융합되는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  24. 제23항에 있어서, 가용성 폴리펩티드가 서열식별번호: 1과 최대 99%, 최대 98%, 최대 97%, 최대 96%, 최대 95%, 최대 94%, 또는 최대 93% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  25. 제23항에 있어서, 가용성 폴리펩티드가 서열식별번호: 2와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 그 초과로 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  26. 제23항에 있어서, 가용성 폴리펩티드가 서열식별번호: 2인 폴리펩티드 서열을 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  27. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, RTK/Tie2의 활성화제가 서열식별번호: 6과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, RTK/Tie2의 활성화제가 항체 또는 그의 단편을 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  29. 제28항에 있어서, RTK/Tie2의 활성화제가 1가 Fab', 2가 Fab2, F(ab)'3 단편, 단일-쇄 가변 단편 (scFv), 비스-scFv, (scFv)2, 디아바디, 미니바디, 나노바디, 트리아바디, 테트라바디, 디술피드 안정화된 Fv 단백질 ("dsFv"), 단일-도메인 항체 (sdAb), Ig NAR, 낙타류 항체, 또는 그의 조합, 그의 결합 단편, 또는 그의 화학적으로 변형된 유도체를 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, RTK/Tie2의 활성화제가 Ang2와 결합하여 이를 억제하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 단편이 서열식별번호: 12와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 폴리펩티드와 결합하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 단편이 서열식별번호: 25-27 중 어느 하나, 그의 단편, 또는 그의 조합과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  33. 제1항에 있어서, RTK/Tie2의 활성화제가 억제성 RNA를 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  34. 제33항에 있어서, 억제성 RNA가 shRNA, siRNA, miRNA, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  35. 제34항에 있어서, 억제성 RNA가 shRNA를 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  36. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 억제성 RNA가 안지오포이에틴을 코딩하는 내인성 핵산과 결합하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  37. 제36항에 있어서, 안지오포이에틴이 Ang2를 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  38. 제37항에 있어서, Ang2가 서열식별번호: 13과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 핵산 서열을 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 발현 카세트가 하나 이상의 프로모터, 하나 이상의 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 또는 둘 다를 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, VEGF 억제제 및 RTK/Tie2의 활성화제 또는 RTK/Tie2가 VEGF 억제제 및 RTK/Tie2의 활성화제 또는 RTK/Tie2의 부재 하에서의 신생혈관증식 신호전달과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 또는 그 초과만큼 세포에서의 발현 시 신생혈관증식 신호전달을 감소시키는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  41. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, VEGF 억제제 및 RTK/Tie2의 활성화제 또는 RTK/TIE2가 2개의 상이한 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드로부터 코딩된 필적하는 VEGF 억제제 및 필적하는 RTK/Tie2의 활성화제 또는 필적하는 RTK/Tie2에 의해 감소된 신생혈관증식 신호전달과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 또는 그 초과만큼 세포에서의 발현 시 신생혈관증식 신호전달을 감소시키는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  42. 하기를 발현하기 위한 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드:
    a) VEGF 억제제; 및
    b) Ang1 폴리펩티드.
  43. 하기를 발현하기 위한 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드:
    a) VEGF 억제제; 및
    b) Ang2 억제제.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, VEGF 억제제가 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, 또는 그의 조합과 결합하여 이를 억제하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, VEGF 억제제가 항체를 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  46. 제45항에 있어서, VEGF 억제제가 1가 Fab', 2가 Fab2, F(ab)'3 단편, 단일-쇄 가변 단편 (scFv), 비스-scFv, (scFv)2, 디아바디, 미니바디, 나노바디, 트리아바디, 테트라바디, 디술피드 안정화된 Fv 단백질 ("dsFv"), 단일-도메인 항체 (sdAb), Ig NAR, 낙타류 항체, 또는 그의 조합, 그의 결합 단편, 또는 그의 화학적으로 변형된 유도체를 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  47. 제46항에 있어서, VEGF 억제제가 서열식별번호: 21, 서열식별번호: 22, 서열식별번호: 23, 서열식별번호: 32, 서열식별번호: 33, 서열식별번호: 34, 서열식별번호: 35, 또는 그의 조합, 또는 그의 단편과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  48. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, VEGF 억제제가 비-항체 VEGF 억제제를 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  49. 제48항에 있어서, 비-항체 VEGF 억제제가 VEGF 수용체 1, VEGF 수용체 2, VEGF 수용체 3, 그의 단편, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  50. 제48항에 있어서, 비-항체 VEGF 억제제가 가용성 VEGFR1, 가용성 VEGFR2, 가용성 VEGFR3, 그의 가용성 단편, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  51. 제48항에 있어서, 비-항체 VEGF 억제제가 VEGF-트랩 또는 그의 변형된 버전을 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  52. 제51항에 있어서, 비-항체 VEGF 억제제가 서열식별번호: 24, 서열식별번호: 25, 서열식별번호: 26, 또는 서열식별번호: 31, 또는 그의 조합, 또는 그의 단편과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  53. 제42항 및 제44항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, Ang1 폴리펩티드가 전체 길이의 Ang1인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  54. 제42항 및 제44항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, Ang1 폴리펩티드가 서열식별번호: 3과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  55. 제42항 및 제44항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, Ang1 폴리펩티드가 Ang1의 피브로넥틴-유사 도메인 (FLD)을 포함하는 Ang1 기능적 단편을 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  56. 제55항에 있어서, Ang1 폴리펩티드가 서열식별번호: 5와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  57. 제56항에 있어서, FLD가 서열식별번호: 6과 최대 99%, 최대 98%, 최대 96%, 최대 95%, 최대 94%, 또는 최대 93% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하는 가용성 폴리펩티드와 융합되는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  58. 제43항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, Ang2 억제제가 Ang2와 결합하여 이를 억제하는 항체 또는 그의 단편을 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  59. 제58항에 있어서, Ang2 억제제가 1가 Fab', 2가 Fab2, F(ab)'3 단편, 단일-쇄 가변 단편 (scFv), 비스-scFv, (scFv)2, 디아바디, 미니바디, 나노바디, 트리아바디, 테트라바디, 디술피드 안정화된 Fv 단백질 ("dsFv"), 단일-도메인 항체 (sdAb), Ig NAR, 낙타류 항체, 또는 그의 조합, 그의 결합 단편, 또는 그의 화학적으로 변형된 유도체를 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  60. 제58항 또는 제59항에 있어서, 항체 또는 그의 단편이 서열식별번호: 12와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 폴리펩티드와 결합하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  61. 제58항 또는 제59항에 있어서, 항체 또는 그의 단편이 서열식별번호: 25-27 중 어느 하나, 또는 그의 단편, 또는 그의 조합과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  62. 제43항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, Ang2 억제제가 RNA 간섭 (RNAi)을 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  63. 제62항에 있어서, RNAi가 shRNA, siRNA, miRNA, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  64. 제63항에 있어서, RNAi가 Ang2를 코딩하는 내인성 핵산과 결합하는 shRNA를 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  65. 제64항에 있어서, RNAi가 서열식별번호: 13과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 Ang2 핵산 서열과 결합하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  66. 제62항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드가 서열식별번호: 81-86 중 어느 하나와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  67. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드가 서열식별번호: 31-34 및 51-77 중 어느 하나와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  68. 제42항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 발현 카세트가 하나 이상의 프로모터, 하나 이상의 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 또는 둘 다를 포함하는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  69. 제42항, 제44항 내지 제57항 및 제66항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, VEGF 억제제 및 Ang1 폴리펩티드가 VEGF 억제제 및 Ang1 폴리펩티드의 부재 하에서의 신생혈관증식 신호전달과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 또는 그 초과만큼 세포에서의 발현 시 신생혈관증식 신호전달을 감소시키는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  70. 제42항, 제44항 내지 제57항 및 제66항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, VEGF 억제제 및 Ang1 폴리펩티드가 2개의 상이한 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드로부터 코딩된 필적하는 VEGF 억제제 및 필적하는 Ang1 폴리펩티드에 의해 감소된 신생혈관증식 신호전달과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 또는 그 초과만큼 세포에서의 발현 시 신생혈관증식 신호전달을 감소시키는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  71. 제43항 내지 제52항 및 제58항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, VEGF 억제제 및 Ang2 억제제가 VEGF 억제제 및 Ang2 억제제의 부재 하에서의 신생혈관증식 신호전달과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 또는 그 초과만큼 세포에서의 발현 시 신생혈관증식 신호전달을 감소시키는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  72. 제43항 내지 제52항 및 제58항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, VEGF 억제제 및 Ang2 억제제가 2개의 상이한 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드로부터 코딩된 필적하는 VEGF 억제제 및 필적하는 Ang2 억제제에 의해 감소된 신생혈관증식 신호전달과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 또는 그 초과만큼 세포에서의 발현 시 신생혈관증식 신호전달을 감소시키는 것인 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드.
  73. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항의 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터.
  74. 제73항에 있어서, 바이러스 벡터가 scAAV 벡터인 바이러스 벡터.
  75. 제73항 또는 제74항에 있어서, 바이러스 벡터가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 AAV 혈청형을 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  76. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항의 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포.
  77. 제76항에 있어서, 세포가 배아 줄기 세포, 배아 줄기 세포-유래 분화된 세포, 망막 색소 상피 (RPE) 세포, 신경 전구 세포, 광수용체 전구 세포, 골수-유래 조혈 줄기 세포, 또는 골수-유래 조혈 줄기 전구 세포를 포함하는 것인 세포.
  78. 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항의 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드 또는 제76항 또는 제77항의 세포를 포함하는 제약 조성물.
  79. 제78항에 있어서, 제약 조성물이 이를 필요로 하는 대상체에게 척수강내로, 안구내로, 유리체내로, 망막으로, 정맥내로, 근육내로, 심실내로, 대뇌내로, 소뇌내로, 뇌실내로, 실질내로, 피하로, 종양내로, 폐로, 기관내로, 복강내로, 방광내로, 질내로, 직장내로, 경구로, 설하로, 경피로, 흡입에 의해, 흡입 연무 형태에 의해, 관강내-GI 경로에 의해, 또는 그의 조합에 의해 투여하기 위해 제형화되는 것인 제약 조성물.
  80. 제78항에 있어서, 제약 조성물이 안구 질환 또는 병태를 치료하기 위한 것인 제약 조성물.
  81. 제78항에 있어서, 제약 조성물이 대상체에서 신생혈관증식, 혈관 누출, 염증, 또는 그의 조합을 감소시키는 것인 제약 조성물.
  82. 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로서, 대상체에게 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항의 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드, 제76항 또는 제77항의 세포, 또는 제78항 내지 제81항 중 어느 한 항의 제약 조성물의 치료상 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  83. 제82항에 있어서, VEGF 억제제 및 RTK/Tie2의 활성화제 또는 RTK/Tie2가 VEGF 억제제 및 RTK/Tie2의 활성화제 또는 RTK/Tie2의 부재 하에서의 신생혈관증식 신호전달과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 또는 그 초과만큼 세포에서의 발현 시 신생혈관증식 신호전달을 감소시키는 것인 방법.
  84. 제82항에 있어서, VEGF 억제제 및 RTK/Tie2의 활성화제 또는 RTK/Tie2가 2개의 상이한 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드로부터 코딩된 필적하는 VEGF 억제제 및 필적하는 RTK/Tie2의 활성화제 또는 필적하는 RTK/Tie2에 의해 감소된 신생혈관증식 신호전달과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 또는 그 초과만큼 세포에서의 신생혈관증식 신호전달을 감소시키는 것인 방법.
  85. 제82항에 있어서, 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항의 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드, 제76항 또는 제77항의 세포, 또는 제78항 내지 제81항 중 어느 한 항의 제약 조성물이 대상체에서 신생혈관증식, 혈관 누출, 염증, 또는 그의 조합을 감소시키는 것인 방법.
  86. 제85항에 있어서, VEGF 억제제 및 RTK/Tie2의 활성화제 또는 RTK/Tie2가 VEGF 억제제 및 RTK/Tie2의 활성화제 또는 RTK/Tie2의 부재 하에서의 신생혈관증식과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 또는 그 초과만큼 세포에서의 신생혈관증식을 감소시키는 것인 방법.
  87. 제85항에 있어서, VEGF 억제제 및 RTK/Tie2의 활성화제 또는 RTK/Tie2가 2개의 상이한 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드로부터 코딩된 필적하는 VEGF 억제제 및 필적하는 RTK/Tie2의 활성화제 또는 필적하는 RTK/Tie2에 의해 감소된 신생혈관증식과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 또는 그 초과만큼 세포에서의 신생혈관증식을 감소시키는 것인 방법.
  88. 제85항에 있어서, VEGF 억제제 및 RTK/Tie2의 활성화제 또는 RTK/Tie2가 VEGF 억제제 및 RTK/Tie2의 활성화제 또는 RTK/Tie2의 부재 하에서의 혈관 누출과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 또는 그 초과만큼 세포에서의 혈관 누출을 감소시키는 것인 방법.
  89. 제85항에 있어서, VEGF 억제제 및 RTK/Tie2의 활성화제 또는 RTK/Tie2가 2개의 상이한 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드로부터 코딩된 필적하는 VEGF 억제제 및 필적하는 RTK/Tie2의 활성화제 또는 필적하는 RTK/Tie2에 의해 감소된 혈관 누출과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 또는 그 초과만큼 세포에서의 혈관 누출을 감소시키는 것인 방법.
  90. 제85항에 있어서, VEGF 억제제 및 RTK/Tie2의 활성화제 또는 RTK/Tie2가 VEGF 억제제 및 RTK/Tie2의 활성화제 또는 RTK/Tie2의 부재 하에서의 염증과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 또는 그 초과만큼 세포에서의 염증을 감소시키는 것인 방법.
  91. 제85항에 있어서, VEGF 억제제 및 RTK/Tie2의 활성화제 또는 RTK/Tie2가 2개의 상이한 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드로부터 코딩된 필적하는 VEGF 억제제 및 필적하는 RTK/Tie2의 활성화제 또는 필적하는 RTK/Tie2에 의해 감소된 염증 신호전달과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 또는 그 초과만큼 세포에서의 염증을 감소시키는 것인 방법.
  92. 제82항에 있어서, 질환 또는 병태가 안구 허혈 증후군, 증식성 망막병증, 신생혈관 녹내장 (NG), 포도막염, 신생혈관 포도막염, 완전색맹, 연령-관련 황반 변성 (nAMD), 당뇨병성 황반 부종 (DME), 당뇨병성 황반 망막병증 (DMR), 망막 정맥 폐색증 (RVO), 녹내장, 바르데-비들 증후군, 베스트병, 맥락막결손, 레베르 선천성 흑암시, 황반 변성, 결절성 맥락막 혈관병증 (PCV), 색소성 망막염, 레프섬병, 스타르가르트병, 어셔 증후군, X-연관 망막층간분리 (XLRS), 간체-추체 이영양증, 추체-간체 이영양증, 오구치병, 말라티아 레벤티네스 (가족성 우성 드루젠) 및 청색 추체 단색형색각을 포함하는 것인 방법.
  93. 제92항에 있어서, 질환 또는 병태가 당뇨병성 황반 부종 (DME)을 포함하는 것인 방법.
  94. 제92항에 있어서, 질환 또는 병태가 당뇨병성 황반 망막병증 (DMR)을 포함하는 것인 방법.
  95. 하기를 포함하는 키트:
    a) 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항의 비-자연 발생 폴리뉴클레오티드, 제76항 또는 제77항의 세포, 또는 제78항 내지 제81항 중 어느 한 항의 제약 조성물; 및
    b) 용기.
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