KR20240043784A - 염증유발성 시토카인의 방출로부터 t 세포-매개 종양 세포독성을 디커플링시키는 단백질 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은 일반적으로, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체, 및 CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체를 포함하는, 표적 종양 세포 사멸을 위한 단백질에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 출원은 ROR1과 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서 본 출원은 또한 암 치료에 있어서 이러한 단백질을 사용하는 치료 방법을 제공한다.
Description
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2021년 8월 9일에 출원된 미국 가출원 번호 63/231,148을 우선권 주장하며, 이 가출원의 전체 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록 XML에 대한 참조
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본 개시내용의 분야
본 개시내용은 일반적으로 종양 세포의 T 세포 세포독성을 유도할 수 있는 이중특이적 단백질, 및 암 치료를 위한 그의 용도에 관한 것이다.
ROR1은 배아 발생 동안 주로 발현되는 세포 표면 티로신 키나제이다. ROR1은 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 세포 및 외투 세포 백혈병 (MCL) 세포를 포함한 혈액 종양 세포, 및 난소, 폐, 위, 췌장, 자궁, 유방 및 전립선의 종양을 포함한 고형 종양 둘 다에서 발현된다. ROR1은 정상적인 성체 조직 (예를 들어, 지방 조직, 프리-B 세포, 췌장섬)에서 제한된 발현을 나타내므로 상대적으로 종양-특이적 종양-연관 항원 ("TAA")으로 간주된다. ROR1-특이적 항체 약물 접합체 (ADC)는 관리 가능한 유해 사례 (AE) 프로파일을 통해 초기 임상 시험에서 유망한 효능을 입증하였다. 그러나, 고형 종양에서 세포 표면 ROR1 발현의 밀도가 낮고 이질적인 특성은 항체 의존성 세포독성 및 ADC를 매개하는 단일특이적 항체를 포함한 많은 면역치료 양식에 대한 문제를 나타낸다.
ADC는 효능을 위해 ADC 내재화의 규모에 의존한다. ROR1 ADC는 CLL 및 MCL을 포함한 ROR1+ 혈액 악성종양에 대한 초기 임상 시험에서 매우 효과적인 것으로 보이지만 이는 적어도 부분적으로 (1) ADC의 침투를 필요로 하는 고형 종양에 비해 혈액 종양에 대한 ADC의 더 큰 접근, 및 (2) 고형 종양에 비해 혈액 종양에 의한 ROR1의 더 높은 빈도와 더 동질적인 발현에 기인할 수 있다.
CD3 이중특이적 항체 (bsAb)는 강력한 기능적 활성을 매개하기 위해 최소한의 수용체 점유를 필요로 한다. TAA-CD3 bsAb는 T 세포 상의 CD3과 종양 세포 상의 표적 TAA 에피토프 간에 브릿지될 때, αβ T 세포, γδ T 세포, NK-T 세포, 조절 T 세포 (Treg), 점막 연관 불변 T (MAIT) 세포, 및 그의 표현형 서브세트를 포함한 모든 CD3+ 림프구를 활성화시킨다. 고형 종양에서, CD8+ 세포독성 T 세포를 포함한 CD3+ 림프구의 상대적 빈도는, 고도로 면역원성이고 염증이 있는 종양, 예컨대 흑색종에서도 종양 세포에 비해 낮다 (일반적으로 CD8+ T 세포당 >10개의 종양 세포). 따라서, CD3 bsAb의 효능은 하나 초과의 종양 세포를 사멸시킬 수 있는 단일 CD8+ T 세포의 능력에 따라 달라지며, 이러한 프로세스는 연쇄 사멸이라고 한다.
이러한 bsAb 브릿지를 통한 TCR/CD3 복합체의 가교는 세포독성 T 세포 서브세트를 우선적으로 활성화시켜 TAA-발현 세포 (그 중 대부분은 종양 세포인 것으로 추정됨)의 사멸과 종양 미세환경 (TME)을 면역억제에서 면역 허용으로 전환시킬 수 있는 염증유발성 시토카인의 방출을 매개한다. Treg의 맥락에서, CD3 bsAb는 Treg를 활성화시켜 면역억제성 시토카인, 예컨대 TGFβ를 분비할 수 있다. 이러한 메커니즘은 혈액 악성종양의 치료를 위한 CD19-표적화 CD3 bsAb인 블리나투모맙의 효능에 영향을 미치는 중요한 요인이다.
그러나, CD3 bsAb는 시토카인 방출 증후군 (CRS) 및 신경독성을 비롯한 잠재적으로 치명적인 AE와 관련이 있다. 따라서 특정 bsAb 치료 후보는 염증유발성 시토카인 (예를 들어, IFNγ, TNFα, IL-2) 방출로부터 종양 세포독성 활성을 디커플링시키는 것을 목표로 삼았다 (예를 들어, 문헌 [Zuch de Zafra et al. (2019) Clin Cancer Res.;25(13):3921-3933.; Trinklein et al. (2019) MAbs.;11(4):639-652.; and Hernandez-Hoyos et al. (2016) Mol Cancer Ther.;15(9):2155-65] 참조).
강력한 종양 세포-표적화된 사멸 활성, 최소한의 오프-타겟 독성, 고형 종양 및/또는 조혈 종양에 대한 확장된 치료 창, 및 관리 가능한 AE 프로파일을 갖춘 새로운 치료법이 절실히 요구된다.
본 개시내용은 일반적으로 종양 세포에 대항하여 강력한 T 세포 세포독성을 유도할 수 있는 이중특이적 단백질, 및 암 치료를 위한 그의 용도를 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 일반적으로 특정 TAA 발현 세포에 대항하여 강력한 T 세포 세포독성을 유도할 수 있고/거나 유도하는 이중특이적 단백질, 및 암 치료를 위한 그의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ROR1+ 종양 세포에 대항하여 강력한 T 세포 세포독성을 유도할 수 있고/거나 유도하는 이중특이적 단백질, 및 암 치료를 위한 그의 용도를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 유의미한 양의 시토카인 방출을 유도하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 특정 TAA 발현 세포에 대항하여 강력한 T 세포 세포독성을 유도하지만 유의미한 양의 시토카인 방출을 유도하지 않는다.
일부 실시양태에서, 특정 TAA 발현 세포에 대항하여 강력한 T 세포 세포독성을 유도하지만 유의미한 양의 시토카인 방출을 유도하지 않는 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 2개의 아암을 포함하며, 제1 아암은 N-말단 단부에서 TAA와 특이적으로 결합하는 제1 성분, 및 C-말단 단부에서 동일한 TAA와 특이적으로 결합하는 제2 성분을 포함하고, 제2 아암은 N-말단 단부에서 CD3과 특이적으로 결합하는 성분을 포함한다.
일부 실시양태에서, 특정 TAA 발현 세포에 대항하여 강력한 T 세포 세포독성을 유도하지만 유의미한 양의 시토카인 방출을 유도하지 않는 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 (i) N-말단에서 C-말단으로, TAA와 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체를 포함하는 제1 성분, 제1 힌지 폴리펩티드, SEED 포맷 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 제1 폴리펩티드, 및 TAA와 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체를 포함하는 제2 성분을 포함하는 제1 아암; 및 (ii) N-말단에서 C-말단으로, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체, 제2 힌지 폴리펩티드, 및 SEED 포맷 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 제2 폴리펩티드를 포함하는 제2 아암을 포함하며, 여기서 SEED 포맷 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 이량체화된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단백질은 브릿징 모이어티의 단부에 연결된 ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체; 및 브릿징 모이어티의 반대쪽 단부에 연결된 CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체를 포함한다.
일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 브릿징 모이어티의 C-말단 단부에 연결되고, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결된다.
일부 실시양태에서, 단백질은 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결된 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 브릿징 모이어티는 2개의 폴리펩티드 아암을 포함하며, 여기서 ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체 및 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체는 동일한 폴리펩티드 아암의 C-말단 단부 및 N-말단 단부에 각각 연결되고, 여기서 CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 제2 폴리펩티드 아암의 N-말단 단부에 연결된다.
일부 실시양태에서, 특정 TAA 발현 종양 세포에 대항하여 강력한 T 세포 세포독성을 유도하지만 유의미한 양의 시토카인 방출을 유도하지 않는 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 (i) N-말단에서 C-말단으로, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체를 포함하는 제1 성분, 제1 힌지 폴리펩티드, SEED 포맷 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 제1 폴리펩티드, 및 ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체를 포함하는 제2 성분을 포함하는 제1 아암; 및 (ii) N-말단에서 C-말단으로, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체, 제2 힌지 폴리펩티드, 및 SEED 포맷 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 제2 폴리펩티드를 포함하는 제2 아암을 포함하며, 여기서 SEED 포맷 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 이량체화된다.
일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결되고, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 브릿징 모이어티의 C-말단 단부에 연결된다.
일부 실시양태에서, 단백질은 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결된 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 브릿징 모이어티는 2개의 폴리펩티드 아암을 포함하며, 여기서 ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체 및 CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 샘플 폴리펩티드 아암의 N-말단 단부 및 C-말단 단부에 각각 연결되고, 여기서 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체는 제2 폴리펩티드 아암의 N-말단 단부에 연결된다.
일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 단일-쇄 가변 단편 (scFv), Fab, Fab', F(ab')2, 미니바디, 및 나노바디 (VHH)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 scFv이다.
일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체는 scFv, Fab, Fab', F(ab')2, 미니바디 및 VHH로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체는 scFv이다.
일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체, 또는 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체는 (i) GFTFTSYA (서열식별번호(SEQ ID NO): 8)의 아미노산 서열 또는 GFSITTSGVS (서열식별번호: 23)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 1 (VHCDR1); (ii) ISGSGGGT (서열식별번호: 9)의 아미노산 서열 또는 IYWDDDK (서열식별번호: 24)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 2 (VHCDR2); (iii) AQGSSIFDY (서열식별번호: 10)의 아미노산 서열 또는 AHAPRYTPGGYFDY (서열식별번호: 25)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 3 (VHCDR3); (iv) QSVSSY (서열식별번호: 11)의 아미노산 서열 또는 QSVSSN (서열식별번호: 26)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 1 (VLCDR1); (v) DAS 또는 GAS의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 2 (VLCDR2); 및 (vi) QQRSNWPPXT (서열식별번호: 13)의 아미노산 서열 (여기서 X는 F, S, C, R, Q, I, L, Y 또는 V임) 또는 QQYKNWPPA (서열식별번호: 28)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 3 (VLCDR3)을 포함한다.
일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체, 또는 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체는 GFTFTSYA (서열식별번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, ISGSGGGT (서열식별번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, AQGSSIFDY (서열식별번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, QSVSSY (서열식별번호: 11)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, DAS의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 QQRSNWPPFT (서열식별번호: 14)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함한다.
일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체, 또는 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체는 GFTFTSYA (서열식별번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, ISGSGGGT (서열식별번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, AQGSSIFDY (서열식별번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, QSVSSY (서열식별번호: 11)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, DAS의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 QQRSNWPPST (서열식별번호: 15)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함한다.
일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체, 또는 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체는 GFSITTSGVS (서열식별번호: 23)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, IYWDDDK (서열식별번호: 24)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, AHAPRYTPGGYFDY (서열식별번호: 25)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, QSVSSN (서열식별번호: 26)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, GAS의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 QQYKNWPPA (서열식별번호: 28)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함한다.
일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체, 또는 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체는, IMGT 고유 넘버링 체계에 따라, 본 개시내용에 열거된 바와 같은 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인의 VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 서열에 상응하는 아미노산 서열을 각각 포함하는 VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3을 포함한다.
일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체, 또는 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체는 서열식별번호: 29 또는 서열식별번호: 39와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 서열 및 서열식별번호: 30, 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 32, 서열식별번호: 33, 서열식별번호: 34, 서열식별번호: 35, 서열식별번호: 36, 서열식별번호: 37, 서열식별번호: 38, 또는 서열식별번호: 40과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체, 또는 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체는 서열식별번호: 29와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 서열 및 서열식별번호: 30과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체, 또는 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체는 서열식별번호: 29와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 서열 및 서열식별번호: 31과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체, 또는 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체는 서열식별번호: 39와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 서열 및 서열식별번호: 40과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체, 또는 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체는 본 출원에 개시된 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인 서열에 상응하는 아미노산 서열을 각각 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체, 또는 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체는 (GGGGS)n (서열식별번호: 1) 서열을 포함하는 링커 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 n은 1 내지 12이다.
일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체, 또는 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체는 서열식별번호: 41, 서열식별번호: 42, 서열식별번호: 43, 서열식별번호: 44, 서열식별번호: 45, 서열식별번호: 46, 서열식별번호: 47, 서열식별번호: 49, 또는 서열식별번호: 59와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체, 또는 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체는 서열식별번호: 41과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체, 또는 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체는 서열식별번호: 42와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체, 또는 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체는 서열식별번호: 59와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체, 또는 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체는 본 개시내용에 열거된 scFv에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함한다.
일부 실시양태에서, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, 미니바디 및 VHH로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 Fab이다.
일부 실시양태에서, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 (i) GFTFNTYA (서열식별번호: 61)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 1 (VHCDR1); (ii) IRSKYNNYAT (서열식별번호: 62)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 2 (VHCDR2); (iii) VRHGNFGX1X2YVSWFAY (서열식별번호: 67)의 아미노산 서열 (여기서 X1은 N, A 또는 E이고, X2는 S 또는 A임)을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 3 (VHCDR3); (iv) TGAVTTSN (서열식별번호: 64)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 1 (VLCDR1); (v) GT의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 2 (VLCDR2); 및 (vi) ALWYSNLWV (서열식별번호: 66)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 3 (VLCDR3)을 포함한다.
일부 실시양태에서, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 GFTFNTYA (서열식별번호: 61)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1; IRSKYNNYAT (서열식별번호: 62)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2; VRHGNFGNSYVSWFAY (서열식별번호: 63)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3; TGAVTTSN (서열식별번호: 64)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1; GT의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2; 및 ALWYSNLWV (서열식별번호: 66)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함한다.
일부 실시양태에서, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 GFTFNTYA (서열식별번호: 61)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1; IRSKYNNYAT (서열식별번호: 62)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2; VRHGNFGASYVSWFAY (서열식별번호: 68)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3; TGAVTTSN (서열식별번호: 64)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1; GT의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2; 및 ALWYSNLWV (서열식별번호: 66)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함한다.
일부 실시양태에서, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는, IMGT 고유 넘버링 체계에 따라, 본 개시내용에 각각 열거된 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인의 VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 서열에 상응하는 아미노산 서열을 각각 포함하는 VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3을 포함한다.
일부 실시양태에서, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 서열식별번호: 71, 서열식별번호: 72, 서열식별번호: 73, 서열식별번호: 74, 서열식별번호: 75, 또는 서열식별번호: 80과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 서열 및 서열식별번호: 76, 서열식별번호: 77, 서열식별번호: 78, 서열식별번호: 79, 또는 서열식별번호: 81과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 서열식별번호: 72와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 서열 및 서열식별번호: 81과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 서열식별번호: 71과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 서열 및 서열식별번호: 76과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는, IMGT 고유 넘버링 체계에 따라, 본 개시내용에 각각 열거된 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인 서열에 상응하는 아미노산 서열을 각각 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 서열식별번호: 82 또는 서열식별번호: 83과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 서열, 및 서열식별번호: 84 또는 서열식별번호: 85와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는, IMGT 고유 넘버링 체계에 따라, 본 개시내용에 각각 열거된 중쇄 및 경쇄의 중쇄 및 경쇄 서열에 상응하는 아미노산 서열을 각각 포함하는 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 브릿징 모이어티는 기능적 또는 비-기능적이다.
일부 실시양태에서, 브릿징 모이어티는 가닥-교환 조작된 도메인 (SEED) 포맷 Fc 도메인 또는 그의 기능적 단편, 이뮤노글로불린 Fc 도메인 또는 그의 기능적 단편, 폴리펩티드 링커, 또는 폴리펩티드 힌지를 포함한다.
일부 실시양태에서, SEED 포맷 Fc 도메인은 하나 또는 하나 초과의 이펙터 기능 침묵 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, SEED 포맷 Fc 도메인은 서열식별번호: 86, 서열식별번호: 117, 또는 서열식별번호: 88과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열식별번호: 87, 서열식별번호: 118, 또는 서열식별번호: 89와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 브릿징 모이어티는 이뮤노글로불린 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이뮤노글로불린 Fc 도메인은 이종이량체화를 촉진하는 하나 또는 하나 초과의 돌연변이를 각각 포함하는 2개의 폴리펩티드 아암을 포함한다.
일부 실시양태에서, 이뮤노글로불린 Fc 도메인은 본 개시내용에 각각 열거된 제1 폴리펩티드 아암 및 제2 폴리펩티드 아암의 제1 폴리펩티드 아암 및 제2 폴리펩티드 아암 서열에 상응하는 아미노산 서열을 각각 포함하는 제1 폴리펩티드 아암 및 제2 폴리펩티드 아암을 포함한다.
일부 실시양태에서, 브릿징 모이어티는 N-말단 단부에 힌지를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 힌지는 서열식별번호: 92로 구성된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 아암을 포함한다.
일부 실시양태에서, 힌지는 서열식별번호: 90 또는 서열식별번호: 92로 구성된 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 아암을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 힌지는 본 개시내용에 열거된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 아암을 포함한다. 일부 실시양태에서, 힌지는 본 개시내용에 열거된 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 아암을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 링커 폴리펩티드에 의해 브릿징 모이어티의 C-말단 단부에 연결된다. 일부 실시양태에서, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 링커 폴리펩티드에 의해 브릿징 모이어티의 C-말단 단부에 연결된다. 일부 실시양태에서, 링커 폴리펩티드는 (GGGGS)n (서열식별번호: 1) 서열을 포함하며, 여기서 n은 1 내지 12이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단백질은 (i) GFTFTSYA (서열식별번호: 8)의 아미노산 서열 또는 GFSITTSGVS (서열식별번호: 23)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 1 (VHCDR1), ISGSGGGT (서열식별번호: 9)의 아미노산 서열 또는 IYWDDDK (서열식별번호: 24)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 2 (VHCDR2), AQGSSIFDY (서열식별번호: 10)의 아미노산 서열 또는 AHAPRYTPGGYFDY (서열식별번호: 25)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 3 (VHCDR3), QSVSSY (서열식별번호: 11)의 아미노산 서열 또는 QSVSSN (서열식별번호: 26)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 1 (VLCDR1), DAS 또는 GAS의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 2 (VLCDR2) 및 QQRSNWPPXT (서열식별번호: 13)의 아미노산 서열 (여기서 X는 F, S, C, R, Q, I, L, Y 또는 V임) 또는 QQYKNWPPA (서열식별번호: 28)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 3 (VLCDR3)을 포함하는, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체; (ii) GFTFNTYA (서열식별번호: 61)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, IRSKYNNYAT (서열식별번호: 62)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, VRHGNFGX1X2YVSWFAY (서열식별번호: 67)의 아미노산 서열 (여기서 X1은 N, A 또는 E이고, X2는 S 또는 A임)을 포함하는 VHCDR3, TGAVTTSN (서열식별번호: 64)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, GT의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 ALWYSNLWV (서열식별번호: 66)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체; 및 (iii) ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체를 CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체에 연결하는 브릿징 모이어티로서, (a) 서열식별번호: 90 및 서열식별번호: 86 또는 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 아암, 및 (b) 서열식별번호: 90 및 서열식별번호: 87, 또는 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 아암을 포함하는 브릿징 모이어티를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단백질은 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결된 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체는 GFTFTSYA (서열식별번호: 8)의 아미노산 서열 또는 GFSITTSGVS (서열식별번호: 23)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, ISGSGGGT (서열식별번호: 9)의 아미노산 서열 또는 IYWDDDK (서열식별번호: 24)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, AQGSSIFDY (서열식별번호: 10)의 아미노산 서열 또는 AHAPRYTPGGYFDY (서열식별번호: 25)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, QSVSSY (서열식별번호: 11)의 아미노산 서열 또는 QSVSSN (서열식별번호: 26)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, DAS 또는 GAS의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 QQRSNWPPXT (서열식별번호: 13)의 아미노산 서열 (여기서 X는 F, S, C, R, Q, I, L, Y 또는 V임) 또는 QQYKNWPPA (서열식별번호: 28)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단백질은 (i) GFTFTSYA (서열식별번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, ISGSGGGT (서열식별번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, AQGSSIFDY (서열식별번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, QSVSSY (서열식별번호: 11)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, DAS의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 QQRSNWPPST (서열식별번호: 15)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체; (ii) GFTFNTYA (서열식별번호: 61)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, IRSKYNNYAT (서열식별번호: 62)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, VRHGNFGNSYVSWFAY (서열식별번호: 63)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, TGAVTTSN (서열식별번호: 64)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, GT의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 ALWYSNLWV (서열식별번호: 66)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체; (iii) ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 N-말단 단부를 CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 C-말단 단부에 연결하는 브릿징 모이어티로서, (a) 서열식별번호: 90 및 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 아암, 및 (b) 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 아암을 포함하는 브릿징 모이어티; 및 (iv) GFTFTSYA (서열식별번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, ISGSGGGT (서열식별번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, AQGSSIFDY (서열식별번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, QSVSSY (서열식별번호: 11)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, DAS의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 QQRSNWPPST (서열식별번호: 15)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는, 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결된 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단백질은 (i) GFTFTSYA (서열식별번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, ISGSGGGT (서열식별번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, AQGSSIFDY (서열식별번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, QSVSSY (서열식별번호: 11)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, DAS의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 QQRSNWPPFT (서열식별번호: 14)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체; (ii) GFTFNTYA (서열식별번호: 61)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, IRSKYNNYAT (서열식별번호: 62)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, VRHGNFGNSYVSWFAY (서열식별번호: 63)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, TGAVTTSN (서열식별번호: 64)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, GT의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 ALWYSNLWV (서열식별번호: 66)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체; (iii) ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 N-말단 단부를 CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 C-말단 단부에 연결하는 브릿징 모이어티로서, (a) 서열식별번호: 90 및 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 아암, 및 (b) 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 아암을 포함하는 브릿징 모이어티; 및 (iv) GFTFTSYA (서열식별번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, ISGSGGGT (서열식별번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, AQGSSIFDY (서열식별번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, QSVSSY(서열식별번호: 11)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, DAS의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 QQRSNWPPFT (서열식별번호: 14)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는, 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결된 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단백질은 (i) GFSITTSGVS (서열식별번호: 23)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, IYWDDDK (서열식별번호: 24)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, AHAPRYTPGGYFDY (서열식별번호: 25)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, QSVSSN (서열식별번호: 26)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, GAS의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 QQYKNWPPA (서열식별번호: 28)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체; (ii) GFTFNTYA (서열식별번호: 61)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, IRSKYNNYAT (서열식별번호: 62)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, VRHGNFGNSYVSWFAY (서열식별번호: 63)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, TGAVTTSN(서열식별번호: 64)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, GT의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 ALWYSNLWV (서열식별번호: 66)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체; (iii) ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 C-말단 단부를 CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 N-말단 단부에 연결하는 브릿징 모이어티로서, (a) 서열식별번호: 90 및 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 아암 및 (b) 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 아암을 포함하는 브릿징 모이어티; 및 (iv) GFSITTSGVS (서열식별번호: 23)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, IYWDDDK (서열식별번호: 24)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, AHAPRYTPGGYFDY (서열식별번호: 25)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, QSVSSN (서열식별번호: 26)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, GAS의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 QQYKNWPPA (서열식별번호: 28)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는, ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단백질은 (i) GFSITTSGVS (서열식별번호: 23)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, IYWDDDK (서열식별번호: 24)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, AHAPRYTPGGYFDY (서열식별번호: 25)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, QSVSSN (서열식별번호: 26)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, GAS의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 QQYKNWPPA (서열식별번호: 28)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체; (ii) GFTFNTYA (서열식별번호: 61)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, IRSKYNNYAT (서열식별번호: 62)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, VRHGNFGNSYVSWFAY (서열식별번호: 63)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, TGAVTTSN (서열식별번호: 64)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, GT의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 ALWYSNLWV (서열식별번호: 66)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체; (iii) ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 C-말단 단부를 CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 N-말단 단부에 연결하는 브릿징 모이어티로서, (a) 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 아암, 및 (b) 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 아암을 포함하는 브릿징 모이어티; 및 (iv) GFSITTSGVS (서열식별번호: 23)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, IYWDDDK (서열식별번호: 24)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, AHAPRYTPGGYFDY (서열식별번호: 25)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, QSVSSN (서열식별번호: 26)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, GAS의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 QQYKNWPPA (서열식별번호: 28)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는, 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결된 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단백질은 (i) 서열식별번호: 29 또는 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH), 및 서열식별번호: 30, 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 32, 서열식별번호: 33; 서열식별번호: 34, 서열식별번호: 35, 서열식별번호: 36, 서열식별번호: 37, 서열식별번호: 38, 또는 서열식별번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체; (ii) 서열식별번호: 71, 서열식별번호: 72, 서열식별번호: 73, 서열식별번호: 74, 서열식별번호: 75, 또는 서열식별번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 76, 서열식별번호: 77, 서열식별번호: 78, 서열식별번호: 79, 또는 서열식별번호: 81의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체; 및 (iii) ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체를 CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체에 연결하는 브릿징 모이어티로서, (a) 서열식별번호: 90 및 서열식별번호: 86, 또는 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 아암, 및 (b) 서열식별번호: 90 및 서열식별번호: 87, 또는 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 아암을 포함하는 브릿징 모이어티을 포함한다.
일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체는 서열식별번호: 29 또는 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 서열식별번호: 30, 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 32, 서열식별번호: 33; 서열식별번호: 34, 서열식별번호: 35, 서열식별번호: 36, 서열식별번호: 37, 서열식별번호: 38, 또는 서열식별번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 단백질은 (i) 서열식별번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체; (ii) 서열식별번호: 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체; (iii) ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 N-말단 단부를 CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 C-말단 단부에 연결하는 브릿징 모이어티로서, 여기서 브릿징 모이어티는 (a) N-말단 단부에 서열식별번호: 92의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 폴리펩티드, 및 (b) 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 및 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 브릿징 모이어티는 (1) 서열식별번호: 90 및 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 아암, 및 (2) 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 아암을 포함하는 것인 브릿징 모이어티; 및 (iv) 서열식별번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결된 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단백질은 (i) 서열식별번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체; (ii) 서열식별번호: 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체; (iii) ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 N-말단 단부를 CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 C-말단 단부에 연결하는 브릿징 모이어티로서, (a) 서열식별번호: 90 및 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 아암, 및 (b) 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 아암을 포함하는 브릿징 모이어티; 및 (iv) 서열식별번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결된 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단백질은 (i) 서열식별번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는, ROR1과 특이적으로 결합하는 scFv; (ii) 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, CD3과 특이적으로 결합하는 Fab; (iii) ROR1과 특이적으로 결합하는 scFv의 N-말단 단부를 CD3과 특이적으로 결합하는 Fab의 C-말단 단부에 연결하는 브릿징 모이어티로서, (a) 서열식별번호: 90 및 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 아암, 및 (b) 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 아암을 포함하는 브릿징 모이어티; 및 (iv) 서열식별번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는, 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결된 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 scFv를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단백질은 (i) 서열식별번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는, ROR1과 특이적으로 결합하는 scFv; (ii) 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, CD3과 특이적으로 결합하는 Fab; (iii) ROR1과 특이적으로 결합하는 scFv의 N-말단 단부를 CD3과 특이적으로 결합하는 Fab의 C-말단 단부에 연결하는 브릿징 모이어티로서, (a) 서열식별번호: 90 및 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 아암, 및 (b) 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 아암을 포함하는 브릿징 모이어티; 및 (iv) 서열식별번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는, 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결된 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 scFv를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단백질은 본 개시내용에 각각 열거된 제1 중쇄의 서열, 제2 중쇄의 서열, 및 경쇄의 서열에 상응하는 아미노산 서열을 각각 포함하는, 제1 중쇄, 제2 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단백질은 생물층 간섭계 검정에서 측정 시 10 nM 내지 50 nM, 또는 15 nM 내지 20 nM의 CD3 결합에 대한 KD를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단백질은 활성화된 T 세포를 사용하는 CD3 결합 검정에서 20 nM 내지 50 nM, 또는 25 nM 내지 35 nM의 EC50을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단백질은 ROR1의 Ig-유사 도메인과 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단백질은 ROR1의 프리즐드(Frizzled) 및/또는 크링글(Kringle) 도메인과 결합하지 않는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단백질은 생물층 간섭계 검정에서 측정 시, 80 nM 내지 120 nM, 95 nM 내지 105 nM, 1 nM 내지 10 nM, 또는 3 nM 내지 5 nM의 TAA 결합에 대한 KD를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단백질은 생물층 간섭계 검정에서 측정 시, 80 nM 내지 120 nM, 95 nM 내지 105 nM, 1 nM 내지 10 nM, 또는 3 nM 내지 5 nM의 ROR1 결합에 대한 KD를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단백질은 약 3.5 X 104개의 TAA 분자/세포를 발현하는 세포를 사용하는 TAA 결합 검정에서 80 nM 내지 120 nM, 90 nM 내지 110 nM, 1 nM 내지 10 nM, 또는 2 nM 내지 5 nM의 EC50을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단백질은 약 3.5 X 104개의 ROR1 분자/세포를 발현하는 세포를 사용하는 ROR1 결합 검정에서 80 nM 내지 120 nM, 90 nM 내지 110 nM, 1 nM 내지 10 nM, 또는 2 nM 내지 5 nM의 EC50을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단백질은 고형 종양의 치료에 사용하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단백질은 혈액 종양의 치료에 사용하기 위한 것이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단백질은 T 세포 용해성 과립 탈과립화를 유도한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단백질은 T 세포/종양 세포 공동-배양 사멸 검정에서 측정 시 TAA-발현 세포의 T 세포 매개 세포독성에 대해 160 pM 내지 200 pM, 165 pM 내지 190 pM, 25 pM 내지 50 pM, 또는 30 pM 내지 40 pM의 EC50을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단백질은 T 세포/종양 세포 공동-배양 사멸 검정에서 측정 시 ROR1-발현 종양 세포의 T 세포 매개 세포독성에 대해 160 pM 내지 200 pM, 165 pM 내지 190 pM, 25 pM 내지 50 pM, 또는 30 pM 내지 40 pM의 EC50을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단백질은 T 세포 매개 세포독성을 유도하기에 충분한 농도로 배양물에 투여될 때 T 세포에 의한 염증유발성 시토카인의 생산 및/또는 방출의 유의미한 증가를 유도하지 않는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단백질은 T 세포/종양 세포 공동-배양 IFNγ 생산 검정에서 측정 시 1000 pM 내지 2000 pM, 1400 pM 내지 1800 pM, 200 pM 내지 600 pM, 또는 300 pM 내지 500 pM의 EC50을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단백질은 T 세포/종양 세포 공동-배양 IFNγ 생산 검정에서 측정 시 참조 T 세포-결합제와 비교하여 20% 내지 60%, 35% 내지 45%, 또는 45% 내지 55%의 Cmax를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단백질은 신선하게 단리된 말초 단핵 세포 (PBMC) 배양물 또는 고밀도에서 48시간 동안 사전 배양된 PBMC에 투여될 때 유의미한 수준의 TNFα 또는 IL2 방출을 유도하지 않는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단백질은 T 세포/종양 세포 공동-배양 사멸 검정 및 IFNγ 생산 검정에서 측정 시 참조 T 세포-결합제에 대해 정규화된 1:2 내지 1:4, 1:2.2 또는 1:2.9의 시토카인 방출 대 사멸 디커플링 비율을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단백질은 T 세포/종양 세포 공동-배양 사멸 검정에서 측정 시 3 내지 5, 3.4 내지 3.6, 또는 3.8 내지 4.2의 종양 연쇄 사멸 지수를 유도한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단백질은 시노몰구스 CD3과 교차-반응성이지만 마우스 CD3과는 그렇지 않다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단백질은 시노몰구스 TAA 및 마우스 TAA와 교차-반응성이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 단백질은 시노몰구스 ROR1 및 마우스 ROR1과 교차-반응성이다.
본 개시내용은 또한 본 발명의 단백질 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제형을 제공한다.
본 개시내용은 또한 본 발명의 단백질을 코딩하는 핵산을 제공한다.
본 개시내용은 본 발명의 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 세포를 추가로 제공한다.
본 개시내용은 환자에게 본 발명의 단백질 또는 제형을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 암은 혈액 암 또는 고형 종양 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 만성 림프구성 백혈병, 외투 세포 림프종, 비-호지킨 림프종, 난소암, 폐암, 기관지암, 결장암, 직장암, 흑색종, 신장암, 위암, 췌장암, 전립선암, 자궁암, 유방암, 구강암, 인두암, 모발상 세포 백혈병, 간암, 간내 담관암, 및 갑상선암으로 이루어진 군으로부터 선택된다
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 기능적 단편은, IMGT 고유 넘버링 체계에 따라, GFTFTSYA (서열식별번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 상보성-결정 영역 1 (VHCDR1), ISGSGGGT (서열식별번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 상보성-결정 영역 2 (VHCDR2), AQGSSIFDY (서열식별번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 상보성-결정 영역 3 (VHCDR3), QSVSSY (서열식별번호: 11)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 상보성-결정 영역 1 (VLCDR1), DAS의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 상보성-결정 영역 2 (VLCDR2), 및 QQRSNWPPFT (서열식별번호: 14)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 상보성-결정 영역 3 (VLCDR3)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 29와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 서열식별번호: 30과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는, IMGT 고유 넘버링 체계에 따라, GFTFTSYA (서열식별번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 상보성-결정 영역 1 (VHCDR1), ISGSGGGT (서열식별번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 상보성-결정 영역 2 (VHCDR2), AQGSSIFDY (서열식별번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 상보성-결정 영역 3 (VHCDR3), QSVSSY (서열식별번호: 11)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 상보성-결정 영역 1 (VLCDR1), DAS의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 상보성-결정 영역 2 (VLCDR2), 및 QQRSNWPPST (서열식별번호: 15)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 상보성-결정 영역 3 (VLCDR3)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 39와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 서열식별번호: 40과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 IgG1 항체이다
본 개시내용의 다른 실시양태 및 세부사항은 하기에 제시되어 있다.
도 1a 및 1b는 브릿징 모이어티, 종양-연관 항원 ("TAA") (예를 들어, ROR1)과 특이적으로 결합하는 제1 scFv, CD3과 특이적으로 결합하는 Fab, 및 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 scFv를 포함하는 이중특이적 T 세포-참여인자 (TCE)의 단백질 설계에 대한 도식적 예시를 제공한다. 도 1a는 "포맷 1A"의 예시적인 이중특이적 TCE의 도식적 예시이며, 여기서 TAA (예를 들어, ROR1)와 특이적으로 결합하는 제1 scFv는 브릿징 모이어티의 C-말단 단부에 연결되고, CD3과 특이적으로 결합하는 Fab는 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결되고, TAA (예를 들어, ROR1)와 특이적으로 결합하는 제2 scFv는 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결된다. 도 1b는 "포맷 1B"의 예시적인 이중특이적 TCE의 도식적 예시이며, 여기서 TAA (예를 들어, ROR1)와 특이적으로 결합하는 제1 scFv는 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결되고, CD3과 특이적으로 결합하는 Fab는 브릿징 모이어티의 C-말단 단부에 연결되고, TAA (예를 들어, ROR1)와 특이적으로 결합하는 제2 scFv는 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결된다.
도 2a 내지 2d는 Jurkat T 세포 (도 2a), 시노몰구스 범-T 세포 (도 2b), 인간 CD3 녹인 C57BL/6 마우스로부터 단리된 T 세포 (도 2c), 또는 인간 CD3 녹아웃 Jurkat T 세포 (도 2d) 상의 인간 또는 시노몰구스 CD3에 대한, 포맷 1A 및 포맷 1B의 69A02 및/또는 82H02 이중특이적 TCE, 인간 IgG1 이소타입 대조군 (hIgG2), 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제), 또는 포맷 1A 또는 포맷 1B의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE (Ref. Frz-결합 TCE)의 CD3-결합 폴리펩티드 아암의 겉보기 결합 친화도를 나타내는 그래프이다.
도 3a 내지 3d는 hROR1+ MDA-MB-231 세포 (도 3a), hROR1- T47D 세포 (도 3b), 인간 ROR1을 과다 발현하도록 조작된 4T1 세포 (도 3c), 또는 뮤린 ROR1을 과다 발현하도록 조작된 4T1 세포 (도 3d) 상의 인간 ROR1에 대한, 포맷 1A 및 포맷 1B의 69A02 및/또는 82H02 이중특이적 TCE, 인간 IgG1 이소타입 대조군 (이소타입 대조군), 및 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제), 또는 포맷 1A 또는 포맷 1B의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE (Ref. Frz-결합 TCE)의 ROR1-결합 폴리펩티드 아암의 겉보기 결합 친화도를 나타내는 그래프이다.
도 4a 및 4b는 hROR1+ MDA-MB-231 종양 세포 (도 4a), 또는 hROR1- T47D 종양 세포 (도 4b)와 24시간 동안 공동-배양된 신선하게 단리된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에 대한, 포맷 1A 또는 포맷 1B의 69A02 및/또는 82H02 이중특이적 TCE, 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제), 또는 포맷 1A의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE (Ref. Frz-결합 TCE 1A)에 의한 세포독성 활성 유도의 적정을 나타내는 그래프이다. 도 4c 및 4d는 hROR1+ MDA-MB-231 종양 세포 (도 4c), 또는 hROR1- T47D 종양 세포 (도 4d)와 24시간 동안 공동-배양된 신선하게 단리된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에 대한, 포맷 1A 또는 포맷 1B의 69A02 및/또는 82H02 이중특이적 TCE, 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제), 또는 포맷 1A의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE (Ref. Frz-결합 TCE 1A)에 의한 IFNγ 방출 유도의 적정을 나타내는 그래프이다. 도 4e는 세포독성 활성 유도가, 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제)에 의해 달성된 값에 대해 정규화된 포맷 1A 또는 포맷 1B의 69A02 또는 82H02 이중특이적 TCE, 또는 포맷 1A의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE (Ref. Frz-결합 TCE 1A)에 의해 염증유발성 시토카인 방출 유도로부터 디커플링되는 규모를 나타내는 막대 그래프이다.
도 5a는 hROR1+ MDA-MB-231 종양 세포와 24시간 동안 공동-배양된 CD8+ T 세포에 대한, 포맷 1A 또는 포맷 1B의 69A02 또는 82H02 이중특이적 TCE, 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제), 또는 포맷 1A의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE (Ref. Frz-결합 TCE 1A)에 의한 세포독성 활성 유도의 적정을 나타내는 그래프이다. 도 5b는 hROR1+ MDA-MB-231 종양 세포와 24시간 동안 공동-배양된 CD8+ T 세포에 대한, 포맷 1A 또는 포맷 1B의 69A02 또는 82H02 이중특이적 TCE, 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제), 또는 포맷 1A의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE (Ref. Frz-결합 TCE 1A)에 의한 IFNγ 생산 유도의 적정을 나타내는 그래프이다. 도 5c 및 도 5d는 MCF-7 종양 세포 및 T47D 세포와 각각 24시간 동안 공동-배양된 CD8+ T 세포에 대한, 포맷 1A 또는 포맷 1B의 69A02 이중특이적 TCE, 또는 포맷 1A 또는 포맷 1B의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE (Ref. Frz-결합 TCE)에 의한 IFNγ 생산 유도의 적정을 나타내는 그래프이다.
도 6a는 포맷 1A 또는 포맷 1B의 69A02 또는 82H02 이중특이적 TCE, 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제), 또는 포맷 1A 또는 포맷 1B의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE (Ref. Frz-결합 TCE)의 존재 하에, 삼중 음성 유방암 (TNBC) 생검으로부터 확장된 종양 침윤 림프구 (TIL)에 의한 hROR1+ NCI-H1975 종양 세포의 연쇄 사멸 빈도를 나타내는 막대 그래프이다. 도 6b는 포맷 1A 또는 포맷 1B의 69A02 또는 82H02 이중특이적 TCE, 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제), 또는 포맷 1A 또는 포맷 1B의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE (Ref. Frz-결합 TCE)의 존재 하에, TNBC 생검으로부터 확장된 TIL에 의한 hROR1- T47D 종양 세포의 연쇄 사멸 빈도를 나타내는 막대 그래프이다.
도 7a는 hROR1+ Du-145, A549, NCI-H1975, MDA-MB-231, NCCIT 종양 세포, 또는 hROR1- MCF-7 종양 세포와 24시간 동안 공동-배양된 신선하게 단리된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에 대한, 포맷 1A의 82H02 이중특이적 TCE (82H02 TCE 1A), 또는 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제)에 의한 세포독성 활성 유도의 적정을 나타내는 그래프이다. 도 7b는 hROR1+ Du-145, A549, NCI-H1975, MDA-MB-231, NCCIT 종양 세포, 또는 hROR1- MCF-7 종양 세포와 24시간 동안 공동-배양된 신선하게 단리된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에 대한, 포맷 1A의 82H02 이중특이적 TCE (82H02 TCE 1A), 또는 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제)에 의한 IFNγ 방출 유도의 적정을 나타내는 그래프이다. 도 7c는 hROR1+ Du-145, A549, NCI-H1975, MDA-MB-231, NCCIT 종양 세포, 또는 hROR1- MCF-7 종양 세포와 24시간 동안 공동-배양된 신선하게 단리된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에 대한, 포맷 1B의 82H02 이중특이적 TCE (82H02 TCE 1B), 또는 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제)에 의한 세포독성 활성 유도의 적정을 나타내는 그래프이다. 도 7d는 hROR1+ Du-145, A549, NCI-H1975, MDA-MB-231, NCCIT 종양 세포, 또는 hROR1- MCF-7 종양 세포와 24시간 동안 공동-배양된 신선하게 단리된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에 대한, 포맷 1B의 82H02 이중특이적 TCE (82H02 TCE 1B), 또는 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제)에 의한 IFNγ 방출 유도의 적정을 나타내는 그래프이다. 도 7e는 hROR1+ Du-145, A549, NCI-H1975, MDA-MB-231, NCCIT 종양 세포, 또는 hROR1- MCF-7 종양 세포와 24시간 동안 공동-배양된 신선하게 단리된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에 대한, 포맷 1A의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE (Ref. Frz-결합 TCE), 또는 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제)에 의한 세포독성 활성 유도의 적정을 나타내는 그래프이다. 도 7f는 hROR1+ Du-145, A549, NCI-H1975, MDA-MB-231, NCCIT 종양 세포, 또는 hROR1- MCF-7 종양 세포와 24시간 동안 공동-배양된 신선하게 단리된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에 대한, 포맷 1A의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE (Ref. Frz-결합 TCE), 또는 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제)에 의한 IFNγ 방출 유도의 적정을 나타내는 그래프이다.
도 8a 및 8b는 hROR1+ MDA-MB-231 종양 세포와 24시간 동안 공동-배양된 인간 CD8+ T 세포 (도 8a) 또는 시노몰구스 CD8+ T 세포 (도 8b)에 대한, 포맷 1A 또는 포맷 1B의 82H02 이중특이적 TCE, 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제), 또는 포맷 1A 또는 포맷 1B의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE (Ref. Frz-결합 TCE)에 의한 세포독성 활성 유도의 적정을 나타내는 그래프이다. 도 8c 및 도 8d는 hROR1+ MDA-MB-231 종양 세포와 24시간 동안 공동-배양된 인간 CD8+ T 세포 (도 8c) 또는 시노몰구스 CD8+ T 세포 (도 8d)에 대한, 포맷 1A 또는 포맷 1B의 82H02 이중특이적 TCE, 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제), 또는 포맷 1A 또는 포맷 1B의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE (Ref. Frz-결합 TCE)에 의한 IFNγ 방출 유도의 적정을 나타내는 그래프이다.
도 9a 및 9c는 인간 ROR1+ 4T1 종양 세포 (도 9a) 또는 뮤린 ROR1+ 4T1 종양 세포 (도 9c)와 24시간 동안 공동-배양된 인간 CD3ε 녹인 마우스로부터 신선하게 단리된 비장세포에 대한, 포맷 1A 또는 포맷 1B의 82H02 이중특이적 TCE, 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제), 또는 포맷 1A 또는 포맷 1B의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE (Ref. Frz-결합 TCE)에 의한 세포독성 활성 유도의 적정을 나타내는 그래프이다. 도 9b 및 9d는 인간 ROR1+ 4T1 종양 세포 (도 9b) 또는 뮤린 ROR1+ 4T1 종양 세포 (도 9d)와 24시간 동안 공동-배양된 인간 CD3ε 녹인 마우스로부터 신선하게 단리된 비장세포에 대한, 포맷 1A 또는 포맷 1B의 82H02 이중특이적 TCE, 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제), 또는 포맷 1A 또는 포맷 1B의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE (Ref. Frz-결합 TCE)에 의한 IFNγ 방출 유도의 적정을 나타내는 그래프이다. 도 9e 및 9f는 hROR-1+ 4T1 종양 세포 (도 9e) 또는 mROR1+ 4T1 종양 세포 (도 9f)에 대항한 세포독성 활성 유도가, 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제)에 의해 달성된 값에 대해 정규화된, 포맷 1A 또는 포맷 1B의 82H02 이중특이적 TCE, 또는 포맷 1A 또는 포맷 1B의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE (Ref. Frz-결합 TCE)에 의해 염증유발성 시토카인 방출 유도로부터 디커플링되는 규모를 나타내는 막대 그래프이다.
도 10a 내지 10d는 1.0 X 107개 세포/ml의 세포 밀도로 배양된 건강한 인간 공여자로부터 신선하게 단리된 PBMC에 대한, 포맷 1A 또는 포맷 1B의 82H02 이중특이적 TCE, OKT3 α-CD3 양성 대조군 (OKT3), hIgG1 이소타입 대조군 (hIgG1), 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제), 또는 포맷 1A 또는 포맷 1B의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE (Ref. Frz-결합 TCE)에 의한 IFNγ (도 10a), TNFα (도 10b), IL-10 (도 10c) 또는 IL-2 (도 10d) 방출 유도의 적정을 나타내는 그래프이다.
도 11a 내지 11d는 1 X 107개 세포/ml의 세포 밀도로 48시간 동안 사전 배양된 건강한 인간 공여자로부터의 PBMC에 대한, 포맷 1A 또는 포맷 1B의 82H02 이중특이적 TCE, OKT3 α-CD3 양성 대조군 (OKT3), hIgG1 이소타입 대조군 (hIgG1), 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제), 또는 포맷 1A 또는 포맷 1B의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE (Ref. Frz-결합 TCE)에 의한 IFNγ (도 11a), TNFα (도 11b), IL-10 (도 11c) 또는 IL-2 (도 11d) 방출 유도의 적정을 나타내는 그래프이다.
도 12a 및 12b는 인간 CD8+ 세포 (도 12a) 또는 시노몰구스 범-T 세포 (도 12b)에 대한, 포맷 1A의 4개 서열 최적화된 82H02 이중특이적 TCE (82H02 TCE #1, 82H02 TCE #2, 82H02 TCE #3, 82H02 TCE #4), 인간 IgG1 이소타입 대조군 (hIgG1), 또는 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제)의 CD3-결합 폴리펩티드 아암의 겉보기 결합 친화도를 나타내는 그래프이다.
도 13a 내지 13d는 MDA-MB-231 종양 세포 (도 13a 및 도 13b) 또는 mROR1+ 4T1 종양 세포 (도 13c 및 도 13d)에 대한, 포맷 1A의 서열 최적화된 82H02 이중특이적 TCE (도 13a; 82H02 #1, 82H02 #2, 도 13b; 82H02 #3, 82H02 #4), 인간 IgG1 이소타입 대조군 (hIgG1), 또는 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제)의 ROR1-결합 폴리펩티드 아암의 겉보기 결합 친화도를 나타내는 그래프이다.
도 14a는 hROR1+ MDA-MB-231 종양 세포와 24시간 동안 공동-배양된 신선하게 단리된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에 대한, 포맷 1A의 4개의 서열 최적화된 82H02 이중특이적 TCE (82H02 TCE #1, 82H02 TCE #2, 82H02 TCE #3, 82H02 TCE #4), 또는 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제)에 의한 세포독성 활성 유도의 적정을 나타내는 그래프이다. 도 14b는 hROR1+ MDA-MB-231 종양 세포와 24시간 동안 공동-배양된 신선하게 단리된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에 대한, 포맷 1A의 4개의 서열 최적화된 82H02 이중특이적 TCE (82H02 TCE #1, 82H02 TCE #2, 82H02 TCE #3, 82H02 TCE #4), 또는 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제)에 의한 IFNγ 방출 유도의 적정을 나타내는 그래프이다. 도 14c는 세포독성 활성의 유도가, 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제)에 의해 달성된 값에 대해 정규화된, 포맷 1A의 4개의 서열 최적화된 82H02 이중특이적 TCE (82H02 TCE #1, 82H02 TCE #2, 82H02 TCE #3, 82H02 TCE #4)에 의한 염증유발성 시토카인 방출의 유도로부터 디커플링되는 규모를 나타내는 막대 그래프이다.
도 15는 포맷 1A의 4개의 서열 최적화된 82H02 이중특이적 TCE (82H02 TCE #1, 82H02 TCE #2, 82H02 TCE #3, 82H02 TCE #4), 또는 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제)의 존재 하에, 삼중 음성 유방암 (TNBC) 생검으로부터 확장된 종양 침윤 림프구 (TIL)에 의한 hROR1+ NCI-H1975 종양 세포의 연쇄 사멸 빈도를 나타내는 막대 그래프이다.
도 16a 내지 16f는 대략 7 X 106개 (도 16a), 1.3 X 106개 (도 16b), 6 X 105개 (도 16c), 4 X 105개 (도 16d), 2 X 105개 (도 16e) 분자/세포의 hROR1 발현의 세포 표면 밀도를 갖는 MDA-MB-231 종양 세포, 또는 hROR1 녹아웃 세포 (도 16f)와 24시간 동안 공동-배양된 신선하게 단리된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에 대한, 포맷 1A의 4개의 서열 최적화된 82H02 이중특이적 TCE (82H02 TCE #1, 82H02 TCE #2, 82H02 TCE #3, 82H02 TCE #4), 또는 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제)에 의한 세포독성 활성 유도의 적정을 나타내는 그래프이다.
도 17a 내지 17f는 대략 7 X 106개 (도 17a), 1.3 X 106개 (도 17b), 6 X 105개 (도 17c), 4 X 105개 (도 17d), 2 X 105개 (도 17e) 분자/세포의 hROR1 발현의 세포 표면 밀도를 갖는 MDA-MB-231 종양 세포, 또는 hROR1 녹아웃 세포 (도 17f)와 24시간 동안 공동-배양된 신선하게 단리된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에 대한, 포맷 1A의 4개의 서열 최적화된 82H02 이중특이적 TCE (82H02 TCE #1, 82H02 TCE #2, 82H02 TCE #3, 82H02 TCE #4), 또는 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제)에 의한 IFNγ 방출 유도의 적정을 나타내는 그래프이다.
도 18은 대략 2 X 105개, 4 X 105개, 6 X 105개, 1.3 X 106개, 또는 약 7 X 106개 분자/세포의 hROR1 발현의 세포 표면 밀도를 갖는 MDA-MB-231 종양 세포에 대항한 세포독성 활성의 유도가, 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제)에 의해 달성된 값에 대해 정규화된, 포맷 1A의 4개의 서열 최적화된 82H02 이중특이적 TCE (82H02 TCE #1, 82H02 TCE #2, 82H02 TCE #3, 82H02 TCE #4)에 의해 염증유발성 시토카인 방출의 유도로부터 디커플링되는 규모를 나타내는 막대 그래프이다.
도 19는 scFv-Fc 포맷의 본 개시내용의 ROR1-결합 클론 (82H02 scFv-Fc 및 69A02 scFv-Fc), scFv 포맷의 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제 scFv-Fc), 또는 scFv-Fc 포맷의 참조 프리즐드-결합 클론 (Ref. Frz-결합 scFv-Fc)으로 미리 처리된 다음, 경쟁 결합 검정에서 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 647-접합된 제논(Zenon) 단편으로 표지된 82H02 scFv-Fc와 함께 인큐베이션된 NCCIT 세포 배양물의 평균 형광 강도 (MFI)를 나타내는 그래프이다.
도 2a 내지 2d는 Jurkat T 세포 (도 2a), 시노몰구스 범-T 세포 (도 2b), 인간 CD3 녹인 C57BL/6 마우스로부터 단리된 T 세포 (도 2c), 또는 인간 CD3 녹아웃 Jurkat T 세포 (도 2d) 상의 인간 또는 시노몰구스 CD3에 대한, 포맷 1A 및 포맷 1B의 69A02 및/또는 82H02 이중특이적 TCE, 인간 IgG1 이소타입 대조군 (hIgG2), 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제), 또는 포맷 1A 또는 포맷 1B의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE (Ref. Frz-결합 TCE)의 CD3-결합 폴리펩티드 아암의 겉보기 결합 친화도를 나타내는 그래프이다.
도 3a 내지 3d는 hROR1+ MDA-MB-231 세포 (도 3a), hROR1- T47D 세포 (도 3b), 인간 ROR1을 과다 발현하도록 조작된 4T1 세포 (도 3c), 또는 뮤린 ROR1을 과다 발현하도록 조작된 4T1 세포 (도 3d) 상의 인간 ROR1에 대한, 포맷 1A 및 포맷 1B의 69A02 및/또는 82H02 이중특이적 TCE, 인간 IgG1 이소타입 대조군 (이소타입 대조군), 및 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제), 또는 포맷 1A 또는 포맷 1B의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE (Ref. Frz-결합 TCE)의 ROR1-결합 폴리펩티드 아암의 겉보기 결합 친화도를 나타내는 그래프이다.
도 4a 및 4b는 hROR1+ MDA-MB-231 종양 세포 (도 4a), 또는 hROR1- T47D 종양 세포 (도 4b)와 24시간 동안 공동-배양된 신선하게 단리된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에 대한, 포맷 1A 또는 포맷 1B의 69A02 및/또는 82H02 이중특이적 TCE, 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제), 또는 포맷 1A의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE (Ref. Frz-결합 TCE 1A)에 의한 세포독성 활성 유도의 적정을 나타내는 그래프이다. 도 4c 및 4d는 hROR1+ MDA-MB-231 종양 세포 (도 4c), 또는 hROR1- T47D 종양 세포 (도 4d)와 24시간 동안 공동-배양된 신선하게 단리된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에 대한, 포맷 1A 또는 포맷 1B의 69A02 및/또는 82H02 이중특이적 TCE, 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제), 또는 포맷 1A의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE (Ref. Frz-결합 TCE 1A)에 의한 IFNγ 방출 유도의 적정을 나타내는 그래프이다. 도 4e는 세포독성 활성 유도가, 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제)에 의해 달성된 값에 대해 정규화된 포맷 1A 또는 포맷 1B의 69A02 또는 82H02 이중특이적 TCE, 또는 포맷 1A의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE (Ref. Frz-결합 TCE 1A)에 의해 염증유발성 시토카인 방출 유도로부터 디커플링되는 규모를 나타내는 막대 그래프이다.
도 5a는 hROR1+ MDA-MB-231 종양 세포와 24시간 동안 공동-배양된 CD8+ T 세포에 대한, 포맷 1A 또는 포맷 1B의 69A02 또는 82H02 이중특이적 TCE, 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제), 또는 포맷 1A의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE (Ref. Frz-결합 TCE 1A)에 의한 세포독성 활성 유도의 적정을 나타내는 그래프이다. 도 5b는 hROR1+ MDA-MB-231 종양 세포와 24시간 동안 공동-배양된 CD8+ T 세포에 대한, 포맷 1A 또는 포맷 1B의 69A02 또는 82H02 이중특이적 TCE, 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제), 또는 포맷 1A의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE (Ref. Frz-결합 TCE 1A)에 의한 IFNγ 생산 유도의 적정을 나타내는 그래프이다. 도 5c 및 도 5d는 MCF-7 종양 세포 및 T47D 세포와 각각 24시간 동안 공동-배양된 CD8+ T 세포에 대한, 포맷 1A 또는 포맷 1B의 69A02 이중특이적 TCE, 또는 포맷 1A 또는 포맷 1B의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE (Ref. Frz-결합 TCE)에 의한 IFNγ 생산 유도의 적정을 나타내는 그래프이다.
도 6a는 포맷 1A 또는 포맷 1B의 69A02 또는 82H02 이중특이적 TCE, 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제), 또는 포맷 1A 또는 포맷 1B의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE (Ref. Frz-결합 TCE)의 존재 하에, 삼중 음성 유방암 (TNBC) 생검으로부터 확장된 종양 침윤 림프구 (TIL)에 의한 hROR1+ NCI-H1975 종양 세포의 연쇄 사멸 빈도를 나타내는 막대 그래프이다. 도 6b는 포맷 1A 또는 포맷 1B의 69A02 또는 82H02 이중특이적 TCE, 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제), 또는 포맷 1A 또는 포맷 1B의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE (Ref. Frz-결합 TCE)의 존재 하에, TNBC 생검으로부터 확장된 TIL에 의한 hROR1- T47D 종양 세포의 연쇄 사멸 빈도를 나타내는 막대 그래프이다.
도 7a는 hROR1+ Du-145, A549, NCI-H1975, MDA-MB-231, NCCIT 종양 세포, 또는 hROR1- MCF-7 종양 세포와 24시간 동안 공동-배양된 신선하게 단리된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에 대한, 포맷 1A의 82H02 이중특이적 TCE (82H02 TCE 1A), 또는 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제)에 의한 세포독성 활성 유도의 적정을 나타내는 그래프이다. 도 7b는 hROR1+ Du-145, A549, NCI-H1975, MDA-MB-231, NCCIT 종양 세포, 또는 hROR1- MCF-7 종양 세포와 24시간 동안 공동-배양된 신선하게 단리된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에 대한, 포맷 1A의 82H02 이중특이적 TCE (82H02 TCE 1A), 또는 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제)에 의한 IFNγ 방출 유도의 적정을 나타내는 그래프이다. 도 7c는 hROR1+ Du-145, A549, NCI-H1975, MDA-MB-231, NCCIT 종양 세포, 또는 hROR1- MCF-7 종양 세포와 24시간 동안 공동-배양된 신선하게 단리된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에 대한, 포맷 1B의 82H02 이중특이적 TCE (82H02 TCE 1B), 또는 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제)에 의한 세포독성 활성 유도의 적정을 나타내는 그래프이다. 도 7d는 hROR1+ Du-145, A549, NCI-H1975, MDA-MB-231, NCCIT 종양 세포, 또는 hROR1- MCF-7 종양 세포와 24시간 동안 공동-배양된 신선하게 단리된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에 대한, 포맷 1B의 82H02 이중특이적 TCE (82H02 TCE 1B), 또는 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제)에 의한 IFNγ 방출 유도의 적정을 나타내는 그래프이다. 도 7e는 hROR1+ Du-145, A549, NCI-H1975, MDA-MB-231, NCCIT 종양 세포, 또는 hROR1- MCF-7 종양 세포와 24시간 동안 공동-배양된 신선하게 단리된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에 대한, 포맷 1A의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE (Ref. Frz-결합 TCE), 또는 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제)에 의한 세포독성 활성 유도의 적정을 나타내는 그래프이다. 도 7f는 hROR1+ Du-145, A549, NCI-H1975, MDA-MB-231, NCCIT 종양 세포, 또는 hROR1- MCF-7 종양 세포와 24시간 동안 공동-배양된 신선하게 단리된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에 대한, 포맷 1A의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE (Ref. Frz-결합 TCE), 또는 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제)에 의한 IFNγ 방출 유도의 적정을 나타내는 그래프이다.
도 8a 및 8b는 hROR1+ MDA-MB-231 종양 세포와 24시간 동안 공동-배양된 인간 CD8+ T 세포 (도 8a) 또는 시노몰구스 CD8+ T 세포 (도 8b)에 대한, 포맷 1A 또는 포맷 1B의 82H02 이중특이적 TCE, 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제), 또는 포맷 1A 또는 포맷 1B의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE (Ref. Frz-결합 TCE)에 의한 세포독성 활성 유도의 적정을 나타내는 그래프이다. 도 8c 및 도 8d는 hROR1+ MDA-MB-231 종양 세포와 24시간 동안 공동-배양된 인간 CD8+ T 세포 (도 8c) 또는 시노몰구스 CD8+ T 세포 (도 8d)에 대한, 포맷 1A 또는 포맷 1B의 82H02 이중특이적 TCE, 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제), 또는 포맷 1A 또는 포맷 1B의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE (Ref. Frz-결합 TCE)에 의한 IFNγ 방출 유도의 적정을 나타내는 그래프이다.
도 9a 및 9c는 인간 ROR1+ 4T1 종양 세포 (도 9a) 또는 뮤린 ROR1+ 4T1 종양 세포 (도 9c)와 24시간 동안 공동-배양된 인간 CD3ε 녹인 마우스로부터 신선하게 단리된 비장세포에 대한, 포맷 1A 또는 포맷 1B의 82H02 이중특이적 TCE, 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제), 또는 포맷 1A 또는 포맷 1B의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE (Ref. Frz-결합 TCE)에 의한 세포독성 활성 유도의 적정을 나타내는 그래프이다. 도 9b 및 9d는 인간 ROR1+ 4T1 종양 세포 (도 9b) 또는 뮤린 ROR1+ 4T1 종양 세포 (도 9d)와 24시간 동안 공동-배양된 인간 CD3ε 녹인 마우스로부터 신선하게 단리된 비장세포에 대한, 포맷 1A 또는 포맷 1B의 82H02 이중특이적 TCE, 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제), 또는 포맷 1A 또는 포맷 1B의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE (Ref. Frz-결합 TCE)에 의한 IFNγ 방출 유도의 적정을 나타내는 그래프이다. 도 9e 및 9f는 hROR-1+ 4T1 종양 세포 (도 9e) 또는 mROR1+ 4T1 종양 세포 (도 9f)에 대항한 세포독성 활성 유도가, 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제)에 의해 달성된 값에 대해 정규화된, 포맷 1A 또는 포맷 1B의 82H02 이중특이적 TCE, 또는 포맷 1A 또는 포맷 1B의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE (Ref. Frz-결합 TCE)에 의해 염증유발성 시토카인 방출 유도로부터 디커플링되는 규모를 나타내는 막대 그래프이다.
도 10a 내지 10d는 1.0 X 107개 세포/ml의 세포 밀도로 배양된 건강한 인간 공여자로부터 신선하게 단리된 PBMC에 대한, 포맷 1A 또는 포맷 1B의 82H02 이중특이적 TCE, OKT3 α-CD3 양성 대조군 (OKT3), hIgG1 이소타입 대조군 (hIgG1), 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제), 또는 포맷 1A 또는 포맷 1B의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE (Ref. Frz-결합 TCE)에 의한 IFNγ (도 10a), TNFα (도 10b), IL-10 (도 10c) 또는 IL-2 (도 10d) 방출 유도의 적정을 나타내는 그래프이다.
도 11a 내지 11d는 1 X 107개 세포/ml의 세포 밀도로 48시간 동안 사전 배양된 건강한 인간 공여자로부터의 PBMC에 대한, 포맷 1A 또는 포맷 1B의 82H02 이중특이적 TCE, OKT3 α-CD3 양성 대조군 (OKT3), hIgG1 이소타입 대조군 (hIgG1), 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제), 또는 포맷 1A 또는 포맷 1B의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE (Ref. Frz-결합 TCE)에 의한 IFNγ (도 11a), TNFα (도 11b), IL-10 (도 11c) 또는 IL-2 (도 11d) 방출 유도의 적정을 나타내는 그래프이다.
도 12a 및 12b는 인간 CD8+ 세포 (도 12a) 또는 시노몰구스 범-T 세포 (도 12b)에 대한, 포맷 1A의 4개 서열 최적화된 82H02 이중특이적 TCE (82H02 TCE #1, 82H02 TCE #2, 82H02 TCE #3, 82H02 TCE #4), 인간 IgG1 이소타입 대조군 (hIgG1), 또는 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제)의 CD3-결합 폴리펩티드 아암의 겉보기 결합 친화도를 나타내는 그래프이다.
도 13a 내지 13d는 MDA-MB-231 종양 세포 (도 13a 및 도 13b) 또는 mROR1+ 4T1 종양 세포 (도 13c 및 도 13d)에 대한, 포맷 1A의 서열 최적화된 82H02 이중특이적 TCE (도 13a; 82H02 #1, 82H02 #2, 도 13b; 82H02 #3, 82H02 #4), 인간 IgG1 이소타입 대조군 (hIgG1), 또는 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제)의 ROR1-결합 폴리펩티드 아암의 겉보기 결합 친화도를 나타내는 그래프이다.
도 14a는 hROR1+ MDA-MB-231 종양 세포와 24시간 동안 공동-배양된 신선하게 단리된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에 대한, 포맷 1A의 4개의 서열 최적화된 82H02 이중특이적 TCE (82H02 TCE #1, 82H02 TCE #2, 82H02 TCE #3, 82H02 TCE #4), 또는 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제)에 의한 세포독성 활성 유도의 적정을 나타내는 그래프이다. 도 14b는 hROR1+ MDA-MB-231 종양 세포와 24시간 동안 공동-배양된 신선하게 단리된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에 대한, 포맷 1A의 4개의 서열 최적화된 82H02 이중특이적 TCE (82H02 TCE #1, 82H02 TCE #2, 82H02 TCE #3, 82H02 TCE #4), 또는 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제)에 의한 IFNγ 방출 유도의 적정을 나타내는 그래프이다. 도 14c는 세포독성 활성의 유도가, 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제)에 의해 달성된 값에 대해 정규화된, 포맷 1A의 4개의 서열 최적화된 82H02 이중특이적 TCE (82H02 TCE #1, 82H02 TCE #2, 82H02 TCE #3, 82H02 TCE #4)에 의한 염증유발성 시토카인 방출의 유도로부터 디커플링되는 규모를 나타내는 막대 그래프이다.
도 15는 포맷 1A의 4개의 서열 최적화된 82H02 이중특이적 TCE (82H02 TCE #1, 82H02 TCE #2, 82H02 TCE #3, 82H02 TCE #4), 또는 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제)의 존재 하에, 삼중 음성 유방암 (TNBC) 생검으로부터 확장된 종양 침윤 림프구 (TIL)에 의한 hROR1+ NCI-H1975 종양 세포의 연쇄 사멸 빈도를 나타내는 막대 그래프이다.
도 16a 내지 16f는 대략 7 X 106개 (도 16a), 1.3 X 106개 (도 16b), 6 X 105개 (도 16c), 4 X 105개 (도 16d), 2 X 105개 (도 16e) 분자/세포의 hROR1 발현의 세포 표면 밀도를 갖는 MDA-MB-231 종양 세포, 또는 hROR1 녹아웃 세포 (도 16f)와 24시간 동안 공동-배양된 신선하게 단리된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에 대한, 포맷 1A의 4개의 서열 최적화된 82H02 이중특이적 TCE (82H02 TCE #1, 82H02 TCE #2, 82H02 TCE #3, 82H02 TCE #4), 또는 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제)에 의한 세포독성 활성 유도의 적정을 나타내는 그래프이다.
도 17a 내지 17f는 대략 7 X 106개 (도 17a), 1.3 X 106개 (도 17b), 6 X 105개 (도 17c), 4 X 105개 (도 17d), 2 X 105개 (도 17e) 분자/세포의 hROR1 발현의 세포 표면 밀도를 갖는 MDA-MB-231 종양 세포, 또는 hROR1 녹아웃 세포 (도 17f)와 24시간 동안 공동-배양된 신선하게 단리된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에 대한, 포맷 1A의 4개의 서열 최적화된 82H02 이중특이적 TCE (82H02 TCE #1, 82H02 TCE #2, 82H02 TCE #3, 82H02 TCE #4), 또는 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제)에 의한 IFNγ 방출 유도의 적정을 나타내는 그래프이다.
도 18은 대략 2 X 105개, 4 X 105개, 6 X 105개, 1.3 X 106개, 또는 약 7 X 106개 분자/세포의 hROR1 발현의 세포 표면 밀도를 갖는 MDA-MB-231 종양 세포에 대항한 세포독성 활성의 유도가, 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제)에 의해 달성된 값에 대해 정규화된, 포맷 1A의 4개의 서열 최적화된 82H02 이중특이적 TCE (82H02 TCE #1, 82H02 TCE #2, 82H02 TCE #3, 82H02 TCE #4)에 의해 염증유발성 시토카인 방출의 유도로부터 디커플링되는 규모를 나타내는 막대 그래프이다.
도 19는 scFv-Fc 포맷의 본 개시내용의 ROR1-결합 클론 (82H02 scFv-Fc 및 69A02 scFv-Fc), scFv 포맷의 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제 scFv-Fc), 또는 scFv-Fc 포맷의 참조 프리즐드-결합 클론 (Ref. Frz-결합 scFv-Fc)으로 미리 처리된 다음, 경쟁 결합 검정에서 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 647-접합된 제논(Zenon) 단편으로 표지된 82H02 scFv-Fc와 함께 인큐베이션된 NCCIT 세포 배양물의 평균 형광 강도 (MFI)를 나타내는 그래프이다.
본 출원은 종양 세포 표면 상의 TAA (예를 들어, ROR1) 및 T 세포 표면 상의 CD3과 결합하고 ROR1+ 종양 세포에 대항하여 강력한 T 세포 세포독성 활성을 유도할 수 있는 이중특이적 단백질을 제공한다. 이러한 항종양 세포독성 유도 활성은 염증유발성 시토카인 생산을 유도할 수 있는 능력으로부터 디커플링된다. 일부 실시양태에서, 본 출원은 또한 암 치료를 위해 이러한 단백질을 사용하는 치료 방법을 제공한다. 본 출원에 기재된 이중특이적 단백질의 다양한 측면은 하기 섹션에 제시되어 있지만; 하나의 특정한 섹션에 기재된 단백질의 측면은 임의의 특정한 섹션으로 제한되지는 않는다. 또한 본 출원에는 ROR1의 Ig-유사 도메인과 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다.
정의
본 출원의 이해를 용이하게 하기 위해, 다수의 용어 및 문구가 하기에 정의된다.
본원에 사용된 바와 같은 단수형은 "하나 이상"을 의미하며, 문맥이 부적절하지 않는 한 복수형을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "항원-결합 부위"는 항원 결합에 참여하는 이뮤노글로불린 (Ig) 분자의 일부를 지칭한다. 인간 항체에서, 항원-결합 부위는 중쇄 ("H") 및 경쇄 ("L")의 N-말단 가변 ("V") 도메인의 아미노산 잔기에 의해 형성된다. 중쇄와 경쇄의 V 영역 내에서 매우 다양한 3개의 연장물은 "프레임워크 영역" 또는 "FR"로서 공지된 보다 보존된 플랭킹 연장물 사이에 삽입되는 "초가변 영역"으로서 지칭된다. 따라서, 용어 "FR"은 이뮤노글로불린 내의 초가변 영역 사이 및 이에 인접하여 자연적으로 발견되는 아미노산 서열을 지칭한다. 인간 항체 분자에서, 경쇄의 3개 초가변 영역과 중쇄의 3개 초가변 영역은 3차원 공간에서 서로에 대해 배치되어 항원-결합 표면을 형성한다. 항원-결합 표면은 항원-결합 부위와 특이적으로 결합하는 항원의 3차원 표면에 상보적이며, 중쇄와 경쇄 각각의 3개의 초가변 영역이 "상보성-결정 영역", 또는 "CDR"로서 지칭된다. 특정 동물, 예컨대 낙타 및 연골 어류에서, 항원-결합 부위는 "단일 도메인 항체"를 제공하는 단일 항체 쇄에 의해 형성된다. 항원-결합 부위는 단일 폴리펩티드, 미니바디 또는 나노바디 (VHH) 내의 중쇄 가변 도메인을 경쇄 가변 도메인에 연결하는 펩티드 링커를 사용하여, 무손상 항체, 항원-결합 표면을 유지하는 항체의 항원-결합 단편 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2), 또는 재조합 폴리펩티드, 예컨대 scFv에 존재할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "그의 기능적 단편"은 전체 단백질 또는 폴리펩티드의 생물학적 기능을 수행할 수 있는 능력을 유지하는 단백질 또는 폴리펩티드의 일부분을 지칭한다. 예를 들어, 본 출원의 폴리펩티드 또는 단백질의 기능적 단편은 그의 동족 결합 파트너 또는 리간드와 결합할 수 있는 능력을 유지한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에 기재된 방법 및 조성물에 의해 치료될 유기체를 지칭한다. 이러한 유기체는 바람직하게 포유동물 (예를 들어, 뮤린, 유인원, 말, 소, 돼지, 개, 고양이 등)을 포함하나 이에 제한되지는 않고, 더욱 바람직하게 인간을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "유효량"은 유익하거나 원하는 결과를 초래하기에 충분한 화합물 (예를 들어, 본 출원의 이중특이적 단백질 또는 항체)의 양을 지칭한다. 유효량은 1회 이상의 투여, 적용 또는 투여량으로 투여될 수 있으며 특정한 제형 또는 투여 경로로 제한되는 것은 아니다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "치료"는 병태, 질환, 장애 등의 개선 또는 그의 증상의 완화를 가져오는 임의의 효과, 예를 들어 경감, 감소, 조정, 완화 또는 제거를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, "유의미하게" 또는 "유의미한"은 적절한 통계적으로 관련된 시험에 따라 결정된 바와 같은 통계적으로 유의미한 정도로 측정 가능한 파라미터의 변화 또는 변경을 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 변화 또는 변경은, 예를 들어 스튜던트 t-검정, 카이 제곱 또는 만 휘트니(Mann Whitney) 시험에 따라 통계적으로 유의미한 경우에 유의미한 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, ROR1 또는 ROR-1은 서열식별번호: 268의 단백질 및 관련 이소형 및 오르토로그를 지칭한다.
ROR1 아미노산 서열:
MHRPRRRGTRPPLLALLAALLLAARGAAAQETELSVSAELVPTSSWNISSELNKDSYLTLDEPMNNITTSLGQTAELHCKVSGNPPPTIRWFKNDAPVVQEPRRLSFRSTIYGSRLRIRNLDTTDTGYFQCVATNGKEVVSSTGVLFVKFGPPPTASPGYSDEYEEDGFCQPYRGIACARFIGNRTVYMESLHMQGEIENQITAAFTMIGTSSHLSDKCSQFAIPSLCHYAFPYCDETSSVPKPRDLCRDECEILENVLCQTEYIFARSNPMILMRLKLPNCEDLPQPESPEAANCIRIGIPMADPINKNHKCYNSTGVDYRGTVSVTKSGRQCQPWNSQYPHTHTFTALRFPELNGGHSYCRNPGNQKEAPWCFTLDENFKSDLCDIPACDSKDSKEKNKMEILYILVPSVAIPLAIALLFFFICVCRNNQKSSSAPVQRQPKHVRGQNVEMSMLNAYKPKSKAKELPLSAVRFMEELGECAFGKIYKGHLYLPGMDHAQLVAIKTLKDYNNPQQWTEFQQEASLMAELHHPNIVCLLGAVTQEQPVCMLFEYINQGDLHEFLIMRSPHSDVGCSSDEDGTVKSSLDHGDFLHIAIQIAAGMEYLSSHFFVHKDLAARNILIGEQLHVKISDLGLSREIYSADYYRVQSKSLLPIRWMPPEAIMYGKFSSDSDIWSFGVVLWEIFSFGLQPYYGFSNQEVIEMVRKRQLLPCSEDCPPRMYSLMTECWNEIPSRRPRFKDIHVRLRSWEGLSSHTSSTTPSGGNATTQTTSLSASPVSNLSNPRYPNYMFPSQGITPQGQIAGFIGPPIPQNQRFIPINGYPIPPGYAAFPAAHYQPTGPPRVIQHCPPPKSRSPSSASGSTSTGHVTSLPSSGSNQEANIPLLPHMSIPNHPGGMGITVFGNKSQKPYKIDSKQASLLGDANIHGHTESMISAEL (서열식별번호: 268)
본원에 사용된 바와 같은, CD3은 T-세포 수용체 α/β 및 γ/δ 이종이량체와 함께 T-세포 수용체-CD3 복합체를 형성하는, CD3ε (서열식별번호: 269), CD3γ (서열식별번호: 270), CD3δ (서열식별번호: 271), 및 CD3ξ (서열식별번호: 96) 폴리펩티드를 포함하는 단백질을 지칭한다.
CD3ε 서열:
MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDVMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRI (서열식별번호: 269)
CD3γ 서열:
MEQGKGLAVLILAIILLQGTLAQSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIELNAATISGFLFAEIVSIFVLAVGVYFIAGQDGVRQSRASDKQTLLPNDQLYQPLKDREDDQYSHLQGNQLRRN (서열식별번호: 270)
CD3δ 서열:
MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMCQSCVELDPATVAGIIVTDVIATLLLALGVFCFAGHETGRLSGAADTQALLRNDQVYQPLRDRDDAQYSHLGGNWARNK (서열식별번호: 271)
CD3ξ 서열:
MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (서열식별번호: 96)
신호 펩티드와 함께 본원에 제시된 서열의 경우, 성숙한 버전의 단백질이 신호 펩티드 없이 발현되는 것으로 이해된다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 단백질이 특이적 성분을 갖거나, 포함하거나, 또는 포함하는 것으로 기재되거나, 프로세스 및 방법이 특이적 단계를 갖거나, 포함하거나, 또는 포함하는 것으로 기재되는 경우, 이는 부가적으로, 나열된 성분으로 본질적으로 이루어지거나 이루어진 본 출원에 기재된 단백질이 있고, 나열된 프로세싱 단계로 본질적으로 이루어지거나 이루어진 본 출원에 따른 프로세스 및 방법이 있는 것으로 고려된다.
I. 단백질
본 출원은 TAA와 특이적으로 결합하는 이중특이적 단백질을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 특정 TAA 발현 세포에 대항하여 강력한 T 세포 세포독성을 유도하지만 유의미한 양의 시토카인 방출을 유도하지 않는다.
일부 실시양태에서, 특정 TAA 발현 세포에 대항하여 강력한 T 세포 세포독성을 유도하지만 유의미한 양의 시토카인 방출을 유도하지 않는 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 2개의 아암을 포함하며, 제1 아암은 N-말단 단부에서 TAA와 특이적으로 결합하는 제1 성분, 및 C-말단 단부에서 동일한 TAA와 특이적으로 결합하는 제2 성분을 포함하고, 제2 아암은 N-말단 단부에서 CD3과 특이적으로 결합하는 성분을 포함한다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 출원의 이중특이적 단백질은 2가 방식으로 암 세포에서 발현된 ROR1의 Ig-유사 도메인과 특이적으로 결합한다. 고 친화도 및/또는 1가 항체와 비교 시, 본 출원의 단백질은 ROR1 표면 밀도에 기반하여 표적 종양 세포와 오프-타겟 비-종양 세포를 구별할 수 있는 더 큰 능력을 갖는다. 더욱이, 표적 종양 세포 표면 상의 ROR1과 T 세포 표면 상의 CD3을 브릿징함으로써, 본 출원의 단백질은 CD8+ T 세포의 세포독성 활성을 활성화시키고 ROR1-발현 종양 세포의 T 세포 연쇄 사멸을 유도한다. 이러한 세포독성 활성은 T 세포 시토카인 방출 유도로부터 디커플링된다.
본 개시내용의 이중특이적 단백질은 2개의 아암을 포함하며, 각각의 아암은 적어도 하나의 성분 (예를 들어, 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체)을 포함하며, 여기서 제1 아암은 N-말단 또는 C-말단 단부에서 ROR1과 특이적으로 결합하는 제1 성분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 아암은 N-말단 또는 C-말단 단부에서 CD3과 특이적으로 결합하는 성분을 포함하고, 제1 아암은 제1 성분의 반대쪽 단부에서 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 성분을 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 제2 아암은 N-말단 또는 C-말단 단부에서 CD3과 특이적으로 결합하는 성분을 포함하고, CD3과 특이적으로 결합하는 성분의 반대쪽인 제2 아암의 단부에서 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 성분을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 성분은 단일 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CD3과 특이적으로 결합하는 성분은 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CD3과 특이적으로 결합하는 성분의 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 하나 또는 하나 초과의 공유 연결 (예를 들어, 디술피드 결합) 및/또는 하나 또는 하나 초과의 비-공유 상호작용 (예를 들어, 이온성 또는 소수성 상호작용)에 의해 연결될 수 있다. 예시적인 이중특이적 단백질에 대한 추가 설명이 하기에 제공된다.
본 개시내용의 이중특이적 단백질은 ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체인 제1 성분 및 제2 성분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 성분 및 제2 성분은 하나 이상의 항원-결합 부위, 예를 들어, 단일-쇄 가변 단편 (scFv), 항체, Fab, Fab', F(ab')2, 미니바디 또는 나노바디 (VHH)일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본 개시내용의 이중특이적 단백질은 CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체인 성분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 성분은 하나 이상의 항원-결합 부위, 예를 들어 Fab, 항체, Fab', F(ab')2, 단일-쇄 가변 단편 (scFv), 미니바디 또는 나노바디 (VHH)일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 브릿징 모이어티를 부가적으로 포함하며, 이는 가닥-교환 조작된 도메인 (SEED) 포맷 이뮤노글로불린 Fc 도메인 또는 그의 기능적 단편, 이뮤노글로불린 Fc 도메인 또는 그의 기능적 단편, 폴리펩티드 링커, 또는 폴리펩티드 힌지를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 브릿징 모이어티는 단백질의 2개 아암의 이종이량체화를 촉진하는 하나 또는 하나 초과의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 브릿징 모이어티는 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 SEED 포맷 이뮤노글로불린 Fc 도메인이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 SEED 포맷 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 제1 및 제2 폴리펩티드 각각에 대해 바로 N-말단에 힌지 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 ROR1과 특이적으로 결합하는 제1 성분 또는 제2 성분, 또는 CD3과 특이적으로 결합하는 성분을 브릿징 모이어티의 N-말단 또는 C-말단 단부에 연결하는 링커 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 특정 TAA 발현 세포에 대항하여 강력한 T 세포 세포독성을 유도하지만 유의미한 양의 시토카인 방출을 유도하지 않는 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 (i) N-말단에서 C-말단으로, TAA와 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체를 포함하는 제1 성분, 제1 힌지 폴리펩티드, SEED 포맷 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 제1 폴리펩티드, 및 TAA와 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체를 포함하는 제2 성분을 포함하는 제1 아암; 및 (ii) N-말단에서 C-말단으로, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체, 제2 힌지 폴리펩티드, 및 SEED 포맷 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 제2 폴리펩티드를 포함하는 제2 아암을 포함하며, 여기서 SEED 포맷 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 이량체화된다.
본원에 기재된 이중특이적 단백질은 다양한 포맷을 취할 수 있다. 예를 들어, 하나의 이중특이적 단백질 포맷은 (i) N-말단에서 C-말단으로, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체를 포함하는 제1 성분, 제1 힌지 폴리펩티드, SEED 포맷 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 제1 폴리펩티드, 및 ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체를 포함하는 제2 성분을 포함하는 제1 아암; 및 (ii) N-말단에서 C-말단으로, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체, 제2 힌지 폴리펩티드, 및 SEED 포맷 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 제2 폴리펩티드를 포함하는 제2 아암을 포함하며, 여기서 SEED 포맷 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 이량체화된다. 이러한 포맷에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 성분은 항원-결합 부위 (예를 들어 scFv, 항체, Fab, Fab', F(ab')2, 미니바디 또는 VHH)이며, CD3과 특이적으로 결합하는 성분은 항원-결합 부위 (예를 들어 Fab, scFv, 항체, Fab', F(ab')2, 미니바디 또는 VHH)이다. 일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 성분은 scFv이고, CD3과 특이적으로 결합하는 성분은 Fab이다 (도 1a). 일부 실시양태에서, CD3과 특이적으로 결합하는 성분은 Fab를 포함하며, 여기서 부분적인 힌지 (예를 들어, 서열식별번호: 133의 서열을 갖는 폴리펩티드)는 Fab 중쇄 (HC) CH1 도메인의 C-말단에 연결되어 Fab 경쇄 (LC)와 디술피드 결합을 형성한다. 이러한 포맷의 이중특이적 단백질은 또한 임의로, SEED 포맷 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 제1 폴리펩티드의 C-말단을 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 성분의 N-말단에 연결하는 링커 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
또 다른 이중특이적 단백질 포맷은 (i) N-말단에서 C-말단으로, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체를 포함하는 제1 성분, 제1 힌지 폴리펩티드, SEED 포맷 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 제1 폴리펩티드, 및 CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체를 포함하는 성분을 포함하는 제1 아암; 및 (ii) N-말단에서 C-말단으로, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체를 포함하는 제2 성분, 제2 힌지 폴리펩티드, 및 SEED 포맷 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 제2 폴리펩티드를 포함하는 제2 아암을 포함하며, 여기서 SEED 포맷 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 이량체화된다. 이러한 포맷에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 성분은 항원-결합 부위 (예를 들어 scFv, 항체, Fab, Fab', F(ab')2, 미니바디 또는 VHH)이며, CD3과 특이적으로 결합하는 성분은 항원-결합 부위 (예를 들어 Fab, scFv, 항체, Fab', F(ab')2, 미니바디 또는 VHH)이다. 일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 성분은 scFv이며, CD3과 특이적으로 결합하는 성분은 Fab이다 (도 1b). 일부 실시양태에서, CD3과 특이적으로 결합하는 성분은 Fab를 포함하며, 여기서 부분적인 힌지 (예를 들어, 서열식별번호: 133의 서열을 갖는 폴리펩티드)는 Fab 중쇄 (HC) CH1 도메인의 C-말단에 연결되어 Fab 경쇄 (LC)와 디술피드 결합을 형성한다. 이러한 포맷의 이중특이적 단백질은 또한 임의로, SEED 포맷 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 제1 폴리펩티드의 C-말단을 CD3과 특이적으로 결합하는 성분의 N-말단에 연결하는 링커 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
또 다른 포맷에서, 이중특이적 단백질은 (i) N-말단에서 C-말단으로, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체를 포함하는 제1 성분, 제1 힌지 폴리펩티드, 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 제1 폴리펩티드, 및 ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체를 포함하는 제2 성분을 포함하는 제1 아암; 및 (ii) N-말단에서 C-말단으로, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체, 제2 힌지 폴리펩티드, 및 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 제2 폴리펩티드를 포함하는 제2 아암을 포함하며, 여기서 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 제1 및 제2 폴리펩티드는 각각 제1 및 제2 아암의 이종이량체화를 촉진하는 하나 또는 하나 초과의 돌연변이를 포함한다. 이러한 포맷에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 성분은 항원-결합 부위 (예를 들어, scFv, 항체, Fab, Fab', F(ab')2, 미니바디 또는 VHH)이며, CD3과 특이적으로 결합하는 성분은 항원-결합 부위 (예를 들어, Fab, scFv, 항체, Fab', F(ab')2, 미니바디 또는 VHH)이다. 일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 성분은 scFv이고, CD3과 특이적으로 결합하는 성분은 Fab이다 (도 1a). 일부 실시양태에서, CD3과 특이적으로 결합하는 성분은 Fab를 포함하며, 여기서 부분적인 힌지 (예를 들어, 서열식별번호: 133의 서열을 갖는 폴리펩티드)는 Fab 중쇄 (HC) CH1 도메인의 C-말단에 연결되어 Fab 경쇄 (LC)와 디술피드 결합을 형성한다. 이러한 포맷의 이중특이적 단백질은 또한 임의로, 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 제1 폴리펩티드의 C-말단을 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 성분의 N-말단에 연결하는 링커 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
또 다른 포맷에서, 이중특이적 단백질은 (i) N-말단에서 C-말단으로, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체를 포함하는 제1 성분, 제1 힌지 폴리펩티드, 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 제1 폴리펩티드, 및 CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체를 포함하는 성분을 포함하는 제1 아암; 및 (ii) N-말단에서 C-말단으로, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체를 포함하는 제2 성분, 제2 힌지 폴리펩티드, 및 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 제2 폴리펩티드를 포함하는 제2 아암을 포함하며, 여기서 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 제1 및 제2 폴리펩티드는 각각 제1 및 제2 아암의 이종이량체화를 촉진하는 하나 또는 하나 초과의 돌연변이를 포함한다. 이러한 포맷에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 성분은 항원-결합 부위 (예를 들어, scFv, 항체, Fab, Fab', F(ab')2, 미니바디 또는 VHH)이고, CD3과 특이적으로 결합하는 성분은 항원-결합 부위 (예를 들어, Fab, scFv, 항체, Fab', F(ab')2, 미니바디 또는 VHH)이다. 일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 성분은 scFv이고, CD3과 특이적으로 결합하는 성분은 Fab이다 (도 1b). 일부 실시양태에서, CD3과 특이적으로 결합하는 성분은 Fab를 포함하며, 여기서 부분적인 힌지 (예를 들어 서열식별번호: 133의 서열을 갖는 폴리펩티드)는 Fab 중쇄 (HC) CH1 도메인의 C-말단에 연결되어 Fab 경쇄 (LC)와 디술피드 결합을 형성한다. 이러한 포맷의 이중특이적 단백질은 또한 임의로, 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 제1 폴리펩티드의 C-말단을 CD3과 특이적으로 결합하는 성분의 N-말단에 연결하는 링커 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
단백질의 개별 성분은 하기에 더 자세히 기재되어 있다.
I.A ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체
종양 세포 표면 상의 ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 본 개시내용의 이중특이적 단백질이, 혈액 종양 세포, 예를 들어 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 세포 및 외투 세포 백혈병 (MCL) 세포뿐만 아니라 고형 종양 세포, 예를 들어, 난소, 폐, 위, 전립선, 자궁 및 유방 종양 세포를 표적으로 하도록 기능한다. ROR1은 세포 표면에서 상대적으로 낮은 밀도로 발현되지만, 상대적으로 특이적 TAA인 것으로 간주된다. 따라서, 본 개시내용의 ROR1-결합 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 정상적인 비-암성 성체 조직에 대한 결합이 제한된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 ROR1-결합 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 관련 기술분야에 공지된 ROR1-결합 고 친화도 및/또는 1가 항체와 비교 시 상대적으로 더 낮은 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 2개의 더 낮은 친화도의 ROR1-결합 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체를 포함하며, 이에 의해 표면 ROR1 발현의 상이한 밀도를 갖는 세포를 구별할 수 있는 더 큰 능력을 부여한다.
본원에 사용된 바와 같은, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 서열식별번호: 268의 서열을 갖는 단백질 및 관련 이소형 및 오르토로그와 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체이다. 일부 실시양태에서, ROR1-결합 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 ROR1의 세포외 도메인 상의 하나 또는 하나 초과의 에피토프와 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, ROR1-결합 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 ROR1의 원위 Ig-유사 도메인 (서열식별번호: 99)과 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 ROR1-결합 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 ROR1의 프리즐드 또는 크링글 도메인 (각각 서열식별번호: 102 및 서열식별번호: 105)과 결합하지 않는다.
ROR1 Ig-유사 도메인:
PTSSWNISSELNKDSYLTLDEPMNNITTSLGQTAELHCKVSGNPPPTIRWFKNDAPVVQEPRRLSFRSTIYGSRLRIRNLDTTDTGYFQCVATNGKEVVSSTGVLF (서열식별번호: 99)
ROR1 프리즐드 도메인:
EEDGFCQPYRGIACARFIGNRTVYMESLHMQGEIENQITAAFTMIGTSSHLSDKCSQFAIPSLCHYAFPYCDETSSVPKPRDLCRDECEILENVLCQTEYIFARSNPMILMRLKLPNCEDLPQPESPEAANCIRI (서열식별번호: 102)
ROR1 크링글 도메인:
KCYNSTGVDYRGTVSVTKSGRQCQPWNSQYPHTHTFTALRFPELNGGHSYCRNPGNQKEAPWCFTLDENFKSDLCDIPAC (서열식별번호: 105).
일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체에는 단일-쇄 가변 단편 (scFv), 항체, Fab, Fab', F(ab')2, 미니바디 또는 나노바디 (VHH)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 각각 ROR1의 Ig-유사 도메인과 특이적으로 결합하는 2개의 scFv 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다. 표 1에는 조합하여 ROR1과 특이적으로 결합할 수 있는 VH 및 VL 상보성-결정 영역 (CDR)이 열거되어 있다. 일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 IMGT 고유 넘버링 체계, 카바트(Kabat) (문헌 [Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH Publication No. 91-3242, Bethesda] 참조), 코티아(Chothia) (예를 들어, 문헌 [Chothia C & Lesk A M, (1987), J. Mol. Biol. 196: 901-917] 참조), 맥컬럼(MacCallum) (문헌 [MacCallum R M et al., (1996) J. Mol. Biol. 262: 732-745] 참조), 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 다른 CDR 결정 방법 하에 결정된, 표 1에 열거된 VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 서열로부터 선택된 VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 서열을 포함한다.
달리 명시되지 않는 한, 표 1에 제공된 CDR 서열은 IMGT 고유 넘버링 체계 하에 결정된다.
표 1: ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체에 대한 VHCDR 및 VLCDR 서열
일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 (i) 서열식별번호: 8 또는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1; (ii) 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2; (iii) 서열식별번호: 10 또는 서열식별번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3; (iv) 서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1; (v) 아미노산 서열 DAS 또는 GAS를 포함하는 VLCDR2; 및 (vi) 서열식별번호: 13 또는 서열식별번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 서열식별번호: 14, 서열식별번호: 15, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 18, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 21, 서열식별번호: 22, 또는 서열식별번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함한다.
일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 (i) 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1; (ii) 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2; (iii) 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3; (iv) 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1; (v) DAS의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2; 및 (vi) 서열식별번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함한다.
일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 (i) 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1; (ii) 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2; (iii) 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3; (iv) 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1; (v) DAS의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2; 및 (vi) 서열식별번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함한다.
일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 (i) 서열식별번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1; (ii) 서열식별번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2; (iii) 서열식별번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3; (iv) 서열식별번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1; (v) GAS의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2; 및 (vi) 서열식별번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함한다.
표 2에는 조합하여 ROR1과 특이적으로 결합할 수 있는 예시적인 VH 및 VL 도메인의 아미노산 서열이 열거되어 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 표 2에 열거된 VH 도메인 및 VL 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 VH 및 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 및 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 서열은 표 2에 개시된 VH 및 VL 서열의 IMGT 고유 넘버링 체계, 카바트 (문헌 [Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH Publication No. 91-3242, Bethesda] 참조), 코티아 (예를 들어, 문헌 [Chothia C & Lesk A M, (1987), J. Mol. Biol. 196: 901-917] 참조), 맥컬럼 (문헌 [MacCallum R M et al., (1996) J. Mol. Biol. 262: 732-745] 참조), 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 다른 CDR 결정 방법 하에 결정된다.
달리 명시되지 않는 한, 표 2에 제공된 CDR 서열은 IMGT 고유 넘버링 체계 하에 결정된다.
표 2: ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체에 대한 VH 및 VL 서열
일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 (i) 서열식별번호: 29 또는 서열식별번호: 39와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 VH; 및 (ii) 서열식별번호: 30, 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 32, 서열식별번호: 33, 서열식별번호: 34, 서열식별번호: 35, 서열식별번호: 36, 서열식별번호: 37, 서열식별번호: 38, 또는 서열식별번호: 40과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 (i) 서열식별번호: 29와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 VH; 및 (ii) 서열식별번호: 30과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 (i) 서열식별번호: 29와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 VH; 및 (ii) 서열식별번호: 31과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 (i) 서열식별번호: 39와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 VH; 및 (ii) 서열식별번호: 40과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 scFv 포맷이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 ROR1-결합 scFv는 VH 도메인과 VL 도메인을 연결하는 링커 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커 폴리펩티드는 서열 (GGGGS)n (서열식별번호: 1)을 포함하며, 여기서 n은 1 내지 12이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, ROR-1 결합 scFv는 N-말단에서 C-말단으로, VL 도메인, 링커 폴리펩티드, 및 VH 도메인을 포함한다. 다른 실시양태에서, ROR-1 결합 scFv는 N-말단에서 C-말단으로, VH 도메인, 링커 폴리펩티드, 및 VL 도메인을 포함한다.
표 3에는 예시적인 ROR1-결합 scFv의 아미노산 서열이 열거되어 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 표 3에 열거된 scFv 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 동일한 scFv 서열을 포함하는 2개의 scFv를 포함한다.
표 3: 예시적인 ROR1-결합 scFv 아미노산 서열
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 서열식별번호: 41, 서열식별번호: 42, 서열식별번호: 43, 서열식별번호: 44, 서열식별번호: 45, 서열식별번호: 46, 서열식별번호: 47, 서열식별번호: 48, 서열식별번호: 49, 또는 서열식별번호: 59와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, ROR1과 특이적으로 결합하는 scFv를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 서열식별번호: 41, 서열식별번호: 42, 서열식별번호: 43, 서열식별번호: 44, 서열식별번호: 45, 서열식별번호: 46, 서열식별번호: 47, 서열식별번호: 48, 서열식별번호: 49, 또는 서열식별번호: 59와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 각각 포함하는, ROR1과 특이적으로 결합하는 2개의 scFv를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 서열식별번호: 41과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, ROR1과 특이적으로 결합하는 scFv를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 서열식별번호: 41과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 각각 포함하는, ROR1과 특이적으로 결합하는 2개의 scFv를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 서열식별번호: 42와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, ROR1과 특이적으로 결합하는 scFv를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 서열식별번호: 42와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 각각 포함하는, ROR1과 특이적으로 결합하는 2개의 scFv를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 서열식별번호: 59와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, ROR1과 특이적으로 결합하는 scFv를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 서열식별번호: 59와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 각각 포함하는, ROR1과 특이적으로 결합하는 2개의 scFv를 포함한다.
I.B CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체
본 개시내용의 이중특이적 단백질은 T 세포 표면 상의 CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 모든 성숙한 T 림프구, 예를 들어 αβ T 세포, γδ T 세포, NK-T 세포, 점막-연관 불변 T (MAIT) 세포, 및 그의 표현형 서브세트에서 광범위하게 발현되는 CD3/T 세포 수용체 복합체의 CD3ε 쇄와 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, CD3ε 쇄의 결합은 ROR1에 브릿지될 때 T 세포의 활성화를 유도한다.
본원에 사용된 바와 같은, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 CD3ε (서열식별번호: 269)와 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체이다.
일부 실시양태에서, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 Fab, 항체, Fab', F(ab')2, 단일-쇄 가변 단편 (scFv), 미니바디, 또는 나노바디 (VHH)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 단일-쇄 가변 단편 (scFv), 항체, Fab, Fab', F(ab')2, 미니바디, 또는 나노바디(VHH)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 각각 ROR1의 Ig-유사 도메인과 특이적으로 결합하는 2개의 scFv 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함한다. 표 4에는 조합하여 CD3과 특이적으로 결합할 수 있는 VH 및 VL CDR이 열거되어 있다. 일부 실시양태에서, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 IMGT 고유 넘버링 체계, 카바트 (문헌 [Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH Publication No. 91-3242, Bethesda] 참조), 코티아 (예를 들어, 문헌 [Chothia C & Lesk A M, (1987), J. Mol. Biol. 196: 901-917] 참조), 맥컬럼 (문헌 [MacCallum R M et al., (1996) J. Mol. Biol. 262: 732-745] 참조), 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 다른 CDR 결정 방법 하에 결정된, 표 4에 열거된 VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 서열로부터 선택된 VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 서열을 포함한다.
달리 명시되지 않는 한, 표 4에 제공된 CDR 서열은 IMGT 고유 넘버링 체계 하에 결정된다.
표 4: CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체에 대한 VHCDR 및 VLCDR 서열
일부 실시양태에서, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 (i) 서열식별번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1; (ii) 서열식별번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2; (iii) 서열식별번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3; (iv) 서열식별번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1; (v) GT의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2; 및 (vi) 서열식별번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 서열식별번호: 63, 서열식별번호: 68, 서열식별번호: 69, 또는 서열식별번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3을 포함한다.
특정 실시양태에서, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 (i) 서열식별번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1; (ii) 서열식별번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2; (iii) 서열식별번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3; (iv) 서열식별번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1; (v) GT의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2; 및 (vi) 서열식별번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함한다.
일부 실시양태에서, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 (i) 서열식별번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1; (ii) 서열식별번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2; (iii) 서열식별번호: 68의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3; (iv) 서열식별번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1; (v) GT의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2; 및 (vi) 서열식별번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함한다.
표 5에는 조합하여 CD3과 특이적으로 결합할 수 있는 예시적인 VH 및 VL 도메인의 아미노산 서열이 열거되어 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 표 5에 열거된 VH 도메인 및 VL 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 VH 및 VL을 포함한다. 특정 실시양태에서, VHCDR1, VHCDR2, 및 VHCDR3 및 VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 서열은 포맷 1A 또는 포맷 1B로 개시된 VH 및 VL 서열의 IMGT 고유 넘버링 체계, 카바트 (문헌 [Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH Publication No. 91-3242, Bethesda] 참조), 코티아 (예를 들어, 문헌 [Chothia C & Lesk A M, (1987), J. Mol. Biol. 196: 901-917] 참조), 맥컬럼 (문헌 [MacCallum R M et al., (1996) J. Mol. Biol. 262: 732-745] 참조), 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 다른 CDR 결정 방법 하에 결정된다.
달리 명시되지 않는 한, 표 5에 제공된 CDR 서열은 IMGT 고유 넘버링 체계 하에 결정된다.
표 5: CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체에 대한 VH 및 VL 서열
일부 실시양태에서, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 (i) 서열식별번호: 71, 서열식별번호: 72, 서열식별번호: 73, 서열식별번호: 74, 서열식별번호: 75 또는 서열식별번호: 80과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 VH; 및 (ii) 서열식별번호: 76, 서열식별번호: 77, 서열식별번호: 78, 서열식별번호: 79, 또는 서열식별번호: 81과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 (i) 서열식별번호: 72와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 VH; 및 (ii) 서열식별번호: 81과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 (i) 서열식별번호: 71과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 VH; 및 (ii) 서열식별번호: 76과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 VL을 포함한다.
일부 실시양태에서, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 Fab 포맷이다. 표 6에는 조합하여 CD3과 특이적으로 결합할 수 있는 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC)의 폴리펩티드 서열이 열거되어 있다. 일부 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄는 표 6에 열거된 HC 및 LC 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 동일한 HC 및 LC 서열을 갖는 Fab 포맷으로 배열된다.
표 6: CD3과 특이적으로 결합하는 Fab 포맷의 항원 결합 부위에 대한 중쇄 및 경쇄 서열
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 서열식별번호: 82 또는 서열식별번호: 83과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열식별번호: 84 또는 서열식별번호: 85와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, CD3과 특이적으로 결합하는 Fab를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 서열식별번호: 82와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열식별번호: 84와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, CD3과 특이적으로 결합하는 Fab를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 서열식별번호: 83과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열식별번호: 85와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, CD3과 특이적으로 결합하는 Fab를 포함한다.
일부 실시양태에서, 부분적인 힌지 (예를 들어, EPKSC (서열식별번호: 133)의 서열을 갖는 폴리펩티드)는, CD3과 특이적으로 결합하는 Fab 중쇄 (HC)의 CH1 도메인의 C-말단에 연결되어, CD3과 특이적으로 결합하는 Fab 경쇄 (LC)와 디술피드 결합을 형성한다.
I.C 브릿징 모이어티
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 브릿징 모이어티를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 브릿징 모이어티는 비-기능적일 수 있는데, 즉 단지 구조적 연결 및/또는 부속물로만 작용하고 생물학적 기능을 수행하지 않거나 생물학적 목적을 갖지 않는다. 다른 실시양태에서, 브릿징 모이어티는 기능적이며 단백질의 맥락에서 생물학적 기능을 갖는다.
일부 실시양태에서, 브릿징 모이어티의 N-말단은 CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 C-말단에 연결되고, 브릿징 모이어티의 C-말단은 ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 N-말단에 연결된다. 일부 실시양태에서, 브릿징 모이어티의 N-말단은 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체의 C-말단에 추가로 연결된다. 일부 실시양태에서, 브릿징 모이어티는 2개의 폴리펩티드 아암을 포함하며, 여기서 제1 폴리펩티드 아암의 N-말단은 CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 C-말단에 연결되고, 제2 폴리펩티드 아암의 C-말단은 ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 N-말단에 연결되고, 제2 폴리펩티드 아암의 N-말단은 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체의 C-말단에 연결된다.
일부 실시양태에서, 브릿징 모이어티의 N-말단은 ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 C-말단에 연결되고, 브릿징 모이어티의 C-말단은 CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 N-말단에 연결된다. 일부 실시양태에서, 브릿징 모이어티의 N-말단은 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체의 C-말단에 추가로 연결된다. 일부 실시양태에서, 브릿징 모이어티는 2개의 폴리펩티드 아암을 포함하며, 여기서 제1 폴리펩티드 아암의 N-말단은 ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 C-말단에 연결되고, 제1 폴리펩티드 아암의 C-말단은 CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 N-말단에 연결되고, 제2 폴리펩티드 아암의 N-말단은 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체의 C-말단에 연결된다.
일부 실시양태에서, 브릿징 모이어티는 가닥-교환 조작된 도메인 (SEED) 포맷 Fc 도메인 또는 그의 기능적 단편, 이뮤노글로불린 Fc 도메인 또는 그의 기능적 단편, 폴리펩티드 링커, 또는 폴리펩티드 힌지를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
SEED 포맷 Fc 도메인
특정 실시양태에서, 브릿징 모이어티는 IgA 및 IgG CH3 도메인의 교대 서열을 각각 포함하는, AG 및 GA로 지정되는 2개의 비대칭 상보적 폴리펩티드 아암을 포함하는 SEED 포맷 Fc 도메인 또는 그의 기능적 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, SEED 포맷 Fc 도메인의 AG 및 GA 폴리펩티드 아암은 인간 IgA 및 IgG CH3 도메인의 교대 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, SEED 포맷 Fc 도메인은 AG/GA 이종이량체화를 촉진하고 AG 및 GA 동종이량체를 선호하지 않는다.
Fc 도메인 내에서, CD16 결합은 힌지 영역과 CH2 도메인에 의해 매개된다. 예를 들어, 인간 IgG1 내에서, CD16과의 상호작용은 주로, 카바트에서와 같은 EU 지수에 따라 넘버링된, CH2 도메인 내의 아미노산 잔기 Asp 265 - Glu 269, Asn 297 - Thr 299, Ala 327 - Ile 332, Leu 234 - Ser 239, 및 탄수화물 잔기 N-아세틸-D-글루코사민에 집중된다 (문헌 [Sondermann et al., Nature, 406 (6793):267-273] 참조). 공지된 도메인을 기반으로 하여, 돌연변이는 파지-디스플레이된 라이브러리 또는 효모 표면-디스플레이된 cDNA 라이브러리를 사용하는 것과 같이 CD16에 대한 결합 친화도를 향상시키거나 감소시키기 위해 선택될 수 있거나, 또는 상호작용의 공지된 3차원 구조를 기반으로 설계될 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, SEED 포맷 Fc 도메인 또는 그의 기능적 부분은 힌지 폴리펩티드 및 CH2 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, SEED 포맷 AG 폴리펩티드 아암 및 GA 폴리펩티드 아암은 각각 SEED 포맷 Fc 도메인의 제1 및/또는 제2 폴리펩티드 아암 내의 Fcγ 수용체 (예를 들어, FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA 또는 FcγRIIIB) 또는 보체 성분 (예를 들어, C1q)에 대한 결합을 감소시키기 위한 하나 이상의 돌연변이(들)를 포함한다. 이러한 돌연변이는 이펙터 기능을 감소시키는데 유용한다. 예를 들어, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 LALA (L234A 및 L235A) 돌연변이, LALAPA (L234A, L235A, 및 P329A) 돌연변이, LALAPG (L234A, L235A, 및 P329G) 돌연변이, 또는 LALEGAASPS (L234A, L235E, G237A, A330S, 및 P331S) 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, SEED 포맷 Fc 도메인의 말단 리신 잔기는 돌연변이되거나 (K447A) 결실된다 (K447Δ). 일부 실시양태에서, 위치 322, 330, 331, 355 및 358 중 어느 하나 이상에서의 아미노산이 돌연변이될 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 아미노산 치환 위치는 모두 카바트에서와 같은 EU 지수에 따라 넘버링되어 있다.
표 7에는 각각의 CH3 도메인에서 서로 이종이량체화하는 SEED 포맷 AG 및 GA 폴리펩티드 아암의 폴리펩티드 서열이 열거되어 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 (i) 표 7에 열거된 AG 폴리펩티드 아암 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 갖는 AG 폴리펩티드 아암; 및 (ii) 표 7에 열거된 GA 폴리펩티드 아암 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 갖는 GA 폴리펩티드 아암을 포함한다.
표 7: 예시적인 SEED 포맷 Fc 도메인 서열
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 서열식별번호: 86, 서열식별번호: 117, 또는 서열식별번호: 88과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 SEED 포맷 AG 폴리펩티드 아암, 및 서열식별번호: 87, 서열식별번호: 118, 또는 서열식별번호: 89와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 SEED 포맷 GA 폴리펩티드 아암을 포함하는 브릿징 모이어티를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 서열식별번호: 86과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 SEED 포맷 AG 폴리펩티드 아암, 및 서열식별번호: 87과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 SEED 포맷 GA 폴리펩티드 아암을 포함하는 브릿징 모이어티를 포함한다.
IgG Fc 이종이량체
특정 실시양태에서, 브릿징 모이어티는 이뮤노글로불린 Fc 도메인을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 브릿징 모이어티는 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE Fc 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 브릿징 모이어티는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 Fc 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 브릿징 모이어티는 IgG1 Fc 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 브릿징 모이어티는 인간 IgG1 Fc 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 이뮤노글로불린 Fc 도메인 브릿징 모이어티는 서로 이량체화되는, 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 제1 폴리펩티드 아암과 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 제2 폴리펩티드 아암을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 제1 이뮤노글로불린 Fc 도메인 폴리펩티드 아암 및 제2 이뮤노글로불린 Fc 도메인 폴리펩티드 아암을 포함하며, 둘 다 서로의 이종이량체화를 촉진하는 하나 이상의 돌연변이(들)를 포함하는 IgG1 Fc 도메인 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 이종이량체화를 촉진하는 하나 이상의 돌연변이(들)는 IgG1 Fc 도메인의 CH3 내에 있다. 예를 들어, 이뮤노글로불린 Fc 도메인은 "노브-인투-홀" 포맷, 듀오바디 포맷, 비대칭 포맷, 전하쌍 포맷, crossMab 포맷, 정전기 스티어링 포맷, 또는 HA-TF 포맷 (이에 제한되지는 않음)을 사용하여 이종이량체화를 위해 조작될 수 있다. 예를 들어, Fc 도메인이 인간 IgG1의 Fc로부터 유래된 경우, Fc 도메인은 인간 IgG1 항체의 아미노산 234-332와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, EU 넘버링에 따라 E345, Q347, Y349, T350, L351, S354, E356, E357, K360, S364, T366, L368, K370, K392, T394, D399, F405, Y407, 및 K409로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치(들)에서 상이하다.
특정 실시양태에서, 이뮤노글로불린 Fc 도메인 또는 그의 기능적 부분은 힌지 폴리펩티드 및 CH2 도메인을 포함한다.
특정 실시양태에서, 브릿징 모이어티는 인간 IgG1 Fc 도메인의 제1 및/또는 제2 폴리펩티드 아암 내의 Fcγ 수용체 (예를 들어, FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA 또는 FcγRIIIB) 또는 보체 성분 (예를 들어, C1q)에 대한 결합을 감소시키기 위한 하나 이상의 돌연변이(들)를 포함하는 인간 IgG1 Fc 도메인을 포함한다. 이러한 돌연변이는 이펙터 기능을 감소시키는데 유용한다. 예를 들어, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 LALA (L234A 및 L235A) 돌연변이, LALAPA (L234A, L235A 및 P329A) 돌연변이, LALAPG (L234A, L235A 및 P329G) 돌연변이, 또는 LALEGAASPS (L234A, L235E, G237A, A330S 및 P331S) 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 IgG1 Fc 도메인의 말단 리신 잔기는 돌연변이되거나 (K447A) 결실된다 (K447Δ). 일부 실시양태에서, 위치 322, 330, 331, 355 및 358 중 어느 하나 이상에서의 아미노산이 돌연변이될 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 아미노산 치환 위치는 모두 카바트에서와 같은 EU 지수에 따라 넘버링되어 있다.
표 8에는 서로 이종이량체화되는, 이뮤노글로불린 Fc 도메인 폴리펩티드 아암의 폴리펩티드 서열이 열거되어 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 (i) 표 8에 열거된 제1 폴리펩티드 아암 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 갖는 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 제1 폴리펩티드 아암; 및 (ii) 표 8에 열거된 제2 폴리펩티드 아암 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 갖는 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 제2 폴리펩티드 아암을 포함한다.
표 8: 예시적인 인간 이뮤노글로불린 Fc 도메인 이종이량체화 서열
힌지 폴리펩티드
일부 실시양태에서, 브릿징 모이어티는 힌지 폴리펩티드 아암의 적어도 일부분을 포함한다. 힌지 폴리펩티드 아암은 이뮤노글로불린 중쇄, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 기타 클래스로부터 유래될 수 있다. 바람직하게, 힌지 폴리펩티드 아암은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 유래된다. 보다 바람직하게, 힌지 폴리펩티드 아암은 인간 IgG1 중쇄로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, 힌지 폴리펩티드 아암의 적어도 일부분은 SEED 포맷 Fc 도메인의 AG 폴리펩티드 아암과 GA 폴리펩티드 아암, 또는 인간 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 제1 폴리펩티드 아암과 제2 폴리펩티드 아암의 중쇄 불변 도메인 2 (CH2)의 N-말단에 연결된다.
일부 실시양태에서, 힌지 폴리펩티드 아암은 CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 C-말단을 SEED 포맷 Fc 도메인 AG 또는 GA 폴리펩티드 아암의 CH2 도메인의 N-말단, 또는 이뮤노글로불린 Fc 도메인 제1 폴리펩티드 아암 또는 제2 폴리펩티드 아암의 CH2 도메인의 N-말단에 연결한다. 일부 실시양태에서, 힌지 폴리펩티드 아암은 ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 C-말단을 SEED 포맷 Fc 도메인 AG 또는 GA 폴리펩티드 아암의 CH2 도메인의 N-말단, 또는 이뮤노글로불린 Fc 도메인 제1 폴리펩티드 아암 또는 제2 폴리펩티드 아암의 CH2 도메인의 N-말단에 연결한다.
일부 실시양태에서, 힌지 폴리펩티드 아암은 ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 C-말단을 SEED 포맷 Fc 도메인 AG 또는 GA 폴리펩티드 아암의 CH2 도메인의 N-말단, 또는 이뮤노글로불린 Fc 도메인 제1 폴리펩티드 아암 또는 제2 폴리펩티드 아암의 CH2 도메인의 N-말단에 연결한다. 일부 실시양태에서, 힌지 폴리펩티드 아암은 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체의 C-말단을 SEED 포맷 Fc 도메인 AG 또는 GA 폴리펩티드 아암의 CH2 도메인의 N-말단, 또는 이뮤노글로불린 Fc 도메인 제1 폴리펩티드 아암 또는 제2 폴리펩티드 아암의 CH2 도메인의 N-말단에 연결한다.
일부 실시양태에서, 위치 C220, E233, L234 또는 L235 중 어느 하나 이상에서의 아미노산은 인간 IgG1의 힌지 폴리펩티드 아암에서 돌연변이될 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 아미노산 치환 위치는 모두 카바트에서와 같은 EU 지수에 따라 넘버링되어 있다.
표 9에는 예시적인 힌지 폴리펩티드 아암 서열이 열거되어 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 브릿징 모이어티는 표 9에 열거된 힌지 폴리펩티드 아암 서열과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 힌지 폴리펩티드 아암을 포함한다.
표 9: 예시적인 힌지 폴리펩티드 아암 서열
특정 실시양태에서, 본 발명의 브릿징 모이어티는 (i) 서열식별번호: 92와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 동일한 아미노산을 포함하는 힌지 폴리펩티드 아암; 및 서열식별번호: 90과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 동일한 아미노산을 포함하는 제2 힌지 폴리펩티드 아암을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 브릿징 모이어티는 (i) 서열식별번호: 92와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 동일한 아미노산을 포함하는 힌지 폴리펩티드 아암; 및 서열식별번호: 92와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 동일한 아미노산을 포함하는 제2 힌지 폴리펩티드 아암을 포함한다.
I.D 링커
일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 N-말단은 링커 폴리펩티드를 통해 브릿징 모이어티의 C-말단에 연결된다. 다른 실시양태에서, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 N-말단은 링커 폴리펩티드를 통해 브릿징 모이어티의 C-말단에 연결된다.
링커 폴리펩티드의 아미노산 조성과 관련하여, 링커 폴리펩티드 서열은 가요성을 부여하는 특성을 갖고, 본 출원에 기재된 단백질의 다른 도메인 및/또는 폴리펩티드의 구조 및 기능에 대한 간섭을 최소화하도록 선택된다. 링커 폴리펩티드 서열은 또한 단백질분해 절단에 내성이 있도록 선택된다. 예를 들어, 글리신 및 세린 잔기는 일반적으로 프로테아제 내성을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 이중특이적 단백질은 (GlyGlyGlyGlySer)4 ((G4S)4) 링커 (서열식별번호: 249)를 포함한다. 링커 (예를 들어, 가요성 링커)의 길이는 "짧은", 예를 들어 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 아미노산 잔기, 또는 "긴", 예를 들어 적어도 13개의 아미노산 잔기일 수 있다. 특정 실시양태에서, 링커는 10-50, 10-40, 10-30, 10-25, 10-20, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25, 15-20, 20-50, 20-40, 20-30, 또는 20-25개 아미노산 잔기 길이이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 표 10에 열거된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 하나 이상의 폴리펩티드 링커를 포함한다.
표 10: 예시적인 링커 폴리펩티드
I.E 예시적인 이중특이적 단백질
TAA (예를 들어, ROR1)와 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체 및 CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체를 포함하는 본 발명의 이중특이적 단백질의 예가 하기에 열거되어 있다.
한 측면에서, 특정 TAA 발현 세포에 대항하여 강력한 T 세포 세포독성을 유도하지만 유의미한 양의 시토카인 방출을 유도하지 않는 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 2개의 아암을 포함하며, 제1 아암은 N-말단 단부에서 TAA와 특이적으로 결합하는 제1 성분, 및 C-말단 단부에서 동일한 TAA와 특이적으로 결합하는 제2 성분을 포함하고, 제2 아암은 N-말단 단부에서 CD3과 특이적으로 결합하는 성분을 포함한다.
일부 실시양태에서, 특정 TAA 발현 세포에 대항하여 강력한 T 세포 세포독성을 유도하지만 유의미한 양의 시토카인 방출을 유도하지 않는 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 (i) N-말단에서 C-말단으로, TAA와 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체를 포함하는 제1 성분, 제1 힌지 폴리펩티드, SEED 포맷 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 제1 폴리펩티드, 및 TAA와 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체를 포함하는 제2 성분을 포함하는 제1 아암; 및 (ii) N-말단에서 C-말단으로, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체, 제2 힌지 폴리펩티드, 및 SEED 포맷 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 제2 폴리펩티드를 포함하는 제2 아암을 포함하며, 여기서 SEED 포맷 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 이량체화된다.
일부 실시양태에서, 특정 TAA 발현 종양 세포에 대항하여 강력한 T 세포 세포독성을 유도하지만 유의미한 양의 시토카인 방출을 유도하지 않는 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 (i) N-말단에서 C-말단으로, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체를 포함하는 제1 성분, 제1 힌지 폴리펩티드, SEED 포맷 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 제1 폴리펩티드, 및 ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체를 포함하는 제2 성분을 포함하는 제1 아암; 및 (ii) N-말단에서 C-말단으로, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체, 제2 힌지 폴리펩티드, 및 SEED 포맷 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 제2 폴리펩티드를 포함하는 제2 아암을 포함하며, 여기서 SEED 포맷 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 이량체화된다.
일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 항원 결합 부위 (예를 들어, 단일-쇄 가변 단편 (scFv); 항체, Fab; Fab', F(ab')2, 미니바디; 또는 나노바디(VHH))를 포함할 수 있다. 예를 들어, ROR1과 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위는 표 1에 열거된 VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 서열, 표 2에 열거된 VH 및 VL 서열, 및/또는 표 3에 열거된 scFv 서열을 포함하는 scFv를 포함할 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 이중특이적 단백질은 브릿징 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 N-말단에서 브릿징 모이어티의 C-말단에 연결되고, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 C-말단에서 브릿징 모이어티의 N-말단에 연결된다. 일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체는 C-말단에서 브릿징 모이어티의 N-말단에 연결된다.
다른 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 C-말단에서 브릿징 모이어티의 N-말단에 연결되고, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 N-말단에서 브릿징 모이어티의 C-말단에 연결된다. 일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체는 C-말단에서 브릿징 모이어티의 N-말단에 연결된다.
상기 기재된 바와 같이, 브릿징 모이어티는 가닥-교환 조작된 도메인 (SEED) 포맷 Fc 도메인 또는 그의 기능적 단편, 이뮤노글로불린 Fc 도메인 또는 그의 기능적 단편, 폴리펩티드 링커, 또는 폴리펩티드 힌지일 수 있다. 예를 들어, 브릿징 모이어티는 표 7에 열거된 SEED 포맷 Fc 도메인 폴리펩티드 아암의 임의의 AG 및 GA 쌍을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 브릿징 모이어티는 표 8에 열거된 임의의 제1 폴리펩티드 아암 및 제2 폴리펩티드 아암 쌍을 포함하는 이뮤노글로불린 Fc 도메인을 포함할 수 있다. 브릿징 모이어티는 또한 N-말단에서 표 9에 열거된 서열 중 어느 하나로부터 선택된 서열과 같은 하나 이상의 돌연변이를 임의로 포함하는 힌지 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
또한 상기 기재된 바와 같이, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체, 또는 CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체는 링커 폴리펩티드를 통해 브릿징 모이어티의 C-말단에 연결될 수 있다. 예를 들어, 링커 폴리펩티드는 표 10에 열거된 서열 중 어느 하나로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 단백질은 제1 중쇄, 제2 중쇄 및 경쇄를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 제1 중쇄는 N-말단에서 C-말단으로, (i) CD3과 특이적으로 결합하는 Fab의 중쇄 가변 (VH) 도메인 및 중쇄 불변 도메인 1 (CH1); 및 (ii) N-말단에 힌지 폴리펩티드의 적어도 일부분, 및 SEED 포맷 Fc 도메인의 AG 또는 GA 폴리펩티드 아암을 포함하는 브릿징 모이어티를 포함할 수 있다. 본 발명의 제2 중쇄는 N-말단에서 C-말단으로, (i) ROR1과 특이적으로 결합하는 scFv; (ii) N-말단에 힌지 폴리펩티드의 적어도 일부분, 및 SEED 포맷 Fc 도메인의 GA 또는 AG 폴리펩티드 아암을 포함하는 브릿징 모이어티; (iii) 링커 폴리펩티드; 및 (iv) ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 scFv를 포함할 수 있다. 본 발명의 경쇄는 N-말단에서 C-말단으로, (i) CD3과 특이적으로 결합하는 Fab의 경쇄 가변 (VL) 도메인 및 경쇄 불변 (CL) 도메인을 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 제1 중쇄는 N-말단에서 C-말단으로, (i) CD3과 특이적으로 결합하는 Fab의 VH 도메인 및 CH1 도메인; 및 (ii) N-말단에 힌지 폴리펩티드의 적어도 일부분, 및 이종이량체화를 촉진하는 하나 또는 하나 초과의 돌연변이를 포함하는 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 제1 또는 제2 폴리펩티드 아암을 포함하는 브릿징 모이어티를 포함할 수 있다. 본 발명의 제2 중쇄는 N-말단에서 C-말단으로, (i) ROR1과 특이적으로 결합하는 scFv; (ii) N-말단에 힌지 폴리펩티드의 적어도 일부분, 및 이종이량체화를 촉진하는 하나 또는 하나 초과의 돌연변이를 포함하는 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 제2 또는 제1 폴리펩티드 아암을 포함하는 브릿징 모이어티; (iii) 링커 폴리펩티드; 및 (iv) ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 scFv를 포함할 수 있다. 본 발명의 경쇄는 N-말단에서 C-말단으로, (i) CD3과 특이적으로 결합하는 Fab의 VL 도메인 및 CL 도메인을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 제1 중쇄는 N-말단에서 C-말단으로, (i) ROR1과 특이적으로 결합하는 scFv; (ii) N-말단에 힌지 폴리펩티드의 적어도 일부분, 및 SEED 포맷 Fc 도메인의 AG 또는 GA 폴리펩티드 아암을 포함하는 브릿징 모이어티; (iii) 링커 폴리펩티드; 및 (iv) CD3과 특이적으로 결합하는 Fab의 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함할 수 있다. 본 발명의 제2 중쇄는 N-말단에서 C-말단으로, (i) ROR1과 특이적으로 결합하는 scFv; (ii) N-말단에 힌지 폴리펩티드의 적어도 일부분, 및 SEED 포맷 Fc 도메인의 GA 또는 AG 폴리펩티드 아암을 포함하는 브릿징 모이어티를 포함할 수 있다. 본 발명의 경쇄는 N-말단에서 C-말단으로, (i) CD3과 특이적으로 결합하는 Fab의 VL 도메인 및 CL 도메인을 포함할 수 있다. 제1 중쇄는 CL 내의 시스테인 잔기와 디술피드 결합을 형성할 수 있는 시스테인 잔기를 포함하는 부분적인 IgG1 힌지 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 133의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드)을 CH1 도메인의 C-말단에 부가적으로 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 제1 중쇄는 N-말단에서 C-말단으로, (i) ROR1과 특이적으로 결합하는 scFv; (ii) N-말단에 힌지 폴리펩티드의 적어도 일부분, 및 이종이량체화를 촉진하는 하나 또는 하나 초과의 돌연변이를 포함하는 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 제1 또는 제2 폴리펩티드 아암을 포함하는 브릿징 모이어티; (iii) 링커 폴리펩티드; 및 (iv) CD3과 특이적으로 결합하는 Fab의 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함할 수 있다. 본 발명의 제2 중쇄는 N-말단에서 C-말단으로, (i) ROR1과 특이적으로 결합하는 scFv; 및 (ii) N-말단에 힌지 폴리펩티드의 적어도 일부분, 및 이종이량체화를 촉진하는 하나 또는 하나 초과의 돌연변이를 포함하는 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 제2 또는 제1 폴리펩티드 아암을 포함하는 브릿징 모이어티를 포함한다. 본 발명의 경쇄는 N-말단에서 C-말단으로, (i) CD3과 특이적으로 결합하는 Fab의 VL 도메인 및 CL 도메인을 포함할 수 있다. 제1 중쇄는 CL 내의 시스테인 잔기와 디술피드 결합을 형성할 수 있는 시스테인 잔기를 포함하는 부분적인 IgG1 힌지 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 133의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드)을 CH1 도메인의 C-말단에 부가적으로 포함할 수 있다.
표 11에는 본 발명의 이중특이적 단백질의 예시적인 제1 중쇄, 제2 중쇄, 및 경쇄 서열이 열거되어 있다. 조합하여, 표 11에 열거된 바와 같은 제1 중쇄와 경쇄, 또는 제2 중쇄와 경쇄는 예를 들어 디술피드 결합에 의해 연결되어 연합하고, CD3과 특이적으로 결합할 수 있다. 본 발명의 이중특이적 단백질에서 고려된 바와 같이, SEED 포맷 Fc 도메인의 AG 폴리펩티드 아암의 힌지 폴리펩티드 및/또는 CH3 도메인은 SEED 포맷 Fc 도메인의 GA 폴리펩티드 아암의 힌지 폴리펩티드 및/또는 CH3 도메인과의 이량체화를 용이하게 하여, 제1 및 제2 중쇄와 경쇄를 포함하는 이중특이적 단백질을 생성할 수 있다. 다른 실시양태에서 고려된 바와 같이, 하나 또는 하나 초과의 돌연변이를 포함하는 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 제1 폴리펩티드 아암의 힌지 폴리펩티드 및/또는 CH2 도메인은 하나 또는 하나 초과의 돌연변이를 포함하는 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 제2 폴리펩티드 아암의 힌지 폴리펩티드 및/또는 CH2 도메인과의 이종이량체화를 용이하게 하여, 제1 및 제2 중쇄와 경쇄를 포함하는 이중특이적 단백질을 생성할 수 있다.
표 11: 예시적인 제1 중쇄, 제2 중쇄 및 경쇄 서열
이중특이적 단백질의 제조에 있어서의, 표 11에 각각 열거된 제1 또는 제2 중쇄 아미노산 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 서열을 포함하는 제1 또는 제2 중쇄의 용도가 또한 본원에 제공되며, 여기서 제1 중쇄 또는 제2 중쇄는 (i) 표 11에 열거된 경쇄 아미노산 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 경쇄와 연합되고 (예를 들어, 디술피드 결합을 통함); (ii) 표 11에 열거된 제2 또는 제1 중쇄 아미노산 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 중쇄, 또는 제1 중쇄와 연합된다. 부가적으로 이중특이적 단백질의 제조에 있어서의, 표 11에 각각 열거된 제1 또는 제2 중쇄 아미노산 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 서열을 포함하는 제1 또는 제2 중쇄를 코딩하는 핵산의 용도가 본원에 제공되며, 여기서 제1 중쇄 또는 제2 중쇄는 (i) 표 11에 열거된 경쇄 아미노산 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 경쇄와 연합되고 (예를 들어, 디술피드 결합을 통함); (ii) 표 11에 열거된 제2 또는 제1 중쇄 아미노산 서열 중 임의의 것으로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 중쇄, 또는 제1 중쇄와 연합된다. 본원에 개시된 이중특이적 단백질을 코딩하는 핵산은 표준 생물정보학 방법을 사용하여 최적의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 본 발명의 이중특이적 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 세포가 또한 고려되며, 표준 형질감염 또는 형질도입 방법 (예를 들어, 전기천공, 염화칼슘 형질감염, 리포펙션, 렌티바이러스 전달, 또는 아데노-연관 바이러스 전달)에 의해 생산될 수 있다.
I.F 단백질의 특징
일부 실시양태에서, 특정 TAA 발현 세포에 대항하여 강력한 T 세포 세포독성을 유도하지만 유의미한 양의 시토카인 방출을 유도하지 않는 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 2개의 아암을 포함하며, 제1 아암은 N-말단 단부에서 TAA와 특이적으로 결합하는 제1 성분, 및 C-말단 단부에서 동일한 TAA와 특이적으로 결합하는 제2 성분을 포함하고, 제2 아암은 N-말단 단부에서 CD3과 특이적으로 결합하는 성분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 ROR1 및 CD3과 특이적으로 결합할 수 있거나 결합하는 이중특이적 단백질을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 ROR1의 Ig-유사 도메인과 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 ROR1의 프리즐드 및/또는 크링글 도메인과 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 CD3의 CD3ε (서열식별번호: 269), CD3γ (서열식별번호: 270), CD3δ (서열식별번호: 271), 또는 CD3ξ (서열식별번호: 96) 폴리펩티드와 특이적으로 결합한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 CD3의 CD3ε 폴리펩티드와 특이적으로 결합한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 관련 기술분야에 공지된 다양한 검정 (예를 들어, 실시예 2에 기재된 바와 같은 결합 검정) 중 어느 하나에 의한 측정 시 높은 친화도로 TAA 및 CD3 둘 다와 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 관련 기술분야에 공지된 다양한 검정 (예를 들어, 실시예 2에 기재된 바와 같은 결합 검정) 중 어느 하나에 의한 측정 시 높은 친화도로 ROR1 및 CD3 둘 다와 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 생물층 간섭계 검정에서 측정 시, 1 nM 내지 10 nM, 예를 들어, 2 nM 내지 8 nM, 3 nM 내지 5 nM, 또는 4 nM 내지 6 nM의 ROR1 결합에 대한 KD를 갖는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 생물층 간섭계 검정에서 측정 시 3 nM 내지 5 nM (예를 들어, 3.0 nM, 3.2 nM, 3.4 nM, 3.6 nM, 3.8 nM, 4.0 nM, 4.2 nM, 4.4 nM, 4.6 nM, 4.8 nM, 또는 5.0 nM)의 ROR1 결합에 대한 KD를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 생물층 간섭계 검정에서 측정 시 1 nM 내지 10 nM (예를 들어, 1 nM, 2 nM, 3 nM, 4 nM, 5 nM, 6 nM, 7 nM, 8 nM, 9 nM, 또는 10 nM)의 CD3 결합에 대한 KD를 갖는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 생물층 간섭계 검정에서 측정 시 4.0 nM 내지 6.0 nM (예를 들어, 4.0 nM, 4.2 nM, 4.4 nM, 4.6 nM, 4.8 nM, 5.0 nM, 5.2 nM, 5.4 nM, 5.6 nM, 5.8 nM, 또는 6.0 nM)의 CD3 결합에 대한 KD를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 세포 결합 검정 (예를 들어, 실시예 2에 기재된 바와 같은 세포 결합 검정)에 의한 측정 시 낮은 친화도로 TAA와 결합하고 높은 친화도로 CD3과 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 세포 결합 검정 (예를 들어, 실시예 2에 기재된 바와 같은 세포 결합 검정)에 의한 측정 시 낮은 친화도로 ROR1과 결합하고 높은 친화도로 CD3과 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 생물층 간섭계 검정에서 측정 시, 75 nM 내지 150 nM, 예를 들어, 80 nM 내지 120 nM, 85 nM 내지 115 nM, 90 nM 내지 110 nM, 또는 95 내지 105 nM의 ROR1 결합에 대한 KD를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 생물층 간섭계 검정에서 측정 시 1 nM 내지 10 nM (예를 들어, 1 nM, 2 nM , 3 nM, 4 nM, 5 nM, 6 nM, 7 nM, 8 nM, 9 nM, 또는 10 nM)의 CD3 결합에 대한 KD를 갖는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 생물층 간섭계 검정에서 측정 시 4.0 nM 내지 6.0 nM (예를 들어, 4.0 nM, 4.2 nM, 4.4 nM, 4.6 nM, 4.8 nM, 5.0 nM, 5.2 nM, 5.4 nM, 5.6 nM, 5.8 nM, 또는 6.0 nM)의 CD3 결합에 대한 KD를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 세포 결합 검정 (예를 들어, 실시예 2에 기재된 바와 같은 세포 결합 검정)에 의한 측정 시 높은 친화도로 TAA와 결합하고 낮은 친화도로 CD3과 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 세포 결합 검정 (예를 들어, 실시예 2에 기재된 바와 같은 세포 결합 검정)에 의한 측정 시 높은 친화도로 ROR1과 결합하고 낮은 친화도로 CD3과 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 생물층 간섭계 검정에서 측정 시, 1 nM 내지 10 nM, 예를 들어, 2 nM 내지 8 nM, 3 nM 내지 5 nM, 또는 4 nM 내지 6 nM의 ROR1 결합에 대한 KD를 갖는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 생물층 간섭계 검정에서 측정 시 3 nM 내지 5 nM (예를 들어, 3.0 nM, 3.2 nM, 3.4 nM, 3.6 nM, 3.8 nM, 4.0 nM, 4.2 nM, 4.4 nM, 4.6 nM, 4.8 nM, 또는 5.0 nM)의 ROR1 결합에 대한 KD를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 생물층 간섭계 검정에서 측정 시 10 nM 내지 100 nM, 예를 들어, 10 nM 내지 80 nM, 10 nM 내지 60 nM, 10 nM 내지 50 nM, 10 nM 내지 40 nM, 20 nM 내지 60 nM, 30 nM 내지 50 nM, 35 nM 내지 45 nM, 15 nM 내지 80 nM, 15 nM 내지 60 nM, 15 nM 내지 40 nM, 또는 15 nM 내지 20 nM의 CD3 결합에 대한 KD를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 세포 결합 검정 (예를 들어, 실시예 2에 기재된 바와 같은 세포 결합 검정)에 의한 측정 시 낮은 친화도로 TAA와 결합하고 낮은 친화도로 CD3과 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 세포 결합 검정 (예를 들어, 실시예 2에 기재된 바와 같은 세포 결합 검정)에 의한 측정 시 낮은 친화도로 ROR1과 결합하고 낮은 친화도로 CD3과 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 생물층 간섭계 검정에서 측정 시, 75 nM 내지 150 nM, 예를 들어, 80 nM 내지 120 nM, 85 nM 내지 115 nM, 90 nM 내지 110 nM, 또는 95 내지 105 nM의 ROR1 결합에 대한 KD를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 생물층 간섭계 검정에서 측정 시 10 nM 내지 100 nM, 예를 들어, 10 nM 내지 80 nM, 10 nM 내지 60 nM, 10 nM 내지 50 nM, 10 nM 내지 40 nM, 20 nM 내지 60 nM, 30 nM 내지 50 nM, 35 nM 내지 45 nM, 15 nM 내지 80 nM, 15 nM 내지 60 nM, 15 nM 내지 40 nM, 또는 15 nM 내지 20의 CD3 결합에 대한 KD를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 유동 세포계수법-기반 결합 검정 (예를 들어, 실시예 2에 기재된 바와 같은 유동 세포계수법-기반 결합 검정)에서 측정 시 높은 친화도로 TAA 및 CD3 둘 다와 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 유동 세포계수법-기반 결합 검정 (예를 들어, 실시예 2에 기재된 바와 같은 유동 세포계수법-기반 결합 검정)에서 측정 시 높은 친화도로 ROR1 및 CD3 둘 다와 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 유동 세포계수법-기반 ROR1 결합 검정에서 측정 시 0.1 nM 내지 10 nM, 예를 들어, 0.1 nM 내지 1 nM, 0.2 nM 내지 8 nM, 0.4 nM 내지 6 nM, 0.6 nM 내지 4 nM, 0.8 nM 내지 2 nM, 0.1 nM 내지 1 nM, 0.2 nM 내지 1 nM, 0.4 nM 내지 1 nM, 0.6 nM 내지 1 nM, 0.8 nM 내지 1 nM, 1 nM 내지 10 nM, 2 nM 내지 10 nM, 6 nM 내지 10 nM, 8 nM 내지 10 nM, 2 nM 내지 4 nM, 2 nM 내지 5 nM, 2 nM 내지 6 nM, 2 nM 내지 8 nM, 또는 2 nM 내지 10 nM의 ROR1 결합에 대한 EC50을 갖는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 본 발명의 이중특이적 단백질은 약 3.5 X 104개의 ROR1 분자/세포를 발현하는 세포를 사용하는 유동 세포계수법-기반 ROR1 결합 검정에서 측정 시 0.1 nM 내지 1 nM (예를 들어, 0.1 nM, 0.2 nM, 0.3 nM, 0.4 nM, 0.5 nM, 0.6 nM, 0.7 nM, 0.8 nM, 0.9 nM, 또는 1 nM)의 ROR1 결합에 대한 EC50을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 약 3.5 X 104개의 ROR1 분자/세포를 발현하는 세포를 사용하는 유동 세포계수법-기반 ROR1 결합 검정에서 측정 시 1 nM 내지 10 nM (예를 들어, 1 nM, 2 nM, 3 nM, 4 nM, 5 nM, 6 nM, 7 nM, 8 nM, 9 nM, 또는 10 nM)의 ROR1 결합에 대한 EC50을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 약 3.5 X 104개의 ROR1 분자/세포를 발현하는 세포를 사용하는 유동 세포계수법-기반 ROR1 결합 검정에서 측정 시 2 nM 내지 5 nM (예를 들어, 2 nM, 3 nM, 4 nM, 또는 5 nM)의 ROR1 결합에 대한 EC50을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 활성화된 T 세포를 사용하는 유동 세포계수법-기반 CD3 결합 검정 (예를 들어, 실시예 2에 기재된 바와 같은 CD3 결합 검정)에서 측정 시 1 nM 내지 10 nM (예를 들어, 1 nM, 2 nM, 3 nM, 4 nM, 5 nM, 6 nM, 7 nM, 8 nM, 9 nM, 또는 10 nM)의 CD3 결합에 대한 EC50을 갖는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 활성화된 T 세포를 사용하는 유동 세포계수법-기반 CD3 결합 검정에서 측정 시 2 nM 내지 4 nM (예를 들어, 2.0 nM, 2.2 nM, 2.4 nM, 2.6 nM, 2.8 nM, 3.0 nM, 3.2 nM, 3.4 nM, 3.6 nM, 3.8 nM, 또는 4.0 nM)의 CD3 결합에 대한 EC50을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 유동 세포계수법-기반 결합 검정 (예를 들어, 실시예 2에 기재된 바와 같은 유동 세포계수법-기반 결합 검정)에서 측정 시 높은 친화도로 TAA와 결합하고 낮은 친화도로 CD3과 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 유동 세포계수법-기반 결합 검정 (예를 들어, 실시예 2에 기재된 바와 같은 유동 세포계수법-기반 결합 검정)에서 측정 시 높은 친화도로 ROR1과 결합하고 낮은 친화도로 CD3과 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 유동 세포계수법-기반 ROR1 결합 검정에서 측정 시 0.1 nM 내지 10 nM, 예를 들어, 0.1 nM 내지 1 nM, 0.2 nM 내지 8 nM, 0.4 nM 내지 6 nM, 0.6 nM 내지 4 nM, 0.8 nM 내지 2 nM, 0.1 nM 내지 1 nM, 0.2 nM 내지 1 nM, 0.4 nM 내지 1 nM, 0.6 nM 내지 1 nM, 0.8 nM 내지 1 nM, 1 nM 내지 10 nM, 2 nM 내지 10 nM, 6 nM 내지 10 nM, 8 nM 내지 10 nM, 2 nM 내지 4 nM, 2 nM 내지 5 nM, 2 nM 내지 6 nM, 2 nM 내지 8 nM, 또는 2 nM 내지 10 nM의 ROR1 결합에 대한 EC50을 갖는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 본 발명의 이중특이적 단백질은 약 3.5 X 104개의 ROR1 분자/세포를 발현하는 세포를 사용하는 유동 세포계수법-기반 ROR1 결합 검정에서 측정 시 0.1 nM 내지 1 nM (예를 들어, 0.1 nM, 0.2 nM, 0.3 nM, 0.4 nM, 0.5 nM, 0.6 nM, 0.7 nM, 0.8 nM, 0.9 nM, 또는 1 nM)의 ROR1 결합에 대한 EC50을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 약 3.5 X 104개의 ROR1 분자/세포를 발현하는 세포를 사용하는 유동 세포계수법-기반 ROR1 결합 검정에서 측정 시 1 nM 내지 10 nM (예를 들어, 1 nM, 2 nM, 3 nM, 4 nM, 5 nM, 6 nM, 7 nM, 8 nM, 9 nM, 또는 10 nM)의 ROR1 결합에 대한 EC50을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 약 3.5 X 104개의 ROR1 분자/세포를 발현하는 세포를 사용하는 유동 세포계수법-기반 ROR1 결합 검정에서 측정 시 2 nM 내지 5 nM (예를 들어, 2 nM, 3 nM, 4 nM, 또는 5 nM)의 ROR1 결합에 대한 EC50을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 활성화된 T 세포를 사용하는 유동 세포계수법-기반 CD3 결합 검정에서 측정 시 10 nM 내지 100 nM, 10 nM 내지 90 nM, 10 nM 내지 80 nM, 10 nM 내지 70 nM, 10 nM 내지 60 nM, 10 nM 내지 50 nM, 10 nM 내지 40 nM, 10 nM 내지 30 nM, 10 nM 내지 20 nM, 20 nM 내지 100 nM, 20 nM 내지 90 nM, 20 nM 내지 80 nM, 20 nM 내지 70 nM, 20 nM 내지 60 nM, 20 nM 내지 50 nM, 25 nM 내지 75 nM, 25 nM 내지 65 nM, 25 nM 내지 55 nM, 25 nM 내지 45 nM, 또는 25 nM 내지 35 nM의 CD3 결합에 대한 EC50을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 유동 세포계수법-기반 결합 검정 (예를 들어, 실시예 2에 기재된 바와 같은 유동 세포계수법-기반 결합 검정)에서 측정 시 낮은 친화도로 TAA와 결합하고 높은 친화도로 CD3과 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 유동 세포계수법-기반 결합 검정 (예를 들어, 실시예 2에 기재된 바와 같은 유동 세포계수법-기반 결합 검정)에서 측정 시 낮은 친화도로 ROR1과 결합하고 높은 친화도로 CD3과 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 유동 세포계수법-기반 ROR1 결합 검정에서 측정 시 50 nM 내지 220 nM, 60 nM 내지 220 nM, 70 nM 내지 220 nM, 80 nM 내지 220 nM, 90 nM 내지 220 nM, 100 nM 내지 220 nM, 110 nM 내지 220 nM, 120 nM 내지 220 nM, 130 nM 내지 220 nM, 140 nM 내지 220 nM, 150 nM 내지 220 nM, 175 nM 내지 220 nM, 200 nM 내지 220 nM, 50 nM 내지 200 nM, 60 nM 내지 200 nM, 70 nM 내지 200 nM, 80 nM 내지 200 nM, 90 nM 내지 200 nM, 100 nM 내지 200 nM, 110 nM 내지 200 nM, 120 nM 내지 200 nM, 130 nM 내지 200 nM, 140 nM 내지 200 nM, 150 nM 내지 200 nM, 50 nM 내지 180 nM, 60 nM 내지 180 nM, 70 nM 내지 180 nM, 80 nM 내지 180 nM, 90 nM 내지 180 nM, 100 nM 내지 180 nM, 110 nM 내지 180 nM, 120 nM 내지 180 nM, 130 nM 내지 180 nM, 140 nM 내지 180 nM, 150 nM 내지 180 nM, 50 nM 내지 160 nM, 60 nM 내지 160 nM, 70 nM 내지 160 nM, 80 nM 내지 160 nM, 90 nM 내지 160 nM, 100 nM 내지 160 nM, 110 nM 내지 160 nM, 120 nM 내지 160 nM, 130 nM 내지 160 nM, 140 nM 내지 160 nM, 150 nM 내지 160 nM, 50 nM 내지 140 nM, 60 nM 내지 140 nM, 70 nM 내지 140 nM, 80 nM 내지 140 nM, 90 nM 내지 140 nM, 100 nM 내지 140 nM, 110 nM 내지 140 nM, 120 nM 내지 140 nM, 130 nM 내지 140 nM, 50 nM 내지 120 nM, 60 nM 내지 120 nM, 70 nM 내지 120 nM, 80 nM 내지 120 nM, 90 nM 내지 120 nM, 100 nM 내지 120 nM, 110 nM 내지 120 nM, 50 nM 내지 110 nM, 60 nM 내지 110 nM, 70 nM 내지 110 nM, 80 nM 내지 110 nM, 90 nM 내지 110 nM, 100 nM 내지 110 nM, 50 nM 내지 100 nM, 60 nM 내지 100 nM, 70 nM 내지 100 nM, 80 nM 내지 100 nM, 또는 90 nM 내지 100 nM의 ROR1 결합에 대한 EC50을 갖는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 약 3.5 X 104개의 ROR1 분자/세포를 발현하는 세포를 사용하는 유동 세포계수법-기반 ROR1 결합 검정에서 측정 시 80 nM 내지 120 nM 또는 90 nM 내지 110 nM의 ROR1 결합에 대한 EC50을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 약 3.5 X 104개의 ROR1 분자/세포를 발현하는 세포를 사용하는 유동 세포계수법-기반 ROR1 결합 검정에서 측정 시 1 nM 내지 10 nM (예를 들어, 1 nM, 2 nM, 3 nM, 4 nM, 5 nM, 6 nM, 7 nM, 8 nM, 9 nM, 또는 10 nM)의 ROR1 결합에 대한 EC50을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 약 3.5 X 104개의 ROR1 분자/세포를 발현하는 세포를 사용하는 유동 세포계수법-기반 ROR1 결합 검정에서 측정 시 2 nM 내지 5 nM (예를 들어, 2 nM, 3 nM, 4 nM, 또는 5 nM)의 ROR1 결합에 대한 EC50을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 활성화된 T 세포를 사용하는 유동 세포계수법-기반 CD3 결합 검정 (예를 들어, 실시예 2에 기재된 바와 같은 CD3 결합 검정)에서 측정 시 1 nM 내지 10 nM (예를 들어, 1 nM, 2 nM, 3 nM, 4 nM, 5 nM, 6 nM, 7 nM, 8 nM, 9 nM, 또는 10 nM)의 CD3 결합에 대한 EC50을 갖는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 활성화된 T 세포를 사용하는 유동 세포계수법-기반 CD3 결합 검정에서 측정 시 2 nM 내지 4 nM (예를 들어, 2.0 nM, 2.2 nM, 2.4 nM, 2.6 nM, 2.8 nM, 3.0 nM, 3.2 nM, 3.4 nM, 3.6 nM, 3.8 nM, 또는 4.0 nM)의 CD3 결합에 대한 EC50을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 유동 세포계수법-기반 결합 검정 (예를 들어, 실시예 2에 기재된 바와 같은 유동 세포계수법-기반 결합 검정)에서 측정 시 낮은 친화도로 TAA와 결합하고 높은 친화도로 CD3과 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 유동 세포계수법-기반 결합 검정 (예를 들어, 실시예 2에 기재된 바와 같은 유동 세포계수법-기반 결합 검정)에서 측정 시 낮은 친화도로 ROR1과 결합하고 높은 친화도로 CD3과 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 유동 세포계수법-기반 ROR1 결합 검정에서 측정 시 50 nM 내지 220 nM, 60 nM 내지 220 nM, 70 nM 내지 220 nM, 80 nM 내지 220 nM, 90 nM 내지 220 nM, 100 nM 내지 220 nM, 110 nM 내지 220 nM, 120 nM 내지 220 nM, 130 nM 내지 220 nM, 140 nM 내지 220 nM, 150 nM 내지 220 nM, 175 nM 내지 220 nM, 200 nM 내지 220 nM, 50 nM 내지 200 nM, 60 nM 내지 200 nM, 70 nM 내지 200 nM, 80 nM 내지 200 nM, 90 nM 내지 200 nM, 100 nM 내지 200 nM, 110 nM 내지 200 nM, 120 nM 내지 200 nM, 130 nM 내지 200 nM, 140 nM 내지 200 nM, 150 nM 내지 200 nM, 50 nM 내지 180 nM, 60 nM 내지 180 nM, 70 nM 내지 180 nM, 80 nM 내지 180 nM, 90 nM 내지 180 nM, 100 nM 내지 180 nM, 110 nM 내지 180 nM, 120 nM 내지 180 nM, 130 nM 내지 180 nM, 140 nM 내지 180 nM, 150 nM 내지 180 nM, 50 nM 내지 160 nM, 60 nM 내지 160 nM, 70 nM 내지 160 nM, 80 nM 내지 160 nM, 90 nM 내지 160 nM, 100 nM 내지 160 nM, 110 nM 내지 160 nM, 120 nM 내지 160 nM, 130 nM 내지 160 nM, 140 nM 내지 160 nM, 150 nM 내지 160 nM, 50 nM 내지 140 nM, 60 nM 내지 140 nM, 70 nM 내지 140 nM, 80 nM 내지 140 nM, 90 nM 내지 140 nM, 100 nM 내지 140 nM, 110 nM 내지 140 nM, 120 nM 내지 140 nM, 130 nM 내지 140 nM, 50 nM 내지 120 nM, 60 nM 내지 120 nM, 70 nM 내지 120 nM, 80 nM 내지 120 nM, 90 nM 내지 120 nM, 100 nM 내지 120 nM, 110 nM 내지 120 nM, 50 nM 내지 110 nM, 60 nM 내지 110 nM, 70 nM 내지 110 nM, 80 nM 내지 110 nM, 90 nM 내지 110 nM, 100 nM 내지 110 nM, 50 nM 내지 100 nM, 60 nM 내지 100 nM, 70 nM 내지 100 nM, 80 nM 내지 100 nM, 또는 90 nM 내지 100 nM의 ROR1 결합에 대한 EC50을 갖는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 약 3.5 X 104개의 ROR1 분자/세포를 발현하는 세포를 사용하는 유동 세포계수법-기반 ROR1 결합 검정에서 측정 시 80 nM 내지 120 nM 또는 90 nM 내지 110 nM의 ROR1 결합에 대한 EC50을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 약 3.5 X 104개의 ROR1 분자/세포를 발현하는 세포를 사용하는 유동 세포계수법-기반 ROR1 결합 검정에서 측정 시 1 nM 내지 10 nM (예를 들어, 1 nM, 2 nM, 3 nM, 4 nM, 5 nM, 6 nM, 7 nM, 8 nM, 9 nM, 또는 10 nM)의 ROR1 결합에 대한 EC50을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 약 3.5 X 104개의 ROR1 분자/세포를 발현하는 세포를 사용하는 유동 세포계수법-기반 ROR1 결합 검정에서 측정 시 2 nM 내지 5 nM (예를 들어, 2 nM, 3 nM, 4 nM, 또는 5 nM)의 ROR1 결합에 대한 EC50을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 단백질은 활성화된 T 세포를 사용하는 유동 세포계수법-기반 CD3 결합 검정에서 측정 시 10 nM 내지 100 nM, 10 nM 내지 90 nM, 10 nM 내지 80 nM, 10 nM 내지 70 nM, 10 nM 내지 60 nM, 10 nM 내지 50 nM, 10 nM 내지 40 nM, 10 nM 내지 30 nM, 10 nM 내지 20 nM, 20 nM 내지 100 nM, 20 nM 내지 90 nM, 20 nM 내지 80 nM, 20 nM 내지 70 nM, 20 nM 내지 60 nM, 20 nM 내지 50 nM, 25 nM 내지 75 nM, 25 nM 내지 65 nM, 25 nM 내지 55 nM, 25 nM 내지 45 nM, 또는 25 nM 내지 35 nM의 CD3 결합에 대한 EC50을 갖는다.
CD3/TCR 복합체를 표적 세포의 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자 상에 제시된 동족 펩티드 리간드와 결합함으로써, T 세포, 예를 들어 세포독성 CD8+ T 세포의 활성화는 사전 형성된 용해성 과립의 탈과립화를 유도하고 T 세포와 표적 세포 간에 형성된 면역 시냅스로의 세포독성 효소의 방출을 유도한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 T 세포 용해성 과립 탈과립화를 촉진한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 TAA-발현 종양 세포의 T 세포 매개 세포독성을 유도한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 ROR1-발현 종양 세포의 T 세포 매개 세포독성을 유도한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 실시예 3에 기재된 바와 같은 T 세포/종양 세포 공동-배양 사멸 검정에서 측정 시, 150 pM 내지 250 pM, 155 pM 내지 250 pM, 160 pM 내지 250 pM, 165 pM 내지 250 pM, 170 pM 내지 250 pM, 175 pM 내지 250 pM, 150 pM 내지 225 pM, 155 pM 내지 225 pM, 160 pM 내지 225 pM, 165 pM 내지 225 pM, 170 pM 내지 225 pM, 175 pM 내지 225 pM, 150 pM 내지 200 pM, 155 pM 내지 200 pM, 160 pM 내지 200 pM, 165 pM 내지 200 pM, 170 pM 내지 200 pM, 175 pM 내지 200 pM, 150 pM 내지 190 pM, 155 pM 내지 190 pM, 160 pM 내지 190 pM, 165 pM 내지 190 pM, 170 pM 내지 190 pM, 또는 175 pM 내지 190 pM의 ROR1-발현 종양 세포의 T 세포 매개 세포독성에 대한 EC50을 갖는다.
다른 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 실시예 3에 기재된 바와 같은 T 세포/종양 세포 공동-배양 사멸 검정에서 측정 시, 10 pM 내지 100 pM, 15 pM 내지 100 pM, 20 pM 내지 100 pM, 25 pM 내지 100 pM, 30 pM 내지 100 pM, 35 pM 내지 100 pM, 40 pM 내지 100 pM, 50 pM 내지 100 pM, 10 pM 내지 75 pM, 15 pM 내지 75 pM, 20 pM 내지 75 pM, 25 pM 내지 75 pM, 30 pM 내지 75 pM, 35 pM 내지 75 pM, 40 pM 내지 75 pM, 50 pM 내지 75 pM, 10 pM 내지 50 pM, 15 pM 내지 50 pM, 20 pM 내지 50 pM, 25 pM 내지 50 pM, 30 pM 내지 50 pM, 35 pM 내지 50 pM, 40 pM 내지 50 pM, 10 pM 내지 40 pM, 15 pM 내지 40 pM, 20 pM 내지 40 pM, 25 pM 내지 40 pM, 30 pM 내지 40 pM, 또는 35 pM 내지 40 pM의 ROR1-발현 종양 세포의 T 세포 매개 세포독성에 대한 EC50을 갖는다.
CD3/TCR 복합체를 표적 세포의 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자 상에 제시된 동족 펩티드 리간드와 결합함으로써 T 세포의 활성화는 염증유발성 시토카인, 예컨대 IFNγ, TNFα 및 IL2 (이에 제한되지는 않음)의 방출을 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 참조 대조군 분자와 비교 시 활성화된 T 세포로부터 유의미한 수준의 염증유발성 시토카인의 방출을 유도하지 않는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 실시예 3에 기재된 바와 같은 T 세포/종양 세포 공동-배양 IFNγ 생산 검정에서 측정 시, 1000 pM 내지 2000 pM, 1200 pM 내지 2000 pM, 1400 pM 내지 2000 pM, 1600 pM 내지 2000 pM, 1800 pM 내지 2000 pM, 1000 pM 내지 1800 pM, 1200 pM 내지 1800 pM, 1400 pM 내지 1800 pM, 또는 1600 pM 내지 1800 pM의 IFNγ 방출에 대한 EC50을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 참조 대조군 분자와 비교 시 활성화된 T 세포로부터 유의미한 수준의 염증유발성 시토카인의 방출을 유도하지 않는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 실시예 3에 기재된 바와 같은 T 세포/종양 세포 공동-배양 IFNγ 생산 검정에서 측정 시, 1000 pM 내지 2000 pM, 1200 pM 내지 2000 pM, 1400 pM 내지 2000 pM, 1600 pM 내지 2000 pM, 1800 pM 내지 2000 pM, 1000 pM 내지 1800 pM, 1200 pM 내지 1800 pM, 1400 pM 내지 1800 pM, 또는 1600 pM 내지 1800 pM의 IFNγ 방출에 대한 EC50을 갖는다.
다른 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 실시예 3에 기재된 바와 같은 T 세포/종양 세포 공동-배양 IFNγ 생산 검정에서 측정 시, 100 pM 내지 1000 pM, 200 pM 내지 1000 pM, 300 pM 내지 1000 pM, 400 pM 내지 1000 pM, 500 pM 내지 1000 pM, 600 pM 내지 1000 pM, 700 pM 내지 1000 pM, 800 pM 내지 1000 pM, 900 pM 내지 1000 pM, 100 pM 내지 800 pM, 200 pM 내지 100 pM, 300 pM 내지 800 pM, 400 pM 내지 800 pM, 500 pM 내지 800 pM, 600 pM 내지 800 pM, 700 pM 내지 800 pM, 100 pM 내지 600 pM, 200 pM 내지 100 pM, 300 pM 내지 600 pM, 400 pM 내지 600 pM, 500 pM 내지 600 pM, 100 pM 내지 500 pM, 200 pM 내지 500 pM, 300 pM 내지 500 pM, 또는 400 pM 내지 500 pM의 IFNγ 방출에 대한 EC50을 갖는다.
본원에 사용된 바와 같은, "최대 농도" 또는 "Cmax"는 세포로부터 방출될 수 있는 시토카인의 최대 농도를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 T 세포/종양 세포 공동-배양 IFNγ 생산 검정에서 측정 시 참조 T 세포-결합제와 비교하여 10% 내지 80%, 20% 내지 60%, 35% 내지 45%, 45% 내지 55%, 또는 35% 내지 75%의 Cmax를 유도할 수 있다. 예를 들어, 참조 T 세포-결합제는 서열식별번호: 302, 서열식별번호: 303, 서열식별번호: 304, 및 서열식별번호: 305의 아미노산 서열을 갖는 4개의 폴리펩티드를 포함하는 이중특이적 단백질을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
참조 T 세포 결합제 폴리펩티드 1:
MGWSCIILFLVATATGVHSELVLTQSPSVSAALGSPAKITCTLSSAHKTDTIDWYQQLQGEAPRYLMQVQSDGSYTKRPGVPDRFSGSSSGADRYLIIPSVQADDEADYYCGADYIGGYVFGGGTQLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (서열식별번호: 302)
참조 T 세포 결합제 폴리펩티드 2:
QEQLVESGGRLVTPGGSLTLSCKASGFDFSAYYMSWVRQAPGKGLEWIATIYPSSGKTYYATWVNGRFTISSDNAQNTVDLQMNSLTAADRATYFCARDSYADDGALFNIWGPGTLVTISSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열식별번호: 303)
참조 T 세포 결합제 폴리펩티드 3:
QEQLVESGGRLVTPGGSLTLSCKASGFDFSAYYMSWVRQAPGKGLEWIATIYPSSGKTYYATWVNGRFTISSDNAQNTVDLQMNSLTAADRATYFCARDSYADDGALFNIWGPGTLVTISSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열식별번호: 304)
참조 T 세포 결합제 폴리펩티드 4:
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC (서열식별번호: 305)
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 항-CD3 참조 항체와 비교 시 신선하게 단리된 PBMC 배양물에 투여될 때 유의미한 수준의 TNFα 방출을 유도하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 항-CD3 참조 항체와 비교 시 높은 밀도 (예를 들어, 1.0 x 107개 세포/mL)로 48시간 동안 배양된 PBMC에 투여될 때 유의미한 수준의 TNFα 방출을 유도하지 않는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 항-CD3 참조 항체와 비교 시 신선하게 단리된 PBMC 배양물에 투여될 때 유의미한 수준의 IL2 방출을 유도하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 항-CD3 참조 항체와 비교 시 높은 밀도 (예를 들어, 1.0 x 107개 세포/mL)로 48시간 동안 배양된 PBMC에 투여될 때 유의미한 수준의 IL2 방출을 유도하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은, 주어진 이중특이적 단백질에 대한 "시토카인 방출 대 사멸 디커플링 비율"은 IFNγ 방출 유도를 위한 곡선 아래 면적 (AUC) (실시예 3에 기재된 바와 같은 T 세포/종양 세포 공동-배양 IFNγ 생산 검정에서 측정 시)과 세포독성 사멸을 위한 AUC (실시예 3에 기재된 바와 같은 T 세포/종양 세포 공동-배양 사멸 검정에서 측정 시) 간의 비율을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 T 세포/종양 세포 공동-배양 사멸 검정 및 IFNγ 생산 검정에서 측정 시 참조 T 세포-결합제에 대해 정규화된, 1:2, 1:2.1, 1:2.2, 1:2.3, 1:2.4, 1:2.5, 1:2.6. 1:2.7, 1:2.8, 1:2.9, 1:3, 1:3.1, 1:3.2, 1:3.3, 1:3.4, 1:3.5, 1:3.6, 1:3.7, 1:3.8, 1:3.9, 1:4, 1:4.1, 1:4.2, 1:4.3, 1:4.4, 1:4.5, 1:4.6, 1:4.7, 1:4.8, 1:4.9, 또는 1:5의 시토카인 방출 대 사멸 디커플링 비율을 갖는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 T 세포/종양 세포 공동-배양 사멸 검정 및 IFNγ 생산 검정에서 측정 시 참조 T 세포-결합제에 대해 정규화된 1:2 내지 1:4의 시토카인 방출 대 사멸 디커플링 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 T 세포/종양 세포 공동-배양 사멸 검정 및 IFNγ 생산 검정에서 측정 시 참조 T 세포-결합제에 대해 정규화된 1:2.2의 시토카인 방출 대 사멸 디커플링 비율을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 T 세포/종양 세포 공동-배양 사멸 검정 및 IFNγ 생산 검정에서 측정 시 참조 T 세포-결합제에 대해 정규화된 1:2.9의 시토카인 방출 대 사멸 디커플링 비율을 갖는다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "연쇄 사멸 지수" 또는 "종양 연쇄 사멸 지수"는 단일 CD8+ T 세포에 의해 사멸되는 종양 세포의 평균 수를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 2 내지 6의 종양 연쇄 사멸 지수를 유도한다. 예를 들어, 본 개시내용의 이중특이적 단백질로 처리된 T 세포는 T 세포/종양 세포 공동-배양 사멸 검정에서 측정 시 2.2 내지 5.5, 2.4 내지 5.5, 2.6 내지 5.5, 2.8 내지 5.5, 3.0 내지 5.5, 3.2 내지 5.5, 3.4 내지 5.5, 3.6 내지 5.5, 3.8 내지 5.5, 4.0 내지 5.5, 2.2 내지 5.0, 2.4 내지 5.0, 2.6 내지 5.0, 2.8 내지 5.0, 3.0 내지 5.0, 3.2 내지 5.0, 3.4 내지 5.0, 3.6 내지 5.0, 3.8 내지 5.0, 4.0 내지 5.0, 2.2 내지 4.8, 2.4 내지 4.8, 2.6 내지 4.8, 2.8 내지 4.8, 3.0 내지 4.8, 3.2 내지 4.8, 3.4 내지 4.8, 3.6 내지 4.8, 3.8 내지 4.8, 4.0 내지 4.8, 2.2 내지 4.6, 2.4 내지 4.6, 2.6 내지 4.6, 2.8 내지 4.6, 3.0 내지 4.6, 3.2 내지 4.6, 3.4 내지 4.6, 3.6 내지 4.6, 3.8 내지 4.6, 4.0 내지 4.6, 2.2 내지 4.4, 2.4 내지 4.4, 2.6 내지 4.4, 2.8 내지 4.4, 3.0 내지 4.4, 3.2 내지 4.4, 3.4 내지 4.4, 3.6 내지 4.4, 3.8 내지 4.4, 4.0 내지 4.4, 2.2 내지 4.2, 2.4 내지 4.2, 2.6 내지 4.2, 2.8 내지 4.2, 3.0 내지 4.2, 3.2 내지 4.2, 3.4 내지 4.2, 3.6 내지 4.2, 3.8 내지 4.2, 4.0 내지 4.2, 2.2 내지 4.0, 2.4 내지 4.0, 2.6 내지 4.0, 2.8 내지 4.0, 3.0 내지 4.0, 3.2 내지 4.0, 3.4 내지 4.0, 3.6 내지 4.0, 3.8 내지 4.0, 2.2 내지 3.8, 2.4 내지 3.8, 2.6 내지 3.8, 2.8 내지 3.8, 3.0 내지 3.8, 3.2 내지 3.8, 3.4 내지 3.8, 3.6 내지 3.8, 2.2 내지 3.6, 2.4 내지 3.6, 2.6 내지 3.6, 2.8 내지 3.6, 3.0 내지 3.6, 3.2 내지 3.6, 3.4 내지 3.6, 2.2 내지 3.4, 2.4 내지 3.4, 2.6 내지 3.4, 2.8 내지 3.4, 3.0 내지 3.4, 또는 3.2 내지 3.4의 연쇄 사멸 지수를 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 3.4 내지 3.6의 종양 연쇄 사멸 지수를 유도한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 3.8 내지 4.2의 종양 연쇄 사멸 지수를 유도한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 시노몰구스 CD3과 교차-반응성이지만 마우스 CD3과는 그렇지 않다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 단백질은 시노몰구스 ROR1 및 마우스 ROR1과 교차-반응성이다.
II 항체
또한 ROR1과 특이적으로 결합하는 항체가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 항체는 표 2에 열거된 서열로부터 선택된 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 표 1에 열거된 VHCDR 및 VLCDR 서열로부터 선택된 VH 및 VL CDR 서열을 포함한다.
달리 명시되지 않는 한, 표 1에 제공된 CDR 서열은 IMGT 고유 넘버링 체계 하에 결정된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE일 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 IgG1, IgG1, IgG3, 또는 IgG4이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 IgG1 항체이다.
특정 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 항체는 서열식별번호: 10 또는 서열식별번호: 25의 서열로부터 선택된 VHCDR3 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 항체는 서열식별번호: 13의 컨센서스 서열 또는 서열식별번호: 28의 서열로부터 선택된 VLCDR3 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 항체는 서열식별번호: 8 또는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 상보성-결정 영역 1 (VHCDR1); 서열식별번호: 9, 또는 서열식별번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 상보성-결정 영역 2 (VHCDR2); 및 서열식별번호: 10 또는 서열식별번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 상보성-결정 영역 3 (VHCDR3)을 포함한다.
일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 항체는 서열식별번호: 11, 또는 서열식별번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 상보성-결정 영역 1 (VLCDR1); 아미노산 서열 DAS 또는 GAS를 포함하는 경쇄 가변 상보성-결정 영역 2 (VLCDR2); 및 서열식별번호: 14, 서열식별번호: 15, 또는 서열식별번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 상보성-결정 영역 3 (VLCDR3)을 포함한다.
일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 항체는 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1; 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2; 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3; 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1; DAS의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2; 및 서열식별번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함한다.
일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 항체는 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1; 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2; 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3; 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1; DAS의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2; 및 서열식별번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함한다.
일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 항체는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1; 서열식별번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2; 서열식별번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3; 서열식별번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1; GAS의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2; 및 서열식별번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함한다.
일부 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 항체는, IMGT 고유 넘버링 체계에 따라, 각각 표 1의 VHCDR 및 VLCDR 컨센서스 서열의 VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 서열에 상응하는 아미노산 서열을 각각 포함하는, VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3을 포함한다.
특정 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 항체는 표 2에 개시된 항체의 VH와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 가변 도메인 (VH), 및 표 2에 개시된 동일한 항체의 VL과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 항체는 표 1에 개시된 VH 및 VL 서열의 IMGT 고유 넘버링 체계, 카바트 (문헌 [Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH Publication No. 91-3242, Bethesda] 참조), 코티아 (예를 들어, 문헌 [Chothia C & Lesk A M, (1987), J. Mol. Biol. 196: 901-917] 참조), 맥컬럼 (문헌 [MacCallum R M et al., (1996) J. Mol. Biol. 262: 732-745] 참조), 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 다른 CDR 결정 방법 하에 결정된, 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 및 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함한다.
특정 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 항체는 서열식별번호: 29와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 30과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 항체는 서열식별번호: 29와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 31과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 실시양태에서, ROR1과 특이적으로 결합하는 항체는 서열식별번호: 39와 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 40과 적어도 90% (예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
III 치료적 적용
본 개시내용은 또한 본원에 개시된 단백질의 치료상 유효량을 함유하는 제약 제형을 제공한다. 제약 제형은 하나 이상의 부형제를 포함하며 특정 pH로 유지된다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "부형제"는 원하는 물리적 또는 화학적 특성, 예를 들어 pH, 삼투압, 점도, 투명도, 색상, 등장성, 냄새, 무균성, 안정성, 용해 또는 방출 속도, 흡착 또는 침투를 제공하기 위해 제형에 부가되는 임의의 비-치료제를 의미한다.
본 출원은 본원에 기재된 단백질 및/또는 본원에 기재된 제약 제형을 사용하여 암을 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 만성 림프구성 백혈병, 외투 세포 림프종, 비-호지킨 림프종, 난소암, 폐암, 기관지암, 결장암, 직장암, 흑색종, 신장암, 위암, 췌장암, 전립선암, 자궁암, 유방암, 구강암, 인두암, 모발상 세포 백혈병, 간암, 간내 담관암, 및 갑상선암을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 암을 치료하는데 사용될 수 있다.
실시예
이제 일반적으로 설명되는 본 개시내용은 하기 실시예를 참조하여 더 쉽게 이해될 것이며, 이는 본 개시내용의 특정 측면 및 실시양태를 예시하기 위한 목적으로만 포함되며, 어떤 방식으로든 본 개시내용의 범위를 제한하려는 의도는 아니다.
실시예 1: 시약 제조
본 실시예는 본 개시내용의 데이터를 생성하는데 사용된 시약 및 스크리닝 검정을 설명한다.
1.1 루시페라제 리포터 표적 세포
렌티바이러스 형질도입을 통해 반딧불이 루시페라제 및 eGFP를 안정적으로 발현하도록 표적 세포를 조작하였다. 샘플에 D-루시페린을 부가할 때 루시페라제 활성의 상실을 세포 사멸의 지표로서 사용하였다.
1.2 ROR1-결합 클론의 스크리닝 및 확인
클론 69A02는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 표준 기술을 사용하여 재조합 ROR1 단백질을 패닝하는 나이브 인간 scFv 파지 라이브러리로부터 수득하였다. His-태그부착된 인간 ROR2 세포외 도메인 (ECD) 및 무관한 His-태그부착된 음성 표적에 대해 역선택을 수행하였다. His-태그부착된 인간 ROR1 ECD ROR1 결합제에 대해 양성 선택이 수행되었다. 인간 ROR1 vs. 인간 ROR2에 대한 1차 스크리닝에 이어 재조합적으로 과다 발현된 인간 ROR1에 대한 특이적 세포 결합에 대한 2차 스크리닝이 이어졌다. 코팅된 인간 Fc-Ig (huFc-Ig) (서열식별번호: 134), 인간 Fc-Ig-프리즐드 (huFc-Ig-frz) (서열식별번호: 137), 또는 인간 Fc-프리즐드-크링글 (huFc-frz-KNG) (서열식별번호: 138) 융합 단백질을 적용한 후속 ELISA 도메인 비닝은 인간 ROR1의 Ig-유사 도메인에 대한 69A02의 특이성을 밝혀내었다. 부가의 샌드위치 ELISA-기반 Ig-결합제 비닝 (결합제 A의 코팅, 사전 인큐베이션 결합제 B + 인간 ROR1 ECD-His, 항-His-서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)를 통한 비-중첩 결합의 검출)은 추가의 내부 히트 후보와 중첩되지 않는 고유한 에피토프를 나타내었다.
클론 82H02는 인간 ROR1 ECD-His 단백질로 면역된 인간 가변 항체 도메인을 생산하는 트랜스제닉 래트로부터 유래된 무작위로 쌍을 이룬 Fab 효모 표면 디스플레이 라이브러리를 적용함으로써 확인되었다. 82H02는 마우스 및 인간 ROR1에 대한 게이팅에 의해 선택되었으며 후속 분류 라운드에서는 huFc-Ig (서열식별번호: 134)에 대해 추가로 분류되었지만 huFc-frz-KNG (서열식별번호: 138) 결합에 대해서는 그렇지 않았다. 재조합 세포주를 사용한 유동 세포계수법을 통해, 인간 ROR2와 결합하지 않고서도 인간 ROR1에 대한 특이성을 확인하였다. 이는 표준 ELISA 검정을 사용하여 추가로 확인되었다.
huFc-Ig:
MKLPVRLLVLMFWIPASLSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKQETELSVSAELVPTSSWNISSELNKDSYLTLDEPMNNITTSLGQTAELHCKVSGNPPPTIRWFKNDAPVVQEPRRLSFRSTIYGSRLRIRNLDTTDTGYFQCVATNGKEVVSSTGVLFVKFGPPPTASPGYSDEY (서열식별번호: 134)
huFc-frz:
MKLPVRLLVLMFWIPASLSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKQETELSVSAELVPTSSWNISSELNKDSYLTLDEPMNNITTSLGQTAELHCKVSGNPPPTIRWFKNDAPVVQEPRRLSFRSTIYGSRLRIRNLDTTDTGYFQCVATNGKEVVSSTGVLFVKFGPPPTASPGYSDEYEEDGFCQPYRGIACARFIGNRTVYMESLHMQGEIENQITAAFTMIGTSSHLSDKCSQFAIPSLCHYAFPYCDETSSVPKPRDLCRDECEILENVLCQTEYIFARSNPMILMRLKLPNCEDLPQPESPEAANCIRIGIPMADPINKNH (서열식별번호: 137)
huFc-frz-KNG:
MKLPVRLLVLMFWIPASLSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKVKFGPPPTASPGYSDEYEEDGFCQPYRGIACARFIGNRTVYMESLHMQGEIENQITAAFTMIGTSSHLSDKCSQFAIPSLCHYAFPYCDETSSVPKPRDLCRDECEILENVLCQTEYIFARSNPMILMRLKLPNCEDLPQPESPEAANCIRIGIPMADPINKNHKCYNSTGVDYRGTVSVTKSGRQCQPWNSQYPHTHTFTALRFPELNGGHSYCRNPGNQKEAPWCFTLDENFKSDLCDIPACDSKDSKEKNKMEILY (서열식별번호: 138)
실시예 2: 세포 결합 검정
본 실시예는 본 개시내용의 이중특이적 TCE의 결합 친화도를 결정하기 위해 사용된 세포 결합 검정을 설명한다.
표적 세포 (예를 들어, 인간 Jurkat-T 세포 (도 2a); 시노몰구스 범-T 세포 (도 2b); C57BL/6 인간 CD3ε 녹인 마우스 T 세포 (도 2c); CD3ε 녹아웃 인간 Jurkat-T 세포 (도 2d); MDA-MB-231 세포 (도 3a); T-47D 세포 (도 3b); 인간 ROR1 발현 마우스 4T1 세포 (도 3c); 마우스 ROR1 발현 마우스 4T1 세포 (도 3d); 인간 CD8+ T 세포 (도 12a); 시노몰구스 pan-T 세포 (도 12b); MDA-MB-231 세포 (도 13a 및 도 13b); 마우스 ROR1 발현 마우스 4T1 세포 (도 13c 및 도 13d)를 V-바닥 96-웰 플레이트에 웰당 300,000개의 세포로 부가하였다. 실온에서 5분 동안 500 x g로 원심분리하여 200 μL의 인산염 완충 식염수 (PBS)로 2회 세척한 후, 세포를 100 μL의 생/사 고정 가능 그린 작업 완충액에 재현탁시켰다 [써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific), Cat No: L23101; 생/사 고정 가능 그린 분말의 1개 바이알을 50 μL의 DMSO에 용해시키고 1 μL의 용해된 생/사 고정 가능 그린을 1 mL의 PBS에 부가하여 작업 완충액을 제조하였다]. 실온에서 15분 동안 인큐베이션한 후, 세포를 실온에서 5분 동안 500 x g로 원심분리하여 200 μL의 PBS로 2회 세척하고 BD 염색 완충액 [BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences), Cat No: 554657] 중의 50 mL의 10% 염소 혈청에 재현탁시켰다. 다음으로, 세포를 실온에서 20분 동안 인큐베이션하고 50 μL의 이중특이적 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제) (서열식별번호: 302, 서열식별번호: 303, 서열식별번호: 304, 서열식별번호: 305의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함함), 참조 프리즐드-결합 TCE (Ref Frz-결합 TCE 1A 또는 Ref Frz-결합 TCE 1B), 69A02 TCE (69A02 TCE 1A 또는 69A02 TCE 1B) 또는 82H02 TCE (82H02 TCE 1A 또는 82H02 1B) (각각의 도면에 표시된 바와 같이, 250 nM 내지 10 pM의 BD 염색 완충액 중의 연속 희석액)를 세척 없이 세포에 부가하였다. 그런 다음 플레이트를 직사광선을 피하기 위해 호일로 덮고 4℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 실온에서 5분 동안 500 x g로 원심분리하여 200 μL의 PBS로 2회 세척하고, BD 염색 완충액 중 100 μL의 3 μg/mL 염소 항-인간 IgG-알렉사 플루오르 647 항체 [잭슨 이뮤노리서치 랩(Jackson ImmunoResearch Lab), Cat No: 109-606-003]에 재현탁시켰다. 4℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 세포를 실온에서 5분 동안 500 x g로 원심분리하여 200 μL의 PBS로 2회 세척하고, 100 μL의 고정 완충액 [바이오레젠드(BioLegend), Cat No: 420801]에 재현탁시켰다. 그런 다음 샘플을 플로우조(FlowJo) 소프트웨어를 사용하여 결합 신호에 대해 유동 세포계수기에서 분석하였다. 참조 분자 및 시험 이중특이적 TCE에 대한 ROR1 및 CD3 결합 EC50 (농도 vs 평균 형광 강도 (MFI))은 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)의 4-파라미터 비-선형 회귀 곡선 피팅을 사용하여 수득되었다.
2.1 CD3 결합 친화도
Jurkat T 세포, 시노몰구스 범-T 세포, 인간 CD3의 엑토도메인과 마우스 CD3의 막횡단 및 세포질 도메인으로 이루어진 키메라 CD3ε를 발현하는 C57BL/6 마우스로부터 단리된 T 세포, 또는 인간 CD3 녹아웃 Jurkat T 세포에 대한, 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제), 포맷 1A의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE (Ref. Frz-결합 TCE 1A), 포맷 1B의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE (Ref. Frz-결합 TCE 1B), 포맷 1A의 이중특이적 TCE 69A02 (69A02 TCE 1A), 포맷 1B의 이중특이적 TCE 69A02 (69A02 TCE 1B), 포맷 1A의 이중특이적 TCE 82H02 (82H02 TCE 1A), 및 포맷 1B의 이중특이적 TCE 82H02 (82H02 TCE 1B)와 연관된 인간 또는 시노몰구스 CD3에 대한 겉보기 결합 친화도를 각각 도 2a (및 표 12에 요약됨), 도 2b (및 표 12에 요약됨), 도 2c (및 표 12에 요약됨), 및 도 2d (및 표 12에 요약됨)에 나타내었다.
표 12: 겉보기 CD3 결합 친화도
표 12에 나타낸 바와 같이, EC50은 인간, 시노몰구스 및 인간/마우스 키메라 CD3에 대한 69A02 TCE 1A, 69A02 TCE 1B, 82H02 TCE 1A 및 82H02 TCE 1B의 겉보기 결합 친화도가 서로 3배 미만 차이가 있음을 나타낸다. 69A02 및 82H02 TCE의 CD3에 대한 겉보기 결합 친화도는 포맷 1A와 비교 시 포맷 1B에서 대략 4배 더 낮았다. 참조 T 세포-결합제는 포맷 1A의 이중특이적 TCE 69A02 및 82H02와 비교 시 CD3에 대해 대략 15배 더 낮은 겉보기 결합 친화도를 가졌고 포맷 1B의 이중특이적 TCE 69A02 및 82H02와 비교 시 CD3에 대해 대략 4배 더 낮은 겉보기 결합 친화도를 가졌다. CD3에 대한 특이성을 다루기 위해, CD3이 없는 Jurkat T 세포에 대한 포맷 1A 및 포맷 1B의 이중특이적 TCE 69A02 및 82H02의 결합을 평가하였다 (도 2d). 비-특이적 결합은 관찰되지 않았다.
82H02의 서열 최적화된 변이체를 포함하는 이중특이적 TCE (높은 ROR1 결합 친화도와 높은 CD3 친화도를 갖는 82H02 TCE #1; 높은 ROR1 결합 친화도와 낮은 CD3 결합 친화도를 갖는 82H02 TCE #2; 낮은 ROR1 결합 친화도와 높은 CD3 결합 친화도를 갖는 82H02 TCE #3; 및 낮은 ROR1 결합 친화도와 낮은 CD3 결합 친화도를 갖는 82H02 TCE #4), 및 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제)와 연관된 인간 및 시노몰구스 CD3에 대한 겉보기 결합 친화도는 인간 CD8+ T 세포 (도 12a 및 표 13에 요약됨) 및 시노몰구스 마카크로부터의 범 T 세포 (도 12b 및 표 13에 요약됨)를 사용하는 유동 세포계수법에 의해 결정되었다.
표 13: 서열 최적화된 변이체의 겉보기 CD3 결합 친화도
표 13에 나타낸 바와 같이, 참조 T 세포-결합제는 인간 및 시노몰구스 CD3 둘 다에 대해 각각 약 250 및 350 nM에서 가장 약한 친화도를 가졌다. 이들 값은 서열 최적화된 변이체 82H02 TCE #1 및 82H02 TCE #3보다 대략 100배 더 낮은 친화도였으며, 서열 최적화된 변이체 82H02 TCE #2 및 82H02 TCE #4보다 대략 10배 내지 15배 더 낮은 친화도였다. 각각의 서열 최적화된 82H02 TCE 변이체에 대한 인간 및 시노몰구스 CD3에 대한 겉보기 CD3 결합 친화도 간의 차이는 2배 미만이었다. 흥미롭게도, 82H02 TCE #1에 의해 결합된 CD3 분자의 최대 수 (Cmax)는 82H02 TCE #3에 대해 관찰된 Cmax보다 30% (인간) 내지 40% (시노몰구스) 더 높았다. 이러한 관찰에 대한 작용 메커니즘은 불분명하지만 82H02 TCE #3보다 82H02 TCE #1에서 CD3으로 더 쉽게 접근할 수 있게 하는 2개의 이중특이적 TCE 간의 입체 형태의 차이로 인해 발생할 수 있다.
2.2 ROR1 결합 친화도
MDA-MB-231 세포, T47D 세포, 인간 ROR1을 과다 발현하도록 조작된 4T1 세포, 또는 뮤린 ROR1을 과다 발현하도록 조작된 4T1 세포에 대한, 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제), 포맷 1A의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE (Ref. Frz-결합 TCE 1A), 포맷 1B의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE (Ref. Frz-결합 TCE 1B), 포맷 1A의 이중특이적 TCE 69A02 (69A02 TCE 1A), 포맷 1B의 이중특이적 TCE 69A02 (69A02 TCE 1B), 포맷 1A의 이중특이적 TCE 82H02 (82H02 TCE 1A), 및 포맷 1B의 이중특이적 TCE 82H02 (82H02 TCE 1B)와 연관된 인간 ROR1에 대한 겉보기 결합 친화도를 각각 도 3a (및 표 14에 요약됨), 도 3b (및 표 14에 요약됨), 도 3c (및 표 14에 요약됨) 및 도 3d (및 표 14에 요약됨)에 나타내었다.
표 14: 겉보기 ROR1 결합 친화도
표 14에 나타낸 바와 같이, 참조 T 세포-결합제, 69A02 TCE 및 82H02 TCE의 겉보기 결합 친화도는 낮은 수준의 ROR1을 발현하는 야생형 MDA-MB-231 세포를 사용한 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE보다 30배 초과하여 더 높았다. ROR1- T47D 세포에 대한 최소한의 비-특이적 결합은 참조 T 세포 결합제 및 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE를 고농도로 사용하여 관찰되었다. 69A02 또는 82H02 TCE에서는 비-특이적 결합이 관찰되지 않았다.
마우스 ROR1에 대한 포맷 1A 및 포맷 1B의 이중특이적 82H02의 겉보기 결합 친화도를 결정하기 위해, 피기백(PiggyBAC) 트랜스포존을 사용하여 4T1 세포를 조작하여 마우스 ROR-1을 과다 발현하였고 (도 3d), 인간 ROR1을 발현하도록 조작된 세포와 비교하였다 (도 3c). 인간 및 마우스 ROR1에 대한 겉보기 친화도는 포맷 1A의 이중특이적 TCE 82H02, 포맷 1B의 이중특이적 TCE 82H02 및 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE 간에 3배 미만의 차이가 있었다. 정제된 인간 IgG를 음성 대조군으로서 사용하였다. 참조 T 세포-결합제는 마우스 ROR1과 결합하지 않았다.
참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE에 대한 겉보기 ROR1 결합 친화도는 MDA-MB-231 세포 (도 3a)와 비교 시 인간 ROR1을 발현하도록 조작된 4T1 세포 (도 3c)에서 30배 초과하여 더 높았다. 이러한 결합 친화도 증가는 4T1-hROR1+ 세포 상의 ROR1 발현 밀도가 MDA-MB-231 세포 상의 발현보다 10배 초과하여 높기 때문일 수 있다. 추가로, 포맷 1A 및 1B의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE에 의해 결합된 hROR1 분자의 최대 수는 포맷 1A 및 1B의 이중특이적 TCE 82H02보다 대략 2.5배 더 적었다. 대조적으로, 마우스 ROR1의 경우, 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE 및 포맷 1A 및 1B의 이중특이적 TCE 82H02에 의해 결합된 muROR1 분자의 최대 수는 거의 동일하였다. 이러한 인간 대 마우스 ROR1에 대한 결합의 차이가 나타나는 이유는 (1) 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE가 특이적인 인간 대 마우스 ROR1 프리즐드 도메인에 대한 접근성 및/또는 (2) 4T1 세포에서 인간과 마우스 ROR1 발현 간의 밀도 차이에 기인할 수 있다.
82H02의 서열 최적화된 변이체를 포함하는 이중특이적 TCE (82H02 TCE #1, 82H02 TCE #2, 82H02 TCE #3, 82H02 TCE #4) 및 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제)와 연관된 인간 및 마우스 ROR1에 대한 겉보기 결합 친화도는 ROR1+ MDA-MB-231 세포 (도 13a 및 표 15에 요약됨) 및 뮤린 ROR1을 과다 발현하도록 조작된 4T1 세포 (도 13b 및 표 15에 요약됨)를 사용하여 유동 세포계수법에 의해 결정되었다.
표 15: 서열 최적화된 변이체의 겉보기 ROR1 결합 친화도
표 15에 나타낸 바와 같이, 서열 최적화된 변이체 82H02 TCE #1 및 82H02 TCE #2 둘 다는 인간과 마우스 ROR1 간의 겉보기 ROR1 결합 친화도에 있어서 대략 3배의 차이를 가졌다. 서열 최적화된 변이체 82H02 TCE #3 및 82H02 TCE #4의 경우, 인간과 마우스 간의 겉보기 ROR1 결합 친화도에 있어서의 차이는 각각 대략 5배 및 6.5배였다. 높은 ROR1 결합 친화도를 갖는 이중특이적 TCE (82H02 TCE #1 및 82H02 TCE #2)와 낮은 ROR1 결합 친화도를 갖는 이중특이적 TCE (82H02 TCE #3 및 82H02 TCE #4) 간의 겉보기 ROR1 결합 친화도 차이는 인간 ROR1의 경우 100 내지 250배 범위이고, 마우스 ROR1의 경우에는 250 내지 500배 범위였다. 흥미롭게도, 높은 ROR1 결합 친화도를 갖는 이중특이적 TCE의 겉보기 ROR1 결합 친화도는 높거나 낮은 CD3 결합 친화도에 의해 눈에 띄게 영향을 받지는 않았지만, 82H02 TCE #3 (낮은 82H02 결합 친화도와 높은 CD3 결합 친화도를 가짐) 대 82H02 TCE #4 (낮은 82H02 결합 친화도와 낮은 CD3 결합 친화도를 가짐)의 ROR1 결합 친화도 차이는 인간 ROR1 및 마우스 ROR1에 대해 각각 약 3배 및 2배 더 높았다. 이러한 결과는 82H02 TCE #1 및 82H02 TCE #2에 비해 82H02 TCE #3 및 82H02 TCE #4에 의해 결합된 ROR1 분자의 최대 수에 기인할 수 있으며, 이로 인해 82H02 TCE #3 및 82H02 TCE #4에 대한 정확한 EC50 결합 값을 계산하기가 어려워졌다.
실시예 3: 표적 의존적 세포독성 (TDCC) 및 시토카인 방출 검정 (TDCR)
본 실시예는 본 개시내용의 이중특이적 TCE의 존재 또는 부재 하에 CD8+ T 세포에 의한 표적 종양 세포 사멸 및 시토카인 방출의 유도를 설명한다.
3.1 인간 CD8
+
T 세포를 사용하는 TDCC 및 TDCR 검정
TDCC 및 TDCR 실험 24시간 전에, 표적 세포 (MDA-MB-231 세포 (도 5a 및 도 5b); MCF-7 세포 (도 5c); T-47D 세포 (도 5d); MDA-MB-231 세포 (도 8a 및 도 8c))를 항생제가 없는 배지에서 배양하였다. 100 μL의 표적 세포 현탁액을 흑색 벽의 투명한 평평한 바닥 플레이트의 각각의 웰에 분배하고 (웰당 5000개 세포), 4시간 동안 인큐베이션하였다. 250 IU/mL IL2에서 48시간 동안 배양된 인간 CD8+ T 세포 [헤마케어 바이오리서치(HemaCare Bioresearch) (Cat No. PB08NC)]의 생육력은 트립판 블루 배제를 통해 결정되었으며, 생육 가능한 세포 밀도는 250 U/mL IL2가 보충된 AIM-V 배지 [깁코(Gibco), Cat No: 12055-091]에서 500,000개의 세포/mL로 조정되었다. 시험 이중특이적 TCE, 참조 T 세포-결합제 및 참조 프리즐드-결합 TCE를 AIM-V 배지에 연쇄적으로 희석하였다. 표적 세포의 4시간 인큐베이션 종료 시, 배양 배지를 제거하고 50 μL의 배지 대조군를 지정된 웰에 부가하거나 50 μl의 CD8+ T 세포 현탁액을 각각의 지정된 웰에 부가하여 이펙터 CD8+ T 세포:표적 세포 (E:T) 비율을 5:1로 만들었다. 50 μL의 배지 대조군, 시험 이중특이적 TCE, 참조 T 세포-결합제, 또는 참조 프리즐드-결합 TCE 희석액을 지정된 웰에 부가하고, 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션하였다.
24시간 인큐베이션 후, 플레이트를 1000 RPM에서 30초 동안 원심분리하고 50 μl의 상청액을 흑색 벽의 투명한 평평한 바닥 플레이트로 옮기고, 50 μL의 ONE-Glo 루시페라제 검정 용액 [프로메가(Promega), Cat No: E6120]을 각각의 웰에 부가하고 실온에서 2분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트 내 샘플의 생물발광은 엔비젼(Envision) 플레이트 판독기 (또는 등가물)를 사용하여 측정되었다. 샘플 내 표적 세포의 사멸 백분율은 CD8+ T 세포 및 배지 대조군과 공동-배양된 표적 세포를 포함하는 샘플의 생물발광을 표적 세포의 100% 사멸로서 처리함으로써 계산된 반면, 표적 세포를 포함하는 샘플의 생물발광 및 CD8+ T 세포의 부재 하에 표적 세포를 포함하는 샘플의 생물발광은 표적 세포의 0% 사멸로서 간주된다. 사멸 EC50 (농도 vs 사멸 백분율)은 그래프패드 프리즘에서 4-파라미터 비-선형 회귀 곡선 피팅을 사용하여 수득되었다.
24시간 인큐베이션 후, IFNγ 방출 검출을 위해 50 μL의 상청액을 V-바닥 저장 플레이트의 웰로 옮겼다. IFNγ 방출은 인간 IFNγ AlphaLISA 검출 키트 [퍼킨엘머(PerkinElmer), Cat No: AL217F]를 사용하여 측정되었다. 간단히 언급하면, 5 μL의 샘플 또는 표준물을 불투명한 384-웰 평평한 바닥 검정 플레이트에 부가하였다. AlphaLISA 항-IFNγ 수용체 비드 (1 용적)를 198 용적의 준비된 1x 검정 완충액 중 비오티닐화된 항-IFNγ 항체 (1 용적)와 혼합하였다. 20 μL의 혼합 수용체 비드/항체를 샘플 및 표준물에 부가하고 실온 하의 암실에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 다음으로, 1 용적의 스트렙타비딘 공여자 비드를 61.5 용적의 1x 검정 완충액에 희석하고 25 μL의 희석된 스트렙타비딘 공여자 비드를 샘플과 표준물을 함유하는 웰에 부가하고 실온 하의 암실에서 30분간 인큐베이션하였다. 30분 인큐베이션 후, 엔비젼 플레이트 판독기를 사용하여 플레이트를 판독하였다. IFNγ 농도로의 전환은 제조업체의 사양에 따라 계산되었다. IFNγ 방출의 EC50 (농도 vs IFNγ)은 그래프패드 프리즘의 4-파라미터 비-선형 회귀 곡선 피팅을 사용하여 수득되었다.
도 5a에 나타낸 바와 같이 (표 16에 요약됨), 참조 T 세포-결합제 및 포맷 1A의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE는 MDA-MB-231 세포와 공동-배양될 때 CD8+ T 세포 세포독성을 유도할 수 있는 능력에 대해 시험된 가장 강력한 분자였으며 서로 2배 미만의 차이가 있었다. 효능은 표적 세포 사멸에 대한 EC50으로서 정의되었다. 포맷 1A의 이중특이적 TCE 69A02와 포맷 1A의 이중특이적 TCE 82H02에 대한 EC50은 둘 다 대략 20 pM이었고 포맷 1B의 이중특이적 TCE 69A02와 포맷 1B의 이중특이적 TCE 82H02에 대한 EC50의 차이는 각각 2 내지 3배 이내였다.
참조 T 세포-결합제, 포맷 1A의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE, 포맷 1A의 이중특이적 TCE 69A02 및 포맷 1A의 이중특이적 TCE 82H02의 사멸 규모는 눈에 띄게 상이하지 않은 반면, 포맷 1B의 이중특이적 TCE 69A02 및 포맷 1B의 이중특이적 TCE 82H02는 약 35 내지 60 pm 범위의 EC50로 효능이 약간 감소하였다.
표 16: 인간 CD8
+
T 세포의 표적 의존적 세포독성
도 5b에 나타낸 바와 같이 (표 17에 요약됨), 참조 T 세포-결합제 및 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE는 MDA-MB-231 세포와 공동-배양될 때 CD8+ T 세포 IFNγ 방출을 유도할 수 있는 능력에 대해 시험된 가장 강력한 분자였으며 서로 대략 2배의 차이가 있었다. 효능은 IFNγ 방출에 대한 EC50으로서 정의되었다.
포맷 1A의 이중특이적 TCE 69A02 및 포맷 1A의 이중특이적 TCE 82H02는 참조 T 세포-결합제보다 대략 2 내지 3배 덜 강력했으며 대략 30% 적은 최대 IFNγ 방출을 유도하였으며, 이는 T 세포 세포독성 활성 유도로부터의 디커플링을 나타낸다. 포맷 1B의 이중특이적 TCE 69A02 및 포맷 1B의 이중특이적 TCE 82H02는 참조 T 세포-결합제보다 대략 3 내지 9배 덜 강력했으며 대략 40% 적은 최대 IFNγ 방출을 유도하였다.
도 5c 및 5d에 나타낸 바와 같이 (표 17에 요약됨), 포맷 1A 또는 포맷 1B의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE, 또는 포맷 1A 또는 포맷 1B의 이중특이적 TCE 69A02는 검출 가능한 수준의 IFNγ 방출을 유도하지 못하였으며, 이는 IFNγ 방출이 ROR1 의존적임을 나타낸다.
표 17: 인간 CD8
+
T 세포의 표적 의존적 시토카인 방출
3.2 시노몰구스 CD8
+
T 세포를 사용하는 TDCC 및 TDCR 검정
시노몰구스 원숭이가 본 개시내용의 이중특이적 TCE를 연구하기 위한 관련 종인지 평가하기 위해, 본 발명자들은 시험관 내 표적 의존적 세포독성 및 IFNγ 방출 검정에서 인간 및 시노몰구스 CD8+ T 세포의 기능적 활성을 비교하였다.
시노몰구스 CD8+ T 세포 [IQ 바이오사이언시즈(IQ Biosciences), Cat No: IQB-Mn1-CD8T2]를 사용하는 TDCC 검정은 상기 실시예 3.1에 기재된 바와 같은 인간 CD8+ T 세포를 사용하는 TDCC 검정과 유사한 방법을 사용하여 수행되었다.
시노몰구스 CD8+ T 세포를 사용하는 TDCR 검정은 상기 실시예 3.1에 기재된 바와 같은 인간 IFNγ AlphaLISA 검출 키트와 유사한 제조업체의 프로토콜을 갖는 시노몰구스 IFNγ AlphaLISA 검출 키트 (퍼킨엘머, Cat No: AL561C)를 사용하여 수행되었다.
도 8a 및 도 8b에 나타낸 바와 같이 (표 18에 요약됨), MDA-MB-231 종양 세포와 공동-배양될 때 CD8+ T 세포 세포독성을 유도할 수 있는 능력에 대해 시험된 분자의 순위 순서는 인간 및 시노몰구스 CD8+ T 세포 둘 다에 대해 동일하였으며; 즉, 포맷 1A의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE > 참조 T 세포-결합제 > 포맷 1B의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE > 포맷 1A의 이중특이적 TCE 82H02 > 포맷 1B의 이중특이적 TCE 82H02였다. 시험된 각각의 분자에 대해, 처리된 인간 CD8+ T 세포와 처리된 시노몰구스 CD8+ T 세포 간의 세포독성 활성 유도 효능에서는 대략 2배의 차이가 있었다.
표 18: 인간 및 시노몰구스 CD8
+
T 세포의 표적 의존적 세포독성
도 8c 및 도 8d에 나타낸 바와 같이 (표 19에 요약됨), MDA-MB-231 종양 세포와 공동-배양된 CD8+ T 세포로부터 IFNγ 방출을 유도할 수 있는 능력에 대해 시험된 분자의 순위 순서는 인간 및 시노몰구스 CD8+ T 세포 둘 다에 대해 동일하였으며; 즉, 포맷 1A의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE > 참조 T 세포-결합제 > 포맷 1B의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE > 포맷 1A의 이중특이적 TCE 82H02 > 포맷 1B의 이중특이적 TCE 82H02였다. 시험된 각각의 분자에 대해, 처리된 인간 CD8+ T 세포와 처리된 시노몰구스 CD8+ T 세포 간의 IFNγ 방출 유도 효능에 대략 2배의 차이가 있었다.
ROR1 의존적 종양 세포 세포독성 및 IFNγ 방출의 규모는 인간과 시노몰구스 CD8+ T 세포 간에 유사하였다. 이는 본 개시내용의 이중특이적 TCE의 비-임상 연구를 위한 시노몰구스 원숭이의 사용을 뒷받침해준다.
표 19: 인간 및 시노몰구스 CD8
+
T 세포의 표적 의존적 시토카인 방출
3.3 인간 PBMC를 사용하는 TDCC 및 TDCR 검정
인간 전혈 및 표적 세포 (MDA-MB-231 세포 (도 4a, 도 4c 및 도 14); T-47D 세포 (도 4b 및 도 4d); Du-145 세포, A549 세포, NCI-H1975 세포, MDA-MB-231 세포, NCCIT 세포 및 MCF-7 세포 (도 7); 및 상이한 발현 수준의 ROR1을 갖는 MDA-MB-231 세포 (도 16 및 도 17))로부터 단리된 PBMC를 사용하는 TDCC 검정은 상기 실시예 3.1에 기재된 바와 같이 인간 CD8+ T 세포를 사용하는 TDCC 검정과 유사한 방법을 사용하여 수행되었다.
구체적으로, 제조업체의 지침에 따라 피콜-파크 플러스 배지 [GE 헬스케어(GE Healthcare), Cat No: 17144002]를 사용하여 전혈로부터 PBMC를 단리하고, 300만개 세포/mL의 세포 밀도로 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI1640 배지에 재현탁시켰다.
PBMC를 사용하는 TDCR 검정은 상기 실시예 3.1에 기재된 바와 같이 인간 IFNγ AlphaLISA 검출 키트 (퍼킨엘머, Cat No: AL217F)를 사용하여 수행되었다.
표적 종양 세포의 강력한 TDCC 및 PBMC로부터 낮은 수준의 TDCR을 유도하는 이중특이적 TCE를 확인하기 위해, TDCC 검정 사멸 백분율 vs 농도 플롯의 곡선 아래 면적 (AUC) 및 TDCR 검정 IFNγ 방출 vs 농도 플롯의 AUC의 몫으로서 디커플링 비율을 계산하고 정의하였다.
도 4a에 나타낸 바와 같이 (표 20에 요약됨), 참조 T 세포-결합제 및 포맷 1A의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE는 MDA-MB-231 세포와 공동-배양될 때 CD8+ T 세포 세포독성을 유도할 수 있는 능력에 대해 시험된 가장 강력한 분자였으며 서로 2배 미만의 차이가 있었다. 효능은 표적 세포 사멸에 대한 EC50으로서 정의되었다.
포맷 1A의 이중특이적 TCE 69A02 및 포맷 1A의 이중특이적 TCE 82H02에 대한 EC50은 참조 T 세포 결합제보다 대략 5배 덜 강력하였다 (~ 19 내지 25 pM). 포맷 1B의 이중특이적 TCE 69A02 및 포맷 1B의 이중특이적 TCE 82H02에 대한 EC50은 포맷 1A의 이중특이적 TCE 69A02 및 포맷 1A의 이중특이적 TCE 82H02보다 각각 4배 덜 강력하였다(~ 48 내지 77 pM).
참조 T 세포-결합제, 포맷 1A의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE, 포맷 1A의 이중특이적 TCE 69A02 및 포맷 1A의 이중특이적 TCE 82H02의 사멸 규모는 눈의 띄게 상이하지 않았다. 도 4b에 나타낸 바와 같이 (표 20에 요약됨), PBMC와 ROR1- T47D 표적 종양 세포의 공동-배양물에서는 세포독성이 측정 가능하게 검출되지 않았으며, 이는 관찰된 세포독성이 ROR1 의존적임을 나타낸다.
표 20: 인간 PBMC의 표적 의존적 세포독성
도 4c에 나타낸 바와 같이 (표 21에 요약됨), 참조 T 세포-결합제 및 포맷 1A의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE는 MDA-MB-231 세포와 공동-배양될 때 PBMC IFNγ 방출을 유도할 수 있는 능력에 대해 시험된 가장 강력한 분자였으며 서로 2배 미만의 차이가 있었다. 효능은 IFNγ 방출에 대한 EC50으로서 정의되었다.
포맷 1A의 이중특이적 TCE 69A02 및 포맷 1A의 이중특이적 TCE 82H02는 참조 T 세포-결합제보다 대략 10배 덜 강력하였다. 포맷 1B의 이중특이적 TCE 69A02 및 포맷 1B의 이중특이적 TCE 82H02는 참조 T 세포-결합제보다 대략 300 내지 1000배 덜 강력했으며 대략 60 내지 70% 적은 최대 IFNγ 방출을 유도하였다.
도 4d에 나타낸 바와 같이 (표 21에 요약됨), 참조 T 세포-결합제, 포맷 1A의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE, 포맷 1A 또는 포맷 1B의 이중특이적 TCE 69A02, 또는 포맷 1A 또는 포맷 1B의 이중특이적 TCE 82H02는 검출 가능한 수준의 IFNγ 방출을 유도하지 못하였으며, 이는 IFNγ 방출이 ROR1 의존적임을 나타낸다.
참조 T 세포-결합제 및 포맷 1A의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE는 종양 세포의 PBMC 세포독성 사멸 및 IFNγ 방출의 유도에 매우 강력한 반면, 포맷 1A 및 1B의 이중특이적 TCE 69A02 및 82H02는 IFNγ 방출보다 세포독성 사멸의 더 강력한 유도제이다.
표 21: 인간 PBMC의 표적 의존적 시토카인 방출
각각의 시험 이중특이적 TCE가 염증유발성 시토카인 방출로부터 세포독성을 디커플링시키는 규모를 정량화하기 위해, 주어진 시험 또는 참조 분자에 대한 표적 사멸에 대한 곡선 아래 면적 (AUC)과 IFNγ 방출에 대한 AUC 간의 몫으로서 "디커플링 비율"을 계산하였다.
AUC 값은 참조 T 세포-결합제에 대해 계산된 값으로 정규화되었으며, 이에 대한 표적 세포 사멸 및 IFNγ 방출의 EC50 (효능)은 둘 다 약 6 pM이었다 (즉, 디커플링 비율 1은 세포독성이 IFNγ 방출로부터 디커플링되지 않았다는 것을 의미한다). 도 4e에 나타낸 바와 같이, 포맷 1A 및 1B의 이중특이적 TCE 69A02, 및 포맷 1A 및 1B의 이중특이적 TCE 82H02는 참조 T 세포 결합제보다 유의미하게 더 큰 (즉, 1보다 큰) 디커플링 비율을 가졌다.
포맷 1A 및 1B의 이중특이적 TCE 69A02, 및 포맷 1A의 이중특이적 TCE 82H02는 대략 1.8 내지 2 범위의 비슷한 디커플링 비율을 가졌다. 포맷 1B의 이중특이적 TCE 82H02는 가장 높은 디커플링 비율을 가졌다.
PBMC에서 관찰된 염증유발성 시토카인 방출로부터 세포독성의 디커플링은 순수 CD8+ T 세포 집단에서 관찰된 디커플링 (상기 실시예 3.1), 특히 포맷 1B의 이중특이적 TCE 82H02에 대해 더 두드러졌다. 이들 결과는 CD4+ 헬퍼 T 세포의 존재가, 본 개시내용의 이중특이적 TCE가 IFNγ 방출을 감소시키면서 세포독성을 유지하는 작용 메커니즘에서 일정 역할을 할 수 있다는 것을 시사한다.
본 개시내용의 이중특이적 TCE에 의해 매개된 염증유발성 시토카인 방출로부터 세포독성의 디커플링이 ROR1+ 종양 세포주의 어레이 전체에 걸쳐 일반화된 특징인지 여부를 결정하기 위해, ROR1의 다양한 표면 발현 수준을 갖는 여러 종양 세포주에 걸쳐 ROR1 의존적 표적 세포 사멸 및 ROR1 의존적 IFNγ 방출을 평가하였다. 본 실시예에 사용된 세포주에 대한 ROR1의 평균 세포 표면 밀도를 표 22에 나타내었다.
표 22: 다양한 세포주의 ROR1 세포 표면 밀도
도 7a 내지 7d에 나타낸 바와 같고, 이전에 MDA-MB-231 표적에서 관찰된 바와 같이, 포맷 1A (도 7a 및 도 7b) 및 1B (도 7c 및 도 7d)의 이중특이적 TCE 82H02의 존재 하에 PBMC와 공동-배양될 때 모든 ROR-1+ 종양 세포주에서, 염증유발성 시토카인 방출로부터 세포독성의 디커플링이 관찰되었다. 참조 T 세포-결합제 또는 포맷 1A의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE에서는 디커플링이 관찰되지 않았다 (도 7e 및 도 7f). ROR1- MCF-7 세포와의 PBMC 공동-배양물에서는 표적 세포 사멸 또는 IFNγ 방출이 관찰되지 않았다.
전반적으로, 표적 세포 사멸과 염증유발성 시토카인 방출 둘 다는 ROR1 의존적인 것으로 관찰되었다. 추가로, 포맷 1A 및 1B의 이중특이적 TCE 82H02에 의해 관찰된 시토카인 방출로부터의 세포독성의 디커플링이, 시험된 모든 ROR1+ 세포주에서 관찰되었다는 점을 고려하면, 이러한 현상은 MDA-MB-231로만 제한되지 않고 모든 ROR1+ 세포주에 더 일반적으로 적용 가능한 것으로 보인다.
도 14a에 나타낸 바와 같이 (표 23에 요약됨), 참조 T 세포-결합제는 서열 최적화된 이중특이적 TCE 82H02 TCE #1 및 82H02 TCE #2; 및 이중특이적 TCE 82H02 TCE #3 및 82H02 TCE #4와 각각 비교 시, PBMC가 MDA-MB-231 세포와 공동-배양되었을 때 세포독성 종양 세포 사멸을 유도하는데 있어서 2 내지 4배 및 15배 더 강력하였다. 이중특이적 TCE 82H02 TCE #3 및 82H02 TCE #4 (낮은 친화도 ROR1 결합)와 비교하여 이중특이적 TCE 82H02 TCE #1 및 82H02 TCE #2 (높은 친화도 ROR1 결합)의 효능 감소는 4 내지 6배였다. 이중특이적 TCE 82H02 TCE #2 및 82H02 TCE #4 (낮은 친화도 CD3 결합)와 비교하여 이중특이적 TCE 82H02 TCE #1 및 82H02 TCE #3 (높은 친화도 CD3 결합)의 효능 감소는 2배 미만이었다. 이들 결과는 본 개시내용의 이중특이적 TCE 간의 세포독성 사멸 활성을 유도하는 효능에 있어서의 주요 차이가 주로, CD3이 아닌 ROR1에 대한 겉보기 친화도에 의해 구동된다는 것을 시사하였다.
도 14b에 나타낸 바와 같이 (표 24에 요약됨), 참조 T 세포-결합제는 서열 최적화된 이중특이적 TCE 82H02 TCE #1 및 82H02 TCE #2; 및 이중특이적 TCE 82H02 TCE #3 및 82H02 TCE #4와 각각 비교 시, PBMC가 MDA-MB-231 세포와 공동-배양되었을 때 IFNγ 방출 유도에 있어서 약 20 내지 25배 및 40 내지 50배 더 강력하였다. 이중특이적 TCE 82H02 TCE #3 및 82H02 TCE #4 (낮은 친화도 ROR1 결합)와 비교하여 이중특이적 TCE 82H02 TCE #1 및 82H02 TCE #2 (높은 친화도 ROR1 결합)의 효능 감소는 대략 2배였다. 이중특이적 TCE 82H02 TCE #2 및 82H02 TCE #4 (낮은 친화도 CD3 결합)와 비교하여 이중특이적 TCE 82H02 TCE #1 및 82H02 TCE #3 (높은 친화도 CD3 결합)의 효능 감소는 2배 미만이었다. 이들 결과는 본 개시내용의 이중특이적 TCE 간의 IFNγ 방출을 유도하는 효능에 있어서의 주요 차이가 주로, CD3가 아닌 ROR1에 대한 겉보기 친화도에 의해 구동된다는 것을 시사하였다. 또한, IFNγ의 최대 방출은 서열 최적화된 이중특이적 TCE 82H02 TCE #1 및 82H02 TCE #2; 및 이중특이적 TCE 82H02 TCE #3 및 82H02 TCE #4 각각에 의해 약 50% 및 60 내지 65%만큼 감소되었다.
도 14c에 나타낸 바와 같이, 이중특이적 TCE 82H02 TCE #1, 82H02 TCE #2, 82H02 TCE #3 및 82H02 TCE #4 모두는 서로 눈에 띄게 상이하지 않은 디커플링 비율과 연관되어 있었다 (참조 T 세포 결합제에 대해 정규화된 바와 같이 대략 2임).
표 23: 인간 PBMC의 표적 의존적 세포독성
표 24: 인간 PBMC의 표적 의존적 시토카인 방출
본 개시내용의 서열 최적화된 이중특이적 TCE와 관련된 ROR1 밀도 구별 능력은 ROR1의 상이한 세포 표면 밀도를 발현하도록 조작된 표적 MDA-MB-231 종양 세포와 PBMC를 공동-배양함으로써 평가되었다. MDA-MB-231 세포는 대략 40,000개의 ROR1 분자/세포를 발현한다. ROR1의 표면 발현을 감소시키기 위해, MDA-MB-231 세포에 ROR1-특이적 shRNA를 코딩하는 렌티바이러스를 형질도입하였다. ROR1의 표면 발현을 증가시키기 위해, MDA-MB-231 세포에 완전한 길이의 ROR1을 코딩하는 렌티바이러스를 형질도입하였다. ROR1 녹아웃 MDA-MB-231 세포는 Cas9/CRISPR 기술을 사용하여 만들어졌다. ROR1의 다양한 표면 발현 수준을 갖는 총 6개의 세포주가 생성되었다: 0.2 x 105개의 분자/세포 (MDA-MB-231-0.2); 0.4 x 105개의 분자/세포 (MDA-MB-231-0.4); 6 x 105개의 분자/세포 (MDA-MB-231-0.6); 1.3 x 106개의 분자/세포 (MDA-MB-231-1.3); 7 x 106개의 분자/세포 (MDA-MB-231-7).
도 16f (및 표 25에 요약됨) 및 도 17f (및 표 26에 요약됨)에 나타낸 바와 같이, ROR1 녹아웃 MDA-MB-231 표적 세포와 PBMC의 공동-배양물은 배경 이상의 상당한 수준의 사멸 또는 IFNγ 방출을 초래하지 않았다. 도 16a 내지 16e에 나타낸 바와 같이, 서열 최적화된 이중특이적 82H02 TCE 또는 참조 T 세포-결합제에 의해 유도된 최대 PBMC 매개 세포독성은, ROR1의 세포 표면 밀도가 감소함에 따라 감소되었다. 유사하게, 도 17a 내지 17e에 나타낸 바와 같이, 서열 최적화된 이중특이적 82H02 TCE 또는 참조 T 세포-결합제에 의해 유도된 최대 IFNγ 방출은, ROR1의 세포 표면 밀도가 감소됨에 따라 감소되었다.
세포독성 활성의 유도와 IFNγ 방출 둘 다에 대한 효능의 순위 순서는 참조 T 세포-결합제 > 82H02 TCE #1 > 82H02 TCE #2 > 82H02 TCE #3 > 82H02 TCE #4였다.
표적 종양 세포의 세포독성 사멸의 경우, ROR1 밀도가 감소함에 따라 시험 분자의 효능 차이가 증가하였다. 가장 낮은 ROR1 세포 밀도에서 (MDA-MB-231-0.2), 참조 T 세포-결합제, 82H02 TCE #1, 82H02 TCE #2, 82H02 TCE #3, 및 82H02 TCE #4의 세포독성 활성 효능은 3배 미만이었다.
IFNγ 방출의 경우, 세포독성 사멸에 비해 더 낮은 EC50 및 Emax 값은 시토카인 방출로부터 세포독성의 디커플링과 일치했으며, 82H02 TCE #1, 82H02 TCE #2, 82H02 TCE #3 및 82H02 TCE #4에서는 관찰되었지만 참조 T 세포-결합제에서는 그렇지 않았다. 디커플링의 규모는 ROR1의 세포 표면 밀도와 역의 상관관계가 있었고 ROR1의 초생리학적 밀도 (즉, > 1.3x106개의 분자/세포)에서 참조 T 세포-결합제에 의한 유도보다 눈에 띄게 우수하지 않았다.
도 18에 나타낸 바와 같이, 디커플링 비율 (참조 T 세포-결합제에 대해 정규화됨)은 세포 표면 ROR1 발현 밀도가 감소함에 따라 증가되었다. 가장 높은 디커플링 비율은 82H02 TCE #2, 82H02 TCE #3 및 82H02 TCE #4에서 관찰되었으며 서로 눈에 띄게 다르지 않았다. 0.2 x 105 내지 0.6 x 105개의 분자/세포의 ROR1 밀도에서 82H02 TCE #1과 연관된 디커플링 비율은 82H02 TCE #2, 82H02 TCE #3 및 82H02 TCE #4와 비교하여 대략 20% 더 낮았다.
표 25: 다양한 ROR1 세포 표면 밀도를 갖는 표적 세포에 대항한 인간 PBMC의 표적 의존적 세포독성
표 26: 다양한 ROR1 세포 표면 밀도를 갖는 표적 세포에 대항한 인간 PBMC의 표적 의존적 시토카인 방출
3.4 CD3ε-녹인 C57BL/6 마우스 비장세포를 사용하는 TDCC 및 TDCR 검정
마우스 CD3ε이 녹아웃되고 인간 CD3의 엑토도메인과 마우스 CD3의 막횡단 및 세포질 도메인으로 이루어진 키메라 CD3ε (인간 CD3 녹인 또는 hCD3-KI)으로 대체된 C57BL/6 마우스를 생성하여, 이러한 동물이 본 개시내용의 이중특이적 TCE의 전임상 생체 내 활성을 평가하기 위한 관련 모델로서 사용될 수 있는지 확인하였다. 피기백 트랜스포존 기반 시스템을 사용하는 세포 표면 인간 ROR1 (hROR1+ 4T1) 또는 마우스 ROR1 (mROR1+ 4T1)을 안정적으로 발현하는 4T1 세포.
CD3ε-녹인 C57BL/6 마우스 비장세포 및 표적 세포 (4T1-hROR1 세포 (도 9a 및 도 9b); 또는 4T1-mROR1 세포 (도 9c 및 도 9d))를 사용하는 TDCC 검정은 상기 실시예 3.1에 기재된 바와 같이 인간 CD8+ T 세포를 사용하는 TDCC 검정과 유사한 방법을 사용하여 수행되었다.
구체적으로, 100-μm 세포 여과기를 통해 비장을 50 mL 원뿔형 튜브에 밀어 넣어 인간 CD3ε-녹인 C57BL/6 마우스의 비장으로부터 마우스 비장세포를 단리하였다. 세포 여과기를 5 mL의 PBS로 2회 세척하고 통과액을 50 mL 원뿔형 튜브에 수집하였다. 비장세포를 펠릿화하고, 5 mL의 ACK 용해 완충액 (써모피셔, Cat No: A1049201)에 재현탁시키고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 비장세포를 PBS로 세척하고 배양 배지 (10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 RPMI1640)에 3 x 106개 세포/mL의 밀도로 재현탁시켰다.
마우스 CD8+ T 세포를 사용하는 TDCR 검정은 상기 실시예 3.1에 기재된 바와 같이 인간 IFNγ AlphaLISA 검출 키트와 유사한 제조업체의 프로토콜을 갖는 마우스 IFNγ AlphaLISA 검출 키트 (퍼킨엘머, Cat No: AL501C)를 사용하여 수행되었다.
표적 종양 세포의 강력한 TDCC와 PBMC로부터 낮은 수준의 TDCR을 유도하는 이중특이적 TCE를 확인하기 위해, TDCC 검정 사멸 백분율 vs 농도 플롯의 AUC 및 TDCR 검정 IFNγ 방출 vs 농도 플롯의 AUC의 몫으로서 디커플링 비율을 계산하고 정의하였다.
도 9a에 나타낸 바와 같이 (표 27에 요약됨), hROR1+ 4T1 세포에 대항한 세포독성 표적 세포 사멸 유도에 대한 효능의 순위 순서는 참조 T 세포-결합제 > 포맷 1A의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE > 포맷 1B의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE > 포맷 1A의 이중특이적 TCE 82H02 > 포맷 1B의 이중특이적 TCE 82H02였다. 도 9c에 나타낸 바와 같이 (표 27에 요약됨), mROR1+ 4T1 세포에 대항한 세포독성 표적 세포 사멸 유도에 대한 효능의 순위 순서는 포맷 1A의 이중특이적 TCE 82H02 > 포맷 1A의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE > 포맷 1B의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE > 포맷 1B의 이중특이적 TCE 82H02였다. 예상된 바와 같이, 참조 T 세포-결합제는 뮤린 ROR1과 결합하지 않기 때문에 mROR1+ 4T1 세포에 대항한 세포독성 활성을 갖지 않았다. 이중특이적 TCE 82H02의 경우, hROR1+ 4T1 및 mROR1+ 4T1에 대항한 효능 차이는 포맷 1A 및 1B에 대해 각각 대략 3배 및 9배였다.
도 9b에 나타낸 바와 같이 (표 28에 요약됨), hROR1+ 4T1 세포에 대항한 IFNγ 방출 유도에 대한 효능의 순위 순서는 참조 T 세포-결합제 > 포맷 1A의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE > 포맷 1B의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE > 포맷 1A의 이중특이적 TCE 82H02 > 포맷 1B의 이중특이적 TCE 82H02였다. 도 9d에 나타낸 바와 같이 (표 28에 요약됨), mROR1+ 4T1 세포에 대항한 IFNγ 방출 유도에 대한 효능의 순위 순서는 포맷 1A의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE > 포맷 1B의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE > 포맷 1A의 이중특이적 TCE 82H02 > 포맷 1B의 이중특이적 TCE 82H02였다. 예상된 바와 같이, 참조 T 세포-결합제는 뮤린 ROR1과 결합하지 않기 때문에 mROR1+ 4T1 세포에 대항하여 측정 가능한 IFNγ 방출이 없었다. 이중특이적 TCE 82H02의 경우, hROR1+ 4T1 및 mROR1+ 4T1에 대항한 IFNγ 방출에 대한 효능의 차이는 포맷 1A 및 1B에 대해 각각 대략 3배 및 3배 초과였다.
표 27: 인간 또는 마우스 ROR1
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4T1 세포에 대항한 인간 CD3-녹인 마우스 비장세포의 표적 의존적 세포독성
표 28: 인간 또는 마우스 ROR1
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4T1 세포에 대항한 인간 CD3-녹인 마우스 비장세포의 표적 의존적 시토카인 방출
비장세포 hCD3-녹인 마우스 비장세포와 hROR1+ 4T1 세포의 공동-배양물에서, 염증유발성 시토카인 방출로부터 세포독성의 디커플링은 포맷 1A 및 1B의 이중특이적 TCE 82H02에 대해 관찰되었지만 참조 T 세포 결합제 또는 포맷 1A 또는 1B의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE에 대해서는 그렇지 않았다. 디커플링 비율 ≥ 1.5는 포맷 1A 및 1B의 이중특이적 TCE 82H02에서 관찰되었으며, 델타는 각각 참조 T 세포-결합제에 대해 정규화된 약 1.7 및 2배에 도달하였다 (도 9e).
참조 T 세포-결합제는 mROR1과 결합하지 않기 때문에, hCD3-녹인 마우스 비장세포와 mROR1+ 4T1 세포의 공동-배양 실험에서는, 포맷 1A의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE에 대해 정규화하여 디커플링 비율을 계산하였다. 도 9f에 나타낸 바와 같이, 비장세포 hCD3-녹인 마우스 비장세포와 mROR1+ 4T1 세포의 공동-배양물에서는 염증유발성 시토카인 방출로부터 세포독성의 디커플링이 거의 내지 전혀 관찰되지 않았다.
전반적으로, ROR1 의존적 종양 세포 세포독성의 규모는, 인간 또는 마우스 ROR1을 발현하는 마우스 종양 표적이 hCD3-녹인 마우스로부터의 비장세포와 공동-배양되었을 때 유사하였다. 염증유발성 시토카인 방출로부터 세포독성의 디커플링은 hROR1+ 4T1 세포와의 공동-배양물에서 관찰되었지만 mROR1+ 4T1 세포와의 공동-배양물에서는 감소되는 것으로 나타났다. 이러한 관찰은 비-임상적 생체 내 약동학/약력학 및 효능 연구를 위한 인간 ROR1 조작된 동계 종양 보유 hCD3-녹인 마우스의 사용을 뒷받침해준다.
실시예 4: 종양 침윤 T 세포 (TIL)에 의한 연쇄 사멸 검정
본 실시예는 본 개시내용의 이중특이적 TCE의 존재 또는 부재 하에 종양 침윤 림프구 (TIL)에 의한 표적 종양 세포의 연쇄 사멸의 유도를 설명한다.
TIL은 신선한 삼중 음성 유방암 생검으로부터 단리되어 배양에서 확장되었다. 간단히 언급하면, 생검 조직 조각 1 mm/1그램을 5 mL의 콜라게나제 IA [시그마(Sigma) Cat No: C9891; 100 U/ml에서 RPMI1640에 재현탁됨]와 함께 인큐베이션하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, 실온에서 30분 더 인큐베이션하였다. 샘플을 40 μm 세포 여과기에 통과시키고 50 ml 튜브에 수집하였다. 세포를 RPMI1640 배지로 세척하고 제조업체의 지침에 따라 피콜-파크 플러스 배지 [시티바(Cytiva), Cat No: GE17-1440-02]를 사용하여 단핵 세포를 단리하였다. 1 x 106개의 단리된 단핵 세포를 10% 열 불활성화 인간 AB 혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 10 mM 글루타민, 및 10 mM HEPES가 보충된 RPMI1640 배지에서 mL당 1 x 106개 세포의 세포 밀도로 24시간 동안 6000 U/mL의 인간 IL2와 함께 배양하였다. 24시간 인큐베이션한 후, 1.3 x 105개의 TIL을 10% 열 불활성화 인간 AB 혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 10 mM 글루타민, 10 mM HEPES, 3000 U/mL 인간 IL-2 및 0.03 μg/mL CD3 항체 클론 OKT3이 보충된 10 mL의 RPMI1640 배지에 재현탁시켰다.
6명의 상이한 건강한 공여자로부터 수집한 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 5000 rad에서 감마선 조사하고, 2.7 x 106개의 조사된 PBMC를 AIM-V 배지에 재현탁하고 T-25 플라스크 내의 1.3 x 105개의 TIL에 부가하였다. PBMC-TIL 공동-배양물을 96시간 동안 인큐베이션한 후, 각각의 플라스크로부터 배양 배지 10 mL를 제거하고 AIM-V 배지 5 ml와 10% 열 불활성화 인간 AB 혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 10 mM 글루타민, 10 mM HEPES 및 6000 U/mL 인간 IL2이 보충된 RPMI1640 5 mL로 교체하였다. 3,000 U/mL IL2가 보충된 AIM-V 배지를 부가함으로써 세포를 1 x 106개 미만 세포/mL의 배양 밀도로 유지하였다. 14일 인큐베이션한 후, TIL 세포를 계수하고 CD3, CD4 및 CD8 발현으로 염색하여 유동 세포계수법으로 분석하였다 (세포의 >99%는 CD3+ T 세포였으며 >80% CD3+ T 세포는 CD8+ T 세포였다). TIL은 연쇄 사멸 검정에 사용될 때까지 동결 배지 (써모피셔, Cat No: 12648010)에서 동결되었다.
연쇄 사멸 검정을 수행하기 위해, 동결된 TIL을 해동하고, 세척한 후, 10% 소 태아 혈청 (FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 500 U/mL 인간 IL2가 보충된 RPMI1640 배지에서 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 배양한 다음, 동일한 배지에서 연쇄적으로 희석하여 1 x 106, 5 x 105, 2.5 x 105, 1.25 x 105, 6.25 x 104, 3.125 x 104, 1.562 x 104, 7.81 x 103개 세포/mL의 세포 밀도를 갖는 TIL 세포 현탁액을 만들거나 배지 단독 (즉, 0개 TIL)을 만들었다.
표적 세포 (NCI-H1975 세포 (도 6a 및 도 15); 및 T-47D 세포 (도 6b))를 항생제의 부재 하에 24시간 동안 배양한 다음, 배양 배지에 50,000개 세포/mL의 세포 밀도로 재현탁시켰다. 100 μL의 표적 세포 현탁액을 흑색 벽의 투명하고 평평한 바닥의 플레이트의 각각의 웰에 조심스럽게 분배하고 4시간 동안 인큐베이션하였다. 100 μL의 배양 배지 중 20000, 10000, 5000, 2500, 1250, 625, 313, 156, 78 및 0개의 표적 세포를 함유하는 웰이 또한, 표준 참조물로서 사용하기 위해 지정된 웰에 시딩되었다.
100 μL의 각각의 시험 이중특이적 TCE (100 pM), 참조 T 세포-결합제 (100 pM), 참조 프리즐드-결합 TCE 희석액 (100 pM), 또는 배지 대조군을 100 μl의 각각의 TIL 세포 현탁액 희석액, 또는 배지 대조군과 혼합한 다음, 표적 세포의 희석액을 함유하는 흑색 벽의 투명한 평평한 바닥의 플레이트의 웰에 부가하고, 공동-배양물을 30℃, 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션하였다.
24시간 인큐베이션한 후, 세포를 1000 RPM에서 30초 동안 원심분리하고, 100 μL의 상청액을 각각의 웰로부터 제거하고 저장을 위해 제2 플레이트로 옮겼다. 100 μL의 One-Glo 용액을 공동-배양물 및 나머지 100 μL의 공동-배양물 상청액을 함유하는 각각의 웰에 부가하고 실온에서 2분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트 내 샘플의 생물발광은 엔비젼 플레이트 판독기 (또는 등가물)를 사용하여 측정되었다. 표적 세포 표준 참조물의 생물발광 강도를 사용하여 표준 곡선을 플롯팅하였다. 각각의 공동-배양물 샘플 중 살아있는 표적 세포의 수는 표준 곡선을 사용하여 계산되었으며, 사멸된 표적 세포의 수는 각각의 웰에 시딩된 5000개의 표적 세포와 살아있는 표적 세포의 계산된 수 간의 차이로서 추가로 계산되었다. 사멸 빈도는 사멸된 표적 세포의 수를 각각의 조건에 대한 TIL의 수로 나누어 계산하고 그의 평균을 내어 E:T 비율 1:8 및 1:16에서의 사멸 빈도를 제공하였다. 그래프패드 프리즘을 사용하여 평균 사멸 빈도를 플롯팅하였다.
도 6a에 나타낸 바와 같이, TIL을 참조 T 세포-결합제의 존재 하에 NCI-H1975 세포와 공동-배양한 경우, 연쇄 사멸이 거의 내지 전혀 관찰되지 않았다. 포맷 1A의 이중특이적 TCE 82H02는 포맷 1A의 이중특이적 TCE 82H02보다 30 내지 40% 더 큰 연쇄 사멸을 유도하였다. 포맷 1A의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE는 포맷 1A의 이중특이적 TCE 69A02 및 포맷 1A의 이중특이적 TCE 82H02보다 각각 대략 25% 및 30% 더 큰 연쇄 사멸을 유도하였다. 포맷 1B의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE는 포맷 1B의 이중특이적 TCE 69A02 및 포맷 1B의 이중특이적 TCE 82H02보다 각각 대략 20% 및 30% 더 큰 연쇄 사멸을 유도하였다.
전반적으로, 포맷 1A의 참조 ROR1 프리즐드 도메인-결합 TCE, 포맷 1A의 이중특이적 TCE 69A02 및 포맷 1A의 이중특이적 TCE 82H02는 모두 T 세포당 적어도 3개의 종양 세포의 연쇄 사멸 빈도를 유도하였다. 포맷 1B에 비해 포맷 1A의 분자에서 관찰된 더 큰 연쇄 사멸은 CD3에 대한 더 높은 겉보기 친화도에 기인한 것으로 보이며, 이는 아마도 포맷 1B의 C-말단과 비교 시 포맷 1A의 브릿징 모이어티의 N-말단 상으로 조작될 때 입체 장애가 감소되었기 때문일 것이다. 도 6b에 나타낸 바와 같이, TIL을 ROR1- T47D 세포와 공동-배양한 경우 연쇄 사멸이 관찰되지 않았으며, 이는 관찰된 연쇄 사멸이 ROR1 의존적임을 나타낸다.
도 15에 나타낸 바와 같이, 참조 T 세포-결합제는 TIL에 의한 NCI-H1975 종양 세포의 연쇄 사멸을 거의 내지 전혀 유도하지 않았다. 서열 최적화된 이중특이적 TCE 82H02 #1, 82H02 #2, 82H02 #3 및 82H02 #4는 비슷한 수준의 연쇄 사멸을 나타냈다 (약 3 내지 4개의 종양 세포/T 세포).
실시예 5: 생물안전성 검정
본 실시예는 본 개시내용의 이중특이적 TCE의 존재 또는 부재 하에 배양된, 신선하게 단리된 PBMC 또는 고밀도로 사전 배양된 PBMC에 의한 시토카인 및 케모카인 방출을 측정하기 위해 수행된 실험을 설명한다. 건강한 공여자로부터 신선하게 단리된 PBMC는 세포 간 접촉이 드문 순환계에서 PBMC를 모방하기 위한 것이다. 고밀도 사전 배양된 PBMC (예를 들어, 48시간 동안 1 x 107개 세포/mL)는 세포 간 접촉이 높은 2차 림프 구조물 (예를 들어, 비장 및 림프절)에서 PBMC를 모방하도록 설계되었다. 이러한 세포 간 접촉은 모든 세포에서 MHC와의 매우 낮은 친화도 상호작용을 통해 T 세포에서 TCR/CD3 복합체의 약한 강장성 신호전달을 초래하여, T 세포를 약간 프라이밍하는 것으로 생각된다. 이러한 "고밀도" 사전 배양은 CD28 초효능제 항체인 TGN1412에 의해 유도된 비-특이적 T 세포 매개 염증유발성 시토카인 방출을 재현하는데 필요한 것으로 나타났다 (Romer et al. (2011) Blood. 118(26):6772-82).
인간 PBMC는 제조업체의 지침에 따라 피콜-파크 플러스 배지 (GE 헬스케어, Cat No: 17144002)를 사용하여 전혈로부터 단리되었다. 그런 다음 PBMC를 배양 배지 (10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI1640)에 2 x 106개 세포/mL의 세포 밀도로 재현탁시켰다. 50 μL의 PBMC를 평평한 바닥 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 부가하였다 (즉, 100,000개 세포/웰). 시험 이중특이적 TCE (82H02 TCE 1A 또는 82H02 TCE 1B), 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제), 참조 프리즐드-결합 TCE (Ref. Frz-결합 TCE 1A 또는 Ref. Frz-결합 TCE 1A), 이소타입 대조군 항체 (hIgG) 또는 마우스 항-인간 CD3 클론 OKT3 (OKT3, 양성 대조군)을 각각 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI1640 배지에서 24 pM 농도로 제조하였다. 50 μl의 제조된 시험 이중특이적 TCE, 참조 T 세포-결합제, 참조 프리즐드-결합 TCE, hIgG 또는 OKT3을 PBMC를 함유하는 96-웰 플레이트의 웰에 최종 용적 100 μL로 부가하고, 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 24시간 인큐베이션한 후, 시토카인 및 케모카인 방출의 정량화를 위해 상청액을 수집하였다.
고밀도 공동-배양 실험을 위해, 신선하게 단리된 PBMC를 펠릿화하고 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI1640 배지에 1.0 x 107개 세포/mL의 세포 밀도가 되도록 재현탁시키고, 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 48시간 인큐베이션한 후, PBMC를 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI1640 배지에 2.0 x 106개 세포/mL의 세포 밀도로 재현탁시켰다. 50 μL의 PBMC를 평평한 바닥 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 부가하였다 (즉, 100,000개 세포/웰). 시험 이중특이적 TCE (82H02 TCE 1A 또는 82H02 TCE 1B), 참조 T 세포-결합제 (Ref. T 세포-결합제), 참조 프리즐드-결합 TCE (Ref. Frz-결합 TCE 1A 또는 Ref. Frz-결합 TCE 1A), 이소타입 대조군 항체 (hIgG) 또는 마우스 항-인간 CD3 클론 OKT3 (OKT3, 양성 대조군)을 각각 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI1640 배지에서 24 pM 농도로 제조하였다. 50 μl의 제조된 시험 이중특이적 TCE, 참조 T 세포-결합제, 참조 프리즐드-결합 TCE, hIgG 또는 OKT3을 고밀도 사전 배양된 PBMC를 함유하는 96-웰 플레이트의 웰에 최종 용적 100 μL로 부가하고 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 24시간 인큐베이션한 후, 시토카인 및 케모카인 방출의 정량화를 위해 상청액을 수집하였다.
배양된 PBMC 샘플 중의 시토카인 및 케모카인 수준은 제조업체의 지침에 따라 MILLIPLEX® 인간 CD8+ T 세포 자기 비드 패널 사전 혼합된 17 플렉스 - 면역학 다중화 검정 키트 (시그마, Cat No: HCD8MAG15K17PMX)를 사용하여 측정되었다. 간단히 언급하면, 키트에 제공된 96-웰 검정 플레이트에 200 μL의 검정 완충액을 부가하였다. 이어서, 플레이트를 밀봉하고 실온에서 10분 동안 플레이트-진탕기에 놓아 두고 완충액을 폐기하였다. 25 μL의 PBMC 배양 상청액, 표준 또는 대조군을 지정된 웰에 부가하고 25 μL의 RPMI1640 배양 배지를 각각의 웰에 부가하여 각각의 웰의 용적을 50 μL로 만들었다. 25 μL의 사전 혼합된 비드를 각각의 웰에 부가하고 플레이트를 밀봉하고 플레이트 진탕기에 놓아 두고 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 플레이트를 2회 세척하고 25 μL의 제조된 검출 항체를 각각의 웰에 부가하였다. 플레이트를 밀봉하고 플레이트-진탕기에서 실온 하에 1시간 동안 인큐베이션하였다. 25 μl의 스트렙타비딘-피코에리트린 (PE)을 각각의 웰에 부가하고 플레이트를 밀봉하고 실온에서 추가 30분 동안 플레이트 진탕기에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 후, 플레이트를 2회 세척하고 150 μL의 외장액을 각각의 웰에 부가하였다. 플레이트를 플레이트-진탕기에서 5분 동안 추가로 인큐베이션하고 샘플을 xPONENT® 소프트웨어를 사용하여 MAGPIX® 기기에서 분석하였다. 개별 표준물의 판독값을 사용하여 표준 곡선이 생성되었다. 시토카인 또는 케모카인의 수준은 각각의 시토카인 또는 케모카인에 대한 개별 표준 곡선을 사용하여 계산되었다. 결과는 그래프패드 프리즘에 플롯팅되었다 (시토카인/케모카인 방출 vs 시험 제품의 농도).
도 10a 내지 도 10d, 및 도 11a 내지 도 11d에 나타낸 바와 같이, 항-인간 CD3 클론 OKT3은 신선하게 단리된 PBMC 배양물과 고밀도 사전 배양된 PBMC 둘 다에서 용량 의존적 방식으로 유의미한 시토카인 방출 (IFNγ, TNFα 및 IL10)을 유도하였다.
참조 T 세포-결합제 및 포맷 1B의 참조 프리즐드-결합 TCE는 신선하게 단리된 PBMC에서 약간의 비-특이적 IL2 방출을 유도하였고, 고밀도 사전 배양된 PBMC에서 TNFα를 유도하였다. 포맷 1A 및 1B의 이중특이적 TCE 82H02는 배경 또는 hIgG1 이소타입 대조군과 비교 시 유의미한 수준의 시토카인의 방출을 유도하지 않았다.
실시예 6: 경쟁 검정
본 실시예는 본 개시내용의 ROR1-결합 클론 (82H02 및 69A02), 이중특이적 참조 T 세포-결합제, 또는 참조 프리즐드-결합 클론이 NCCIT 세포에서 ROR1과의 결합을 놓고 경쟁하는지 여부를 결정하기 위해 수행된 실험을 설명한다.
NCCIT 세포 배양물을 생육력에 대해 시험하고 1 x 106개 세포/ml의 세포 밀도로 배양 배지에 재현탁시켰다. 200 μl의 NCCIT 세포 현탁액을 U-바닥 96 웰 플레이트의 각각의 웰에 부가하였다 (즉, 웰당 200,000개 세포). 세포를 PBS로 2회 세척하고 100 μl의 생/사 고정 가능 염색 용액 (써모 피셔, Cat No: L34961)을 각각의 웰에 부가하였다. 세포를 실온 하의 암실에서 15분 동안 인큐베이션하고, PBS로 2회 세척한 다음, 염색 완충액 [이바이오사이언시즈(eBiosciences), Cat No: 00-4222-26] 중 연쇄적으로 희석된 비표지된 82H02 scFv-Fc, 69A02 scFv-Fc, Ref. T 세포-결합제 scFv-Fc, 또는 Ref. Frz-결합 scFv-Fc (1000 nM 내지 0.017 nM의 3배 희석물) 100 μL에 재현탁시켰다. 이어서, 세포를 암실에서 30분 동안 얼음 위에서 인큐베이션하고, 빙냉 PBS로 세척한 후, 알렉사 플루오르 647-접합된 제논 단편 (써모 피셔, Cat No: Z25408)으로 표지된 100 μL의 146 nM 82H02 scFv-Fc에 재현탁시켰다. 세포를 암실에서 30분 동안 얼음 위에서 인큐베이션하고, 빙냉 PBS로 3회 세척한 다음, 50 μl/웰의 고정 완충액 (바이오레젠드, Cat No: 42080)에서 실온에서 10분 동안 고정하였다. 그런 다음 세포를 200 μl의 PBS에 재현탁시키고 플로우조 소프트웨어를 사용하여 포르테사(Fortessa) X-20 기기에서 수행된 유동 세포계수법으로 세포를 분석하였다.
도 19에 나타낸 바와 같이,알렉사 플루오르 647-접합된 제논 단편 표지된 82H02 scFv-Fc는 경쟁 항체 (즉, 비표지된 82H02 scFv-Fc)가 차지한 NCCIT 세포에서 ROR-1과 결합하지 않았으며 유동 세포계수법에 의한 측정 시 약한 알렉사 플루오르 647 신호를 제공하였다. 대조적으로, 유의미한 알렉사 플루오르 647 신호는 69A02 scFv-Fc, Ref. T 세포-결합제 scFv-Fc, 또는 Ref. Frz-결합 scFv-Fc로 사전 처리된 NCCIT 세포 샘플에서 측정되었으며, 이는 알렉사 플루오르 647-접합된 제논 단편 표지된 82H02 scFv-Fc가 ROR1의 결합을 놓고 이들 분자와 경쟁하지 않는다는 것과, 이들 분자가 ROR1의 상이한 에피토프/영역과 결합한다는 것을 시사한다.
실시예 7: 결합 친화도 검정
본 실시예는 본 개시내용의 이중특이적 TCE 및 서열 최적화된 변이체의 결합 친화도를 결정하기 위해 사용된 생물층 간섭계 실험을 설명한다.
표 29는 생물층 간섭계에 의한 측정 시 재조합 인간 ROR1 세포외 도메인 단백질에 대항한 고정화된 이중특이적 TCE의 KD 값을 나타낸다.
표 29: ROR1-결합 이중특이적 TCE에 대한 결합 친화도
표 30은 생물층 간섭계에 의한 측정 시 재조합 인간 CD3ε/δ 이종이량체 SEED Fc 융합 단백질에 대항한 고정화된 이중특이적 TCE의 KD 값을 나타낸다.
표 30: CD3-결합 이중특이적 TCE에 대한 결합 친화도
참조로 포함
본원에 언급된 각각의 특허 문서 및 과학 논문의 전체 개시내용은 모든 목적을 위해 참조로 포함된다.
등가물
본 개시내용은 그의 요지 또는 본질적인 특징을 벗어나지 않고서도 다른 구체적인 형태로 구현될 수 있다. 따라서 전술한 실시양태는 모든 측면에서 본원에 기재된 개시내용을 제한하기보다는 예시적인 것으로 간주되어야 한다. 상이한 실시양태 및 다양한 개시된 방법 단계의 다양한 구조적 요소는 다양한 조합 및 순열로 활용될 수 있으며, 이러한 모든 변동은 본 개시내용의 형태로 간주되어야 한다. 따라서 본 개시내용의 범위는 전술한 설명보다는 첨부된 청구범위에 의해 표시되며, 청구범위의 의미 및 등가성의 범위 내에 있는 모든 변화가 본원에 포괄되는 것으로 의도된다.
Claims (194)
- 하기를 포함하는 단백질:
브릿징 모이어티의 단부에 연결된 ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체; 및
브릿징 모이어티의 반대쪽 단부에 연결된 CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체. - 제1항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 브릿징 모이어티의 C-말단 단부에 연결되고, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결되는 것인 단백질.
- 제2항에 있어서, 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결된 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체를 추가로 포함하는 단백질.
- 제3항에 있어서, 브릿징 모이어티가 2개의 폴리펩티드 아암을 포함하고, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체 및 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체가 동일한 폴리펩티드 아암의 C-말단 단부 및 N-말단 단부에 각각 연결되고, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 제2 폴리펩티드 아암의 N-말단 단부에 연결되는 것인 단백질.
- 제1항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결되고, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 브릿징 모이어티의 C-말단 단부에 연결되는 것인 단백질.
- 제5항에 있어서, 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결된 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체를 추가로 포함하는 단백질.
- 제6항에 있어서, 브릿징 모이어티가 2개의 폴리펩티드 아암을 포함하고, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체 및 CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 샘플 폴리펩티드 아암의 N-말단 단부 및 C-말단 단부에 각각 연결되고, ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체가 제2 폴리펩티드 아암의 N-말단 단부에 연결되는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 단일-쇄 가변 단편 (scFv), Fab, Fab', F(ab')2, 미니바디, 및 나노바디 (VHH)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단백질.
- 제8항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 scFv인 단백질.
- 제3항, 제4항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체가 scFv, Fab, Fab', F(ab')2, 미니바디 및 VHH로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단백질.
- 제10항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체가 scFv인 단백질.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 하기를 포함하는 것인 단백질:
GFTFTSYA (서열식별번호: 8)의 아미노산 서열 또는 GFSITTSGVS (서열식별번호: 23)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 1 (VHCDR1);
ISGSGGGT (서열식별번호: 9)의 아미노산 서열 또는 IYWDDDK (서열식별번호: 24)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 2 (VHCDR2);
AQGSSIFDY (서열식별번호: 10)의 아미노산 서열 또는 AHAPRYTPGGYFDY (서열식별번호: 25)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 3 (VHCDR3);
QSVSSY (서열식별번호: 11)의 아미노산 서열 또는 QSVSSN (서열식별번호: 26)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 1 (VLCDR1);
DAS 또는 GAS의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 2 (VLCDR2); 및
QQRSNWPPXT (서열식별번호: 13)의 아미노산 서열 (여기서 X는 F, S, C, R, Q, I, L, Y 또는 V임) 또는 QQYKNWPPA (서열식별번호: 28)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 3 (VLCDR3). - 제3항, 제4항, 제6항, 제7항 및 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체가 하기를 포함하는 것인 단백질:
GFTFTSYA (서열식별번호: 8)의 아미노산 서열 또는 GFSITTSGVS (서열식별번호: 23)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 1 (VHCDR1);
ISGSGGGT (서열식별번호: 9)의 아미노산 서열 또는 IYWDDDK (서열식별번호: 24)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 2 (VHCDR2);
AQGSSIFDY (서열식별번호: 10)의 아미노산 서열 또는 AHAPRYTPGGYFDY (서열식별번호: 25)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 3 (VHCDR3);
QSVSSY (서열식별번호: 11)의 아미노산 서열 또는 QSVSSN (서열식별번호: 26)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 1 (VLCDR1);
DAS 또는 GAS의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 2 (VLCDR2); 및
QQRSNWPPXT (서열식별번호: 13)의 아미노산 서열 (여기서 X는 F, S, C, R, Q, I, L, Y 또는 V임) 또는 QQYKNWPPA (서열식별번호: 28)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 3 (VLCDR3). - 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 GFTFTSYA (서열식별번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, ISGSGGGT (서열식별번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, AQGSSIFDY (서열식별번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, QSVSSY (서열식별번호: 11)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, DAS의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 QQRSNWPPFT (서열식별번호: 14)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는 것인 단백질.
- 제3항, 제4항, 제6항, 제7항 및 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체가 GFTFTSYA (서열식별번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, ISGSGGGT (서열식별번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, AQGSSIFDY (서열식별번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, QSVSSY (서열식별번호: 11)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, DAS의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 QQRSNWPPFT (서열식별번호: 14)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 GFTFTSYA (서열식별번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, ISGSGGGT (서열식별번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, AQGSSIFDY (서열식별번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, QSVSSY (서열식별번호: 11)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, DAS의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 QQRSNWPPST (서열식별번호: 15)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는 것인 단백질.
- 제3항, 제4항, 제6항, 제7항, 제10항 내지 제13항 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체가 GFTFTSYA (서열식별번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, ISGSGGGT (서열식별번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, AQGSSIFDY (서열식별번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, QSVSSY (서열식별번호: 11)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, DAS의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 QQRSNWPPST (서열식별번호: 15)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 GFSITTSGVS (서열식별번호: 23)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, IYWDDDK (서열식별번호: 24)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, AHAPRYTPGGYFDY (서열식별번호: 25)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, QSVSSN (서열식별번호: 26)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, GAS의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 QQYKNWPPA (서열식별번호: 28)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는 것인 단백질.
- 제3항, 제4항, 제6항, 제7항, 제10항 내지 제13항 및 제18항 중 어느 한 항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체가 GFSITTSGVS (서열식별번호: 23)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, IYWDDDK (서열식별번호: 24)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, AHAPRYTPGGYFDY (서열식별번호: 25)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, QSVSSN (서열식별번호: 26)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, GAS의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 QQYKNWPPA (서열식별번호: 28)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가, IMGT 고유 넘버링 체계에 따라, 표 1에 각각 열거된 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인의 VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 서열에 상응하는 아미노산 서열을 각각 포함하는 VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3을 포함하는 것인 단백질.
- 제3항, 제4항, 제6항, 제7항, 제10항, 제11항 및 제20항 중 어느 한 항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체가, IMGT 고유 넘버링 체계에 따라, 표 1에 각각 열거된 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인의 VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 서열에 상응하는 아미노산 서열을 각각 포함하는 VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3을 포함하는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 서열식별번호: 29 또는 서열식별번호: 39와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열 및 서열식별번호: 30, 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 32, 서열식별번호: 33, 서열식별번호: 34, 서열식별번호: 35, 서열식별번호: 36, 서열식별번호: 37, 서열식별번호: 38, 또는 서열식별번호: 40과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단백질.
- 제3항, 제4항, 제6항, 제7항, 제10항 내지 제13항 및 제22항 중 어느 한 항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체가 서열식별번호: 29 또는 서열식별번호: 39와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열 및 서열식별번호: 30, 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 32, 서열식별번호: 33, 서열식별번호: 34, 서열식별번호: 35, 서열식별번호: 36, 서열식별번호: 37, 서열식별번호: 38, 또는 서열식별번호: 40과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제15항, 제22항 및 제23항 중 어느 한 항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 서열식별번호: 29와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열 및 서열식별번호: 30과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단백질.
- 제3항, 제4항, 제6항, 제7항, 제10항 내지 제15항 및 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체가 서열식별번호: 29와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열 및 서열식별번호: 30과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제13항, 제16항, 제17항, 제22항 및 제23항 중 어느 한 항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 서열식별번호: 29와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열 및 서열식별번호: 31과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단백질.
- 제3항, 제4항, 제6항, 제7항, 제10항 내지 제13항, 제16항, 제17항, 제22항, 제23항 및 제26항 중 어느 한 항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체가 서열식별번호: 29와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열 및 서열식별번호: 31과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제13항, 제18항, 제19항, 제22항 및 제23항 중 어느 한 항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 서열식별번호: 39와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열 및 서열식별번호: 40과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단백질.
- 제3항, 제4항, 제6항, 제7항, 제10항 내지 제13항, 제18항, 제19항, 제22항, 제23항 및 제28항 중 어느 한 항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체가 서열식별번호: 39와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열 및 서열식별번호: 40과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제11항, 제20항 및 제21항 중 어느 한 항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가, 표 2에 각각 열거된 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인 서열에 상응하는 아미노산 서열을 각각 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 것인 단백질.
- 제3항, 제4항, 제6항, 제7항, 제10항, 제11항, 제20항, 제21항 및 제30항 중 어느 한 항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체가, 표 2에 각각 열거된 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인 서열에 상응하는 아미노산 서열을 각각 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 (GGGGS)n (서열식별번호: 1) 서열을 포함하는 링커 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 n은 1 내지 12인 단백질.
- 제3항, 제4항, 제6항, 제7항 및 제10항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체가 (GGGGS)n (서열식별번호: 1) 서열을 포함하는 링커 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 n은 1 내지 12인 단백질.
- 제1항 내지 제13항, 제22항, 제23항, 제32항 및 제33항 중 어느 한 항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 서열식별번호: 41, 서열식별번호: 42, 서열식별번호: 43, 서열식별번호: 44, 서열식별번호: 45, 서열식별번호: 46, 서열식별번호: 47, 서열식별번호: 49, 또는 서열식별번호: 59와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단백질.
- 제3항, 제4항, 제6항, 제7항, 제10항 내지 제13항, 제22항, 제23항 및 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체가 서열식별번호: 41, 서열식별번호: 42, 서열식별번호: 43, 서열식별번호: 44, 서열식별번호: 45, 서열식별번호: 46, 서열식별번호: 47, 서열식별번호: 49 또는 서열식별번호: 59와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제15항, 제22항 내지 제25항 및 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 서열식별번호: 41과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단백질.
- 제3항, 제4항, 제6항, 제7항, 제10항 내지 제15항, 제22항 내지 제25항 및 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체가 서열식별번호: 41과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제13항, 제16항, 제17항, 제22항, 제23항, 제26항, 제27항 및 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 서열식별번호: 42와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단백질.
- 제3항, 제4항, 제6항, 제7항, 제10항 내지 제13항, 제16항, 제17항, 제22항, 제23항, 제26항, 제27항, 제32항 내지 제35항 및 제38항 중 어느 한 항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체가 서열식별번호: 42와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제13항, 제18항, 제19항, 제22항, 제23항, 제28항, 제29항 및 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 서열식별번호: 59와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단백질.
- 제3항, 제4항, 제6항, 제7항, 제10항 내지 제13항, 제18항, 제19항, 제22항, 제23항, 제28항, 제29항, 제32항 내지 제35항 및 제40항 중 어느 한 항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체가 서열식별번호: 59와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제11항, 제20항, 제21항, 제30항 및 제31항 중 어느 한 항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 표 3에 열거된 scFv에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하는 것인 단백질.
- 제3항, 제4항, 제6항, 제7항, 제10항, 제11항, 제20항, 제21항, 제30항, 제31항 및 제42항 중 어느 한 항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체가 표 3에 열거된 scFv에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, 미니바디 및 VHH로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단백질.
- 제44항에 있어서, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 Fab인 단백질.
- 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 하기를 포함하는 것인 단백질:
GFTFNTYA (서열식별번호: 61)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 1 (VHCDR1);
IRSKYNNYAT (서열식별번호: 62)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 2 (VHCDR2);
VRHGNFGX1X2YVSWFAY (서열식별번호: 67)의 아미노산 서열 (여기서 X1은 N, A 또는 E이고, X2는 S 또는 A임)을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 3 (VHCDR3);
TGAVTTSN (서열식별번호: 64)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 1 (VLCDR1);
GT의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 2 (VLCDR2); 및
ALWYSNLWV (서열식별번호: 66)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 3 (VLCDR3). - 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 GFTFNTYA (서열식별번호: 61)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1; IRSKYNNYAT (서열식별번호: 62)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2; VRHGNFGNSYVSWFAY (서열식별번호: 63)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3; TGAVTTSN (서열식별번호: 64)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1; GT의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2; 및 ALWYSNLWV (서열식별번호: 66)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 GFTFNTYA (서열식별번호: 61)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1; IRSKYNNYAT (서열식별번호: 62)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2; VRHGNFGASYVSWFAY (서열식별번호: 68)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3; TGAVTTSN (서열식별번호: 64)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1; GT의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2; 및 ALWYSNLWV (서열식별번호: 66)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가, IMGT 고유 넘버링 체계에 따라, 표 4에 각각 열거된 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인의 VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3 서열에 상응하는 아미노산 서열을 각각 포함하는 VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VLCDR1, VLCDR2, 및 VLCDR3을 포함하는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 서열식별번호: 71, 서열식별번호: 72, 서열식별번호: 73, 서열식별번호: 74, 서열식별번호: 75, 또는 서열식별번호: 80과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열 및 서열식별번호: 76, 서열식별번호: 77, 서열식별번호: 78, 서열식별번호: 79, 또는 서열식별번호: 81과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제48항 및 제50항 중 어느 한 항에 있어서, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 서열식별번호: 72와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열 및 서열식별번호: 81과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제48항 및 제50항 중 어느 한 항에 있어서, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 서열식별번호: 71과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열 및 서열식별번호: 76과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제45항 및 제49항 중 어느 한 항에 있어서, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가, IMGT 고유 넘버링 체계에 따라, 표 5에 각각 열거된 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인 서열에 상응하는 아미노산 서열을 각각 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제48항 및 제50항 중 어느 한 항에 있어서, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 서열식별번호: 82 또는 서열식별번호: 83과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열, 및 서열식별번호: 84 또는 서열식별번호: 85와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제48항, 제50항 및 제54항 중 어느 한 항에 있어서, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 서열식별번호: 82와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열 및 서열식별번호: 84와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제48항, 제50항 및 제54항 중 어느 한 항에 있어서, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 서열식별번호: 83과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열 및 서열식별번호: 85와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제45항, 제49항 및 제53항 중 어느 한 항에 있어서, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가, IMGT 고유 넘버링 체계에 따라, 표 6에 각각 열거된 중쇄 및 경쇄의 중쇄 및 경쇄 서열에 상응하는 아미노산 서열을 각각 포함하는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 브릿징 모이어티가 기능적 또는 비-기능적인 단백질.
- 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 브릿징 모이어티가 가닥-교환 조작된 도메인 (SEED) 포맷 Fc 도메인 또는 그의 기능적 단편, 이뮤노글로불린 Fc 도메인 또는 그의 기능적 단편, 폴리펩티드 링커, 또는 폴리펩티드 힌지를 포함하는 것인 단백질.
- 제59항에 있어서, 브릿징 모이어티가 SEED 포맷 Fc 도메인을 포함하는 것인 단백질.
- 제59항 또는 제60에 있어서, SEED 포맷 Fc 도메인이 하나 또는 하나 초과의 이펙터 기능 침묵 돌연변이를 포함하는 것인 단백질.
- 제59항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, SEED 포맷 Fc 도메인이 서열식별번호: 86, 서열식별번호: 117, 또는 서열식별번호: 88과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열식별번호: 87, 서열식별번호: 118, 또는 서열식별번호: 89와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 것인 단백질.
- 제59항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, SEED 포맷 Fc 도메인이 서열식별번호: 86을 포함하거나 또는 그로 이루어진 폴리펩티드 및 서열식별번호: 87을 포함하거나 또는 그로 이루어진 폴리펩티드를 포함하는 것인 단백질.
- 제59항에 있어서, 브릿징 모이어티가 이뮤노글로불린 Fc 도메인을 포함하는 것인 단백질.
- 제59항 또는 제64항에 있어서, 이뮤노글로불린 Fc 도메인이, 이종이량체화를 촉진하는 하나 또는 하나 초과의 돌연변이를 각각 포함하는 2개의 폴리펩티드 아암을 포함하는 것인 단백질.
- 제59항, 제64항 및 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 이뮤노글로불린 Fc 도메인이 표 8에 각각 열거된 제1 폴리펩티드 아암 및 제2 폴리펩티드 아암의 제1 폴리펩티드 아암 및 제2 폴리펩티드 아암 서열에 상응하는 아미노산 서열을 각각 포함하는 제1 폴리펩티드 아암 및 제2 폴리펩티드 아암을 포함하는 것인 단백질.
- 제60항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 브릿징 모이어티가 N-말단 단부에 힌지를 추가로 포함하는 것인 단백질.
- 제67항에 있어서, 힌지가 서열식별번호: 92로 구성된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 아암을 포함하는 것인 단백질.
- 제68항에 있어서, 힌지가 서열식별번호: 90 또는 서열식별번호: 92로 구성된 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 아암을 추가로 포함하는 것인 단백질.
- 제67항에 있어서, 힌지가 표 9에 열거된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 아암을 포함하는 것인 단백질.
- 제68항에 있어서, 힌지가 표 9에 열거된 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 아암을 추가로 포함하는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제4항 및 제8항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 링커 폴리펩티드에 의해 브릿징 모이어티의 C-말단 단부에 연결되는 것인 단백질.
- 제1항 및 제5항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 링커 폴리펩티드에 의해 브릿징 모이어티의 C-말단 단부에 연결되는 것인 단백질.
- 제72항 또는 제73항에 있어서, 링커 폴리펩티드가 (GGGGS)n (서열식별번호: 1) 서열을 포함하며, 여기서 n은 1 내지 12인 단백질.
- 하기를 포함하는 단백질:
(i) GFTFTSYA (서열식별번호: 8)의 아미노산 서열 또는 GFSITTSGVS (서열식별번호: 23)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 1 (VHCDR1), ISGSGGGT (서열식별번호: 9)의 아미노산 서열 또는 IYWDDDK (서열식별번호: 24)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 2 (VHCDR2), AQGSSIFDY (서열식별번호: 10)의 아미노산 서열 또는 AHAPRYTPGGYFDY (서열식별번호: 25)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성-결정 영역 3 (VHCDR3), QSVSSY (서열식별번호: 11)의 아미노산 서열 또는 QSVSSN (서열식별번호: 26)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 1 (VLCDR1), DAS 또는 GAS의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 2 (VLCDR2), 및 QQRSNWPPXT (서열식별번호: 13)의 아미노산 서열 (여기서 X는 F, S, C, R, Q, I, L, Y 또는 V임) 또는 QQYKNWPPA (서열식별번호: 28)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성-결정 영역 3 (VLCDR3)을 포함하는, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체;
(ii) GFTFNTYA (서열식별번호: 61)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, IRSKYNNYAT (서열식별번호: 62)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, VRHGNFGX1X2YVSWFAY (서열식별번호: 67)의 아미노산 서열 (여기서 X1은 N, A 또는 E이고, X2는 S 또는 A임)을 포함하는 VHCDR3, TGAVTTSN (서열식별번호: 64)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, GT의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 ALWYSNLWV (서열식별번호: 66)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체; 및
(iii) ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체를 CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체에 연결하는 브릿징 모이어티로서, (a) 서열식별번호: 90 및 서열식별번호: 86 또는 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 아암, 및 (b) 서열식별번호: 90 및 서열식별번호: 87, 또는 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 아암을 포함하는 브릿징 모이어티. - 제75항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 브릿징 모이어티의 C-말단 단부에 연결되고, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결되는 것인 단백질.
- 제76항에 있어서, 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결된 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체를 추가로 포함하는 단백질.
- 제77항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체가 GFTFTSYA (서열식별번호: 8)의 아미노산 서열 또는 GFSITTSGVS (서열식별번호: 23)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, ISGSGGGT (서열식별번호: 9)의 아미노산 서열 또는 IYWDDDK (서열식별번호: 24)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, AQGSSIFDY (서열식별번호: 10)의 아미노산 서열 또는 AHAPRYTPGGYFDY (서열식별번호: 25)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, QSVSSY (서열식별번호: 11)의 아미노산 서열 또는 QSVSSN (서열식별번호: 26)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, DAS 또는 GAS의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 QQRSNWPPXT (서열식별번호: 13)의 아미노산 서열 (여기서 X는 F, S, C, R, Q, I, L, Y 또는 V임) 또는 QQYKNWPPA (서열식별번호: 28)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는 것인 단백질.
- 제76항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 링커 폴리펩티드에 의해 브릿징 모이어티의 C-말단 단부에 연결되는 것인 단백질.
- 제79항에 있어서, 링커 폴리펩티드가 (GGGGS)n (서열식별번호: 1) 서열을 포함하며, 여기서 n은 1 내지 12인 단백질.
- 제75항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결되고, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 브릿징 모이어티의 C-말단 단부에 연결되는 것인 단백질.
- 제81항에 있어서, 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결된 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체를 추가로 포함하는 단백질.
- 제82항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체가 GFTFTSYA (서열식별번호: 8)의 아미노산 서열 또는 GFSITTSGVS (서열식별번호: 23)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, ISGSGGGT (서열식별번호: 9)의 아미노산 서열 또는 IYWDDDK (서열식별번호: 24)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, AQGSSIFDY (서열식별번호: 10)의 아미노산 서열 또는 AHAPRYTPGGYFDY (서열식별번호: 25)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, QSVSSY (서열식별번호: 11)의 아미노산 서열 또는 QSVSSN (서열식별번호: 26)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, DAS 또는 GAS의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 QQRSNWPPXT (서열식별번호: 13)의 아미노산 서열 (여기서 X는 F, S, C, R, Q, I, L, Y 또는 V임) 또는 QQYKNWPPA (서열식별번호: 28)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는 것인 단백질.
- 제81항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 링커 폴리펩티드에 의해 브릿징 모이어티의 C-말단 단부에 연결되는 것인 단백질.
- 제84항에 있어서, 링커 폴리펩티드가 (GGGGS)n (서열식별번호: 1) 서열을 포함하며, 여기서 n은 1 내지 12인 단백질.
- 제75항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 단백질:
(i) GFTFTSYA (서열식별번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, ISGSGGGT (서열식별번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, AQGSSIFDY (서열식별번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, QSVSSY (서열식별번호: 11)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, DAS의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 QQRSNWPPST (서열식별번호: 15)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체;
(ii) GFTFNTYA (서열식별번호: 61)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, IRSKYNNYAT (서열식별번호: 62)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, VRHGNFGASYVSWFAY (서열식별번호: 68)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, TGAVTTSN (서열식별번호: 64)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, GT의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 ALWYSNLWV (서열식별번호: 66)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체;
(iii) ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 N-말단 단부를 CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 C-말단 단부에 연결하는 브릿징 모이어티로서, (a) 서열식별번호: 90 및 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 아암, 및 (b) 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 아암을 포함하는 브릿징 모이어티; 및
(iv) GFTFTSYA (서열식별번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, ISGSGGGT (서열식별번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, AQGSSIFDY (서열식별번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, QSVSSY (서열식별번호: 11)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, DAS의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 QQRSNWPPST (서열식별번호: 15)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는, 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결된 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체. - 제75항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 단백질:
(i) GFTFTSYA (서열식별번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, ISGSGGGT (서열식별번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, AQGSSIFDY (서열식별번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, QSVSSY (서열식별번호: 11)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, DAS의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 QQRSNWPPST (서열식별번호: 15)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체;
(ii) GFTFNTYA (서열식별번호: 61)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, IRSKYNNYAT (서열식별번호: 62)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, VRHGNFGNSYVSWFAY (서열식별번호: 63)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, TGAVTTSN (서열식별번호: 64)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, GT의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 ALWYSNLWV (서열식별번호: 66)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체;
(iii) ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 N-말단 단부를 CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 C-말단 단부에 연결하는 브릿징 모이어티로서, (a) 서열식별번호: 90 및 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 아암, 및 (b) 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 아암을 포함하는 브릿징 모이어티; 및
(iv) GFTFTSYA (서열식별번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, ISGSGGGT (서열식별번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, AQGSSIFDY (서열식별번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, QSVSSY (서열식별번호: 11)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, DAS의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 QQRSNWPPST (서열식별번호: 15)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는, 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결된 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체. - 제75항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 단백질:
(i) GFTFTSYA (서열식별번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, ISGSGGGT (서열식별번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, AQGSSIFDY (서열식별번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, QSVSSY (서열식별번호: 11)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, DAS의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 QQRSNWPPFT (서열식별번호: 14)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체;
(ii) GFTFNTYA (서열식별번호: 61)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, IRSKYNNYAT (서열식별번호: 62)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, VRHGNFGASYVSWFAY (서열식별번호: 68)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, TGAVTTSN (서열식별번호: 64)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, GT의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 ALWYSNLWV (서열식별번호: 66)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체;
(iii) ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 N-말단 단부를 CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 C-말단 단부에 연결하는 브릿징 모이어티로서, (a) 서열식별번호: 90 및 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 아암, 및 (b) 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 아암을 포함하는 브릿징 모이어티; 및
(iv) GFTFTSYA (서열식별번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, ISGSGGGT (서열식별번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, AQGSSIFDY (서열식별번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, QSVSSY (서열식별번호: 11)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, DAS의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 QQRSNWPPFT (서열식별번호: 14)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는, 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결된 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체. - 제75항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 단백질:
(i) GFTFTSYA (서열식별번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, ISGSGGGT (서열식별번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, AQGSSIFDY (서열식별번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, QSVSSY (서열식별번호: 11)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, DAS의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 QQRSNWPPFT (서열식별번호: 14)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체;
(ii) GFTFNTYA (서열식별번호: 61)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, IRSKYNNYAT (서열식별번호: 62)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, VRHGNFGNSYVSWFAY (서열식별번호: 63)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, TGAVTTSN (서열식별번호: 64)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, GT의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 ALWYSNLWV (서열식별번호: 66)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체;
(iii) ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 N-말단 단부를 CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 C-말단 단부에 연결하는 브릿징 모이어티로서, (a) 서열식별번호: 90 및 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 아암, 및 (b) 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 아암을 포함하는 브릿징 모이어티; 및
(iv) GFTFTSYA (서열식별번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, ISGSGGGT (서열식별번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, AQGSSIFDY (서열식별번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, QSVSSY (서열식별번호: 11)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, DAS의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 QQRSNWPPFT (서열식별번호: 14)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는, 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결된 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체. - 제75항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 단백질:
(i) GFSITTSGVS (서열식별번호: 23)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, IYWDDDK (서열식별번호: 24)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, AHAPRYTPGGYFDY (서열식별번호: 25)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, QSVSSN (서열식별번호: 26)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, GAS의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 QQYKNWPPA (서열식별번호: 28)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체;
(ii) GFTFNTYA (서열식별번호: 61)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, IRSKYNNYAT (서열식별번호: 62)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, VRHGNFGNSYVSWFAY (서열식별번호: 63)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, TGAVTTSN(서열식별번호: 64)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, GT의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 ALWYSNLWV (서열식별번호: 66)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체;
(iii) ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 C-말단 단부를 CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 N-말단 단부에 연결하는 브릿징 모이어티로서, (a) 서열식별번호: 90 및 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 아암 및 (b) 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 아암을 포함하는 브릿징 모이어티; 및
(iv) GFSITTSGVS (서열식별번호: 23)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, IYWDDDK (서열식별번호: 24)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, AHAPRYTPGGYFDY (서열식별번호: 25)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, QSVSSN (서열식별번호: 26)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, GAS의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 QQYKNWPPA (서열식별번호: 28)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는, ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체. - 제81항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 단백질:
(i) GFTFTSYA (서열식별번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, ISGSGGGT (서열식별번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, AQGSSIFDY (서열식별번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, QSVSSY (서열식별번호: 11)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, DAS의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 QQRSNWPPST (서열식별번호: 15)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체;
(ii) GFTFNTYA (서열식별번호: 61)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, IRSKYNNYAT (서열식별번호: 62)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, VRHGNFGNSYVSWFAY (서열식별번호: 63)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, TGAVTTSN (서열식별번호: 64)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, GT의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 ALWYSNLWV (서열식별번호: 66)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체;
(iii) ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 C-말단 단부를 CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 N-말단 단부에 연결하는 브릿징 모이어티로서, (a) 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 아암, 및 (b) 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 아암을 포함하는 브릿징 모이어티; 및
(iv) GFTFTSYA (서열식별번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, ISGSGGGT (서열식별번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, AQGSSIFDY (서열식별번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, QSVSSY (서열식별번호: 11)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, DAS의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 QQRSNWPPST (서열식별번호: 15)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는, 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결된 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체. - 제81항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 단백질:
(i) GFSITTSGVS (서열식별번호: 23)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, IYWDDDK (서열식별번호: 24)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, AHAPRYTPGGYFDY (서열식별번호: 25)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, QSVSSN (서열식별번호: 26)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, GAS의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 QQYKNWPPA (서열식별번호: 28)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체;
(ii) GFTFNTYA (서열식별번호: 61)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, IRSKYNNYAT (서열식별번호: 62)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, VRHGNFGNSYVSWFAY (서열식별번호: 63)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, TGAVTTSN (서열식별번호: 64)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, GT의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 ALWYSNLWV (서열식별번호: 66)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체;
(iii) ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 C-말단 단부를 CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 N-말단 단부에 연결하는 브릿징 모이어티로서, (a) 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 아암, 및 (b) 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 아암을 포함하는 브릿징 모이어티; 및
(iv) GFSITTSGVS (서열식별번호: 23)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR1, IYWDDDK (서열식별번호: 24)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR2, AHAPRYTPGGYFDY (서열식별번호: 25)의 아미노산 서열을 포함하는 VHCDR3, QSVSSN (서열식별번호: 26)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR1, GAS의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR2, 및 QQYKNWPPA (서열식별번호: 28)의 아미노산 서열을 포함하는 VLCDR3을 포함하는, 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결된 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체. - 하기를 포함하는 단백질:
(i) 서열식별번호: 29 또는 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 서열식별번호: 30, 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 32, 서열식별번호: 33; 서열식별번호: 34, 서열식별번호: 35, 서열식별번호: 36, 서열식별번호: 37, 서열식별번호: 38, 또는 서열식별번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체;
(ii) 서열식별번호: 71, 서열식별번호: 72, 서열식별번호: 73, 서열식별번호: 74, 서열식별번호: 75, 또는 서열식별번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 76, 서열식별번호: 77, 서열식별번호: 78, 서열식별번호: 79, 또는 서열식별번호: 81의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체; 및
(iii) ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체를 CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체에 연결하는 브릿징 모이어티로서, (a) 서열식별번호: 90 및 서열식별번호: 86, 또는 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 아암, 및 (b) 서열식별번호: 90 및 서열식별번호: 87, 또는 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 아암을 포함하는 브릿징 모이어티. - 제93항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 브릿징 모이어티의 C-말단 단부에 연결되고, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결되는 것인 단백질.
- 제94항에 있어서, 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결된 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체를 추가로 포함하는 단백질.
- 제95항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체가 서열식별번호: 29 또는 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 서열식별번호: 30, 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 32, 서열식별번호: 33; 서열식별번호: 34, 서열식별번호: 35, 서열식별번호: 36, 서열식별번호: 37, 서열식별번호: 38, 또는 서열식별번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 것인 단백질.
- 제94항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 링커 폴리펩티드에 의해 브릿징 모이어티의 C-말단 단부에 연결되는 것인 단백질.
- 제97항에 있어서, 링커 폴리펩티드가 (GGGGS)n (서열식별번호: 1) 서열을 포함하며, 여기서 n은 1 내지 12인 단백질.
- 제93항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결되고, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 브릿징 모이어티의 C-말단 단부에 연결되는 것인 단백질.
- 제99항에 있어서, 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결된 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체를 추가로 포함하는 단백질.
- 제100항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체가 서열식별번호: 29 또는 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 서열식별번호: 30, 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 32, 서열식별번호: 33; 서열식별번호: 34, 서열식별번호: 35, 서열식별번호: 36, 서열식별번호: 37, 서열식별번호: 38, 또는 서열식별번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 것인 단백질.
- 제99항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체가 링커 폴리펩티드에 의해 브릿징 모이어티의 C-말단 단부에 연결되는 것인 단백질.
- 제102항에 있어서, 링커 폴리펩티드가 (GGGGS)n (서열식별번호: 1) 서열을 포함하며, 여기서 n은 1 내지 12인 단백질.
- 제93항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 단백질:
(i) 서열식별번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체;
(ii) 서열식별번호: 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 81의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체;
(iii) ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 N-말단 단부를 CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 C-말단 단부에 연결하는 브릿징 모이어티로서, (a) 서열식별번호: 90 및 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 아암, 및 (b) 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 아암을 포함하는 브릿징 모이어티; 및
(iv) 서열식별번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결된 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체. - 제93항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 단백질:
(i) 서열식별번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체;
(ii) 서열식별번호: 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체;
(iii) ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 N-말단 단부를 CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 C-말단 단부에 연결하는 브릿징 모이어티로서, 여기서 브릿징 모이어티는 (a) N-말단 단부에 서열식별번호: 92의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 폴리펩티드, 및 (b) 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 및 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 브릿징 모이어티는 (1) 서열식별번호: 90 및 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 아암, 및 (2) 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 아암을 포함하는 것인 브릿징 모이어티; 및
(iv) 서열식별번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결된 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체. - 제93항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 단백질:
(i) 서열식별번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체;
서열식별번호: 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 81의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체;
(ii) ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 N-말단 단부를 CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 C-말단 단부에 연결하는 브릿징 모이어티로서, (a) 서열식별번호: 90 및 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 아암, 및 (b) 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 아암을 포함하는 브릿징 모이어티; 및
(iii) 서열식별번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결된 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체. - 제93항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 단백질:
(i) 서열식별번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체;
(ii) 서열식별번호: 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 76의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체;
(iii) ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 N-말단 단부를 CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 C-말단 단부에 연결하는 브릿징 모이어티로서, (a) 서열식별번호: 90 및 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 아암, 및 (b) 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 아암을 포함하는 브릿징 모이어티; 및
(iv) 서열식별번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결된 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체. - 제93항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 단백질:
(i) 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체;
(ii) 서열식별번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 81의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체;
(iii) ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 C-말단 단부를 CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 N-말단 단부에 연결하는 브릿징 모이어티로서, (a) 서열식별번호: 90 및 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 아암, 및 (b) 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 아암을 포함하는 브릿징 모이어티; 및
(iv) 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결된 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체. - 제99항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 단백질:
(i) 서열식별번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체;
(ii) 서열식별번호: 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 81의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체;
(iii) ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 C-말단 단부를 CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 N-말단 단부에 연결하는 브릿징 모이어티로서, (a) 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 아암, 및 (b) 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 아암을 포함하는 브릿징 모이어티; 및
(iv) 서열식별번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결된 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체. - 제99항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 단백질:
(i) 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체;
(ii) 서열식별번호: 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 81의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체;
(iii) ROR1과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 C-말단 단부를 CD3과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 복합체의 N-말단 단부에 연결하는 브릿징 모이어티로서, (a) 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 아암, 및 (b) 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 아암을 포함하는 브릿징 모이어티; 및
(iv) 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열식별번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결된 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 폴리펩티드 또는 2개 이상의 폴리펩티드의 제2 복합체. - 하기를 포함하는 단백질:
(i) 서열식별번호: 41, 서열식별번호: 42, 서열식별번호: 43, 서열식별번호: 44, 서열식별번호: 45, 서열식별번호: 46, 서열식별번호: 47, 서열식별번호: 48, 서열식별번호: 49, 서열식별번호: 50, 서열식별번호: 51, 서열식별번호: 52, 서열식별번호: 53, 서열식별번호: 54, 서열식별번호: 55, 서열식별번호: 56, 서열식별번호: 57, 서열식별번호: 58, 서열식별번호: 59, 또는 서열식별번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는, ROR1과 특이적으로 결합하는 단일-쇄 가변 단편 (scFv);
(ii) 서열식별번호: 82 또는 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 84 또는 서열식별번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, CD3과 특이적으로 결합하는 Fab; 및
(iii) ROR1과 특이적으로 결합하는 scFv를 CD3과 특이적으로 결합하는 Fab에 연결하는 브릿징 모이어티로서, (a) 서열식별번호: 90 및 서열식별번호: 86, 또는 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 아암, 및 (b) 서열식별번호: 90 및 서열식별번호: 87, 또는 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 아암을 포함하는 브릿징 모이어티. - 제111항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 scFv가 브릿징 모이어티의 C-말단 단부에 연결되고, CD3과 특이적으로 결합하는 Fab가 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결되는 것인 단백질.
- 제112항에 있어서, 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결된 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 scFv를 추가로 포함하는 단백질.
- 제113항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 scFv가 서열식별번호: 41, 서열식별번호: 42, 서열식별번호: 43, 서열식별번호: 44, 서열식별번호: 45, 서열식별번호: 46, 서열식별번호: 47, 서열식별번호: 48, 서열식별번호: 49, 서열식별번호: 50, 서열식별번호: 51, 서열식별번호: 52, 서열식별번호: 53, 서열식별번호: 54, 서열식별번호: 55, 서열식별번호: 56, 서열식별번호: 57, 서열식별번호: 58, 서열식별번호: 59, 또는 서열식별번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 것인 단백질.
- 제112항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 scFv가 링커 폴리펩티드에 의해 브릿징 모이어티의 C-말단 단부에 연결되는 것인 단백질.
- 제115항에 있어서, 링커 폴리펩티드가 (GGGGS)n (서열식별번호: 1) 서열을 포함하며, 여기서 n은 1 내지 12인 단백질.
- 제111항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 scFv가 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결되고, CD3과 특이적으로 결합하는 Fab가 브릿징 모이어티의 C-말단 단부에 연결되는 것인 단백질.
- 제117항에 있어서, 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결된 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 scFv를 추가로 포함하는 단백질.
- 제118항에 있어서, ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 scFv가 서열식별번호: 41, 서열식별번호: 42, 서열식별번호: 43, 서열식별번호: 44, 서열식별번호: 45, 서열식별번호: 46, 서열식별번호: 47, 서열식별번호: 48, 서열식별번호: 49, 서열식별번호: 50, 서열식별번호: 51, 서열식별번호: 52, 서열식별번호: 53, 서열식별번호: 54, 서열식별번호: 55, 서열식별번호: 56, 서열식별번호: 57, 서열식별번호: 58, 서열식별번호: 59, 또는 서열식별번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 것인 단백질.
- 제117항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, CD3과 특이적으로 결합하는 Fab가 링커 폴리펩티드에 의해 브릿징 모이어티의 C-말단 단부에 연결되는 것인 단백질.
- 제120항에 있어서, 링커 폴리펩티드가 (GGGGS)n (서열식별번호: 1) 서열을 포함하며, 여기서 n은 1 내지 12인 단백질.
- 제112항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 단백질:
(i) 서열식별번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는, ROR1과 특이적으로 결합하는 scFv;
(ii) 서열식별번호: 82의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, CD3과 특이적으로 결합하는 Fab;
(iii) ROR1과 특이적으로 결합하는 scFv의 N-말단 단부를 CD3과 특이적으로 결합하는 Fab의 C-말단 단부에 연결하는 브릿징 모이어티로서, (a) 서열식별번호: 90 및 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 아암, 및 (b) 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 아암을 포함하는 브릿징 모이어티; 및
(iv) 서열식별번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는, 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결된 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 scFv. - 제112항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 단백질:
(i) 서열식별번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는, ROR1과 특이적으로 결합하는 scFv;
(ii) 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, CD3과 특이적으로 결합하는 Fab;
(iii) ROR1과 특이적으로 결합하는 scFv의 N-말단 단부를 CD3과 특이적으로 결합하는 Fab의 C-말단 단부에 연결하는 브릿징 모이어티로서, (a) 서열식별번호: 90 및 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 아암, 및 (b) 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 아암을 포함하는 브릿징 모이어티; 및
서열식별번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는, 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결된 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 scFv. - 제112항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 단백질:
(i) 서열식별번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는, ROR1과 특이적으로 결합하는 scFv;
(ii) 서열식별번호: 82의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, CD3과 특이적으로 결합하는 Fab;
(iii) ROR1과 특이적으로 결합하는 scFv의 N-말단 단부를 CD3과 특이적으로 결합하는 Fab의 C-말단 단부에 연결하는 브릿징 모이어티로서, (a) 서열식별번호: 90 및 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 아암, 및 (b) 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 아암을 포함하는 브릿징 모이어티; 및
(iv) 서열식별번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는, 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결된 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 scFv. - 제112항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 단백질:
(i) 서열식별번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는, ROR1과 특이적으로 결합하는 scFv;
(ii) 서열식별번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, CD3과 특이적으로 결합하는 Fab;
(iii) ROR1과 특이적으로 결합하는 scFv의 N-말단 단부를 CD3과 특이적으로 결합하는 Fab의 C-말단 단부에 연결하는 브릿징 모이어티로서, (a) 서열식별번호: 90 및 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 아암, 및 (b) 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 아암을 포함하는 브릿징 모이어티; 및
(iv) 서열식별번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는, 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결된 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 scFv. - 제112항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 단백질:
(i) 서열식별번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는, ROR1과 특이적으로 결합하는 scFv;
(ii) 서열식별번호: 93의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, CD3과 특이적으로 결합하는 Fab;
(iii) ROR1과 특이적으로 결합하는 scFv의 C-말단 단부를 CD3과 특이적으로 결합하는 Fab의 N-말단 단부에 연결하는 브릿징 모이어티로서, (a) 서열식별번호: 90 및 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 아암, 및 (b) 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 아암을 포함하는 브릿징 모이어티; 및
(iv) 서열식별번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는, 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결된 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 scFv. - 제117항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 단백질:
(i) 서열식별번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는, ROR1과 특이적으로 결합하는 scFv;
(ii) 서열식별번호: 93의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, CD3과 특이적으로 결합하는 Fab;
(iii) ROR1과 특이적으로 결합하는 scFv의 C-말단 단부를 CD3과 특이적으로 결합하는 Fab의 N-말단 단부에 연결하는 브릿징 모이어티로서, (a) 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 아암, 및 (b) 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 아암을 포함하는 브릿징 모이어티; 및
(iv) 서열식별번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는, 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결된 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 scFv. - 제117항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 단백질:
(i) 서열식별번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는, ROR1과 특이적으로 결합하는 scFv;
(ii) 서열식별번호: 93의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, CD3과 특이적으로 결합하는 Fab;
(iii) ROR1과 특이적으로 결합하는 scFv의 C-말단 단부를 CD3과 특이적으로 결합하는 Fab의 N-말단 단부에 연결하는 브릿징 모이어티로서, (a) 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 86의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 아암, 및 (b) 서열식별번호: 92 및 서열식별번호: 87의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 아암을 포함하는 브릿징 모이어티; 및
(iv) 서열식별번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는, 브릿징 모이어티의 N-말단 단부에 연결된 ROR1과 특이적으로 결합하는 제2 scFv. - 서열식별번호: 95, 서열식별번호: 98, 서열식별번호: 101, 서열식별번호: 104, 서열식별번호: 219, 서열식별번호: 109, 및 서열식별번호: 220으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 단백질.
- 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 단백질:
(a) 서열식별번호: 94, 서열식별번호: 95, 및 서열식별번호: 84;
(b) 서열식별번호: 97, 서열식별번호: 98, 및 서열식별번호: 85;
(c) 서열식별번호: 100, 서열식별번호: 101, 및 서열식별번호: 84;
(d) 서열식별번호: 103, 서열식별번호: 104, 및 서열식별번호: 85;
(e) 서열식별번호: 218, 서열식별번호: 219, 및 서열식별번호: 85;
(f) 서열식별번호: 109, 서열식별번호: 110, 및 서열식별번호: 84; 및
(g) 서열식별번호: 220, 서열식별번호: 221, 및 서열식별번호: 84. - 서열식별번호: 94의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열식별번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열식별번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 단백질.
- 서열식별번호: 97의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열식별번호: 98의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열식별번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 단백질.
- 서열식별번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열식별번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 단백질.
- 서열식별번호: 103의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열식별번호: 104의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열식별번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 단백질.
- 서열식별번호: 218의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열식별번호: 219의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열식별번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 단백질.
- 서열식별번호: 109의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열식별번호: 110의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열식별번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 단백질.
- 서열식별번호: 220의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 서열식별번호: 221의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 서열식별번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 단백질.
- 표 11에 각각 열거된 제1 중쇄의 서열, 제2 중쇄의 서열, 및 경쇄의 서열에 상응하는 아미노산 서열을 각각 포함하는 제1 중쇄, 제2 중쇄, 및 경쇄를 포함하는 단백질.
- 제1항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 생물층 간섭계 검정에서 측정 시 10 nM 내지 50 nM의 CD3 결합에 대한 KD를 갖는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 생물층 간섭계 검정에서 측정 시 15 nM 내지 20 nM의 CD3 결합에 대한 KD를 갖는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 활성화된 T 세포를 사용하는 CD3 결합 검정에서 20 nM 내지 50 nM의 EC50을 갖는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 활성화된 T 세포를 사용하는 CD3 결합 검정에서 25 nM 내지 35 nM의 EC50을 갖는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 ROR1의 Ig-유사 도메인과 결합하는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 ROR1의 프리즐드 및/또는 크링글 도메인과 결합하지 않는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 생물층 간섭계 검정에서 측정 시 80 nM 내지 120 nM의 ROR1 결합에 대한 KD를 갖는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 생물층 간섭계 검정에서 측정 시 95 nM 내지 105 nM의 ROR1 결합에 대한 KD를 갖는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 생물층 간섭계 검정에서 측정 시 1 nM 내지 10 nM의 ROR1 결합에 대한 KD를 갖는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 생물층 간섭계 검정에서 측정 시 3 nM 내지 5 nM의 ROR1 결합에 대한 KD를 갖는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 약 3.5 X 104개의 ROR1 분자/세포를 발현하는 세포를 사용하는 ROR1 결합 검정에서 80 nM 내지 120 nM의 EC50을 갖는 것인 단백질.
- 제149항에 있어서, 단백질이 약 3.5 X 104개의 ROR1 분자/세포를 발현하는 세포를 사용하는 ROR1 결합 검정에서 90 nM 내지 110 nM의 EC50을 갖는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 약 3.5 X 104개의 ROR1 분자/세포를 발현하는 세포를 사용하는 ROR1 결합 검정에서 1 nM 내지 10 nM의 EC50을 갖는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 약 3.5 X 104개의 ROR1 분자/세포를 발현하는 세포를 사용하는 ROR1 결합 검정에서 2 nM 내지 5 nM의 EC50을 갖는 것인 단백질.
- 제145항, 제146항, 제149항 및 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 고형 종양의 치료에 사용하기 위한 단백질.
- 제147항, 제148항, 제151항 및 제152항 중 어느 한 항에 있어서, 혈액 종양의 치료에 사용하기 위한 단백질.
- 제1항 내지 제154항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 T 세포 용해성 과립 탈과립화를 유도하는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제155항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 T 세포/종양 세포 공동-배양 사멸 검정에서 측정 시 ROR1-발현 종양 세포의 T 세포 매개 세포독성에 대해 160 pM 내지 200 pM의 EC50을 갖는 것인 단백질.
- 제156항에 있어서, 단백질이 T 세포/종양 세포 공동-배양 사멸 검정에서 측정 시 ROR1-발현 종양 세포의 T 세포 매개 세포독성에 대해 165 pM 내지 190 pM의 EC50을 갖는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제155항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 T 세포/종양 세포 공동-배양 사멸 검정에서 측정 시 ROR1-발현 종양 세포의 T 세포 매개 세포독성에 대해 25 pM 내지 50 pM의 EC50을 갖는 것인 단백질.
- 제158항에 있어서, 단백질이 T 세포/종양 세포 공동-배양 사멸 검정에서 측정 시 ROR1-발현 종양 세포의 T 세포 매개 세포독성에 대해 30 pM 내지 40 pM의 EC50을 갖는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제159항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 T 세포 매개 세포독성을 유도하기에 충분한 농도로 배양물에 투여될 때 T 세포에 의한 염증유발성 시토카인의 생산 및/또는 방출의 유의미한 증가를 유도하지 않는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제159항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 T 세포/종양 세포 공동-배양 IFNγ 생산 검정에서 측정 시 1000 pM 내지 2000 pM의 EC50을 갖는 것인 단백질.
- 제161항에 있어서, 단백질이 T 세포/종양 세포 공동-배양 IFNγ 생산 검정에서 측정 시 1400 pM 내지 1800 pM의 EC50을 갖는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제159항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 T 세포/종양 세포 공동-배양 IFNγ 생산 검정에서 측정 시 200 pM 내지 600 pM의 EC50을 갖는 것인 단백질.
- 제163항에 있어서, 단백질이 T 세포/종양 세포 공동-배양 IFNγ 생산 검정에서 측정 시 300 pM 내지 500 pM의 EC50을 갖는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제159항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 T 세포/종양 세포 공동-배양 IFNγ 생산 검정에서 측정 시 참조 T 세포-결합제와 비교하여 20% 내지 60%의 Cmax를 갖는 것인 단백질.
- 제165항에 있어서, 단백질이 T 세포/종양 세포 공동-배양 IFNγ 생산 검정에서 측정 시 참조 T 세포-결합제와 비교하여 35% 내지 45%의 Cmax를 갖는 것인 단백질.
- 제165항에 있어서, 단백질이 T 세포/종양 세포 공동-배양 IFNγ 생산 검정에서 측정 시 참조 T 세포-결합제와 비교하여 45% 내지 55%의 Cmax를 갖는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제167항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 신선하게 단리된 말초 단핵 세포 (PBMC) 배양물에 투여될 때 유의미한 수준의 TNFα 방출을 유도하지 않는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제168항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 고밀도에서 48시간 동안 사전 배양된 PBMC에 투여될 때 유의미한 수준의 TNFα 방출을 유도하지 않는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 신선하게 단리된 PBMC 배양물에 투여될 때 유의미한 수준의 IL2 방출을 유도하지 않는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 고밀도에서 48시간 동안 사전 배양된 PBMC에 투여될 때 유의미한 수준의 IL2 방출을 유도하지 않는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제171항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 T 세포/종양 세포 공동-배양 사멸 검정에서 측정 시 참조 T 세포-결합제에 대해 정규화된 1:2 내지 1:4의 시토카인 방출 대 사멸 디커플링 비율을 갖는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제172항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 T 세포/종양 세포 공동-배양 사멸 검정에서 측정 시 참조 T 세포-결합제에 대해 정규화된 1:2.2의 시토카인 방출 대 사멸 디커플링 비율을 갖는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제172항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 T 세포/종양 세포 공동-배양 사멸 검정에서 측정 시 참조 T 세포-결합제에 대해 정규화된 1:2.9의 시토카인 방출 대 사멸 디커플링 비율을 갖는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제174항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 T 세포/종양 세포 공동-배양 사멸 검정에서 측정 시 3 내지 5의 종양 연쇄 사멸 지수를 유도하는 것인 단백질.
- 제175항에 있어서, 단백질이 T 세포/종양 세포 공동-배양 사멸 검정에서 측정 시 3.4 내지 3.6의 종양 연쇄 사멸 지수를 유도하는 것인 단백질.
- 제175항에 있어서, 단백질이 T 세포/종양 세포 공동-배양 사멸 검정에서 측정 시 3.8 내지 4.2의 종양 연쇄 사멸 지수를 유도하는 것인 단백질.
- 제1항 내지 제177항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 시노몰구스 CD3과 교차-반응성이지만 마우스 CD3과는 그렇지 않은 것인 단백질.
- 제1항 내지 제178항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 시노몰구스 ROR1 및 마우스 ROR1과 교차-반응성인 단백질.
- 제1항 내지 제179항 중 어느 한 항의 단백질 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제형.
- 제1항 내지 제179항 중 어느 한 항의 단백질을 코딩하는 핵산.
- 제1항 내지 제179항 중 어느 한 항의 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 세포.
- 제1항 내지 제179항 중 어느 한 항의 단백질, 또는 제180항의 제형을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법.
- 제183항에 있어서, 암이 혈액 암 또는 고형 종양 암인 방법.
- 제184항에 있어서, 암이 만성 림프구성 백혈병, 외투 세포 림프종, 비-호지킨 림프종, 난소암, 폐암, 기관지암, 결장암, 직장암, 흑색종, 신장암, 위암, 췌장암, 전립선암, 자궁암, 유방암, 구강암, 인두암, 모발상 세포 백혈병, 간암, 간내 담관암, 및 갑상선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제130항의 단백질의 제조에 있어서의, 제129항의 단백질 또는 그의 기능적 단편의 용도.
- 제130항의 단백질의 제조에 있어서의, 제129항의 단백질 또는 그의 기능적 단편을 코딩하는 핵산의 용도.
- IMGT 고유 넘버링 체계에 따라, GFTFTSYA (서열식별번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 상보성-결정 영역 1 (VHCDR1), ISGSGGGT (서열식별번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 상보성-결정 영역 2 (VHCDR2), AQGSSIFDY (서열식별번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 상보성-결정 영역 3 (VHCDR3), QSVSSY (서열식별번호: 11)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 상보성-결정 영역 1 (VLCDR1), DAS의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 상보성-결정 영역 2 (VLCDR2), 및 QQRSNWPPFT (서열식별번호: 14)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 상보성-결정 영역 3 (VLCDR3)을 포함하는 항체 또는 그의 기능적 단편.
- 제188항에 있어서, 중쇄 가변 도메인이 서열식별번호: 29와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄가 서열식별번호: 30과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체.
- IMGT 고유 넘버링 체계에 따라, GFTFTSYA (서열식별번호: 8)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 상보성-결정 영역 1 (VHCDR1), ISGSGGGT (서열식별번호: 9)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 상보성-결정 영역 2 (VHCDR2), AQGSSIFDY (서열식별번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 상보성-결정 영역 3 (VHCDR3), QSVSSY (서열식별번호: 11)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 상보성-결정 영역 1 (VLCDR1), DAS의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 상보성-결정 영역 2 (VLCDR2), 및 QQRSNWPPST (서열식별번호: 15)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 상보성-결정 영역 3 (VLCDR3)을 포함하는 항체 또는 그의 기능적 단편.
- 제190항에 있어서, 중쇄 가변 도메인이 서열식별번호: 29와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 도메인이 서열식별번호: 31과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체.
- IMGT 고유 넘버링 체계에 따라, GFSITTSGVS (서열식별번호: 23)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 상보성-결정 영역 1 (VHCDR1), IYWDDDK (서열식별번호: 24)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 상보성-결정 영역 2 (VHCDR2), AHAPRYTPGGYFDY (서열식별번호: 25)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 상보성-결정 영역 3 (VHCDR3), QSVSSN (서열식별번호: 26)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 상보성-결정 영역 1 (VLCDR1), GAS의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 상보성-결정 영역 2 (VLCDR2), 및 QQYKNWPPA (서열식별번호: 28)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 상보성-결정 영역 3 (VLCDR3)을 포함하는 항체 또는 그의 기능적 단편.
- 제192항에 있어서, 중쇄 가변 도메인이 서열식별번호: 39와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 도메인이 서열식별번호: 40과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체.
- 제188항 내지 제193항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IgG1 항체인 항체 또는 그의 기능적 단편.
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