KR20240006054A - 항-tigit 항체, 항-cd96 항체, 및 이의 사용 방법 - Google Patents
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Abstract
본 개시는 CD96(예: 인간 CD96) 및/또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 다중특이적 분자 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 또한, 이들 다중특이적 분자 및 항체를 포함하는 약학적 조성물, 이들 다중특이적 분자 및 항체를 암호화하는 핵산, 이들 다중특이적 분자 및 항체를 제조하기 위한 발현 벡터 및 숙주 세포, 및 이들 다중특이적 분자 및 항체를 사용하여 대상체를 치료하는 방법이 제공된다.
Description
관련 출원
본 출원은 2021년 5월 4일에 출원된 미국 특허 가출원 제63/201,537호에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 그 전체는 참조로서 본원에 통합된다.
서열 목록
ASCII 텍스트 파일(명칭: 190448_SL; 크기 293,587 바이트; 생성일: 2022년 4월 26일) 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록의 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
기술분야
본 개시는 CD96(예: 인간 CD96) 및/또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 다중특이적 분자, 항-TIGIT 항체, 및 이를 사용하는 방법에 관한 것이다.
TACTILE(T 세포 활성화, 후기 발현 증가)로도 알려진 CD96(분화 클러스터 96)은 면역글로불린(Ig) 상과의 I형 막관통 단백질이다. 이는 단일 Ig 도메인(I형 막관통 도메인), 단일 세포내 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프(ITIM), 및 단일 YXXM 인산화 모티프를 가지며, T 세포 및 자연 살해(NK) 세포의 표면에서 발현된다.
CD96은 면역 세포(예를 들어, NK 세포 및 T 세포) 및 종양 전이의 조절에 역할을 하는 것으로 여겨진다. 특히, CD96 기능의 차단은 여러 마우스 종양 모델에서 원발성 종양 성장을 CD8+ T 세포 의존적 방식으로 억제한 것으로 나타났다.
VSIG9 또는 VSTM3으로도 알려진, Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 단백질 T-세포 면역수용체(TIGIT)는 면역글로불린(Ig) 상과에 속하는 I형 막관통 단백질이다. 이는 단일 Ig 도메인, I형 막관통 도메인, 단일 세포내 면역수용체 티로신 기반 억제 모티프(ITIM), 및 단일 면역글로불린 꼬리 티로신(ITT)-유사 인산화 모티프를 가지며, 활성화된 CD4-양성/CD25-양성 조절 T 세포(Treg), 기억 CD45RO-양성 T 세포, 및 자연 살해(NK) 세포 상에서 발현되지만, 미노출 T 세포 상에서는 발현되지 않는다.
CD155(폴리오바이러스 수용체(PVR)로도 알려짐)는 단핵구 및 수지상 세포에서 고도로 발현되며, 작동자 T 세포 및 NK 세포를 활성화시킬 수 있을 뿐만 아니라, 이의 2개의 수용체인 CD226 및 CD96에 결합함으로써 Treg의 활성을 약화시킬 수도 있다. TIGIT는 CD155에 결합하며, CD155와 CD226 및 CD96의 상호작용을 길항하여 T 세포 및 NK 세포 매개 면역 활성을 억제하는 것으로 나타났다.
면역 반응을 조절하는 데 있어서 인간 CD96 및 인간 TIGIT의 역할을 고려하면, CD96 리간드 상호작용 및/또는 TIGIT 리간드 상호작용을 차단하도록 설계된 치료제는 면역 억제에 관여하는 질환을 치료하는 데 큰 가능성을 갖는다.
본 개시는 CD96(예: 인간 CD96) 및/또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 다중특이적 분자 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 또한, 이들 다중특이적 분자 및 항체를 포함하는 약학적 조성물, 이들 다중특이적 분자 및 항체를 암호화하는 핵산, 이들 다중특이적 분자 및 항체를 제조하기 위한 발현 벡터 및 숙주 세포, 및 이들 다중특이적 분자 및 항체를 사용하여 대상체를 치료하는 방법이 제공된다.
일 양태에서, 본 개시는 다음을 포함하는 다중특이적 분자를 제공한다:
(a) 인간 CD96에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역으로서, CDR(CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3)을 포함하는 제1 VH 및 CDR(CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3)을 포함하는 제1 VL을 포함하되,
(i) 제1 VH는 서열번호 34의 VH 아미노산 서열의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하고; 제1 VL은 서열번호 35의 VL 아미노산 서열의 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하거나,
(ii) 제1 VH는 서열번호 36의 VH 아미노산 서열의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하고; 제1 VL은 서열번호 37의 VL 아미노산 서열의 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하거나,
(iii) 제1 VH는 서열번호 38의 VH 아미노산 서열의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하고; 제1 VL은 서열번호 39의 VL 아미노산 서열의 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는, 제1 항원 결합 영역; 및
(b) 인간 CD96 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역으로서, CDR(CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3)을 포함하는 제2 VH 및 CDR(CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3)을 포함하는 제2 VL을 포함하는, 제2 항원 결합 영역.
소정의 구현예에서, 제1 항원 결합 영역의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 서열번호 10, 11, 12, 13, 14, 및 15의 아미노산 서열; 16, 17, 18, 19, 20, 및 21의 아미노산 서열; 또는 22, 23, 24, 25, 26, 및 27의 아미노산 서열을 각각 포함한다.
소정의 구현예에서, 제2 항원 결합 영역은 인간 TIGIT에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 제2 VH는 서열번호 40의 VH 아미노산 서열의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하고; 제2 VL은 서열번호 41의 VL 아미노산 서열의 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제2 항원 결합 영역의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 서열번호 28, 29, 30, 31, 32, 및 33의 아미노산 서열을 각각 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 다음을 포함하는 다중특이적 분자를 제공한다:
(a) 인간 TIGIT 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역으로서, CDR(CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3)을 포함하는 제1 VH 및 CDR(CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3)을 포함하는 제1 VL을 포함하는, 제1 항원 결합 영역; 및
(b) 인간 TIGIT에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역으로서, 서열번호 40의 VH 아미노산 서열의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는 제2 VH; 및 서열번호 41의 VL 아미노산 서열의 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는 제2 VL을 포함하는, 제2 항원 결합 영역.
소정의 구현예에서, 제2 항원 결합 영역의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 서열번호 28, 29, 30, 31, 32, 및 33의 아미노산 서열을 각각 포함한다.
소정의 구현예에서, 제1 항원 결합 영역은 인간 CD96에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 제1 VH는 서열번호 34, 36, 또는 38의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제1 VH의 아미노산 서열은 서열번호 34, 36, 또는 38의 아미노산 서열로 이루어진다. 또 다른 구현예에서, 제1 VL은 서열번호 35, 37, 또는 39의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제1 VL의 아미노산 서열은 서열번호 35, 37, 또는 39의 아미노산 서열로 이루어진다.
소정의 구현예에서, 제2 VH는 서열번호 40의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 VH의 아미노산 서열은 서열번호 40의 아미노산 서열로 이루어진다.
소정의 구현예에서, 제2 VL은 서열번호 41의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 VL의 아미노산 서열은 서열번호 41의 아미노산 서열로 이루어진다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 다음을 포함하는 다중특이적 분자를 제공한다:
(a) 인간 CD96에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역으로서, 서열번호 34, 36, 또는 38의 아미노산 서열을 포함하는 제1 VH; 및/또는 서열번호 35, 37, 또는 39의 아미노산 서열을 포함하는 제1 VL을 포함하는, 제1 항원 결합 영역; 및
(b) 인간 CD96 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역으로서, 제2 VH 및 제2 VL을 포함하는, 제2 항원 결합 영역.
소정의 구현예에서, 제2 항원 결합 영역은 인간 TIGIT에 특이적으로 결합한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 다음을 포함하는 다중특이적 분자를 제공한다:
(a) 인간 TIGIT 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역으로서, 제1 VH 및 제1 VL을 포함하는, 제1 항원 결합 영역; 및
(b) 인간 TIGIT에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역으로서, 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 제2 VH; 및/또는 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 제2 VL을 포함하는, 제2 항원 결합 영역.
소정의 구현예에서, 제1 항원 결합 영역은 인간 CD96에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 제1 VH는 서열번호 34, 36, 또는 38의 아미노산 서열을 포함하고, 제1 VL은 서열번호 35, 37, 또는 39의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제1 VH의 아미노산 서열은 서열번호 34, 36, 또는 38로 이루어지고, 제1 VL의 아미노산 서열은 서열번호 35, 37, 또는 39로 이루어진다. 또 다른 구현예에서, 제1 VH 및 제1 VL은 서열번호 34 및 35; 36 및 37; 또는 38 및 39의 아미노산 서열을 각각 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제1 VH 및 제1 VL의 아미노산 서열은 서열번호 34 및 35; 36 및 37; 또는 38 및 39의 아미노산 서열로 각각 이루어진다. 또 다른 구현예에서, 제2 VH는 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 VL은 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제2 VH 및 제2 VL의 아미노산 서열은 서열번호 40 및 41의 아미노산 서열로 각각 이루어진다. 또 다른 구현예에서, 제1 VH 및 제1 VL은 서열번호 34 및 35; 36 및 37; 또는 38 및 39의 아미노산 서열을 각각 포함하고; 제2 VH 및 제2 VL은 서열번호 40 및 41의 아미노산 서열을 각각 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제1 VH 및 제1 VL의 아미노산 서열은 서열번호 34 및 35; 36 및 37; 또는 38 및 39의 아미노산 서열로 각각 이루어지고; 제2 VH 및 제2 VL의 아미노산 서열은 서열번호 40 및 41의 아미노산 서열로 각각 이루어진다.
소정의 구현예에서, 제1 및/또는 제2 항원 결합 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 불변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 중쇄 불변 영역은 IgG1 중쇄 불변 영역이다. 또 다른 구현예에서, 중쇄 불변 영역은 서열번호 49~60 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
소정의 구현예에서, IgG1 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 N297A 돌연변이를 포함한다.
소정의 구현예에서, 제1 및/또는 제2 항원 결합 영역은 야생형 중쇄 불변 영역의 변이체인 중쇄 불변 영역을 포함하고, 여기서 변이체 중쇄 불변 영역은 야생형 중쇄 불변 영역이 FcγR에 결합하는 것보다 더 높은 친화도로 FcγR에 결합한다. 특정 구현예에서, FcγR은 FcγRIIB 또는 FcγRIIIA이다.
소정의 구현예에서, IgG1 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 S267E 및 L328F 돌연변이를 포함한다.
소정의 구현예에서, IgG1 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 S239D, A330L, 및 I332E로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
소정의 구현예에서, 제1 항원 결합 영역은 제1 중쇄 불변 영역을 포함하되, 제1 중쇄 불변 영역은 아미노산 위치 239에서 아스파르테이트를 포함하고 아미노산 위치 239 및 332에서 아스파르테이트 및 글루타메이트를 각각 포함하거나; 아미노산 위치 239, 330, 및 332에서 아스파르테이트, 류신, 및 글루타메이트를 각각 포함하고;
제2 항원 결합 영역은 아미노산 위치 239, 330, 및 332에서 아스파르테이트, 류신, 및 글루타메이트를 각각 포함하지 않는 제2 중쇄 불변 영역을 포함하고,
아미노산 위치는 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된다.
특정 구현예에서, 제1 중쇄 불변 영역 및 제2 중쇄 불변 영역은 서열번호 58 및 57; 59 및 57; 또는 60 및 57을 각각 포함한다.
소정의 구현예에서, 제1 항원 결합 영역은 제1 중쇄 불변 영역을 포함하되, 제1 중쇄 불변 영역은 아미노산 위치 239 및 332에서 아스파르테이트 및 글루타메이트를 포함하거나; 아미노산 위치 239, 330, 및 332에서 아스파르테이트, 류신, 및 글루타메이트를 각각 포함하고;
제2 항원 결합 영역은 아미노산 위치 239에서 아스파르테이트를 포함하는 제2 중쇄 불변 영역을 포함하고,
아미노산 위치는 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는, 다중특이적 분자.
특정 구현예에서, 제1 중쇄 불변 영역 및 제2 중쇄 불변 영역은 서열번호 59 및 58; 또는 60 및 58을 각각 포함한다.
소정의 구현예에서, 제1 중쇄 불변 영역은 아미노산 위치 239, 330, 및 332에서 아스파르테이트, 류신, 및 글루타메이트를 각각 포함하고;
제2 중쇄 불변 영역은 아미노산 위치 332에서 글루타메이트를 추가로 포함하고,
아미노산 위치는 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는, 다중특이적 분자.
특정 구현예에서, 제1 중쇄 불변 영역 및 제2 중쇄 불변 영역은 서열번호 60 및 59를 각각 포함한다.
소정의 구현예에서, 제1 항원 결합 영역은 아미노산 위치 239, 330, 및 332에서 아스파르테이트, 류신, 및 글루타메이트를 각각 포함하지 않는 제1 중쇄 불변 영역을 포함하고;
제2 항원 결합 영역은 제2 중쇄 불변 영역을 포함하되, 제2 중쇄 불변 영역은 아미노산 위치 239에서 아스파르테이트를 포함하고 아미노산 위치 239 및 332에서 아스파르테이트 및 글루타메이트를 각각 포함하거나; 아미노산 위치 239, 330, 및 332에서 아스파르테이트, 류신, 및 글루타메이트를 각각 포함하고,
아미노산 위치는 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는, 다중특이적 분자.
특정 구현예에서, 제1 중쇄 불변 영역 및 제2 중쇄 불변 영역은 서열번호 57 및 60; 57 및 59; 또는 57 및 58을 각각 포함한다.
소정의 구현예에서, 제1 항원 결합 영역은 아미노산 위치 239에서 아스파르테이트를 포함하는 제1 중쇄 불변 영역을 포함하고;
제2 항원 결합 영역은 제2 중쇄 불변 영역을 포함하되, 제2 중쇄 불변 영역은 아미노산 위치 239 및 332에서 아스파르테이트 및 글루타메이트를 각각 포함하거나; 아미노산 위치 239, 330, 및 332에서 아스파르테이트, 류신, 및 글루타메이트를 각각 포함하고,
아미노산 위치는 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는, 다중특이적 분자.
특정 구현예에서, 제1 중쇄 불변 영역 및 제2 중쇄 불변 영역은 서열번호 58 및 60; 또는 58 및 59를 각각 포함한다.
소정의 구현예에서, 제1 중쇄 불변 영역은 아미노산 위치 332에서 글루타메이트를 추가로 포함하고,
제2 중쇄 불변 영역은 아미노산 위치 239, 330, 및 332에서 아스파르테이트, 류신, 및 글루타메이트를 각각 포함하고;
아미노산 위치는 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는, 다중특이적 분자.
특정 구현예에서, 제1 중쇄 불변 영역 및 제2 중쇄 불변 영역은 서열번호 59 및 60을 각각 포함한다.
소정의 구현예에서, 제1 항원 결합 영역은 아미노산 위치 366에서 트립토판을 포함하는 제1 중쇄 불변 영역을 포함하고;
제2 항원 결합 영역은 아미노산 위치 366, 368, 및 407에서 세린, 알라닌, 및 발린을 각각 포함하는 제2 중쇄 불변 영역을 포함하고,
아미노산 위치는 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는, 다중특이적 분자.
특정 구현예에서, 제1 중쇄 불변 영역은 서열번호 53, 54, 55, 또는 56을 포함하고; 제2 중쇄 불변 영역은 서열번호 49, 50, 51, 또는 52를 포함한다.
소정의 구현예에서, 제1 항원 결합 영역은 아미노산 위치 366, 368, 및 407에서 세린, 알라닌, 및 발린을 각각 포함하는 제1 중쇄 불변 영역을 포함하고,
제2 항원 결합 영역은 아미노산 위치 366에서 트립토판을 포함하는 제2 중쇄 불변 영역을 포함하고,
아미노산 위치는 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는, 다중특이적 분자.
특정 구현예에서, 제1 중쇄 불변 영역은 서열번호 49, 50, 51, 또는 52를 포함하고; 제2 중쇄 불변 영역은 서열번호 53, 54, 55, 또는 56을 포함한다.
소정의 구현예에서, 제1 항원 결합 영역은 서열번호 1, 3, 5, 또는 67~99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 중쇄는 서열번호 1, 3, 5, 또는 67~99의 아미노산 서열로 이루어진다. 소정의 구현예에서, 제2 항원 결합 영역은 서열번호 7 또는 100~110의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 7 또는 100~110의 아미노산 서열로 이루어진다.
소정의 구현예에서, 다중특이적 분자는 서열번호 42, 43, 또는 44의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 항원 결합 영역은 서열번호 2, 4, 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제1 경쇄는 서열번호 2, 4, 또는 6의 아미노산 서열로 이루어진다. 특정 구현예에서, 제2 항원 결합 영역은 서열번호 8 또는 9의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제2 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 8 또는 9의 아미노산 서열로 이루어진다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 다음을 포함하는 다중특이적 분자를 제공한다:
(a) 인간 CD96에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역으로서, 서열번호 1, 3, 5, 또는 67~99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄; 및/또는 서열번호 2, 4, 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄를 포함하는, 제1 항원 결합 영역; 및
(b) 인간 CD96 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역으로서, 제2 중쇄 및 제2 경쇄를 포함하는, 제2 항원 결합 영역.
소정의 구현예에서, 제2 항원 결합 영역은 인간 TIGIT에 특이적으로 결합한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 다음을 포함하는 다중특이적 분자를 제공한다:
(a) 인간 TIGIT 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역으로서, 제1 중쇄 및 제1 경쇄를 포함하는, 제1 항원 결합 영역; 및
(b) 인간 TIGIT에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역으로서, 서열번호 7 또는 100~110의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄; 및/또는 서열번호 8 또는 9의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄를 포함하는, 제2 항원 결합 영역.
소정의 구현예에서, 제1 항원 결합 영역은 인간 CD96에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 제1 중쇄는 서열번호 1, 3, 5, 또는 67~99의 아미노산 서열을 포함하고/하거나; 제1 경쇄는 서열번호 2, 4, 또는 6의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제1 중쇄는 서열번호 1, 3, 5, 또는 67~69의 아미노산 서열을 포함하고, 제1 경쇄는 서열번호 2, 4, 또는 6의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제1 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 1, 3, 5, 또는 67~99의 아미노산 서열로 이루어지고; 제1 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 2, 4, 또는 6의 아미노산 서열로 이루어진다.
소정의 구현예에서, 제2 중쇄는 서열번호 7 또는 100~110의 아미노산 서열을 포함하고/하거나; 제2 경쇄는 서열번호 8 또는 9의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 중쇄는 서열번호 7 또는 100~110의 아미노산 서열을 포함하고; 제2 경쇄는 서열번호 8 또는 9의 아미노산 서열을 포함한다. 소정의 구현예에서, 제2 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지고; 제2 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 8 또는 9의 아미노산 서열로 이루어진다.
소정의 구현예에서, 제1 중쇄 및 제1 경쇄는 서열번호 1 및 2; 3 및 4; 또는 5 및 6의 아미노산 서열을 각각 포함하고/하거나; 제2 중쇄 및 제2 경쇄는 서열번호 7 및 8; 또는 7 및 9의 아미노산 서열을 각각 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 중쇄 및 제1 경쇄는 서열번호 1 및 2; 3 및 4; 또는 5 및 6의 아미노산 서열을 각각 포함하고; 제2 중쇄 및 제2 경쇄는 서열번호 7 및 8; 또는 7 및 9의 아미노산 서열을 각각 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제1 중쇄 및 제1 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 1 및 2; 3 및 4; 또는 5 및 6으로 각각 이루어지고; 제2 중쇄 및 제2 경쇄는 서열번호 7 및 8; 또는 7 및 9의 아미노산 서열로 각각 이루어진다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 인간 CD96에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역; 및 인간 TIGIT에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서:
(a) 제1 항원 결합 영역은 아미노산 위치 239, 330, 332, 및 366에서 아스파르테이트, 류신, 글루타메이트, 및 트립토판을 각각 포함하고;
(b) 제2 항원 결합 영역은 아미노산 위치 366, 368, 및 407에서 세린, 알라닌, 및 발린을 각각 포함하지만, 아미노산 위치 239, 330, 및 332에서 아스파르테이트, 류신, 및 글루타메이트를 각각 포함하지는 않고;
아미노산 위치는 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는, 다중특이적 분자.
일부 구현예에서, 제1 항원 결합 영역은 서열번호 73, 84, 95, 또는 56을 포함하고; 제2 항원 결합 영역은 서열번호 103 또는 49를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 인간 CD96에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역; 및 인간 TIGIT에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서:
(a) 제1 항원 결합 영역은 아미노산 위치 239, 330, 332, 및 366에서 아스파르테이트, 류신, 글루타메이트, 및 트립토판을 각각 포함하고;
(b) 제2 항원 결합 영역은 아미노산 위치 239, 366, 368, 및 407에서 아스파르테이트, 세린, 알라닌, 및 발린을 각각 포함하고,
아미노산 위치는 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는, 다중특이적 분자.
소정의 구현예에서, 제1 항원 결합 영역은 서열번호 73, 84, 95, 또는 56을 포함하고; 제2 항원 결합 영역은 서열번호 104 또는 50을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 인간 CD96에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역; 및 인간 TIGIT에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서:
(a) 제1 항원 결합 영역은 아미노산 위치 366, 368, 및 407에서 세린, 알라닌, 및 발린을 각각 포함하지만, 아미노산 위치 239, 330, 및 332에서 아스파르테이트, 류신, 및 글루타메이트를 각각 포함하지는 않고;
(b) 제2 항원 결합 영역은 아미노산 위치 239, 330, 332, 및 366에서 아스파르테이트, 류신, 글루타메이트, 및 트립토판을 각각 포함하고,
아미노산 위치는 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는, 다중특이적 분자.
소정의 구현예에서, 제1 항원 결합 영역은 서열번호 67, 78, 89, 또는 49를 포함하고; 제2 항원 결합 영역은 서열번호 7 또는 56을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 인간 CD96에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역; 및 인간 TIGIT에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서:
(a) 제1 항원 결합 영역은 아미노산 위치 239, 366, 368, 및 407에서 아스파르테이트, 세린, 알라닌, 및 발린을 각각 포함하고;
(b) 제2 항원 결합 영역은 아미노산 위치 239, 330, 332, 및 366에서 아스파르테이트, 류신, 글루타메이트, 및 트립토판을 각각 포함하고,
아미노산 위치는 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는, 다중특이적 분자.
소정의 구현예에서, 제1 항원 결합 영역은 서열번호 1, 3, 5, 또는 50을 포함하고; 제2 항원 결합 영역은 서열번호 7 또는 56을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 인간 CD96에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역; 및 인간 TIGIT에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서:
(a) 제1 항원 결합 영역은 아미노산 위치 239, 332, 및 366에서 아스파르테이트, 글루타메이트, 및 트립토판을 각각 포함하고;
(b) 제2 항원 결합 영역은 아미노산 위치 366, 368, 및 407에서 세린, 알라닌, 및 발린을 각각 포함하지만, 아미노산 위치 239, 330, 및 332에서 아스파르테이트, 류신, 및 글루타메이트를 각각 포함하지는 않고;
아미노산 위치는 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는, 다중특이적 분자.
소정의 구현예에서, 제1 항원 결합 영역은 서열번호 72, 83, 94, 또는 55을 포함하고; 제2 항원 결합 영역은 서열번호 103 또는 49를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 인간 CD96에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역; 및 인간 TIGIT에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서:
(a) 제1 항원 결합 영역은 아미노산 위치 366, 368, 및 407에서 세린, 알라닌, 및 발린을 각각 포함하지만, 아미노산 위치 239, 330, 및 332에서 아스파르테이트, 류신, 및 글루타메이트를 각각 포함하지는 않고;
(b) 제2 항원 결합 영역은 아미노산 위치 239, 332, 및 366에서 아스파르테이트, 글루타메이트, 및 트립토판을 각각 포함하고,
아미노산 위치는 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는, 다중특이적 분자.
소정의 구현예에서, 제1 항원 결합 영역은 서열번호 67, 78, 89, 또는 49를 포함하고; 제2 항원 결합 영역은 서열번호 102 또는 55를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 인간 TIGIT에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공하며, 상기 항체는 서열번호 40의 VH 아미노산 서열의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열번호 41의 VL 아미노산 서열의 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 소정의 구현예에서, 항체는 서열번호 28, 29, 30, 31, 32, 및 33의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 각각 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호 40의 VH 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, VH는 서열번호 40의 아미노산 서열로 이루어진다. 또 다른 구현예에서, 항체는 서열번호 41의 VL 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, VL의 아미노산 서열은 서열번호 41의 아미노산 서열로 이루어진다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 인간 TIGIT에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공하며, 상기 항체는 서열번호 40 및 41의 아미노산 서열을 각각 포함하는 VH 및 VL을 포함한다. 소정의 구현예에서, VH 및 VL은 서열번호 40 및 41의 아미노산 서열로 각각 이루어진다.
일부 구현예에서, 항체는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 불변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 IgG1 중쇄 불변 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항체는 서열번호 57, 58, 59, 또는 60의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, IgG1 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 N297A 돌연변이를 포함한다.
소정의 구현예에서, 항체는 야생형 중쇄 불변 영역의 변이체인 중쇄 불변 영역을 포함하고, 여기서 변이체 중쇄 불변 영역은 야생형 중쇄 불변 영역이 FcγR에 결합하는 것보다 더 높은 친화도로 FcγR에 결합한다. 특정 구현예에서, FcγR은 FcγRIIB 또는 FcγRIIIA이다.
소정의 구현예에서, IgG1 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 S267E 및 L328F 돌연변이를 포함한다.
소정의 구현예에서, IgG1 중쇄 불변 영역은 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
소정의 구현예에서, 항체는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 소정의 구현예에서, 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진다.
소정의 구현예에서, 항체는 서열번호 43 또는 44의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 서열번호 8 또는 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 8 또는 9의 아미노산 서열로 이루어진다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 인간 TIGIT에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공하며, 상기 항체는 서열번호 107, 108, 109, 또는 110의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열번호 8 또는 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 구현예에서, 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 107, 108, 109, 또는 110의 아미노산 서열로 이루어지고; 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 8 또는 9의 아미노산 서열로 이루어진다. 또 다른 구현예에서, 중쇄 및 경쇄는 서열번호 107 및 8; 107 및 9; 108 및 8; 108 및 9; 109 및 8; 109 및 9; 110 및 8; 또는 110 및 9의 아미노산 서열을 각각 포함한다. 또 다른 구현예에서, 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 107 및 8; 107 및 9; 108 및 8; 108 및 9; 109 및 8; 109 및 9; 110 및 8; 또는 110 및 9의 아미노산 서열로 각각 이루어진다.
소정의 구현예에서, 항체는 다중특이적이다.
소정의 구현예에서, 다중특이적 분자 또는 단리된 항체는 세포독성제, 세포증식억제제, 독소, 방사성 핵종, 또는 검출 가능한 표지에 접합된다. 소정의 구현예에서, 다중특이적 분자 또는 단리된 항체는 항체에 접합된다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 다음을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다:
(a) 본원에 개시된 다중특이적 분자의 VH, VL, 중쇄, 및/또는 경쇄;
(b) 본원에 개시된 다중특이적 분자의 제1 VH 및 제1 VL;
(c) 본원에 개시된 다중특이적 분자의 제2 VH 및 제2 VL;
(d) 본원에 개시된 다중특이적 분자의 제1 중쇄 및 제1 경쇄; 또는
(e) 본원에 개시된 다중특이적 분자의 제2 중쇄 및 제2 경쇄.
또 다른 양태에서, 본 개시는 본원에 개시된 단리된 항체의 VH 및/또는 VL, 또는 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 다음을 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다:
(a) 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드;
(b) 본원에 개시된 벡터;
(c) 본원에 개시된 제1 항원 결합 영역의 VH 및 VL을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 및 본원에 개시된 제2 항원 결합 영역의 VH 및 VL을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드;
(d) 본원에 개시된 제1 항원 결합 영역의 VH 및 VL을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 벡터, 및 본원에 개시된 제2 항원 결합 영역의 VH 및 VL을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 벡터;
(e) 본원에 개시된 제1 항원 결합 영역의 VH를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 본원에 개시된 제1 항원 결합 영역의 VL을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드, 본원에 개시된 제2 항원 결합 영역의 VH를 암호화하는 제3 폴리뉴클레오티드, 및 본원에 개시된 제2 항원 결합 영역의 VL을 암호화하는 제4 폴리뉴클레오티드;
(f) 본원에 개시된 제1 항원 결합 영역의 VH를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 벡터, 본원에 개시된 제1 항원 결합 영역의 VL을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 벡터, 본원에 개시된 제2 항원 결합 영역의 VH를 암호화하는 제3 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제3 벡터, 및 본원에 개시된 제2 항원 결합 영역의 VL을 암호화하는 제4 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제4 벡터;
(g) 본원에 개시된 제1 항원 결합 영역의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 및 본원에 개시된 제2 항원 결합 영역의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드;
(h) 본원에 개시된 제1 항원 결합 영역의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 벡터, 및 본원에 개시된 제2 항원 결합 영역의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 벡터;
(i) 본원에 개시된 제1 항원 결합 영역의 중쇄를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 본원에 개시된 제1 항원 결합 영역의 경쇄를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드, 본원에 개시된 제2 항원 결합 영역의 중쇄를 암호화하는 제3 폴리뉴클레오티드, 및 본원에 개시된 제2 항원 결합 영역의 VL을 암호화하는 제4 폴리뉴클레오티드; 또는
(j) 본원에 개시된 제1 항원 결합 영역의 중쇄를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 벡터, 본원에 개시된 제1 항원 결합 영역의 경쇄를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 벡터, 본원에 개시된 제2 항원 결합 영역의 중쇄를 암호화하는 제3 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제3 벡터, 및 본원에 개시된 제2 항원 결합 영역의 경쇄를 암호화하는 제4 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제4 벡터.
또 다른 양태에서, 본 개시는 다음을 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다:
(a) 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드;
(b) 본원에 개시된 벡터;
(c) 본원에 개시된 단리된 항체의 VH 및 VL을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
(d) 본원에 개시된 단리된 항체의 VH 및 VL을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터;
(e) 본원에 개시된 단리된 항체의 VH를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 및 본원에 개시된 단리된 항체의 VL을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드; 또는
(f) 본원에 개시된 단리된 항체의 VH를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 벡터, 및 본원에 개시된 단리된 항체의 VL을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 벡터.
또 다른 양태에서, 본 개시는 본원에 개시된 다중특이적 분자, 본원에 개시된 단리된 항체, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드, 본원에 개시된 벡터, 또는 본원에 개시된 숙주 세포; 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 다중특이적 분자 또는 단리된 항체를 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 폴리뉴클레오티드가 발현되고 다중특이적 분자 또는 단리된 항체가 생산되도록 적절한 조건 하에 본원에 개시된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 다중특이적 분자를 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 폴리뉴클레오티드가 발현되고 다중특이적 분자가 생산되도록 적절한 조건 하에, 세포에서 다음을 발현시키는 단계를 포함한다:
(a) 본원에 개시된 제1 항원 결합 영역의 VH 및 VL을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드; 및 본원에 개시된 항원 결합 영역의 VH 및 VL을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드; 또는
(b) 본원에 개시된 제1 항원 결합 영역의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드; 및 본원에 개시된 제2 항원 결합 영역의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드.
또 다른 양태에서, 본 개시는 다중특이적 분자를 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 폴리뉴클레오티드가 발현되고 다중특이적 분자가 생산되도록 적절한 조건 하에, 세포에서 다음을 발현시키는 단계를 포함한다:
(a) 본원에 개시된 제1 항원 결합 영역의 VH를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 본원에 개시된 제1 항원 결합 영역의 VL을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드, 본원에 개시된 제2 항원 결합 영역의 VH를 암호화하는 제3 폴리뉴클레오티드, 및 본원에 개시된 제2 항원 결합 영역의 VL을 암호화하는 제4 폴리뉴클레오티드; 또는
(b) 본원에 개시된 제1 항원 결합 영역의 중쇄를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 본원에 개시된 제1 항원 결합 영역의 경쇄를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드, 본원에 개시된 제2 항원 결합 영역의 중쇄를 암호화하는 제3 폴리뉴클레오티드, 및 본원에 개시된 제2 항원 결합 영역의 경쇄를 암호화하는 제4 폴리뉴클레오티드.
또 다른 양태에서, 본 개시는 다중특이적 분자를 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
(a) 제1 항원 결합 영역이 생성되는 조건 하에, 제1 세포에서 본원에 개시된 제1 항원 결합 영역의 VH 및 VL을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 단계;
(b) 제2 항원 결합 영역이 생성되는 조건 하에, 제2 세포에서 본원에 개시된 제2 항원 결합 영역의 VH 및 VL을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 단계; 및
(c) 다중특이적 분자가 생산되도록 적절한 조건 하에, 단계 (a) 및 (b)에서 생산된 제1 및 제2 항원 결합 영역을 접촉시키는 단계.
또 다른 양태에서, 본 개시는 다중특이적 분자를 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
(a) 제1 항원 결합 영역이 생성되는 조건 하에, 제1 세포에서 본원에 개시된 제1 항원 결합 영역의 VH를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 본원에 개시된 제1 항원 결합 영역의 VL을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 단계;
(b) 제2 항원 결합 영역이 생성되는 조건 하에, 제2 세포에서 본원에 개시된 제2 항원 결합 영역의 VH를 암호화하는 제3 폴리뉴클레오티드 및 본원에 개시된 제2 항원 결합 영역의 VL을 암호화하는 제4 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 단계;
(c) 다중특이적 분자가 생산되도록 하는 조건 하에, 단계 (a) 및 (b)에서 생산된 제1 및 제2 항원 결합 영역을 접촉시키는 단계.
또 다른 양태에서, 본 개시는 다중특이적 분자를 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다중특이적 분자가 생산되도록 하는 조건 하에 본원에 개시된 제1 항원 결합 영역 및 제2 항원 결합 영역을 접촉시키는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 단리된 항체를 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 폴리뉴클레오티드가 발현되고 항체가 생산되도록 적절한 조건 하에 세포에서 다음을 발현시키는 단계를 포함한다:
(a) 본원에 개시된 항체의 VH 및 VL을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 또는
(b) 본원에 개시된 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
또 다른 양태에서, 본 개시는 단리된 항체를 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 폴리뉴클레오티드가 발현되고 항체가 생산되도록 적절한 조건 하에 세포에서 다음을 발현시키는 단계를 포함한다:
(a) 본원에 개시된 항체의 VH를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드; 및 본원에 개시된 항체의 VL을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드; 또는
(b) 본원에 개시된 항체의 중쇄를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드; 및 본원에 개시된 항체의 경쇄를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드.
또 다른 양태에서, 본 개시는 대상체에서 면역 반응을 향상시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 개시된 다중특이적 분자, 본원에 개시된 단리된 항체, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드, 본원에 개시된 벡터, 본원에 개시된 숙주 세포, 또는 본원에 개시된 약학적 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 개시된 이중특이적 분자, 본원에 개시된 단리된 항체, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드, 본원에 개시된 벡터, 본원에 개시된 숙주 세포, 또는 본원에 개시된 약학적 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
소정의 구현예에서, 다중특이적 분자, 단리된 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포, 또는 약학적 조성물은 전신, 정맥내, 피하, 종양내 투여되거나, 종양 배액 림프절에 전달된다.
소정의 구현예에서, 상기 방법은 추가의 치료제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 추가 치료제는 화학요법제이다. 특정 구현예에서, 추가 치료제는 관문 표적화제이다. 또 다른 구현예에서, 관문 표적화제는 길항제 항-PD-1 항체, 길항제 항-PD-L1 항체, 길항제 항-PD-L2 항체, 길항제 항-CTLA-4 항체, 길항제 항-TIM-3 항체, 길항제 항-LAG-3 항체, 길항제 항-VISTA 항체, 길항제 항-TIGIT 항체, 길항제 항-CEACAM1 항체, 길항제 항-CD96 항체, 작용제 항-GITR 항체, 및 작용제 항-OX40 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 추가 치료제는 항-PD-1 항체이고, 임의로 항-PD-1 항체는 펨브롤리주맙(pembrolizumab) 또는 니볼루맙(nivolumab)이다. 특정 구현예에서, 추가 치료제는 인돌아민-2,3-디옥시게나아제(IDO)의 억제제이다. 또 다른 구현예에서, 억제제는 에파카도스타트(epacadostat), F001287, 인독시모드(indoximod), 및 NLG919로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 추가 치료제는 백신이다. 또 다른 구현예에서, 백신은 항원 펩티드와 복합체화된 열충격 단백질을 포함하는 열충격 단백질 펩티드 복합체(HSPPC)를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 열충격 단백질은 hsc70이고, 종양 연관 항원 펩티드와 복합체화된다. 또 다른 구현예에서, 열충격 단백질은 gp96이고, 종양 연관 항원 펩티드와 복합체화되며, 임의로 여기서 HSPPC는 대상체로부터 수득한 종양에서 유래된다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 대상체에서 감염성 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 개시된 이중특이적 분자, 본원에 개시된 단리된 항체, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드, 본원에 개시된 벡터, 본원에 개시된 숙주 세포, 또는 본원에 개시된 약학적 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
도 1a~도 1c는 인간 TIGIT 및 인간 CD96의 세포외 도메인이 다중특이적 분자 BA123(도 1a), BA125(도 1b), 및 BA127(도 1c)에 동시에 결합하는 것을 보여주는 일련의 센서그램이다.
도 2a~도 2b는 대조군 다중특이적 분자 BA128, BA131, 및 BA133과 비교했을 때 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA127이, 인간 TIGIT 또는 인간 CD96을 발현하도록 조작된 CHO 세포에 동시에 결합하는 것을 보여주는 그래프이다. 세포-발현된 인간 TIGIT 및 가용성 His-태그된 인간 CD96(도 2a) 또는 세포-발현된 인간 CD96 및 가용성 His-태그된 인간 TIGIT(도 2b)의 이중 결합은 형광색소-접합된 (Alex Fluor 488) 항-His 항체를 사용하여 유세포 분석법으로 검출하였다.
도 3a~도 3i는 이소형 대조군 다중특이적 분자(BA128)와 비교했을 때 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA123(도 3a), BA125(도 3b), 또는 BA127(도 3c), 또는 대조군 다중특이적 분자 BA129(도 3d), BA130(도 3e), BA131(도 3f), BA133(도 3g), BA134(도 3h), 또는 BA136(도 3i)이, 인간 CD96의 세포 표면 이소형 2를 높은 수준으로 발현하도록 조작된 CHO 세포에 결합하는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. BA128의 CHO 세포 결합과 비교하여, 각각의 경우에 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때의 결합 수준을, 세포와 함께 인큐베이션한 각 항체의 농도에 대해 도표화하였다.
도 4a~도 4i는 이소형 대조군 다중특이적 분자(BA128)와 비교했을 때 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA123(도 4a), BA127(도 4b), 또는 BA125(도 4c), 또는 대조군 다중특이적 분자 BA129(도 4d), BA130(도 4e), BA131(도 4f), BA133(도 4g), BA134(도 4h), 또는 BA136(도 4i)이, 인간 CD96의 세포 표면 이소형 1을 높은 수준으로 발현하도록 조작된 CHO 세포에 결합하는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. BA128의 CHO 세포 결합과 비교하여, 각각의 경우에 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때의 결합 수준을, 세포와 함께 인큐베이션한 각 항체의 농도에 대해 도표화하였다.
도 5a~도 5i는 이소형 대조군 다중특이적 분자(BA128)와 비교했을 때 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA123(도 5a), BA125(도 5b), 또는 BA127(도 5c), 또는 대조군 다중특이적 분자 BA129(도 5d), BA130(도 5e), BA131(도 5f), BA133(도 5g), BA134(도 5h), 또는 BA136(도 5i)이, 시노몰구스 원숭이 CD96의 세포 표면 이소형 2를 높은 수준으로 발현하도록 조작된 CHO 세포에 결합하는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. BA128의 CHO 세포 결합과 비교하여, 각각의 경우에 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때의 결합 수준이, 세포와 함께 인큐베이션한 각 항체의 농도에 대해 도표화되어 있다.
도 6a~도 6i는 인간 CD96의 세포 표면 이소형 2를 높은 수준으로 발현하도록 조작된 CHO 세포에 대한 인간 CD155-Fc 결합을 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA123(도 6a), BA125(도 6b), 또는 BA127(도 6c), 또는 대조군 다중특이적 분자 BA129(도 6d), BA130(도 6e), BA131(도 6f), BA133(도 6g), BA134(도 6h), 또는 BA136(도 6i)이 차단하는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. 이소형 대조군 다중특이적 분자(BA128)에 의한 차단과 비교하여, 각각의 경우에 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때의 CD155-Fc의 결합 수준을, 세포와 함께 인큐베이션한 각 항체의 농도에 대한 최대 반응 백분율로서 도표화하였다.
도 7a~도 7i는 시노몰구스 원숭이 CD96의 세포 표면 이소형 2를 높은 수준으로 발현하도록 조작된 CHO 세포에 대한 인간 CD155-Fc 결합을 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA123(도 7a), BA125(도 7b), 또는 BA127(도 7c), 또는 대조군 다중특이적 분자 BA129(도 7d), BA130(도 7e), BA131(도 7f), BA133(도 7g), BA134(도 7h), 또는 BA136(도 7i)이 차단하는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. 이소형 대조군 다중특이적 분자(BA128)에 의한 차단과 비교하여, 각각의 경우에 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때의 CD155-Fc의 결합 수준을, 세포와 함께 인큐베이션한 각 다중특이적 분자의 농도에 대한 최대 반응 백분율로서 도표화하였다.
도 8a~도 8i는 세포 표면 인간 TIGIT를 높은 수준으로 발현하도록 조작된 CHO 세포에 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA123(도 8a), BA125(도 8b), 또는 BA127(도 8c), 또는 대조군 다중특이적 분자 BA129(도 8d), BA130(도 8e), BA131(도 8f), BA133(도 8g), BA134(도 8h), 또는 BA136(도 8i)이 결합하는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. 이소형 대조군 다중특이적 분자(BA128)의 CHO 세포 결합과 비교하여, 각각의 경우에 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때의 결합 수준을, 세포와 함께 인큐베이션한 각 항체의 농도에 대해 도표화하였다.
도 9a~도 9i는 세포 표면 시노몰구스 원숭이 TIGIT를 높은 수준으로 발현하도록 조작된 CHO 세포에 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA123(도 9a), BA125(도 9b), 또는 BA127(도 9c), 또는 대조군 다중특이적 분자 BA129(도 9d), BA130(도 9e), BA131(도 9f), BA133(도 9g), BA134(도 9h), 또는 BA136(도 9i)이 결합하는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. 이소형 대조군 다중특이적 분자(BA128)의 결합과 비교하여, 각각의 경우에 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때의 결합 수준을, 세포와 함께 인큐베이션한 각 항체의 농도에 대해 도표화하였다.
도 10a~도 10i는 세포 표면 인간 TIGIT를 높은 수준으로 발현하도록 조작된 CHO 세포에 대한 인간 CD155-Fc 결합을 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA123(도 10a), BA125(도 10b), 또는 BA127(도 10c), 또는 대조군 다중특이적 분자 BA129(도 10d), BA134(도 10e), BA131(도 10f), BA133(도 10g), BA130(도 10h), 또는 BA136(도 10i)이 차단하는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. 이소형 대조군 다중특이적 분자(BA128)에 의한 차단과 비교하여, 각각의 경우에 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때의 CD155-Fc의 결합 수준을, 세포와 함께 인큐베이션한 각 항체의 농도에 대한 최대 반응 백분율로서 도표화하였다.
도 11a~도 11i는 세포 표면 시노몰구스 원숭이 TIGIT를 높은 수준으로 발현하도록 조작된 CHO 세포에 대한 인간 CD155-Fc 결합을 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA123(도 11a), BA125(도 11b), 또는 BA127(도 11c), 또는 대조군 다중특이적 분자 BA129(도 11d), BA130(도 11e), BA131(도 11f), BA133(도 11g), BA134(도 11h), 또는 BA136(도 11i)이 차단하는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. 이소형 대조군 다중특이적 분자(BA128)에 의한 차단과 비교하여, 각각의 경우에 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때의 CD155-Fc의 결합 수준을, 세포와 함께 인큐베이션한 각 항체의 농도에 대한 최대 반응 백분율로서 도표화하였다.
도 12a~도 12i는 세포 표면 인간 TIGIT 및 인간 CD96의 이소형 2를 높은 수준으로 공동 발현하도록 조작된 CHO 세포에 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA123(도 12a), BA125(도 12b), 또는 BA127(도 12c), 또는 대조군 다중특이적 분자 BA129(도 12d), BA130(도 12e), BA131(도 12f), BA133(도 12g), BA134(도 12h), 또는 BA136(도 12i)이 결합하는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. 이소형 대조군 다중특이적 분자(BA128)의 결합과 비교하여, 각각의 경우에 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때의 결합 수준을, 세포와 함께 인큐베이션한 각 항체의 농도에 대해 도표화하였다.
도 13a~도 13i는 세포 표면 인간 TIGIT 및 인간 CD96의 이소형 2를 높은 수준으로 공동 발현하도록 조작된 CHO 세포에 대한 인간 CD155-Fc 결합을 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA123(도 13a), BA125(도 13b), 또는 BA127(도 13c), 또는 대조군 다중특이적 분자 BA129(도 13d), BA130(도 13e), BA131(도 13f), BA133(도 13g), BA134(도 13h), 또는 BA136(도 13i)이 차단하는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. 이소형 대조군 다중특이적 분자(BA128)에 의한 차단과 비교하여, 각각의 경우에 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때의 CD155-Fc의 결합 수준을, 세포와 함께 인큐베이션한 각 항체의 농도에 대한 최대 반응 백분율로서 도표화하였다.
도 14a~도 14f는 인간 FcγRIIIa의 세포 표면 변이체 V/V를 높은 수준으로 발현하도록 조작된 CHO 세포에 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA123(도 14a), BA125(도 14b), 또는 BA127(도 14c), 또는 대조군 다중특이적 분자 BA129(도 14d), BA130(도 14e), 및 BA131(도 14f)이 결합하는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때의 결합 수준을, 세포와 함께 인큐베이션한 각 항체의 농도에 대해 도표화하였다.
도 15a~도 15f는 인간 FcγRIIIa의 세포 표면 변이체 F/F를 높은 수준으로 발현하도록 조작된 CHO 세포에 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA123(도 15a), BA125(도 15b), 또는 BA127(도 15c), 또는 대조군 다중특이적 분자 BA129(도 15d), BA130(도 15e), 및 BA131(도 15f)이 결합하는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때의 결합 수준을, 세포와 함께 인큐베이션한 각 항체의 농도에 대해 도표화하였다.
도 16a~도 16c는 이소형 대조군 항체(BA146)와 비교하여 항-CD96 항체 BA143(도 16a), BA144(도 16b), BA145(도 16c)가, 인간 CD96의 세포 표면 이소형 2를 높은 수준으로 발현하도록 조작된 CHO 세포에 결합하는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. BA146의 CHO 세포 결합과 비교하여, 각각의 경우에 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때의 결합 수준을, 세포와 함께 인큐베이션한 각 항체의 농도에 대해 도표화하였다.
도 17a~도 17c는 이소형 대조군 항체(BA146)와 비교하여 항-CD96 항체 BA143(도 17a), BA144(도 17b), BA145(도 17c)가, 시노몰구스 원숭이 CD96의 세포 표면 이소형 2를 높은 수준으로 발현하도록 조작된 CHO 세포에 결합하는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. BA146의 CHO 세포 결합과 비교하여, 각각의 경우에 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때의 결합 수준을, 세포와 함께 인큐베이션한 각 항체의 농도에 대해 도표화하였다.
도 18a~도 18c는 인간 CD96의 세포 표면 이소형 2를 높은 수준으로 발현하도록 조작된 CHO 세포에 대한 CD155-Fc 결합을 항-CD96 항체 BA143(도 18a), BA144(도 18b), 또는 BA145(도 18c)가 차단하는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. 이소형 대조군 항체(BA146)에 의한 차단과 비교하여, 각각의 경우에 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때의 CD155-Fc의 결합 수준을, 세포와 함께 인큐베이션한 각 항체의 농도에 대한 최대 반응 백분율로서 도표화하였다.
도 19a~도 19c는 시노몰구스 원숭이 CD96의 세포 표면 이소형 2를 높은 수준으로 발현하도록 조작된 CHO 세포에 대한 CD155-Fc 결합을 항-CD96 항체 BA143(도 19a), BA144(도 19b), 또는 BA145(도 19c)가 차단하는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. 이소형 대조군 항체(BA146)에 의한 차단과 비교하여, 각각의 경우에 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때의 CD155-Fc의 결합 수준을, 세포와 함께 인큐베이션한 각 항체의 농도에 대한 최대 반응 백분율로서 도표화하였다.
도 20은 이소형 대조군 항체(BA149)와 비교하여 항-TIGIT IgG1 항체 BA148이, 세포 표면 인간 TIGIT를 높은 수준으로 발현하도록 조작된 CHO 세포에 결합하는 것을 보여주는 그래프이다. BA149의 CHO 세포 결합과 비교하여, 각각의 경우에 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때의 결합 수준을, 세포와 함께 인큐베이션한 각 항체의 농도에 대해 도표화하였다.
도 21은 이소형 대조군 항체(BA149)와 비교하여 항-TIGIT 항체 BA148이, 세포 표면 시노몰구스 원숭이 TIGIT를 높은 수준으로 발현하도록 조작된 CHO 세포에 결합하는 것을 보여주는 그래프이다. BA149의 CHO 세포 결합과 비교하여, 각각의 경우에 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때의 결합 수준을, 세포와 함께 인큐베이션한 각 항체의 농도에 대해 도표화하였다.
도 22는 높은 수준으로 인간 TIGIT를 발현하도록 조작된 CHO 세포에 대한 인간 CD155-Fc 결합을 항-TIGIT 항체 BA148이 차단하는 것을 보여주는 그래프이다. 이소형 대조군 항체(BA149)에 의한 차단과 비교하여, 중앙값 형광 강도(MFI)로 평가했을 때의 CD155-Fc의 결합 수준을, 세포와 함께 인큐베이션한 각 항체의 농도에 대한 최대 반응 백분율로서 도표화하였다.
도 23은 높은 수준으로 시노몰구스 원숭이 TIGIT를 발현하도록 조작된 CHO 세포에 대한 인간 CD155-Fc 결합을 항-TIGIT 항체 BA148이 차단하는 것을 보여주는 그래프이다. 이소형 대조군 항체(BA149)에 의한 차단과 비교하여, 중앙값 형광 강도(MFI)로 평가했을 때의 CD155-Fc의 결합 수준을, 세포와 함께 인큐베이션한 각 항체의 농도에 대한 최대 반응 백분율로서 도표화하였다.
도 24a~도 24d는 인간 FcγRIIIa의 변이체 V/V를 높은 수준으로 발현하도록 조작된 CHO 세포에 항-TIGIT 항체 BA148, 및 항-CD96 항체 BA143, BA144, 및 BA145가 결합하는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때의 BA143(도 24a), BA144(도 24b), BA145(도 24c), 및 BA148(도 24d)의 결합 수준을, 세포와 함께 인큐베이션한 각 항체의 농도에 대해 도표화하였다.
도 25a~도 25d는 인간 FcγRIIIa의 변이체 F/F를 높은 수준으로 발현하도록 조작된 CHO 세포에 항-TIGIT IgG1 항체 BA148, 및 항-CD96 IgG1 WT 항체 BA143, BA144, 및 BA145가 결합하는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때의 BA143(도 25a), BA144(도 25b), BA145(도 25c), 및 BA148(도 25d)의 결합 수준을, 세포와 함께 인큐베이션한 각 항체의 농도에 대해 도표화하였다.
도 26a~도 26f는 3개의 상이한 공여자에서 활성화된 인간 T 세포에 결합하는 BA127, BA143, BA148, 또는 BA128의 능력을 보여주는 일련의 그래프이다. 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때, CD4+ T 세포(도 26a, 도 26b, 및 도 26c) 및 CD8+ T 세포(도 26d, 도 26e, 및 도 26f)에 대한 결합을, 세포와 함께 인큐베이션된 각 항체의 농도에 대해 도표화하였다.
도 27a~도 27f는 3개의 상이한 공여자에서 활성화된 인간 T 세포에 결합하는 BA127 또는 BA128의 능력을 보여주는 일련의 그래프이다. 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때, CD4+ T 세포(도 27a, 도 27b, 및 도 27c) 및 CD8+ T 세포(도 27d, 도 27e, 및 도 27f)에 대한 결합을, 세포와 함께 인큐베이션된 각 항체의 농도에 대해 도표화하였다.
도 28a~도 28c는 다중특이적 분자의 다양한 농도에 걸쳐 단일 공여자 유래의 SEA-자극된 PBMC에 의한 IL-2 분비를 촉진하는 BA123, BA125, BA127, BA128, BA129, BA130, 및 BA131 다중특이적 분자의 능력을 보여주는 일련의 그래프이다. 각각의 패널은 동일한 공여자를 사용하는 독립적인 실험을 나타낸다.
도 29는 다중특이적 분자의 다양한 농도에 걸쳐 단일 공여자 유래의 SEA-자극된 PBMC에 의한 IL-2 분비를 촉진하는 BA127 및 BA128 다중특이적 분자 및 BA143 및 BA148 항체의 능력을 보여주는 그래프이다.
도 30a~도 30f는 다양한 항체 농도에 걸쳐 6명의 상이한 공여자 유래의 SEA-자극된 PBMC에 의한 IL-2 분비를 촉진하는 BA127 및 BA128의 능력을 보여주는 일련의 그래프이다.
도 31a~도 31b는 Jurkat 세포에서 발현된 TIGIT가 CHO 세포에서 발현된 CD155에 결합하는 것을 차단하는 BA125, BA127, BA128, 및 BA133(도 31a) 및 BA127, BA143, BA146, 항-TIGIT 단일특이적 기준 항체 1, 및 항-TIGIT 단일특이적 기준 항체 2(도 31b)의 능력을 보여주는 그래프이다. 도 31c는 Jurkat 세포에서 발현된 TIGIT가 CHO 세포에서 발현된 CD155에 결합하는 것을 차단하는 BA127, BA131, BA128, 및 항-TIGIT 기준 항체 3의 능력을 보여주는 그래프이다. 차단은 다양한 항체 농도에 걸쳐 NFAT-루시페라아제 신호의 배수 변화로서 표현된다.
도 32a~도 32b는 2명의 공여자 유래의 준최적 농도의 SEA 초항원으로 자극시킨 일차 건강한 공여자 인간 PBMC에서, 다양한 농도의 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA127, 기준 항-TIGIT 항체, 및 이소형 대조군 항체가 IL-2 사이토카인 분비를 유도하는 능력을 보여주는 그래프이다.
도 33a~도 33e는 이중특이적 이소형 대조군(도 33a), 항-TIGIT 마우스 대리 단일특이적 항체(도 33b), 항-CD96 마우스 대리 단일특이적 항체(도 33c), 항-TIGIT 및 항-CD96 마우스 대리 단일특이적 항체 둘 다(도 33d), 또는 항-TIGITxCD96 마우스 대리 다중특이적 분자(도 33e)를 마우스에게 투여한 마우스 결장 암종 모델에서 시간 경과에 따른 종양 부피를 보여주는 일련의 그래프이다.
도 34a는 항-TIGIT + 항-CD96 마우스 대리 단일특이적 항체, 항-TIGITxCD96 마우스 대리 다중특이적 분자, Fc 침묵 항-TIGITxCD96 마우스 대리 다중특이적 분자, 또는 이소형 대조군을 마우스에게 투여한 마우스 결장 암종 모델에서 시간 경과에 따른 평균 종양 부피를 보여주는 그래프이다. 도 34b~도 34e는 항-TIGIT + 항-CD96 마우스 대리 단일특이적 항체(도 34c), 항-TIGITxCD96 마우스 대리 다중특이적 분자(도 34d), Fc-침묵 항-TIGITxCD96 마우스 대리 다중특이적 분자(도 34e), 또는 이소형 대조군(도 34b)을 투여한 각각의 개별 마우스에 대한 시간 경과에 따른 개별 종양 부피를 보여주는 일련의 그래프이다.
도 2a~도 2b는 대조군 다중특이적 분자 BA128, BA131, 및 BA133과 비교했을 때 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA127이, 인간 TIGIT 또는 인간 CD96을 발현하도록 조작된 CHO 세포에 동시에 결합하는 것을 보여주는 그래프이다. 세포-발현된 인간 TIGIT 및 가용성 His-태그된 인간 CD96(도 2a) 또는 세포-발현된 인간 CD96 및 가용성 His-태그된 인간 TIGIT(도 2b)의 이중 결합은 형광색소-접합된 (Alex Fluor 488) 항-His 항체를 사용하여 유세포 분석법으로 검출하였다.
도 3a~도 3i는 이소형 대조군 다중특이적 분자(BA128)와 비교했을 때 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA123(도 3a), BA125(도 3b), 또는 BA127(도 3c), 또는 대조군 다중특이적 분자 BA129(도 3d), BA130(도 3e), BA131(도 3f), BA133(도 3g), BA134(도 3h), 또는 BA136(도 3i)이, 인간 CD96의 세포 표면 이소형 2를 높은 수준으로 발현하도록 조작된 CHO 세포에 결합하는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. BA128의 CHO 세포 결합과 비교하여, 각각의 경우에 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때의 결합 수준을, 세포와 함께 인큐베이션한 각 항체의 농도에 대해 도표화하였다.
도 4a~도 4i는 이소형 대조군 다중특이적 분자(BA128)와 비교했을 때 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA123(도 4a), BA127(도 4b), 또는 BA125(도 4c), 또는 대조군 다중특이적 분자 BA129(도 4d), BA130(도 4e), BA131(도 4f), BA133(도 4g), BA134(도 4h), 또는 BA136(도 4i)이, 인간 CD96의 세포 표면 이소형 1을 높은 수준으로 발현하도록 조작된 CHO 세포에 결합하는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. BA128의 CHO 세포 결합과 비교하여, 각각의 경우에 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때의 결합 수준을, 세포와 함께 인큐베이션한 각 항체의 농도에 대해 도표화하였다.
도 5a~도 5i는 이소형 대조군 다중특이적 분자(BA128)와 비교했을 때 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA123(도 5a), BA125(도 5b), 또는 BA127(도 5c), 또는 대조군 다중특이적 분자 BA129(도 5d), BA130(도 5e), BA131(도 5f), BA133(도 5g), BA134(도 5h), 또는 BA136(도 5i)이, 시노몰구스 원숭이 CD96의 세포 표면 이소형 2를 높은 수준으로 발현하도록 조작된 CHO 세포에 결합하는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. BA128의 CHO 세포 결합과 비교하여, 각각의 경우에 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때의 결합 수준이, 세포와 함께 인큐베이션한 각 항체의 농도에 대해 도표화되어 있다.
도 6a~도 6i는 인간 CD96의 세포 표면 이소형 2를 높은 수준으로 발현하도록 조작된 CHO 세포에 대한 인간 CD155-Fc 결합을 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA123(도 6a), BA125(도 6b), 또는 BA127(도 6c), 또는 대조군 다중특이적 분자 BA129(도 6d), BA130(도 6e), BA131(도 6f), BA133(도 6g), BA134(도 6h), 또는 BA136(도 6i)이 차단하는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. 이소형 대조군 다중특이적 분자(BA128)에 의한 차단과 비교하여, 각각의 경우에 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때의 CD155-Fc의 결합 수준을, 세포와 함께 인큐베이션한 각 항체의 농도에 대한 최대 반응 백분율로서 도표화하였다.
도 7a~도 7i는 시노몰구스 원숭이 CD96의 세포 표면 이소형 2를 높은 수준으로 발현하도록 조작된 CHO 세포에 대한 인간 CD155-Fc 결합을 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA123(도 7a), BA125(도 7b), 또는 BA127(도 7c), 또는 대조군 다중특이적 분자 BA129(도 7d), BA130(도 7e), BA131(도 7f), BA133(도 7g), BA134(도 7h), 또는 BA136(도 7i)이 차단하는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. 이소형 대조군 다중특이적 분자(BA128)에 의한 차단과 비교하여, 각각의 경우에 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때의 CD155-Fc의 결합 수준을, 세포와 함께 인큐베이션한 각 다중특이적 분자의 농도에 대한 최대 반응 백분율로서 도표화하였다.
도 8a~도 8i는 세포 표면 인간 TIGIT를 높은 수준으로 발현하도록 조작된 CHO 세포에 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA123(도 8a), BA125(도 8b), 또는 BA127(도 8c), 또는 대조군 다중특이적 분자 BA129(도 8d), BA130(도 8e), BA131(도 8f), BA133(도 8g), BA134(도 8h), 또는 BA136(도 8i)이 결합하는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. 이소형 대조군 다중특이적 분자(BA128)의 CHO 세포 결합과 비교하여, 각각의 경우에 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때의 결합 수준을, 세포와 함께 인큐베이션한 각 항체의 농도에 대해 도표화하였다.
도 9a~도 9i는 세포 표면 시노몰구스 원숭이 TIGIT를 높은 수준으로 발현하도록 조작된 CHO 세포에 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA123(도 9a), BA125(도 9b), 또는 BA127(도 9c), 또는 대조군 다중특이적 분자 BA129(도 9d), BA130(도 9e), BA131(도 9f), BA133(도 9g), BA134(도 9h), 또는 BA136(도 9i)이 결합하는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. 이소형 대조군 다중특이적 분자(BA128)의 결합과 비교하여, 각각의 경우에 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때의 결합 수준을, 세포와 함께 인큐베이션한 각 항체의 농도에 대해 도표화하였다.
도 10a~도 10i는 세포 표면 인간 TIGIT를 높은 수준으로 발현하도록 조작된 CHO 세포에 대한 인간 CD155-Fc 결합을 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA123(도 10a), BA125(도 10b), 또는 BA127(도 10c), 또는 대조군 다중특이적 분자 BA129(도 10d), BA134(도 10e), BA131(도 10f), BA133(도 10g), BA130(도 10h), 또는 BA136(도 10i)이 차단하는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. 이소형 대조군 다중특이적 분자(BA128)에 의한 차단과 비교하여, 각각의 경우에 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때의 CD155-Fc의 결합 수준을, 세포와 함께 인큐베이션한 각 항체의 농도에 대한 최대 반응 백분율로서 도표화하였다.
도 11a~도 11i는 세포 표면 시노몰구스 원숭이 TIGIT를 높은 수준으로 발현하도록 조작된 CHO 세포에 대한 인간 CD155-Fc 결합을 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA123(도 11a), BA125(도 11b), 또는 BA127(도 11c), 또는 대조군 다중특이적 분자 BA129(도 11d), BA130(도 11e), BA131(도 11f), BA133(도 11g), BA134(도 11h), 또는 BA136(도 11i)이 차단하는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. 이소형 대조군 다중특이적 분자(BA128)에 의한 차단과 비교하여, 각각의 경우에 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때의 CD155-Fc의 결합 수준을, 세포와 함께 인큐베이션한 각 항체의 농도에 대한 최대 반응 백분율로서 도표화하였다.
도 12a~도 12i는 세포 표면 인간 TIGIT 및 인간 CD96의 이소형 2를 높은 수준으로 공동 발현하도록 조작된 CHO 세포에 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA123(도 12a), BA125(도 12b), 또는 BA127(도 12c), 또는 대조군 다중특이적 분자 BA129(도 12d), BA130(도 12e), BA131(도 12f), BA133(도 12g), BA134(도 12h), 또는 BA136(도 12i)이 결합하는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. 이소형 대조군 다중특이적 분자(BA128)의 결합과 비교하여, 각각의 경우에 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때의 결합 수준을, 세포와 함께 인큐베이션한 각 항체의 농도에 대해 도표화하였다.
도 13a~도 13i는 세포 표면 인간 TIGIT 및 인간 CD96의 이소형 2를 높은 수준으로 공동 발현하도록 조작된 CHO 세포에 대한 인간 CD155-Fc 결합을 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA123(도 13a), BA125(도 13b), 또는 BA127(도 13c), 또는 대조군 다중특이적 분자 BA129(도 13d), BA130(도 13e), BA131(도 13f), BA133(도 13g), BA134(도 13h), 또는 BA136(도 13i)이 차단하는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. 이소형 대조군 다중특이적 분자(BA128)에 의한 차단과 비교하여, 각각의 경우에 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때의 CD155-Fc의 결합 수준을, 세포와 함께 인큐베이션한 각 항체의 농도에 대한 최대 반응 백분율로서 도표화하였다.
도 14a~도 14f는 인간 FcγRIIIa의 세포 표면 변이체 V/V를 높은 수준으로 발현하도록 조작된 CHO 세포에 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA123(도 14a), BA125(도 14b), 또는 BA127(도 14c), 또는 대조군 다중특이적 분자 BA129(도 14d), BA130(도 14e), 및 BA131(도 14f)이 결합하는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때의 결합 수준을, 세포와 함께 인큐베이션한 각 항체의 농도에 대해 도표화하였다.
도 15a~도 15f는 인간 FcγRIIIa의 세포 표면 변이체 F/F를 높은 수준으로 발현하도록 조작된 CHO 세포에 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA123(도 15a), BA125(도 15b), 또는 BA127(도 15c), 또는 대조군 다중특이적 분자 BA129(도 15d), BA130(도 15e), 및 BA131(도 15f)이 결합하는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때의 결합 수준을, 세포와 함께 인큐베이션한 각 항체의 농도에 대해 도표화하였다.
도 16a~도 16c는 이소형 대조군 항체(BA146)와 비교하여 항-CD96 항체 BA143(도 16a), BA144(도 16b), BA145(도 16c)가, 인간 CD96의 세포 표면 이소형 2를 높은 수준으로 발현하도록 조작된 CHO 세포에 결합하는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. BA146의 CHO 세포 결합과 비교하여, 각각의 경우에 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때의 결합 수준을, 세포와 함께 인큐베이션한 각 항체의 농도에 대해 도표화하였다.
도 17a~도 17c는 이소형 대조군 항체(BA146)와 비교하여 항-CD96 항체 BA143(도 17a), BA144(도 17b), BA145(도 17c)가, 시노몰구스 원숭이 CD96의 세포 표면 이소형 2를 높은 수준으로 발현하도록 조작된 CHO 세포에 결합하는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. BA146의 CHO 세포 결합과 비교하여, 각각의 경우에 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때의 결합 수준을, 세포와 함께 인큐베이션한 각 항체의 농도에 대해 도표화하였다.
도 18a~도 18c는 인간 CD96의 세포 표면 이소형 2를 높은 수준으로 발현하도록 조작된 CHO 세포에 대한 CD155-Fc 결합을 항-CD96 항체 BA143(도 18a), BA144(도 18b), 또는 BA145(도 18c)가 차단하는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. 이소형 대조군 항체(BA146)에 의한 차단과 비교하여, 각각의 경우에 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때의 CD155-Fc의 결합 수준을, 세포와 함께 인큐베이션한 각 항체의 농도에 대한 최대 반응 백분율로서 도표화하였다.
도 19a~도 19c는 시노몰구스 원숭이 CD96의 세포 표면 이소형 2를 높은 수준으로 발현하도록 조작된 CHO 세포에 대한 CD155-Fc 결합을 항-CD96 항체 BA143(도 19a), BA144(도 19b), 또는 BA145(도 19c)가 차단하는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. 이소형 대조군 항체(BA146)에 의한 차단과 비교하여, 각각의 경우에 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때의 CD155-Fc의 결합 수준을, 세포와 함께 인큐베이션한 각 항체의 농도에 대한 최대 반응 백분율로서 도표화하였다.
도 20은 이소형 대조군 항체(BA149)와 비교하여 항-TIGIT IgG1 항체 BA148이, 세포 표면 인간 TIGIT를 높은 수준으로 발현하도록 조작된 CHO 세포에 결합하는 것을 보여주는 그래프이다. BA149의 CHO 세포 결합과 비교하여, 각각의 경우에 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때의 결합 수준을, 세포와 함께 인큐베이션한 각 항체의 농도에 대해 도표화하였다.
도 21은 이소형 대조군 항체(BA149)와 비교하여 항-TIGIT 항체 BA148이, 세포 표면 시노몰구스 원숭이 TIGIT를 높은 수준으로 발현하도록 조작된 CHO 세포에 결합하는 것을 보여주는 그래프이다. BA149의 CHO 세포 결합과 비교하여, 각각의 경우에 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때의 결합 수준을, 세포와 함께 인큐베이션한 각 항체의 농도에 대해 도표화하였다.
도 22는 높은 수준으로 인간 TIGIT를 발현하도록 조작된 CHO 세포에 대한 인간 CD155-Fc 결합을 항-TIGIT 항체 BA148이 차단하는 것을 보여주는 그래프이다. 이소형 대조군 항체(BA149)에 의한 차단과 비교하여, 중앙값 형광 강도(MFI)로 평가했을 때의 CD155-Fc의 결합 수준을, 세포와 함께 인큐베이션한 각 항체의 농도에 대한 최대 반응 백분율로서 도표화하였다.
도 23은 높은 수준으로 시노몰구스 원숭이 TIGIT를 발현하도록 조작된 CHO 세포에 대한 인간 CD155-Fc 결합을 항-TIGIT 항체 BA148이 차단하는 것을 보여주는 그래프이다. 이소형 대조군 항체(BA149)에 의한 차단과 비교하여, 중앙값 형광 강도(MFI)로 평가했을 때의 CD155-Fc의 결합 수준을, 세포와 함께 인큐베이션한 각 항체의 농도에 대한 최대 반응 백분율로서 도표화하였다.
도 24a~도 24d는 인간 FcγRIIIa의 변이체 V/V를 높은 수준으로 발현하도록 조작된 CHO 세포에 항-TIGIT 항체 BA148, 및 항-CD96 항체 BA143, BA144, 및 BA145가 결합하는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때의 BA143(도 24a), BA144(도 24b), BA145(도 24c), 및 BA148(도 24d)의 결합 수준을, 세포와 함께 인큐베이션한 각 항체의 농도에 대해 도표화하였다.
도 25a~도 25d는 인간 FcγRIIIa의 변이체 F/F를 높은 수준으로 발현하도록 조작된 CHO 세포에 항-TIGIT IgG1 항체 BA148, 및 항-CD96 IgG1 WT 항체 BA143, BA144, 및 BA145가 결합하는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때의 BA143(도 25a), BA144(도 25b), BA145(도 25c), 및 BA148(도 25d)의 결합 수준을, 세포와 함께 인큐베이션한 각 항체의 농도에 대해 도표화하였다.
도 26a~도 26f는 3개의 상이한 공여자에서 활성화된 인간 T 세포에 결합하는 BA127, BA143, BA148, 또는 BA128의 능력을 보여주는 일련의 그래프이다. 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때, CD4+ T 세포(도 26a, 도 26b, 및 도 26c) 및 CD8+ T 세포(도 26d, 도 26e, 및 도 26f)에 대한 결합을, 세포와 함께 인큐베이션된 각 항체의 농도에 대해 도표화하였다.
도 27a~도 27f는 3개의 상이한 공여자에서 활성화된 인간 T 세포에 결합하는 BA127 또는 BA128의 능력을 보여주는 일련의 그래프이다. 중앙값 형광 강도(MFI)에 의해 평가했을 때, CD4+ T 세포(도 27a, 도 27b, 및 도 27c) 및 CD8+ T 세포(도 27d, 도 27e, 및 도 27f)에 대한 결합을, 세포와 함께 인큐베이션된 각 항체의 농도에 대해 도표화하였다.
도 28a~도 28c는 다중특이적 분자의 다양한 농도에 걸쳐 단일 공여자 유래의 SEA-자극된 PBMC에 의한 IL-2 분비를 촉진하는 BA123, BA125, BA127, BA128, BA129, BA130, 및 BA131 다중특이적 분자의 능력을 보여주는 일련의 그래프이다. 각각의 패널은 동일한 공여자를 사용하는 독립적인 실험을 나타낸다.
도 29는 다중특이적 분자의 다양한 농도에 걸쳐 단일 공여자 유래의 SEA-자극된 PBMC에 의한 IL-2 분비를 촉진하는 BA127 및 BA128 다중특이적 분자 및 BA143 및 BA148 항체의 능력을 보여주는 그래프이다.
도 30a~도 30f는 다양한 항체 농도에 걸쳐 6명의 상이한 공여자 유래의 SEA-자극된 PBMC에 의한 IL-2 분비를 촉진하는 BA127 및 BA128의 능력을 보여주는 일련의 그래프이다.
도 31a~도 31b는 Jurkat 세포에서 발현된 TIGIT가 CHO 세포에서 발현된 CD155에 결합하는 것을 차단하는 BA125, BA127, BA128, 및 BA133(도 31a) 및 BA127, BA143, BA146, 항-TIGIT 단일특이적 기준 항체 1, 및 항-TIGIT 단일특이적 기준 항체 2(도 31b)의 능력을 보여주는 그래프이다. 도 31c는 Jurkat 세포에서 발현된 TIGIT가 CHO 세포에서 발현된 CD155에 결합하는 것을 차단하는 BA127, BA131, BA128, 및 항-TIGIT 기준 항체 3의 능력을 보여주는 그래프이다. 차단은 다양한 항체 농도에 걸쳐 NFAT-루시페라아제 신호의 배수 변화로서 표현된다.
도 32a~도 32b는 2명의 공여자 유래의 준최적 농도의 SEA 초항원으로 자극시킨 일차 건강한 공여자 인간 PBMC에서, 다양한 농도의 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA127, 기준 항-TIGIT 항체, 및 이소형 대조군 항체가 IL-2 사이토카인 분비를 유도하는 능력을 보여주는 그래프이다.
도 33a~도 33e는 이중특이적 이소형 대조군(도 33a), 항-TIGIT 마우스 대리 단일특이적 항체(도 33b), 항-CD96 마우스 대리 단일특이적 항체(도 33c), 항-TIGIT 및 항-CD96 마우스 대리 단일특이적 항체 둘 다(도 33d), 또는 항-TIGITxCD96 마우스 대리 다중특이적 분자(도 33e)를 마우스에게 투여한 마우스 결장 암종 모델에서 시간 경과에 따른 종양 부피를 보여주는 일련의 그래프이다.
도 34a는 항-TIGIT + 항-CD96 마우스 대리 단일특이적 항체, 항-TIGITxCD96 마우스 대리 다중특이적 분자, Fc 침묵 항-TIGITxCD96 마우스 대리 다중특이적 분자, 또는 이소형 대조군을 마우스에게 투여한 마우스 결장 암종 모델에서 시간 경과에 따른 평균 종양 부피를 보여주는 그래프이다. 도 34b~도 34e는 항-TIGIT + 항-CD96 마우스 대리 단일특이적 항체(도 34c), 항-TIGITxCD96 마우스 대리 다중특이적 분자(도 34d), Fc-침묵 항-TIGITxCD96 마우스 대리 다중특이적 분자(도 34e), 또는 이소형 대조군(도 34b)을 투여한 각각의 개별 마우스에 대한 시간 경과에 따른 개별 종양 부피를 보여주는 일련의 그래프이다.
본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 다중특이적 분자 및 단리된 항-TIGIT 항체를 제공한다. 또한, 이들 다중특이적 분자 및 항체를 포함하는 약학적 조성물, 이들 다중특이적 분자 및 항체를 암호화하는 핵산, 이들 다중특이적 분자 및 항체를 제조하기 위한 발현 벡터 및 숙주 세포, 및 이들 다중특이적 분자 및 항체를 사용하여 대상체를 치료하는 방법이 제공된다. 본원에 개시된 다중특이적 분자 및 항체는 면역 세포 활성화를 증가시키는 데 특히 유용하며, 따라서 대상체에서 암을 치료하거나 대상체에서 감염성 질환을 치료하거나 예방하는 데 유용하다.
7.1
정의
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "CD96"은 인간에서 CD96 유전자에 의해 암호화되는, TACTILE(T 세포 활성화, 후기 발현 증가)로도 알려진, 분화 클러스터 96을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "인간 CD96"은 야생형 인간 CD96 유전자(예를 들어, GenBank?? 수탁 번호 NM_005816.5), 이의 단편, 또는 변이체에 의해 암호화된 CD96 단백질을 지칭한다. 인간 CD96의 예시적인 세포외 부분은 서열번호 61~65로서 본원에서 제공된다. 시노몰구스 CD96의 예시적인 세포외 부분은 서열번호 66, 111, 및 112로서 본원에서 제공된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "TIGIT"는 인간에서 TIGIT 유전자에 의해 암호화되는 Ig 및 ITIM 도메인(VSIG9 또는 VSTM3으로도 알려짐)을 갖는 T 세포 면역수용체를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "인간 TIGIT"는 야생형 인간 TIGIT 유전자(예: GenBank?? 수탁 번호 NM_173799.3)에 의해 암호화된 TIGIT 단백질 또는 이러한 단백질의 세포외 도메인을 지칭한다. 성숙한 인간 TIGIT 단백질 및 시노몰구스 TIGIT 단백질의 세포외 도메인의 예시적인 아미노산 서열은 서열번호 113 및 114로서 각각 제공된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "다중특이적 분자"는 상이한 항원에 특이적으로 결합하는 둘 이상의 항원 결합 영역을 포함하는 분자이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "항원 결합 영역"은 다중특이적 분자 또는 항체에게 항원에 대한 이들의 특이성을 부여하는 아미노산 잔기를 포함하는 다중특이적 분자 또는 항체의 부분을 지칭한다. 항원 결합 영역의 예는 항체 상보성 결정 영역(CDR), 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, 중쇄, 경쇄, 및 이들의 임의의 단편을 포함한다. 항원 결합 영역은 설치류(예: 마우스, 랫트, 또는 햄스터) 및 인간과 같은 임의의 동물 종으로부터 유래될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체(antibody 및 antibodies)"는 전장 항체, 전장 항체의 항원 결합 단편, 및 항체 CDR, VH 영역, 및/또는 VL 영역을 포함하는 분자를 포함한다. 항체의 예는 다음을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다: 단클론 항체, 재조합적으로 생산된 항체, 단일특이적 항체, 다중특이적 항체(이중특이적 항체 포함), 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 면역글로불린, 합성 항체, 2개의 중쇄 분자 및 2개의 경쇄 분자를 포함하는 4량체 항체, 항체 경쇄 단량체, 항체 중쇄 단량체, 항체 경쇄 2량체, 항체 중쇄 2량체, 항체 경쇄-항체 중쇄 쌍, 인트라바디(intrabodies), 이형접합 항체, 단일 도메인 항체, 1가 항체, 단쇄 항체 또는 단쇄 Fv (scFv), 카멜화 항체, 어피바디(affibody), Fab 단편, F(ab')2 단편, 이황화 결합 Fv (sdFv), (예를 들어, 항-항-Id 항체를 포함하는) 항-유전자형 (항-Id) 항체, 전술한 것 중 어느 하나의 항원 결합 단편. 소정의 구현예에서, 본원에서 기술된 항체는 다클론 항체 모집단을 지칭한다. 항체는 면역 글로불린 분자의 임의의 유형(예: IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 또는 IgY), 임의의 부류(예: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 또는 IgA2), 또는 임의의 하위 부류(예: IgG2a 또는 IgG2b)일 수 있다. 소정의 구현예에서, 본원에서 기술된 항체는 IgG 항체, 또는 이의 부류(예: 인간 IgG1 또는 IgG4) 또는 하위 부류이다. 특정 구현예에서, 항체는 인간화(humanized) 단클론 항체이다. 또 다른 특정 구현예에서, 항체는 인간화(humanized) 단클론 항체이다.
"다중특이적 항체"는 2개 이상의 상이한 항원 또는 동일한 항원의 2개 이상의 상이한 영역에 특이적으로 결합하는 항체(예를 들어, 이중특이적 항체)이다. 다중특이적 항체는 2개의 상이한 항원 결합 부위(Fc 부위 제외)를 함유하는 이중특이적 항체를 포함한다. 다중 특이성 항체는, 예를 들어, 재조합으로 생성된 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 재표면화 항체, 키메라 항체, 면역 글로불린, 합성 항체, 2개의 중쇄 분자 및 2개의 경쇄 분자를 포함하는 4량체 항체, 항체 경쇄 단량체, 항체 중쇄 단량체, 이형접합체 항체, 연결된 단쇄 항체 또는 연결된 단쇄 Fvs(scFv), 카멜화 항체, 애피바디(affybody), 연결된 Fab 단편, F(ab')2 단편, 화학적으로 연결된 Fvs, 및 이황화 연결된 Fvs(sdFv)를 포함할 수 있다. 다중특이적 항체는 면역 글로불린 분자의 임의의 유형(예: IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 또는 IgY), 임의의 부류(예: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 또는 IgA2), 또는 임의의 하위 부류(예: IgG2a 또는 IgG2b)일 수 있다. 소정의 구현예에서, 본원에서 기술된 다중특이적 항체는 IgG 항체, 또는 이의 부류(예: 인간 IgG1, IgG2, 또는 IgG4) 또는 하위 부류이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "CDR" 또는 "상보성 결정 영역"은 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드의 가변 영역 내에서 발견되는 비연속 항원 결합 부위를 의미한다. 이들 특정 영역은, 예를 들어 Kabat 등의 문헌[J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977)] 및 Kabat 등의 문헌[Sequences of protein of immunological interest. (1991)], Chothia 등의 문헌[J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)], 및 MacCallum 등의 문헌[J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)]에 기술되어 있으고, 이들 문헌 모두는 그 전체가 참조로서 본원에 통합되며, 상기 정의는, 서로 비교될 때 중첩되는 아미노산 잔기 또는 아미노산 잔기의 하위 집합을 포함한다. CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3은 중쇄 CDR을 나타내고, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 경쇄 CDR을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "가변 영역" 및 "가변 도메인"은 상호 교환 가능하게 사용되며 당업계의 일반적인 용어이다. 가변 영역은 일반적으로 항체의 일부, 일반적으로는 경쇄 또는 중쇄의 일부, 일반적으로는 성숙한 중쇄의 아미노 말단 약 110 내지 120개 아미노산 또는 110 내지 125개 아미노산 및 성숙한 경쇄의 약 90 내지 115개 아미노산을 지칭하는데, 그 서열은 항체 간에 광범위하게 상이하며, 특정 항체의 특정 항원에 대한 결합 및 특이성에 사용된다. 서열의 가변성은 상보적 결정 영역(CDR)으로 불리는 이들 영역에서 집중되는데, 가변 영역에서 보다 고도로 보존된 영역은 프레임워크 영역(FR)으로 불린다. 임의의 특정 메커니즘이나 이론에 구속되기를 바라는 것은 아니지만, 경쇄 및 중쇄의 CDR은 일차적으로 항체와 항원의 상호 작용과 특이성을 담당하는 것으로 여겨진다. 소정의 구현예에서, 가변 영역은 인간 가변 영역이다. 소정의 구현예에서, 가변 영역은 설치류 또는 쥣과 CDR 및 인간 프레임워크 영역(FR)을 포함한다. 소정의 구현예에서, 가변 영역은 영장류(예: 비인간 영장류) 가변 영역이다. 소정의 구현예에서, 가변 영역은 설치류 또는 쥣과 CDR 및 영장류(예: 비인간 영장류) 프레임워크 영역(FR)을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "VH" 및 "VL"는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된 Kabat 등의 문헌[(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (NIH Publication No. 91-3242, Bethesda)]에 기술된 것과 같은 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 각각 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "불변 영역"은 당업계에서 공통으로 사용되는 용어이다. 불변 영역은 항체 부위, 예를 들어, 경쇄 및/또는 중쇄의 카복실 말단 위치로서, 항원에 대한 항체의 결합에 직접 관여하지 않지만, Fc 수용체(예: Fc 감마 수용체)와의 상호 작용과 같은 다양한 작동자 기능을 나타낼 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "중쇄"가 항체와 관련하여 사용된 경우, 이는 불변 영역의 아미노산 서열에 기초한 임의의 구별되는 유형, 예를 들어, 알파(α), 델타(δ), 엡실론(ε), 감마(γ), 및 뮤(μ)를 지칭할 수 있으며, 이들은 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4와 같은 IgG의 하위 부류를 포함하여 항체의 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 부류를 각각 생성시킨다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "경쇄"가 항체와 관련하여 사용된 경우, 이는 불변 영역의 아미노산 서열에 기초한 임의의 구별되는 유형, 예를 들어, 카파(κ) 또는 람다(λ)를 지칭할 수 있다. 경쇄 아미노산 서열은 당업계에 잘 알려져 있다. 특정 구현예에서, 경쇄는 인간 경쇄이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "특이적 결합", "특이적 인식", "면역 특이적 결합", 및 "면역 특이적 인식"은 항체의 맥락에서 유사 용어들이며, 이러한 결합이 당업자에 의해 이해하는 바와 같이 항원(예: 에피토프 또는 면역 복합체)에 결합되는 분자를 지칭한다. 예를 들어, 항원에 특이적으로 결합되는 분자는, 예를 들어, 면역 검정, BIAcore®, KinExA 3000 기기(Sapidyne Instruments, Boise, ID), 또는 당업계에 알려진 다른 검정에 의해 결정했을 때 일반적으로 더 낮은 친화도으로 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드들에 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, 항원에 특이적으로 결합하는 분자는, 이 분자가 다른 항원에 비특이적으로 결합할 때의 KA보다 적어도 2 log(예를 들어, 10배), 2.5 log, 3 log, 4 log 이상의 KA로 항원에 결합한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "EU 넘버링 시스템"은 항체의 불변 영역에 대한 EU 넘버링 규칙을 지칭하며, 이는 Edelman, G.M. 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85 (1969)] 및 Kabat 등의 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health and Human Services, 5th edition, 1991]에 기술된 것과 같고, 이들 문헌 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료(treat, treating, 및 treatment)"는 본원에 기술된 치료적 또는 예방적 조치를 지칭한다. "치료" 방법은, 질환 또는 장애를 가지고 있거나 이러한 질환 또는 장애를 가지기 쉬운 대상체를 대상으로 질환이나 장애 또는 재발성 질환이나 장애를 예방하거나, 치유하거나, 이의 중증도를 감소시키거나, 이의 하나 이상의 증상을 완화시키기 위해, 또는 이러한 치료가 없었을 때 예상되는 것 이상으로 대상체의 생존을 연장시키기 위해 상기 대상체에게 항체를 투여하는 것을 사용한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 대상체에게 치료제를 투여하는 것의 맥락에서의 용어 "유효량"은 원하는 예방적 또는 치료적 효과를 달성하는 치료제의 양을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. 소정의 구현예에서, 대상체는 인간 또는 비인간 포유동물이다. 소정의 구현예에서, 대상체는 인간이다.
항체 또는 폴리뉴클레오티드와 관련하여 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단리된"은 항체 또는 폴리뉴클레오티드의 천연 공급원에 존재하는 하나 이상의 오염물(예를 들어, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 지질, 또는 탄수화물 등)로부터 분리된 항체 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 본원에 기술된 "단리된 항체"의 모든 경우는, 단리될 수 있지만 반드시 그럴 필요는 없는 항체로서 추가적으로 고려된다. 본원에 기술된 "단리된 폴리뉴클레오티드"의 모든 경우는, 단리될 수 있지만 반드시 그럴 필요는 없는 폴리뉴클레오티드로서 추가적으로 고려된다. 본원에 기술된 "항체"의 모든 경우는, 단리될 수 있지만 반드시 그럴 필요는 없는 항체로서 추가적으로 고려된다. 본원에 기술된 "폴리뉴클레오티드"의 모든 경우는, 단리될 수 있지만 반드시 그럴 필요는 없는 폴리뉴클레오티드로서 추가적으로 고려된다.
2개의 서열(예: 아미노산 서열 또는 핵산 서열) 간의 "동일성 백분율(percent identity)"을 결정하는 것은 수학적 알고리즘을 사용해 이뤄질 수 있다. 두 서열의 비교에 사용된 수학적 알고리즘의 특정 비제한적인 예는 Karlin S & Altschul SF의 문헌[(1990) PNAS 87: 2264-2268]에서의 알고리즘이며, 이는 Karlin S & Altschul SF의 문헌[(1993) PNAS 90: 5873-5877]에서와 같이 수정되었다(이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 이러한 알고리즘은 Altschul 등의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 통합되었다(Altschul SF 등의 문헌[1990, J. Mol. Biol. 215:403], 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). BLAST 뉴클레오티드 검색은 본원에 기술된 핵산 분자에 상동인 뉴클레오타이드 서열을 수득하기 위해, 예를 들어, score=100, wordlength=12로 설정된 NBLAST 뉴클레오티드 프로그램 파라미터로 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 본원에 기술된 단백질 분자에 상동인 아미노산 서열을 수득하기 위해, 예를 들어, score=50, wordlength=3으로 설정된 XBLAST 프로그램 파라미터로 수행될 수 있다. 비교 목적을 위한 갭 정렬을 획득하기 위해, Altschul SF 등의 문헌[(1997) Nuc Acids Res 25: 3389 3402](그 전체가 본원에 참조로서 통합됨)에 기술된 것과 같은 Gapped BLAST가 사용될 수 있다. 대안적으로, PSI BLAST가 사용되어 분자들 사이의 먼 관계(Id.)를 검출하는 반복 검색을 수행할 수 있다. BLAST, Gapped BLAST, 및 PSI Blast 프로그램을 사용할 때, 각각의 프로그램(예: XBLAST 및 NBLAST)의 기본 파라미터가 사용될 수 있다(예: National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 웹페이지 www.ncbi.nlm.nih.gov 참조). 서열의 비교에 사용된 수학적 알고리즘의 다른 특정 비제한적인 예는 Myers 및 Miller의 알고리즘이다(Myers 및 Miller의 문헌[1988, CABIOS 4:11-17]을 참조하고, 그 전체는 참조로서 본원에 통합됨). 이러한 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합되어 있다. 아미노산 서열의 비교를 위해 ALIGN 프로그램를 사용할 때, PAM120 중량 잔기표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 패널티가 사용될 수 있다.
2개의 서열 사이의 동일성 백분율은 갭의 허용 여부와 무관하게 위에 설명된 것들과 유사한 기술을 사용해 알아낼 수 있다. 동일성 백분율의 계산에 있어서, 일반적으로는 정확히 일치하는 것만 계산된다.
7.2
CD96 및/또는 TIGIT에 결합하는 다중특이적 분자 및 항-TIGIT 항체
일 양태에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 다중특이적 분자를 제공한다. 예를 들어, 본원에 제공된 다중특이적 분자는 CD96에 결합하는 제1 항원 결합 영역 및 CD96 이외의 항원에 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함할 수 있다. 본원에 제공된 다중특이적 분자는 TIGIT 이외의 항원에 결합하는 제1 항원 결합 영역 및 TIGIT에 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함할 수도 있다. 또한, CD96에 결합하는 제1 항원 결합 영역 및 TIGIT에 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자가 본원에 제공된다. 예시적인 항-CD96 항원 결합 영역 및 항-TIGIT 항원 결합 영역의 아미노산 서열은 표 1 및 표 2에 각각 제시되어 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 예시적인 항체의 아미노산 서열은 표 2에 제시되어 있다.
| 예시적인 항-CD96 항원 결합 영역의 아미노산 서열. | ||
| 설명 | 아미노산 서열 | SEQ ID NO |
| BA137 중쇄 |
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNANTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARSAGVLGGMDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG | 1 |
| BA137 BA145 경쇄 |
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| BA138 중쇄 |
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYAVHWVRQAPGQRLEWMGWINTGNANTKYSQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSLGVYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG | 3 |
| BA138 BA144 경쇄 |
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| BA139 중쇄 |
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| BA139 BA143 경쇄 |
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPKITFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 6 |
| BA137 BA145 HCDR1 |
SYGIS | 10 |
| BA137 BA145 HCDR2 |
WISAYNANTNYAQKLQG | 11 |
| BA137 BA145 HCDR3 |
SAGVLGGMDV | 12 |
| BA137 BA145 LCDR1 |
RASQSVNAYLA | 13 |
| BA137 BA145 LCDR2 |
GASTRAT | 14 |
| BA137 BA145 LCDR3 |
QQYNNWPS | 15 |
| BA138 BA144 HCDR1 |
NYAVH | 16 |
| BA138 BA144 HCDR2 |
WINTGNANTKYSQKFQG | 17 |
| BA138 BA144 HCDR3 |
SLGVYYGMDV | 18 |
| BA138 BA144 LCDR1 |
RASQSVSTFLN | 19 |
| BA138 BA144 LCDR2 |
AASSLQS | 20 |
| BA138 BA144 LCDR3 |
LQTYSIPYT | 21 |
| BA139 BA143 HCDR1 |
TYALH | 22 |
| BA139 BA143 HCDR2 |
WINTGSGDTKYSQKFQG | 23 |
| BA139 BA143 HCDR3 |
SLGVYYGMDV | 24 |
| BA139 BA143 LCDR1 |
RASQSISSYLN | 25 |
| BA139 BA143 LCDR2 |
AASSLQS | 26 |
| BA139 BA143 LCDR3 |
QQSYSTPKIT | 27 |
| BA137 BA145 VH |
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNANTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARSAGVLGGMDVWGRGTLVTVSS | 34 |
| BA137 BA145 VL |
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVNAYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPSFGQGTKLEIK | 35 |
| BA138 BA144 VH |
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYAVHWVRQAPGQRLEWMGWINTGNANTKYSQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSLGVYYGMDVWGQGTTVTVSS | 36 |
| BA138 BA144 VL |
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSTFLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQTYSIPYTFGQGTKLEIK | 37 |
| BA139 BA143 VH |
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYALHWVRQAPGQRLEWMGWINTGSGDTKYSQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSLGVYYGMDVWGQGTLVTVSS | 38 |
| BA139 BA143 VL |
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPKITFGQGTKLEIK | 39 |
| BA137 BA138 BA139 BA143 BA144 BA145 경쇄 불변 영역 |
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC | 42 |
| BA137a 중쇄 |
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| BA137b 중쇄 |
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNANTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARSAGVLGGMDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG | 68 |
| BA137c 중쇄 |
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNANTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARSAGVLGGMDVWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG | 69 |
| BA137d 중쇄 |
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| BA137e 중쇄 |
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| BA137f 중쇄 |
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| BA137g 중쇄 |
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| BA137h 중쇄 |
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| BA137i 중쇄 |
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| BA137j 중쇄 |
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| BA137k 중쇄 |
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| BA145 중쇄 |
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| BA138a 중쇄 |
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| BA138b 중쇄 |
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| BA138c 중쇄 |
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| BA138d 중쇄 |
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| BA138e 중쇄 |
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| BA138f 중쇄 |
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| BA138g 중쇄 |
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| BA138h 중쇄 |
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| BA138i 중쇄 |
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| BA138j 중쇄 |
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| BA138k 중쇄 |
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| BA144 중쇄 |
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| BA139a 중쇄 |
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| BA139b 중쇄 |
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| BA139c 중쇄 |
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| BA139d 중쇄 |
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| BA139e 중쇄 |
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| BA139f 중쇄 |
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| BA139g 중쇄 |
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| BA143 중쇄 |
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| BA137a BA138a BA139a 중쇄 불변 영역 |
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| BA137 BA138 BA139 중쇄 불변 영역 |
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG | 50 |
| BA137b BA138b BA139b 중쇄 불변 영역 |
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG | 51 |
| BA137c BA138c BA139c 중쇄 불변 영역 |
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG | 52 |
| BA137d BA138d BA139d 중쇄 불변 영역 |
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG | 53 |
| BA137e BA138e BA139e 중쇄 불변 영역 |
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG | 54 |
| BA137f BA138f BA139f 중쇄 불변 영역 |
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG | 55 |
| BA137g BA138g BA139g 중쇄 불변 영역 |
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG | 56 |
| BA137h BA138h BA139h 중쇄 불변 영역 |
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG | 57 |
| BA137i BA138i BA139i 중쇄 불변 영역 |
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG | 58 |
| BA137j BA138j BA139j 중쇄 불변 영역 |
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG | 59 |
| BA137k BA138k BA139k 중쇄 불변 영역 |
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG | 60 |
| 예시적인 항-TIGIT 항원 결합 영역 및 항-TIGIT 항체의 아미노산 서열. | ||
| 설명 | 아미노산 서열 | SEQ ID NO |
| BA142 BA150 중쇄 |
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFASYGISWVRQAPGQGLEWMGGITPFFNRVDVAEKFQGRVTITADKSTSTAYIELSSLRSEDTAVYYCARDLRRGGVGDAFDIWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG | 7 |
| BA142 경쇄 |
QSALTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSPDVGSHAYRSWYQQHPGKAPKLMIYEVSYRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYPPSSATVFGAGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS | 8 |
| BA150 BA148 경쇄 |
QSALTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSPDVGSHAYRSWYQQHPGKAPKLMIYEVSYRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYPPSSATVFGAGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC | 9 |
| BA142 BA150 BA148 HCDR1 |
SYGIS | 28 |
| BA142 BA150 BA148 HCDR2 |
GITPFFNRVDVAEKFQG | 29 |
| BA142 BA150 BA148 HCDR3 |
DLRRGGVGDAFDI | 30 |
| BA142 BA150 BA148 LCDR1 |
TGTSPDVGSHAYRS | 31 |
| BA142 BA150 BA148 LCDR2 |
EVSYRPS | 32 |
| BA142 BA150 BA148 LCDR3 |
SSYPPSSATV | 33 |
| BA142 BA150 BA148 VH |
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFASYGISWVRQAPGQGLEWMGGITPFFNRVDVAEKFQGRVTITADKSTSTAYIELSSLRSEDTAVYYCARDLRRGGVGDAFDIWGRGTLVTVSS | 40 |
| BA142 BA150 BA148 VL |
QSALTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSPDVGSHAYRSWYQQHPGKAPKLMIYEVSYRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYPPSSATVFGAGTKLTVL | 41 |
| BA142 경쇄 불변 영역 |
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS | 43 |
| BA150 BA148 경쇄 불변 영역 |
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC | 44 |
| BA142d BA150d 중쇄 |
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFASYGISWVRQAPGQGLEWMGGITPFFNRVDVAEKFQGRVTITADKSTSTAYIELSSLRSEDTAVYYCARDLRRGGVGDAFDIWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG | 100 |
| BA142e BA150e 중쇄 |
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFASYGISWVRQAPGQGLEWMGGITPFFNRVDVAEKFQGRVTITADKSTSTAYIELSSLRSEDTAVYYCARDLRRGGVGDAFDIWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG | 101 |
| BA142f BA150f 중쇄 |
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFASYGISWVRQAPGQGLEWMGGITPFFNRVDVAEKFQGRVTITADKSTSTAYIELSSLRSEDTAVYYCARDLRRGGVGDAFDIWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG | 102 |
| BA142a BA150a 중쇄 |
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFASYGISWVRQAPGQGLEWMGGITPFFNRVDVAEKFQGRVTITADKSTSTAYIELSSLRSEDTAVYYCARDLRRGGVGDAFDIWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG | 103 |
| BA142g BA150g 중쇄 |
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| BA142b BA150b 중쇄 |
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| BA142h BA150h 중쇄 |
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| BA142i BA150i 중쇄 불변 영역 |
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| BA142j BA150j 중쇄 불변 영역 |
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| BA142k BA150k 중쇄 불변 영역 |
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG | 60 |
| 예시적인 CD96 서열. | ||
| 설명 | 아미노산 서열 | SEQ ID NO |
| 예시적인 인간 CD96 세포외 도메인 이소형 1 서열1 | VWEKTVNTEENVYATLGSDVNLTCQTQTVGFFVQMQWSKVTNKIDLIAVYHPQYGFYCAYGRPCESLVTFTETPENGSKWTLHLRNMSCSVSGRYECMLVLYPEGIQTKIYNLLIQTHVTADEWNSNHTIEIEINQTLEIPCFQNSSSKISSEFTYAWSVENSSTDSWVLLSKGIKEDNGTQETLISQNHLISNSTLLKDRVKLGTDYRLHLSPVQIFDDGRKFSCHIRVGPNKILRSSTTVKVFAKPEIPVIVENNSTDVLVERRFTCLLKNVFPKANITWFIDGSFLHDEKEGIYITNEERKGKDGFLELKSVLTRVHSNKPAQSDNLTIWCMALSPVPGNKVWNISSEKITFLLGSEISSTDPPLSVTESTLDTQPSPASSVSPARYPATSSVTLVDVSALRPNTTPQPSNSSMTTRGFNYPWTSSGTDTKKSVSRIPSETYSSSPSGAGSTLHDNVFTSTARAFSEVPTTANGSTKTNHVHITGIVVNKPKDGM | 61 |
| 예시적인 인간 CD96 세포외 도메인 이소형 2 서열1 | VWEKTVNTEENVYATLGSDVNLTCQTQTVGFFVQMQWSKVTNKIDLIAVYHPQYGFYCAYGRPCESLVTFTETPENGSKWTLHLRNMSCSVSGRYECMLVLYPEGIQTKIYNLLIQTHVTADEWNSNHTIEIEINQTLEIPCFQNSSSKISSEFTYAWSVEDNGTQETLISQNHLISNSTLLKDRVKLGTDYRLHLSPVQIFDDGRKFSCHIRVGPNKILRSSTTVKVFAKPEIPVIVENNSTDVLVERRFTCLLKNVFPKANITWFIDGSFLHDEKEGIYITNEERKGKDGFLELKSVLTRVHSNKPAQSDNLTIWCMALSPVPGNKVWNISSEKITFLLGSEISSTDPPLSVTESTLDTQPSPASSVSPARYPATSSVTLVDVSALRPNTTPQPSNSSMTTRGFNYPWTSSGTDTKKSVSRIPSETYSSSPSGAGSTLHDNVFTSTARAFSEVPTTANGSTKTNHVHITGIVVNKPKDGM | 62 |
| 예시적인 인간 CD96 세포외 도메인 이소형 2 C89S1 | VWEKTVNTEENVYATLGSDVNLTCQTQTVGFFVQMQWSKVTNKIDLIAVYHPQYGFYCAYGRPCESLVTFTETPENGSKWTLHLRNMSSSVSGRYECMLVLYPEGIQTKIYNLLIQTHVTADEWNSNHTIEIEINQTLEIPCFQNSSSKISSEFTYAWSVEDNGTQETLISQNHLISNSTLLKDRVKLGTDYRLHLSPVQIFDDGRKFSCHIRVGPNKILRSSTTVKVFAKPEIPVIVENNSTDVLVERRFTCLLKNVFPKANITWFIDGSFLHDEKEGIYITNEERKGKDGFLELKSVLTRVHSNKPAQSDNLTIWCMALSPVPGNKVWNISSEKITFLLGSEISSTDPPLSVTESTLDTQPSPASSVSPARYPATSSVTLVDVSALRPNTTPQPSNSSMTTRGFNYPWTSSGTDTKKSVSRIPSETYSSSPSGAGSTLHDNVFTSTARAFSEVPTTANGSTKTNHVHITGIVVNKPKDGMENLYFQGLEHHHHHHHHHHGGSGGLPETGGDR | 63 |
| 예시적인 인간 CD96 도메인 11 | VWEKTVNTEENVYATLGSDVNLTCQTQTVGFFVQMQWSKVTNKIDLIAVYHPQYGFYCAYGRPCESLVTFTETPENGSKWTLHLRNMSCSVSGRYECMLVLYPEGIQTKIYNLLIQTHV | 64 |
| 예시적인 인간 CD96 도메인 1 C89S1 | VWEKTVNTEENVYATLGSDVNLTCQTQTVGFFVQMQWSKVTNKIDLIAVYHPQYGFYCAYGRPCESLVTFTETPENGSKWTLHLRNMSSSVSGRYECMLVLYPEGIQTKIYNLLIQTHV | 65 |
| 예시적인 Cyno CD96 세포외 도메인 이소형 12 | VWGKPFNTEENIYATLGSDVNLTCQTQAKGFLVQMQWSKVTDKADLIALYHPQYGFHCAYGSPCESLVTFTQTPENGSKWTLHLRNMSSSVSGRYECMLTLYPEGMQTKIYNLLIQTHVTPDEWKSNHTIEIEINQTLEIPCFQNSSSEISSEFTYAWLVVKNSSTDSWVLLSKGKRYDNGTQQTLISQDHLISSSTLLKDRVKVGIDYRLHLSPVQIFDDGRKFSCHIRVGPDKILRSSTTIKVFAKPEIPMIVENNSTDVLVERTFTCLLKNVFPKANIIWFIDGSFLHDEKEGIYITNEERKGKDGFLELKSVLTRVHSDKPAQSDNLTIWCMALSPVPGNKVWNISSEKITFLLGSEMSTTDLPPSVTESTLDTQPSPASSVSPTRYPATSSVTLADVSALRPNTTPQSSSSSVTTQDFNYPWTSSGTDAKKSFSQIPSETYSSSPSGAGSTLHDNVFTSTTRALSEVPTTANGSTKTNHVHITGIVVSKPKDGM | 66 |
| 예시적인 Cyno CD96 세포외 도메인 서열 이소형 22 | VWGKPFNTEENIYATLGSDVNLTCQTQAKGFLVQMQWSKVTDKADLIALYHPQYGFHCAYGSPCESLVTFTQTPENGSKWTLHLRNMSSSVSGRYECMLTLYPEGMQTKIYNLLIQTHVTPDEWKSNHTIEIEINQTLEIPCFQNSSSEISSEFTYAWLVEDNGTQQTLISQDHLISSSTLLKDRVKVGIDYRLHLSPVQIFDDGRKFSCHIRVGPDKILRSSTTIKVFAKPEIPMIVENNSTDVLVERTFTCLLKNVFPKANIIWFIDGSFLHDEKEGIYITNEERKGKDGFLELKSVLTRVHSDKPAQSDNLTIWCMALSPVPGNKVWNISSEKITFLLGSEMSTTDLPPSVTESTLDTQPSPASSVSPTRYPATSSVTLADVSALRPNTTPQSSSSSVTTQDFNYPWTSSGTDAKKSFSQIPSETYSSSPSGAGSTLHDNVFTSTTRALSEVPTTANGSTKTNHVHITGIVVSKPKDGMENLYFQGLEHHHHHHHHHHGGSGGLPETGGDR | 111 |
| 예시적인 Cyno CD96 도메인 12 | VWGKPFNTEENIYATLGSDVNLTCQTQAKGFLVQMQWSKVTDKADLIALYHPQYGFHCAYGSPCESLVTFTQTPENGSKWTLHLRNMSSSVSGRYECMLTLYPEGMQTKIYNLLIQTHV | 112 |
| 1
hCD96에 대한 도메인의 UniProt 설명에 기초하여 할당된 도메인. 2 cyCD96의 경우, hCD96 서열과 cyCD96 서열 간의 서열 상동성을 사용하여 도메인 1, 도메인 2, 또는 도메인 3을 정의함. |
||
| 예시적인 TIGIT 서열. | ||
| 설명 | 아미노산 서열 | SEQ ID NO |
| 예시적인 인간 TIGIT 세포외 도메인 | MMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQENLYFQGLEHHHHHHHHHHGGSGGLPETGGDR | 113 |
| 예시적인 Cyno TIGIT 세포외 도메인 | MMTGTIETTGNISAKKGGSVILQCHLSSTMAQVTQVNWEQHDHSLLAIRNAELGWHIYPAFKDRVAPGPGLGLTLQSLTMNDTGEYFCTYHTYPDGTYRGRIFLEVLESSVAEHSARFQENLYFQGLEHHHHHHHHHHGGSGGLPETGGDR | 114 |
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 제1 항원 결합 영역은 표 1에 제시된 VH의 CDR 중 1개, 2개, 또는 3개 다를 포함하는 VH를 포함한다. 소정의 구현예에서, 제1 항원 결합 영역은 표 1에 제시된 VH의 CDRH1을 포함한다. 소정의 구현예에서, 제1 항원 결합 영역은 표 1에 제시된 VH의 CDRH2를 포함한다. 소정의 구현예에서, 제1 항원 결합 영역은 표 1에 제시된 VH의 CDRH3을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 제1 항원 결합 영역은 표 1에 제시된 VL의 CDR 중 1개, 2개, 또는 3개 다를 포함하는 VL을 포함한다. 소정의 구현예에서, 제1 항원 결합 영역은 표 1에 제시된 VL의 CDRL1을 포함한다. 소정의 구현예에서, 제1 항원 결합 영역은 표 1에 제시된 VL의 CDRL2를 포함한다. 소정의 구현예에서, 제1 항원 결합 영역은 표 1에 제시된 VL의 CDRL3을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 제2 항원 결합 영역은 표 2에 제시된 VH의 CDR 중 1개, 2개, 또는 3개 다를 포함하는 VH를 포함한다. 소정의 구현예에서, 제2 항원 결합 영역은 표 2에 제시된 VH의 CDRH1을 포함한다. 소정의 구현예에서, 제2 항원 결합 영역은 표 2에 제시된 VH의 CDRH2를 포함한다. 소정의 구현예에서, 제2 항원 결합 영역은 표 2에 제시된 VH의 CDRH3을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 제2 항원 결합 영역은 표 2에 제시된 VL의 CDR 중 1개, 2개, 또는 3개 다를 포함하는 VL을 포함한다. 소정의 구현예에서, 제2 항원 결합 영역은 표 2에 제시된 VL의 CDRL1을 포함한다. 소정의 구현예에서, 제2 항원 결합 영역은 표 2에 제시된 VL의 CDRL2를 포함한다. 소정의 구현예에서, 제2 항원 결합 영역은 표 2에 제시된 VL의 CDRL3을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 제1 항원 결합 영역은 표 1에 제시된 VH의 CDR 중 1개, 2개, 또는 3개 다를 포함하는 VH를 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 표 2에 제시된 VH의 CDR 중 1개, 2개, 또는 3개 다를 포함하는 VH를 포함한다. 소정의 구현예에서, 제1 항원 결합 영역은 표 1에 제시된 VH의 CDRH1을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 표 2에 제시된 VH의 CDRH1을 포함한다. 소정의 구현예에서, 제1 항원 결합 영역은 표 1에 제시된 VH의 CDRH2를 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 표 2에 제시된 VH의 CDRH2를 포함한다. 소정의 구현예에서, 제1 항원 결합 영역은 표 1에 제시된 VH의 CDRH3을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 표 2에 제시된 VH의 CDRH3을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 제1 항원 결합 영역은 표 1에 제시된 VL의 CDR 중 1개, 2개, 또는 3개 다를 포함하는 VL을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 표 2에 제시된 VL의 CDR 중 1개, 2개, 또는 3개 다를 포함하는 VL을 포함한다. 소정의 구현예에서, 제1 항원 결합 영역은 표 1에 제시된 VL의 CDRH1을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 표 2에 제시된 VL의 CDRH1을 포함한다. 소정의 구현예에서, 제1 항원 결합 영역은 표 1에 제시된 VL의 CDRH2를 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 표 2에 제시된 VL의 CDRH2를 포함한다. 소정의 구현예에서, 제1 항원 결합 영역은 표 1에 제시된 VL의 CDRH3을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 표 2에 제시된 VL의 CDRH3을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공하며, 항체는 표 2에 제시된 VH 도메인의 CDR 중 1개, 2개, 또는 3개 다를 포함하는 VH 도메인을 포함한다. 소정의 구현예에서, 항체는 표 2에 제시된 VH 도메인의 CDRH1을 포함한다. 소정의 구현예에서, 항체는 표 2에 제시된 VH 도메인의 CDRH2를 포함한다. 소정의 구현예에서, 항체는 표 2에 제시된 VH 도메인의 CDRH3을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공하며, 항체는 표 2에 개시된 VL 도메인의 CDR 중 1개, 2개, 또는 3개 다를 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 소정의 구현예에서, 항체는 표 2에 제시된 VL 도메인의 CDRL1을 포함한다. 소정의 구현예에서, 항체는 표 2에 제시된 VL 도메인의 CDRL2를 포함한다. 소정의 구현예에서, 항체는 표 2에 제시된 VL 도메인의 CDRL3을 포함한다.
본원에 개시된 다중특이적 분자 또는 항체의 개별 CDR은 당업계에 알려진 임의의 CDR 넘버링 체계에 따라 결정될 수 있다.
소정의 구현예에서, 본원에 개시된 다중특이적 분자 또는 항체의 CDR 중 하나 이상은 Kabat 등의 문헌[J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977)] 및 Kabat 등의 문헌[Sequences of protein of immunological interest (1991)]에 따라 결정될 수 있으며, 동 문헌 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 Kabat 넘버링 방식에 의해 결정했을 때, 본원의 표 1에 개시된 항원 결합 영역의 CDR을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 Kabat 넘버링 방식에 의해 결정했을 때, 제2 항원 결합 영역은 본원의 표 2에 개시된 항원 결합 영역의 CDR을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 Kabat 넘버링 방식에 의해 결정했을 때, 제1 항원 결합 영역은 본원의 표 1에 개시된 항원 결합 영역의 CDR을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 본원의 표 2에 개시된 항원 결합 영역의 CDR을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하고, Kabat 넘버링 방식에 의해 결정했을 때, 본원의 표 2에 개시된 항체의 CDR을 포함하는 항체를 제공한다.
소정의 구현예에서, 본원에 개시된 다중특이적 분자 또는 항체의 CDR 중 하나 이상은 면역 글로불린 구조 루프의 위치를 지칭하는 Chothia 넘버링 방식에 따라 결정될 수 있다(예를 들어, Chothia C & Lesk AM의 문헌[(1987), J Mol Biol 196: 901-917]; Al-Lazikani B 등의 문헌[(1997) J Mol Biol 273: 927-948]; Chothia C 등의 문헌[(1992) J Mol Biol 227: 799-817]; Tramontano A 등의 문헌[(1990) J Mol Biol 215(1): 175-82]; 및 미국 특허 제7,709,226호를 참조하고, 이들 모두는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨).
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 Chotia 넘버링 시스템에 의해 결정했을 때, 제1 항원 결합 영역은 본원의 표 1에 개시된 항원 결합 영역의 CDR을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 Chotia 넘버링 시스템에 의해 결정했을 때, 제2 항원 결합 영역은 본원의 표 2에 개시된 항원 결합 영역의 CDR을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 Chotia 넘버링 시스템에 의해 결정했을 때, 제1 항원 결합 영역은 본원의 표 1에 개시된 항원 결합 영역의 CDR을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 본원의 표 2에 개시된 항원 결합 영역의 CDR을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하고, Chothia 넘버링 시스템에 의해 결정했을 때, 본원의 표 2에 개시된 항체의 CDR을 포함하는 항체를 제공한다.
소정의 구현예에서, 본원에 개시된 다중특이적 분자 또는 항체의 CDR 중 하나 이상은 MacCallum RM 등의 문헌[(1996) J Mol Biol 262: 732-745]에 따라 결정될 수 있으며, 동 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 예를 들어, Kontermann 및 Dubel(eds.)의 문헌[Antibody Engineering, Chapter 31, pp. 422-439, Springer-Verlag, Berlin (2001)] 중 Martin A의 "Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains"를 또한 참조하고, 동 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 MacCallum 넘버링 시스템에 의해 결정했을 때, 제1 항원 결합 영역은 본원의 표 1에 개시된 항원 결합 영역의 CDR을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 MacCallum 넘버링 시스템에 의해 결정했을 때, 제2 항원 결합 영역은 본원의 표 2에 개시된 항원 결합 영역의 CDR을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 MacCallum 넘버링 시스템에 의해 결정했을 때, 제1 항원 결합 영역은 본원의 표 1에 개시된 항원 결합 영역의 CDR을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 본원의 표 2에 개시된 항원 결합 영역의 CDR을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하고, MacCallum 넘버링 시스템에 의해 결정했을 때, 본원의 표 2에 개시된 항체의 CDR을 포함하는 항체를 제공한다.
소정의 구현예에서, 본원에 개시된 다중특이적 분자 또는 항체의 CDR은 다음에 기술된 것과 같은 IMGT 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다: Lefranc M-P의 문헌[(1999) The Immunologist 7: 132-136]; Lefranc M-P 등의 문헌[(1999) Nucleic Acids Res 27: 209-212](이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨); 및 Lefranc M-P 등의 문헌[(2009) Nucleic Acids Res 37: D1006-D1012].
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 IMGT 넘버링 시스템에 의해 결정했을 때, 제1 항원 결합 영역은 본원의 표 1에 개시된 항원 결합 영역의 CDR을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 IMGT 넘버링 시스템에 의해 결정했을 때, 제2 항원 결합 영역은 본원의 표 2에 개시된 항원 결합 영역의 CDR을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 IMGT 넘버링 시스템에 의해 결정했을 때, 제1 항원 결합 영역은 본원의 표 1에 개시된 항원 결합 영역의 CDR을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 본원의 표 2에 개시된 항원 결합 영역의 CDR을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하고, IMGT 넘버링 시스템에 의해 결정했을 때, 본원의 표 2에 개시된 항체의 CDR을 포함하는 항체를 제공한다.
소정의 구현예에서, 본원에 개시된 다중특이적 분자 또는 항체의 CDR은 AbM 넘버링 방식에 따라 결정될 수 있는데, 이 방식은 Kabat CDR과 Chothia 구조 루프 사이의 절충을 나타내는 AbM 초가변 영역을 지칭하고, Oxford Molecular의 AbM 항체 모델링 소프트웨어(Oxford Molecular Group, Inc.)에 의해 사용되며, 동 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 AbM 넘버링 방식에 의해 결정했을 때, 본원의 표 1에 개시된 항원 결합 영역의 CDR을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 AbM 넘버링 방식에 의해 결정했을 때, 제2 항원 결합 영역은 본원의 표 2에 개시된 항원 결합 영역의 CDR을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 AbM 넘버링 방식에 의해 결정했을 때, 제1 항원 결합 영역은 본원의 표 1에 개시된 항원 결합 영역의 CDR을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 본원의 표 2에 개시된 항원 결합 영역의 CDR을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하고, AbM 넘버링 방식에 의해 결정했을 때, 본원의 표 2에 개시된 항체의 CDR을 포함하는 항체를 제공한다.
소정의 구현예에서, 본원에 개시된 항체의 CDR은 Honegger 및 Pluckthun의 문헌[J. Mol. Biol. 309:657-670 (2001)]에 기술된 것과 같은 AHo 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있으며, 동 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 AHo 넘버링 시스템에 의해 결정했을 때, 제1 항원 결합 영역은 본원의 표 1에 개시된 항원 결합 영역의 CDR을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 AHo 넘버링 시스템에 의해 결정했을 때, 제2 항원 결합 영역은 본원의 표 2에 개시된 항원 결합 영역의 CDR을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 AHo 넘버링 시스템에 의해 결정했을 때, 제1 항원 결합 영역은 본원의 표 1에 개시된 항원 결합 영역의 CDR을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 본원의 표 2에 개시된 항원 결합 영역의 CDR을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하고, AHo 넘버링 시스템에 의해 결정했을 때, 본원의 표 2에 개시된 항체의 CDR을 포함하는 항체를 제공한다.
소정의 구현예에서, 본원에 개시된 다중특이적 분다 또는 항체의 개별 CDR은 Kabat, Chothia, MacCallum, IMGT, AHo, 또는 AbM 넘버링 방식 중 하나에 따라 각각 독립적으로 결정되거나, 다중특이적 분자의 구조 분석에 의해 각각 독립적으로 결정되며, 여기서 구조 분석은 CD96 또는 TIGIT의 에피토프 영역과 접촉할 것으로 예측되는 가변 영역(들) 내의 잔기를 식별한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역 및 CD96 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 서열번호 34, 36, 또는 38에 제시된 VH의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 영역 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 35, 37, 또는 39에 제시된 VL의 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 영역 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하고, 각각의 CDR은 Kabat, Chothia, MacCallum, IMGT, AHo, 또는 AbM 넘버링 방식 중 하나에 의해 독립적으로 결정되거나 다중특이적 분자의 구조 분석에 의해 독립적으로 결정되며, 상기 구조 분석은 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)의 에피토프 영역과 접촉할 것으로 예측되는 가변 영역(들) 내의 잔기를 식별한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 서열번호 40에 제시된 VH의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 영역 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 41에 제시된 VL의 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 영역 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하고, 각각의 CDR은 Kabat, Chothia, MacCallum, IMGT, AHo, 또는 AbM 넘버링 방식 중 하나에 의해 독립적으로 결정되거나 다중특이적 분자의 구조 분석에 의해 독립적으로 결정되며, 상기 구조 분석은 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)의 에피토프 영역과 접촉할 것으로 예측되는 가변 영역(들) 내의 잔기를 식별한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 서열번호 34, 36, 또는 38에 제시된 VH의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 영역 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 35, 37, 또는 39에 제시된 VL의 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 영역 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 서열번호 40에 제시된 VH의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 영역 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 41에 제시된 VL의 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 영역 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하고, 각각의 CDR은 Kabat, Chothia, MacCallum, IMGT, AHo, 또는 AbM 넘버링 방식 중 하나에 의해 독립적으로 결정되거나 다중특이적 분자의 구조 분석에 의해 독립적으로 결정되며, 상기 구조 분석은 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)의 에피토프 영역과 각각 접촉할 것으로 예측되는 가변 영역(들) 내의 잔기를 식별한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 서열번호 10, 11, 및 12; 16, 17, 및 18; 또는 22, 23, 및 24에 각각 제시된 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 서열번호 13, 14, 및 15; 19, 20, 및 21; 또는 25, 26, 및 27에 각각 제시된 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 영역을 포함하는 VH, 및 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 영역을 포함하는 VL을 포함하고, CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 영역은 서열번호 10, 11, 12, 13, 14, 및 15; 16, 17, 18, 19, 20, 및 21; 또는 22, 23, 24, 25, 26, 및 27에 각각 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 서열번호 34, 36, 또는 38에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%(예를 들어 적어도 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 서열번호 34, 36, 또는 38에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 소정의 구현예에서, VH의 아미노산 서열은 서열번호 34, 36, 및 38로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 서열번호 35, 37, 또는 39에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%(예를 들어 적어도 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 서열번호 35, 37, 또는 39에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 소정의 구현예에서, VL의 아미노산 서열은 서열번호 35, 37, 및 39로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 서열번호 34, 36, 또는 38에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%(예를 들어 적어도 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 35, 37, 또는 39에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%(예를 들어, 적어도 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 소정의 구현예에서, VH의 아미노산 서열은 서열번호 34에 제시된 아미노산 서열로 이루어지고; VL의 아미노산 서열은 서열번호 35에 제시된 아미노산 서열로 이루어진다. 소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 소정의 구현예에서, VH의 아미노산 서열은 서열번호 36에 제시된 아미노산 서열로 이루어지고; VL의 아미노산 서열은 서열번호 37에 제시된 아미노산 서열로 이루어진다. 소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 소정의 구현예에서, VH의 아미노산 서열은 서열번호 38에 제시된 아미노산 서열로 이루어지고; VL의 아미노산 서열은 서열번호 39에 제시된 아미노산 서열로 이루어진다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 서열번호 34 및 35; 36 및 37; 또는 38 및 39에 각각 제시된 VH 및 VL 아미노산 서열을 포함한다. 소정의 구현예에서, VH 및 VL의 아미노산 서열은 서열번호 34 및 35; 36 및 37; 및 38 및 39로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 각각 이루어진다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 결합하기 위해 서열번호 34 및 35; 36 및 37; 또는 38 및 39에 각각 제시된 VH 및 VL 아미노산 서열을 포함하는 다중특이적 분자와 교차 경쟁하는 다중특이적 분자를 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 본원에 기술된 다중특이적 분자, 예를 들어 서열번호 34 및 35; 36 및 37; 또는 38 및 39에 각각 제시된 VH 및 VL 아미노산 서열을 포함하는 다중특이적 분자와 동일하거나 중첩하는 CD96의 에피토프(예를 들어 인간 CD96의 에피토프 또는 시노몰구스 CD96의 에피토프)에 결합하는 다중특이적 분자를 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제2 항원 결합 영역은 서열번호 28, 29, 및 30에 각각 제시된 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제2 항원 결합 영역은 서열번호 31, 32, 및 33에 각각 제시된 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제2 항원 결합 영역은 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 영역을 포함하는 VH, 및 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 영역을 포함하는 VL을 포함하고, CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 영역은 서열번호 28, 29, 30, 31, 32, 및 33에 각각 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제2 항원 결합 영역은 서열번호 40에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%(예를 들어 적어도 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제2 항원 결합 영역은 서열번호 40에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 소정의 구현예에서, VH의 아미노산 서열은 서열번호 40에 제시된 아미노산 서열로 이루어진다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제2 항원 결합 영역은 서열번호 41에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%(예를 들어 적어도 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제2 항원 결합 영역은 서열번호 41에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 소정의 구현예에서, VL의 아미노산 서열은 서열번호 41에 제시된 아미노산 서열로 이루어진다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제2 항원 결합 영역은 서열번호 40에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%(예를 들어 적어도 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 41에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%(예를 들어, 적어도 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제2 항원 결합 영역은 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 소정의 구현예에서, VH의 아미노산 서열은 서열번호 40에 제시된 아미노산 서열로 이루어지고; VL의 아미노산 서열은 서열번호 41에 제시된 아미노산 서열로 이루어진다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제2 항원 결합 영역은 서열번호 40 및 41에 제시된 VH 및 VL 아미노산 서열을 포함한다. 소정의 구현예에서, VH 및 VL의 아미노산 서열은 서열번호 40 및 41에 제시된 아미노산 서열로 각각 이루어진다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 결합하기 위해 서열번호 40 및 41에 각각 제시된 VH 및 VL 아미노산 서열을 포함하는 다중특이적 분자와 교차 경쟁하는 다중특이적 분자를 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 본원에 기술된 다중특이적 분자, 예를 들어 서열번호 40 및 41에 각각 제시된 VH 및 VL 아미노산 서열을 포함하는 다중특이적 분자와 동일하거나 중첩하는 TIGIT의 에피토프(예를 들어 인간 TIGIT의 에피토프 또는 시노몰구스 TIGIT의 에피토프)에 결합하는 다중특이적 분자를 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 분자는 서열번호 10, 11, 및 12; 16, 17, 및 18; 또는 22, 23, 및 24에 각각 제시된 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는 제1 VH를 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 서열번호 28, 29, 및 30에 각각 제시된 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는 제2 VH를 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 분자는 서열번호 13, 14, 및 15; 19, 20, 및 21; 또는 25, 26, 및 27에 각각 제시된 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는 제1 VL을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 서열번호 31, 32, 및 33에 각각 제시된 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는 제2 VL을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 분자는 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 영역을 포함하는 제1 VH, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 영역을 포함하는 제1 VL을 포함하되, CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 영역은 서열번호 10, 11, 12, 13, 14, 및 15; 16, 17, 18, 19, 20, 및 21; 또는 22, 23, 24, 25, 26, 및 27에 각각 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 영역을 포함하는 제2 VH 및 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 영역을 포함하는 제2 VL을 포함하되, CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 영역은 서열번호 28, 29, 30, 31, 32, 및 33에 각각 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 (예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 서열번호 34, 36, 또는 38에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%(예를 들어 적어도 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 VH를 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 서열번호 40에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%(예를 들어, 적어도 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 VH를 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 서열번호 34, 36, 또는 38에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 제1 VH를 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 서열번호 40에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 제2 VH를 포함한다. 소정의 구현예에서, 제1 VH의 아미노산 서열은 서열번호 34, 36, 및 38로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어지고; 제2 VH의 아미노산 서열은 서열번호 40에 제시된 아미노산 서열로 이루어진다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 (예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 서열번호 35, 37, 또는 39에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%(예를 들어 적어도 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 VL을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 서열번호 41에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%(예를 들어, 적어도 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 VL을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 서열번호 35, 37, 또는 39에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 제1 VL을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 서열번호 41에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 제2 VL을 포함한다. 소정의 구현예에서, 제1 VL의 아미노산 서열은 서열번호 35, 37, 및 39로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어지고; 제2 VL의 아미노산 서열은 서열번호 41에 제시된 아미노산 서열로 이루어진다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96 (예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 서열번호 34, 36, 또는 38에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%(예를 들어 적어도 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제1 VH, 및 서열번호 35, 37, 또는 39에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%(예를 들어 적어도 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 VH를 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 서열번호 40에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%(예를 들어 적어도 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 VH, 및 서열번호 41에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%(예를 들어 적어도 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 제2 VL을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 서열번호 34, 36, 또는 38에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 제1 VH, 및 서열번호 35, 37, 또는 39의 아미노산 서열을 포함하는 제1 VL을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 서열번호 40에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 제2 VH, 및 서열번호 41에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 제2 VL을 포함한다. 소정의 구현예에서, 제1 VH의 아미노산 서열은 서열번호 34, 36, 및 38로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어지고; 제1 VL의 아미노산 서열은 서열번호 35, 37, 및 39로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어지고, 제2 VH의 아미노산 서열은 서열번호 40의 아미노산 서열로 이루어지고; 제2 VL의 아미노산 서열은 서열번호 41의 아미노산 서열로 이루어진다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 서열번호 34 및 35; 36 및 37; 또는 38 및 39에 각각 제시된 아미노산 서열을 포함하는 제1 VH 및 제1 VL을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 서열번호 40 및 41에 각각 제시된 아미노산 서열을 포함하는 제2 VH 및 제2 VL을 포함한다. 소정의 구현예에서, 제1 VH 및 제1 VL의 아미노산 서열은 서열번호 34 및 35; 36 및 37; 및 38 및 39의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 각각 이루어지고; 제2 VH 및 제2 VL의 아미노산 서열은 서열번호 40 및 41에 제시된 아미노산 서열로 각각 이루어진다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하고, 서열번호 34 및 35; 36 및 37; 또는 38 및 39에 각각 제시된 VH 및 VL 아미노산 서열을 포함하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하고, 서열번호 40 및 41에 각각 제시된 VH 및 VL 아미노산 서열을 포함하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 본원에 기술된 다중특이적 분자, 예를 들어 서열번호 34 및 35; 36 및 37; 또는 38 및 39에 각각 제시된 VH 및 VL 아미노산 서열을 포함하는 다중특이적 분자와 동일하거나 중첩되는 CD96의 에피토프(예를 들어 인간 CD96의 에피토프 또는 시노몰구스 CD96의 에피토프)에 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 본원에 기술된 다중특이적 분자, 예를 들어 서열번호 40 및 41에 각각 제시된 VH 및 VL 아미노산 서열을 포함하는 다중특이적 분자와 동일하거나 중첩되는 TIGIT의 에피토프(예를 들어 인간 TIGIT의 에피토프 또는 시노몰구스 TIGIT의 에피토프)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공하며, 상기 항체는 서열번호 28, 29, 및 30에 각각 제시된 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공하며, 여기서 단리된 항체는 서열번호 31, 32, 및 33에 각각 제시된 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공하며, 여기서 단리된 항체는 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 영역을 포함하는 VH, 및 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 영역을 포함하는 VL을 포함하고, 여기서 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 영역은 서열번호 28, 29, 30, 31, 32, 및 33에 각각 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공하며, 상기 항체는 서열번호 40에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%(예를 들어, 적어도 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하를 제공하며, 상기 항체는 서열번호 40에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 소정의 구현예에서, VH의 아미노산 서열은 서열번호 40에 제시된 아미노산 서열로 이루어진다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공하며, 상기 항체는 서열번호 41에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%(예를 들어, 적어도 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공하며, 상기 항체는 서열번호 41에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 소정의 구현예에서, VL의 아미노산 서열은 서열번호 41에 제시된 아미노산 서열로 이루어진다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공하며, 상기 항체는 서열번호 40에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%(예를 들어 적어도 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열번호 41에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%(예를 들어, 적어도 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공하며, 상기 항체는 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 소정의 구현예에서, VH의 아미노산 서열은 서열번호 40에 제시된 아미노산 서열로 이루어지고; VL의 아미노산 서열은 서열번호 41에 제시된 아미노산 서열로 이루어진다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공하며, 상기 항체는 서열번호 40 및 41에 각각 제시된 VH 및 VL 아미노산 서열을 포함한다. 소정의 구현예에서, VH 및 VL의 아미노산 서열은 서열번호 40 및 41에 제시된 아미노산 서열로 각각 이루어진다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 결합하기 위해 서열번호 40 및 41에 각각 제시된 VH 및 VL 아미노산 서열을 포함하는 항체와 교차 경쟁하는 단리된 항체를 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 본원에 기술된 항체, 예를 들어 서열번호 40 및 41에 각각 제시된 VH 및 VL 아미노산 서열을 포함하는 항체와 동일하거나 중첩되는 TIGIT의 에피토프(예를 들어 인간 TIGIT의 에피토프 또는 시노몰구스 TIGIT의 에피토프)에 결합하는 단리된 항체를 제공한다.
소정의 구현예에서, 다중특이적 분자 또는 항체의 에피토프는, 예를 들어 NMR 분광학, 표면 플라스몬 공면(BIAcore®), X-선 회절 결정학 연구, ELISA 검정, 질량 분석(예: 액체 크로마토그래피 전기 분무 질량 분석)과 결합된 수소/중수소 교환, 어레이 기반 올리고-펩티드 스캐닝 검정, 및/또는 돌연변이 유발 맵핑(예: 부위-지향적 돌연변이 유발 맵핑)에 의해 결정될 수 있다. X-선 결정학의 경우, 결정화는 당업계에 공지된 임의의 방법(예: Giege R 등의 문헌[(1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4): 339-350]; McPherson A의 문헌[(1990) Eur J Biochem 189: 1-23]; Chayen NE의 문헌[(1997) Structure 5: 1269-1274]; McPherson A의 문헌[(1976) J Biol Chem 251: 6300-6303], 동 문헌 모두는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨) 중 어느 하나를 사용해 이뤄질 수 있다. 다중특이적 분자:항원 결정 또는 항체:항원 결정은 잘 알려진 X-선 회절 기술을 사용하여 연구될 수 있고, X-PLOR과 같은 컴퓨터 소프트웨어를 사용해 정제될 수 있다(Molecular Simulations, Inc.에서 배포한 Yale University의 1992 문헌; 예를 들어 Wyckoff HW 등(편집)의 문헌[Meth Enzymol (1985) volumes 114 & 115]; 미국 특허 출원 제2004/0014194호, 및 BUSTER (Bricogne G의 문헌[(1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1): 37-60]; Bricogne G의 문헌[(1997) Meth Enzymol 276A: 361-423, Carter CW(편집)]; Roversi P 등의 문헌[(2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10): 1316-1323], 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 돌연변이 유발 맵핑 연구는 당업자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 이뤄질 수 있다. 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발 기술을 포함하여, 돌연변이 유발 기술에 대해서는, 예를 들어 Champe M 등의 전술한 (1995) 문헌 및 Cunningham BC & Wells JA의 전술한 (1989) 문헌을 참조한다. 특정 구현예에서, 다중특이적 분자 또는 항체의 에피토프는 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발 연구를 사용하여 결정된다. 또한, CD96(예: 인간 CD96 TIGIT 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)의 동일하거나 중첩되는 에피토프를 인식하고 이에 결합하는 다중특이적 분자 또는 항체는 면역 검정과 같은 일상적인 기술을 사용하여 식별되거나, 예를 들어 다른 다중특이적 분자 또는 항체가 표적 항원에 결합하는 것을 하나의 항체가 차단하는 능력을 나타냄으로써, 즉 경쟁 결합 검정에 의해 식별할 수 있다. 경쟁 결합 검정은 2개의 다중특이적 분자 또는 항체가 에피토프에 대한 유사한 결합 특이성을 갖는지 여부를 결정하는 데 사용될 수도 있다. 경쟁 결합은, 시험 중인 면역글로불린이 기준 다중특이적 분자 또는 항체가 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)와 같은 공통 항원에 특이적으로 결합하는 것을 억제하는 검정에서 결정될 수 있다. 예를 들어, 다음과 같은 많은 유형의 경쟁 결합 검정이 알려져 있으며, 이들 모두는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다: 고상 직간접 방사 면역 검정(solid phase direct or indirect radioimmunoassay, RIA), 고상 직간접 효소 면역 검정(solid phase direct or indirect enzyme immunoassay, EIA), 샌드위치 경쟁 검정(sandwich competition assay; Stahli C 등의 문헌[(1983) Methods Enzymol 9: 242-253] 참조); 고상 직접 비오틴-아비딘 EIA(solid phase direct biotin-avidin EIA; Kirkl및 TN 등의 문헌[(1986) J Immunol 137: 3614-9] 참조); 고상 직접 표지 검정, 고상 직접 표지 샌드위치 검정(solid phase direct labeled assay, solid phase direct labeled sandwich assay; Harlow E & Lane D의 문헌[(1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press] 참조); I-125 표지를 사용하는 고상 직접 표지 RIA(solid phase direct label RIA; Morel GA 등의 문헌[(1988) Mol Immunol 25(1): 7-15] 참조); 고상 직접 비오틴-아비딘 EIA(solid phase direct biotin-avidin EIA (Cheung RC 등의 문헌[(1990) Virology 176: 546-52] 참조); 및 직접 표지 RIA(direct labeled RIA; Moldenhauer G 등의 문헌[(1990) Scand J Immunol 32: 77-82] 참조). 일반적으로, 이러한 검정은 비표지된 면역글로불린과 표지된 기준 면역글로불린 중 하나를 갖는 세포에 결합되거나 또는 고체 표면에 결합된 정제된 항원(예를 들어, 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96과 같은 CD96, 또는 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT와 같은 TIGIT)의 사용을 포함한다. 경쟁적 억제는 테스트 면역 글로불린의 존재 하에 고체 표면이나 세포에 결합된 표지의 양을 알아냄으로써 측정될 수 있다. 일반적으로 시험용 면역 글로불린은 과량으로 존재한다. 일반적으로, 경쟁 다중특이적 분자 또는 항체가 과량으로 존재할 때, 이는 기준 다중특이적 분자 또는 항체가 공통 항원에 특이적으로 결합하는 것을 적어도 50~55%, 55~60%, 60~65%, 65~70%, 70~75% 또는 그 이상 만큼 억제하게 된다. 경쟁 결합 검정은 표지된 항원 또는 표지된 다중특이적 분자 또는 항체를 사용하여 다수의 상이한 포맷으로 구성될 수 있다. 이러한 검정의 공통적 버전에서, 항원은 96-웰 플레이트에 고정된다. 그런 다음, 표지되지 않은 다중특이적 분자 또는 항체가 표지된 항체가 항원에 결합하는 것을 차단하는 능력을 방사성 표지 또는 효소 표지를 사용해 측정한다. 보다 상세한 내용은, 예를 들어 Wagener C 등의 문헌[(1983) J Immunol 130: 2308-2315]; Wagener C 등의 문헌[(1984) J Immunol Methods 68: 269-274]; Kuroki M 등의 문헌[(1990) Cancer Res 50: 4872-4879]; Kuroki M 등의 문헌[(1992) Immunol Invest 21: 523-538]; Kuroki M 등의 문헌[(1992) Hybridoma 11: 391-407] 및 Harlow E & Lane D(편집)의 전술한 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual, 386-389]을 참조하고, 이들 모두는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
소정의 구현예에서, 다중특이적 분자는 인간 CD96이 인간 CD155(폴리오바이러스 수용체(PVR)로도 알려짐)에 결합하는 것을 억제한다. 소정의 구현예에서, 다중특이적 분자가 있을 때 인간 CD155에 대한 인간 CD96의 결합은 다중특이적 분자 항체가 없을 때 인간 CD155에 대한 인간 CD96의 결합에 비해 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%만큼 또는 그 이상 감소된다.
소정의 구현예에서, 다중특이적 분자는 인간 CD96의 가용성 단편이 인간 CD155의 가용성 단편에 결합하는 것을 억제한다. 소정의 구현예에서, 다중특이적 분자가 있을 때 인간 CD155의 가용성 단편에 대한 인간 CD96의 가용성 단편의 결합은 다중특이적 분자가 없을 때 인간 CD155의 가용성 단편에 대한 인간 CD96의 가용성 단편의 결합에 비해 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%만큼 또는 그 이상 감소된다.
소정의 구현예에서, 항체는 인간 CD96-발현 세포가 인간 CD155의 가용성 단편에 결합하는 것을 억제한다. 소정의 구현예에서, 다중특이적 분자가 있을 때 인간 CD155의 가용성 단편에 대한 CD96-발현 세포의 결합은 다중특이적 분자가 없을 때 인간 CD155의 가용성 단편에 대한 CD96-발현 세포의 결합에 비해 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%만큼 또는 그 이상 감소된다.
소정의 구현예에서, 다중특이적 분자는 인간 CD96-발현 세포가 인간 CD155를 발현하는 세포에 결합하는 것을 억제한다. 소정의 구현예에서, 다중특이적 분자가 있을 때 CD155-발현 세포에 대한 CD96-발현 세포의 결합은 다중특이적 분자가 없을 때 CD155-발현 세포에 대한 CD96-발현 세포의 결합에 비해 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%만큼 또는 그 이상 감소된다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 서열번호 1, 3, 5, 또는 67~99에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 소정의 구현예에서, 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 1, 3, 5, 및 67~99로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 서열번호 2, 4, 또는 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 소정의 구현예에서, 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 2, 4, 및 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 서열번호 1 및 2; 3 및 4; 또는 5 또는 6에 제시된 아미노산 서열을 각각 포함하는 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 소정의 구현예에서, 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 1 및 2; 3 및 4; 및 5 및 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 각각 이루어진다.
소정의 구현예에서, 다중특이적 분자는 인간 TIGIT가 인간 CD155(폴리오바이러스 수용체(PVR)로도 알려짐)에 결합하는 것을 억제한다. 소정의 구현예에서, 다중특이적 분자가 있을 때 인간 CD155에 대한 인간 TIGIT의 결합은 다중특이적 분자 항체가 없을 때 인간 CD155에 대한 인간 TIGIT의 결합에 비해 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%만큼 또는 그 이상 감소된다.
소정의 구현예에서, 다중특이적 분자는 인간 TIGIT의 가용성 단편이 인간 CD155의 가용성 단편에 결합하는 것을 억제한다. 소정의 구현예에서, 다중특이적 분자가 있을 때 인간 CD155의 가용성 단편에 대한 인간 TIGIT의 가용성 단편의 결합은 다중특이적 분자가 없을 때 인간 CD155의 가용성 단편에 대한 인간 TIGIT의 가용성 단편의 결합에 비해 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%만큼 또는 그 이상 감소된다.
소정의 구현예에서, 다중특이적 분자는 TIGIT-발현 세포가 인간 CD155의 가용성 단편에 결합하는 것을 억제한다. 소정의 구현예에서, 다중특이적 분자가 있을 때 인간 CD155의 가용성 단편에 대한 TIGIT-발현 세포의 결합은 다중특이적 분자가 없을 때 인간 CD155의 가용성 단편에 대한 TIGIT-발현 세포의 결합에 비해 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%만큼 또는 그 이상 감소된다.
소정의 구현예에서, 다중특이적 분자는 인간 TIGIT-발현 세포가 인간 CD155를 발현하는 세포에 결합하는 것을 억제한다. 소정의 구현예에서, 다중특이적 분자가 있을 때 CD155-발현 세포에 대한 TIGIT-발현 세포의 결합은 다중특이적 분자가 없을 때 CD155-발현 세포에 대한 TIGIT-발현 세포의 결합에 비해 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%만큼 또는 그 이상 감소된다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제2 항원 결합 영역은 서열번호 7 또는 100~110에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 소정의 구현예에서, 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 7 및 100~110으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제2 항원 결합 영역은 서열번호 8 또는 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 소정의 구현예에서, 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 8 및 9로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제2 항원 결합 영역은 서열번호 7 및 8; 또는 7 및 9에 제시된 아미노산 서열을 각각 포함하는 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 소정의 구현예에서, 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 7 및 8; 및 7 및 9로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 각각 이루어진다.
소정의 구현예에서, 다중특이적 분자는 인간 CD96 및 인간 TIGIT가 인간 CD155(폴리오바이러스 수용체(PVR)로도 알려짐)에 결합하는 것을 억제한다. 소정의 구현예에서, 다중특이적 분자가 있을 때 인간 CD155에 대한 인간 CD96 및 인간 TIGIT의 결합은 다중특이적 분자 항체가 없을 때 인간 CD155에 대한 인간 CD96 및 인간 TIGIT의 결합에 비해 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%만큼 또는 그 이상 감소된다.
소정의 구현예에서, 다중특이적 분자는 인간 CD96의 가용성 단편 및 인간 TIGIT의 가용성 단편이 인간 CD155의 가용성 단편에 결합하는 것을 억제한다. 소정의 구현예에서, 다중특이적 분자가 있을 때 인간 CD155의 가용성 단편에 대한 인간 CD96의 가용성 단편 및 인간 TIGIT의 가용성 단편의 결합은 다중특이적 분자가 없을 때 인간 CD155의 가용성 단편에 대한 인간 CD96의 가용성 단편 및 인간 TIGIT의 가용성 단편의 결합에 비해 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%만큼 또는 그 이상 감소된다.
소정의 구현예에서, 다중특이적 분자는 CD96, TIGIT, 또는 CD96과 TIGIT를 발현하는 세포가 인간 CD155의 가용성 단편에 결합하는 것을 억제한다. 소정의 구현예에서, 다중특이적 분자가 있을 때 인간 CD155의 가용성 단편에 대한 CD96, TIGIT, 또는 CD96과 TIGIT를 발현하는 세포의 결합은 다중특이적 분자가 없을 때 인간 CD155의 가용성 단편에 대한 CD96, TIGIT, 또는 CD96과 TIGIT를 발현하는 세포의 결합에 비해 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%만큼 또는 그 이상 감소된다.
소정의 구현예에서, 다중특이적 분자는 CD96, TIGIT, 또는 CD96과 TIGIT를 발현하는 세포가 인간 CD155를 발현하는 세포에 결합하는 것을 억제한다. 소정의 구현예에서, 다중특이적 분자가 있을 때 CD155-발현 세포에 대한 CD96, TIGIT, 또는 CD96과 TIGIT를 발현하는 세포의 결합은 다중특이적 분자가 없을 때 CD155-발현 세포에 대한 CD96, TIGIT, 또는 CD96과 TIGIT를 발현하는 세포의 결합에 비해 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%만큼 또는 그 이상 감소된다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 서열번호 1, 2, 3, 또는 67~99에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄를 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 서열번호 7 또는 100~110에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄를 포함한다. 소정의 구현예에서, 제1 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 1, 2, 3, 및 67~99로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어지고, 제2 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 7 및 100~110으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 서열번호 2, 4, 또는 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄를 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 서열번호 8 또는 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함한다. 소정의 구현예에서, 제1 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 2, 4, 및 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어지고, 제2 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 8 및 9로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 서열번호 1 및 2; 3 및 4; 또는 5 및 6에 각각 제시된 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄 및 제1 경쇄를 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 서열번호 7 및 8; 또는 7 및 9에 각각 제시된 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄 및 제2 경쇄를 포함한다. 소정의 구현예에서, 제1 중쇄 및 제1 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 1 및 2; 3 및 4; 및 5 및 6으로부터 선택된 아미노산 서열로 각각 이루어지고; 제2 중쇄 및 제2 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 7 및 8; 또는 7 및 9의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 각각 이루어진다.
소정의 구현예에서, 항체는 인간 TIGIT가 인간 CD155(폴리오바이러스 수용체(PVR)로도 알려짐)에 결합하는 것을 억제한다. 소정의 구현예에서, 인간 CD155에 대한 인간 TIGIT의 결합은 항체가 없을 때 인간 CD155에 대한 인간 TIGIT의 결합에 비해 항체가 있을 때 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%만큼 또는 그 이상 감소된다.
소정의 구현예에서, 항체는 인간 TIGIT의 가용성 단편이 인간 CD155의 가용성 단편에 결합하는 것을 억제한다. 소정의 구현예에서, 인간 CD155의 가용성 단편에 대한 인간 TIGIT의 가용성 단편의 결합은 항체가 없을 때 인간 CD155의 가용성 단편에 대한 인간 TIGIT의 가용성 단편의 결합에 비해 항체가 있을 때 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%만큼 또는 그 이상 감소된다.
소정의 구현예에서, 항체는 TIGIT-발현 세포가 인간 CD155의 가용성 단편에 결합하는 것을 억제한다. 소정의 구현예에서, 인간 CD155의 가용성 단편에 대한 TIGIT-발현 세포의 결합은 항체가 없을 때 인간 CD155의 가용성 단편에 대한 TIGIT-발현 세포의 결합에 비해 항체가 있을 때 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%만큼 또는 그 이상 감소된다.
소정의 구현예에서, 항체는 TIGIT-발현 세포가 인간 CD155를 발현하는 세포에 결합하는 것을 억제한다. 소정의 구현예에서, 항체가 있을 때 CD155-발현 세포에 대한 TIGIT-발현 세포의 결합은 항체가 없을 때 CD155-발현 세포에 대한 TIGIT-발현 세포의 결합에 비해 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%만큼 또는 그 이상 감소된다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공하며, 상기 항체는 서열번호 107, 108, 109, 또는 110에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 소정의 구현예에서, 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 107, 108, 109, 또는 110에 제시된 아미노산 서열로 이루어진다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공하며, 상기 항체는 서열번호 8 또는 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 소정의 구현예에서, 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 8 및 9로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공하며, 상기 항체는 서열번호 107 및 8; 107 및 9; 108 및 8; 108 및 9; 109 및 8; 109 및 9; 110 및 8; 또는 110 및 9의 아미노산 서열을 각각 포함하는 중쇄 및 경쇄를 포함한다.
소정의 구현예에서, 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 107 및 8; 107 및 9; 108 및 8; 108 및 9; 109 및 8; 109 및 9; 110 및 8; 또는 110 및 9로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 각각 이루어진다.
소정의 구현예에서, 본원에 개시된 다중특이적 분자 또는 항체는 세포독성제, 세포증식억제제, 독소, 방사성 핵종, 또는 검출 가능한 표지에 접합된다. 소정의 구현예에서, 세포독성제는 이와 접촉하는 세포의 사멸 또는 파괴를 유도할 수 있다. 소정의 구현예에서, 세포증식억제제는 이와 접촉하는 세포의 증식을 방지하거나 실질적으로 감소시킬 수 있고/있거나 이와 접촉하는 세포의 활성 또는 기능을 억제할 수 있다. 소정의 구현예에서, 세포독성제 또는 세포증식억제제는 화학요법제이다. 소정의 구현예에서, 방사성 핵종은 동위원소 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 67Cu, 90Y, 99Tc, 111In, 117Lu, 121I, 124I, 125I, 131I, 198Au, 211At, 213Bi, 225Ac, and 186Re로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정의 구현예에서, 검출 가능한 표지는 형광 모이어티 또는 클릭 화학 핸들을 포함한다.
임의의 면역글로불린(Ig) 불변 영역이 본원에 개시된 다중특이적 분자 또는 항체에 사용될 수 있다. 소정의 구현예에서, Ig 영역은 인간 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 또는 IgY 면역 글로불린 분자, 면역 글로불린 분자의 임의의 부류(예: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2), 또는 면역 글로불린 분자의 임의의 하위 부류(예: IgG2a 및 IgG2b)이다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 서열번호 49~60 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제2 항원 결합 영역은 서열번호 49~60 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 서열번호 43 또는 44의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 서열번호 43 또는 44의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공하며, 상기 항체는 서열번호 57, 58, 59, 또는 60의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공하며, 상기 항체는 서열번호 43 또는 44의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본원에 기술된 다중특이적 분자 또는 항체의 하나 이상의 기능적 특성, 예컨대 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합, 및/또는 항원 의존적 세포 독성을 변경하기 위해, 1개, 2개, 또는 그 이상의 돌연변이(예: 아미노산 치환)가 본원에 기술된 다중특이적 분자 또는 항체의 Fc 영역(예: CH2 도메인(인간 IgG1의 잔기 231~340) 및/또는 CH3 도메인(인간 IgG1의 잔기 341~447) 및/또는 힌지 영역(잔기 216~230))에 도입된다(잔기는 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링됨).
소정의 구현예에서, 예를 들어 미국 특허 제5,677,425호(그 전체가 참조로서 본원에 통합됨)에 기술된 것과 같이 힌지 영역 내 시스테인 잔기의 수가 변경되도록(예를 들어 증가하거나 감소하도록), 1개, 2개, 또는 그 이상의 돌연변이(예: 아미노산 치환)가 본원에 기술된 다중특이적 분자 또는 항체의 힌지 영역 내로 도입된다. 힌지 영역 내 시스테인 잔기의 수는, 예를 들어 경쇄 및 중쇄의 조립을 용이하게 하거나 다중특이적 분자 또는 항체의 안정성을 변경하도록(예를 들어 증가시키거나 감소시키도록) 변경될 수 있다.
특정 구현예에서, 생체 내에서 다중특이적 분자 또는 항체의 반감기를 변경시키기 위해(예를 들어 감소시키거나 증가시키기 위해), 1개, 2개, 또는 그 이상의 아미노산 돌연변이(예: 치환, 삽입, 또는 결실)가 IgG 불변 영역, 또는 이의 FcRn-결합 단편 내로 (바람직하게는 Fc 또는 힌지-Fc 단편 내로) 도입된다. 생체 내에서 다중특이적 분자 또는 항체의 반감기를 변경(예: 감소 또는 증가)시킬 돌연변이의 예에 대해서는, 예를 들어, 국제 공개 제WO 02/060919호; 제WO 98/23289호; 및 제WO 97/34631호; 및 미국 특허 제5,869,046호, 제6,121,022호, 제6,277,375호, 및 제6,165,745호를 참조하고, 이들 모두는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 소정의 구현예에서, 생체 내에서 다중특이적 분자 또는 항체의 반감기를 감소시키기 위해, 1개, 2개, 또는 그 이상의 아미노산 돌연변이(즉, 치환, 삽입 또는 결실)가 IgG 불변 영역 또는 이의 FcRn-결합 단편 내로 (바람직하게는, Fc 또는 힌지-Fc 단편 내로) 도입된다. 다른 구현예에서, 생체 내에서 다중특이적 분자 또는 항체의 반감기를 증가시키기 위해, 1개, 2개, 또는 그 이상의 아미노산 돌연변이(즉, 치환, 삽입, 또는 결실)가 IgG 불변 영역 또는 이의 FcRn-결합 단편 내로 (바람직하게는, Fc 또는 힌지-Fc 단편 내로) 도입된다. 특정 구현예에서, 다중특이적 분자 또는 항체는 하나 이상의 아미노산 돌연변이(예: 치환)를 제2 불변(CH2) 도메인(인간 IgG1의 잔기 231~340) 및/또는 제3 불변(CH3) 도메인(인간 IgG1의 잔기 341~447)에 가질 수 있다(잔기는 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링됨). 특정 구현예에서, 본원에 기술된 다중특이적 분자 또는 항체의 IgG1의 불변 영역은 위치 252에서 메티오닌(M)에서 티로신(Y)으로의 치환, 위치 254에서 세린(S)에서 트레오닌(T)으로의 치환, 및 위치 256에서 트레오닌(T)에서 글루탐산(E)으로의 치환을 포함한다(메티오닌(M), 티로신(Y), 세닐(S), 트레오닌(T), 클루탐산(E)은 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링 됨). 미국 특허 제7,658,921호를 참조하고, 동 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. "YTE 돌연변이체"로서 지칭되는 이러한 유형의 돌연변이체 IgG는 동일한 다중특이적 분자 또는 항체의 야생형 버전과 비교하여 4배 증가된 반감기를 나타내는 것으로 나타났다(Dall'Acqua WF 등의 문헌[(2006) J Biol Chem 281: 23514-24]을 참조하고, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 소정의 구현예에서, 다중특이적 분자 또는 항체는 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 위치 251~257, 285~290, 308~314, 385~389, 및 428~436에서 아미노산 잔기의 1개, 2개, 3개, 또는 그 이상의 아미노산 치환을 포함하는 IgG 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 작동자 세포 표면 상의 Fc 수용체(예: 활성화된 Fc 수용체)에 대한 다중특이적 분자 또는 항체의 친화도를 증가시키거나 감소시키기 위해, 1개, 2개, 또는 그 이상의 돌연변이(예: 아미노산 치환)가 본원에서 기술된 다중특이적 분자 또는 항체의 Fc 영역(예: CH2 도메인(인간 IgG1의 잔기 231~340) 및/또는 CH3 도메인(인간 IgG1의 잔기 341~447) 및/또는 힌지 영역(잔기 216~230) 내로 도입된다(잔기는 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링됨). Fc 수용체에 대한 다중특이적 분자 또는 항체의 친화도를 감소시키거나 증가시키는 다중특이적 분자 또는 항체의 Fc 영역 내의 돌연변이, 및 이러한 돌연변이를 Fc 수용체 또는 이의 단편에 도입하는 기술은 당업자에게 공지되어 있다. Fc 수용체에 대한 항체의 친화도를 변경시킬 수 있는 다중특이적 분자 또는 항체의 Fc 수용체 내의 돌연변이의 예는, 예를 들어 Smith P 등의 문헌[(2012) PNAS 109: 6181-6186]; 미국 특허 제6,737,056호; 및 국제 공개 제WO 02/060919호; 제WO 98/23289호; 및 제WO 97/34631호에 기술되어 있으며, 이들 문헌 모두는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
소정의 구현예에서, 다중특이적 분자 또는 항체는 야생형 중쇄 불변 영역의 변이체인 중쇄 불변 영역을 포함하며, 여기서 변이체 중쇄 불변 영역은 야생형 중쇄 불변 영역이 FcγRIIB에 결합하는 것보다 더 높은 친화도로 FcγRIIB에 결합한다. 소정의 구현예에서, 변이체 중쇄 불변 영역은 변이체 인간 중쇄 불변 영역, 예를 들어 변이체 인간 IgG1, 변이체 인간 IgG2, 또는 변이체 인간 IgG4 중쇄 불변 영역이다. 소정의 구현예에서, 변이체 인간 IgG 중쇄 불변 영역은 EU 넘버링 시스템에 따른 다음 아미노산 돌연변이 중 하나 이상을 포함한다: G236D, P238D, S239D, S267E, L328F, 및 L328E. 소정의 구현예에서, 변이체 인간 IgG 중쇄 불변 영역은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 돌연변이 세트를 포함한다: (EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된) S267E 및 L328F; P238D 및 L328E; P238D 및 E233D, G237D, H268D, P271G, 및 A330R로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환; P238D, E233D, G237D, H268D, P271G, 및 A330R; G236D 및 S267E; S239D 및 S267E; V262E, S267E, 및 L328F; 및 V264E, S267E, 및 L328F. 소정의 구현예에서, FcγRIIB는 대식세포, 단핵구, B 세포, 수지상 세포, 내피 세포, 및 활성화된 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포에서 발현된다.
추가의 구현예에서, 다중특이적 분자 또는 항체의 작동자 기능(들)을 변경시키기 위해 1개, 2개, 또는 그 이상의 아미노산 치환이 IgG 불변 영역 Fc 영역에 도입된다. 예를 들어, 다중특이적 분자 또는 항체가 작동자 리간드에 대해 변경된 친화성을 갖되 부모 다중특이적 분자 또는 항체의 항원 결합 능력을 유지하도록, EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링 된 아미노산 잔기 234, 235, 236, 237, 239, 243, 267, 292, 297, 300, 318, 320, 322, 328, 330, 332, 및 396으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산이 상이한 아미노산 잔기로 치환될 수 있다. 친화도가 변경된 작동자 리간드는, 예를 들어, Fc 수용체이거나 보체의 C1 성분일 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 제5,624,821호 및 제5,648,260호에 더 상세히 기술되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 소정의 구현예에서, (점 돌연변이 또는 다른 수단을 통한) 불변 영역 도메인의 결실 또는 불활성화는 순환하는 다중특이적 분자 또는 항체의 Fc 수용체 결합을 감소시켜 종양의 국지화를 증가시킨다. 불변 영역을 결실시키거나 불활성화시켜 종양 국지화를 증가시키는 돌연변이에 대한 설명은 예를 들어 미국 특허 제5,585,097호 및 제8,591,886호를 참조하고, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 소정의 구현예에서, Fc 수용체 결합을 감소시킬 수 있는 Fc 영역 상의 잠재적인 글리코실화 영역을 제거하기 위해, 하나 이상의 아미노산 치환이 본원에 기술된 다중특이적 분자 또는 항체의 Fc 영역에 도입될 수 있다(예를 들어, Shields RL 등의 문헌[(2001) J Biol Chem 276: 6591-604]를 참조하고, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 다양한 구현예에서, 본원에 기술된 다중특이적 분자 또는 항체의 불변 영역에서 다음 돌연변이 중 하나 이상이 만들어질 수 있다: (EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된) N297A 치환; N297Q 치환; L234A 치환; L234F 치환; L235A 치환; L235F 치환; L235V 치환; L237A 치환; S239D 치환; E233P 치환; L234V 치환; L235A 치환; C236 결실; P238A 치환; S239D 치환; F243L 치환; D265A 치환; S267E 치환; L328F 치환; R292P 치환; Y300L 치환; A327Q 치환; P329A 치환; A330L 치환; I332E 치환; 또는 P396L 치환.
소정의 구현예에서, EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 D265A, P329A, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이가 본원에 기술된 다중특이적 분자 또는 항체의 불변 영역에서 만들어질 수 있다. 소정의 구현예에서, EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 L235A, L237A, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이가 본원에 기술된 다중특이적 분자 또는 항체의 불변 영역에서 만들어질 수 있다. 소정의 구현예에서, EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 S267E, L328F, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이가 본원에 기술된 다중특이적 분자 또는 항체의 불변 영역에서 만들어질 수 있다. 소정의 구현예에서, EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 S239D, I332E, 임의로 A330L, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이가 본원에 기술된 다중특이적 분자 또는 항체의 불변 영역에서 만들어질 수 있다. 소정의 구현예에서, EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 L235V, F243L, R292P, Y300L, P396L, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이가 본원에 기술된 다중특이적 분자 또는 항체의 불변 영역에서 만들어질 수 있다. 소정의 구현예에서, EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 S267E, L328F, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이가 본원에 기술된 다중특이적 분자 또는 항체의 불변 영역에서 만들어질 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 다중특이적 분자 또는 항체는, EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링 된 N297Q 또는 N297A 아미노산 치환을 갖는 IgG1의 불변 영역을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본원에 기술된 다중특이적 분자 또는 항체는 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 D265A, P329A, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이를 갖는 IgG1의 불변 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 다중특이적 분자 또는 항체는 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 L234A, L235A, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이를 갖는 IgG1의 불변 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기술된 다중특이적 분자 또는 항체는 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 L234F, L235F, N297A, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이를 갖는 IgG1의 불변 영역을 포함한다. 소정의 구현예에서, 인간 IgG1 중쇄 내에서 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 위치 L234, L235, 및 D265 위치에 상응하는 위치에서 본원에 기술된 다중특이적 분자 또는 항체의 불변 영역의 아미노산 잔기는 각각 L이 아니고, L이고, D이다. 이러한 접근법은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된 국제 공개 제WO 14/108483호에 상세히 기술되어 있다. 소정의 구현예에서, 인간 IgG1 중쇄 내에서 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 위치 L234, L235, 및 D265에 상응하는 아미노산은 각각 F, E, 및 A이거나; A, A, 및 A이다.
소정의 구현예에서, 다중특이적 분자 또는 항체가 변경된 C1q 결합을 갖고/갖거나 감소되거나 파괴된 보체 의존성 세포 독성(CDC)를 갖도록, 본원에 기술된 다중특이적 분자 또는 항체의 불변 영역 내의 아미노산 잔기 329, 331, 및 322(EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링 됨)로부터 선택된 하나 이상의 아미노산이 상이한 아미노산 잔기로 치환될 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 제6,194,551호(Idusogie 등)에 더 상세히 기술되어 있으며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 소정의 구현예에서, 본원에 기술된 다중특이적 분자 또는 항체의 CH2 도메인의 N-말단 영역 내의 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링됨 아미노산 위치 231~238에 있는 하나 이상의 아미노산 잔기가 변경되어 보체에 결합하는 다중특이적 분자 또는 항체의 능력을 변경시킨다. 이러한 접근법은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된 국제 공개 제WO 94/29351호에 추가로 기술되어 있다. 소정의 구현예에서, 본원에 기술된 다중특이적 분자 또는 항체의 Fc 영역은 항체 의존적 세포 세포독성(ADCC)을 매개하는 다중특이적 분자 또는 항체의 능력을 증가시키고/시키거나, EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 다음 위치에서 하나 이상의 아미노산을 돌연변이시킴으로써 (예를 들어 아미노산 치환을 도입함으로써) Fcg 수용체에 대한 항체의 친화도를 증가시키도록 변형된다: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438, 또는 439. 이러한 접근법은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된 국제 공개 제WO 00/42072호에 추가로 기술되어 있다.
소정의 구현예에서, 본원에 기술된 다중특이적 분자 또는 항체는 IgG1의 변형된 불변 영역을 포함하며, 여기서 변형은 항체 의존적 세포 세포독성(ADCC)을 매개하는 다중특이적 분자 또는 항체의 능력을 증가시킨다. 소정의 구현예에서, 0.1, 1, 또는 10 μg/mL의 다중특이적 분자 또는 항체는, 본원에 기술된 방법 및/또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 1, 2, 또는 3시간 이내에 CD96-발현 세포 및/또는 TIGIT-발현 세포의 적어도 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 또는 60%의 세포 사멸을 유도할 수 있다. 소정의 구현예에서, IgG1의 변형된 불변 영역은 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 S239D 및 I332E 치환을 포함한다. 소정의 구현예에서, IgG1의 변형된 불변 영역은 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 S239D, A330L, 및 I332E 치환을 포함한다. 소정의 구현예에서, IgG1의 변형된 불변 영역은 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 L235V, F243L, R292P, Y300L, 및 P396L 치환을 포함한다. 소정의 구현예에서, 항체는 작동자 T 세포 및 Treg에서 세포 사멸을 유도할 수 있으며, 여기서 세포 사멸을 거치는 Treg의 백분율은 세포 사멸을 거치는 작동자 T 세포의 백분율보다 적어도 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 또는 5배만큼 더 높다.
소정의 구현예에서, 본원에 기술된 다중특이적 분자는 제1 및 제2 중쇄 불변 영역을 포함하되, 제1 중쇄 불변 영역 및 제2 중쇄 불변 영역은 상이한 아미노산 치환을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT와 같은 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이를 포함하지 않는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT와 같은 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D 및 I332E 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이를 포함하지 않는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT와 같은 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이를 포함하지 않는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT와 같은 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D 및 I332E 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT와 같은 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT와 같은 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D 및 I332E 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT와 같은 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D 및 I332E 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT와 같은 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT와 같은 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D 및 I332E 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT와 같은 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이를 포함하지 않는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT와 같은 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이를 포함하지 않는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D 및 I332E 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT와 같은 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이를 포함하지 않는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96과 같은 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이를 포함하지 않는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96과 같은 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D 및 I332E 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이를 포함하지 않는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96과 같은 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이를 포함하지 않는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96과 같은 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D 및 I332E 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96과 같은 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96과 같은 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D 및 I332E 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96과 같은 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D 및 I332E 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96과 같은 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96과 같은 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D 및 I332E 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96과 같은 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이를 포함하지 않는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96과 같은 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이를 포함하지 않는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D 및 I332E 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96과 같은 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, CD96 및/또는 TIGIT에 결합되는 다중특이적 분자는, T366W 돌연변이를 "노브 사슬"에 포함하고 T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 "홀 사슬"에 포함하는 "노브-인투-홀" 돌연변이를 포함하고; 예를 들어 Y349C 돌연변이를 "노브 사슬"에 도입하고 E356C 돌연변이 또는 S354C 돌연변이를 "홀 사슬"에 도입하고; R409D, K370E 돌연변이를 "노브 사슬"에 포함하고 D399K, E357K 돌연변이를 "홀 사슬"에 포함하고; R409D, K370E 돌연변이를 "노브 사슬"에 포함하고 D399K, E357K 돌연변이를 "홀 사슬"에 포함하고; T366W 돌연변이를 "노브 사슬"에 포함하고 T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 "홀 사슬"에 포함하고; R409D, K370E 돌연변이를 "노브 사슬"에 포함하고 D399K, E357K 돌연변이를 "홀 사슬"에 포함하고; Y349C, T366W 돌연변이를 사슬들 중 하나에 포함하고 E356C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 상대측 사슬에 포함하고; Y349C, T366W 돌연변이를 하나의 사슬에 포함하고 S354C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 상대측 사슬에 포함하고; Y349C, T366W 돌연변이를 하나의 사슬에 포함하고 S354C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 상대측 사슬에 포함하고; Y349C, T366W 돌연변이를 하나의 사슬에 포함하고 S354C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 상대측 사슬에 포함함으로써 임의로 추가의 사슬간 이황화 브리지를 CH3 도메인 사이에 포함한다(돌연변이 명칭은 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링 됨).
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT와 같은 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 T366W 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT와 같은 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 T366W 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96과 같은 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 T366W 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96와 같은 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 T366W 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본원에 기술된 다중특이적 분자는 제1 및 제2 중쇄 불변 영역을 포함하되, 제1 중쇄 불변 영역 및 제2 중쇄 불변 영역은 노브-인투-홀 치환을 포함하고, 제1 항원 결합 영역 및 제2 항원 결합 영역이 상이한 추가의 아미노산 치환을 추가로 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT와 같은 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 T366W 돌연변이를 포함하지만 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이는 포함하지 않는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT와 같은 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D, I332E, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 T366W 돌연변이를 포함하지만 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이는 포함하지 않는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT와 같은 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D, A330L, I332E, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 T366W 돌연변이를 포함하지만 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이는 포함하지 않는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT와 같은 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D, I332E, 및 T366W 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT와 같은 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D, A330L, I332E, 및 T366W 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT와 같은 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D, I332E, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D 및 T366W 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT와 같은 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D, I332E, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D, A330L, I332E, 및 T366W 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT와 같은 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D, A330L, I332E, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D 및 T366W 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT와 같은 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D, A330L, I332E, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D, I332E, 및 T366W 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT와 같은 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하지만 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이는 포함하지 않는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D 및 T366W 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT와 같은 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하지만 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이는 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D, I332E, 및 T366W 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT와 같은 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하지만 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이는 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D, A330L, I332E, 및 T366W 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT와 같은 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D 및 T366W 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하지만 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이는 포함하지 않는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT와 같은 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D, I332E, 및 T366W 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하지만 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이는 포함하지 않는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT와 같은 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D, A330L, I332E, 및 T366W 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하지만 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이는 포함하지 않는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT와 같은 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D 및 T366W 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D, I332E, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT와 같은 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D 및 T366W 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D, A330L, I332E, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT와 같은 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D, I332E, 및 T366W 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT와 같은 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D, I332E, 및 T366W 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D, A330L, I332E, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT와 같은 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D, A330L, I332E, 및 T366W 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT와 같은 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D, A330L, I332E, 및 T366W 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D, I332E, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT와 같은 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 T366W 돌연변이를 포함하지만 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이는 포함하지 않는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT와 같은 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 T366W 돌연변이를 포함하지만 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이는 포함하지 않는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D, I332E, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CD96 이외의 항원(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT와 같은 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 T366W 돌연변이를 포함하지만 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이는 포함하지 않는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D, A330L, I332E, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96과 같은 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 T366W 돌연변이를 포함하지만 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이는 포함하지 않는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96과 같은 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D, I332E, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 T366W 돌연변이를 포함하지만 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이는 포함하지 않는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96과 같은 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D, A330L, I332E, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 T366W 돌연변이를 포함하지만 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이는 포함하지 않는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96과 같은 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D, A330L, I332E, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D, I332E, 및 T366W 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96과 같은 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D, A330L, I332E, 및 T366W 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96과 같은 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D, I332E, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D 및 T366W 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96과 같은 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D, I332E, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D, A330L, I332E, 및 T366W 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96과 같은 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D, A330L, I332E, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D 및 T366W 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96과 같은 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D, I332E, 및 T366W 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96과 같은 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하지만 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이는 포함하지 않는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D 및 T366W 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96과 같은 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하지만 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이는 포함하지 않는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D, I332E, 및 T366W 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96과 같은 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하지만 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이는 포함하지 않는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D, A330L, I332E, 및 T366W 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96과 같은 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D 및 T366W 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하지만 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이는 포함하지 않는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96과 같은 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D, I332E, 및 T366W 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하지만 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이는 포함하지 않는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96과 같은 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D, A330L, I332E, 및 T366W 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하지만 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이는 포함하지 않는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96과 같은 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D 및 T366W 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D, I332E, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96과 같은 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D 및 T366W 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D, A330L, I332E, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96과 같은 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D, I332E, 및 T366W 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96과 같은 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D, I332E, 및 T366W 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D, A330L, I332E, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96과 같은 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D, A330L, I332E, 및 T366W 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96과 같은 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 S239D, A330L, I332E, 및 T366W 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D, I332E, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96과 같은 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 T366W 돌연변이를 포함하지만 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이는 포함하지 않는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96과 같은 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 T366W 돌연변이를 포함하지만 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이는 포함하지 않는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D, I332E, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT 이외의 항원(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96과 같은 CD96)에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 TIGIT(예: 인간 TIGT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 제1 항원 결합 영역은 T366W 돌연변이를 포함하지만 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이는 포함하지 않는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 제2 항원 결합 영역은 S239D, A330L, I332E, T366S, L368A, 및 Y407V 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본원에 기술된 다중특이적 분자 또는 항체는 IgG4 항체의 불변 영역을 포함하고, EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링 된 중쇄의 아미노산 잔기 228에서 세린(serine)은 프롤린(proline)으로 치환된다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 다중특이적 분자를 제공하며, 여기서 항체는 서열번호 49~60 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본원에 기술된 불변 영역 돌연변이 또는 변형 중 어느 하나는 2개의 중쇄 불변 영역을 갖는 본원에 기술된 다중특이적 분자 또는 항체의 중쇄 불변 영역 중 하나 또는 둘 다에 도입될 수 있다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하고 길항제로서 기능하는(예를 들어 CD96 활성을 감소시키거나 억제하는) 다중특이적 분자를 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하고, 본원에 기술된 방법 및/또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 없거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 있는 경우의 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 활성에 비해 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 활성을 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 만큼 감소시키거나 억제하는 다중특이적 분자를 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하고, 본원에 기술된 방법 및/또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 없거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 CD96(예를 들어 인간 CD96)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 있는 경우의 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 활성에 비해 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 활성을 적어도 약 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 또는 그 이상 감소시키거나 억제하는 다중특이적 분자를 제공한다. CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 활성의 비제한적인 예는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 신호 전달; CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)이 이의 리간드(예를 들어 CD155) 또는 이의 단편 및/또는 융합 단백질에 결합하는 것; T 세포(예를 들어 인간 CD96을 발현하는 T 세포)의 활성화; 자연 살해(NK) 세포의 활성화; Treg의 감소 또는 억제; 사이토카인(예를 들어 IL-2) 생산의 증가; CD155(예를 들어 인간 CD155)의 활성 증가를 포함한다. 특정 구현예에서, CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 활성의 증가는 실시예에 기술된 것과 같이 평가된다.
특정 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하고, 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 없거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 있는 경우에, CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)이 이의 리간드에 결합하는 것에 비해 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)이 이의 리간드(예: CD155)에 결합하는 것을 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 만큼 감소시키거나 억제하는 다중특이적 분자를 제공한다. 특정 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하고, 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 없거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하지 않는 항체)가 있는 경우에, CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)이 이의 리간드(예를 들어 CD155) 또는 이의 단편 및/또는 융합 단백질에 결합하는 것에 비해 CD96(예: 인간 또는 시노몰구스 CD96)이 이의 리간드(예: CD155(예: 인간 또는 시노몰구스 CD155))에 결합하는 것을 적어도 약 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 또는 100배만큼 증가시키는 다중특이적 분자를 제공한다.
특정 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하고 T 세포(예: 인간 CD96을 발현하는 T 세포)를 활성화하는 다중특이적 분자를 제공한다. 소정의 구현예에서, T 세포는 기억 T 세포이다. 소정의 구현예에서, T 세포는 일차 CD3-발현 T 세포이다. 소정의 구현예에서, T 세포는 CD96-발현 Jurkat 세포이다. 소정의 구현예에서, 본원에 개시된 다중특이적 분자는, 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 없거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 있는 경우에 활성화된 T 세포의 핵 인자(NFAT)의 활성에 비해 NAFT의 활성을 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%만큼 증가시킨다. 소정의 구현예에서, 본원에 개시된 다중특이적 분자는 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 있거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 있는 경우의 NFAT 활성에 비해 NFAT의 활성을 적어도 약 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 또는 100배 또는 그 이상만큼 증가시킨다. 소정의 구현예에서, 다중특이적 분자는 CD96의 리간드(예를 들어 CD155) 또는 CD96의 단편 및/또는 융합 단백질, 및/또는 CD96의 리간드를 발현하는 세포(예를 들어 단핵구 또는 수지상 세포)가 존재할 때 NFAT 활성을 증가시킨다.
특정 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하고, 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 있거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 있는 경우의 사이토카인 생산에 비해 사이토카인 생산(예: IL-2)을 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%만큼 증가시키는 다중특이적 분자를 제공한다. 특정 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하고, 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 없거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 CD96(예: 인간 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 있는 경우의 사이토카인 생산에 비해 사이토카인 생산(예를 들어 IL-2)을 적어도 약 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 또는 그 이상 증가시키는 다중특이적 분자를 제공한다. 소정의 구현예에서, 다중특이적 분자는 CD96의 리간드(예를 들어 CD155) 또는 CD96의 단편 및/또는 융합 단백질, 및/또는 CD96의 리간드를 발현하는 세포(예를 들어 단핵구 또는 수지상 세포)가 존재할 때 사이토카인(예를 들어 IL-2) 생산을 증가시킨다. 소정의 구현예에서, 다중특이적 분자는 임의의 다중특이적 분자가 없거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 CD96(예: 인간 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 있는 경우의 IL-2 생산에 비해 IL-2의 생산을 증가시킨다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하고, 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 없거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 있는 경우에 IFNγ 및/또는 IL-2 생산에 비해, 포도상구균 내독소 A(SEA) 자극에 반응하여 단독으로 또는 항-PD-1 항체(예를 들어 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙)와 함께 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 IFNγ 및/또는 IL-2 생산을 적어도 약 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 또는 100배만큼 증가시키는 다중특이적 분자를 제공한다.
소정의 구현예에서, CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하는 본원에 기술된 항체가 존재하는 가운데 포도상구균 내독소 A(SEA)로 자극시킨 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는, 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 없거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 있을 때만 SEA로 자극시킨 PBMC에서의 IFNγ 및/또는 IL-2 생산에 비해 IFNγ 및/또는 IL-2 생산을 적어도 약 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 또는 100배만큼 증가시켰다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하고 기억 T 세포의 기억 회상(memory recall)을 증가시키거나 촉진하는 다중특이적 분자를 제공한다. 소정의 구현예에서, 기억 T 세포는 CD8 작동자 기억 T 세포이다. 소정의 구현예에서, 기억 T 세포는 CD4 작동자 기억 T 세포이다. 소정의 구현예에서, 다중특이적 분자는 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 없거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 존재하는 경우에, 기억 T 세포가 이들의 동족 항원(들)과 접촉할 때 증식하는 기억 T 세포의 수에 비해 기억 T 세포가 이들의 동족 항원(들)과 접촉할 때 증식하는 기억 T 세포의 수를 적어도 약 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 또는 100배만큼 증가시킨다. 소정의 구현예에서, 다중특이적 분자는 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 없거나 또는 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 존재하는 경우에, 기억 T 세포가 이들의 동족 항원(들)과 접촉할 때 기억 T 세포로부터 사이토카인이 생산되는 것에 비해 기억 T 세포가 이들의 동족 항원(들)과 접촉할 때 기억 T 세포로부터 사이토카인(예를 들어 IFNγ, TNFα)이 생산되는 것을 적어도 약 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 또는 100배만큼 증가시킨다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하고 NK 세포를 활성화하는 다중특이적 분자를 제공한다. 소정의 구현예에서, NK 세포는 단리된다. 소정의 구현예에서, NK 세포는 혼합된 PBMC 배양물 형태이다. 소정의 구현예에서, 본원에 개시된 다중특이적 분자는, 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 없거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 있는 경우에, NK 세포에서 CD107a의 발현 수준에 비해 NK 세포에서 CD107a의 발현 수준을 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%만큼 증가시킨다. 소정의 구현예에서, 본원에 개시된 다중특이적 분자는, 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 없거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 있는 경우에, NK 세포에서 CD107a의 발현 수준에 비해 NK 세포에서 CD107a의 발현 수준을 적어도 약 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 또는 100배 또는 그 이상만큼 증가시킨다. 소정의 구현예에서, 본원에 개시된 다중특이적 분자는, 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 없거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 있는 경우에, NK 세포로부터 사이토카인(예를 들어 IFNγ 및/또는 TNFα)의 생산에 비해 NK 세포로부터 사이토카인(예를 들어 IFNγ 및/또는 TNFα)의 생산을 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%만큼 증가시킨다. 소정의 구현예에서, 본원에 개시된 다중특이적 분자는, 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 없거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하지 않는 항체)가 있는 경우에, NK 세포로부터 사이토카인(예를 들어 IFNγ 및/또는 TNFα)의 생산에 비해 NK 세포로부터 사이토카인(예를 들어 IFNγ 및/또는 TNFα)의 생산을 적어도 약 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 또는 100배 또는 그 이상만큼 증가시킨다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하고 길항제로서 기능하는 (예를 들어 TIGIT 활성을 감소시키거나 억제하는) 다중특이적 분자를 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하고, 본원에 기술된 방법 및/또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 없거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 있는 경우의 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 활성에 비해 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 활성을 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%만큼 감소시키거나 억제하는 다중특이적 분자를 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하고, 본원에 기술된 방법 및/또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 다중특이적 분자가 없거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 있는 경우의 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 활성에 비해 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 활성을 적어도 아무런 약 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 또는 그 이상 감소시키거나 억제하는 단리된 항체를 제공한다. TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 활성의 비제한적인 예는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 신호 전달; TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)가 이의 리간드(예: CD155) 또는 이의 단편 및/또는 융합 단백질에 결합하는 것; T 세포(예: 인간 TIGIT를 발현하는 T 세포)의 활성화; 자연 살해(NK) 세포의 활성화; Treg의 감소 또는 억제; 사이토카인(예: IL-2) 생산의 증가; CD155(예: 인간 CD155)의 활성 증가를 포함한다. 특정 구현예에서, TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 활성의 증가는 실시예에 기술된 것과 같이 평가된다.
특정 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하고, 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 없거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 있는 경우에, TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)가 이의 리간드에 결합하는 것에 비해 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)가 이의 리간드(예: CD155) 또는 TIGIT의 단편 및/또는 융합 단백질에 결합하는 것을 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 만큼 감소시키거나 억제하는 다중특이적 분자를 제공한다. 특정 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하고, 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 없거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 있는 경우에 TIGIT(예: 인간 TIGIT)가 이의 리간드(예: CD155(예: 인간 CD155 또는 시노몰구스 CD155) 또는 TIGIT의 단편 및/또는 융합 단백질)에 결합하는 것에 비해 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)가 이러한 리간드에 결합하는 것을 적어도 약 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 또는 100배만큼 증가시키는 단리된 항체를 제공한다.
특정 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하고 T 세포(예: 인간 TIGIT를 발현하는 T 세포)를 활성화하는 다중특이적 분자를 제공한다. 소정의 구현예에서, T 세포는 기억 T 세포이다. 소정의 구현예에서, T 세포는 일차 CD3-발현 T 세포이다. 소정의 구현예에서, T 세포는 TIGIT-발현 Jurkat 세포이다. 소정의 구현예에서, 본원에 개시된 다중특이적 분자는, 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 없거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 있는 경우에 활성화된 T 세포의 핵 인자(NFAT)의 활성에 비해 NAFT의 활성을 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%만큼 증가시킨다. 소정의 구현예에서, 본원에 개시된 다중특이적 분자는 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 있거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 있는 경우의 NFAT 활성에 비해 NFAT의 활성을 적어도 약 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 또는 100배 또는 그 이상만큼 증가시킨다. 소정의 구현예에서, 다중특이적 분자는 TIGIT의 리간드(예: CD155) 또는 TIGIT의 단편 및/또는 융합 단백질, 및/또는 TIGIT의 리간드를 발현하는 세포(예: 단핵구 또는 수지상 세포)가 존재하는 가운데 NFAT 활성을 증가시킨다.
특정 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하고, 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 있거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 있는 경우의 사이토카인 생산에 비해 사이토카인 생산(예: IL-2)을 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%만큼 증가시키는 다중특이적 분자를 제공한다. 특정 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하고, 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 없거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 있는 경우의 사이토카인 생산에 비해 사이토카인 생산(예를 들어 IL-2)을 적어도 약 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 또는 그 이상 증가시키는 다중특이적 분자를 제공한다. 소정의 구현예에서, 다중특이적 분자는 TIGIT의 리간드((예: CD155) 또는 TIGIT의 단편 및/또는 융합 단백질), 및/또는 TIGIT의 리간드를 발현하는 세포(예: 단핵구 또는 수지상 세포)가 존재하는 가운데 사이토카인(예를 들어 IL-2) 생산을 증가시킨다. 소정의 구현예에서, 다중특이적 분자는 임의의 다중특이적 분자가 없거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 있는 경우의 IL-2 생산에 비해 IL-2의 생산을 증가시킨다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하고, 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 없거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 있는 경우에 IFNγ 및/또는 IL-2 생산에 비해, 포도상구균 내독소 A(SEA) 자극에 반응하여 단독으로 또는 항-PD-1 항체(예를 들어 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙)와 함께 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 IFNγ 및/또는 IL-2 생산을 적어도 약 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 또는 100배만큼 증가시키는 다중특이적 분자를 제공한다.
소정의 구현예에서, TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 본원에 기술된 항체가 존재하는 가운데 포도상구균 내독소 A(SEA)로 자극시킨 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는, 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 없거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 있을 때만 SEA로 자극시킨 PBMC에서의 IFNγ 및/또는 IL-2 생산에 비해 IFNγ 및/또는 IL-2 생산을 적어도 약 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 또는 100배만큼 증가시켰다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하고 기억 T 세포의 기억 회상을 증가시키거나 촉진하는 분자를 제공한다. 소정의 구현예에서, 기억 T 세포는 CD8 작동자 기억 T 세포이다. 소정의 구현예에서, 기억 T 세포는 CD4 작동자 기억 T 세포이다. 소정의 구현예에서, 다중특이적 분자는 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 없거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 존재하는 경우에, 기억 T 세포가 이들의 동족 항원(들)과 접촉할 때 증식하는 기억 T 세포의 수에 비해 기억 T 세포가 이들의 동족 항원(들)과 접촉할 때 증식하는 기억 T 세포의 수를 적어도 약 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 또는 100배만큼 증가시킨다. 소정의 구현예에서, 다중특이적 분자는 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 없거나 또는 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 존재하는 경우에, 기억 T 세포가 이들의 동족 항원(들)과 접촉할 때 기억 T 세포로부터 사이토카인이 생산되는 것에 비해 기억 T 세포가 이들의 동족 항원(들)과 접촉할 때 기억 T 세포로부터 사이토카인(예를 들어 IFNγ, TNFα)이 생산되는 것을 적어도 약 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 또는 100배만큼 증가시킨다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하고 NK 세포를 활성화시키는 다중특이적 분자를 제공한다. 소정의 구현예에서, NK 세포는 단리된다. 소정의 구현예에서, NK 세포는 혼합된 PBMC 배양물 형태이다. 소정의 구현예에서, 본원에 개시된 다중특이적 분자는, 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 없거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 있는 경우에, NK 세포에서 CD107a의 발현 수준에 비해 NK 세포에서 CD107a의 발현 수준을 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%만큼 증가시킨다. 소정의 구현예에서, 본원에 개시된 다중특이적 분자는, 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 없거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 있는 경우에, NK 세포에서 CD107a의 발현 수준에 비해 NK 세포에서 CD107a의 발현 수준을 적어도 약 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 또는 100배 또는 그 이상만큼 증가시킨다. 소정의 구현예에서, 본원에 개시된 다중특이적 분자는, 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 없거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 있는 경우에, NK 세포로부터 사이토카인(예를 들어 IFNγ 및/또는 TNFα)의 생산에 비해 NK 세포로부터 사이토카인(예를 들어 IFNγ 및/또는 TNFα)의 생산을 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%만큼 증가시킨다. 소정의 구현예에서, 본원에 개시된 다중특이적 분자는, 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 없거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 항체)가 있는 경우에, NK 세포로부터 사이토카인(예를 들어 IFNγ 및/또는 TNFα)의 생산에 비해 NK 세포로부터 사이토카인(예를 들어 IFNγ 및/또는 TNFα)의 생산을 적어도 약 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 또는 100배 또는 그 이상만큼 증가시킨다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하고 길항제로서 기능하는 (예를 들어 CD96 또는 TIGIT 활성을 감소시키거나 억제하는) 다중특이적 분자를 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하고, 본원에 기술된 방법 및/또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 없거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 있는 경우의 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 활성에 비해 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 활성을 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 만큼 감소시키거나 억제하는 다중특이적 분자를 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하고, 본원에 기술된 방법 및/또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 없거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 있는 경우의 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 활성에 비해 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 활성을 적어도 약 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100 배만큼 또는 그 이상 감소시키거나 억제하는 다중특이적 분자를 제공한다. CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 활성의 비제한적인 예는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 신호 전달; CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)가 이의 리간드((예: CD155) 또는 CD96 및 TIGIT의 단편 및/또는 융합 단백질)에 결합하는 것; T 세포(예: 인간 CD96 및/또는 TIGIT를 발현하는 T 세포)의 활성화; 자연 살해(NK) 세포의 활성화; Treg의 감소 또는 억제; 사이토카인(예: IL-2) 생산의 증가; CD155(예: 인간 CD155)의 활성 증가를 포함한다. 특정 구현예에서, CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 활성의 증가는 실시예에 기술된 것과 같이 평가된다.
특정 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하고, 본원에 기술된 방법 및/또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 없거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 있는 경우에 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)가 이의 리간드에 결합하는 것보다 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)가 이의 리간드(예: CD155) 또는 단편 및/또는 융합 단백질에 결합하는 것을 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 만큼 감소시키거나 억제하는 다중특이적 분자를 제공한다. 특정 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하고, 본원에 기술된 방법 및/또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 없거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 항체)가 있는 경우에 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)가 이의 리간드에 결합하는 것에 비해 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)가 이의 리간드(예: CD155(예: 인간 또는 시노몰구스 CD155) 또는 단편 및/또는 융합 단백질에 결합하는 것을 적어도 약 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 또는 100배만큼 증가시키는 다중특이적 분자를 제공한다.
특정 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하고 T 세포(예: 인간 CD96 및/또는 인간 TIGIT를 발현하는 T 세포)를 활성화하는 다중특이적 분자를 제공한다. 소정의 구현예에서, T 세포는 기억 T 세포이다. 소정의 구현예에서, T 세포는 일차 CD3-발현 T 세포이다. 소정의 구현예에서, T 세포는 CD96-발현 및/또는 TIGIT-발현 Jurkat 세포이다. 소정의 구현예에서, 본원에 개시된 다중특이적 분자는, 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 없거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 있는 경우에 활성화된 T 세포의 핵 인자(NFAT)의 활성에 비해 NAFT의 활성을 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%만큼 증가시킨다. 소정의 구현예에서, 본원에 개시된 다중특이적 분자는 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 있거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 있는 경우의 NFAT 활성에 비해 NFAT의 활성을 적어도 약 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 또는 100배 또는 그 이상만큼 증가시킨다. 소정의 구현예에서, 다중특이적 분자는 CD96 및/또는 TIGIT의 리간드(예: CD155) 또는 단편 및/또는 융합 단백질, 및/또는 CD96 및/또는 TIGIT의 리간드를 발현하는 세포(예: 단핵구 또는 수지상 세포)가 존재하는 가운데 NFAT 활성을 증가시킨다.
특정 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하고, 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 있거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 있는 경우의 사이토카인 생산에 비해 사이토카인 생산(예: IL-2)을 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%만큼 증가시키는 다중특이적 분자를 제공한다. 특정 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하고, 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 없거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 있는 경우의 사이토카인 생산에 비해 사이토카인 생산(예를 들어 IL-2)을 적어도 약 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 또는 그 이상 증가시키는 다중특이적 분자를 제공한다. 소정의 구현예에서, 다중특이적 분자는 CD96 및/또는 TIGIT의 리간드(예: CD155) 또는 단편 및/또는 융합 단백질, 및/또는 CD96 및/또는 TIGIT의 리간드를 발현하는 세포(예: 단핵구 또는 수지상 세포)가 존재하는 가운데 사이토카인(예를 들어 IL-2) 생산을 증가시킨다. 소정의 구현예에서, 다중특이적 분자는 임의의 다중특이적 분자가 없거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 CD96(예: 인간 또는 시노몰구스 CD96) 또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 있는 경우의 IL-2 생산에 비해 IL-2의 생산을 증가시킨다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 또는 시노몰구스 CD96) 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하고, 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 없거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 CD96(예: 인간 또는 시노몰구스 CD96) 또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 있는 경우에 IFNγ 및/또는 IL-2 생산에 비해, 포도상구균 내독소 A(SEA) 자극에 반응하여 단독으로 또는 항-PD-1 항체(예를 들어 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙)와 함께 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 IFNγ 및/또는 IL-2 생산을 적어도 약 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 또는 100배만큼 증가시키는 다중특이적 분자를 제공한다.
소정의 구현예에서, CD96(예: 인간 또는 시노몰구스 CD96) 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 본원에 기술된 항체가 존재하는 가운데 포도상구균 내독소 A(SEA)로 자극시킨 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는, 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 없거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 CD96(예: 인간 또는 시노몰구스 CD96) 또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 있을 때만 SEA로 자극시킨 PBMC에서의 IFNγ 및/또는 IL-2 생산에 비해 IFNγ 및/또는 IL-2 생산을 적어도 약 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 또는 100배만큼 증가시켰다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 또는 시노몰구스 CD96) 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하고 기억 T 세포의 기억 회상을 증가시키거나 촉진하는 분자를 제공한다. 소정의 구현예에서, 기억 T 세포는 CD8 작동자 기억 T 세포이다. 소정의 구현예에서, 기억 T 세포는 CD4 작동자 기억 T 세포이다. 소정의 구현예에서, 다중특이적 분자는 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 없거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 CD96(예: 인간 또는 시노몰구스 CD96) 또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 존재하는 경우에, 기억 T 세포가 이들의 동족 항원(들)과 접촉할 때 증식하는 기억 T 세포의 수에 비해 기억 T 세포가 이들의 동족 항원(들)과 접촉할 때 증식하는 기억 T 세포의 수를 적어도 약 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 또는 100배만큼 증가시킨다. 소정의 구현예에서, 다중특이적 분자는 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 없거나 또는 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 CD96(예: 인간 또는 시노몰구스 CD96) 또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 존재하는 경우에, 기억 T 세포가 이들의 동족 항원(들)과 접촉할 때 기억 T 세포로부터 사이토카인이 생산되는 것에 비해 기억 T 세포가 이들의 동족 항원(들)과 접촉할 때 기억 T 세포로부터 사이토카인(예를 들어 IFNγ, TNFα)이 생산되는 것을 적어도 약 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 또는 100배만큼 증가시킨다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 CD96(예: 인간 또는 시노몰구스 CD96) 및 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하고 NK 세포를 활성화시키는 다중특이적 분자를 제공한다. 소정의 구현예에서, NK 세포는 단리된다. 소정의 구현예에서, NK 세포는 혼합된 PBMC 배양물 형태이다. 소정의 구현예에서, 본원에 개시된 다중특이적 분자는, 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 없거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 CD96(예: 인간 또는 시노몰구스 CD96) 또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 있는 경우에, NK 세포에서 CD107a의 발현 수준에 비해 NK 세포에서 CD107a의 발현 수준을 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%만큼 증가시킨다. 소정의 구현예에서, 본원에 개시된 다중특이적 분자는, 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 없거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 CD96(예: 인간 또는 시노몰구스 CD96) 또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 있는 경우에, NK 세포에서 CD107a의 발현 수준에 비해 NK 세포에서 CD107a의 발현 수준을 적어도 약 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 또는 100배 또는 그 이상만큼 증가시킨다. 소정의 구현예에서, 본원에 개시된 다중특이적 분자는, 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 없거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 CD96(예: 인간 또는 시노몰구스 CD96) 또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 다중특이적 분자)가 있는 경우에, NK 세포로부터 사이토카인(예를 들어 IFNγ 및/또는 TNFα)의 생산에 비해 NK 세포로부터 사이토카인(예를 들어 IFNγ 및/또는 TNFα)의 생산을 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%만큼 증가시킨다. 소정의 구현예에서, 본원에 개시된 다중특이적 분자는, 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 다중특이적 분자가 없거나 무관한 다중특이적 분자(예를 들어 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 항체)가 있는 경우에, NK 세포로부터 사이토카인(예를 들어 IFNγ 및/또는 TNFα)의 생산에 비해 NK 세포로부터 사이토카인(예를 들어 IFNγ 및/또는 TNFα)의 생산을 적어도 약 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 또는 100배 또는 그 이상만큼 증가시킨다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하고 길항제로서 기능하는 (예를 들어 TIGIT 활성을 감소시키거나 억제하는) 단리된 항체를 제공한다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하고, 본원에 기술된 방법 및/또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 활성을 아무런 항체가 없는 경우 또는 무관한 항체(예: TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 항체)가 있는 경우의 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 활성에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%만큼 감소시키거나 억제하는 단리된 항체를 제공한다. 소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하고, 본원에 기술된 방법 및/또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 활성을 적어도 아무런 항체가 없는 경우 또는 무관한 항체(예를 들어 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 항체)가 있는 경우의 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 활성에 비해 약 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 또는 그 이상 감소시키거나 억제하는 단리된 항체를 제공한다. TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 활성의 비제한적인 예는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 신호 전달; TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)가 이의 리간드((예: CD155) 또는 이의 단편 및/또는 융합 단백질)에 결합하는 것; T 세포(예: 인간 TIGIT를 발현하는 T 세포)의 활성화; 자연 살해(NK) 세포의 활성화; Treg의 감소 또는 억제; 사이토카인(예: IL-2) 생산의 증가; CD155(예: 인간 CD155)의 활성 증가를 포함한다. 특정 구현예에서, TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 활성의 증가는 실시예에 기술된 것과 같이 평가된다.
특정 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하고, 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 항체가 없거나 무관한 항체(예를 들어 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 항체)가 있는 경우에, TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)가 이의 리간드에 결합하는 것에 비해 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)가 이의 리간드(예: CD155) 또는 단편 및/또는 융합 단백질에 결합하는 것을 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 만큼 감소시키거나 억제하는 단리된 항체를 제공한다. 특정 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하고, 본원에 기술된 방법 및/또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 항체가 없거나 무관한 항체(예를 들어 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 항체)가 있는 경우에 TIGIT(예: 인간 TIGIT)가 이의 리간드에 결합하는 것에 비해 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)가 이의 리간드(예: CD155(예: 인간 CD155 또는 시노몰구스 CD155) 또는 이의 단편 및/또는 융합 단백질)에 결합하는 것을 적어도 약 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 또는 100배만큼 증가시키는 단리된 항체를 제공한다.
특정 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하고 T 세포(예: 인간 TIGIT를 발현하는 T 세포)를 활성화하는 단리된 항체를 제공한다. 소정의 구현예에서, T 세포는 기억 T 세포이다. 소정의 구현예에서, T 세포는 일차 CD3-발현 T 세포이다. 소정의 구현예에서, T 세포는 TIGIT-발현 Jurkat 세포이다. 소정의 구현예에서, 본원에 개시된 항체는, 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 없거나 무관한 항체(예를 들어 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 항체)가 있는 경우의 활성화된 T 세포의 핵 인자(NFAT)에 비해 NFAT 활성을 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%만큼 증가시킨다. 소정의 구현예에서, 본원에 개시된 항체는 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 항체가 없거나 무관한 항체(예를 들어 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 항체)가 있는 경우의 NFAT 활성에 비해 NFAT의 활성을 적어도 약 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 또는 100배 또는 그 이상만큼 증가시킨다. 소정의 구현예에서, 항체는 TIGIT의 리간드(예: CD155) 또는 이의 단편 및/또는 융합 단백질, 및/또는 TIGIT의 리간드를 발현하는 세포(예: 단핵구 또는 수지상 세포)가 존재하는 가운데 NFAT 활성을 증가시킨다.
특정 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하고, 본원에 기술된 방법 및/또는 당업자에게 알려진 방법으로 평가했을 때 사이토카인 생산(예를 들어 IL-2)을 아무런 항체가 없거나 무관한 항체(예를 들어 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 항체)가 있는 경우의 사이토카인 생산에 비해 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%만큼 증가시키는 단리된 항체를 제공한다. 특정 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하고, 본원에 기술된 방법 및/또는 당업자에게 알려진 방법으로 평가했을 때 사이토카인 생산(예를 들어 IL-2)을 아무런 항체가 없거나 무관한 항체(예를 들어 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 항체)가 있는 경우의 사이토카인 생산에 비해 적어도 약 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 또는 그 이상 증가시키는 단리된 항체를 제공한다. 소정의 구현예에서, 항체는 TIGIT의 리간드(예: CD155) 또는 단편 및/또는 융합 단백질, 및/또는 TIGIT의 리간드를 발현하는 세포(예: 단핵구 또는 수지상 세포)가 존재하는 가운데 사이토카인(예를 들어 IL-2) 생산을 증가시킨다. 소정의 구현예에서, 항체는 IL-2의 생산을 아무런 항체가 없거나 무관한 항체(예를 들어 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 항체)가 있는 경우의 IL-2 생산에 비해 증가시킨다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하고, 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법으로 평가했을 때 포도상구균 내독소 A(SEA) 자극에 반응하여 단독으로 또는 항-PD-1 항체(예를 들어 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙)와 함께 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 IFNγ 및/또는 IL-2 생산을, 아무런 항체가 없거나 무관한 항체(예를 들어 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 항체)가 있는 경우의 IFNγ 및/또는 IL-2 생산에 비해 적어도 약 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 또는 100배만큼 증가시키는 단리된 항체를 제공한다.
소정의 구현예에서, TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는, 본원에 기술된 항체가 존재하는 가운데 포도상구균 내독소 A(SEA)로 자극시킨 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는, 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법으로 평가했을 때, 아무런 항체가 없거나 무관한 항체(예를 들어 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 항체)가 있는 경우에만 SEA로만 자극시킨 PBMC에서의 IFNγ 및/또는 IL-2 생산에 비해 IFNγ 및/또는 IL-2 생산을 적어도 약 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 또는 100배만큼 증가시켰다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하고 기억 T 세포의 기억 회상을 증가시키거나 촉진하는 단리된 항체를 제공한다. 소정의 구현예에서, 기억 T 세포는 CD8 작동자 기억 T 세포이다. 소정의 구현예에서, 기억 T 세포는 CD4 작동자 기억 T 세포이다. 소정의 구현예에서, 항체는 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법으로 평가했을 때, 기억 T 세포가 이들의 동족 항원(들)과 접촉할 때 증식하는 기억 T 세포의 수를, 아무런 항체가 없거나 또는 무관한 항체(예를 들어 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 항체)가 있는 경우에 기억 T 세포가 이들의 동족 항원(들)과 접촉할 때 증식하는 기억 T 세포의 수에 비해 적어도 약 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 또는 100배만큼 증가시킨다. 소정의 구현예에서, 항체는, 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법으로 평가했을 때, 기억 T 세포가 이들의 동족 항원과 접촉할 때 기억 T 세포로부터 사이토카인(예를 들어 IFNγ, TNFα)의 생산을 아무런 항체가 없거나 무관한 항체(예를 들어 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 항체)가 있을 때 기억 T 세포가 이들의 동족 항원과 접촉할 때 기억 T 세포로부터 사이토카인의 생산에 비해, 적어도 약 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 또는 100배만큼 증가시킨다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하고 NK 세포를 활성화시키는 단리된 항체를 제공한다. 소정의 구현예에서, NK 세포는 단리된다. 소정의 구현예에서, NK 세포는 혼합된 PBMC 배양물 형태이다. 소정의 구현예에서, 본원에 개시된 항체는, 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법으로 평가했을 때, NK 세포에서 CD107a의 발현 수준을 아무런 항체가 없거나 무관한 항체(예를 들어 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 항체)가 있을 때 NK 세포에서 CD107a의 발현 수준에 비해 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%만큼 증가시킨다. 소정의 구현예에서, 본원에 개시된 항체는, 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법으로 평가했을 때, NK 세포에서 CD107a의 발현 수준을 아무런 항체가 없거나 무관한 항체(예를 들어 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 항체)가 있을 때 NK 세포에서 CD107a의 발현 수준에 비해 적어도 약 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 또는 100배 또는 그 이상만큼 증가시킨다. 소정의 구현예에서, 본원에 개시된 항체는, 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법에 의해 평가했을 때, 임의의 항체가 없거나 무관한 항체(예를 들어 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 항체)가 있는 경우에 NK 세포로부터 사이토카인(예를 들어 IFNγ 및/또는 TNFα)의 생산에 비해 NK 세포로부터 사이토카인(예를 들어 IFNγ 및/또는 TNFα) 생산을 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%만큼 증가시킨다. 소정의 구현예에서, 본원에 개시된 항체는, 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 알려진 방법으로 평가했을 때, 임의의 항체가 없거나 무관한 항체(예를 들어 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하지 않는 항체)가 있을 때 NK 세포로부터 사이토카인(예를 들어 IFNγ 및/또는 TNFα)의 생산에 비해 NK 세포로부터 사이토카인(예를 들어 IFNγ 및/또는 TNFα)의 생산을 적어도 약 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 또는 100배 또는 그 이상만큼 증가시킨다.
7.3
약학적 조성물
생리학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제 중에서 원하는 정도의 순도를 갖는, 본원에 개시된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다(예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA 참조). 허용 가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이며, 다음을 포함한다: 인산염, 구연산염, 및 기타 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 염화벤잘코늄, 염화벤제토늄; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저 분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노오스, 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류, 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로오스, 만니톨, 트레할로스, 또는 소르비톨과 같은 당류; 나트륨과 같은 염 형성 반대이온; 금속 복합체(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 TWEEN??, PLURONICS??, 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제.
특정 구현예에서, 약학적 조성물은 본원에 개시된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체, 및 임의로 하나 이상의 추가 예방제 또는 치료제를 약학적으로 허용 가능한 담체 중에 포함한다. 특정 구현예에서, 약학적 조성물은 본원의 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체의 유효량, 및 임의로 하나 이상의 추가 예방제 또는 치료제를 약학적으로 허용 가능한 담체 중에 포함한다. 소정의 구현예에서, 다중특이적 분자 또는 항체는 약학적 조성물에 포함된 유일한 활성 성분이다. 본원에 기술된 약학적 조성물은 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 활성을 증가시키거나 촉진하고 암 또는 감염성 질환과 같은 병태를 치료하는 데 유용할 수 있다. 소정의 구현예에서, 본 발명은, 본 발명의 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체를 포함하고 의약으로서 사용하기 위한 본 발명의 약학적 조성물에 관한 것이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 암 또는 감염성 질환을 치료하기 위한 방법에 사용하기 위한 본 발명의 약학적 조성물에 관한 것이다.
비경구 제제에 사용되는 약학적으로 허용 가능한 담체는 수성 비히클, 비수성 비히클, 항균제, 등장제, 완충제, 항산화제, 국소 마취제, 현탁제 및 분산제, 유화제, 격리제 또는 킬레이트제, 및 기타 약학적으로 허용 가능한 물질을 포함한다. 수성 비히클의 예는 염화나트륨 주사제, 링거 주사제, 등장성 덱스트로오스 주사제, 멸균수 주사제, 덱스트로오스 및 젖산화 링거 주사제를 포함한다. 비수성 비경구 비히클은 식물성 고정유, 면실유, 옥수수유, 참기름, 및 땅콩유를 포함한다. 정균(bacteroiostatic) 또는 정진균(fungistatic) 농도의 항균제가 페놀 또는 크레졸, 수은, 벤질 알코올, 클로로부탄올, 메틸 및 프로필 p-하이드록시벤조산 에스테르, 티메로살, 염화벤잘코늄, 및 염화벤제토늄을 포함하는 다회 투여 용기에 포장된 비경구 제제에 첨가될 수 있다. 등장성 제제는 염화나트륨 및 덱스트로스를 포함한다. 완충액은 인산염 및 구연산염을 포함한다. 항산화제는 중황산나트륨을 포함한다. 국소 마취제는 프로카인 하이드로클로라이드를 포함한다. 현탁제 및 분산제는 나트륨 카복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스, 및 폴리비닐피롤리돈을 포함한다. 유화제는 폴리소르베이트 80(TWEEN® 80)을 포함한다. 금속 이온의 격리제 또는 킬레이트제는 EDTA를 포함한다. 약학적 담체 또한 수혼화성 비히클용 에틸 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 및 프로필렌 글리콜; 및 pH 조절용 수산화나트륨, 염산, 구연산, 또는 락트산을 포함한다.
약학적 조성물은 대상체에 대한 임의의 투여 경로에 맞게 제형화될 수 있다. 투여 경로의 구체적인 예는 비강, 경구, 폐, 경피, 피부 내, 및 비경구를 포함한다. 피하, 근육 내, 또는 정맥 내 주사를 특징으로 하는 비경구 투여도 본원에서 고려된다. 주사제는 액체 용액 또는 현탁액으로서, 주사 전에 액체 중의 용해시키거나 현탁시키기 적합한 고형분 형태로서, 또는 유화액으로서 종래의 형태로 제조될 수 있다. 주사제, 용액, 및 유화액은 하나 이상의 부형제를 또한 함유한다. 적절한 부형제는, 예를 들어, 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 또는 에탄올이다. 추가로, 원하는 경우, 투여할 약학적 조성물은 소량의 비독성 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 안정화제, 용해도 증강제, 및 다른 이러한 제제, 예컨대 아세트산 나트륨, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트, 및 시클로덱스트린을 또한 함유할 수 있다.
다중특이적 분자 또는 항체의 비경구 투여를 위한 제제는 다음을 포함한다: 주사용 멸균 용액; 주사용 정제를 포함하여, 사용 직전에 용매와 쉽게 조합할 수 있는 동결 건조 분말과 같은 멸균 건조 가용성 산물; 주사용 멸균 현탁액; 사용 직전에 비히클과 쉽게 조합할 수 있는 멸균 건조 불용성 산물; 및 멸균 유화액. 용액은 수성 또는 비수성일 수 있다.
정맥 내 투여되는 경우, 적합한 담체는 생리식염수 또는 인산염 완충 식염수(PBS), 및 포도당, 폴리에틸렌 글리콜, 및 폴리프로필렌 글리콜과 같은 증점제 및 가용화제를 함유하는 용액, 및 이들의 혼합물을 포함한다.
항체를 포함하는 국소 혼합물은 국소 및 전신 투여에 대해 기술된 것과 같이 제조된다. 생성된 혼합물은 용액, 현탁액, 유화액 등일 수 있고, 크림, 겔, 연고, 유화액, 용액, 엘릭서, 로션, 현탁액, 팅크제, 페이스트, 발포체, 에어로졸, 관류, 분무제, 좌제, 붕대, 진피 패치, 또는 국소 투여에 적합한 임의의 다른 제형으로서 제형화될 수 있다.
본원에 개시된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체는, 예를 들어 흡입에 의한 국소 도포용 에어로졸로서 제형화될 수 있다(예를 들어, 염증성 질환, 특히 천식의 치료에 유용한 스테로이드의 전달을 위한 에어로졸을 기술하는 미국 특허 제4,044,126, 제4,414,209호 및 제4,364,923호를 참조하고, 그 전체는 참조로서 본원에 통합됨). 호흡기에 투여하기 위한 이들 제형은, 단독으로 또는 락토오스와 같은 불활성 담체와 조합되어, 네블라이저(nebulizer)용 에어로졸 또는 용액의 형태를 취하거나, 취입용 미세 분말의 형태를 취할 수 있다. 이러한 경우에, 제형의 입자는, 소정의 구현예에서, 50 μm 미만의 직경을 가질 것이고, 소정의 구현예에서는 10 μm 미만의 직경을 가질 것이다.
본원에 개시된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체는 국지 또는 국소 도포용으로, 예컨대 피부 및 점막에 대한 (예를 들어 눈 안에) 국소 도포하기 위한 겔, 크림, 및 로션의 형태로 제형화될 수 있고, 눈 도포용, 또는 낭내 또는 척수내 도포용으로 제형화될 수 있다. 국소 투여는 경피 전달용으로서 고려되고, 안구 또는 점막에 대한 투여, 또는 흡입 요법용으로도 고려된다. 항체의 비강 용액이 단독으로 투여되거나 약학적으로 허용 가능한 다른 부형제와 조합하여 투여될 수도 있다.
이온영동 장치 및 전기영동 장치를 포함하는 경피 패치는 당업자에게 잘 알려져 있고, 항체를 투여하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 패치는 미국 특허 제6,267,983호, 제6,261,595호, 제6,256,533호, 제6,167,301호, 제6,024,975호, 제6,010715호, 제5,985,317호, 제5,983,134호, 제5,948,433호, 및 제5,860,957호에 개시되어 있으며, 이들 모두는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
소정의 구현예에서, 본원에 기술된 다중특이적 분자 또는 항체를 포함하는 약학적 조성물은 동결 건조된 분말이며, 이는 용액, 유화액, 및 다른 혼합물로서 투여되도록 재구성될 수 있다. 이는 고형분 또는 겔로서 재구성되고 제형화될 수도 있다. 동결 건조된 분말은 본원에 기술된 다중특이적 분자 또는 항체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 유도체를 적절한 용매에 용해시켜 제조된다. 소정의 구현예에서, 동결 건조된 분말은 멸균 상태이다. 용매는 안정성을 개선하는 부형제 또는 분말의 다른 약리학적 성분, 또는 분말로부터 제조된 재구성 용액을 함유할 수 있다. 사용될 수 있는 부형제는 덱스트로오스, 소르비톨, 과당, 옥수수 시럽, 크실리톨, 글리세린, 글루코스, 수크로오스, 또는 다른 적절한 제제를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 소정의 구현예에서, 용매는 완충제, 예컨대 구연산염, 인산나트륨 또는 인산칼륨, 또는 당업자에게 알려져 있는 다른 이러한 완충제를 중성에 가까운 pH로 함유할 수도 있다. 후속하는 용액의 멸균 여과에 이어서, 당업자에게 알려진 표준 조건 하의 동결건조를 통해 제형을 수득한다. 소정의 구현예에서, 생성된 용액은 동결건조를 위해 바이알로 배분될 것이다. 각각의 바이알은 화합물의 1회 투여량 또는 다회 투여량을 함유할 것이다. 동결 건조된 분말은 적절한 조건 하에, 예컨대 약 4℃ 내지 실온에서 보관될 수 있다. 주사용수로 이러한 동결 건조된 분말을 재구성하면 비경구 투여용 제형을 얻을 수 있다. 재구성을 위해, 동결 건조된 분말을 멸균수 또는 다른 적절한 담체에 첨가한다. 정확한 양은 선택된 화합물에 따라 달라진다. 이러한 양은 경험적으로 결정될 수 있다.
본원에 개시된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체 및 본원에 제공된 다른 조성물은 치료 대상 대상체의 특정 조직, 수용체, 또는 다른 신체 영역에 대해 표적화되도록 제형화될 수도 있다. 많은 이러한 표적화 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 모든 표적화 방법은 본 조성물에 사용하기 위한 것으로 본 명세서에서 고려된다. 표적화 방법의 비제한적인 예에 대해서는 예를 들어 미국 특허 제6,316,652호, 제6,274,552호, 제6,271,359호, 제6,253,872호, 제6,139,865호, 제6,131,570호, 제6,120,751호, 제6,071,495호, 제6,060,082호, 제6,048,736호, 제6,039,975호, 제6,004,534호, 제5,985,307호, 제5,972,366호, 제5,900,252호, 제5,840,674호, 제5,759,542호, 및 제5,709,874호를 참조하고, 이들 모두는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 다중특이적 분자 또는 항체는 종양에 대해 표적화된다.
생체내 투여를 위해 사용될 조성물은 멸균 상태일 수 있다. 이는, 예를 들어 멸균 여과 멤브레인을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
7.4
사용 방법 및 용도
또 다른 양태에서, 본 개시는 본원에 개시된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체를 사용하여 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96CD96) 및/또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 기능의 감소가 이익이 되는 대상체의 임의의 질환 또는 장애는 본원에 개시된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 및 단리된 항-TIGIT 항체를 사용해 치료할 수 있다. 소정의 구현예에서, 질환 또는 장애는 관문 표적화제(예를 들어 길항제 항-CTLA-4 항체, 길항제 항-PD-L1 항체, 길항제 항-PD-L2 항체, 또는 길항제 항-PD-1 항체)에 대해 저항성이다. 소정의 구현예에서, 질환 또는 장애는 관문 표적화제(예를 들어 길항제 항-CTLA-4 항체, 길항제 항-PD-L1 항체, 길항제 항-PD-L2 항체, 또는 길항제 항-PD-1 항체)로 치료한 후 재발한 질환 또는 장애이다.
본원에 개시된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체는 종양에 대한 면역계 내성을 억제하는 데 특히 유용하며, 따라서 암환자를 위한 면역요법으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 소정의 구현예에서, 본 개시는 대상체에서 항원에 대한 T 세포(예: CD8+ 세포독성 T 세포, CD4+ 헬퍼 T 세포, NKT 세포, 작동자 T 세포, 또는 기억 T 세포) 활성화를 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 개시된 것과 같은 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체, 또는 이의 약학적 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 개시는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 개시된 것과 같은 항체 또는 약학적 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
본원에 개시된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체 또는 약학적 조성물로 치료할 수 있는 암은 고형 종양, 혈액암(예를 들어 백혈병, 림프종, 다발성 골수종과 같은 골수종), 및 전이성 병변을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 소정의 구현예에서, 암은 고형 종양이다. 고형 종양의 예는 악성 종양, 예를 들어, 육종 및 암종, 예를 들어, 다양한 기관계의 선암종, 예컨대 폐, 유방, 난소, 림프계, 위장(예: 결장), 항문, 생식기 및 비뇨생식관(예: 신장, 요로상피, 방광 세포, 전립선), 인두, CNS(예: 뇌 세포, 신경 세포, 또는 신경교 세포), 두경부, 피부(예: 흑색종), 및 췌장에 영향을 미치는 것들을 비롯하여, 악성 종양을 포함하는 선암종, 예컨대 대장암, 직장암, 신세포 암종, 간암, 폐암(예: 비소세포 폐암 또는 소세포 폐암), 소장암, 및 식도암을 포함한다. 암은 초기, 중기, 후기 암이거나, 전이성 암일 수 있다. 소정의 구현예에서, 암은 관문 표적화제(예를 들어 길항제 항-CTLA-4 항체, 길항제 항-PD-L1 항체, 길항제 항-PD-L2 항체, 또는 길항제 항-PD-1 항체)에 대해 저항성이다. 소정의 구현예에서, 암은 관문 표적화제(예를 들어 길항제 항-CTLA-4 항체, 길항제 항-PD-L1 항체, 길항제 항-PD-L2 항체, 또는 길항제 항-PD-1 항체)로 치료한 후 재발한 암이다.
소정의 구현예에서, 암은 폐암(예를 들어, 폐 선암종 또는 비소세포 폐암(NSCLC)(예를 들어, 편평 및/또는 비편평 조직구조를 갖는 NSCLC, 또는 NSCLC 선암종)), 흑색종(예를 들어, 진행성 흑색종), 신암(예를 들어, 신세포 암종), 간암(예를 들어 간세포암종), 골수종(예를 들어, 다발성 골수종), 전립선암, 유방암(예를 들어, 삼중 음성 유방암과 같이 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 또는 Her2/neu 중 하나, 둘, 또는 셋 모두를 발현하지 않는 유방암), 난소암, 결장암, 췌장암, 두경부암(예를 들어, 두경부 편평세포 암종(HNSCC), 항문암, 위-식도암(예를 들어, 식도 편평 세포 암종), 중피종, 비인두암, 갑상선암, 자궁경부암, 상피암, 복막암, 또는 림프구증식성 질환(예를 들어, 이식 후 림프구증식 질환)으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 암은 자궁경부암이다.
소정의 구현예에서, 암은 혈액암, 예를 들어, 백혈병, 림프종, 또는 골수종이다. 소정의 구현예에서, 암은 백혈병, 예를 들어, 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 골수단핵구성 백혈병(CMML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 또는 모양세포 백혈병이다. 소정의 구현예에서, 암은 림프종, 예를 들어, B 세포 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL), 활성화된 B-세포 유사(ABC) 미만성 거대 B 세포 림프종, 배중심 B 세포(GCB) 미만성 거대 B 세포 림프종, 외투세포 림프종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 재발성 비호지킨 림프종, 불응성 비호지킨 림프종, 재발성 여포성 비호지킨 림프종, 버킷 림프종, 소림프구성 림프종, 여포 림프종, 림프형질세포성 림프종, 또는 결절외 변연부 림프종이다. 소정의 구현예에서, 암은 골수종, 예를 들어, 다발성 골수종이다.
또 다른 구현예에서, 암은 암종(예를 들어, 진행성 또는 전이성 암종), 흑색종, 또는 폐암종, 예를 들어, 비소세포 폐암종으로부터 선택된다.
소정의 구현예에서, 암은 폐암, 예를 들어, 폐 선암종, 비소세포 폐암, 또는 소세포 폐암이다.
소정의 구현예에서, 암은 흑색종, 예를 들어, 진행된 흑색종이다. 소정의 구현예에서, 암은 다른 요법에 반응하지 않는 진행된 또는 절제 불가능한 흑색종이다. 다른 구현예에서, 암은 BRAF 돌연변이(예를 들어, BRAF V600 돌연변이)를 갖는 흑색종이다. 또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자, 단리된 항-TIGIT 항체, 또는 약학적 조성물은 BRAF 억제제(예: 베무라페닙 또는 다브라페닙)가 있거나 없는 가운데 항-CTLA-4 항체(예: 이필리무맙)로 치료한 후 투여된다.
또 다른 구현예에서, 암은 바이러스 감염, 예를 들어, 만성 바이러스 간염을 동반하거나 동반하지 않는 간암종, 예를 들어, 진행성 간암종이다.
또 다른 구현예에서, 암은 전립선암, 예를 들어, 진행성 전립선암이다.
또 다른 구현예에서, 암은 골수종, 예를 들어, 다발성 골수종이다.
또 다른 구현예에서, 암은 신암, 예를 들어, 신세포 암종(RCC) (예를 들어, 전이성 RCC, 투명 세포 신세포 암종(CRCC), 또는 신장 유두 세포 암종)이다.
또 다른 구현예에서, 암은 폐암, 흑색종, 신암, 유방암, 대장암, 백혈병, 또는 암의 전이성 병변으로부터 선택된다.
소정의 구현예에서, 본 개시는 대상체에서 감염성 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 개시된 것과 같은 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체 또는 이의 약학적 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 소정의 구현예에서, 감염증(예를 들어, 바이러스 감염증, 박테리아 감염증, 진균 감염증, 원생동물 감염증, 또는 기생충 감염증)을 예방 및/또는 치료하기 위한 방법이 본원에 제공된다. 상기 방법에 따라 예방 및/또는 치료되는 감염증은 본원에서 식별된 감염원에 의해 야기될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체 또는 이의 조성물은 대상체에게 투여되는 유일한 활성제이다. 소정의 구현예에서, 본원에 기술된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체 또는 이의 조성물은 감염성 질환의 치료를 위한 항-감염성 중재(예를 들어 항바이러스제, 항균제, 항진균제, 또는 항-연충제)와 병용으로 사용된다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 감염성 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 본 발명의 다중특이적 분자 또는 항체 및/또는 약학적 조성물에 관한 것으로서, 임의로 상기 항체 또는 약학적 조성물은 대상체에게 투여되는 유일한 활성제이거나, 상기 항체 또는 약학적 조성물이 항-감염성 중재와 병용으로 사용된다.
본원에 개시된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체 또는 약학적 조성물에 의해 치료 및/또는 예방될 수 있는 감염성 질환은 박테리아, 기생충, 진균류, 원생동물, 및 바이러스를 포함하지만 이에 한정되지 않는 감염원에 의해 유발된다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체 또는 약학적 조성물에 의해 치료되고/되거나 예방되는 감염성 질환은 바이러스에 의해 유발된다. 본원에 기술된 방법에 따라 예방 및/또는 치료될 수 있는 바이러스 질환 또는 바이러스 감염증은 다음을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다: A형 간염, B형 간염, C형 간염, 인플루엔자(예: 인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B), 수두, 아데노바이러스, 단순 포진 I형(HSV-I), 단순 포진 II형(HSV-II), 린더페스트, 리노바이러스, 에코바이러스, 로타바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 유두종 바이러스, 파포바 바이러스, 거대세포바이러스, 에키노바이러스, 아르보바이러스, 헌타바이러스, 콕사키 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 소아마비 바이러스, 천연두, 엡스타인 바 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 I형(HIV-I), 인간 면역결핍 바이러스 II형(HIV-II), 및 바이러스성 질환의 인자, 예컨대 바이러스성 수막염, 뇌염, 뎅기열, 또는 천연두에 의해 유발된 것들.
예방 및/또는 치료할 수 있는 세균성 감염증에는 대장균(Escherichia coli), 폐렴간균(Klebsiella pneumoniae), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 장구균 페칼리스(Enterococcus faecalis), 심상변형균(Proteus vulgaris), 녹색 포도상구균(Staphylococcus viridans), 및 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)에 의해 유발된 감염증이 포함된다. 본원에 기술된 방법에 따라 예방되고/되거나 치료될 수 있는, 박테리아(예를 들어 대장균, 폐렴간균, 황색포도상구균, 장구균 페칼리스, 심상변형균, 녹색 포도상구균, 및 녹농균)에 의해 유발된 세균성 질환은 다음을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다: 콜레라, 페스트, 디프테리아, 클라미디아, 황색 포도상구균 및 레지오넬라.마이코박테리아 리케차(Mycobacteria rickettsia), 마이코플라즈마(Mycoplasma), 나이세리아(Neisseria), 폐렴구균(S. pneumonia), 보렐리아 부르고도르페리(Borrelia burgdorferi (라임병)), 탄저균(Bacillus antracis (탄저병)), 파상풍(tetanus), 연쇄상구균(Streptococcus), 포도상구균(Staphylococcus), 마이코박테리아(mycobacterium), 백일해(pertussis), 콜레라(cholera), 페스트(plague), 디프테리아(diphtheria), 클라미디아(chlamydia), 황색포도상구균(S. aureus), 및 레지오넬라(legionella).
본원에 기술된 방법에 따라 예방 및/또는 치료될 수 있는, 원생동물에 의해 유발된 원생동물 질환 또는 원생동물 감염증은 리슈만증(leishmania), 콕시디아증(coccidiosis), 트리파노소마 주혈흡충(trypanosoma schistosoma), 또는 말라리아(malaria)를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 본원에 기술된 방법에 따라 예방 및/또는 치료될 수 있는, 기생충에 의해 유발된 기생충 질환 또는 기생충 감염증은 클라미디아 및 리케차를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
본원에 기술된 방법에 따라 예방 및/또는 치료될 수 있는 진균성 질환 또는 진균성 감염증은 다음을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다: 칸디다(Candida) 감염으로 유발된 것들; 접합균증(zygomycosis), 칸디다 유방염(Candida mastitis), 잠복성 트리코스포론혈증을 동반하는 진행성 파종성 트리코스포론증(progressive disseminated trichosporonosis with latent trichosporonemia), 파종성 칸디다증(disseminated candidiasis), 폐 파라콕시디오이데스진균증(pulmonary paracoccidioidomycosis), 폐 아스페르길루스증(pulmonary aspergillosis), 폐포자충 폐렴(Pneumocystis carinii pneumonia), 크립토콕쿠스 수막염(cryptococcal meningitis), 콕시디오이드 수막뇌염 및 뇌척수 혈관염(coccidioidal meningoencephalitis and cerebrospinal vasculitis), 아스페르길루스 니제르 감염(Aspergillus niger infection), 푸사륨 각막염(Fusarium keratitis), 부비동 진균증(paranasal sinus mycoses), 아스페르길루스 푸미가투스 심내막염(Aspergillus fumigatus endocarditis), 경골 연골 형성이상(tibial dyschondroplasia), 칸디다 글라브라타 질염(Candida glabrata vaginitis), 구강인두 칸디다증(oropharyngeal candidiasis), X-연관 만성 육아종 질환(X-linked chronic granulomatous disease), 발백선증(tinea pedis), 피부칸디다증(cutaneous candidiasis), 진균성 태반염(mycotic placentitis), 파종성 트리코스포론증(disseminated trichosporonosis), 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증(allergic bronchopulmonary aspergillosis), 진균성 각막염(mycotic keratitis), 크립토코쿠스 네오포르만스 감염증(Cryptococcus neoformans infection), 진균성 복막염(fungal peritonitis), 쿠르불라리아 엽고병 감염증(Curvularia geniculata infection), 포도구균 내안구염(staphylococcal endophthalmitis), 스포로트리코증(sporotrichosis), 및 피부 사상균증(dermatophytosis).
소정의 구현예에서, 이들 방법은 추가의 치료제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 소정의 구현예에서, 추가의 치료제는 화학요법제, 방사선치료제, 또는 관문 표적화제이다. 소정의 구현예에서, 화학요법제는 아자시티딘(azacitidine)과 같은 저메틸화제(hypomethylating agent)이다. 소정의 구현예에서, 화학요법제는 젬시타빈(gemcitabine)과 같은 DNA 손상-유도제이다. 소정의 구현예에서, 관문 표적화제는 길항제 항-CTLA-4 항체, 길항제 항-PD-L1 항체, 길항제 항-PD-L2 항체, 길항제 항-PD-1 항체, 길항제 항-TIM-3 항체, 길항제 항-LAG-3 항체, 길항제 항-VISTA 항체, 길항제 항-CD96 항체, 항-CEACAM1 항제, 작용제 항-CD137 항체, 작용제 항-GITR 항체, 및 작용제 항-OX40 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정의 구현예에서, 관문 표적화제는 길항제 항-CTLA-4 항체, 길항제 항-PD-L1 항체, 길항제 항-PD-L2 항체, 및 길항제 항-PD-1 항체로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 본원에 개시된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 항체 또는 약학적 조성물은 관문 표적화제와 상승작용을 한다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 사용하기 위한 본 발명의 다중특이적 분자, 항체, 및/또는 약학적 조성물에 관한 것으로서, 상기 방법은 추가 치료제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 (a) 본 발명의 다중특이적 분자, 항체, 및/또는 약학적 조성물; 및 (b) 의약으로서 사용하기 위한 추가 치료제에 관한 것이다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 (a) 본 발명의 다중특이적 분자, 항체, 및/또는 약학적 조성물; 및 (b) 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 추가 치료제에 관한 것이다. 추가의 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 약학적 조성물, 키트, 또는 조립식 키트(kit-of-parts)에 관한 것이다: (a) 본 발명의 다중특이적 분자, 또는 항체, 및/또는 약학적 조성물; 및 (b) 추가 치료제. 소정의 구현예에서, 추가 치료제는 화학요법제, 방사선치료제, 또는 관문 표적화제이다.
소정의 구현예에서, 항-PD-1 항체가 본원에 개시된 방법에 사용된다. 소정의 구현예에서, 항-PD-1 항체는 Bristol-Myers Squibb에 의해 개발된, BMS-936558 또는 MDX1106으로도 알려진 니볼루맙(nivolumab)이다. 소정의 구현예에서, 항-PD-1 항체는 Merck & Co에 의해 개발된, MK-3475로도 알려진 펨브롤리주맙(pembrolizumab)이다. 소정의 구현예에서, 항-PD-1 항체는 CureTech에 의해 개발된, CT-011로도 알려진 피딜리주맙(pidilizumab)이다. 소정의 구현예에서, 항-PD-1 항체는 MedImmune에 의해 개발된, AMP-514로도 알려진 MEDI0680이다. 소정의 구현예에서, 항-PD-1 항체는 Novartis Pharmaceuticals에 의해 개발된 PDR001이다. 소정의 구현예에서, 항-PD-1 항체는 Regeneron Pharmaceuticals에 의해 개발된 REGN2810이다. 소정의 구현예에서, 항-PD-1 항체는 Pfizer에 의해 개발된 PF-06801591이다. 소정의 구현예에서, 항-PD-1 항체는 BeiGene에 의해 개발된 BGB-A317이다. 소정의 구현예에서, 항-PD-1 항체는 AnaptysBio와 Tesaro에 의해 개발된 TSR-042이다. 소정의 구현예에서, 항-PD-1 항체는 Hengrui에 의해 개발된 SHR-1210이다.
본원에 개시된 치료 방법에 사용할 수 있는 항-PD-1 항체의 추가 비제한적인 예는 다음의 특허 및 특허 출원에 개시되어 있으며, 이들 모두는 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다: 미국 특허 제6,808,710호; 미국 특허 제7,332,582호; 미국 특허 제7,488,802호; 미국 특허 제8,008,449호; 미국 특허 제8,114,845호; 미국 특허 제8,168,757호; 미국 특허 제8,354,509호; 미국 특허 제8,686,119호; 미국 특허 제8,735,553호; 미국 특허 제8,747,847호; 미국 특허 제8,779,105호; 미국 특허 제8,927,697호; 미국 특허 제8,993,731호; 미국 특허 제9,102,727호; 미국 특허 제9,205,148호; 미국 특허 공개 제US 2013/0202623 A1호; 미국 특허 공개 제2013/0291136 A1호; 미국 특허 공개 제US 2014/0044738 A1호; 미국 특허 공개 제US 2014/0356363 A1호; 미국 특허 공개 제2016/0075783 A1호; 및 PCT 공개 제WO 2013/033091 A1호; PCT 공개 제WO 2015/036394 A1호; PCT 공개 제WO 2014/179664 A2호; PCT 공개 제WO 2014/209804 A1호; PCT 공개 제WO 2014/206107 A1호; PCT 공개 제WO 2015/058573 A1호; PCT 공개 제WO 2015/085847 A1호; PCT 공개 제WO 2015/200119 A1호; PCT 공개 제WO 2016/015685 A1호; 및 PCT 공개 제WO 2016/020856 A1호.
소정의 구현예에서, 항-PD-L1 항체가 본원에 개시된 방법에 사용된다. 소정의 구현예에서, 항-PD-L1 항체는 Genentech에 의해 개발된 아테졸리주맙(atezolizumab)이다. 소정의 구현예에서, 항-PD-L1 항체는 AstraZeneca, Celgene, 및 MedImmune에 의해 개발된 더발루맙(durvalumab)이다. 소정의 구현예에서, 항-PD-L1 항체는 Merck Serono 및 Pfizer에 의해 개발되고, MSB0010718C로서 알려진 아벨루맙(avelumab)이다. 소정의 구현예에서, 항-PD-L1 항체는 Bristol-Myers Squibb에 의해 개발된 MDX-1105이다. 소정의 구현예에서, 항-PD-L1 항체는 Amplimmune 및 GSK에 의해 개발된 AMP-224이다.
본원에 개시된 치료 방법에 사용할 수 있는 항-PD-L1 항체의 비제한적인 예는 다음의 특허 및 특허 출원에 개시되어 있으며, 이들 모두는 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다: 미국 특허 제7,943,743호; 미국 특허 제8,168,179호; 미국 특허 제8,217,149호; 미국 특허 제8,552,154호; 미국 특허 제8,779,108호; 미국 특허 제8,981,063호; 미국 특허 제9,175,082호; 미국 특허 공개 제US 2010/0203056 A1호; 미국 특허 공개 제US 2003/0232323 A1호; 미국 특허 공개 제US 2013/0323249 A1호; 미국 특허 공개 제US 2014/0341917 A1호; 미국 특허 공개 제US 2014/0044738 A1호; 미국 특허 공개 제US 2015/0203580 A1호; 미국 특허 공개 제US 2015/0225483 A1호; 미국 특허 공개 제US 2015/0346208 A1호; 미국 특허 공개 제US 2015/0355184 A1호; 및 PCT 공개 제WO 2014/100079 A1호; PCT 공개 제WO 2014/022758 A1호; PCT 공개 제WO 2014/055897 A2호; PCT 공개 제WO 2015/061668 A1호; PCT 공개 제WO 2015/109124 A1호; PCT 공개 제WO 2015/195163 A1호; PCT 공개 제WO 2016/000619 A1호; 및 PCT 공개 제WO 2016/030350 A1호.
소정의 구현예에서, 항-CTLA-4 항체가 본원에 개시된 방법에 사용된다. 소정의 구현예에서, 항-CTLA-4 항체는 Bristol-Myers Squibb에 의해 개발된 이필리무맙(ipilimumab)이다.
소정의 구현예에서, 본원에 개시된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체는 면역조절 효소(들)를 표적으로 하는 화합물, 예컨대 IDO (인돌아민-(2,3)-디옥시게나아제) 및/또는 TDO (트립토판 2,3-디옥시게나아제)와 함께 대상체에게 투여된다. 따라서, 소정의 구현예에서, 추가 치료제는 면역조절 효소(들)를 표적으로 하는 화합물, 예컨대 인돌아민-(2,3)-디옥시게나아제(IDO)의 억제제이다. 소정의 구현예에서, 이러한 화합물은 에파카도스타트(Incyte Corp; 예를 들어, 그 전체가 참조로서 본원에 통합된 WO 2010/005958 참조), F001287(Flexus Biosciences/Bristol-Myers Squibb), 인독시모드(NewLink Genetics), 및 NLG919(NewLink Genetics)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정의 구현예에서, 화합물은 에파카도스타트(epacadostat)이다. 또 다른 구현예에서, 화합물은 F001287이다. 또 다른 구현예에서, 화합물은 인독시모드(indoximod)이다. 또 다른 구현예에서, 화합물은 NLG919이다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체 또는 이의 조성물은 암을 치료하기 위해 IDO 억제제와 함께 대상체에게 투여된다. 암을 치료하는 데 사용하기 위한 본원에 기술된 것과 같은 IDO 억제제는 약학적 조성물의 고형 투여 형태, 예컨대, 정제, 알약, 또는 캡슐로 존재하며, 여기서 약학적 조성물은 IDO 억제제 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함한다. 이와 같이, 본원에 기술된 것과 같은 다중특이적 분자 또는 항체 및 본원에 기술된 것과 같은 IDO 억제제는 별도의 투여 형태로서 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 투여될 수 있다. 소정의 구현예에서, 다중특이적 분자 또는 항체는 비경구 투여되고, IDO 억제제는 경구 투여된다. 소정의 구현예에서, 억제제는 에파카도스타트(epacadostat, Incyte Corp), F001287 (Flexus Biosciences/Bristol-Myers Squibb), 인독시모드(indoximod, NewLink Genetics), 및 NLG919 (NewLink Genetics)로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 에파카도스타트는 PCT 공개 제WO 2010/005958호에 기술되어 있으며, 이는 그 전체가 모든 목적을 위해 참조로서 본원에 통합된다. 소정의 구현예에서, 억제제는 에파카도스타트(epacadostat)이다. 또 다른 구현예에서, 억제제는 F001287이다. 또 다른 구현예에서, 억제제는 인독시모드(indoximod)이다. 또 다른 구현예에서, 억제제는 NLG919이다.
소정의 구현예에서, 본원에 기술된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체 또는 이의 조성물은 암을 치료하기 위해 백신과 함께 대상체에게 투여된다. 백신은, 예를 들어 펩티드 백신, DNA 백신, 또는 RNA 백신일 수 있다. 소정의 구현예에서, 백신은 열충격 단백질-기반 종양 백신 또는 열충격 단백질-기반 병원균 백신이다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체는 열충격 단백질-기반 종양 백신과 함께 대상체에게 투여된다. 열충격 단백질(HSP)은 모든 종에 걸쳐 편재하여 발견되는 고도로 보존된 단백질 계열이다. 이들의 발현은 독소, 산화 스트레스 또는 포도당 결핍에 대한 노출을 포함하여 열충격이나 다른 형태의 스트레스의 결과로 훨씬 더 높은 수준으로 강력하게 유도될 수 있다. 다음 5개의 계열이 분자량에 따라 분류되었다: HSP-110, -90, -70, -60 및 -28. HSP는 T 세포 활성화를 유도하는 마크로파지 및 수지상 세포(DC)와 같은 항원 제시 세포(APC)의 교차 제시 경로를 통해 면역원성 펩티드를 전달한다. HSP는 종양 특이적 면역성을 유도할 수 있는 복합체를 형성하는 종양 관련 항원 펩티드의 샤프론 담체(chaperone carriers)로서 기능한다. 죽어가는 종양 세포로부터 방출 시, HSP-항원 복합체는 항원 제시 세포(APC)에 의해 흡수되며, 항원은 항종양 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 활성을 유도하는 MHC 클래스 I 및 클래스 II 분자에 결합되는 펩티드로 가공된다. 종양 제제로부터 유래된 HSP 복합체에 의해 유도된 면역은 각 대상체의 암에 의해 발현된 독특한 항원 펩티드 레퍼토리에 대해 특이적으로 유도된다. 따라서, 소정의 구현예에서, 본 발명은 (a) 본 발명의 다중특이적 분자, 항체, 및/또는 약학적 조성물; 및 (b) 의약으로서 사용하기 위한, 예를 들어 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 백신에 관한 것이다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 약학적 조성물, 키트, 또는 조립식 키트(kit-of-parts)에 관한 것이다: (a) 본 발명의 다중특이적 분자, 항체, 및/또는 약학적 조성물; 및 (b) 백신. 소정의 구현예에서, 백신은 열충격 단백질-기반 종양 백신이다. 소정의 구현예에서, 백신은 열충격 단백질-기반 병원균 백신이다. 소정의 구현예에서, 백신은 그 전체가 참조로서 본원에 통합되는 WO 2016/183486에 기술된 것과 같다.
열충격 단백질 펩티드 복합체(HSPPC)는 항원 펩티드와 비공유 결합된 열충격 단백질로 이루어지는 단백질 펩티드 복합체이다. HSPPC는 선천 면역 반응과 적응적 면역 반응 모두를 유도한다. 특정 구현예에서, 항원 펩티드(들)는 치료 중인 암에 대한 항원성을 나타낸다. HSPPC는 막 수용체(주로 CD91)를 통하거나, 톨-유사 수용체(Toll-like receptor)에 결합됨으로써 APC에 의해 효율적으로 탈취(seized)된다. HSPPC 내재화로 인해 자연 살해 세포(NK), 단핵 세포, 및 Th1 및 Th-2 매개 면역 반응의 활성화를 유도하는 케모카인(chemokine) 및 사이토카인(cytokine) 생산으로 APC의 기능적 성숙이 이뤄진다. 소정의 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 사용된 HSPPC는 항원 펩티드와 복합체를 이룬 스트레스 단백질의 hsp60, hsp70, 또는 hsp90 패밀리 유래의 하나 이상의 열충격 단백질을 포함한다. 소정의 구현예에서, HSPPC는 hsc70, hsp70, hsp90, hsp110, grp170, gp96, 칼레티쿨린(calreticulin), 또는 이들 중 둘 이상의 조합을 포함한다.
특정 구현예에서, 열충격 단백질 펩티드 복합체(HSPPC)는 재조합 열충격 단백질(예: hsp70 또는 hsc70) 또는 재조합 항원성 펩티드와 복합체화된 이의 펩티드 결합 영역을 포함한다. 재조합 열충격 단백질은 재조합 DNA 기술에 의해, 예를 들어 (그 전체가 참조로서 각각 본원에 통합된) Dworniczak 및 Mirault의 문헌[Nucleic Acids Res. 15:5181-5197 (1987)] 및 GenBank 수탁번호 P11142 및/또는 Y00371에 기술된 것과 같은 인간 hsc70 서열을 사용해 생산될 수 있다. 소정의 구현예에서, Hsp70 서열은 Hunt 및 Morimoto의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82 (19), 6455-6459 (1985)] 및 GenBank 수탁 번호 P0DMV8 및/또는 M11717에 기술되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로서 통합된다. 항원성 펩티드는 당업계에 알려진 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수도 있다.
소정의 구현예에서, 항원성 펩티드는 변형된 아미노산을 포함한다. 소정의 구현예에서, 변형된 아미노산은 번역 후 변형을 포함한다. 소정의 구현예에서, 변형된 아미노산은 번역 후 변형의 모방체를 포함한다. 소정의 구현예에서, 변형된 아미노산은 측쇄 하이드록실 또는 아민 상에서 인산화된 Tyr, Ser, Thr, Arg, Lys, 또는 His이다. 소정의 구현예에서, 변형된 아미노산은 측쇄 하이드록실 또는 아민 상에서 인산화된 Tyr, Ser, Thr, Arg, Lys, 또는 His 아미노산의 모방체이다.
특정 구현예에서, 본원에 개시된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체는 암을 치료하기 위해 열충격 단백질 펩티드 복합체(HSPPC), 예를 들어 열충격 단백질 펩티드 복합체-96(HSPPC-96)과 함께 대상체에게 투여된다. HSPPC-96은 항원 펩티드와 복합체를 이루는 96 kDa 열충격 단백질(Hsp), gp96을 포함한다. HSPPC-96은 대상체의 종양에서 제조된 암 면역요법으로, 암의 항원 "지문"을 함유한다. 소정의 구현예에서, 이러한 지문은 특정 대상체의 특정 세포에서만 존재하는 독특한 항원을 함유하며, 백신의 주입은 대상체의 면역 시스템을 자극하여 특정 암 지문을 갖는 임의의 세포를 인식하고 공격하게 하기 위한 것이다. 따라서, 소정의 구현예에서, 본 발명은 암을 치료하기 위한 의약으로서 사용하기 위한 및/또는 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 열충격 단백질 펩티드 복합체(HSPPC)와 조합된 본 발명의 항체 및/또는 약학적 조성물에 관한 것이다.
소정의 구현예에서, HSPPC, 예를 들어 HSPPC-96은 대상체의 종양 조직으로부터 생산된다. 특정 구현예에서, HSPPC(예를 들어 HSPPC-96)는 치료 중인 암 또는 전이 유형의 종양으로부터 생산된다. 또 다른 특정 구현예에서, HSPPC(예를 들어 HSPPC-96)는 치료 중인 대상체의 자가 조직이다. 소정의 구현예에서, 종양 조직은 비괴사성 종양 조직이다. 소정의 구현예에서, 적어도 1그램(예를 들어 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 또는 적어도 10그램)의 비괴사성 종양 조직이 백신 요법을 생산하는 데 사용된다. 소정의 구현예에서, 외과적 절제술 이후, 비괴사성 종양 조직은 백신 제제에 사용되기 전에 냉동된다. 소정의 구현예에서, HSPPC, 예를 들어 HSPPC-96은 정제 기술에 의해 종양 조직으로부터 단리되고, 여과되어 주사 가능한 백신으로 제조된다. 소정의 구현예에서, HSPCC, 예를 들어 HSPCC-96의 6~12회 투여량이 대상체에게 투여된다. 이러한 구현예에서, HSPPC, 예컨대, HSPPC-96의 용량은 첫 4회 분은 매주 투여하고, 2~8회 분은 격주로 투여할 수 있다.
본원에 기술된 방법에 따라 사용될 수 있는 HSPPC의 추가적인 예는 다음의 특허 및 특허 출원에 개시되어 있고, 이들 모두는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다: 미국 특허 제6,391,306호, 제6,383,492호, 제6,403,095호, 제6,410,026호, 제6,436,404호, 제6,447,780호, 제6,447,781호, 및 제6,610,659호.
소정의 구현예에서, 본원에 기술된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체 또는 이의 조성물은 애쥬번트와 함께 대상체에게 투여된다. 다양한 애쥬번트가 치료 맥락에 따라 사용될 수 있다. 적합한 애쥬번트의 비제한적인 예는 다음을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다: 완전 프로인트 애쥬번트(CFA), 불완전 프로인트 애쥬번트(IFA), montanide ISA(불완전 Seppic 애쥬번트), Ribi 애쥬번트 시스템(RAS), Titer Max, 무라밀 펩티드, Syntex Adjuvant Formulation(SAF), 명반(수산화알루미늄 및/또는 인산알루미늄), 알루미늄 염 애쥬번트, Gerbu® 애쥬번트, 니트로셀룰로오스 흡수 항원, 캡슐화되거나 포획된 항원, 3 데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A(3 D-MPL), 면역자극 올리고뉴클레오티드, Toll-유사 수용체(TLR) 리간드, 만난-결합 렉틴(MBL) 리간드, STING 작용제, 사포닌과 같은 면역 자극 복합체, Quil A, QS-21, QS-7, ISCOMATRIX 등. 다른 애쥬번트는 CpG 올리고뉴클레오티드 및 이중 가닥 RNA 분자, 예컨대 폴리(A) 및 폴리(U)를 포함한다. 상기 애쥬번트의 조합이 사용될 수도 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,645,495호; 제7,029,678호; 및 제7,858,589호를 참조하고 이들 모두는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 소정의 구현예에서, 본원에서 사용되는 애쥬번트는 QS-21 STIMULON이다.
소정의 구현예에서, 본원에 개시된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체는 TCR을 포함하는 추가 치료제와 병용으로 대상체에게 투여된다. 소정의 구현예에서, 추가 치료제는 가용성 TCR이다. 소정의 구현예에서, 추가 치료제는 TCR을 발현하는 세포이다. 따라서, 소정의 구현예에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 및/또는 암의 치료 방법에 사용하기 위한, TCR를 포함하는 추가 치료제와 조합된 본 발명의 다중특이적 분자, 항체, 및/또는 약학적 조성물에 관한 것이다.
소정의 구현예에서, 본원에 개시된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자, 또는 단리된 항-TIGIT 항체는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 세포와 함께 대상체에게 투여된다. 소정의 구현예에서, 세포는 T 세포이다.
소정의 구현예에서, 본원에 기술된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체 또는 이의 조성물은 TCR 모방 항체와 함께 대상체에게 투여된다. 소정의 구현예에서, TCR 모방 항체는 펩티드-MHC 복합체에 특이적으로 결합하는 항체이다. TCR 모방 항체의 비제한적인 예에 관해서는, 예를 들어 미국 특허 제9,074,000호, 미국 공개 제US 2009/0304679 A1호, 및 제US 2014/0134191 A1호를 참조하고, 이들 모두는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
소정의 구현예에서, 본원에 개시된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체는 (예를 들어, 그 전체가 참조로서 본원에 통합된 WO2005061547A2에 의해 기술된 것과 같은) 이중특이적 T 세포 관여자(BiTE) 및/또는 (예를 들어, 그 전체가 참조로서 본원에 통합된 WO2012162067A2에 기술된 것과 같은) 이중-친화도 재표적화 항체(DART)와 함께 대상체에게 투여된다. 소정의 구현예에서, BiTE 및/또는 DART는 종양 연관 항원(예를 들어, 종양에서 과발현된 폴리펩티드, 종양바이러스(oncovirus)에서 유래된 폴리펩티드, 종양에 특이적인 번역 후 변형을 포함하는 폴리펩티드, 종양에서 특이적으로 돌연변이된 폴리펩티드) 및 작동자 세포 상의 분자(예를 들어 CD3 또는 CD16)에 특이적으로 결합한다. 소정의 구현예에서, 종양 연관 항원은 EGFR(예를 들어 인간 EGFR)이고, 임의로 여기서 BiTE 및/또는 DART는 세툭시맙의 VH 및 VL 서열을 포함한다. 소정의 구현예에서, 종양 연관 항원은 Her2(예를 들어 인간 Her2)이고, 임의로 여기서 BiTE 및/또는 DART는 트라스투주맙의 VH 및 VL 서열을 포함한다. 소정의 구현예에서, 종양 연관 항원은 CD20(예를 들어 인간 CD20)이다.
항-CD96(예를 들어, 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체 및 추가 치료제(예를 들어, 화학요법제, 방사선치료제, 관문 표적화제, IDO 억제제, 백신, 애쥬번트, 가용성 TCR, TCR을 발현하는 세포, 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포, 및/또는 TCR 모방 항체)는 별도의 투여 형태로서 개별적으로, 순차적으로, 또는 동시에 투여될 수 있다. 소정의 구현예에서, 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체는 비경구 투여되고, IDO 억제제는 경구 투여된다.
본원에 기술된 항체 또는 약학적 조성물은 다양한 경로로 대상체에게 전달될 수 있다. 이들 경로는 비경구, 비강 내, 기관 내, 경구, 피내, 국소, 근육 내, 복강 내, 경피, 정맥 내, 종양 내, 결막, 동맥 내, 및 피하 경로를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 예를 들어, 흡입기 또는 네블라이저, 및 스프레이로서 사용하기 위한 에어로졸화제가 포함된 제형을 사용함으로써 폐 투여가 사용될 수도 있다. 소정의 구현예에서, 본원에 기술된 다중특이적 분자, 항체, 또는 약학적 조성물은 피하 또는 정맥내 전달된다. 소정의 구현예에서, 본원에 기술된 다중특이적 분자, 항체, 또는 약학적 조성물은 동맥내 전달된다. 소정의 구현예에서, 본원에 기술된 다중특이적 분자, 항체, 또는 약학적 조성물은 종양내 전달된다. 소정의 구현예에서, 본원에 기술된 다중특이적 분자, 항체, 또는 약학적 조성물은 종양 배액 림프절 내에 전달된다.
병태의 치료 및/또는 예방에 효과적인 다중특이적 분자, 항체, 또는 조성물의 양은 질환의 성질에 따라 달라질 것이며, 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다.
조성물에 사용될 정확한 투여량은 또한 투여 경로, 및 감염증 또는 감염증에 의한 질환의 심각성에 따라 달라질 것이며, 전문의의 판단 및 각 대상체의 상황에 따라 결정되어야 한다. 예를 들어, 투여 수단, 표적 부위, (연령, 체중 및 건강을 포함하는) 환자의 생리 상태, 환자가 인간인지 동물인지의 여부, 투여된 다른 약물, 또는 치료가 예방적인지 치료적인지 여부에 따라 유효 투여량도 달라질 수 있다. 일반적으로, 환자는 인간이지만, 유전자 이식 포유류를 포함하는 비인간 포유류도 치료할 수 있다. 치료 투여량은 안전성과 효능을 최적화하기 위해 최적으로 적정된다.
본원에 기술된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체는, 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA), 면역 침강, 또는 웨스턴 블롯팅과 같은 면역 검정을 포함하여, 당업자에게 알려져 있는 전통적인 면역 조직학적 방법을 사용해 생물학적 샘플에서 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 단백질 수준을 검정하는데 사용될 수도 있다. 적합한 항체 검정 표지는 당업계에 알려져 있으며, 글루코스 옥시다제와 같은 효소 표지; 요오드(125I, 121I), 탄소(14C), 황(35S), 삼중수소(3H), 인듐(121In), 및 테크네튬(99Tc)과 같은 방사선 동위원소; 루미놀(luminol)과 같은 발광 표지; 및 플로오레세인(fluorescein)과 로다민(rhodamine) 및 비오틴(biotin)과 같은 형광 표지를 포함한다. 이러한 표지는 본원에 기술된 다중특이적 분자 또는 항체를 표지하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로, 본원에 기술된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체를 인식하는 제2 다중특이적 분자 또는 항체를 표지하여, 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체와 함께 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 단백질 수준을 검출하는 데 사용할 수 있다. 따라서, 소정의 구현예에서, 본 발명은 시험관 내에서 생물학적 샘플에서 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 단백질을 검출하기 위한 본 발명의 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체의 용도에 관한 것이다. 추가의 구현예에서, 본 발명은, 시험관 내에서 생물학적 샘플에서 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 단백질 수준을 검정하고/하거나 검출하기 위한 본 발명의 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체의 용도에 관한 것으로서, 임의로 여기서 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체는 방사성 핵종 또는 검출 가능한 표지에 접합되고/되거나, 본원에 기술된 표지를 보유하고/하거나, 여기서 면역조직학적 방법이 사용된다.
CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 단백질의 발현 수준을 검정하는 것은 제1 생물학적 샘플에서 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 단백질 수준을 (예를 들어 절대 단백질 수준을 결정하거나 추정함으로써) 직접적으로 또는 (예를 들어 제2 생물학적 샘플에서의 질환 연관 단백질 수준과 비교함으로써) 상대적으로 정성적으로 또는 정량적으로 측정하거나 추정하는 것을 포함하도록 의도된다. 제1 생물학적 샘플에서의 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 폴리펩티드 발현 수준을 측정하거나 추정하여 표준 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 단백질 수준과 비교할 수 있으며, 여기서 표준은 예를 들어 장애가 없는 개체로부터 수득한 제2 생물학적 샘플로부터 취한 것이거나, 장애가 없는 개체 모집단의 수준을 평균화하여 결정한 것이다. 당업계에서 이해할 수 있듯이, "표준" CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 폴리펩티드 수준을 알게되면, 이를 비교를 위한 표준으로서 반복적으로 사용할 수 있다. 따라서, 추가의 구현예에서, 본 발명은 생물학적 샘플에서 CD96 및/또는 TIGIT 단백질 수준(예를 들어 인간 CD96 및/또는 TIGIT 단백질 수준)을 검정 및/또는 검출하는 시험관 내 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 면역조직학적 방법에 의해 생물학적 샘플에서 CD96 및/또는 TIGIT 단백질(예를 들어 인간 CD96 및/또는 TIGIT 단백질)의 수준을 정성적으로 또는 정량적으로 측정하거나 추정하는 단계를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "생물학적 샘플"은 잠재적으로 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)를 발현하는 대상체, 세포주, 조직, 또는 다른 세포 공급원으로부터 수득한 임의의 생물학적 샘플을 지칭한다. 동물(예를 들어 인간 또는 시노몰구스 원숭이)로부터 조직 생검 및 체액을 수득하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 생물학적 샘플은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 포함한다.
본원에 기술된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체는 본 명세서에 기초하여 예후, 진단, 모니터링, 및 스크리닝 응용예에 사용될 수 있으며, 여기에는 당업자에게 잘 알려져 있고 당업자에게 표준인 시험관내(in vitro) 및 생체내(in vivo) 응용예가 포함된다. 면역 체계 상태 및/또는 면역 반응에 대한 시험관내 평가 및 검증를 위한 예후, 진단, 모니터링, 및 스크리닝 검정 및 이를 위한 키트는, 면역 체계 기능 이상을 앓고 있거나 의심되는 환자를 포함하여 환자의 샘플을 평가하기 위해 예측, 진단, 및 모니터링하는데 사용되거나, 예상되거나 원하는 면역 체계 반응, 항원 반응 또는 백신 반응과 관련하여 사용될 수 있다. 면역 체계 상태 및/또는 면역 반응에 대한 평가 및 검증은 상이한 제제 또는 항체 대비, 약물의 임상 시험에 대한 환자의 적합성 또는 특정 화학 요법제, 방사선치료제, 또는 항체(이들의 조합을 포함함)의 투여에 대한 환자의 적합성을 결정하는데 있어서도 유용하다. 이러한 유형의 예후 및 진단 모니터링 및 평가는 유방암의 HER2 단백질에 대항해 항체를 사용하여 이미 시행되고 있으며(HercepTestTM, Dako), 이러한 분석법은 Herceptin®을 사용하는 항체 치료법에 대한 환자의 평가에도 사용된다. 생체내 적용에는 유도성 세포 치료, 면역계 조절, 및 면역 반응의 방사선 영상화가 포함된다. 따라서, 소정의 구현예에서, 본 발명은 진단으로서 사용하기 위한 본 발명의 항-CD96 항체 및/또는 약학적 조성물에 관한 것이다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 면역계 기능장애를 갖거나 기능장애가 의심되는 대상체를 예측, 진단, 및/또는 모니터링하고/하거나, 기대하는 또는 바람직한 면역계 반응, 항원 반응, 또는 백신 반응과 관련하여 대상체를 예측, 진단, 및/또는 모니터링하는 방법에 사용하기 위한 본 발명의 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체, 및/또는 약학적 조성물에 관한 것이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 시험관 내에서 대상체의 생물학적 샘플에서 인간 CD96 및/또는 TIGIT 단백질 수준을 검정 및/또는 검출함으로써, 면역계 기능장애를 갖거나 기능장애가 의심되는 대상체를 예측, 진단, 및/또는 모니터링하고/하거나, 기대하는 또는 바람직한 면역 반응, 항원 반응, 또는 백신 반응과 관련하여 대상체를 예측, 진단, 및/또는 모니터링하기 위한, 본 발명의 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체의 용도에 관한 것이다.
소정의 구현예에서, 본원에 기술된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체는 생검 샘플의 면역조직화학에 사용될 수 있다. 소정의 구현예에서, 상기 방법은 시험관 내 방법이다. 또 다른 구현예에서, 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체를 사용해 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)의 수준을 검출하거나, CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)를 막 표면에 함유하는 세포의 수준을 검출한 다음, 그 수준을 특정 질환 증상과 연결시킬 수 있다. 본원에 기술된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체는 검출 가능한 또는 기능적 표지를 가질 수 있고/있거나 방사성 핵종 또는 검출 가능한 표지에 접합될 수 있다. 형광 표지가 사용되는 경우, 현재 이용 가능한 현미경 및 형광-활성화 세포 선별기 분석(FACS) 또는 당업계에 공지된 두 방법 절차의 조합이 특정 결합 멤버를 동정하고 정량화하는데 이용될 수 있다. 본원에 기술된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체는 형광 표지를 갖거나 이에 접합될 접합될 수 있다. 예시적인 형광 표지는, 예를 들어, 반응성 및 접합된 프로브, 예컨대, 아미노쿠마린(Aminocoumarin), 플루오레신 및 텍사스 레드(Fluorescein and Texas red), 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 염료, Cy 염료 및 DyLight 염료를 포함한다. 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체는 동위원소 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 67Cu, 90Y, 99Tc, 111In, 117Lu, 121I, 124I, 125I, 131I, 198Au, 211At, 213Bi, 225Ac, 및 186Re와 같은 방사성 표지 또는 방사성 핵종을 각거나 이에 접합될 수 있다. 방사성 표지가 사용되는 경우, 당업계에 알려진 현재 이용 가능한 계수 절차를 사용하여 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자가 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 것, 또는 단리된 항-TIGIT 항체가 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 것을 식별하고 정량화할 수 있다. 표지가 효소인 경우, 당업계에 알려진 것과 같은, 현재 이용되는 비색 분석, 분광 측정, 형광 분광 측정, 전류 측정 또는 가스 측정 기술 중 어느 하나에 의해 검출을 수행할 수 있다. 이는, 항-CD96 및/또는 항-TIGIT 다중특이적 분자와 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 간에, 또는 항-TIGIT 항체와 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 간에 복합체가 형성될 수 있는 조건 하에, 샘플 또는 대조군 샘플을 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체와 접촉시킴으로써 달성될 수 있다. 항-CD96 및/또는 항-TIGIT 다중특이적 분자와 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 간에, 또는 항-TIGIT 항체와 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 간에 형성된 임의의 복합체를 검출하고 샘플 및 대조군에서 비교한다. 본원에 기술된 다중특이적 분자의 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 대한 특이적 결합, 및 본원에 기술된 항-TIGIT 항체의 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 대한 특이적 결합을 고려하면, 다중특이적 분자는 세포 표면에서 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 발현을 특이적으로 검출하는데 사용될 수 있고, 항-TIGIT 항체는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)를 특이적으로 검출하는 데 사용될 수 있다. 본원에 기술된 항-CD96 및/또는 항-TIGIT 다중특이적 분자는 면역 친화도 정제를 통해 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)를 정제하는 데 사용될 수도 있다. 본원에 기술된 항-TIGIT 항체는 면역 친화도 정제를 통해 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)를 정제하는 데 사용될 수도 있다. 또한, 예를 들어 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT), 또는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)/ CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 리간드 복합체 및/또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)/ TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 리간드 복합체의 존재 정도를 정량적으로 분석하기 위한 시험 키트, 키트, 또는 조립식 키트의 형태로 제조될 수 있는, 검정 시스템이 본원에 포함된다. 상기 시스템, 시험 키트, 키트, 또는 조립식 키트는 표지된 성분, 예를 들어, 표지된 항체, 및 하나 이상의 추가 면역화학 시약을 포함할 수 있다.
7.5
폴리뉴클레오티드, 벡터, 및 다중특이적 분자 및 항체를 생산하는 방법
또 다른 양태에서, CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 항원에 특이적으로 결합하는 본원에 기술된 다중특이적 분자 또는 항체, 또는 이의 일부, 또는 이의 단편(예: VL 및/또는 VH; 및 경쇄 및/또는 중쇄)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및 벡터, 예를 들어 숙주 세포(예를 들어 대장균 및 포유류 세포)에서의 재조합 발현을 위한 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 본원에 제공된다. 본원에 제공된 항체 중 어느 하나의 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라 이러한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터, 예를 들어 포유류 세포와 같은 숙주 세포에서 이들의 효율적인 발현을 위한 발현 벡터가 본원에 제공된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "단리된(isolated)" 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자는 핵산 분자의 천연 공급원에(예: 마우스 또는 인간에) 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리된 것이다. 또한, cDNA 분자와 같은 "단리된" 핵산 분자는, 재조합 기술에 의해 생산될 때 다른 세포 물질(cellular material)이나 배지가 실질적으로 없거나, 화학적으로 합성될 때 화학 전구체나 다른 화학 물질이 실질적으로 없을 수 있다. 예를 들어, "실질적으로 없는"이라는 용어는 다른 물질, 예를 들어 세포 물질, 배지, 다른 핵산 분자, 화학적 전구체 및/또는 다른 화학 물질을 약 15%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0.5%, 또는 0.1% 미만으로(특히, 약 10% 미만으로) 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자의 조제를 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항체를 암호화하는 핵산 분자(들)은 단리되거나 정제된다.
특정 양태에서, CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고 본원에 기술된 것과 같은 아미노산 서열을 포함하는 다중특이적 분자 및 항체 뿐만 아니라, CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 폴리펩티드에 결합하기 위해 이러한 다중특이적 분자 및 항체와 (예를 들어 투여량 의존적 방식으로) 경쟁하거나 이러한 다중특이적 분자 및 항체의 에피토프가 결합하는 것과 동일한 에피토프에 결합하는 다중특이적 분자 및 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에 제공된다.
소정의 양태에서, 본원에 기술된 다중특이적 분자 또는 항체의 경쇄 또는 중쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에 제공된다. 폴리뉴클레오티드는 본원에 기술된 다중특이적 분자 또는 항체의 VL FR 및 CDR을 포함하는 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표 1 및 표 2 참조) 또는 본원에 기술된 다중특이적 분자 또는 항체의 VH FR 및 CDR을 포함하는 중쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(예를 들어 표 1 및 표 2 참조)을 포함할 수 있다. 소정의 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 본원에 기술된 다중특이적 분자의 VH, VL, 중쇄, 및/또는 경쇄를 암호화한다. 또 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제1 VH 및 제1 VL을 암호화한다. 또 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제2 VH 및 제2 VL을 암호화한다. 또 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제1 중쇄 및 제1 경쇄를 암호화한다. 또 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제2 중쇄 및 제2 경쇄를 암호화한다. 또 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 본원에 기술된 단리된 항체의 VH 및/또는 VL, 또는 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화한다.
또한, 예를 들어 코돈/RNA 최적화, 이종 신호 서열과의 치환, 및 mRNA 불안정 요소의 제거에 의해 최적화된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 본원에 제공된다. 코돈 변화를 도입하고/하거나 mRNA에서 억제 영역을 제거함으로써 재조합 발현을 위해, 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체 또는 이의 단편(예를 들어 경쇄, 중쇄, VH 도메인, 또는 VL 도메인)을 암호화하는 최적화된 핵산을 생성하는 방법은, 예를 들어, 미국 특허 제5,965,726호; 제6,174,666호; 제6,291,664호; 제6,414,132호; 및 제6,794,498호(이들 모두는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨)에 기술된 최적화 방법을 적절히 조정으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, RNA 내의 잠재적 접합 부위 및 불안정 요소(예: A/T 또는 A/U가 풍부한 요소)는 핵산 서열에 의해 암호화된 아미노산을 변경시키지 않고 돌연변이되어 재조합 발현을 위한 RNA의 안정성을 증가시킬 수 있다. 변경은, 예를 들어 동일한 아미노산에 대한 대체 코돈을 사용하여 유전 암호의 축퇴(degeneracy)를 이용한다. 소정의 구현예에서, 보존적 돌연변이(예를 들어, 원래의 아미노산과 유사한 화학 구조 및 특성 및/또는 기능을 갖는 유사 아미노산)를 암호화하기 위해 하나 이상의 코돈을 변경시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 방법은, 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 이의 단편의 발현을, 최적화되지 않은 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자의 발현에 비해 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 또는 100배 또는 그 이상만큼 증가시킬 수 있다.
소정의 구현예에서, 본원에 기술된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체 또는 이의 단편(예: VL 도메인 및/또는 VH 도메인)을 암호화하는 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열은 본원에 기술된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체 또는 이의 단편(예: VL 도메인 및/또는 VH 도메인)을 암호화하는 최적화되지 않은 폴리뉴클레오티드 서열의 안티센스(예: 상보적) 폴리뉴클레오티드에 혼성화될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 최적화된 뉴클레오티드 서열은 본원에 기술된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체를 암호화하는 최적화되지 않은 폴리뉴클레오티드 서열의 안티센스 폴리뉴클레오티드에, 높은 엄중도 조건 하에 혼성화된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 최적화된 뉴클레오티드 서열은 본원에 기술된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 단리된 항-TIGIT 항체를 암호화하는 최적화되지 않은 뉴클레오티드 서열의 안티센스 폴리뉴클레오티드에, 높은 엄중도 조건, 중간 또는 낮은 엄중도 조건 하에 혼성화된다. 엄중도 조건에 관한 정보는, 예를 들어 그 전체가 참조로서 본원에 통합된 미국 특허 출원 공개 제2005/0048549호(예: 72~73 단락)에 기술되어 있다.
당업계에 알려진 방법에 의해 폴리뉴클레오티드를 수득할 수 있고, 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 결정할 수 있다. 본원에 기술된 다중특이적 분자 및 항체, 예를 들어 표 1 및 표 2에 기술된 다중특이적 분자 및 항체, 및 이들 다중특이적 분자 및 항체의 변형된 버전을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 결정할 수 있다. 즉, 특정 아미노산을 암호화하는 것으로 알려진 뉴클레오티드 코돈은, 다중특이적 분자 또는 항체를 암호화하는 핵산을 생성하는 방식으로 조립된다. 다중특이적 분자 및 항체를 암호화하는 이러한 폴리뉴클레오티드는 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드로부터 (예를 들어, 그 전체가 참조로서 본원에 통합된 Kutmeier G 등의 문헌[(1994), BioTechniques 17: 242-6]에 기술된 것과 같이) 조립될 수 있으며, 이는 간략하게는, 다중특이적 분자 및 항체를 암호화하는 서열의 일부를 함유하는 중첩 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 이들 올리고뉴클레오티드를 어닐링하고 결합시킨 다음, 결합된 올리고뉴클레오티드를 PCR에 의해 증폭시키는 것을 포함한다.
대안적으로, 본원에 기술된 다중특이적 분자의 항원 결합 영역 또는 본원에 기술된 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 당업계에 잘 알려진 방법(예: PCR 및 다른 분자 클로닝 방법)을 사용하여 적절한 공급원(예를 들어 하이브리도마)에서 유래된 핵산으로부터 생성될 수 있다. 예를 들어, 알려진 서열의 3' 및 5' 말단에 혼성화될 수 있는 합성 프라이머를 사용하는 PCR 증폭은 관심 항체를 생산하는 하이브리도마 세포로부터 수득된 게놈 DNA를 사용하여 수행할 수 있다. 이러한 PCR 증폭 방법은 다중특이적 분자 또는 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산을 수득하는 데 사용될 수 있다. 이러한 PCR 증폭 방법은 다중특이적 분자 또는 항체의 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산을 수득하는 데 사용될 수 있다. 증폭된 핵산은 숙주 세포에서의 발현 및 추가 클로닝을 위해 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
특정 항원 결합 영역 또는 항체를 암호화하는 핵산을 함유하는 클론을 이용할 수는 없지만 항원 결합 영역 또는 항체 분자의 서열을 알고 있는 경우, 3' 및 5' 단부에 혼성화될 수 있는 합성 프라이머를 사용하는 PCR 증폭에 의해서, 또는 예를 들어 항체를 암호화하는 cDNA 클론을 cDNA 라이브러리로부터 식별하는 특정 유전자 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 클로닝에 의해서, 면역글로불린을 암호화하는 핵산을 화학적으로 합성하거나 적절한 공급원으로부터 (예를 들어, 항체 cDNA 라이브러리로부터, 또는 항체를 발현하는 임의의 조직 또는 세포, 예컨대 본원에 기술된 항체를 발현하도록 선택된 하이브리도마 세포 로부터 생성된 cDNA 라이브러리, 또는 이들 조직 또는 세포로부터 단리된 핵산, 바람직하게는 폴리 A+ RNA로부터) 수득할 수 있다. 그런 다음, PCR에 의해 생성된 증폭된 핵산을 당업계에 잘 알려진 임의의 방법을 사용하여 복제 가능한 클로닝 벡터 내에 클로닝할 수 있다.
본원에 기술된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 단리된 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)를 암호화하는 DNA는 통상적인 절차를 사용해(예를 들어 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 항원 결합 영역, 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 항원 결합 영역, 또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 쉽게 단리하고 시퀀싱할 수 있다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 공급원의 역할을 할 수 있다. 단리된 후, DNA를 발현 벡터에 넣을 수 있는데, 그런 다음 달리 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 대장균 세포, 시미안 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포(예를 들어 CHO GS System??(Lonza)의 CHO 세포), 또는 골수종 세포 내로 벡터를 형질감염시켜 재조합 숙주 세포에서 항-CD96 및/또는 항-TIGIT 다중특이적 분자 또는 항-TIGIT 항체를 합성할 수 있다.
전체 항체 또는 항원 결합 영역을 생성하기 위해, VH 및 VL 뉴클레오티드 서열, 제한 부위, 및 제한 부위를 보호하는 인접 서열을 포함하는 PCR 프라이머를 사용하여 scFv 클론에서 VH 또는 VL 서열을 증폭할 수 있다. 당업자에게 알려져 있는 클로닝 기술을 이용하면, PCR 증폭된 VH 도메인을 중쇄 불변 영역(예를 들어 인간 감마 1 또는 인간 감마 4 불변 영역)을 발현하는 벡터 내로 클로닝할 수 있고, PCR 증폭된 VL 도메인을 경쇄 불변 영역(예를 들어 인간 카파 또는 람다 불변 영역)을 발현하는 벡터 내로 클로닝할 수 있다. 소정의 구현예에서, VH 또는 VL 도메인을 발현시키기 위한 벡터는 EF-1α 프로모터, 분비 신호, 가변 영역에 대한 클로닝 부위, 불변 영역, 및 네오마이신과 같은 선택 마커를 포함한다. VH 및 VL 도메인을 필수 불변 영역을 발현하는 하나의 벡터 내로 클로닝할 수도 있다. 그런 다음, 중쇄 변환 벡터 및 경쇄 변환 벡터는 세포주에 공동으로 형질 감염되어, 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 전장 항체, 예를 들어, IgG를 발현하는 안정한 또는 일시적인 세포주를 생성할 수 있다.
예를 들어, 쥣과 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역에 대한 암호화 서열을 치환시키거나, 비면역 글로불린 폴리펩티드에 대한 암호화 서열의 전부 또는 일부를 면역 글로불린 암호화 서열에 공유 결합시킴으로써 DNA를 변형시킬 수도 있다.
또한, 본원에 기술된 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 높은 엄중도, 중간 엄중도, 또는 낮은 엄중도 혼성화 조건 하에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드는 본원에 제공된 VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 높은 엄중도, 중간 엄중도, 또는 낮은 엄중도의 혼성화 조건 하에 혼성화된다.
혼성화 조건은 당업계에 기술되어 있고 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 엄중도 조건 하에서의 혼성화는 약 45℃의 6x 염화나트륨/구연산나트륨(SSC)에서 필터 결합된 DNA에 혼성화한 후 약 50~65℃의 0.2xSSC/0.1% SDS에서 1회 이상 세척하는 것을 포함할 수 있고; 높은 엄중도 조건 하에서의 혼성화는 약 45℃의 6xSSC에서 필터 결합된 핵산에 혼성화한 후 약 68℃의 0.1xSSC/0.2% SDS에서 1회 이상 세척하는 것을 포함할 수 있다. 다른 엄중도 혼성화 조건 하에서의 혼성화는 당업자에게 알려져 있고 기술되어 있다(예를 들어, Ausubel FM (eds.) 등의 문헌[(1989) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York 6.3.1-6.3.6 및 2.10.3쪽]을 참조하고, 동 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨).
특정 양태에서, CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 본원에 기술된 다중특이적 분자 또는 이의 항원 결합 단편을 (예를 들어 재조합적으로) 발현하는 세포(예를 들어 숙주 세포), TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 본원에 기술된 항체를 (예를 들어 재조합적으로) 발현하는 세포(예를 들어 숙주 세포), 및 관련된 폴리뉴클레오티드 및 발현 벡터가 본원에 제공된다. 숙주 세포에서, 바람직하게는 포유류 세포(예: CHO 세포)에서의 재조합 발현을 위해, 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 이의 항원 결합 영역, 및 항-TIGIT 항체 또는 단편을 암호화하는 뉴크레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터(예: 발현 벡터)가 본원에 제공된다. 또한, 본원에 기술된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자, 및 항-TIGIT 항체(예를 들어 인간 또는 인간화 항체)를 재조합적으로 발현하기 위한 이러한 벡터를 포함하는 숙주 세포가 본원에 제공된다. 특정 양태에서, 본원에 기술된 다중특이적 분자 또는 항체를 생산하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 숙주 세포로부터 다중특이적 분자 또는 이의 항월 결합 영역, 또는 항체를 발현시키는 단계를 포함한다.
CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 본원에 기술된 다중특이적 분자 또는 이의 항원 결합 영역, 또는 항체(예를 들어 전장 항체 결합 영역 또는 항체, 또는 본원에 기술된 항체의 중쇄 및/또는 경쇄)의 재조합 발현은 일반적으로, 다중특이적 분자 또는 이의 항원 결합 영역, 또는 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터를 작제하는 것을 포함한다. 본원에 기술된 다중특이적 분자 또는 이의 항원 결합 영역, 또는 항체 분자, 다중특이적 분자 또는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄, 또는 이의 단편(예를 들어 중쇄 또는 경쇄 가변 영역)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 수득된 후, 다중특이적 분자 또는 이의 항원 결합 영역 또는 항체 분자의 생산을 위한 벡터를 당업계에 알려진 기술을 사용하는 재조합 DNA 기술에 의해 생산할 수 있다. 따라서, 뉴클레오티드 서열을 암호화하는 다중특이적 분자 또는 이의 항원 결합 영역, 또는 항체 또는 항체 단편(예: 경쇄 또는 중쇄)을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 발현시킴으로써 단백질을 제조하는 방법이 본원에 기술된다. 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 다중특이적 분자 또는 이의 항원 결합 영역, 또는 항체 또는 항체 단편(예: 경쇄 또는 중쇄) 코딩 서열 및 적절한 전사 및 번역 조절 신호를 함유하는 발현 벡터를 작제할 수 있다. 이들 방법은, 예를 들어, 시험관내(in vitro) 재조합 DNA 기술, 합성 기술, 및 생체내(in vivo) 유전적 재조합을 포함한다. 또한, 본원에 기술된 다중특이적 분자 또는 이의 항원 결합 영역, 또는 항체 분자, 항체의 중쇄 또는 경쇄, 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 또는 이의 단편, 또는 중쇄 또는 경쇄 CDR을 암호화하고, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 복제 가능한 벡터가 제공된다. 이러한 벡터는, 예를 들어 다중특이적 분자 또는 항체 분자의 불변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고(예를 들어 그 전체가 참조로서 본원에 통합된 국제 공개 제WO 86/05807호 및 제WO 89/01036호; 및 미국 특허 제5,122,464호 참조), 다중특이적 분자 또는 항체의 가변 영역은 전체 중쇄, 전체 경쇄, 또는 전체 중쇄와 경쇄 모두의 발현을 위해 이러한 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
소정의 구현예에서, 벡터는 본원에 기술된 다중특이적 분자의 VH, VL, 중쇄, 및/또는 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 벡터는 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제1 VH 및 제1 VL을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 벡터는 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제2 VH 및 제2 VL을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 벡터는 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제1 중쇄 및 제1 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 벡터는 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제2 중쇄 및 제2 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 벡터는 본원에 기술된 단리된 항체의 VH 및/또는 VL, 또는 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
발현 벡터는 종래 기술에 의해 세포(예: 숙주 세포)에 전달될 수 있고, 그런 다음 생성된 세포는 종래 기술에 의해 배양되어 본원에 기술된 다중특이적 분자 또는 이의 항원 결합 영역, 또는 항체 또는 이의 단편을 생산할 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 다중특이적 분자 또는 이의 항원 결합 영역, 또는 항체 또는 이의 단편, 또는 이의 중쇄 또는 경쇄, 또는 이의 단편, 또는 본원에 기술된 단쇄 항체를 암호화하고, 숙주 세포에서 이러한 서열을 발현시키기 위해 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 숙주 세포가 본원에 제공된다.
소정의 구현예에서, 숙주 세포는 본원에 기술된 다중특이적 분자의 VH, VL, 중쇄, 및/또는 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 숙주 세포는 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제1 VH 및 제1 VL을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 숙주 세포는 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제2 VH 및 제2 VL을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 숙주 세포는 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제1 중쇄 및 제1 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 숙주 세포는 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제2 중쇄 및 제2 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 숙주 세포는 본원에 기술된 단리된 항체의 VH 및/또는 VL, 또는 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
소정의 구현예에서, 숙주 세포는 본원에 기술된 다중특이적 분자의 VH, VL, 중쇄, 및/또는 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 숙주 세포는 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제1 VH 및 제1 VL을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 숙주 세포는 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제2 VH 및 제2 VL을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 숙주 세포는 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제1 중쇄 및 제1 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 숙주 세포는 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제2 중쇄 및 제2 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 숙주 세포는 본원에 기술된 단리된 항체의 VH 및/또는 VL, 또는 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다.
소정의 구현예에서, 숙주 세포는 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제1 항원 결합 영역의 VH 및 VL을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 및 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제2 항원 결합 영역의 VH 및 VL을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 숙주 세포는 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제1 항원 결합 영역의 VH 및 VL을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 벡터, 및 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제2 항원 결합 영역의 VH 및 VL을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 벡터를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 숙주 세포는 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제1 항원 결합 영역의 VH를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 및 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제1 항원 결합 영역의 VL을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드, 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제2 항원 결합 영역의 VH를 암호화하는 제3 폴리뉴클레오티드, 및 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제2 항원 결합 영역의 VL을 암호화하는 제4 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 숙주 세포는 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제1 항원 결합 영역의 VH를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 벡터, 및 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제1 항원 결합 영역의 VL을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 벡터, 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제2 항원 결합 영역의 VH를 암호화하는 제3 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제3 벡터, 및 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제2 항원 결합 영역의 VL을 암호화하는 제4 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제4 벡터를 포함한다.
소정의 구현예에서, 숙주 세포는 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제1 항원 결합 영역의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 및 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제2 항원 결합 영역의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 숙주 세포는 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제1 항원 결합 영역의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 벡터, 및 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제2 항원 결합 영역의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 벡터를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 숙주 세포는 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제1 항원 결합 영역의 중쇄를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 및 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제1 항원 결합 영역의 경쇄를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드, 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제2 항원 결합 영역의 중쇄를 암호화하는 제3 폴리뉴클레오티드, 및 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제2 항원 결합 영역의 경쇄를 암호화하는 제4 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 숙주 세포는 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제1 항원 결합 영역의 중쇄를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 벡터, 및 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제1 항원 결합 영역의 경쇄를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 벡터, 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제2 항원 결합 영역의 중쇄를 암호화하는 제3 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제3 벡터, 및 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제2 항원 결합 영역의 경쇄를 암호화하는 제4 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제4 벡터를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 숙주 세포는 본원에 기술된 단리된 항체의 VH 및 VL을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 숙주 세포는 본원에 기술된 단리된 항체의 VH 및 VL을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 숙주 세포는 본원에 기술된 단리된 항체의 VH를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 및 본원에 기술된 단리된 항체의 VL을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 숙주 세포는 본원에 기술된 단리된 항체의 VH를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 벡터, 및 본원에 기술된 단리된 항체의 VL을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 벡터를 포함한다.
특정 구현예에서, 제1 세포에 의해 발현된 중쇄/중쇄 가변 영역이 제2 세포의 경쇄/경쇄 가변 영역과 결합되어 본원에 기술된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 이의 항원 결합 영역, 또는 본원에 기술된 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 항체를 형성한다. 소정의 구현예에서, 이러한 제1 숙주 세포 및 이러한 제2 숙주 세포를 포함하는 숙주 세포의 모집단이 본원에서 제공된다.
소정의 구현예에서, 본원에 기술된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 이의 항원 결합 영역, 또는 본원에 기술된 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 항체의 경쇄/경쇄 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 벡터, 및 본원에 기술된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 이의 항원 결합 영역, 또는 본원에 기술된 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 항체의 중쇄/중쇄 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 벡터를 포함하는 벡터 집단이 본원에 제공된다.
다양한 숙주 발현 벡터 시스템이 본원에 기술된 다중특이적 분자 또는 이의 항원 결합 영역, 또는 본원에 기술된 항체 분자를 발현하는데 사용될 수 있다(예를 들어 미국 특허 제5,807,715호를 참조하고, 그 전체는 참조로서 본원에 통합됨). 이러한 숙주-발현 시스템은, 관심 암호화 서열이 생성된 다음 정제될 수 있는 비히클을 나타낼 뿐만 아니라, 적절한 뉴클레오티드 암호화 서열로 형질전환되거나 형질감염될 때, 본원에 기술된 다중특이적 분자 또는 이의 항원 결합 영역, 또는 본원에 기술된 항체 분자를 인시튜(in situ) 발현할 수 있는 세포도 나타낸다. 여기에는 다음이 포함되지만 이들로 한정되지는 않는다: 예를 들어 다중특이적 분자 또는 이의 항원 결합 영역의 코딩 서열 또는 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아와 같은 미생물(예: 대장균 및 고초균); 예를 들어 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질 전환된 효모(예: 사카로마이세스 피치아(Saccharomyces Pichia)); 예를 들어 다중특이적 분자 또는 이의 항원 결합 영역의 코딩 서열, 또는 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예: 버큘로바이러스)로 감염시킨 곤충 세포 시스템; 예를 들어 다중특이적 분자 또는 이의 항원 결합 영역의 코딩 서열 또는 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예: 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV); 담배 모자이크 바이러스(TMV))로 감염시켰거나, 예를 들어 재조합 플라스미드 발현 벡터(예: Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템(예: 녹조(Chlamydomonas reinhardtii)와 같은 녹색 조류); 또는 예를 들어 포유류 세포의 게놈에서 유래된 프로모터(예: 메탈로티오네인 프로모터(metallothionein promoter)) 또는 포유류 바이러스에서 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터; 우두 바이러스 7.5K 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 작제물을 보유하는 포유류 세포 시스템(예를 들어 COS (예: COS1 또는 COS), CHO, BHK, MDCK, HEK 293, NS0, PER.C6, VERO, CRL7O3O, HsS78Bst, HeLa, 및 NIH 3T3, HEK-293T, HepG2, SP210, R1.1, B-W, L-M, BSC1, BSC40, YB/20, 및 BMT10 세포). 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항체를 발현하기 위한 세포는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 예를 들어 CHO GS System??(Lonza)의 CHO 세포이다. 소정의 구현예에서, CHO 세포에 의해 생산된 다중특이적 분자 또는 이의 항원 결합 영역, 또는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄는 피로글루타메이트로 치환된 N-말단 글루타민 또는 글루타메이트 잔기를 가질 수 있다. 소정의 구현예에서, 본원에 기술된 항체를 발현하기 위한 세포는 인간 세포, 예컨대, 인간 세포주이다. 특정 구현예에서, 포유류 발현 벡터는 pOptiVEC?? 또는 pcDNA3.3이다. 소정의 구현예에서, 특히 전체 재조합 항체 분자의 발현을 위한 대장균(Escherichia coli)과 같은 박테리아 세포 또는 진핵 세포(예: 포유류 세포)가 재조합 항체 분자의 발현에 사용된다. 예를 들어, 인간 사이토메갈로바이러스 유래의 주요 중간 조기 유전자 프로모터 요소와 같은 벡터와 함께, CHO 세포와 같은 포유류 세포는 항체에 대한 효과적인 발현 시스템이다(Foecking MK & Hofstetter H의 문헌[(1986) Gene 45: 101-5]; 및 Cockett MI 등의 문헌[(1990) Biotechnology 8(7): 662-7], 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 소정의 구현예에서, 본원에 기술된 다중특이적 분자 또는 이의 항원 결합 영역, 또는 본원에 기술된 항체는 CHO 세포 또는 NS0 세포에 의해 생산된다. 특정 구현예에서, TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합하는 본원에 기술된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 이의 항원 결합 영역, 또는 본원에 기술된 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 발현은 구성 프로모터, 유도성 프로모터, 또는 조직 특이적 프로모터에 의해 조절된다.
박테리아 시스템에서, 다수의 발현 벡터는 발현되는 다중특이적 분자 또는 항체 분자의 의도된 용도에 따라 유리하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 다중특이적 분자 또는 항체 분자의 약학적 조성물을 생성하기 위해 대량의 이러한 다중특이적 분자 또는 항체를 생산하는 경우, 쉽게 정제되는 융합 단백질 산물의 발현을 높은 수준으로 유도하는 벡터가 바람직할 수 있다. 이러한 벡터는 다음을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다: 융합 단백질이 생산되도록, 벡터 내로 코딩 서열이 lac Z 코딩 영역과 프레임 내 결찰될 수 있는 대장균 발현 벡터 pUR278 (Ruether U & Mueller-Hill B의 문헌[(1983) EMBO J 2: 1791-1794]); pIN 벡터 (Inouye S & Inouye M의 문헌[(1985) Nuc Acids Res 13: 3101-3109]; Van Heeke G & Schuster SM의 문헌[(1989) J Biol Chem 24: 5503-5509]); 등(이들 모두는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 예를 들어, pGEX 벡터가 외래 폴리펩티드를 글루타티온 5-트랜스퍼라아제(GST)와의 융합 단백질로서 발현시키는데 사용될 수도 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이며, 용해된 세포를 글루타티온-아가로스 비드에 흡착시킨 다음 유리 글루타티온의 존재 하에 용리함으로써 용해된 세포로부터 쉽게 정제될 수 있다. pGEX 벡터는, 클로닝된 표적 유전자 산물이 GST 모이어티로부터 방출될 수 있도록 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 설계된다.
곤충 시스템에서, 예를 들어, 오토그라파 캘리포니카 핵 다각체병 바이러스(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus, AcNPV)가 외래 유전자를 발현하기 위한 벡터로서 사용될 수 있다. 바이러스는 열대 거세미나방(Spodoptera Frugiperda) 세포에서 성장한다. 코딩 서열은 바이러스의 비-필수 영역(예를 들어, 폴리헤드린 유전자) 내로 개별적으로 클로닝될 수 있고 AcNPV 프로모터(예를 들어, 폴리헤드린 프로모터)에 의해 조절될 수 있다.
포유류 숙주 세포에서, 다수의 바이러스 기반 발현 시스템이 사용될 수 있다. 아데노바이러스가 발현 벡터로서 사용되는 경우, 관심 코딩 서열은 아데노바이러스 전사/번역 조절 복합체, 예를 들어, 후기 프로모터 및 삼중 리더 서열(tripartite leader sequence)에 연결될 수 있다. 그런 다음, 이러한 키메라 유전자rk 시험관 내 또는 생체 내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈에 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈을 비-필수 영역(예를 들어, 영역 El 또는 E3)에 삽입하면, 감염된 숙주에서 생존할 수 있고 분자를 발현할 수 있는 재조합 바이러스가 생성된다(예를 들어, 그 전체가 참조로서 본원에 통합되는 Logan J & Shenk T의 문헌[(1984) PNAS 81(12): 3655-9] 참조). 삽입된 코딩 서열의 효율적인 번역을 위해서는 특정 개시 신호가 필요할 수도 있다. 이들 신호는 ATG 개시 코돈 및 인접 서열을 포함한다. 또한, 전체 삽입의 번역을 보장하기 위해 개시 코돈은 원하는 코딩 서열의 판독 프레임과 같은 상이어야 한다. 이러한 외인성 번역 조절 신호 및 개시 코돈은 천연 기원 및 합성 기원 모두를 포함하는 다양한 기원의 것일 수 있다. 발현 효율은 적절한 전사 인핸서 요소, 전사 종결자 등을 포함시킴으로써 강화될 수 있다(예를 들어, 그 전체가 참조로서 본원에 통합된 Bitter G 등의 문헌[(1987) Methods Enzymol. 153: 516-544] 참조).
또한, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 원하는 특정 방식으로 유전자 산물을 변형하고 처리하는 숙주 세포 계통이 선택될 수 있다. 단백질 산물의 이러한 변형(예: 당화) 및 가공(예: 절단)은 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 산물의 번역 후 처리 및 변형을 위한 특성 및 특이적 메카니즘을 갖는다. 발현된 외래 단백질의 정확한 변형과 처리를 보장하기 위한 적절한 숙주 세포 또는 숙주 시스템이 선택될 수 있다. 이를 위해서, 유전자 산물의 일차 전사, 글리코실화, 및 인산화를 적절히 처리하기 위한 세포 기관을 보유한 진핵 숙주 세포가 사용될 수 있다. 이러한 포유류 숙주 세포는 CHO, VERO, BHK, Hela, MDCK, HEK 293, NIH 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O 및 T47D, NS0 (어떤 면역 글로불린 사슬도 내인성으로 생산하지 않는 쥣과 골수종 세포주), CRL7O3O, COS (예컨대, COS1 또는 COS), PER.C6, VERO, HsS78Bst, HEK-293T, HepG2, SP210, R1.1, B-W, L-M, BSC1, BSC40, YB/20, BMT10 및 HsS78Bst 세포를 포함하되 이들로 한정되지는 않는다. 소정의 구현예에서, 본원에 기술된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 항체는 CHO 세포와 같은 포유류 세포에서 생산된다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 다중특이적 분자 또는 항체는 감소된 푸코스 함량을 갖거나 푸코스 함량을 갖지 않는다. 이러한 다중특이적 분자 또는 항체는 당업자에게 알려진 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 다중특이적 분자 또는 이의 항원 결합 영역, 또는 항체는 푸코실화하는 능력이 부족하거나 결여된 세포에서 발현될 수 있다. 특정 구현예에서, α1,6-푸코실 전이효소(fucosyltransferase)의 대립 유전자 모두가 녹아웃된 세포주가 푸코스 함량이 감소된 다중특이적 분자 또는 이의 항원 결합 영역, 또는 항체를 생산하는 데 사용될 수 있다. Potelligent® 시스템(Lonza)은 푸코스 함량이 감소된 항체를 생산하는 데 사용될 수 있는 이러한 시스템의 예이다.
재조합 단백질의 장기, 고 수율 생산을 위해 안정적인 발현 세포를 생성할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 이의 항원 결합 영역, 또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 항체를 안정적으로 발현하는 세포주가 조작될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 세포는 본원에 기술된 항원 결합 영역 또는 항체를 형성하기 위해 결합하는 경쇄/경쇄 가변 영역 및 중쇄/중쇄 가변 영역을 안정적으로 발현한다.
소정의 양태에서, 바이러스의 복제 기원을 함유하는 발현 벡터를 사용하기보다는, 적절한 발현 조절 요소(예: 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선택성 마커에 의해 조절된 DNA로 숙주 세포를 형질전환할 수 있다. 외래 DNA/폴리뉴클레오티드를 도입한 다음, 조작된 세포를 농축된 배지에서 1~2일 동안 성장시킨 다음, 선택 배지로 옮길 수 있다. 재조합 플라스미드 내의 선택성 마커는 선택에 대한 저항성을 세포에게 부여하고, 세포가 플라스미드를 그들의 염색체에 안정적으로 통합시키고 성장시켜 병소를 형성하게 하며, 이는 궁극적으로 클로닝되어 세포주로 증식될 수 있다. 이러한 방법은, 본원에 기술된 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 이의 항원 결합 영역, 또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 항체 또는 이의 단편을 발현하는 세포주를 조작하는 데 유리하게 사용될 수 있다. 이러한 조작된 세포주는 다중특이적 분자 또는 항체 분자와 직접 또는 간접적으로 상호작용하는 조성물의 스크리닝 및 평가에 특히 유용할 수 있다.
다음 각각을 포함하되 이들로 한정되지 않는 다수의 선택 시스템이 사용될 수 있다: 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제(Wigler M 등의 문헌[(1977) Cell 11(1): 223-32]), 하이포크산틴구아닌 포스포리보실트랜스퍼라아제(hypoxanthineguanine phosphoribosyltransferase; Szybalska EH & Szybalski W의 문헌[(1962) PNAS 48(12): 2026-2034]), 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제(adenine phosphoribosyltransferase; Lowy I 등의 문헌[(1980) Cell 22(3): 817-23], tk-세포, hgprt-세포, 또는 aprt-세포 내 유전자(이들 모두는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 또한 항대사물 저항성이 다음 유전자에 대한 선택의 근거로서 사용될 수 있다: 메토트렉세이트에 저항성을 부여하는 dhfr (Wigler M 등의 문헌[(1980) PNAS 77(6): 3567-70]; O'Hare K 등의 문헌[(1981) PNAS 78: 1527-31]); 미코페놀산에 저항성을 부여하는 gpt (Mulligan RC & Berg P의 문헌[(1981) PNAS 78(4): 2072-6]); 아미노글리코시드 G-418에 저항성을 부여하는 neo (Wu GY & Wu CH의 문헌[(1991) Biotherapy 3: 87-95]; Tolstoshev P의 문헌[(1993) Ann Rev Pharmacol Toxicol 32: 573-596]; Mulligan RC의 문헌[(1993) Science 260: 926-932]; 및 Morgan RA & Anderson WF의 문헌[(1993) Ann Rev Biochem 62: 191-217]; Nabel GJ & Felgner PL의 문헌[(1993) Trends Biotechnol 11(5): 211-5]); 및 하이그로마이신에 저항성을 부여하는 hygro (Santerre RF 등의 문헌[(1984) Gene 30(1-3): 147-56]) (상기 문헌 모두는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 원하는 재조합 클론을 선택하기 위해 당업계에 일반적으로 알려진 재조합 DNA 기술의 방법이 일상적으로 적용될 수 있고, 이러한 방법은 예를 들어 Ausubel FM(편집) 등의 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993)]; Kriegler M의 문헌[Gene Transfer and Expression, Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)]; 및 Dracopoli NC(편집) 등의 문헌[Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994)]의 Chapters 12 및 13; Colbere-Garapin F 등의 문헌[(1981) J Mol Biol 150: 1-14]에 기술되어 있으며, 이들 문헌 모두는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
다중특이적 분자 또는 이의 항원 결합 영역, 또는 항체 분자의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가될 수 있다(검토는 Bebbington CR & Hentschel CCG의 문헌[The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3 (Academic Press, New York, 1987)]을 참조하고, 동 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 벡터 시스템 내의 마커를 증폭할 수 있는 경우, 숙주 세포의 배양물에 존재하는 억제제 수준을 증가시키면 마커 유전자의 복제 수가 증가하게 된다. 증폭된 영역은 관심 유전자와 결합되어 있으므로, 단백질의 생산도 증가하게 된다(Crouse GF 등의 문헌[(1983) Mol Cell Biol 3: 257-66], 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨).
숙주 세포는 본원에 기술된 2개 이상의 발현 벡터, 즉 제1 Fc 폴리펩티드를 암호화하는 제1 벡터 및 제2 Fc 폴리펩티드를 암호화하는 제2 벡터로 공동으로 형질감염될 수 있다. 2개의 벡터는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드의 동일한 발현을 가능하게 하는 동일한 선택성 마커를 함유할 수 있다. 숙주 세포는 상이한 양의 2개 이상의 발현 벡터로 공동 형질감염될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 다음 비율 중 어느 하나의 제1 발현 벡터와 제2 발현 벡터로 형질감염될 수 있다: 약 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:12, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 또는 1:50.
대안적으로, 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 둘 다를 암호화하고 발현할 수 있는 단일 벡터가 사용될 수 있다. 이러한 상황에서, 경쇄는 무독성 중쇄의 과잉을 피하기 위해 중쇄 앞에 배치되어야 한다(Proudfoot NJ의 문헌[(1986) Nature 322: 562-565]; 및 Kφhler G의 문헌[(1980) PNAS 77: 2197-2199], 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 중쇄 및 경쇄에 대한 코딩 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있다. 발현 벡터는 모노시스트론(monocistronic) 벡터이거나 멀티시스트론(multicistronic) 벡터일 수 있다. 멀티시스트론 핵산 작제물은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 유전자/뉴클레오티드 서열을 암호화하거나, 2~5, 5~10, 또는 10~20개 범위의 유전자/뉴클레오티드 서열을 암호화할 수 있다. 예를 들어, 바이시스트론(bicistronic) 핵산 작제물은 프로모터, 제1 유전자(예를 들어, 본원에 기술된 항체의 중쇄), 및 제2 유전자(예를 들어, 본원에 기술된 항체의 경쇄)를 순서대로 포함할 수 있다. 이러한 발현 벡터에서, 두 유전자의 전사는 프로모터에 의해 유도될 수 있는 반면, 제1 유전자의 mRNA의 번역은 캡-의존적 스캐닝 메커니즘에 의해 유도될 수 있고, 제2 유전자의 mRNA의 번역은 캡-독립적 메커니즘, 예를 들어, IRES에 의해 유도될 수 있다.
본원에 기술된 다중특이적 분자, 또는 이의 항원 결합 영역, 또는 항체 분자가 재조합 발현에 의해 생산되었으면, 면역 글로불린 분자의 정제를 위해 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어, 크로마트그래피(예컨대, 이온 교환, 친화성, 특히 단백질 A 다음의 특정 항원에 대한 친화성 및 크기 조절 칼럼 크로마토그래피), 원심 분리, 차등 용해도, 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술에 의해 생산된 항체 분자를 정제할 수 있다. 또한, 본원에 기술된 다중특이적 분자 및 항체는 정제를 용이하게 하기 위해 본원에 기술된 이종 폴리펩티드 서열 또는 달리 당업계에 공지된 이종 폴리펩티드 서열에 융합될 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 다중특이적 분자 또는 이의 항원 결합 영역, 또는 본원에 기술된 항체는 단리되거나 정제된다. 소정의 구현예에서, 단리된 항체는 단리된 항체와 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 것이다. 예를 들어, 소정의 구현예에서, 본원에 기술된 항체의 제제에는 세포 물질 및/또는 화학적 전구체가 실질적으로 없다. 용어 "세포 물질이 실질적으로 없는"은 항체가 단리되거나 재조합적으로 생산된 세포의 세포 성분으로부터 항체가 분리된 항체의 조제를 포함한다. 따라서, 세포 물질이 실질적으로 없는 항체는 이종 단백질(본원에서 "오염 단백질"로도 지칭됨) 및/또는 항체의 변이체, 예를 들어, 항체의 상이한 번역 후 변형 형태 또는 항체의 다른 상이한 버전(예를 들어 항체 단편)의 (건조 중량 기준으로) 약 30%, 20%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0.5%, 또는 0.1% 미만을 갖는 항체의 제제를 포함한다. 항체가 재조합적으로 생산되면, 이는 또한 배지가 실질적으로 없는 것으로, 배지는 단백질 제제 부피의 약 20%, 10%, 2%, 1%, 0.5%, 또는 0.1% 미만을 나타낸다. 항체가 화학적 합성에 의해 생산되면, 이는 일반적으로 화학적 전구체 또는 다른 화학 물질이 실질적으로 없는 것으로, 항체 또는 단편은 단백질의 합성에 관여한 화학적 전구체 또는 다른 화학 물질로부터 분리된 것이다. 이와 같이, 항체의 이러한 제제는 관심 항체 외에 화학적 전구체 또는 화합물을 (건조 중량 기준으로) 약 30%, 20%, 10%, 또는 5% 미만으로 갖는다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항체는 단리되거나 정제된다.
항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 이의 항원 결합 영역, 또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 항체 또는 이의 단편은 단백질 또는 항체의 합성에 대해 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어 화학적 합성에 의해 또는 재조합 발현 기술에 의해 생산될 수 있다. 달리 언급되지 않는 한, 본원에 기술된 방법은 분자생물학, 미생물학, 유전 분석, 재조합 DNA, 유기화학, 생화학, PCR, 올리고뉴클레오타이드 합성 및 변형, 핵산 하이브리드화, 및 당업계의 관련 분야의 통상의 기술을 사용한다. 이들 기술은, 예를 들어, 본원에 인용된 참조 문헌에 기술되어 있으며, 문헌에서 충분히 설명되어 있다. 예를 들어 Maniatis T 등의 문헌[(1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press]; Sambrook J 등의 문헌[(1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press]; Sambrook J 등의 문헌[(2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY]; Ausubel FM 등의 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 and annual updates)]; Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 및 매년 갱신판) Gait(편집)의 문헌[(1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press]; Eckstein(편집)의 문헌[(1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press]; Birren B(편집) 등의 문헌[(1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press]을 참조하고, 이들 문헌 모두는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 다중특이적 분자 또는 이의 항원 결합 영역, 또는 본원에 기술된 항체는, 예를 들어 합성을 통한 생성, DNA 서열의 유전자 조작을 포함하는 임의의 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나, 단리된다. 소정의 구현예에서, 이러한 다중 특이적 분자 또는 이의 항원 결합 영역, 또는 항체는 동물이나 포유동물(예: 인간)의 생체 내에서 항체 생식선 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않는 서열(예: DNA 서열 또는 아미노산 서열)을 포함한다.
일 양태에서, 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 이의 항원 결합 영역, 또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 항체를 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 본원에 기술된 세포 또는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 소정의 구현예에서, 상기 방법은 시험관 내에서 수행된다. 소정의 양태에서, 항-CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 및/또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 다중특이적 분자 또는 이의 항원 결합 영역, 또는 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 항체를 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 본원에 기술된 세포 또는 숙주 세포(예를 들어 본원에 기술된 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포 또는 숙주 세포)를 사용해 다중특이적 분자 또는 이의 항원 결합 영역, 또는 항체를 발현시키는 (예를 들어 재조합적으로 발현시키는) 단계를 포함한다. 소정의 구현예에서, 세포는 단리된 세포이다. 소정의 구현예에서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 세포 내에 도입되어 있다. 소정의 구현예에서, 상기 방법은 세포 또는 숙주 세포로부터 수득한 다중특이적 분자 또는 이의 항원 결합 영역, 또는 항체를 정제하는 단계를 추가로 포함한다.
소정의 구현예에서, 다중특이적 분자는, 폴리뉴클레오티드가 발현되고 다중특이적 분자가 생산되도록 적합한 조건 하에, 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제1 항원 결합 영역의 VH 및 VL을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 및 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제2 항원 결합 영역의 VH 및 VL을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 세포에서 발현시킴으로써 생산된다. 소정의 구현예에서, 다중특이적 분자는, 폴리뉴클레오티드가 발현되고 다중특이적 분자가 생산되도록 적합한 조건 하에, 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제1 항원 결합 영역의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 및 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제2 항원 결합 영역의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 세포에서 발현시킴으로써 생산된다.
소정의 구현예에서, 다중특이적 분자는, 폴리뉴클레오티드가 발현되고 다중특이적 분자가 생산되도록 적합한 조건 하에, 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제1 항원 결합 영역의 VH를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제1 항원 결합 영역의 VL을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드, 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제2 항원 결합 영역의 VH를 암호화하는 제3 폴리뉴클레오티드, 및 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제2 항원 결합 영역의 VL을 암호화하는 제4 폴리뉴클레오티드를 세포에서 발현시킴으로써 생산된다. 소정의 구현예에서, 다중특이적 분자는, 폴리뉴클레오티드가 발현되고 다중특이적 분자가 생산되도록 적합한 조건 하에, 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제1 항원 결합 영역의 중쇄를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제1 항원 결합 영역의 경쇄를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드, 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제2 항원 결합 영역의 중쇄를 암호화하는 제3 폴리뉴클레오티드, 및 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제2 항원 결합 영역의 경쇄를 암호화하는 제4 폴리뉴클레오티드를 세포에서 발현시킴으로써 생산된다.
소정의 구현예에서, 다중특이적 분자는, 다중특이적 분자가 생산되도록 하는 조건 하에, 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제1 항원 결합 영역 및 제2 항원 결합 영역을 접촉시킴으로써 생산된다. 예를 들어, 소정의 구현예에서, 다중특이적 분자는, 제1 항원 결합 영역이 생산되는 조건 하에, 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제1 항원 결합 영역의 VH 및 VL을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드를 제1 세포에서 발현시키고; 제2 항원 결합 영역이 생산되는 조건 하에, 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제2 항원 결합 영역의 VH 및 VL을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 제2 세포에서 발현시키고; 다중특이적 분자가 생산되도록 적합한 조건 하에 제1 및 제2 항원 결합 영역을 접촉시킴으로써 생산된다. 대안적으로, 소정의 구현예에서, 다중특이적 분자는, 제1 항원 결합 영역이 생산되는 조건 하에, 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제1 항원 결합 영역의 VH를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 및 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제1 항원 결합 영역의 VL을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 제1 세포에서 발현시키고; 제2 항원 결합 영역이 생산되는 조건 하에, 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제2 항원 결합 영역의 VH를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드, 및 본원에 기술된 다중특이적 분자의 제2 항원 결합 영역의 VL을 암호화하는 제4 폴리뉴클레오티드를 제2 세포에서 발현시키고; 다중특이적 분자가 생산되도록 적합한 조건 하에 제1 및 제2 항원 결합 영역을 접촉시킴으로써 생산된다. 다중특이적 분자를 생산하기 위해 제1 및 제2 항원 결합 영역을 접촉시키기 위한 적절한 방법론 및 조건은 WO 2011/131746, WO 2011/147986, WO 2008/119353, 및 WO 2013/060867, 및 Labrijn AF 등의 문헌[(2013) PNAS 110(13): 5145-5150]에 기술된 방법론 및 조건들을 포함하지만 이에 한정되지는 않으며, 이들 문헌 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
소정의 구현예에서, 단리된 항체는 폴리뉴클레오티드가 발현되고 항체가 생산되도록 적절한 조건 하에, 본원에 기술된 항체의 VH 및 VL을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 세포에서 발현시킴으로써 생산된다. 또 다른 구현예에서, 단리된 항체는 폴리뉴클레오티드가 발현되고 항체가 생산되도록 적절한 조건 하에, 본원에 기술된 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 세포에서 발현시킴으로써 생산된다. 소정의 구현예에서, 단리된 항체는 폴리뉴클레오티드가 발현되고 항체가 생산되도록 적절한 조건 하에, 본원에 기술된 항체의 VH를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 및 본원에 기술된 항체의 VH를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 세포에서 발현시킴으로써 생산된다. 소정의 구현예에서, 단리된 항체는 폴리뉴클레오티드가 발현되고 항체가 생산되도록 적절한 조건 하에, 본원에 기술된 항체의 중쇄를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 및 본원에 기술된 항체의 경쇄을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 세포에서 발현시킴으로써 생산된다.
다클론 항체를 생산하는 방법은 당업계에 알려져 있다(예를 들어, Ausubel FM (eds.) 등의 문헌[Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5th Ed., John Wiley and Sons, New York]의 11장 참조, 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨).
단클론 항체는 하이브리도마, 재조합, 및 파지 디스플레이 기술, 또는 이들의 조합의 사용을 포함하여 당업계에 알려진 매우 다양한 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 단클론 항체는 당업계에 공지되고, 예를 들어 다음 문헌에서 교지된 것들을 포함하는 하이브리도마 기술을 사용해 생산될 수 있다: Harlow E & Lane D의 문헌[Antibodies: A] Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd Ed. 1988); Hammerling GJ 등의 문헌[Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563 681 (Elsevier, N.Y., 1981)]. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "단클론 항체(monoclonal antibody)"는 하이브리도마 기술을 통해 생산된 항체들로 한정되지 않는다. 예를 들어, 단클론 항체는 본원에 기술된 항체 또는 이의 단편, 예를 들어, 이러한 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 외생적으로 발현하는 숙주 세포로부터 재조합적으로 생산될 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 사용된 "단클론 항체"는 단일 세포(예를 들어, 재조합 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 숙주 세포)에 의해 생산된 항체이며, 여기서 항체는, 예를 들어, 당업계에 알려졌거나 본원의 실시예를 통해 알려진 ELISA 또는 다른 항원 결합 검정 또는 경쟁 결합 검정에 의해 결정했을 때, CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합한다. 소정의 구현예에서, 단클론 항체는 키메라 항체 또는 인간화 항체일 수 있다. 소정의 구현예에서, 단클론 항체는 1가 항체 또는 다가(예를 들어 2가) 항체이다. 소정의 구현예에서, 단클론 항체는 단일특이적 항체 또는 다중특이적(예를 들어 이중특이적) 항체이다. 본원에 기술된 단클론 항체는, 예를 들어 그 전체가 참조로서 본원에 통합된 Kohler G & Milstein C의 문헌[(1975) Nature 256: 495]에 기술된 것과 같은 하이브리도마 방법에 의해 제조되거나, 예를 들어 본원에 기술된 것과 같은 기술을 사용하여 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 클론 세포주 및 이에 의해 발현된 단클론 항체를 제조하는 다른 방법은 당업계에 알려져 있다(예를 들어, 전술한 Ausubel FM 등의 문헌[Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5th Ed.] 중 11장 참조).
본원에서 사용되는 바와 같이, 항체가 적어도 2개의 (예를 들어 2개 이상의) 1가 결합 영역을 포함하고, 각각의 1가 결합 영역이 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 경우, 항체는 항원에 다가(예를 들어 2가) 결합한다. 각각의 1가 결합 영역은 항원 상의 동일하거나 상이한 에피토프에 결합할 수 있다.
하이브리도마 기술을 사용하여 특이적 항체를 생산하고 스크리닝하는 방법은 통상적이며 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예컨대 양, 염소, 토끼, 랫트, 햄스터, 또는 짧은 꼬리 원숭이(macaque monkey)를 면역화하여 면역화에 사용된 단백질(예를 들어 CD96 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96)에 특이적으로 결합하게 될 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도한다. 대안적으로, 림프구는 시험관 내에서 면역화될 수있다. 그런 다음, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적절한 융합제를 사용하여 림프구를 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다(Goding JW(편집)의 문헌[Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)], 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 또한, RIMMS(반복 면역화 다중 부위) 기술을 사용하여 동물을 면역화할 수 있다(Kilpatrick KE 등의 문헌[(1997) Hybridoma 16:381-9 ], 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨).
소정의 구현예에서, 마우스(또는 랫트, 원숭이, 당나귀, 돼지, 양, 햄스터, 또는 개와 같은 다른 동물)를 항원(예를 들어, CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96))으로 면역화할 수 있고, 면역 반응이 검출되면, 예를 들어, 항원에 특이적인 항체가 마우스 혈청에서 검출되면, 마우스 비장을 채취하고 비장 세포를 단리한다. 그런 다음, 잘 알려진 기술에 의해 비장 세포를 임의의 적절한 골수종 세포, 예를 들어, American Type Culture Collection (ATCC®) (Manassas, VA)으로부터 입수 가능한 세포주 SP20 유래의 세포에 융합시켜 하이브리도마를 형성한다. 하이브리도마를 선택하고 제한 희석에 의해 클로닝한다. 소정의 구현예에서, 면역화된 마우스의 림프절을 채취하고 NS0 골수종 세포와 융합시킨다.
이와 같이 제조된 하이브리도마 세포를, 바람직하게는 융합되지 않은 부모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적절한 배양 배지에 시딩하고 성장시킨다. 예를 들어, 부모 골수종 세포에 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 전이효소(HGPRT 또는 HPRT)가 결여된 경우, 하이브리도마를 위한 배양 배지는 일반적으로 하이포크산틴, 아미노프테린, 및 티미딘(HAT 배지)을 포함하게 되는데, 이 물질들은 HGPRT 결핍 세포가 성장하지 못하게 한다.
특정 구현예는, 효율적으로 융합되고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정적인 고수준 생산을 뒷받침하고, HAT 배지와 같은 배지에 민감한 골수종 세포를 사용한다. 이들 골수종 세포주 중에는 쥣과 골수종 세포주, 예컨대 NS0 세포주 또는 Salk Institute Cell Distribution Center(San Diego, CA, USA)로부터 입수할 수 있는 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양 유래의 세포주, 및 American Type Culture Collection(Rockville, MD, USA)으로부터 입수할 수 있는 SP-2 또는 X63-Ag8.653 세포가 있다. 인간 골수종 세포주 및 마우스-인간 이종골수종 세포주 또한 인간 단클론 항체의 생산에 대해 기술되었다(Kozbor D의 문헌[(1984) J Immunol 133: 3001-5]; Brodeur 등의 문헌[Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)], 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨).
하이브리도마 세포를 성장시키는 배양 배지를 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 대해 유도된 단클론 항체의 생산에 대해 검정한다. 하이브리도마 세포에 의해 생산된 단클론 항체의 결합 특이성은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, 면역침강에 의해, 또는 방사성 면역검정(RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)과 같은 시험관 내 결합 검정에 의해 결정한다.
하이브리도마 세포가 원하는 특이성, 친화도, 및/또는 활성을 갖는 항체를 생산하는 것으로 식별된 후, 제한 희석 절차에 의해 클론을 서브클로닝하고 표준 방법에 의해 성장시킬 수 있다(전술한 Goding JW(편집)의 문헌[Monoclonal Antibodies: Principles and Practice]). 이러한 목적에 적합한 배양 배지는, 예를 들어, D-MEM 또는 RPMI 1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포를 동물의 복수 종양(ascites tumors)으로서 생체 내에서 성장시킬 수 있다.
서브클론에 의해 분비되는 단클론 항체는, 예를 들어, 단백질 A-세파로오스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화도 크로마토그래피와 같은 종래의 면역글로불린 정제 절차에 의해 배양 배지, 복수액, 또는 혈청으로부터 적절히 분리된다.
본원에 기술된 항체는, 예를 들어 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)을 인식하고, 당업자에게 알려진 임의의 기술에 의해 생성될 수 있는 항체 단편을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기술된 Fab 및 F(ab')2 단편은 (Fab 단편을 생산하는) 파파인 또는 (F(ab')2 단편을 생산하는) 펩신과 같은 효소를 사용하여 면역글로불린 분자의 단백질 분해성 절단에 의해 생성될 수 있다. Fab 단편은 항체 분자의 2개의 동일한 아암 중 하나에 상응하며 중쇄의 VH 및 CH1 도메인과 쌍을 이룬 완전한 경쇄를 함유한다. F(ab')2 단편은 힌지 영역에서의 이황화 결합에 의해 연결된 항체 분자의 2개의 항원 결합 아암을 함유한다.
또한, 본원에 기술된 항체는 당업계에 공지된 다양한 파지 디스플레이 방법을 사용해 생성될 수도 있다. 파지 디스플레이 방법에서, 기능적 항체 도메인은 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 파지 입자의 표면 상에 디스플레이된다. 특히, VH 및 VL 도메인을 암호화하는 DNA 서열은 동물 cDNA 라이브러리(예: 감염된 조직의 인간 또는 쥐 cDNA 라이브러리)로부터 증폭된다. VH 및 VL 도메인을 암호화하는 DNA는 PCR에 의해 scFv 링커와 함께 재조합되어 파지미드 벡터(phagemid vector)에 클로닝된다. 벡터는 대장균(E. coli)에서 전기 천공되고, 대장균은 헬퍼 파지로 감염된다. 이들 방법에서 사용된 파지는 일반적으로 fd 및 M13을 포함하는 섬사상(filamentous) 파지이며, VH 및 VL 도메인은 일반적으로 파지 유전자 III 또는 유전자 VIII 중 하나에 재조합적으로 융합된다. 특정 항원에 결합하는 항원 결합 영역을 발현하는 파지는 항원을 사용하여, 예를 들어 표지된 항원을 사용하거나, 고체 표면 또는 비드에 결합되거나 포획된 항원을 사용하여 선택하거나 식별할 수 있다. 본원에 기술된 항체를 만드는데 사용될 수 있는 파지 디스플레이 방법의 예시는 Brinkman U 등의 문헌[(1995) J Immunol Methods 182: 41-50]; Ames RS 등의 문헌[(1995) J Immunol Methods 184: 177-186]; Kettleborough CA 등의 문헌[(1994) Eur J Immunol 24: 952-958]; Persic L 등의 문헌[(1997) Gene 187: 9-18]; Burton DR & Barbas CF의 문헌[(1994) Advan Immunol 57: 191-280]; PCT 출원 제PCT/GB91/001134호; 국제 공개 제WO 90/02809호, 제WO 91/10737호, 제WO 92/01047호, 제WO 92/18619호, 제WO 93/11236호, 제WO 95/15982호, 제WO 95/20401호, 및 제WO 97/13844호; 및 미국 특허 제5,698,426호, 제5,223,409호, 제5,403,484호, 제5,580,717호, 제5,427,908호, 제5,750,753호, 제5,821,047호, 제5,571,698호, 제5,427,908호, 제5,516,637호, 제5,780,225호, 제5,658,727호, 제5,733,743호, 및 제5,969,108호에 개시된 것들을 포함하며, 이들 문헌 모두는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
상기 참조 문헌에 기술된 바와 같이, 파지의 선택 후, 항체 코딩 영역을 파지로부터 단리하여 인간 항체 또는 임의의 다른 원하는 항원 결합 단편을 포함하는 전체 항체를 생성하는데 사용할 수 있고, 예를 들어, 아래에 기술된 것과 같은 포유류 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모, 및 박테리아를 포함하는 임의의 원하는 숙주에서 발현시킬 수 있다. Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편과 같은 항체를 재조합적으로 생산하는 기술은 당업계에 알려진 방법, 예컨대 PCT 공개 제WO 92/22324; Mullinax RL 등의 문헌[(1992) BioTechniques 12(6): 864-9]; Sawai H 등의 문헌[(1995) Am J Reprod Immunol 34: 26-34]; 및 Better M 등의 문헌[(1988) Science 240: 1041-1043](이들 모두는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨)에 개시된 것들에 사용될 수도 있다.
소정의 구현예에서, 전체 항체를 생성하기 위해, VH 및 VL 뉴클레오티드 서열, 제한 부위, 및 제한 부위를 보호하는 인접 서열을 포함하는 PCR 프라이머를 사용하여 scFv 클론과 같은 주형으로부터 VH 또는 VL 서열을 증폭할 수 있다. 당업자에게 공지된 클로닝 기술을 이용하여, PCR 증폭된 VH 도메인을 VH 불변 영역을 발현하는 벡터에 콜로닝할 수 있고, PCR 증폭된 VL 도메인을 VL 불변 영역, 예를 들어, 인간 카파 또는 람다 불변 영역을 발현하는 벡터에 클로닝할 수 있다. VH 및 VL 도메인을 필수 불변 영역을 발현하는 하나의 벡터 내로 클로닝할 수도 있다. 이어서, 중쇄 변환 벡터 및 경쇄 변환 벡터는 세포주에 공동으로 형질 감염되어, 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 전장 항체, 예를 들어, IgG를 발현하는 안정한 또는 일시적인 세포주를 생성할 수 있다.
키메라 항체는 항체의 상이한 부분이 상이한 면역 글로불린 분자로부터 유래된 분자이다. 예를 들어, 키메라 항체는 인간 항체의 불변 영역에 융합된 마우스 또는 랫트 단클론 항체의 가변 영역을 함유할 수 있다. 키메라 항체를 생산하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Morrison SL의 문헌[(1985) Science 229: 1202-7]; Oi VT & Morrison SL의 문헌[(1986) BioTechniques 4: 214-221]; Gillies SD 등의 문헌[(1989) J Immunol Methods 125: 191-202]; 및 미국 특허 제5,807,715호, 제4,816,567호, 제4,816,397호, 및 제6,331,415호를 참조하고, 이들 문헌 모두는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
인간화 항체는 소정의 항원에 결합될 수 있고, 실질적으로 인간 면역 글로불린의 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역 및 실질적으로 비인간 면역 글로불린(예, 쥣과 면역 글로불린)의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함한다. 소정의 구현예에서, 인간화 항체는 또한, 면역 글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 일반적으로 인간 면역 글로불린의 일부를 포함한다. 항체는 또한 중쇄의 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 CH4 영역을 포함할 수 있다. 인간화 항체는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 포함하는 면역 글로불린의 임의의 부류, 및 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 임의의 이소형으로부터 선택될 수 있다. 인간화 항체는 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있고, 상기 기술은 CDR-이식(유럽 특허 번호 제EP 239400호; 국제 공개 제WO 91/09967호; 및 미국 특허 제5,225,539호, 제5,530,101호, 및 제5,585,089호), 베니어링(veneering) 또는 재표현화(resurfacing)(유럽 특허 제EP 592106호 및 제EP 519596호; Padlan EA의 문헌[(1991) Mol Immunol 28(4/5): 489-498]; Studnicka GM 등의 문헌[(1994) Prot Engineering 7(6): 805-814]; 및 Roguska MA 등의 문헌[(1994) PNAS 91: 969-973]), 사슬 셔플링(chain shuffling)(미국 특허 제5,565,332호), 및 예를 들어 미국 특허 제6,407,213호, 미국 특허 제5,766,886호, 국제 공개 제WO 93/17105호; Tan P 등의 문헌[(2002) J Immunol 169: 1119-25]; Caldas C 등의 문헌[(2000) Protein Eng. 13(5): 353-60]; Morea V 등의 문헌[(2000) Methods 20(3): 267-79]; Baca M 등의 문헌[(1997) J Biol Chem 272(16): 10678-84]; Roguska MA 등의 문헌[(1996) Protein Eng 9(10): 895 904]; Couto JR 등의 문헌[(1995) Cancer Res. 55 (23 Supp): 5973s-5977s]; Couto JR 등의 문헌[(1995) Cancer Res 55(8): 1717-22]; Sandhu JS의 문헌[(1994) Gene 150(2): 409-10]; 및 Pedersen JT 등의 문헌[(1994) J Mol Biol 235(3): 959-73]을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다(이들 모두는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 또한, 미국 특허 출원 공개 제US 2005/0042664 A1호(2005년 2월 24일)를 참조하고, 동 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
다중특이적 분자 및 다중특이적 항체(예: 이중특이적 항체)를 제조하는 방법이 기술되어 있으며, 이에 대해서는 예를 들어 미국 특허 제7,951,917호; 제7,183,076호; 제8,227,577호; 제5,837,242호; 제5,989,830호; 제5,869,620호; 제6,132,992호; 및 제8,586,713호를 참조하고, 이들 모두는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
이중특이적 2가 항체 및 이들을 만드는 방법은, 예를 들어 미국 특허 제5,731,168호, 제5,807,706호, 제5,821,333호, 및 미국 특허 출원 공개 제2003/020734호 및 제2002/0155537에 기술되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 이중특이적 4가 항체 및 이들을 만드는 방법은, 예를 들어 국제 특허 출원 공개 제WO02/096948호 및 제WO00/44788호에 기술되어 있으며, 이들 모두의 개시는 그 전체가 본원에 참조로서 통합된다. 일반적으로는, 국제 출원 공개 제WO93/17715호, 제WO92/08802호, 제WO91/00360호, 및 제WO92/05793호; Tutt 등의 문헌[J. Immunol. 147:60-69 (1991)]; 미국 특허 제4,474,893호; 제4,714,681호; 제4,925,648호; 제5,573,920호; 및 제5,601,819호; 및 Kostelny 등의 문헌[J. Immunol. 148:1547-1553 (1992)]을 참조하고, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
본원에 기술된 것과 같은 다중특이적 분자 또는 이중특이적 항체는, 예를 들어, 국제 특허 공개 제WO 2011/131746호, 제WO 2011/147986호, 제WO 2008/119353호, 및 제WO 2013/060867호, 및 Labrijn AF 등의 문헌[(2013) PNAS 110(13): 5145-5150]에 기술된 바와 같이 DuoBody 기술 플랫폼(Genmab A/S)에 따라 생성될 수 있다. DuoBody 기술은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 함유하는 제1 단일특이적 항체 또는 제1 항원 결합 영역의 절반을 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 함유하는 제2 단일특이적 항체 또는 제2 항원 결합 영역의 나머지 절반과 조합하는데 사용될 수 있다. 생성된 이종이량체는 제2 항체 또는 제2 항원 결합 영역의 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄와 짝을 이룬 제1 항체 또는 제1 항원 결합 영역의 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄를 함유한다. 상기 두 개의 단일특이적 항체 또는 항원 결합 영역 모두가 상이한 항원 상의 상이한 에피토프를 인식하는 경우, 생성된 이종이량체는 다중특이적 분자 또는 이중특이적 항체이다.
DuoBody 기술을 사용하기 위해서는, 단일특이적 항체 또는 항원 결합 영역의 각각이 단일 점 돌연변이를 CH3 도메인에 갖는 중쇄 불변 영역을 포함해야 한다. 점 돌연변이는, 단일특이적 항체 또는 항원 결합 영역 중 어느 하나의 CH3 도메인 간의 상호작용보다 생성된 이중특이적 항체의 CH3 도메인 간의 상호작용을 더 강하게 할 수 있다. 각각의 단일특이적 항체 또는 항원 결합 영역의 단일 점 돌연변이는, 예를 들어 국제 특허 공개 제 WO 2011/131746호에 기술된 바와 같이, 중쇄 불변 영역의 CH3 도메인 내의, EU 넘버링 시스템에 의해 넘버링된 잔기 366, 368, 370, 399, 405, 407, 또는 409에 위치한다. 또한, 단일 점 돌연변이는, 다른 하나의 단일특이적 항체 또는 항원 결합 영역과 비교했을 때, 하나의 단일특이적 항체 또는 항원 결합 영역의 상이한 잔기에 위치한다. 예를 들어, 하나의 단일특이적 항체 또는 항원 결합 영역은 돌연변이 F405L(잔기 405에서 페닐알라닌으로부터 류신으로의 돌연변이)을 포함할 수 있고, 다른 하나의 단일특이적 항체 또는 항원 결합 영역은 K409R(잔기 409에서 리신으로부터 아르기닌으로의 돌연변이)를 포함할 수 있다(잔기는 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링 됨). 단일특이적 항체 또는 항원 결합 영역의 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 이소형(예: 인간 IgG1 아이소타입)일 수 있고, DuoBody 기술에 의해 생산된 이중특이적 항체 또는 다중특이적 분자는 Fc-매개 작동자 기능을 유지할 수 있다.
다중특이적 분자 또는 이중특이적 항체를 생성하기 위한 또 다른 방법은 "노브-인투-홀(knobs-into-holes)" 전략이라는 용어로 불려져 왔다(예를 들어, 국제 특허 공개 번호 제WO2006/028936호 참조). 이러한 기술에서는, IgG에서 CH3 도메인의 계면을 형성하는 선택된 아미노산을 돌연변이시킴으로써 Ig 중쇄의 쌍오류(mispairing)가 감소된다. 2개의 중쇄가 직접 상호작용하는 CH3 도메인 내의 위치에서, 작은 측쇄(홀)을 갖는 아미노산이 일 중쇄의 서열에 도입되고, 큰 측쇄(노브)를 갖는 아미노산은 타 중쇄의 상대측 상호작용하는 잔기의 위치에 도입된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은, 이중특이적 항체를 우선적으로 형성하도록 두 개의 폴리펩티드 사이의 계면에서 상호작용하는 선택된 아미노산을 돌연변이시킴으로써 CH3 도메인이 변형된, 면역글로불린 사슬을 갖는다. 이중특이적 항체 또는 다중특이적 분자는 동일한 하위 부류(예: IgG1 또는 IgG3) 또는 상이한 하위 부류(예: IgG1 및 IgG3, 또는 IgG3 및 IgG4)의 면역글로불린 사슬로 구성될 수 있다.
일부 경우에, CD96 및/또는 TIGIT에 결합하는 다중특이적 분자는 IgG4와 IgG1, IgG4와 IgG2, IgG4와 IgG2, IgG4와 IgG3, 또는 IgG1와 IgG3 사슬 이종이량체를 함유할 수 있다. 이러한 이종이량체 중쇄 항체는 이종이량체 중쇄 형성에 유리하도록, 예를 들어 인간 IgG4와 IgG1 또는 IgG3에서 CH3 도메인의 계면을 형성하는 선택된 아미노산을 변형시킴으로써 일상적으로 조작될 수 있다.
소정의 구현예에서, 본원에 기술된 항-TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 항체와 동일한 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)의 에피토프에 결합하는 본원에 기술된 항체는 인간 항체이다. 소정의 구현예에서, 본원에 기술된 항체 중 어느 하나가 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 결합하는 것을 (예를 들어 투여량 의존적 방식으로) 경쟁적으로 차단하는 본원에 기술된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 기능적 내인성 면역 글로불린을 발현할 수 없지만 인간 면역 글로불린 유전자를 발현할 수 있는 유전자 이식된 마우스가 사용될 수 있다. 특히, 인간 중쇄 및 경쇄 면역 글로불린 유전자 복합체가 무작위로 또는 상동 재조합에 의해 마우스 배아 줄기 세포에 도입될 수 있다. 대안적으로, 인간 가변 영역, 불변 영역, 및 다양성 영역이 인간 중쇄 및 경쇄 유전자에 추가하여 마우스 배아 줄기 세포에 도입될 수 있다. 마우스 중쇄 및 경쇄 면역 글로불린 유전자는 상동성 재조합에 의해 인간 면역글로불린 유전자좌를 도입함으로써 개별적으로 또는 동시에 비기능화 될 수 있다. 특히, JH 영역의 동형 접합체 결실에 의해 내인성 항체 생산이 방지된다. 변형된 배아 줄기 세포는 팽창되고 낭포(blastocysts)에 미량주입되어 키메라 마우스를 생산한다. 그런 다음 키메라 마우스를 교배하여 인간 항체를 발현하는 동형 접합성 새끼를 생산한다. 유전자 이식된 마우스는 선택된 항원으로, 예를 들어 항원(예를 들어 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT))의 일부 또는 전부로 정상적인 방식으로 면역화된다. 항원을 향하는 단클론 항체는 통상적인 하이브리도마 기술을 사용하여 면역화된 유전자 이식 마우스로부터 획득될 수 있다. 유전자 이식 마우스가 보유하고 있는 인간 면역 글로불린 이식 유전자는 B 세포 분화 동안 재배열되고, 이어서 클래스 스위칭 및 체세포 돌연변이를 겪는다. 따라서, 이러한 기술을 사용하면, 치료적으로 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체를 생산하는 것이 가능하다. 인간 항체를 생산하기 위한 이러한 기술의 개요에 대해서는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된 Lonberg N & Huszar D의 문헌[(1995) Int Rev Immunol 13:65-93]을 참조한다. 인간 항체 및 인간 단클론 항체를 생산하기 위한 이러한 기술 및 이러한 항체를 생산하기 위한 프로토콜의 상세한 논의에 관해서는, 예를 들어 국제 공개 제WO 98/24893호, 제WO 96/34096호 및 제WO 96/33735호; 및 미국 특허 번호 제5,413,923호, 제5,625,126호, 제5,633,425호, 제5,569,825호, 제5,661,016호, 제5,545,806호, 제5,814,318호 및 제5,939,598호를 참조하고, 이들 문헌 모두는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 인간 항체를 생산할 수 있는 마우스의 예는 Xenomouse?? (Abgenix, Inc.; 미국 특허 제6,075,181호 및 6,150,184호), HuAb-Mouse?? (Medarex, Inc./Gen Pharm; 미국 특허 제5,545,806호 및 제5,569, 825호), Trans Chromo Mouse?? (Kirin), 및 KM Mouse?? (Medarex/Kirin)를 포함하며, 이들 모두는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)에 특이적으로 결합되는 인간 항체는 당업계에 알려진 다양한 방법에 의해 제조될 수 있으며, 이에는 인간 면역 글로불린 서열로부터 유래된 항체 라이브러리를 사용하는 전술한 파지 디스플레이 방법이 포함된다. 또한 미국 특허 제4,444,887호, 제4,716,111호, 및 제5,885,793호; 및 국제 공개 제WO 98/46645호, 제WO 98/50433호, 제WO 98/24893호, 제WO 98/16654호, 제WO 96/34096호, 제WO 96/33735호, 및 WO 91/10741호를 참조하고, 이들 모두는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
소정의 구현예에서, 인간 항체는 인간-마우스 하이브리도마를 사용해 생산될 수 있다. 예를 들어, 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus, EBV)로 형질전환된 인간 말초 혈액 림프구를 마우스 골수종 세포와 융합시켜 인간 단클론 항체를 분비하는 마우스-인간 하이블리도마를 생산할 수 있고, 이들 마우스-인간 하이브리도마를 스크리닝하여 표적 항원(예를 들어 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT))에 특이적으로 결합하는 인간 단클론 항체를 분비하는 것들을 결정할 수 있다. 이러한 당업계에 공지되어 있고 기술되어 있다. 예를 들어, Shinmoto H 등의 문헌[(2004) Cytotechnology 46: 19-23]; Naganawa Y 등의 문헌[(2005) Human Antibodies 14: 27-31]을 참조하고, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
7.6
키트
본원에 기술된 하나 이상의 다중특이적 분자 항체, 또는 이의 약학적 조성물 또는 접합체를 포함하는 키트가 또한 본원에 제공된다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 하나 이상의 다중특이적 분자 또는 항체와 같은 본원에 기술된 약학적 조성물의 성분 중 하나 이상으로 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 약학적 팩 또는 키트가 본원에 제공된다. 소정의 구현예에서, 상기 키트는 본원에 기술된 약학적 조성물 및 본원에 기술된 것들과 같은 임의의 예방제 또는 치료제를 포함한다. 소정의 구현예에서, 상기 키트는 예를 들어 피토헤마글루티닌(phytohaemagglutinin, PHA) 및/또는 포르볼 미리스테이트 아세테이트(phorbot myristate acetate, PMA)와 같은 T 세포 분열 촉진제(mitogen), 또는 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 같은 TCR 복합체 자극 항체를 포함할 수 있다. 이러한 용기(들)과 선택적으로 관련된 것은 의약품이나 생물학적 제제의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관이 정한 형태인 안내문일 수 있으며, 상기 안내문에는 인간 투여용으로 제조, 사용 또는 판매에 대한 정부 기관의 승인이 표시된다.
또한, 전술한 방법에 사용될 수 있는 키트가 본원에 제공된다. 소정의 구현예에서, 키트는 본원에 기술된 항체, 바람직하게는 다중특이적 분자 또는 정제된 항체를 하나 이상의 용기에 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 키트는 실질적으로 단리된 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 항원 및/또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 항원을 대조군으로서 함유한다. 또 다른 특정 구현예에서, 본원에 기술된 키트는 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 항원 및/또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT)와 반응하지 않는 대조군 항체를 추가로 포함한다. 또 다른 특정 구현예에서, 본원에 기술된 키트는 다중특이적 분자 또는 항체가 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 항원 및/또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 항원에 결합하는 것을 검출하기 위한 하나 이상의 요소를 함유한다(예를 들어 다중특이적 분자 또는 항체는 형광 화합물, 효소 기질, 방사성 화합물 또는 발광성 화합물과 같은 검출 가능한 기질에 접합될 수 있거나, 제1 항체를 인식하는 제2 항체가 검출 가능한 기질에 접합될 수 있음). 특정 구현예에서, 본원에 제공된 키트는 재조합적으로 생산되었거나 화학적으로 합성된 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 항원 및/또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 항원을 포함할 수 있다. 키트에 제공된 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 항원 및/또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 항원도 고형 지지체에 부착될 수 있다. 보다 특정한 구현예에서, 전술한 키트의 검출 수단은 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 항원 및/또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 항원이 부착되는 고형 지지체를 포함한다. 이러한 키트는 비부착성 리포터-표지된 항-인간 항체 또는 항-마우스/항-랫트 항체를 포함할 수도 있다. 이 구현예에서, 항체가 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 항원 및/또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 항원에 결합하는 것은 상기 리포터-표지된 항체의 결합에 의해 검출될 수 있다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 시험관 내에서 생물학적 샘플에서 CD96(예: 인간 CD96 또는 시노몰구스 CD96) 항원 및/또는 TIGIT(예: 인간 TIGIT 또는 시노몰구스 TIGIT) 항원을 검정 및/또는 검출하기 위한 본 발명의 키트의 용도에 관한 것이다.
8.
실시예
본 섹션(즉, 섹션 6)의 실시예는 예시로서 제공되며 한정하기 위한 것은 아니다.
표 5는 다음의 실시예에 사용된 다양한 다중특이적 분자 및 단일특이적 항체의 세부 사항을 제공한다.
| 예시적인 다중특이적 분자 및 단일특이적 항체. | ||||
| 설명 |
항-CD96 항원 결합 영역
서열번호 |
항-TIGIT 항원 결합 영역
서열번호 |
||
| HC | LC | HC | LC | |
| BA123 | 1 | 2 | 7 | 9 |
| BA125 | 3 | 4 | 7 | 9 |
| BA127 | 5 | 6 | 7 | 9 |
| BA128 | 이소형 대조군 | 이소형 대조군 | ||
| BA129 | 1 | 2 | 이소형 대조군 | |
| BA130 | 3 | 4 | 이소형 대조군 | |
| BA131 | 5 | 6 | 이소형 대조군 | |
| BA133 | 이소형 대조군 | 7 | 9 | |
| BA134 | 항-CD96 기준 | 이소형 대조군 | ||
| BA136 | 항-CD96 기준 | 7 | 9 | |
| BA143 | 47 | 6 | N/A | N/A |
| BA144 | 46 | 4 | N/A | N/A |
| BA145 | 45 | 2 | N/A | N/A |
| BA146 | 이소형 대조군 | N/A | N/A | |
| BA148 | N/A | N/A | 48 | 9 |
| BA149 | N/A | N/A | 이소형 대조군 | |
8.1 실시예 1: 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자의 특성 분석
8.1.1 정제된 인간 및 시노몰구스 원숭이 CD96 단백질에 결합하는 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자
C89S 돌연변이를 갖는 인간 CD96의 His-태그된 이소형 2에 대한 결합
C89S 돌연변이를 포함하는 CD96의 인간 이소형 2의 전장 세포외 도메인(ECD)(서열번호 63)의 변이체에 대한 다중특이적 분자 BA123, BA125, 및 BA127의 결합 친화도를 표면 플라스몬 공명에 의해 평가하였다.
간략하게, Biacore T200 기기를 사용하여 표면 플라스몬 공명 실험을 수행하였고, Biacore T200 평가 소프트웨어로 1:1 결합 모델을 사용하여 각 실험으로부터 결합 속도(k a), 해리 속도(k d), 및 해리 상수(K D)를 계산하였다.
단일 유세포를 기준으로 유지하면서, 시리즈 S 단백질 A 센서 칩(GE Healthcare Ltd, cat #29-1275-56)의 개별 유세포 상에, 영동 완충액(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 및 0.05% 계면활성제 P20)에서 희석한 대략 2 μg/mL의 BA123, BA125, 및 BA127을 포획하였다. 약 350 공명 단위(RU)에 도달하도록 10 μl/분의 유속으로 30초 주입을 사용하여 다중특이적 분자를 포획하였다. C89S를 가진 인간 CD96의 전장 이소형 2 ECD(서열번호 63)를 0, 0.41, 1.23, 3.7, 11.1, 33.3, 및 100 nM의 농도로 희석하고, 30 μl/분의 유속으로 칩 표면에 흘려 3분의 결합 단계와 10분의 해리 단계를 거쳤다. 사이클 사이에, 10 mM 글리신, pH 1.5를 30초씩 2회 주입하여 센서 칩을 재생시켰다. BIAevaluation 3.0 소프트웨어의 글로벌 데이터 분석 옵션을 사용하여 센서그램을 평가하고 간단한 랭뮤어(Langmuir) 1:1 상호작용 모델에 피팅하였다. 편차와 곡선 피팅을 시각적으로 검사하고, Rmax, Chi2, 및 Tc의 파라미터를 평가함으로써 데이터 정확도를 확인하였다. 결합 동역학(k a, k d, 및 K D)은 센서그램 분석으로부터 결정하였으며, 이는 표 6에 나타나 있다.
시노몰구스 원숭이 CD96의 His-태그된 이소형 2에 대한 결합
CD96의 시노몰구스 원숭이 이소형 2(서열번호 111)의 전장 ECD에 대한 다중특이적 분자 BA123, BA125, 및 BA127의 결합 친화도를 표면 플라스몬 공명에 의해 평가하였다.
간략하게, Biacore T200 기기를 사용하여 표면 플라스몬 공명 실험을 수행하였고, Biacore T200 평가 소프트웨어로 1:1 결합 모델을 사용하여 각 실험으로부터 결합 속도(k a), 해리 속도(k d), 및 해리 상수(K D)를 계산하였다.
단일 유세포를 기준으로 유지하면서, 시리즈 S 단백질 A 센서 칩(GE Healthcare Ltd, cat #29-1275-56)의 개별 유세포 상에, 영동 완충액(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 및 0.05% 계면활성제 P20)에서 희석한 대략 2 μg/mL의 BA123, BA125, 및 BA127을 포획하였다. 약 350 공명 단위(RU)에 도달하도록 10 μl/분의 유속으로 30초 주입을 사용하여 다중특이적 분자를 포획하였다. 시노몰구스 원숭이 CD96의 전장 이소형 2 ECD(서열번호 111)를 0, 0.41, 1.23, 3.7, 11.1, 33.3, 및 100 nM의 농도로 희석하고, 30 μl/분의 유속으로 칩 표면에 흘려 3분의 결합 단계와 10분의 해리 단계를 거쳤다. 사이클 사이에, 10 mM 글리신, pH 1.5를 30초씩 2회 주입하여 센서 칩을 재생시켰다. BIAevaluation 3.0 소프트웨어의 글로벌 데이터 분석 옵션을 사용하여 센서그램을 평가하고 간단한 랭뮤어(Langmuir) 1:1 상호작용 모델에 피팅하였다. 편차와 곡선 피팅을 시각적으로 검사하고, Rmax, Chi2, 및 Tc의 파라미터를 평가함으로써 데이터 정확도를 확인하였다. 결합 동역학(k a, k d, 및 K D)은 센서그램 분석으로부터 결정하였으며, 이는 표 7에 나타나 있다.
8.1.2
정제된 인간 및 시노몰구스 원숭이 TIGIT 단백질에 결합하는 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자
His-태그된 인간 TIGIT에 대한 결합
인간 TIGIT의 전장 ECD(서열번호 113)에 대한 다중특이적 분자 BA123, BA125, 및 BA127의 결합 친화도를 표면 플라스몬 공명에 의해 평가하였다.
간략하게, Biacore T200 기기를 사용하여 표면 플라스몬 공명 실험을 수행하였고, Biacore T200 평가 소프트웨어로 1:1 결합 모델을 사용하여 각 실험으로부터 결합 속도(k a), 해리 속도(k d), 및 해리 상수(K D)를 계산하였다.
단일 유세포를 기준으로 유지하면서, 시리즈 S 단백질 A 센서 칩(GE Healthcare Ltd, cat #29-1275-56)의 개별 유세포 상에, 영동 완충액(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 및 0.05% 계면활성제 P20)에서 희석한 대략 4 μg/mL의 BA123, BA125, 및 BA127을 포획하였다. 약 1000 공명 단위(RU)에 도달하도록 10 μl/분의 유속으로 30초 주입을 사용하여 다중특이적 분자를 포획하였다. 인간 TIGIT의 전장 ECD(서열번호 113)를 0, 0.41, 1.23, 3.7, 11.1, 33.3, 및 100 nM의 농도로 희석하고, 30 μl/분의 유속으로 칩 표면에 흘려 3분의 결합 단계와 10분의 해리 단계를 거쳤다. 사이클 사이에, 10 mM 글리신, pH 1.5를 30초씩 2회 주입하여 센서 칩을 재생시켰다. BIAevaluation 3.0 소프트웨어의 글로벌 데이터 분석 옵션을 사용하여 센서그램을 평가하고 간단한 랭뮤어(Langmuir) 1:1 상호작용 모델에 피팅하였다. 편차와 곡선 피팅을 시각적으로 검사하고, Rmax, Chi2, 및 Tc의 파라미터를 평가함으로써 데이터 정확도를 확인하였다. 결합 동역학(k a, k d, 및 K D)은 센서그램 분석으로부터 결정하였으며, 이는 표 8에 나타나 있다.
His-태그된 시노몰구스 원숭이 TIGIT에 대한 결합
시노몰구스 원숭이 TIGIT의 전장 ECD(서열번호 114)에 대한 다중특이적 분자 BA123, BA125, 및 BA127의 결합 친화도를 표면 플라스몬 공명에 의해 평가하였다.
간략하게, Biacore T200 기기를 사용하여 표면 플라스몬 공명 실험을 수행하였고, Biacore T200 평가 소프트웨어로 1:1 결합 모델을 사용하여 각 실험으로부터 결합 속도(k a), 해리 속도(k d), 및 해리 상수(K D)를 계산하였다.
단일 유세포를 기준으로 유지하면서, 시리즈 S 단백질 A 센서 칩(GE Healthcare Ltd, cat #29-1275-56)의 개별 유세포 상에, 영동 완충액(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 및 0.05% 계면활성제 P20)에서 희석한 대략 4 μg/mL의 BA123, BA125, 및 BA127을 포획하였다. 약 350 공명 단위(RU)에 도달하도록 10 μl/분의 유속으로 30초 주입을 사용하여 다중특이적 분자를 포획하였다. 시노몰구스 원숭이 TIGIT의 전장 ECD(서열번호 114)를 0, 0.41, 1.23, 3.7, 11.1, 33.3, 및 100 nM의 농도로 희석하고, 30 μl/분의 유속으로 칩 표면에 흘려 3분의 결합 단계와 10분의 해리 단계를 거쳤다. 사이클 사이에, 10 mM 글리신, pH 1.5를 30초씩 2회 주입하여 센서 칩을 재생시켰다. BIAevaluation 3.0 소프트웨어의 글로벌 데이터 분석 옵션을 사용하여 센서그램을 평가하고 간단한 랭뮤어(Langmuir) 1:1 상호작용 모델에 피팅하였다. 편차와 곡선 피팅을 시각적으로 검사하고, Rmax, Chi2, 및 Tc의 파라미터를 평가함으로써 데이터 정확도를 확인하였다. 결합 동역학(k a, k d, 및 K D)은 센서그램 분석으로부터 결정하였으며, 이는 표 9에 나타나 있다.
8.2
실시예 2: 정제된 인간 및 시노몰구스 원숭이 CD96 단백질에 결합하는 항-CD96 항체
C89S 돌연변이를 갖는 인간 CD96의 His-태그된 이소형 2에 대한 결합
C89S 돌연변이를 갖는 CD96의 인간 이소형 2의 전장 ECD(서열번호 63)에 대한 다중특이적 항체 BA143, BA144, 및 BA145의 결합 친화도를 표면 플라스몬 공명에 의해 평가하였다.
간략하게, Biacore T200 기기를 사용하여 표면 플라스몬 공명 실험을 수행하였고, Biacore T200 평가 소프트웨어로 1:1 결합 모델을 사용하여 각 실험으로부터 결합 속도(k a), 해리 속도(k d), 및 해리 상수(K D)를 계산하였다.
단일 유세포를 기준으로 유지하면서, 시리즈 S 단백질 A 센서 칩(GE Healthcare Ltd, cat #29-1275-56)의 개별 유세포 상에, 영동 완충액(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 및 0.05% 계면활성제 P20)에서 희석한 대략 1 μg/mL의 BA143, BA144, 및 BA145을 포획하였다. 약 175 공명 단위(RU)에 도달하도록 10 μl/분의 유속으로 30초 주입을 사용하여 항체를 포획하였다. C89S를 가진 인간 CD96의 전장 이소형 2 ECD(서열번호 63)를 0, 0.41, 1.23, 3.7, 11.1, 33.3, 및 100 nM의 농도로 희석하고, 30 μl/분의 유속으로 칩 표면에 흘려 3분의 결합 단계와 10분의 해리 단계를 거쳤다. 사이클 사이에, 10 mM 글리신, pH 1.5를 30초씩 2회 주입하여 센서 칩을 재생시켰다. BIAevaluation 3.0 소프트웨어의 글로벌 데이터 분석 옵션을 사용하여 센서그램을 평가하고 간단한 랭뮤어(Langmuir) 1:1 상호작용 모델에 피팅하였다. 편차와 곡선 피팅을 시각적으로 검사하고, Rmax, Chi2, 및 Tc의 파라미터를 평가함으로써 데이터 정확도를 확인하였다. 결합 동역학(k a, k d, 및 K D)은 센서그램 분석으로부터 결정하였으며, 이는 표 10에 나타나 있다.
시노몰구스 원숭이 CD96의 His-태그된 이소형 2에 대한 결합
CD96의 시노몰구스 원숭이 이소형 2의 전장 ECD(서열번호 111)에 대한 다중특이적 항체 BA143, BA144, 및 BA145의 결합 친화도를 표면 플라스몬 공명에 의해 평가하였다.
간략하게, Biacore T200 기기를 사용하여 표면 플라스몬 공명 실험을 수행하였고, Biacore T200 평가 소프트웨어로 1:1 결합 모델을 사용하여 각 실험으로부터 결합 속도(k a), 해리 속도(k d), 및 해리 상수(K D)를 계산하였다.
단일 유세포를 기준으로 유지하면서, 시리즈 S 단백질 A 센서 칩(GE Healthcare Ltd, cat #29-1275-56)의 개별 유세포 상에, 영동 완충액(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 및 0.05% 계면활성제 P20)에서 희석한 대략 1 μg/mL의 BA143, BA144, 및 BA145을 포획하였다. 약 175 공명 단위(RU)에 도달하도록 10 μl/분의 유속으로 30초 주입을 사용하여 항체를 포획하였다. 시노몰구스 원숭이 CD96의 전장 이소형 2 ECD(서열번호 111)를 0, 0.41, 1.23, 3.7, 11.1, 33.3, 및 100 nM의 농도로 희석하고, 30 μl/분의 유속으로 칩 표면에 흘려 3분의 결합 단계와 10분의 해리 단계를 거쳤다. 사이클 사이에, 10 mM 글리신, pH 1.5를 30초씩 2회 주입하여 센서 칩을 재생시켰다. BIAevaluation 3.0 소프트웨어의 글로벌 데이터 분석 옵션을 사용하여 센서그램을 평가하고 간단한 랭뮤어(Langmuir) 1:1 상호작용 모델에 피팅하였다. 편차와 곡선 피팅을 시각적으로 검사하고, Rmax, Chi2, 및 Tc의 파라미터를 평가함으로써 데이터 정확도를 확인하였다. 결합 동역학(k a, k d, 및 K D)은 센서그램 분석으로부터 결정하였으며, 이는 표 11에 나타나 있다.
8.3
실시예 3: 정제된 인간 및 시노몰구스 원숭이 TIGIT 단백질에 결합하는 항-TIGIT 항체
His-태그된 인간 TIGIT에 대한 결합
인간 TIGIT의 전장 ECD(서열번호 113)에 대한 단일특이적 항체 BA148의 결합 친화도를 표면 플라스몬 공명에 의해 평가하였다.
간략하게, Biacore T200 기기를 사용하여 표면 플라스몬 공명 실험을 수행하였고, Biacore T200 평가 소프트웨어로 1:1 결합 모델을 사용하여 각 실험으로부터 결합 속도(k a), 해리 속도(k d), 및 해리 상수(K D)를 계산하였다.
단일 유세포를 기준으로 유지하면서, 시리즈 S 단백질 A 센서 칩(GE Healthcare Ltd, cat #29-1275-56)의 개별 유세포 상에, 영동 완충액(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 및 0.05% 계면활성제 P20)에서 희석한 대략 2 μg/mL의 BA148을 포획하였다. 약 500 공명 단위(RU)에 도달하도록 10 μl/분의 유속으로 30초 주입을 사용하여 항체를 포획하였다. 인간 TIGIT의 전장 ECD(서열번호 113)를 0, 0.41, 1.23, 3.7, 11.1, 33.3, 및 100 nM의 농도로 희석하고, 30 μl/분의 유속으로 칩 표면에 흘려 3분의 결합 단계와 10분의 해리 단계를 거쳤다. 사이클 사이에, 10 mM 글리신, pH 1.5를 30초씩 2회 주입하여 센서 칩을 재생시켰다. BIAevaluation 3.0 소프트웨어의 글로벌 데이터 분석 옵션을 사용하여 센서그램을 평가하고 간단한 랭뮤어(Langmuir) 1:1 상호작용 모델에 피팅하였다. 편차와 곡선 피팅을 시각적으로 검사하고, Rmax, Chi2, 및 Tc의 파라미터를 평가함으로써 데이터 정확도를 확인하였다. 결합 동역학(k a, k d, 및 K D)은 센서그램 분석으로부터 결정하였으며, 이는 표 12에 나타나 있다.
His-태그된 시노몰구스 원숭이 TIGIT에 대한 결합
시노몰구스 원숭이 TIGIT의 전장 ECD(서열번호 114)에 대한 단일특이적 항체 BA148의 결합 친화도를 표면 플라스몬 공명에 의해 평가하였다.
간략하게, Biacore T200 기기를 사용하여 표면 플라스몬 공명 실험을 수행하였고, Biacore T200 평가 소프트웨어로 1:1 결합 모델을 사용하여 각 실험으로부터 결합 속도(k a), 해리 속도(k d), 및 해리 상수(K D)를 계산하였다.
단일 유세포를 기준으로 유지하면서, 시리즈 S 단백질 A 센서 칩(GE Healthcare Ltd, cat #29-1275-56)의 개별 유세포 상에, 영동 완충액(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 및 0.05% 계면활성제 P20)에서 희석한 대략 4 μg/mL의 BA148을 포획하였다. 약 500 공명 단위(RU)에 도달하도록 10 μl/분의 유속으로 30초 주입을 사용하여 항체를 포획하였다. 시노몰구스 원숭이 TIGIT의 전장 ECD(서열번호 114)를 0, 0.41, 1.23, 3.7, 11.1, 33.3, 및 100 nM의 농도로 희석하고, 30 μl/분의 유속으로 칩 표면에 흘려 3분의 결합 단계와 10분의 해리 단계를 거쳤다. 사이클 사이에, 10 mM 글리신, pH 1.5를 30초씩 2회 주입하여 센서 칩을 재생시켰다. BIAevaluation 3.0 소프트웨어의 글로벌 데이터 분석 옵션을 사용하여 센서그램을 평가하고 간단한 랭뮤어(Langmuir) 1:1 상호작용 모델에 피팅하였다. 편차와 곡선 피팅을 시각적으로 검사하고, Rmax, Chi2, 및 Tc의 파라미터를 평가함으로써 데이터 정확도를 확인하였다. 결합 동역학(k a, k d, 및 K D)은 센서그램 분석으로부터 결정하였으며, 이는 표 13에 나타나 있다.
8.4
실시예 4: 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자에 대한, 정제된 인간 TIGIT 및 CD96 단백질의 동시 이중 결합
표면 플라스몬 공명 결합 검정
다중특이적 분자 BA123, BA125, 및 BA127이 인간 TIGIT의 전장 ECD(서열번호 113) 및 C89S 돌연변이를 가진 CD96의 인간 이소형 2의 전장 ECD(서열번호 63)에 동시에 결합하는 능력을 표면 플라스몬 공명을 사용하여 확인하였다.
간략하게, Biacore T200 기기를 사용하여 표면 플라스몬 공명 실험을 수행하고, Biacore T200 평가 소프트웨어을 사용하여 센서그램을 시각적으로 검사하였다.
단일 유세포를 기준으로 유지하면서, 시리즈 S 단백질 A 센서 칩(GE Healthcare Ltd, cat #29-1275-56)의 개별 유세포 상에, 영동 완충액(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 및 0.05% 계면활성제 P20)에서 희석한 대략 4 μg/mL의 BA123, BA125, 및 BA127을 포획하였다. 약 1000 공명 단위(RU)에 도달하도록 10 μl/분의 유속으로 30초 주입을 사용하여 다중특이적 분자를 포획하였다. 그런 다음, Biacore T200의 이중 주입 프로토콜을 상이한 TIGIT 및/또는 CD96 샘플의 2회 별도 주입(순차적인 즉시 주입)에 사용하였다. 제1 주입으로서, 100 nM의 인간 TIGIT의 전장 ECD(서열번호 113)를 3분 결합 단계 동안 주입한 직후에, 제2 주입으로서 완충액, 100 nM의 인간 TIGIT의 전장 ECD(서열번호 113), 100 nM의 인간 TIGIT의 전장 ECD(서열번호 113) 및 C89S 돌연변이를 가진 100 nM의 CD96의 인간 이소형 2의 전장 ECD(서열번호 63)의 혼합물, 또는 C89S 돌연변이를 가진 100 nM의 CD96의 인간 이소형 2의 전장 ECD(서열번호 63)를 3분 동안 주입하였다. 제2 주입에 이어서 10분의 해리 단계를 가졌다. 사이클 사이에, 10 mM 글리신, pH 1.5를 30초씩 2회 주입하여 센서 칩을 재생시켰다. 센서그램은 BIAevaluation 3.0 소프트웨어를 사용하여 평가하였다.
도 1a~1c에 도시된 것과 같이, TIGIT 결합된 다중특이적 분자 위에 TIGIT와 CD96의 혼합물을 이어서 흘렸을 때 발생하는 신호(RU)의 증가에 의해 입증된 것과 같이, BA123(도 1a), BA125(도 1b), 및 BA127(도 1c)는 인간 TIGIT 단백질과 인간 CD96 단백질에 동시에 결합할 수 있는데, 이는 CD96이 다중특이적 분자의 다른 항원 결합 영역에 결합한다는 것을 나타낸다.
세포 결합 검정
본 실시예에서, 대조군 다중특이적 분자 BA128, BA131, 및 BA133과 비교했을 때 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA127이, 인간 TIGIT 또는 인간 CD96을 발현하도록 조작된 CHO 세포에 동시에 결합한다.
인간 TIGIT 또는 인간 CD96을 발현하는 CHO 세포주를 1 μg/mL 퓨로마이신이 담긴 Power CHO-2 배지에 넣고 37℃의 진탕 플라스크에서 배양하였다. 항체 결합 검정을 위해, 인간 TIGIT 또는 CD96-CHO 세포를 인큐베이터로부터 회수하고 세포 배양물이 담긴 튜브로 옮겼다. 세포를 300g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고, FACS 완충액(2% 소태아 혈청이 보충된 차가운 PBS)에 재현탁된 세포를 50 μL 중 웰 당 1Х105개의 세포 밀도로 96-웰 둥근 바닥 조직 배양 플레이트에 시딩하였다.
항체를 별도의 마이크로플레이트에서 제조하였다. 항체를 FACS 완충액에서 1:3으로 연속 희석하였다. CHO-인간 TIGIT에 결합시키기 위해 90 μg/mL 내지 0.0005 μg/mL 범위, 또는 CHO-인간 CD96에 결합시키기 위해 30 μg/mL 내지 0.0002 μg/mL 범위의 총 12개의 희석물을 제조하였다. 세포를 300 g에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 버리고, 세포를 50 μl의 항체 혼합물에 재현탁하였다. 세포를 4℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 45분 후, 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하고 상청액을 버렸다.
도 2a 및 2b에 도시된 것과 같이, 대조군 다중특이적 분자 BA128, BA131, 및 BA133과 비교했을 때 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA127은 인간 TIGIT와 인간 CD96에 동시에 결합할 수 있었다. 세포-발현된 인간 TIGIT 및 가용성 His-태그된 인간 CD96(도 2a) 또는 세포-발현된 인간 CD96 및 가용성 His-태그된 인간 TIGIT(도 2b)의 이중 결합은 형광색소-접합된 (Alex Fluor 488) 항-His 항체를 사용하여 유세포 분석법으로 검출하였다.
8.5
실시예 5: 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자의 리드 패널의 특성 분석
8.5.1 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자는 인간 및 시노몰구스 원숭이 CD96을 발현하는 세포에 결합한다
본 실시예에서, 다양한 세포 유형의 표면에서 야생형 인간 CD96 또는 야생형 시노몰구스 원숭이 CD96에 결합하는 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자의 능력을 유세포 분석법에 의해 시험관 내에서 시험하였다.
인간 CD96-발현 CHO 세포에 대한 결합
CHO 세포의 표면에서 발현된 인간 CD96에 결합하는 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자의 능력을 평가하였다. 간략하게, 야생형 전장 인간 CD96(인간 CD96-CHO) 이소형 1 또는 이소형 2를 암호화하는 벡터로 CHO 세포를 형질감염시키고, 야생형 CD96 이소형 1 또는 이소형 2를 안정적으로 발현하는 클론을 선택하였다. 안정한 세포주를 4 mM L-글루타민, 100 U/mL 1x HT-보충제, 및 2.5 μg/mL 퓨로마이신을 함유하는 Power CHO-2 배지에서 배양하였다.
항체 결합 검정을 위해, 인간 CD96-CHO 세포(이소형 1 또는 이소형 2)의 동결 분취물을 37℃에서 해동한 다음, 0.5% 소 혈청 알부민 및 0.05% 아지드화 나트륨(FACS 완충액)이 보충된 DPBS가 담긴 튜브에 옮겼다. 세포를 300g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고, FACS 완충액에 재현탁된 세포를 50 μL 중 웰 당 2Х105개의 세포 밀도로 96-웰 둥근 바닥 조직 배양 플레이트에 시딩하였다. 별도의 마이크로플레이트에서, 각 항체의 2x 농축된 중간체 모액을 제조하였다. 항체를 FACS 완충액에서 1:3으로 연속 희석하였다. 60 μg/mL 내지 0.001 μg/mL 범위의 총 11개의 희석물을 제조하였다. 그런 다음, 50 μL의 각 희석물을 인간 CD96-CHO 세포가 담긴 마이크로플레이트에 옮겼다. 그런 다음, 이들 세포를 4℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 항체 염색을 위해, 세포를 차가운 FACS 완충액으로 2회 세척하고, R-피코에리트린(PE) AffiniPure F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG, 특이적 Fcg 단편(Jackson, Cat ## 109-116-098)을 함유하는 FACS 완충액에 1:800의 최종 농도로 재현탁하였다. 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 세포를 차가운 FACS 완충액으로 2회 세척하고, 유세포 계측법(BD LSR Fortesa 유세포 계측기)로 세포를 분석하였다. FlowJo 소프트웨어를 사용해 FSC-A 대 SSC-A, 및 SSC-H 대 SSC-A를 순차적으로 게이팅함으로써 데이터를 분석하였다. PE에 대한 평균 형광 강도(MFI) 값을 계산하고, GraphPad Prism 소프트웨어에 의해 데이터를 도표화하였다. 상기 소프트웨어를 사용해, 4-파라미터 로지스틱 방정식을 사용한 곡선 피팅에 의해 최대 결합의 50%가 되는 다중특이적 분자의 농도(유효 농도 50, [EC50])를 결정하였다.
도 3a~3i(이소형 2) 및 도 4a~4i(이소형 1)에 도시된 것과 같이, BA123, BA125, BA127, BA129, BA130, BA131, BA134, 및 BA136은 투여량 의존적 방식으로 인간 CD96-발현 CHO 세포에 결합하였다. 각 항체별로 평균 EC50 값을 계산하였고, 이는 표 14 및 16(각각 이소형 2 및 이소형 1에 대해)에 보고되어 있다. 대표적인 실험에 대한 곡선 아래 면적(AUC)을 계산하였고, 이는 표 15 및 17(각각 이소형 2 및 이소형 1 에 대해)에 보고되어 있다.
시노몰구스 원숭이 CD96-발현 CHO 세포에 대한 결합
유사한 실험에서, 세포 표면에서 야생형 시노몰구스 원숭이 CD96(이소형 2)을 발현하도록 조작된 CHO 세포(시노몰구스 CD96 CHO 세포)에 결합하는 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자의 능력을 시험하였다. 간략하게, CHO 세포를 야생형 전장 시노몰구스 원숭이 CD96 이소형 2를 암호화하는 벡터로 형질감염시키고, CD96을 안정적으로 발현하는 클론을 선택하였다. 안정한 세포주를 4 mM L-글루타민, 100 U/mL 1x HT-보충제, 및 2.5 μg/mL 퓨로마이신을 함유하는 Power CHO-2 배지에서 배양하였다. 시노몰구스 원숭이 CD96-CHO에 결합하는 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자의 능력을 인간 CD96-CHO 세포에 대해 전술한 것과 같이 결정하였다.
도 5a~5i에 도시된 것과 같이, 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA123, BA127, BA129, BA131, BA134, 및 BA136은 시노몰구스 원숭이 CD96을 발현하는 CHO 세포에 투여량 의존적 방식으로 결합하였다. 시노몰구스 CD96-CHO 세포에 대한 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자의 결합에 대한 EC50 값을 각 항체에 대해 계산하였고, 이는 표 18에 보고되어 있다. 곡선 아래 면적(AUC)을 계산하였고, 이는 표 19에 보고되어 있다.
8.5.2
항-TIGITxCD96 다중특이적 분자는 인간 CD96에 대한 리간드 결합을 차단한다
야생형 인간 CD96(이소형 2) 또는 야생형 시노몰구스 원숭이 CD96(이소형 2)과 이의 리간드 CD155 간의 결합을 차단하는 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자의 능력을 유세포 분석법에 의해 시험관 내에서 시험하였다.
가용성 인간 CD155에 대한 인간 CD96-CHO 세포 결합의 차단
항-TIGITxCD96 다중특이적 분자를, CHO 세포에서 과발현된 야생형 인간 CD96(이소형 2)과 가용성 인간 CD155 간의 결합을 차단하는 이들의 능력에 대해 유세포 분석법에 의해 시험관 내에서 시험하였다.
간략하게, R-피코에리트린(CD155-His-PE)에 접합된 2 μg/mL의 인간 CD155-Fc를 함유하는 용액을 FACS 완충액에서 제조하였다. 그런 다음, 인간 CD155-Fc-PE의 이러한 작업 모액 50 μL를 96-웰 둥근 바닥 마이크로플레이트의 웰에 첨가하였다. 각각의 다중특이적 분자의 4x 농축된 중간 모액을 마이크로플레이트에서 제조하였다. 항체를 FACS 완충액에서 1:3으로 연속 희석하였다. 120 μg/mL 내지 0.002 μg/mL 범위의 총 11개의 희석물을 제조하였다. 그런 다음, 25 μL의 각 희석액을 CD155-Fc-PE가 담긴 마이크로플레이트에 옮겼다. 마지막으로, 전술한 것과 같이 제조한 25 μL의 야생형 인간 CD96-CHO 세포(이소형 2)를 각 웰에 첨가하였다. 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 세포를 차가운 FACS 완충액으로 2회 세척하고, 유세포 계측법(BD LSR Fortesa 유세포 계측기)로 세포를 분석하였다. FSC-A 대 SSC-A 및 SSC-H 대 SSC-A 상에서 순차적으로 게이팅함으로써 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다. PE에 대한 평균 형광 강도(MFI) 값을 계산하고, GraphPad Prism 소프트웨어에 의해 데이터를 도표화하고, 전술한 것과 같이 분석하였다. 각 항체 농도별로, 다중특이적 분자가 없는 가운데 CD155-Fc-PE와 함께 인큐베이션한 인간 CD96-CHO 세포에 대해 수득한 MFI 값 및 인간 CD96-CHO 세포 자가형광(배경)에 대한 MFI 값을 사용해 실험 데이터를 식 1에 따라 정규화하였다.
식 1
최대 신호 (%) =
("다중특이적 분자" MFI - "배경" MFI) / ("총" MFI - "배경" MFI)
식 중
"다중특이적 분자"는 BA123, BA125, BA127, BA129, BA130, BA131, BA133, BA134,, 또는 BA136이고
"배경"은 세포 단독(항체 또는 CD155-Fc-PE 없음)이고
"총"은 항체의 부재 하에 CD155-Fc-PE와 함께 인큐베이션한 세포이다.
인간 CD96-CHO 세포에 대한 CD155-Fc-PE 결합의 50%를 억제하는 다중특이적 분자의 농도를 결정하였다. GraphPad Prism 소프트웨어를 사용해 4 파라미터 로지스틱 방정식을 사용한 곡선 피팅에 의해 IC50 값을 계산하였다.
도 6a~6i에 도시된 것과 같이, BA123, BA125, BA127, BA129, BA130, BA131, BA134, 및 BA136은 CD155에 대한 인간 CD96 결합을 차단하였다. 각 항체별로 평균 IC50 값을 계산하였고, 이는 표 20에 보고되어 있다. 대표적인 실험에 대한 곡선 아래 면적(AUC)을 계산하였고, 이는 표 21에 보고되어 있다.
가용성 인간 CD155에 대한 시노몰구스 CD96-CHO 세포 결합의 차단
유사한 실험에서, 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자를, CHO 세포에서 과발현된 야생형 시노몰구스 원숭이 CD96(이소형 2)과 가용성 인간 CD155 간의 결합을 차단하는 이들의 능력에 대해, 인간 CD96-CHO 세포에 대해 전술한 것과 같이, 유세포 분석법에 의해 시험관 내에서 시험하였다.
인간 CD96-CHO 세포에 대한 CD155-Fc-PE 결합의 50%를 억제하는 항체 농도(IC50)를 결정하였다. GraphPad Prism 소프트웨어를 사용해 4 파라미터 로지스틱 방정식을 사용한 곡선 피팅에 의해 IC50 값을 계산하였다.
도 7a~7i에 도시된 것과 같이, 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA129, BA131, BA134, 및 BA136은 야생형 시노몰구스 원숭이 CD96과 인간 CD155 간의 상호작용을 부분적으로 차단한다. 다중특이적 분자가 부분 차단제이기 때문에 IC50 값을 계산할 수 없었다. 곡선 아래 면적(AUC)을 계산하였고, 이는 표 22에 보고되어 있다.
8.5.3 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자는 인간 및 시노몰구스 원숭이 TIGIT를 발현하는 세포에 결합한다
다양한 세포 유형의 표면에서 야생형 인간 TIGIT 또는 야생형 시노몰구스 원숭이 TIGIT에 결합하는 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자의 능력을 유세포 분석법에 의해 시험관 내에서 시험하였다.
인간 TIGIT-발현 CHO 세포에 대한 결합
CHO 세포의 표면에서 발현된 야생형 인간 TIGIT에 결합하는 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자의 능력을 평가하였다. 간략하게, 야생형 전장 인간 TIGIT(인간 TIGIT-CHO)를 암호화하는 벡터로 CHO 세포를 형질감염시키고, TIGIT를 안정적으로 발현하는 클론을 선택하였다. 안정한 세포주를 4 mM L-글루타민, 100 U/mL 1x HT-보충제, 및 2.5 μg/mL 퓨로마이신을 함유하는 Power CHO-2 배지에서 배양하였다.
항체 결합 검정을 위해, 인간 TIGIT-CHO 세포의 동결 분취물을 37℃에서 해동한 다음, 0.5% 소 혈청 알부민 및 0.05% 아지드화 나트륨(FACS 완충액)이 보충된 DPBS가 담긴 튜브에 옮겼다. 세포를 300g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고, FACS 완충액에 재현탁된 세포를 50 μL 중 웰 당 2Х105개의 세포 밀도로 96-웰 둥근 바닥 조직 배양 플레이트에 시딩하였다. 별도의 마이크로플레이트에서, 각 항체의 2x 농축된 중간체 모액을 제조하였다. 항체를 FACS 완충액에서 1:4로 연속 희석하였다. 60 μg/mL 내지 0.000057 μg/mL 범위의 총 11개의 희석물을 제조하였다. 그런 다음, 50 μL의 각 희석물을 인간 TIGIT-CHO 세포가 담긴 마이크로플레이트에 옮겼다. 그런 다음, 이들 세포를 4℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 항체 염색을 위해, 세포를 차가운 FACS 완충액으로 2회 세척하고, R-피코에리트린(PE) AffiniPure F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG, 특이적 Fcg 단편(Jackson, Cat # 109-116-098)을 함유하는 FACS 완충액에 1:800의 최종 농도로 재현탁하였다. 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 세포를 차가운 FACS 완충액으로 2회 세척하고, 유세포 계측법(BD LSR Fortesa 유세포 계측기)로 세포를 분석하였다. FlowJo 소프트웨어를 사용해 FSC-A 대 SSC-A, 및 SSC-H 대 SSC-A를 순차적으로 게이팅함으로써 데이터를 분석하였다. PE에 대한 평균 형광 강도(MFI) 값을 계산하고, GraphPad Prism 소프트웨어에 의해 데이터를 도표화하였다. 상기 소프트웨어를 사용해, 4-파라미터 로지스틱 방정식을 사용한 곡선 피팅에 의해 최대 결합의 50%가 되는 다중특이적 분자의 농도(유효 농도 50, [EC50])를 결정하였다.
도 8a~8i에 도시된 것과 같이, BA123, BA125, BA127, BA133, 및 BA136은 인간 TIGIT-발현 CHO 세포에 투여량 의존적 방식으로 결합하였다. 각 다중특이적 분자에 대해 평균 EC50 값을 계산하였고, 이는 표 23에 보고되어 있다. 대표적인 실험에 대한 곡선 아래 면적(AUC)을 계산하였고, 이는 표 24에 보고되어 있다.
시노몰구스 원숭이 TIGIT-발현 CHO 세포에 대한 결합
유사한 실험에서, 세포 표면에서 야생형 시노몰구스 원숭이 TIGIT를 발현하도록 조작된 CHO 세포(시노몰구스 TIGIT-CHO 세포)에 결합하는 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자의 능력을 시험하였다. 간략하게, CHO 세포를, 야생형 전장 시노몰구스 원숭이 TIGIT를 암호화하는 벡터로 형질감염시키고, TIGIT를 안정적으로 발현하는 클론을 선택하였다. 안정한 세포주를 4 mM L-글루타민, 100 U/mL 1x HT-보충제, 및 2.5 μg/mL 퓨로마이신을 함유하는 Power CHO-2 배지에서 배양하였다. 시노몰구스 TIGIT-CHO에 결합하는 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자의 능력을 인간 TIGIT-CHO 세포에 대해 전술한 것과 같이 결정하였다.
도 9a~9i에 도시된 것과 같이, BA123, BA125, BA127, BA133, 및 BA136은 시노몰구스 원숭이 TIGIT를 발현하는 CHO 세포에 투여량 의존적 방식으로 결합하였다. 시노몰구스 TIGIT-CHO 세포에 대한 항체의 결합에 대한 평균 EC50 값을 각 항체별로 계산하였고, 이는 표 25에 보고되어 있다. 대표적인 실험에 대한 곡선 아래 면적(AUC)을 계산하였고, 이는 표 26에 보고되어 있다.
8.5.4 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자는 TIGIT에 대한 리간드 결합을 차단한다
야생형 인간 TIGIT 또는 야생형 시노몰구스 원숭이 TIGIT와 이의 리간드 인간 CD155 간의 결합을 차단하는 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자의 능력을 유세포 분석법에 의해 시험관 내에서 시험하였다.
가용성 인간 CD155에 대한 인간 TIGIT-CHO 세포 결합의 차단
본 실시예에서, 야생형 인간 TIGIT와 이의 리간드 인간 CD155(PVR로도 지칭됨) 간의 결합을 차단하는 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자의 능력을 시험하였다. 구체적으로, 항체를, CHO 세포에서 과발현된 인간 TIGIT와 가용성 인간 CD155 간의 결합을 차단하는 이들의 능력에 대해 유세포 분석에 의해 시험관 내에서 시험하였다.
간략하게, R-피코에리트린(CD155-His-PE)에 접합된 2 μg/mL의 인간 CD155-Fc를 함유하는 용액을 FACS 완충액에서 제조하였다. 그런 다음, 인간 CD155-Fc-PE의 이러한 작업 모액 50 μL을 96-웰 둥근 바닥 마이크로플레이트의 웰에 첨가하였다. 각각의 다중특이적 분자의 4x 농축된 중간 모액을 마이크로플레이트에서 제조하였다. 항체를 FACS 완충액에서 1:3으로 연속 희석하였다. 120 μg/mL 내지 0.002 μg/mL 범위의 총 11개의 희석물을 제조하였다. 그런 다음, 25 μL의 각 희석액을 CD155-Fc-PE가 담긴 마이크로플레이트에 옮겼다. 마지막으로, 전술한 것과 같이 제조한 25 μL의 인간 CD96-CHO 세포를 각 웰에 첨가하였다. 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 세포를 차가운 FACS 완충액으로 2회 세척하고, 유세포 계측법(BD LSR Fortesa 유세포 계측기)로 세포를 분석하였다. FSC-A 대 SSC-A 및 SSC-H 대 SSC-A 상에서 순차적으로 게이팅함으로써 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다. PE에 대한 평균 형광 강도(MFI) 값을 계산하고, GraphPad Prism 소프트웨어에 의해 데이터를 도표화하고, 전술한 것과 같이 분석하였다. 각 항체 농도별로, 다중특이적 분자가 없는 가운데 CD155-Fc-PE와 함께 인큐베이션한 인간 TIGIT-CHO 세포에 대해 수득한 MFI 값 및 인간 TIGIT-CHO 세포 자가형광(배경)에 대한 MFI 값을 사용해 실험 데이터를 식 2에 따라 정규화하였다.
식 2
최대 신호 (%) =
("다중특이적 분자" MFI - "배경" MFI) / ("총" MFI - "배경" MFI)
식 중
"다중특이적 분자"는 BA123, BA125, BA127, BA129, BA130, BA131, BA133, BA134,, 또는 BA136이고
"배경"은 세포 단독(항체 또는 CD155-Fc-PE 없음)이고
"총"은 항체의 부재 하에 CD155-Fc-PE와 함께 인큐베이션한 세포이다.
인간 TIGIT-CHO 세포에 대한 CD155-Fc-PE 결합의 50%를 억제하는 다중특이적 분자의 농도를 결정하였다. GraphPad Prism 소프트웨어를 사용해 4 파라미터 로지스틱 방정식을 사용한 곡선 피팅에 의해 IC50 값을 계산하였다.
도 10a~10i에 도시된 것과 같이, BA123, BA125, BA127, BA133, 및 BA136은 CD155에 대한 인간 TIGIT 결합을 차단하였다. 각 항체별로 평균 IC50 값을 계산하였고, 이는 표 27에 보고되어 있다. 대표적인 실험에 대한 곡선 아래 면적(AUC)을 계산하였고, 이는 표 28에 보고되어 있다.
가용성 인간 CD155에 대한 시노몰구스 TIGIT-CHO 세포 결합의 차단
유사한 실험에서, 야생형 시노몰구스 원숭이 TIGIT와 이의 리간드 인간 CD155(PVR로도 지칭됨) 간의 결합을 차단하는 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자의 능력을 시험하였다. 간략하게, 항체를, CHO 세포에서 과발현된 야생형 시노몰구스 원숭이 TIGIT와 가용성 인간 CD155 간의 결합을 차단하는 이들의 능력에 대해, 인간 TIGIT-CHO 세포에 대해 전술한 것과 같이, 유세포 분석법에 의해 시험관 내에서 시험하였다.
인간 TIGIT-CHO 세포에 대한 CD155-Fc-PE 결합의 50%를 억제하는 항체 농도(IC50)를 결정하였다. GraphPad Prism 소프트웨어를 사용해 4 파라미터 로지스틱 방정식을 사용한 곡선 피팅에 의해 IC50 값을 계산하였다.
도 11a~11i에 도시된 것과 같이, 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA123, BA125, BA127, BA133, 및 BA136은 시노몰구스 원숭이 CD96과 CD155 간의 상호작용을 차단한다. 각 항체별로 평균 IC50 값을 계산하였고, 이는 표 29에 보고되어 있다. 대표적인 실험에 대한 곡선 아래 면적(AUC)을 계산하였고, 이는 표 30에 보고되어 있다.
8.5.5 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자는 인간 TIGIT 및 인간 CD96을 공동 발현하는 세포에 결합한다
다양한 세포 유형의 표면에서 인간 TIGIT 또는 야생형 인간 CD96에 결합하는 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자의 능력을 유세포 분석법에 의해 시험관 내에서 시험하였다.
인간 TIGIT 및 인간 CD96을 공동 발현하는 CHO 세포에 대한 결합
CHO 세포의 표면에서 공동 발현된 야생형 인간 TIGIT 및 야생형 인간 CD96에 결합하는 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자의 능력을 평가하였다. 간략하게, 야생형 인간 TIGIT(인간 TIGIT-CHO)를 암호화하는 벡터로 CHO 세포를 형질감염시키고, TIGIT를 안정적으로 발현하는 클론을 선택하였다. 그런 다음, 이들 세포를, 야생형 인간 CD96(이소형 2)을 암호화하는 벡터로 형질감염시켜 인간 TIGIT 및 인간 CD96 둘 다를 발현하는 세포주(인간 TIGIT-CD96-CHO)를 생산하였다. 이들 안정한 세포주를 4 mM L-글루타민, 100 U/mL 1x HT-보충제, 및 2.5 μg/mL 퓨로마이신을 함유하는 Power CHO-2 배지에서 배양하였다. 발현은 유세포 분석법에 의해 확인하였다. 세포는 높은 수준의 TIGIT 발현에 대해 클론성이었으나, CD96 발현은 다양하였다.
항체 결합 검정을 위해, 인간 TIGIT-CD96-CHO 세포의 동결 분취물을 37℃에서 해동한 다음, 0.5% 소 혈청 알부민 및 0.05% 아지드화 나트륨(FACS 완충액)이 보충된 DPBS가 담긴 튜브에 옮겼다. 세포를 300g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고, FACS 완충액에 재현탁된 세포를 50 μL 중 웰 당 2Х105개의 세포 밀도로 96-웰 둥근 바닥 조직 배양 플레이트에 시딩하였다. 별도의 마이크로플레이트에서, 각 항체의 2x 농축된 중간체 모액을 제조하였다. 항체를 FACS 완충액에서 1:3으로 연속 희석하였다. 60 μg/mL 내지 0.001 μg/mL 범위의 총 11개의 희석물을 제조하였다. 그런 다음, 50 μL의 각 희석물을 인간 TIGIT-CD96-CHO 세포가 담긴 마이크로플레이트에 옮겼다. 그런 다음, 이들 세포를 4℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 항체 염색을 위해, 세포를 차가운 FACS 완충액으로 2회 세척하고, R-피코에리트린(PE) AffiniPure F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG, 특이적 Fcg 단편(Jackson, Cat # 109-116-098)을 함유하는 FACS 완충액에 1:800의 최종 농도로 재현탁하였다. 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 세포를 차가운 FACS 완충액으로 2회 세척하고, 유세포 계측법(BD LSR Fortesa 유세포 계측기)로 세포를 분석하였다. FlowJo 소프트웨어를 사용해 FSC-A 대 SSC-A, 및 SSC-H 대 SSC-A를 순차적으로 게이팅함으로써 데이터를 분석하였다. PE에 대한 평균 형광 강도(MFI) 값을 계산하고, GraphPad Prism 소프트웨어에 의해 데이터를 도표화하였다. 상기 소프트웨어를 사용해, 4-파라미터 로지스틱 방정식을 사용한 곡선 피팅에 의해 최대 결합의 50%가 되는 다중특이적 분자의 농도(유효 농도 50, [EC50])를 결정하였다.
도 12a~12i에 도시된 것과 같이, BA123, BA125, BA127, BA129, BA130, BA131, BA133, BA134, 및 BA136은 인간 TIGIT-CD96 발현 CHO 세포에 투여량 의존적 방식으로 결합하였다. 각 다중특이적 항체에 대해 계산한 평균 EC50 값을 계산하였고, 이는 표 31에 보고되어 있다. 대표적인 실험에 대한 곡선 아래 면적(AUC)을 계산하였고, 이는 표 32에 보고되어 있다.
8.5.6 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자는 인간 TIGIT 및 인간 CD96을 공동 발현하는 세포에 대한 리간드 결합을 차단한다
다양한 세포 유형의 표면에서 인간 TIGIT와 인간 CD96 간의 결합을 차단하는 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자의 능력을 유세포 분석법에 의해 시험관 내에서 시험하였다.
인간 TIGIT 및 인간 CD96을 공동 발현하는 CHO 세포에 대한 가용성 인간 CD155 결합의 차단
본 실시예에서, 야생형 인간 TIGIT 및 야생형 인간 CD96과 이의 리간드 인간 CD155(PVR로도 지칭됨) 간의 결합을 차단하는 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자의 능력을 시험하였다. 구체적으로, 항체를, CHO 세포에서 과발현된 인간 TIGIT 및 인간 CD96과 가용성 인간 CD155 간의 결합을 차단하는 이들의 능력에 대해 유세포 분석에 의해 시험관 내에서 시험하였다.
간략하게, R-피코에리트린(CD155-His-PE)에 접합된 2 μg/mL의 인간 CD155-Fc를 함유하는 용액을 FACS 완충액에서 제조하였다. 그런 다음, 인간 CD155-Fc-PE의 이러한 작업 모액 50 μL를 96-웰 둥근 바닥 마이크로플레이트의 웰에 첨가하였다. 각각의 다중특이적 분자의 4x 농축된 중간 모액을 마이크로플레이트에서 제조하였다. 항체를 FACS 완충액에서 1:3으로 연속 희석하였다. 120 μg/mL 내지 0.002 μg/mL 범위의 총 11개의 희석물을 제조하였다. 그런 다음, 25 μL의 각 희석액을 CD155-Fc-PE가 담긴 마이크로플레이트에 옮겼다. 마지막으로, 전술한 것과 같이 제조한 25 μL의 인간 CD96-CHO 세포를 각 웰에 첨가하였다. 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 세포를 차가운 FACS 완충액으로 2회 세척하고, 유세포 계측법(BD LSR Fortesa 유세포 계측기)로 세포를 분석하였다. FSC-A 대 SSC-A 및 SSC-H 대 SSC-A 상에서 순차적으로 게이팅함으로써 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다. PE에 대한 평균 형광 강도(MFI) 값을 계산하고, GraphPad Prism 소프트웨어에 의해 데이터를 도표화하고, 전술한 것과 같이 분석하였다. 각 다중특이적 분자 농도별로, 다중특이적 분자가 없는 가운데 CD155-Fc-PE와 함께 인큐베이션한 인간 TIGIT-CHO 세포에 대해 수득한 MFI 값 및 인간 TIGIT-CHO 세포 자가형광(배경)에 대한 MFI 값을 사용해 실험 데이터를 식 3에 따라 정규화하였다.
식 3
최대 신호 (%) =
("다중특이적 분자" MFI - "배경" MFI) / ("총" MFI - "배경" MFI)
식 중
"다중특이적 분자"는 BA123, BA125, BA127, BA129, BA130, BA131, BA133, BA134,, 또는 BA136이고
"배경"은 세포 단독(항체 또는 CD155-Fc-PE 없음)이고
"총"은 항체의 부재 하에 CD155-Fc-PE와 함께 인큐베이션한 세포이다.
인간 TIGIT-CD96-CHO 세포에 대한 CD155-Fc-PE 결합의 50%를 억제하는 다중특이적 분자의 농도를 결정하였다. GraphPad Prism 소프트웨어를 사용해 4 파라미터 로지스틱 방정식을 사용한 곡선 피팅에 의해 IC50 값을 계산하였다.
도 13a~13i에 도시된 것과 같이, BA123, BA125, BA127, BA133, 및 BA136은 CD155에 대한 인간 TIGIT-CD96 결합을 차단하였다. BA129, BA130, BA131, 및 BA134는 CD155에 대한 인간 TIGIT-CD96 결합을 부분적으로 차단하였다. 각 다중특이적 분자에 대해 평균 IC50 값을 계산하였고, 이는 표 33에 보고되어 있다. 대표적인 실험에 대한 곡선 아래 면적(AUC)을 계산하였고, 이는 표 34에 보고되어 있다.
8.6
실시예 6: 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자는 인간 FcγRIIIa를 발현하는 세포에 결합한다
다양한 세포 유형의 표면에서 인간 FcγRIIIa의 변이체 V/V 또는 변이체 F/F에 결합하는 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자의 능력을 유세포 분석법에 의해 시험관 내에서 시험하였다.
인간 FcγRIIIa 발현 CHO 세포에 대한 결합
CHO 세포의 표면에서 발현된 인간 FcγRIIIa의 변이체 V/V 또는 변이체 F/F에 결합하는 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자의 능력을 평가하였다. 간략하게, CHO 세포를, 전장 인간 FcγRIIIa(인간 FcγRIIIa - CHO) 변이체 V/V 또는 F/F를 암호화하는 벡터로 형질감염시키고, FcγRIIIa(변이체 V/V 또는 변이체 F/F)를 안정적으로 발현하는 클론을 선택하였다. 안정한 세포주를 4 mM L-글루타민, 100 U/mL 1x HT-보충제, 및 2.5 μg/mL 퓨로마이신을 함유하는 Power CHO-2 배지에서 배양하였다.
항체 결합 검정을 위해, 인간 FcγRIIIa-CHO(변이체 V/V 또는 변이체 F/F) 세포의 동결 분취물을 37℃에서 해동한 다음, 0.5% 소 혈청 알부민 및 0.05% 아지드화 나트륨(FACS 완충액)이 보충된 DPBS가 담긴 튜브에 옮겼다. 세포를 300g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고, FACS 완충액에 재현탁된 세포를 50 μL 중 웰 당 2Х105개의 세포 밀도로 96-웰 둥근 바닥 조직 배양 플레이트에 시딩하였다. 별도의 마이크로플레이트에서, 각각의 다중특이적 분자의 2x 농축된 중간 모액을 제조하였다. 다중특이적 분자를 FACS 완충액에서 1:4로 연속 희석하였다. 60 μg/mL 내지 0.000057 μg/mL 범위의 총 11개의 희석물을 제조하였다. 그런 다음, 50 μL의 각 희석물을 인간 FcγRIIIa-CHO(변이체 V/V 또는 변이체 F/F) 세포가 담긴 마이크로플레이트에 옮겼다. 그런 다음, 이들 세포를 4℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 항체 염색을 위해, 세포를 차가운 FACS 완충액으로 2회 세척하고, R-피코에리트린(PE) AffiniPure F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG, 특이적 Fcg 단편(Jackson, Cat # 109-116-098)을 함유하는 FACS 완충액에 1:800의 최종 농도로 재현탁하였다. 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 세포를 차가운 FACS 완충액으로 2회 세척하고, 유세포 계측법(BD LSR Fortesa 유세포 계측기)로 세포를 분석하였다. FlowJo 소프트웨어를 사용해 FSC-A 대 SSC-A, 및 SSC-H 대 SSC-A를 순차적으로 게이팅함으로써 데이터를 분석하였다. PE에 대한 평균 형광 강도(MFI) 값을 계산하고, GraphPad Prism 소프트웨어에 의해 데이터를 도표화하였다. 상기 소프트웨어를 사용해, 4-파라미터 로지스틱 방정식을 사용한 곡선 피팅에 의해 최대 결합의 50%가 되는 다중특이적 분자의 농도(유효 농도 50, [EC50])를 결정하였다.
도 14a~14f(변이체 V/V) 및 15a~15f(변이체 F/F)에 도시된 것과 같이, BA123, BA125, BA127, BA129, BA130, 및 BA131은 인간 FcγRIIIa-발현 CHO 세포에 투여량 의존적 방식으로 결합하였다. 각 다중특이적 분자별로 평균 EC50 값을 계산하였고, 이는 변이체 V/V에 대해 표 35에 보고되어 있다. 대표적인 실험에 대한 곡선 아래 면적(AUC)을 계산하였고, 이는 (변이체 V/V 및 변이체 F/F 각각에 대해) 표 36 및 37에 보고되어 있다.
8.7
실시예 7: 항-CD96 항체의 특성 분석
8.7.1 항-인간 CD96 항체는 인간 및 시노몰구스 원숭이 CD96(이소형 2)을 발현하는 세포에 결합한다
다양한 세포 유형의 표면에서 야생형 인간 CD96 또는 야생형 시노몰구스 원숭이 CD96에 결합하는 항-CD96 항체의 능력을 유세포 분석법에 의해 시험관 내에서 시험하였다.
인간 CD96-발현 CHO 세포에 대한 결합
CHO 세포의 표면에서 발현된 야생형 인간 CD96에 결합하는 항-CD96 항체의 능력을 평가하였다. 간략하게, 인간 CD96(인간 CD96-CHO) 이소형 2를 암호화하는 벡터로 CHO 세포를 형질감염시키고, CD96 이소형 2를 안정적으로 발현하는 클론을 선택하였다. 안정한 세포주를 4 mM L-글루타민, 100 U/mL 1x HT-보충제, 및 2.5 μg/mL 퓨로마이신을 함유하는 Power CHO-2 배지에서 배양하였다.
항체 결합 검정을 위해, 인간 CD96-CHO 세포(이소형 2)의 동결 분취물을 37℃에서 해동한 다음, 0.5% 소 혈청 알부민 및 0.05% 아지드화 나트륨(FACS 완충액)이 보충된 DPBS가 담긴 튜브에 옮겼다. 세포를 300g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고, FACS 완충액에 재현탁된 세포를 50 μL 중 웰 당 2Х105개의 세포 밀도로 96-웰 둥근 바닥 조직 배양 플레이트에 시딩하였다. 별도의 마이크로플레이트에서, 각 항체의 2x 농축된 중간체 모액을 제조하였다. 항체를 FACS 완충액에서 1:4로 연속 희석하였다. 60 μg/mL 내지 0.000057 μg/mL 범위의 총 11개의 희석물을 제조하였다. 그런 다음, 50 μL의 각 희석물을 인간 CD96-CHO 세포가 담긴 마이크로플레이트에 옮겼다. 그런 다음, 이들 세포를 4℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 항체 염색을 위해, 세포를 차가운 FACS 완충액으로 2회 세척하고, R-피코에리트린(PE) AffiniPure F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG, 특이적 Fcg 단편(Jackson, Cat # 109-116-098)을 함유하는 FACS 완충액에 1:800의 최종 농도로 재현탁하였다. 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 세포를 차가운 FACS 완충액으로 2회 세척하고, 유세포 계측법(BD LSR Fortesa 유세포 계측기)로 세포를 분석하였다. FlowJo 소프트웨어를 사용해 FSC-A 대 SSC-A, 및 SSC-H 대 SSC-A를 순차적으로 게이팅함으로써 데이터를 분석하였다. PE에 대한 평균 형광 강도(MFI) 값을 계산하고, GraphPad Prism 소프트웨어에 의해 데이터를 도표화하였다. 상기 소프트웨어를 사용해, 4-파라미터 로지스틱 방정식을 사용한 곡선 피팅에 의해 최대 결합의 50%가 되는 항체의 농도(유효 농도 50, [EC50])를 결정하였다.
도 16a~16c에 도시된 것과 같이, 항-CD96 항체 BA143, BA144, 및 BA145는 인간 CD96-발현 CHO 세포(이소형 2)에 투여량 의존적 방식으로 결합하였다. 각 항체별로 평균 EC50 값을 계산하였고, 이는 표 38에 보고되어 있다. 대표적인 실험에 대한 곡선 아래 면적(AUC)을 계산하였고, 이는 표 39에 보고되어 있다.
시노몰구스 원숭이 CD96-발현 CHO 세포에 대한 결합
유사한 실험에서, 세포 표면에서 야생형 시노몰구스 원숭이 CD96(이소형 2)을 발현하도록 조작된 CHO 세포(시노몰구스 CD96-CHO 세포)에 결합하는 항-CD96 항체의 능력을 시험하였다. 간략하게, CHO 세포를 야생형 시노몰구스 원숭이 CD96 이소형 2를 암호화하는 벡터로 형질감염시키고, 시노몰구스 원숭이 CD96을 안정적으로 발현하는 클론을 선택하였다. 안정한 세포주를 4 mM L-글루타민, 100 U/mL 1x HT-보충제, 및 2.5 μg/mL 퓨로마이신을 함유하는 Power CHO-2 배지에서 배양하였다. 시노몰구스 원숭이 CD96-CHO에 결합하는 항-CD96 항체의 능력을 인간 CD96-CHO 세포에 대해 전술한 것과 같이 결정하였다.
도 17a~17c에 도시된 것과 같이, 항-CD96 항체 BA143 및 BA145는 시노몰구스 원숭이 CD96을 발현하는 CHO 세포에 투여량 의존적 방식으로 결합하였다. 시노몰구스 CD96-CHO 세포에 대한 항-CD96 항체의 결합에 대한 평균 EC50 값을 각 항체별로 계산하였고, 이는 표 40에 보고되어 있다. 대표적인 실험에 대한 곡선 아래 면적(AUC)을 계산하였고, 이는 표 41에 보고되어 있다.
8.7.2 항-인간 CD96 항체는 인간 CD96에 대한 리간드 결합을 차단한다
가용성 인간 CD155에 대한 인간 CD96-CHO 세포 결합의 차단
본 실시예에서, 야생형 인간 CD96과 이의 리간드 인간 CD155(PVR로도 지칭됨) 간의 결합을 차단하는 항-CD96 항체의 능력을 시험하였다. 구체적으로, 항체를, CHO 세포에서 과발현된 인간 CD96(이소형 2)과 가용성 인간 CD155 간의 결합을 차단하는 이들의 능력에 대해 유세포 계측법에 의해 시험관 내에서 시험하였다.
간략하게, R-피코에리트린(CD155-His-PE)에 접합된 2 μg/mL의 인간 CD155-Fc를 함유하는 용액을 FACS 완충액에서 제조하였다. 그런 다음, 인간 CD155-Fc-PE의 이러한 작업 모액 50 μL를 96-웰 둥근 바닥 마이크로플레이트의 웰에 첨가하였다. 각 항체의 4x 농축된 중간체 모액을 마이크로플레이트에서 제조하였다. 항체를 FACS 완충액에서 1:4로 연속 희석하였다. 120 μg/mL 내지 0.0001 μg/mL 범위의 총 11개의 희석물을 제조하였다. 그런 다음, 25 μL의 각 희석액을 CD155-Fc-PE가 담긴 마이크로플레이트에 옮겼다. 마지막으로, 전술한 것과 같이 제조한 25 μL의 인간 CD96-CHO 세포(이소형 2)를 각 웰에 첨가하였다. 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 세포를 차가운 FACS 완충액으로 2회 세척하고, 유세포 계측법(BD LSR Fortesa 유세포 계측기)로 세포를 분석하였다. FSC-A 대 SSC-A 및 SSC-H 대 SSC-A 상에서 순차적으로 게이팅함으로써 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다. PE에 대한 평균 형광 강도(MFI) 값을 계산하고, GraphPad Prism 소프트웨어에 의해 데이터를 도표화하고, 전술한 것과 같이 분석하였다.
각 항체 농도별로, 항체가 없는 가운데 CD155-Fc-PE와 함께 인큐베이션한 인간 CD96-CHO 세포에 대해 수득한 MFI 값 및 인간 CD96-CHO 세포 자가형광(배경)에 대한 MFI 값을 사용해 실험 데이터를 식 4에 따라 정규화하였다.
식 4
최대 신호 (%) =
(MFI "항체" - MFI "배경") / (MFI "총" - MFI "배경")
식 중
"항체"는 BA143, BA144, 또는 BA145이고
"배경"은 세포 단독(항체 또는 CD155-Fc-PE 없음)이고
"총"은 항체의 부재 하에 CD155-Fc-PE와 함께 인큐베이션한 세포이다.
인간 CD96-CHO 세포에 대한 CD155-Fc-PE 결합의 50%를 억제하는 항체 농도(IC50)를 결정하였다. GraphPad Prism 소프트웨어를 사용해 4 파라미터 로지스틱 방정식을 사용한 곡선 피팅에 의해 IC50 값을 계산하였다.
도 18a~18i에 도시된 것과 같이, BA143, BA144, 및 BA145는 CD155에 대한 인간 CD96-CHO 결합을 차단하였다. 각 항체별로 평균 IC50 값을 계산하였고, 이는 표 42에 보고되어 있다. 대표적인 실험에 대한 곡선 아래 면적(AUC)을 계산하였고, 이는 표 43에 보고되어 있다.
가용성 인간 CD155에 대한 시노몰구스 CD96-CHO 세포 결합의 차단
유사한 실험에서, 야생형 시노몰구스 원숭이 CD96과 이의 리간드 인간 CD155(PVR로도 지칭됨) 간의 결합을 차단하는 항-CD96 항체의 능력을 시험하였다. 간략하게, 항체를, CHO 세포에서 과발현된 야생형 시노몰구스 원숭이 CD96(이소형 2)과 가용성 인간 CD155 간의 결합을 차단하는 이들의 능력에 대해, 인간 CD96-CHO 세포에 대해 전술한 것과 같이, 유세포 분석법에 의해 시험관 내에서 시험하였다.
인간 CD96-CHO 세포에 대한 CD155-Fc-PE 결합의 50%를 억제하는 항체 농도(IC50)를 결정하였다. GraphPad Prism 소프트웨어를 사용해 4 파라미터 로지스틱 방정식을 사용한 곡선 피팅에 의해 IC50 값을 계산하였다.
도 19a~19c에 도시된 것과 같이, 항-CD96 항체 BA145 및 BA143은 시노몰구스 원숭이 CD96과 CD155 간의 상호작용을 부분적으로 차단한다. BA145에 대한 평균 IC50 값을 계산하였고, 이는 표 44에 보고되어 있다. BA143에 대한 IC50 값은 부분 차단으로 인해 계산할 수 없었다. 대표적인 실험에 대한 곡선 아래 면적(AUC)을 계산하였고, 이는 표 45에 보고되어 있다.
8.8
실시예 8: 항-TIGIT 항체의 특성 분석
8.8.1 항-인간 TIGIT 항체는 인간 및 시노몰구스 원숭이 TIGIT를 발현하는 세포에 결합한다
다양한 세포 유형의 표면에서 야생형 인간 TIGIT 또는 야생형 시노몰구스 원숭이 TIGIT에 결합하는 항-TIGIT 항체의 능력을 유세포 분석법에 의해 시험관 내에서 시험하였다.
인간 TIGIT-발현 CHO 세포에 대한 결합
CHO 세포의 표면에서 발현된 야생형 인간 TIGIT에 결합하는 항-TIGIT 항체의 능력을 평가하였다. 간략하게, 야생형 인간 TIGIT(인간 TIGIT-CHO)를 암호화하는 벡터로 CHO 세포를 형질감염시키고, TIGIT를 안정적으로 발현하는 클론을 선택하였다. 안정한 세포주를 4 mM L-글루타민, 100 U/mL 1x HT-보충제, 및 2.5 μg/mL 퓨로마이신을 함유하는 Power CHO-2 배지에서 배양하였다.
항체 결합 검정을 위해, 인간 TIGIT-CHO 세포의 동결 분취물을 37℃에서 해동한 다음, 0.5% 소 혈청 알부민 및 0.05% 아지드화 나트륨(FACS 완충액)이 보충된 DPBS가 담긴 튜브에 옮겼다. 세포를 300g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고, FACS 완충액에 재현탁된 세포를 50 μL 중 웰 당 2Х105개의 세포 밀도로 96-웰 둥근 바닥 조직 배양 플레이트에 시딩하였다. 별도의 마이크로플레이트에서, 각 항체의 2x 농축된 중간체 모액을 제조하였다. 항체를 FACS 완충액에서 1:4로 연속 희석하였다. 60 μg/mL 내지 0.000057 μg/mL 범위의 총 11개의 희석물을 제조하였다. 그런 다음, 50 μL의 각 희석물을 인간 TIGIT-CHO 세포가 담긴 마이크로플레이트에 옮겼다. 그런 다음, 이들 세포를 4℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 항체 염색을 위해, 세포를 차가운 FACS 완충액으로 2회 세척하고, R-피코에리트린(PE) AffiniPure F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG, 특이적 Fcg 단편(Jackson, Cat # 109-116-098)을 함유하는 FACS 완충액에 1:800의 최종 농도로 재현탁하였다. 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 세포를 차가운 FACS 완충액으로 2회 세척하고, 유세포 계측법(BD LSR Fortesa 유세포 계측기)로 세포를 분석하였다. FlowJo 소프트웨어를 사용해 FSC-A 대 SSC-A, 및 SSC-H 대 SSC-A를 순차적으로 게이팅함으로써 데이터를 분석하였다. PE에 대한 평균 형광 강도(MFI) 값을 계산하고, GraphPad Prism 소프트웨어에 의해 데이터를 도표화하였다. 상기 소프트웨어를 사용해, 4-파라미터 로지스틱 방정식을 사용한 곡선 피팅에 의해 최대 결합의 50%가 되는 항체의 농도(유효 농도 50, [EC50])를 결정하였다.
도 20에 도시된 바와 같이, BA148은 인간 TIGIT-발현 CHO 세포에 투여량 의존적 방식으로 결합하였다. 각 항체별로 평균 EC50 값을 계산하였고, 이는 표 46에 보고되어 있다. 대표적인 실험에 대한 곡선 아래 면적(AUC)을 계산하였고, 이는 표 47에 보고되어 있다.
시노몰구스 원숭이 TIGIT-발현 CHO 세포에 대한 결합
유사한 실험에서, 세포 표면에서 야생형 시노몰구스 원숭이 TIGIT를 발현하도록 조작된 CHO 세포(시노몰구스 TIGIT-CHO 세포)에 결합하는 항-TIGIT 항체의 능력을 시험하였다. 간략하게, CHO 세포를, 야생형 시노몰구스 원숭이 TIGIT를 암호화하는 벡터로 형질감염시키고, 시노몰구스 원숭이 TIGIT를 안정적으로 발현하는 클론을 선택하였다. 안정한 세포주를 4 mM L-글루타민, 100 U/mL 1x HT-보충제, 및 2.5 μg/mL 퓨로마이신을 함유하는 Power CHO-2 배지에서 배양하였다. 시노몰구스 TIGIT-CHO에 결합하는 항-TIGIT 항체의 능력을 인간 TIGIT-CHO 세포에 대해 전술한 것과 같이 결정하였다.
도 21에 도시된 것과 같이, BA148은 시노몰구스 원숭이 TIGIT를 발현하는 CHO 세포에 투여량 의존적 방식으로 결합하였다. 시노몰구스 TIGIT-CHO 세포에 대한 BA148의 결합에 대한 평균 EC50 값을 각 항체별로 계산하였고, 이는 표 48에 보고되어 있다. 대표적인 실험에 대한 곡선 아래 면적(AUC)을 계산하였고, 이는 표 49에 보고되어 있다.
8.8.2 항-인간 TIGIT 항체는 TIGIT에 대한 리간드 결합을 차단한다
가용성 인간 CD155에 대한 인간 TIGIT-CHO 세포 결합의 차단
본 실시예에서, 야생형 인간 TIGIT와 이의 리간드 인간 CD155(PVR로도 지칭됨) 간의 결합을 차단하는 항-TIGIT 항체의 능력을 시험하였다. 구체적으로, 항체를, CHO 세포에서 과발현된 야생형 인간 TIGIT와 가용성 인간 CD155 간의 결합을 차단하는 이들의 능력에 대해 유세포 분석에 의해 시험관 내에서 시험하였다.
간략하게, R-피코에리트린(CD155-His-PE)에 접합된 2 μg/mL의 인간 CD155-Fc를 함유하는 용액을 FACS 완충액에서 제조하였다. 그런 다음, 인간 CD155-Fc-PE의 이러한 작업 모액 50 μL를 96-웰 둥근 바닥 마이크로플레이트의 웰에 첨가하였다. 각 항체의 4x 농축된 중간체 모액을 마이크로플레이트에서 제조하였다. 항체를 FACS 완충액에서 1:4로 연속 희석하였다. 120 μg/mL 내지 0.0001 μg/mL 범위의 총 11개의 희석물을 제조하였다. 그런 다음, 25 μL의 각 희석액을 CD155-Fc-PE가 담긴 마이크로플레이트에 옮겼다. 마지막으로, 전술한 것과 같이 제조한 25 μL의 인간 CD96-CHO 세포를 각 웰에 첨가하였다. 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 세포를 차가운 FACS 완충액으로 2회 세척하고, 유세포 계측법(BD LSR Fortesa 유세포 계측기)로 세포를 분석하였다. FSC-A 대 SSC-A 및 SSC-H 대 SSC-A 상에서 순차적으로 게이팅함으로써 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다. PE에 대한 평균 형광 강도(MFI) 값을 계산하고, GraphPad Prism 소프트웨어에 의해 데이터를 도표화하고, 전술한 것과 같이 분석하였다.
각 항체 농도별로, 항체가 없는 가운데 CD155-Fc-PE와 함께 인큐베이션한 인간 TIGIT-CHO 세포에 대해 수득한 MFI 값 및 인간 TIGIT-CHO 세포 자가형광(배경)에 대한 MFI 값을 사용해 실험 데이터를 식 5에 따라 정규화하였다.
식 5
최대 신호 (%) =
(MFI "항체" - MFI "배경") / (MFI "총" - MFI "배경")
식 중
"항체"는 BA148이고
"배경"은 세포 단독(항체 또는 CD155-Fc-PE 없음)이고
"총"은 항체의 부재 하에 CD155-Fc-PE와 함께 인큐베이션한 세포이다.
야생형 인간 TIGIT-CHO 세포에 대한 CD155-Fc-PE 결합의 50%를 억제하는 항체 농도(IC50)를 결정하였다. GraphPad Prism 소프트웨어를 사용해 4 파라미터 로지스틱 방정식을 사용한 곡선 피팅에 의해 IC50 값을 계산하였다.
도 22에 도시된 바와 같이, BA148은 CD155에 대한 야생형 인간 TIGIT 결합을 차단하였다. 각 항체에 대해 평균 IC50 값을 계산하였고, 이는 표 50에 보고되어 있다. 대표적인 실험에 대한 곡선 아래 면적(AUC)을 계산하였고, 이는 표 51에 보고되어 있다.
가용성 인간 CD155에 대한 시노몰구스 TIGIT-CHO 세포 결합의 차단
본 실시예에서, 야생형 시노몰구스 원숭이 TIGIT와 이의 리간드 인간 CD155(PVR로도 지칭됨) 간의 결합을 차단하는 항-TIGIT 항체의 능력을 시험하였다. 구체적으로, 항체를, CHO 세포에서 과발현된 야생형 시노몰구스 원숭이 TIGIT와 가용성 인간 CD155 간의 결합을 차단하는 이들의 능력에 대해 유세포 분석에 의해 시험관 내에서 시험하였다.
간략하게, R-피코에리트린(CD155-His-PE)에 접합된 2 μg/mL의 인간 CD155-Fc를 함유하는 용액을 FACS 완충액에서 제조하였다. 그런 다음, 인간 CD155-Fc-PE의 이러한 작업 모액 50 μL를 96-웰 둥근 바닥 마이크로플레이트의 웰에 첨가하였다. 각각의 다중특이적 분자의 4x 농축된 중간 모액을 마이크로플레이트에서 제조하였다. 항체를 FACS 완충액에서 1:4로 연속 희석하였다. 120 μg/mL 내지 0.0001 μg/mL 범위의 총 11개의 희석물을 제조하였다. 그런 다음, 25 μL의 각 희석액을 CD155-Fc-PE가 담긴 마이크로플레이트에 옮겼다. 마지막으로, 전술한 것과 같이 제조한 25 μL의 시노몰구스 CD96-CHO 세포를 각 웰에 첨가하였다. 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 세포를 차가운 FACS 완충액으로 2회 세척하고, 유세포 계측법(BD LSR Fortesa 유세포 계측기)로 세포를 분석하였다. FSC-A 대 SSC-A 및 SSC-H 대 SSC-A 상에서 순차적으로 게이팅함으로써 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다. PE에 대한 평균 형광 강도(MFI) 값을 계산하고, GraphPad Prism 소프트웨어에 의해 데이터를 도표화하고, 전술한 것과 같이 분석하였다.
도 23에 도시된 바와 같이, BA148은 CD155에 대한 시노몰구스 TIGIT-CHO 결합을 차단하였다. 각 항체에 대해 평균 IC50 값을 계산하였고, 이는 표 52에 보고되어 있다. 대표적인 실험에 대한 곡선 아래 면적(AUC)을 계산하였고, 이는 표 53에 보고되어 있다.
8.9
실시예 9: 항-인간 TIGIT 항체 및 항-인간 CD96 항체는 FcγRIIIa 변이체 V/V 및 F/F를 발현하는 세포에 결합한다
다양한 세포 유형의 표면에서 인간 FcγRIIIa(변이체 V/V 또는 변이체 F/F)에 결합하는 항-TIGIT 항체 및 항-CD96 항체의 능력을 유세포 분석법에 의해 시험관 내에서 시험하였다.
인간 FcγRIIIa-발현 CHO 세포에 대한 결합
CHO 세포의 표면에서 발현된 야생형 인간 FcγRIIIa에 결합하는 항-TIGIT 항체 및 항-CD96 항체의 능력을 평가하였다. 간략하게, CHO 세포를, 인간 FcγRIIIa(인간 FcγRIIIa-CHO) 변이체 V/V 또는 F/F를 암호화하는 벡터로 형질감염시키고, FcγRIIIa 변이체 V/V 또는 변이체 F/F를 안정적으로 발현하는 클론을 선택하였다. 안정한 세포주를 4 mM L-글루타민, 100 U/mL 1x HT-보충제, 및 2.5 μg/mL 퓨로마이신을 함유하는 Power CHO-2 배지에서 배양하였다.
항체 결합 검정을 위해, 인간 FcγRIIIa-CHO 세포(변이체 V/V 또는 변이체 F/F)의 동결 분취물을 37℃에서 해동한 다음, 0.5% 소 혈청 알부민 및 0.05% 아지드화 나트륨(FACS 완충액)이 보충된 DPBS가 담긴 튜브에 옮겼다. 세포를 300g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고, FACS 완충액에 재현탁된 세포를 50 μL 중 웰 당 2Х105개의 세포 밀도로 96-웰 둥근 바닥 조직 배양 플레이트에 시딩하였다. 별도의 마이크로플레이트에서, 각 항체의 2x 농축된 중간체 모액을 제조하였다. 항체를 FACS 완충액에서 1:4로 연속 희석하였다. 60 μg/mL 내지 0.000057 μg/mL 범위의 총 11개의 희석물을 제조하였다. 그런 다음, 50 μL의 각 희석물을 인간 FcγRIIIa-CHO(변이체 V/V 또는 변이체 F/F) 세포가 담긴 마이크로플레이트에 옮겼다. 그런 다음, 이들 세포를 4℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 항체 염색을 위해, 세포를 차가운 FACS 완충액으로 2회 세척하고, R-피코에리트린(PE) AffiniPure F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG, 특이적 Fcg 단편(Jackson, Cat # 109-116-098)을 함유하는 FACS 완충액에 1:800의 최종 농도로 재현탁하였다. 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 세포를 차가운 FACS 완충액으로 2회 세척하고, 유세포 계측법(BD LSR Fortesa 유세포 계측기)로 세포를 분석하였다. FlowJo 소프트웨어를 사용해 FSC-A 대 SSC-A, 및 SSC-H 대 SSC-A를 순차적으로 게이팅함으로써 데이터를 분석하였다. PE에 대한 평균 형광 강도(MFI) 값을 계산하고, GraphPad Prism 소프트웨어에 의해 데이터를 도표화하였다. 상기 소프트웨어를 사용해, 4-파라미터 로지스틱 방정식을 사용한 곡선 피팅에 의해 최대 결합의 50%가 되는 항체의 농도(유효 농도 50, [EC50])를 결정하였다.
도 24a~24d에 도시된 것과 같이, BA143, BA144, BA145, 및 BA148은 인간 FcγRIIIa-발현 CHO 세포의 변이체 V/V에 투여량 의존적 방식으로 결합하였다. 각 항체별로 평균 EC50 값을 계산하였고, 이는 표 54에 보고되어 있다. 대표적인 실험에 대한 곡선 아래 면적(AUC)을 계산하였고, 이는 표 55에 보고되어 있다.
도 25a~25e에 도시된 것과 같이, BA143, BA144, 및 BA148은 인간 FcγRIIIa-발현 CHO 세포의 변이체 F/F에 투여량 의존적 방식으로 결합하였다. 각 항체에 대한 EC50 값을 계산하였고, 이는 표 56에 보고되어 있다. 곡선 아래 면적(AUC)을 계산하였고, 이는 표 57에 보고되어 있다.
8.10
실시예 10: 일차 인간 T 세포에 대한 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자의 결합
본 실시예에서, 활성화된 인간 T 세포에 결합하는 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA127뿐만 아니라 항-CD96 단일특이적 대조군 항체 BA143, 항-TIGIT 단일특이적 항체 BA148, 또는 이중특이적 이소형 대조군 항체 BA128의 능력을 시험하였다. 활성화된 T 세포를 위해, 4명의 상이한 건강한 공여자 유래의 인간 PBMC의 동결 분취물을 액체 질소로부터 회수한 즉시 37℃의 물에서, 물에 얼음이 뜨는 것을 관찰할 때까지 해동하였다. 그런 다음, 세포를 미리 데워 둔 10 mL의 R10 배지에 옮겼다. 20 μL를 덜어내서 380 μL의 생존력 검출 염료에 첨가하고, Muse 장치를 사용해 세포를 계수하고 생존력을 확인하였다. 샘플을 1200 rpm에서 5분 동안 원심분리한 다음, R10 배지로 1Х106개 세포/mL의 최종 농도로 현탁하였다. 세포 1Х106개 당 25 ul의 immunoCult CD3/CD28 T 세포 활성화제로 세포를 자극하고, 100 μL의 자극된 세포를 96-웰 둥근 바닥 조직 배양 플레이트의 각 웰에 피펫팅하고 5% CO2에서 37℃에서 4일 동안 인큐베이션하였다.
다양한 투여량의 다중특이적 분자 또는 항체를 96-웰 둥근 바닥 플레이트에 넣었다. 먼저, 50 μg/mL의 각 항체 200 μL를 완충액에서 제조하였다. 그런 다음, 180 μL의 샘플 완충액에 20 μL의 이전 희석물을 피펫팅하여 다중특이적 분자 및 항체를 1:10으로 연속 희석하였다. 50 μg/mL 내지 0.000005 μg/mL 범위의 총 8개의 희석물을 제조하였다. 4일 후, 샘플 플레이트를 2000 rpm에서 2분 동안 원심분리하고, 상청액을 버렸다. FACs 완충액에서 제조한 FcγR 차단제를 100 μL 시험 당 5 μL씩 사용해 샘플을 10분 동안 차단하였다. 그런 다음, 샘플 플레이트를 2000 rpm에서 2분 동안 원심분리하고, 상청액은 버렸다. 그런 다음, 세포를 100 μL의 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자, 또는 도 26a~26f에 도시된 농도의 관련 이소형 대조군에 재현탁하였다. 샘플 플레이트를 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 차가운 샘플 완충액을 첨가하여 세포를 세척하고, 2000 rpm에서 2분 동안 원심분리하고, 상청액은 버렸다. 이러한 세척을 1회 반복하였다.
그런 다음, 세포를 형광 표지된 항체의 칵테일에 재현탁하였다. FACs 완충액에서, 모든 샘플에 대해 충분한 형광 표지된 항체의 칵테일을 제조하였다. 그런 다음, 웰 당 100 μL의 항체를 둥근 바닥 96-웰 플레이트에 웰에 첨가하였다. 샘플 플레이트를 얼음 상에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 차가운 샘플 완충액을 첨가하여 세포를 세척하고, 2000 rpm에서 2분 동안 원심분리하고, 상청액은 버렸다. 이러한 세척을 1회 반복하였다. 11 mL의 FACS 완충액에서 PE-표지된 이차 항-인간 IgG 항체의 최종 칵테일을 제조하였다. 100 μL의 이차 항체를 둥근 바닥 96-웰 플레이트에 웰마다 첨가하였다. 샘플 플레이트를 얼음 상에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 차가운 샘플 완충액을 첨가하여 세포를 세척하고, 2000 rpm에서 2분 동안 원심분리하고, 상청액은 버렸다. 이러한 세척을 1회 반복하였다.
BD LSR Fortesa 유세포 계측기를 사용하여 유세포 분석에 의해 항체 결합을 측정하였다. 단일 세포 선택을 위해, 전방 산란 면적(FSC-A) 대 측면 산란 면적(SSC-A)의 플롯 및 FSC-A 대 FSC-높이(FSC-H)의 또 다른 플롯을 사용해 림프구 모집단 상에서 게이팅하기 위해 미염색 대조군 세포를 사용하였다. 각각의 개별 항체로 염색된 세포의 튜브를 사용해, 실험에 사용된 다양한 색상의 보상을 계산하였다. 각 샘플에 대해 100,000개의 이벤트를 기록하였다. 샘플은 다음 모집단을 순차적으로 게이팅하여 분석하였다: FSC-A 대 SSC-A, FSC-H 대 FSC-A, SSC-A 대 LIVE/DEAD, CD4 대 CD8, 및 SSC 대 CD25. 평균 형광 강도(MFI)를 계산하였다.
도 26a~26f에 도시된 것과 같이, TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA127은 3개의 독립적인 공여자 모두에 걸쳐 활성화된 일차 인간 CD4+ T 세포(도 26a, 26b, 및 26c) 및 활성화된 일차 인간 CD8+ T 세포(도 26d, 256, 및 26f)에 대한 강력한 결합을 나타냈다. 특히, BA127은 상응하는 항-CD96 단일특이적 대조군 항체 BA143 및 항-TIGIT 단일특이적 항체 BA148과 비교하여 공여자 1 및 2 유래의 활성화된 CD4+(도 26a 및 도 26b) 및 CD8+(도 26d 및 도 26e) T 세포에 대해 월등한 최대 결합을 나타냈다. BA127은 BA143과 비교했을 때 공여자 3 유래의 활성화된 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 대해 유사한 결합을 나타냈다(도 26c 및 26f).
8.11
실시예 11: 일차 인간 T 세포에 대한 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자의 결합
이 실험에서, 활성화된 인간 T 세포에 결합하는 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA127의 능력을 시험하였다. 활성화된 T 세포를 위해, 4명의 상이한 건강한 공여자 유래의 인간 PBMC의 동결 분취물을 액체 질소로부터 회수한 즉시 37℃의 물에서, 물에 얼음이 뜨는 것을 관찰할 때까지 해동하였다. 그런 다음, 세포를 미리 데워 둔 10 mL의 R10 배지에 옮겼다. 20 μL를 덜어내서 380 μL의 생존력 검출 염료에 첨가하고, Muse 장치를 사용해 세포를 계수하고 생존력을 확인하였다. 샘플을 1200 rpm에서 5분 동안 원심분리한 다음, R10 배지로 1Х106개 세포/mL의 최종 농도로 현탁하였다. 세포 1Х106개 당 25 ul의 immunoCult CD3/CD28 T 세포 활성화제로 세포를 자극하고, 100 μL의 자극된 세포를 96-웰 둥근 바닥 조직 배양 플레이트의 각 웰에 피펫팅하고 5% CO2에서 37℃에서 4일 동안 인큐베이션하였다.
다양한 투여량의 다중특이적 분자 또는 항체(BA127 또는 이중특이적 이소형 대조군 항체 BA128)를 96-웰 둥근 바닥 플레이트에 넣었다. 먼저, 25 μg/mL의 각 항체 200 μL를 완충액 중에서 제조하였다. 그런 다음, 150 μL의 샘플 완충액에 50 μL의 이전 희석물을 피펫팅하여 다중특이적 분자 및 항체를 1:4로 연속 희석하였다. 50 μg/mL 내지 0.000005 μg/mL 범위의 총 8개의 희석물을 제조하였다. 4일 후, 샘플 플레이트를 2000 rpm에서 2분 동안 원심분리하고, 상청액을 버렸다. FACs 완충액에서 제조한 FcγR 차단제를 100 μL 시험 당 5 μL씩 사용해 샘플을 10분 동안 차단하였다. 그런 다음, 샘플 플레이트를 2000 rpm에서 2분 동안 원심분리하고, 상청액은 버렸다. 그런 다음, 세포를 100 μL의 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자(BA127), 또는 도 27a~27f에 도시된 농도의 관련 이소형 대조군(BA128)에 재현탁하였다. 샘플 플레이트를 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 차가운 샘플 완충액을 첨가하여 세포를 세척하고, 2000 rpm에서 2분 동안 원심분리하고, 상청액은 버렸다. 이러한 세척을 1회 반복하였다.
그런 다음, 세포를 형광 표지된 항체의 칵테일에 재현탁하였다. FACs 완충액에서, 모든 샘플에 대해 충분한 형광 표지된 항체의 칵테일을 제조하였다. 그런 다음, 웰 당 100 μL의 항체를 둥근 바닥 96-웰 플레이트에 웰에 첨가하였다. 샘플 플레이트를 얼음 상에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 차가운 샘플 완충액을 첨가하여 세포를 세척하고, 2000 rpm에서 2분 동안 원심분리하고, 상청액은 버렸다. 이러한 세척을 1회 반복하였다. 11 mL의 FACs 완충액에서 PE-표지된 이차 항-인간 IgG 항체의 최종 칵테일을 제조하였다. 100 μL의 이차 항체를 둥근 바닥 96-웰 플레이트에 웰마다 첨가하였다. 샘플 플레이트를 얼음 상에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 차가운 샘플 완충액을 첨가하여 세포를 세척하고, 2000 rpm에서 2분 동안 원심분리하고, 상청액은 버렸다. 이러한 세척을 1회 반복하였다.
BD LSR Fortesa 유세포 계측기를 사용하여 유세포 분석에 의해 항체 결합을 측정하였다. 단일 세포 선택을 위해, 전방 산란 면적(FSC-A) 대 측면 산란 면적(SSC-A)의 플롯 및 FSC-A 대 FSC-높이(FSC-H)의 또 다른 플롯을 사용해 림프구 모집단 상에서 게이팅하기 위해 미염색 대조군 세포를 사용하였다. 각각의 개별 항체로 염색된 세포의 튜브를 사용해, 실험에 사용된 다양한 색상의 보상을 계산하였다. 각 샘플에 대해 100,000개의 이벤트를 기록하였다. 샘플은 다음 모집단을 순차적으로 게이팅하여 분석하였다: FSC-A 대 SSC-A, FSC-H 대 FSC-A, SSC-A 대 LIVE/DEAD, CD4 대 CD8, 및 SSC 대 CD25. 평균 형광 강도(MFI)를 계산하였다.
도 27a~27f에 도시된 것과 같이, TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA127은 3개의 독립적인 공여자 유래의 활성화된 일차 인간 CD4+ T 세포(도 27a, 27b, 및 27c) 및 활성화된 일차 인간 CD8+ T 세포(도 27d, 27e, 및 27f)에 투여량 의존적 방식으로 결합하였다.
8.12
실시예 12: SEA 자극 검정
본 실시예에서, SEA로 자극된 PBMC에 의한 사이토카인 인터류킨-2(IL-2)의 분리를 촉진하는 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자의 능력을 대조군 다중특이적 분자와 비교하여 시험하였다.
다양한 투여량의 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA123, BA125, 및 BA127, 이소형 대조군 다중특이적 분자 BA128, 및 항-CD96 x 이소형 대조군 다중특이적 분자 BA129, BA130, 및 BA131 각각을 1.2 mL 불릿 튜브에 담긴 5x 농축된 중간체 모액에서 제조하였다. 먼저, 250 μg/ml 중간체 모액을 R10 배지에서 제조하고, 항체를 연속 희석에 의해 1:10으로 총 8회 희석하였다. 웰 당 20 μL의 항체를 둥근 바닥 96-웰 플레이트에 첨가하여 50 μg/mL 내지 0.000005 μg/mL 범위의 최종 농도를 만들었다.
인간 PBMC 동결 분취물을 액체 질소로부터 회수한 즉시 37℃의 물에서, 물에 얼음이 뜨는 것을 관찰할 때까지 해동하였다. 세포를 미리 데워 둔 10 mL의 R10 배지에 옮기고, 즉시 1500 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고 세포를 신선한 R10 배지에 재현탁하였다. 세포를 계수하고 생존력을 확인하기 위해, 20 μL의 샘플을 덜어내서 380 μL의 생존력 검출 염료에 첨가하고, 혼합하고, Muse 장치를 사용해 판독하였다.
세포를 중간체 농도로 재현탁하였다. 1 μg/mL의 중간체 농도를 만들기 위해, 10 μg/mL의 SEA 10 μL를 90 μL의 R10에 첨가하여 중간체 스톡 농도의 SEA를 제조하였다. 세포를 먼저 SEA 펩티드로 자극하고, 80 μL 세포와 SEA 혼합물을 상응하는 웰에 첨가하고, 가습 챔버 내에서 5% CO2 하에 37℃의 조직 배양 인큐베이터에서 4일 동안 인큐베이션하였다. 총 100,000개의 세포/웰와 최종 농도 1 ng/mL의 SEA를 사용하였다.
4일 동안 인큐베이션한 후, 인큐베이터로부터 플레이트를 꺼냈다. 그런 다음, 플레이트를 2000 rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. 5 μL의 상청액을 사이토카인 분석을 위해 384-웰 AlphaLISA 플레이트에 옮겼다. AlphaLISA 키트(Perkin Elmer)를 사용해 IL-2 분비를 측정하였다. 간략하게, 2.5 mL의 10Х AlphaLISA 면역검정 완충액을 22.5 mL의 물에 피펫팅하여 검정 완충액을 제조하였다. 인간 IL-2 분석물을 사용하여 표준 희석물을 제조하였다. 검정 완충액 중에서 1.6Х AlphaLISA 항-IL-2 수용체 비드와 비오틴화 항-IL-2 항체의 혼합물을 제조하였다. 8 μL를 각 웰에 첨가하고, 실온의 암소에서 인큐베이션하였다. AlphaLISA 플레이트를 2000 rpm으로 잠깐 원심분리하였다. 검정 완충액 중에서 2.3Х 스트렙타비딘 공여자 비드 중간체 모액을 제조하였다. 10 μL를 각 웰에 첨가하고, 실온의 암소에서 인큐베이션하였다. AlphaLISA 플레이트를 2000 rpm으로 잠깐 원심분리하였다. 상대 광 단위(RLU)는 EnVision 플레이트 판독기 상에서 AlphaScreen 프로토콜을 사용하여 측정하였다. 결과를 GraphPad Prism에서 도표화하고, 비선형 회귀를 사용하여 곡선을 피팅하였다.
도 28a~28c에 도시된 것과 같이, 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA123, BA125, 및 BA127(도 28a) 및 BA125 및 BA127(도 28b)은 인터류킨-2(IL-2) 사이토카인 분비에 의해 결정했을 때, 이소형 대조군 BA128과 비교하여 T 세포 반응성을 강력하게 향상시켰다. 또한, BA127은 다중특이적 분자 BA129, BA130, 및 BA131 또는 이소형 대조군 항체 BA128에 결합하는 CD96 단독과 비교하여 우월한 기능적 활성을 나타냈다(도 28c).
8.13
실시예 13: SEA 자극 검정
다양한 투여량의 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA127, 이소형 대조군 다중특이적 분자 BA128, 항-CD96 단일특이적 항체 대조군 BA143, 및 항-TIGIT 단일특이적 항체 대조군 BA148 각각을 1.2 mL 불릿 튜브에 담긴 5x 농축된 중간체 모액에서 제조하였다. 먼저, 250 μg/ml 중간체 모액을 R10 배지에서 제조하고, 항체를 연속 희석에 의해 1:10으로 총 8회 희석하였다. 웰 당 20 μL의 항체를 둥근 바닥 96-웰 플레이트에 첨가하여 50 μg/mL 내지 0.000005 μg/mL 범위의 최종 농도를 만들었다.
인간 PBMC 동결 분취물을 액체 질소로부터 회수한 즉시 37℃의 물에서, 물에 얼음이 뜨는 것을 관찰할 때까지 해동하였다. 세포를 미리 데워 둔 10 mL의 R10 배지에 옮기고, 즉시 1500 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고 세포를 신선한 R10 배지에 재현탁하였다. 세포를 계수하고 생존력을 확인하기 위해, 20 μL의 샘플을 덜어내서 380 μL의 생존력 검출 염료에 첨가하고, 혼합하고, Muse 장치를 사용해 판독하였다.
세포를 중간체 농도로 재현탁하였다. 1 μg/mL의 중간체 농도를 만들기 위해, 10 μg/mL의 SEA 10 μL를 90 μL의 R10에 첨가하여 중간체 스톡 농도의 SEA를 제조하였다. 세포를 먼저 SEA 펩티드로 자극하고, 80 μL 세포와 SEA 혼합물을 상응하는 웰에 첨가하고, 가습 챔버 내에서 5% CO2 하에 37℃의 조직 배양 인큐베이터에서 4일 동안 인큐베이션하였다. 총 100,000개의 세포/웰와 최종 농도 1 ng/mL의 SEA를 사용하였다.
4일 동안 인큐베이션한 후, 인큐베이터로부터 플레이트를 꺼냈다. 그런 다음, 플레이트를 2000 rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. 5 μL의 상청액을 사이토카인 분석을 위해 384-웰 AlphaLISA 플레이트에 옮겼다. AlphaLISA 키트(Perkin Elmer)를 사용해 IL-2 분비를 측정하였다. 간략하게, 2.5 mL의 10Х AlphaLISA 면역검정 완충액을 22.5 mL의 물에 피펫팅하여 검정 완충액을 제조하였다. 인간 IL-2 분석물을 사용하여 표준 희석물을 제조하였다. 검정 완충액 중에서 1.6Х AlphaLISA 항-IL-2 수용체 비드와 비오틴화 항-IL-2 항체의 혼합물을 제조하였다. 8 μL를 각 웰에 첨가하고, 실온의 암소에서 인큐베이션하였다. AlphaLISA 플레이트를 2000 rpm으로 잠깐 원심분리하였다. 검정 완충액 중에서 2.3Х 스트렙타비딘 공여자 비드 중간체 모액을 제조하였다. 10 μL를 각 웰에 첨가하고, 실온의 암소에서 인큐베이션하였다. AlphaLISA 플레이트를 2000 rpm으로 잠깐 원심분리하였다. 상대 광 단위(RLU)는 EnVision 플레이트 판독기 상에서 AlphaScreen 프로토콜을 사용하여 측정하였다. 결과를 GraphPad Prism에서 도표화하고, 비선형 회귀를 사용하여 곡선을 피팅하였다.
도 29에 도시된 것과 같이, TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA127은 인터류킨-2(IL-2) 사이토카인 분비에 의해 결정했을 때, 이소형 대조군 BA128과 비교하여 T 세포 반응성을 강력하게 향상시켰다. 또한, BA127은 단일특이적 항-TIGIT 항체 BA148 또는 단일특이적 항-CD96 항체 BA143과 비교하여 우월한 기능적 활성을 나타냈다.
8.14
실시예 14: SEA 자극 검정
다양한 투여량의 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA127 및 이소형 대조군 다중특이적 분자 BA128을 1.2 mL 불릿 튜브에 담긴 5x 농축된 중간체 모액에서 제조하였다. 공여자 1 및 2의 경우, 250 μg/ml 중간체 모액을 R10 배지에서 제조하고, 항체를 연속 희석에 의해 1:10으로 총 8회 희석하였다. 웰 당 20 μL의 항체를 둥근 바닥 96-웰 플레이트에 첨가하여 50 μg/mL 내지 0.000005 μg/mL 범위의 최종 농도를 만들었다.
공여자 3, 4, 5, 및 6의 경우, 10 μg/mL 중간체 스톡을 R10 배지에서 제조하고, 항체를 연속 희석에 의해 1 대 5로 연속 희석하였다. 10 μg/mL 내지 0.000128 μg/mL 범위의 총 8개의 희석물을 R10 배지에서 제조하였다. 20 μL의 항체를 둥근 바닥 96-웰 플레이트에 웰마다 첨가하였다.
인간 PBMC 동결 분취물을 액체 질소로부터 회수한 즉시 37℃의 물에서, 물에 얼음이 뜨는 것을 관찰할 때까지 해동하였다. 세포를 미리 데워 둔 10 mL의 R10 배지에 옮기고, 즉시 1500 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고 세포를 신선한 R10 배지에 재현탁하였다. 세포를 계수하고 생존력을 확인하기 위해, 20 μL의 샘플을 덜어내서 380 μL의 생존력 검출 염료에 첨가하고, 혼합하고, Muse 장치를 사용해 판독하였다.
세포를 중간체 농도로 재현탁하였다. 1 μg/mL의 중간체 농도를 만들기 위해, 10 μg/mL의 SEA 10 μL를 90 μL의 R10에 첨가하여 중간체 스톡 농도의 SEA를 제조하였다. 세포를 먼저 SEA 펩티드로 자극하고, 80 μL 세포와 SEA 혼합물을 상응하는 웰에 첨가하고, 가습 챔버 내에서 5% CO2 하에 37℃의 조직 배양 인큐베이터에서 4일 동안 인큐베이션하였다. 총 100,000개의 세포/웰와 최종 농도 1 ng/mL의 SEA를 사용하였다.
4일 동안 인큐베이션한 후, 인큐베이터로부터 플레이트를 꺼냈다. 그런 다음, 플레이트를 2000 rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. 5 μL의 상청액을 사이토카인 분석을 위해 384-웰 AlphaLISA 플레이트에 옮겼다. AlphaLISA 키트(Perkin Elmer)를 사용해 IL-2 분비를 측정하였다. 간략하게, 2.5 mL의 10Х AlphaLISA 면역검정 완충액을 22.5 mL의 물에 피펫팅하여 검정 완충액을 제조하였다. 인간 IL-2 분석물을 사용하여 표준 희석물을 제조하였다. 검정 완충액 중에서 1.6Х AlphaLISA 항-IL-2 수용체 비드와 비오틴화 항-IL-2 항체의 혼합물을 제조하였다. 8 μL를 각 웰에 첨가하고, 실온의 암소에서 인큐베이션하였다. AlphaLISA 플레이트를 2000 rpm으로 잠깐 원심분리하였다. 검정 완충액 중에서 2.3Х 스트렙타비딘 공여자 비드 중간체 모액을 제조하였다. 10 μL를 각 웰에 첨가하고, 실온의 암소에서 인큐베이션하였다. AlphaLISA 플레이트를 2000 rpm으로 잠깐 원심분리하였다. 상대 광 단위(RLU)는 EnVision 플레이트 판독기 상에서 AlphaScreen 프로토콜을 사용하여 측정하였다. 결과를 GraphPad Prism에서 도표화하고, 비선형 회귀를 사용하여 곡선을 피팅하였다.
도 30a~30f에 도시된 것과 같이, TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA127은 6개의 별도 공여자 유래의 SEA-자극된 PBMC에서 인터류킨-2(IL-2) 사이토카인 분비에 의해 결정했을 때, 이소형 대조군 BA128과 비교하여 T 세포 반응성을 강력하게 향상시켰다. 도 30의 각 공여자에 대한 EC10, EC50, 및 EC90 값은 표 58에 열거되어 있다.
8.15
실시예 15: TIGIT 차단 리포터 검정
본 실시예는 TIGIT/CD155 억제 신호전달을 차단하는 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자의 능력을 입증한다.
TIGIT 차단 리포터 검정은 제조사(Promega)의 프로토콜에 따라 수행하였다. 먼저, TCR 활성화 및 CD226 공자극 모두에 반응할 수 있는 고유 프로모터에 의해 유도된 루시퍼라아제 리포터를 이용해 인간 TIGIT를 발현하도록 조작된 Jurkat 작동자 T 세포를 액체 질소로부터 회수한 즉시 37℃의 물에서, 물에 얼음이 뜨는 것을 관찰할 때까지 해동하였다. 그런 다음, 세포를 원뿔형 튜브에 담긴 12 mL의 미리 데워 둔(37℃) 검정 완충액(90% RPMI 1640/10% FBS)으로 옮겼다. 세포 현탁액을 부드럽게 혼합하고, 멸균 저장조로 옮기고, 80 μL의 세포 현탁액을 96-웰 백색 평평한 바닥 검정 플레이트의 60개의 내부 웰에 옮겼다. 120 μl의 미리 데워둔(37℃) 검정 완충액을 검정 플레이트의 외부 웰 각각에 첨가하였다. 그런 다음, 세포를 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 16~20시간 동안 인큐베이션하였다.
다양한 투여량의 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA125 및 BA127, 이소형 대조군 다중특이적 분자 BA128, 항-TIGIT x 이소형 대조군 다중특이적 분자 BA133, 항-CD96 단일특이적 항체 대조군 BA143, 항-CD96 x 이소형 대조군 다중특이적 분자 BA131, 단일특이적 이소형 대조군 BA146, 항-TIGIT 기준 항체 1, 항-TIGIT 기준 항체 2, 및 항-TIGIT 기준 항체 3을 1.2 mL 불릿 튜브에 담긴 6x 농축된 중간체 모액에서 제조하였다. 먼저, 50 μg/mL 중간체 스톡을 검정 완충액에서 제조한 다음, 항체를 연속 희석에 의해 1 대 2.5로 연속 희석하였다. 검정 완충액에서 50 μg/mL 내지 0.0131 μg/mL 범위(도 31a 및 31b) 또는 40 μg/mL 내지 0.0262μg/mL 범위(도 31c)의 총 10개의 희석물을 제조하였다. 웰 당 20 μL의 항체를 미리 도말된 TIGIT 작동자 세포에 첨가하였다.
항원 비의존적 방식으로 TCR 복합체를 활성화시키도록 설계된, 조작된 세포 표면 단백질을 이용해 인간 CD155를 발현하도록 조작된 CHO-K1 세포(CD155 aAPC/CHO-K1 세포)를 액체 질소로부터 회수한 즉시 37℃의 물에서, 물에 얼음이 뜨는 것을 관찰할 때까지 해동하였다. 그런 다음, 세포를 3 mL의 검정 완충액이 담긴 15 mL 원뿔형 튜브로 옮겼다. 세포 현탁액을 부드럽게 혼합하고 멸균 저장조에 옮기고, 20 μL의 세포 현탁액을 미리 도말된 TIGIT 작동자 세포 및 항체 혼합물로 옮겼다. 최종 검정 부피는 120 μL였다.
그런 다음, 세포를 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 검정 플레이트를 인큐베이터로부터 꺼내고 주변 온도로 10분 동안 평형화시켰다. 그런 다음, 120 μL의 Bio-Glo?? 시약을 미리 도말한 세포 및 다중특이적 분자 또는 항체 혼합물에 첨가하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 상대 광 단위(RLU)는 발광 EnVision 플레이트 판독기를 사용해 측정하였다. 결과를 GraphPad Prism에서 도표화하고, 비선형 회귀를 사용하여 곡선을 피팅하였다.
도 31a, 31b, 및 31c에 도시된 것과 같이, 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA125 및 BA127은, TIGIT-CD155 리간드를 차단한 결과로서, T 세포 수용체(TCR) 활성화 및 CD226 공자극 경로 활성화에 대한 대리물질인 루시페라아제 유전자 발현을 투여량 의존적 방식으로 강력하게 향상시켰다. 예상대로, 항-TIGIT x 이소형 대조군 다중특이적 분자 BA133 또한 루시페라아제 유전자 발현을 향상시켰지만, 항-CD96 단일특이적 항체 대조군 BA143은 그렇지 않았다. 기준 항-TIGIT x 이소형 대조군 다중특이적 분자와 비교하여, BA125 및 BA127은 리포터 활성을 향상시키는 유사한 능력을 입증하였다.
8.16
실시예 16: 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자는 T 세포 자극 검정에서 IL-2 분비를 유도한다
본 실시예에서, 준최적 농도의 SEA 초항원으로 자극한 일차 건강한 공여자 인간 PBMC에서 IL-2 사이토카인 분비를 유도하는 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA127의 능력을 평가하였다.
다양한 투여량의 BA127, 기준 항-TIGIT 단클론 기준 항체 1, 또는 이소형 대조군 다중특이적 분자 BA128을 1.2 mL 불릿 튜브에 담긴 5x 농축된 중간체 모액에서 제조하였다. 먼저, 50 μg/mL 중간체 모액을 R10 배지에서 제조하고, 항체를 연속 희석에 의해 1:5로 총 8회 희석하였다. 웰 당 20 μL의 항체를 둥근 바닥 96-웰 플레이트에 첨가하여 10 μg/mL 내지 0.000128 μg/mL 범위의 최종 농도를 만들었다.
인간 PBMC 동결 분취물을 액체 질소로부터 회수한 즉시 37℃의 물에서, 물에 얼음이 뜨는 것을 관찰할 때까지 해동하였다. 세포를 미리 데워 둔 10 mL의 R10 배지에 옮기고, 즉시 1500 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 버리고 세포를 신선한 R10 배지에 재현탁하였다. 세포를 계수하고 생존력을 확인하기 위해, 20 μL의 샘플을 덜어내서 380 μL의 생존력 검출 염료에 첨가하고, 혼합하고, Muse 장치를 사용해 판독하였다.
세포를 중간체 농도로 재현탁하였다. 1 μg/mL의 중간체 농도를 만들기 위해, 10 μg/mL의 SEA 10 μL를 90 μL의 R10에 첨가하여 중간체 스톡 농도의 SEA를 제조하였다. 세포를 먼저 SEA 펩티드로 자극하고, 80 μL 세포와 SEA 혼합물을 상응하는 웰에 첨가하고, 가습 챔버 내에서 5% CO2 하에 37℃의 조직 배양 인큐베이터에서 4일 동안 인큐베이션하였다. 총 100,000개의 세포/웰와 최종 농도 1 ng/mL의 SEA를 사용하였다.
4일 동안 인큐베이션한 후, 인큐베이터로부터 플레이트를 꺼냈다. 그런 다음, 플레이트를 2000 rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. 5 μL의 상청액을 사이토카인 분석을 위해 384-웰 AlphaLISA 플레이트에 옮겼다. AlphaLISA 키트(Perkin Elmer)를 사용해 IL-2 분비를 측정하였다. 간략하게, 2.5 mL의 10Х AlphaLISA 면역검정 완충액을 22.5 mL의 물에 피펫팅하여 검정 완충액을 제조하였다. 인간 IL-2 분석물을 사용하여 표준 희석물을 제조하였다. 검정 완충액 중에서 1.6Х AlphaLISA 항-IL-2 수용체 비드와 비오틴화 항-IL-2 항체의 혼합물을 제조하였다. 8 μL를 각 웰에 첨가하고, 실온의 암소에서 인큐베이션하였다. AlphaLISA 플레이트를 2000 rpm으로 잠깐 원심분리하였다. 검정 완충액 중에서 2.3Х 스트렙타비딘 공여자 비드 중간체 모액을 제조하였다. 10 μL를 각 웰에 첨가하고, 실온의 암소에서 인큐베이션하였다. AlphaLISA 플레이트를 2000 rpm으로 잠깐 원심분리하였다. 상대 광 단위(RLU)는 EnVision 플레이트 판독기 상에서 AlphaScreen 프로토콜을 사용하여 측정하였다. 결과를 GraphPad Prism에서 도표화하고, 비선형 회귀를 사용하여 곡선을 피팅하였다.
도 32a 및 도 32b에 도시된 것과 같이, 2개의 공여자에서, 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자 BA127은 다양한 투여량 범위에 걸쳐 기준 항-TIGIT 항체 및 이소형 대조군 항체와 비교했을 때 더 높은 수준의 IL-2 사이토카인 분비를 유도하였다.
8.17
실시예 17: 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자는 전임상 마우스 종양 모델에서 종양 성장을 억제하였다
본 실시예는, 마우스 모델에서 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자를 이용한 차단이 상응하는 단일특이적 항체 및 단일특이적 항체의 조합과 비교하여 우월한 종양 조절을 촉진한다는 것을 입증하였다.
마우스 대리물질인 항-TIGIT 및 항-CD96 단일특이적 항체 및 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자를 마우스 결장 암종 모델에서 시험하였다. 구체적으로, 6~8주령의 Balb/c 마우스(Jackson Labs #000651)를 먼저 2주 동안 순화시키고, 털을 깍은 뒤 태그를 부착하였다. CT26 마우스 결장 암종 세포(ATCC® CRL-2638??)를 10% 열 불활성화 FBS 및 노르모신이 보충된 RPMI 배지에 담긴 조직 배양물에서 1주일 동안 증식시켰다. 100의 PBS에 현탁된 1 x 105개의 CT26 세포를 마우스에게 피하 주사하였다. 이식된 종양 세포가 자리를 잡아 약 50 mm3의 크기에 도달할 때 까지 9~10일 동안 방치하였다. 그런 다음, 마우스를 무작위 배정하고 200 μg의 항-TIGIT mIgG2a 대리 항체(클론: 10A7), 항-CD96 mIgG2a 대리 항체(클론: 6A6), 항-TIGIT 및 항-CD96 대리 mAb의 조합, 항-TIGITxCD96 mIgG2a 대리 다중특이적 분자, 항-TIGITxCD96 mIgG2a.N297A 대리 다중특이적 분자, 이소형 대조군 단일특이적 항체(mIgG2a), 또는 이소형 대조군 다중특이적 분자(mIgG2a)를 주 2회 복강내 투여하여 2주 동안 치료하였다. 종양 부피를 캘리퍼에 의해 2주마다 측정하였고, 0.5 x 길이 x 폭2으로서 계산하였다.
도 33a~33e에 도시된 것과 같이, 항-TIGITxCD96 대리 다중특이적 분자 mIgG2a는 15마리의 마우스 중 13마리에서 완전 반응을 유도하였다. 대조적으로, 항-TIGITxCD96 대리 다중특이적 mIgG2a-N297A는 종양 성장을 조절하는 데 아무런 영향을 미치지 않았다. 항-TIGITxCD96 mIgG2a 다중특이적 분자는 항-TIGIT mAb 또는 항-CD96 mAb 또는 항-TIGIT와 항-CD96 mAb의 조합을 사용한 단일 제제 요법에 비해 우월한 종양 조절을 나타냈다. 이러한 결과는 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자가 FcγR 공동 결합에 의존하여 면역 작동자 기능을 향상시키고, 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자가 단일특이적 항체 또는 단일특이적 항체의 조합보다 기능적으로 우월하다는 시험관내 관찰을 입증하였다.
8.18
실시예 18: FcγR 공동 결합은 항종양 면역에 중요하다
본 실시예는 전임상 마우스 종양 모델에서 종양 성장을 억제하는 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자의 능력을 입증하였다.
마우스 대리물질인 항-TIGIT 및 항-CD96 단일특이적 항체 및 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자를 마우스 결장 암종 모델에서 시험하였다. 구체적으로, 6~8주령의 Balb/c 마우스(Jackson Labs #000651)를 먼저 2주 동안 순화시키고, 털을 깍은 뒤 태그를 부착하였다. CT26 마우스 결장 암종 세포(ATCC® CRL-2638??)를 10% 열 불활성화 FBS 및 노르모신이 보충된 RPMI 배지에 담긴 조직 배양물에서 1주일 동안 증식시켰다. 100의 PBS에 현탁된 1 x 105개의 CT26 세포를 마우스에게 피하 주사하였다. 이식된 종양 세포가 자리를 잡아 약 50 mm3의 크기에 도달할 때 까지 9~10일 동안 방치하였다. 그런 다음, 마우스를 무작위 배정하고 200 μg의 항-TIGIT mIgG2a 대리 항체(클론: 10A7), 항-CD96 mIgG2a 대리 항체(클론: 6A6), 항-TIGIT 및 항-CD96 대리 단일특이적 항체의 조합, 항-TIGITxCD96 mIgG2a 대리 항체, 항-TIGITxCD96 이중특이적 mIgG2a.N297A 대리 다중특이적 분자, 이소형 대조군 항체(mIgG2a), 또는 이소형 대조군 다중특이적 분자(mIgG2a)를 주 2회 복강내 투여하여 2주 동안 치료하였다. 종양 부피를 캘리퍼에 의해 2주마다 측정하였고, 0.5 x 길이 x 폭2으로서 계산하였다.
도 34a~34e에 도시된 것과 같이, 항-TIGITxCD96 대리 다중특이적 분자 mIgG2a는 15마리의 마우스 중 13마리에서 완전 반응을 유도하였다. 대조적으로, 항-TIGITxCD96 대리 다중특이적 분자 mIgG2a-N297A는 종양 성장을 조절하는 데 아무런 영향을 미치지 않았다. 항-TIGITxCD96 mIgG2a 다중특이적 분자는 항-TIGIT 단일특이적 항체 또는 항-CD96 단일특이적 항체 또는 항-TIGIT와 항-CD96 단일특잊거 항체의 조합을 사용한 단일 제제 요법에 비해 우월한 종양 조절을 나타냈다. 이러한 결과는 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자가 FcγR 공동 결합에 의존하여 면역 작동자 기능을 향상시키고, 항-TIGITxCD96 다중특이적 분자가 mAb 또는 mAb의 조합보다 기능적으로 우월하다는 시험관내 관찰을 입증하였다.
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본 발명은 본원에 기술된 특정 구현예에 의해 그 범위가 한정되지 않는다. 실제로, 기술된 것 외에도 본 발명의 다양한 변형이 가능함은 전술한 설명과 첨부된 도면으로부터 당업자에게 자명해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범주 내에 속한다.
본원에 인용된 모든 참조 문헌(예컨대, 공보 또는 특허 또는 특허 출원)은 마치 각각의 개별 참조 문헌(예컨대, 공보 또는 특허 또는 특허 출원)이 개별적으로 그 전체가 모든 목적을 위해 본원에 참조로 통합된 것과 동일한 정도로 그 전체가 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 통합된다.
다른 구현예들은 다음 청구 범위에 포함된다.
<110> Agenus Inc.
<120> ANTI-TIGIT ANTIBODIES, ANTI-CD96 ANTIBODIES, AND METHODS OF USE
THEREOF
<130> 404298-AGBW-146WO (190448)
<150> US 63/201,537
<151> 2021-05-04
<160> 114
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 448
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Ala Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ala Gly Val Leu Gly Gly Met Asp Val Trp Gly Arg Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
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355 360 365
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420 425 430
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<211> 213
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 2
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Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
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Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
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Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser
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Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
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Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
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Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
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Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 73
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50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Ile Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Arg Arg Gly Gly Val Gly Asp Ala Phe Asp Ile Trp
100 105 110
Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly
450
<210> 108
<211> 451
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 108
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Thr Pro Phe Phe Asn Arg Val Asp Val Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Ile Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Arg Arg Gly Gly Val Gly Asp Ala Phe Asp Ile Trp
100 105 110
Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly
450
<210> 109
<211> 451
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 109
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Thr Pro Phe Phe Asn Arg Val Asp Val Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Ile Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Arg Arg Gly Gly Val Gly Asp Ala Phe Asp Ile Trp
100 105 110
Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly
450
<210> 110
<211> 451
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 110
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Thr Pro Phe Phe Asn Arg Val Asp Val Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Ile Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Arg Arg Gly Gly Val Gly Asp Ala Phe Asp Ile Trp
100 105 110
Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro
325 330 335
Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly
450
<210> 111
<211> 514
<212> PRT
<213> Macaca fascicularis
<400> 111
Val Trp Gly Lys Pro Phe Asn Thr Glu Glu Asn Ile Tyr Ala Thr Leu
1 5 10 15
Gly Ser Asp Val Asn Leu Thr Cys Gln Thr Gln Ala Lys Gly Phe Leu
20 25 30
Val Gln Met Gln Trp Ser Lys Val Thr Asp Lys Ala Asp Leu Ile Ala
35 40 45
Leu Tyr His Pro Gln Tyr Gly Phe His Cys Ala Tyr Gly Ser Pro Cys
50 55 60
Glu Ser Leu Val Thr Phe Thr Gln Thr Pro Glu Asn Gly Ser Lys Trp
65 70 75 80
Thr Leu His Leu Arg Asn Met Ser Ser Ser Val Ser Gly Arg Tyr Glu
85 90 95
Cys Met Leu Thr Leu Tyr Pro Glu Gly Met Gln Thr Lys Ile Tyr Asn
100 105 110
Leu Leu Ile Gln Thr His Val Thr Pro Asp Glu Trp Lys Ser Asn His
115 120 125
Thr Ile Glu Ile Glu Ile Asn Gln Thr Leu Glu Ile Pro Cys Phe Gln
130 135 140
Asn Ser Ser Ser Glu Ile Ser Ser Glu Phe Thr Tyr Ala Trp Leu Val
145 150 155 160
Glu Asp Asn Gly Thr Gln Gln Thr Leu Ile Ser Gln Asp His Leu Ile
165 170 175
Ser Ser Ser Thr Leu Leu Lys Asp Arg Val Lys Val Gly Ile Asp Tyr
180 185 190
Arg Leu His Leu Ser Pro Val Gln Ile Phe Asp Asp Gly Arg Lys Phe
195 200 205
Ser Cys His Ile Arg Val Gly Pro Asp Lys Ile Leu Arg Ser Ser Thr
210 215 220
Thr Ile Lys Val Phe Ala Lys Pro Glu Ile Pro Met Ile Val Glu Asn
225 230 235 240
Asn Ser Thr Asp Val Leu Val Glu Arg Thr Phe Thr Cys Leu Leu Lys
245 250 255
Asn Val Phe Pro Lys Ala Asn Ile Ile Trp Phe Ile Asp Gly Ser Phe
260 265 270
Leu His Asp Glu Lys Glu Gly Ile Tyr Ile Thr Asn Glu Glu Arg Lys
275 280 285
Gly Lys Asp Gly Phe Leu Glu Leu Lys Ser Val Leu Thr Arg Val His
290 295 300
Ser Asp Lys Pro Ala Gln Ser Asp Asn Leu Thr Ile Trp Cys Met Ala
305 310 315 320
Leu Ser Pro Val Pro Gly Asn Lys Val Trp Asn Ile Ser Ser Glu Lys
325 330 335
Ile Thr Phe Leu Leu Gly Ser Glu Met Ser Thr Thr Asp Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Val Thr Glu Ser Thr Leu Asp Thr Gln Pro Ser Pro Ala Ser Ser
355 360 365
Val Ser Pro Thr Arg Tyr Pro Ala Thr Ser Ser Val Thr Leu Ala Asp
370 375 380
Val Ser Ala Leu Arg Pro Asn Thr Thr Pro Gln Ser Ser Ser Ser Ser
385 390 395 400
Val Thr Thr Gln Asp Phe Asn Tyr Pro Trp Thr Ser Ser Gly Thr Asp
405 410 415
Ala Lys Lys Ser Phe Ser Gln Ile Pro Ser Glu Thr Tyr Ser Ser Ser
420 425 430
Pro Ser Gly Ala Gly Ser Thr Leu His Asp Asn Val Phe Thr Ser Thr
435 440 445
Thr Arg Ala Leu Ser Glu Val Pro Thr Thr Ala Asn Gly Ser Thr Lys
450 455 460
Thr Asn His Val His Ile Thr Gly Ile Val Val Ser Lys Pro Lys Asp
465 470 475 480
Gly Met Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Leu Glu His His His His His
485 490 495
His His His His His Gly Gly Ser Gly Gly Leu Pro Glu Thr Gly Gly
500 505 510
Asp Arg
<210> 112
<211> 119
<212> PRT
<213> Macaca fascicularis
<400> 112
Val Trp Gly Lys Pro Phe Asn Thr Glu Glu Asn Ile Tyr Ala Thr Leu
1 5 10 15
Gly Ser Asp Val Asn Leu Thr Cys Gln Thr Gln Ala Lys Gly Phe Leu
20 25 30
Val Gln Met Gln Trp Ser Lys Val Thr Asp Lys Ala Asp Leu Ile Ala
35 40 45
Leu Tyr His Pro Gln Tyr Gly Phe His Cys Ala Tyr Gly Ser Pro Cys
50 55 60
Glu Ser Leu Val Thr Phe Thr Gln Thr Pro Glu Asn Gly Ser Lys Trp
65 70 75 80
Thr Leu His Leu Arg Asn Met Ser Ser Ser Val Ser Gly Arg Tyr Glu
85 90 95
Cys Met Leu Thr Leu Tyr Pro Glu Gly Met Gln Thr Lys Ile Tyr Asn
100 105 110
Leu Leu Ile Gln Thr His Val
115
<210> 113
<211> 150
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 113
Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys
1 5 10 15
Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln
20 25 30
Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys
35 40 45
Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val
50 55 60
Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn
65 70 75 80
Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr
85 90 95
Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu
100 105 110
His Gly Ala Arg Phe Gln Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Leu Glu His
115 120 125
His His His His His His His His His Gly Gly Ser Gly Gly Leu Pro
130 135 140
Glu Thr Gly Gly Asp Arg
145 150
<210> 114
<211> 151
<212> PRT
<213> Macaca fascicularis
<400> 114
Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Lys Lys
1 5 10 15
Gly Gly Ser Val Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Met Ala Gln
20 25 30
Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln His Asp His Ser Leu Leu Ala Ile
35 40 45
Arg Asn Ala Glu Leu Gly Trp His Ile Tyr Pro Ala Phe Lys Asp Arg
50 55 60
Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Met
65 70 75 80
Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Thr Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly
85 90 95
Thr Tyr Arg Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala
100 105 110
Glu His Ser Ala Arg Phe Gln Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Leu Glu
115 120 125
His His His His His His His His His His Gly Gly Ser Gly Gly Leu
130 135 140
Pro Glu Thr Gly Gly Asp Arg
145 150
Claims (144)
- 다음을 포함하는 다중특이적 분자:
(a) 인간 CD96에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역으로서, CDR(CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3)을 포함하는 제1 VH 및 CDR(CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3)을 포함하는 제1 VL을 포함하되,
(i) 제1 VH는 서열번호 34의 VH 아미노산 서열의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하고; 제1 VL은 서열번호 35의 VL 아미노산 서열의 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하거나,
(ii) 제1 VH는 서열번호 36의 VH 아미노산 서열의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하고; 제1 VL은 서열번호 37의 VL 아미노산 서열의 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하거나,
(iii) 제1 VH는 서열번호 38의 VH 아미노산 서열의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하고; 제1 VL은 서열번호 39의 VL 아미노산 서열의 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는, 제1 항원 결합 영역; 및
(b) 인간 CD96 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역으로서, CDR(CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3)을 포함하는 제2 VH 및 CDR(CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3)을 포함하는 제2 VL을 포함하는, 제2 항원 결합 영역. - 제1항에 있어서, 제1 항원 결합 영역의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 서열번호 10, 11, 12, 13, 14, 및 15의 아미노산 서열; 16, 17, 18, 19, 20, 및 21의 아미노산 서열; 또는 22, 23, 24, 25, 26, 및 27의 아미노산 서열을 각각 포함하는, 다중특이적 분자.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 제2 항원 결합 영역은 인간 TIGIT에 특이적으로 결합하는, 다중특이적 분자.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 VH는 서열번호 40의 VH 아미노산 서열의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하고; 제2 VL은 서열번호 41의 VL 아미노산 서열의 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는, 다중특이적 분자.
- 제4항에 있어서, 제2 항원 결합 영역의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 서열번호 28, 29, 30, 31, 32, 및 33의 아미노산 서열을 각각 포함하는, 다중특이적 분자.
- 다음을 포함하는 다중특이적 분자:
(a) 인간 TIGIT 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역으로서, CDR(CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3)을 포함하는 제1 VH 및 CDR(CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3)을 포함하는 제1 VL을 포함하는, 제1 항원 결합 영역; 및
(b) 인간 TIGIT에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역으로서, 서열번호 40의 VH 아미노산 서열의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는 제2 VH; 및 서열번호 41의 VL 아미노산 서열의 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는 제2 VL을 포함하는, 제2 항원 결합 영역. - 제6항에 있어서, 제2 항원 결합 영역의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3은 서열번호 28, 29, 30, 31, 32, 및 33의 아미노산 서열을 각각 포함하는, 다중특이적 분자.
- 제6항 또는 제7항에 있어서, 제1 항원 결합 영역은 인간 CD96에 특이적으로 결합하는, 다중특이적 분자.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 VH는 서열번호 34, 36, 또는 38의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 다중특이적 분자.
- 제9항에 있어서, 제1 VH의 아미노산 서열은 서열번호 34, 36, 또는 38의 아미노산 서열로 이루어지는, 다중특이적 분자.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 VL은 서열번호 35, 37, 또는 39의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 다중특이적 분자.
- 제11항에 있어서, 제1 VL의 아미노산 서열은 서열번호 35, 37, 또는 39의 아미노산 서열로 이루어지는, 다중특이적 분자.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 VH는 서열번호 40의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 다중특이적 분자.
- 제13항에 있어서, 제2 VH의 아미노산 서열은 서열번호 40의 아미노산 서열로 이루어지는, 다중특이적 분자.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 VL은 서열번호 41의 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 다중특이적 분자.
- 제15항에 있어서, 제2 VL의 아미노산 서열은 서열번호 41의 아미노산 서열로 이루어지는, 다중특이적 분자.
- 다음을 포함하는 다중특이적 분자:
(a) 인간 CD96에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역으로서, 서열번호 34, 36, 또는 38의 아미노산 서열을 포함하는 제1 VH; 및/또는 서열번호 35, 37, 또는 39의 아미노산 서열을 포함하는 제1 VL을 포함하는, 제1 항원 결합 영역; 및
(b) 인간 CD96 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역으로서, 제2 VH 및 제2 VL을 포함하는, 제2 항원 결합 영역. - 제17항에 있어서, 제2 항원 결합 영역은 인간 TIGIT에 특이적으로 결합하는, 단리된 다중특이적 분자.
- 다음을 포함하는 다중특이적 분자:
(a) 인간 TIGIT 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역으로서, 제1 VH 및 제1 VL을 포함하는, 제1 항원 결합 영역; 및
(b) 인간 TIGIT에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역으로서, 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 제2 VH; 및/또는 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 제2 VL을 포함하는, 제2 항원 결합 영역. - 제19항에 있어서, 제1 항원 결합 영역은 인간 CD96에 특이적으로 결합하는, 단리된 다중특이적 분자.
- 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 VH는 서열번호 34, 36, 또는 38의 아미노산 서열을 포함하고, 제1 VL은 서열번호 35, 37, 또는 39의 아미노산 서열을 포함하는, 다중특이적 분자.
- 제21항에 있어서, 제1 VH의 아미노산 서열은 서열번호 34, 36, 또는 38의 아미노산 서열로 이루어지고, 제1 VL의 아미노산 서열은 서열번호 35, 37, 또는 39의 아미노산 서열로 이루어지는, 다중특이적 분자.
- 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 VH 및 제1 VL은 서열번호 34 및 35; 36 및 37; 또는 38 및 39의 아미노산 서열을 각각 포함하는, 다중특이적 분자.
- 제23항에 있어서, 제1 VH 및 제1 VL의 아미노산 서열은 서열번호 34 및 35; 36 및 37; 또는 38 및 39의 아미노산 서열로 각각 이루어지는, 다중특이적 분자.
- 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 VH는 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 VL은 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는, 다중특이적 분자.
- 제25항에 있어서, 제2 VH 및 제2 VL의 아미노산 서열은 서열번호 40 및 41의 아미노산 서열로 각각 이루어지는, 다중특이적 분자.
- 제17항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 VH 및 제1 VL은 서열번호 34 및 35; 36 및 37; 또는 38 및 39의 아미노산 서열을 각각 포함하고; 제2 VH 및 제2 VL은 서열번호 40 및 41의 아미노산 서열을 각각 포함하는, 다중특이적 분자.
- 제27항에 있어서, 제1 VH 및 제1 VL의 아미노산 서열은 서열번호 34 및 35; 36 및 37; 또는 38 및 39의 아미노산 서열로 각각 구성되고; 제2 VH 및 제2 VL의 아미노산 서열은 서열번호 40 및 41의 아미노산 서열로 각각 구성되는, 다중특이적 분자.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 항원 결합 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 불변 영역을 포함하는, 다중특이적 분자.
- 제29항에 있어서, 중쇄 불변 영역은 IgG1 중쇄 불변 영역인, 다중특이적 분자.
- 제30항에 있어서, 중쇄 불변 영역은 서열번호 49~60 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 다중특이적 분자.
- 제30항에 있어서, IgG1 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 N297A 돌연변이를 포함하는, 다중특이적 분자.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 항원 결합 영역은 야생형 중쇄 불변 영역의 변이체인 중쇄 불변 영역을 포함하고, 변이체 중쇄 불변 영역은 야생형 중쇄 불변 영역이 FcγR에 결합하는 것보다 더 높은 친화도로 FcγR에 결합하는, 다중특이적 분자.
- 제33항에 있어서, FcγR은 FcγRIIB 또는 FcγRIIIA인, 다중특이적 분자.
- 제30항에 있어서, IgG1 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 S267E 및 L328F 돌연변이를 포함하는, 다중특이적 분자.
- 제30항에 있어서, IgG1 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 S239D, A330L, 및 I332E로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 다중특이적 분자.
- 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 제1 항원 결합 영역은 제1 중쇄 불변 영역을 포함하되, 제1 중쇄 불변 영역은 아미노산 위치 239에서 아스파르테이트를 포함하거나; 아미노산 위치 239 및 332에서 아스파르테이트 및 글루타메이트를 각각 포함하거나; 아미노산 위치 239, 330, 및 332에서 아스파르테이트, 류신, 및 글루타메이트를 각각 포함하고;
(b) 제2 항원 결합 영역은 제2 중쇄 불변 영역을 포함하되, 제2 중쇄 불변 영역은 아미노산 위치 239, 330, 및 332에서 아스파르테이트, 류신, 및 글루타메이트를 각각 포함하지 않고,
아미노산 위치는 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는, 다중특이적 분자. - 제37항에 있어서, 제1 중쇄 불변 영역 및 제2 중쇄 불변 영역은 서열번호 58 및 57; 59 및 57; 또는 60 및 57을 각각 포함하는, 다중특이적 분자.
- 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 제1 항원 결합 영역은 제1 중쇄 불변 영역을 포함하되, 제1 중쇄 불변 영역은 아미노산 위치 239 및 332에서 아스파르테이트 및 글루타메이트를 포함하거나; 아미노산 위치 239, 330, 및 332에서 아스파르테이트, 류신, 및 글루타메이트를 각각 포함하고;
(b) 제2 항원 결합 영역은 아미노산 위치 239에서 아스파르테이트를 포함하는 제2 중쇄 불변 영역을 포함하고,
아미노산 위치는 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는, 다중특이적 분자. - 제39항에 있어서, 제1 중쇄 불변 영역 및 제2 중쇄 불변 영역은 서열번호 59 및 58; 또는 60 및 58을 각각 포함하는, 다중특이적 분자.
- 제39항에 있어서,
(a) 제1 중쇄 불변 영역은 아미노산 위치 239, 330, 및 332에서 아스파르테이트, 류신, 및 글루타메이트를 각각 포함하고;
(b) 제2 중쇄 불변 영역은 아미노산 위치 332에서 글루타메이트를 추가로 포함하고,
아미노산 위치는 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는, 다중특이적 분자. - 제41항에 있어서, 제1 중쇄 불변 영역 및 제2 중쇄 불변 영역은 서열번호 60 및 59를 각각 포함하는, 다중특이적 분자.
- 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 제1 항원 결합 영역은 제1 중쇄 불변 영역을 포함하되, 제1 중쇄 불변 영역은 아미노산 위치 239, 330, 및 332에서 아스파르테이트, 류신, 및 글루타메이트를 각각 포함하지 않고;
(b) 제2 항원 결합 영역은 제2 중쇄 불변 영역을 포함하되, 제2 중쇄 불변 영역은 아미노산 위치 239에서 아스파르테이트를 포함하고 아미노산 위치 239 및 332에서 아스파르테이트 및 글루타메이트를 각각 포함하거나; 아미노산 위치 239, 330, 및 332에서 아스파르테이트, 류신, 및 글루타메이트를 각각 포함하고,
아미노산 위치는 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는, 다중특이적 분자. - 제43항에 있어서, 제1 중쇄 불변 영역 및 제2 중쇄 불변 영역은 서열번호 57 및 60; 57 및 59; 또는 57 및 58을 각각 포함하는, 다중특이적 분자.
- 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 제1 항원 결합 영역은 아미노산 위치 239에서 아스파르테이트를 포함하는 제1 중쇄 불변 영역을 포함하고;
(b) 제2 항원 결합 영역은 제2 중쇄 불변 영역을 포함하되, 제2 중쇄 불변 영역은 아미노산 위치 239 및 332에서 아스파르테이트 및 글루타메이트를 각각 포함하거나; 아미노산 위치 239, 330, 및 332에서 아스파르테이트, 류신, 및 글루타메이트를 각각 포함하고,
아미노산 위치는 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는, 다중특이적 분자. - 제45항에 있어서, 제1 중쇄 불변 영역 및 제2 중쇄 불변 영역은 서열번호 58 및 60; 또는 58 및 59를 각각 포함하는, 다중특이적 분자.
- 제45항에 있어서,
(a) 제1 중쇄 불변 영역은 아미노산 위치 332에서 글루타메이트를 추가로 포함하고;
(b) 제2 중쇄 불변 영역은 아미노산 위치 239, 330, 및 332에서 아스파르테이트, 류신, 및 글루타메이트를 각각 포함하고;
아미노산 위치는 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는, 다중특이적 분자. - 제47항에 있어서, 제1 중쇄 불변 영역 및 제2 중쇄 불변 영역은 서열번호 59 및 60을 각각 포함하는, 다중특이적 분자.
- 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 제1 항원 결합 영역은 아미노산 위치 366에서 트립토판을 포함하는 제1 중쇄 불변 영역을 포함하고;
(b) 제2 항원 결합 영역은 아미노산 위치 366, 368, 및 407에서 세린, 알라닌, 및 발린을 각각 포함하는 제2 중쇄 불변 영역을 포함하고,
아미노산 위치는 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는, 다중특이적 분자. - 제49항에 있어서, 제1 중쇄 불변 영역은 서열번호 53, 54, 55, 또는 56을 포함하고; 제2 중쇄 불변 영역은 서열번호 49, 50, 51, 또는 52를 포함하는, 다중특이적 분자.
- 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 제1 항원 결합 영역은 제1 중쇄 불변 영역을 포함하되, 제1 중쇄 불변 영역은 아미노산 위치 366, 368, 및 407에서 세린, 알라닌, 및 발린을 각각 포함하고;
(b) 제2 항원 결합 영역은 아미노산 위치 366에서 트립토판을 포함하는 제2 중쇄 불변 영역을 포함하고,
아미노산 위치는 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는, 다중특이적 분자. - 제51항에 있어서, 제1 중쇄 불변 영역은 서열번호 49, 50, 51, 또는 52를 포함하고; 제2 중쇄 불변 영역은 서열번호 53, 54, 55, 또는 56을 포함하는, 다중특이적 분자.
- 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 결합 영역은 서열번호 1, 3, 5, 또는 67~99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄를 포함하는, 다중특이적 분자.
- 제53항에 있어서, 제1 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 1, 3, 5, 또는 67~99의 아미노산 서열로 이루어지는, 다중특이적 분자.
- 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원 결합 영역은 서열번호 7 또는 100~110의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄를 포함하는, 다중특이적 분자.
- 제55항에 있어서, 제2 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 7 또는 100~110의 아미노산 서열로 이루어지는, 다중특이적 분자.
- 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 다중특이적 분자는 서열번호 42, 43, 또는 44의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함하는, 다중특이적 분자.
- 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 결합 영역은 서열번호 2, 4, 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄를 포함하는, 다중특이적 분자.
- 제58항에 있어서, 제1 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 2, 4, 또는 6의 아미노산 서열로 이루어지는, 다중특이적 분자.
- 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원 결합 영역은 서열번호 8 또는 9의 아미노산 서열을 포함하는 제2 경쇄를 포함하는, 다중특이적 분자.
- 제60항에 있어서, 제2 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 8 또는 9의 아미노산 서열로 이루어지는, 다중특이적 분자.
- 다음을 포함하는 다중특이적 분자:
(a) 인간 CD96에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역으로서, 서열번호 1, 3, 5, 또는 67~99의 아미노산 서열을 포함하는 제1 중쇄; 및/또는 서열번호 2, 4, 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 제1 경쇄를 포함하는, 제1 항원 결합 영역; 및
(b) 인간 CD96 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역으로서, 제2 중쇄 및 제2 경쇄를 포함하는, 제2 항원 결합 영역. - 제58항에 있어서, 제2 항원 결합 영역은 인간 TIGIT에 특이적으로 결합하는, 다중특이적 분자.
- 다음을 포함하는 다중특이적 분자:
(a) 인간 TIGIT 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역으로서, 제1 중쇄 및 제1 경쇄를 포함하는, 제1 항원 결합 영역; 및
(b) 인간 TIGIT에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역으로서, 서열번호 7 또는 100~110의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄; 및/또는 서열번호 8 또는 9의 아미노산 서열을 포함하는 제2 중쇄를 포함하는, 제2 항원 결합 영역. - 제64항에 있어서, 제1 항원 결합 영역은 인간 CD96에 특이적으로 결합하는, 다중특이적 분자.
- 제62항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 중쇄는 서열번호 1, 3, 5, 또는 67~99의 아미노산 서열을 포함하고/하거나; 제1 경쇄는 서열번호 2, 4, 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는, 다중특이적 분자.
- 제62항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 중쇄는 서열번호 1, 3, 5, 또는 67~99의 아미노산 서열을 포함하고; 제1 경쇄는 서열번호 2, 4, 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는, 다중특이적 분자.
- 제67항에 있어서, 제1 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 1, 3, 4, 또는 67~99의 아미노산 서열로 이루어지고; 제1 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 2, 4, 또는 6의 아미노산 서열로 이루어지는, 다중특이적 분자.
- 제62항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 중쇄는 서열번호 7 또는 100~110의 아미노산 서열을 포함하고/하거나; 제2 경쇄는 서열번호 8 또는 9의 아미노산 서열을 포함하는, 다중특이적 분자.
- 제62항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 중쇄는 서열번호 7 또는 100~110의 아미노산 서열을 포함하고; 제2 경쇄는 서열번호 8 또는 9의 아미노산 서열을 포함하는, 다중특이적 분자.
- 제70항에 있어서, 제2 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지고; 제2 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 8 또는 9의 아미노산 서열로 이루어지는, 다중특이적 분자.
- 제62항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 중쇄 및 제1 경쇄는 서열번호 1 및 2; 3 및 4; 또는 5 및 6의 아미노산 서열을 각각 포함하고/하거나; 제2 중쇄 및 제2 경쇄는 서열번호 7 및 8; 또는 7 및 9의 아미노산 서열을 각각 포함하는, 다중특이적 분자.
- 제62항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 중쇄 및 제1 경쇄는 서열번호 1 및 2; 3 및 4; 또는 5 및 6의 아미노산 서열을 각각 포함하고; 제2 중쇄 및 제2 경쇄는 서열번호 7 및 8; 또는 7 및 9의 아미노산 서열을 각각 포함하는, 다중특이적 분자.
- 제73항에 있어서, 제1 중쇄 및 제1 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 1 및 2; 3 및 4; 또는 5 및 6으로 각각 이루어지고; 제2 중쇄 및 제2 경쇄는 서열번호 7 및 8; 또는 7 및 9의 아미노산 서열로 각각 이루어지는, 다중특이적 분자.
- 인간 CD96에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역; 및 인간 TIGIT에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자로서:
(a) 제1 항원 결합 영역은 아미노산 위치 239, 330, 332, 및 366에서 아스파르테이트, 류신, 글루타메이트, 및 트립토판을 각각 포함하고;
(b) 제2 항원 결합 영역은 아미노산 위치 366, 368, 및 407에서 세린, 알라닌, 및 발린을 각각 포함하지만, 아미노산 위치 239, 330, 및 332에서 아스파르테이트, 류신, 및 글루타메이트를 각각 포함하지는 않고;
아미노산 위치는 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는, 다중특이적 분자. - 제75항에 있어서, 제1 항원 결합 영역은 서열번호 73, 84, 95, 또는 56을 포함하고; 제2 항원 결합 영역은 서열번호 103 또는 49를 포함하는, 다중특이적 분자.
- 인간 CD96에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역; 및 인간 TIGIT에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자로서:
(a) 제1 항원 결합 영역은 아미노산 위치 239, 330, 332, 및 366에서 아스파르테이트, 류신, 글루타메이트, 및 트립토판을 각각 포함하고;
(b) 제2 항원 결합 영역은 아미노산 위치 239, 366, 368, 및 407에서 아스파르테이트, 세린, 알라닌, 및 발린을 각각 포함하고,
아미노산 위치는 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는, 다중특이적 분자. - 제77항에 있어서, 제1 항원 결합 영역은 서열번호 73, 84, 95, 또는 56을 포함하고; 제2 항원 결합 영역은 서열번호 104 또는 50을 포함하는, 다중특이적 분자.
- 인간 CD96에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역; 및 인간 TIGIT에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자로서:
(a) 제1 항원 결합 영역은 아미노산 위치 366, 368, 및 407에서 세린, 알라닌, 및 발린을 각각 포함하지만, 아미노산 위치 239, 330, 및 332에서 아스파르테이트, 류신, 및 글루타메이트를 각각 포함하지는 않고;
(b) 제2 항원 결합 영역은 아미노산 위치 239, 330, 332, 및 366에서 아스파르테이트, 류신, 글루타메이트, 및 트립토판을 각각 포함하고,
아미노산 위치는 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는, 다중특이적 분자. - 제79항에 있어서, 제1 항원 결합 영역은 서열번호 67, 78, 89, 또는 49를 포함하고; 제2 항원 결합 영역은 서열번호 7 또는 56을 포함하는, 다중특이적 분자.
- 인간 CD96에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역; 및 인간 TIGIT에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자로서:
(a) 제1 항원 결합 영역은 아미노산 위치 239, 366, 368, 및 407에서 아스파르테이트, 세린, 알라닌, 및 발린을 각각 포함하고;
(b) 제2 항원 결합 영역은 아미노산 위치 239, 330, 332, 및 366에서 아스파르테이트, 류신, 글루타메이트, 및 트립토판을 각각 포함하고,
아미노산 위치는 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는, 다중특이적 분자. - 제81항에 있어서, 제1 항원 결합 영역은 서열번호 1, 3, 5, 또는 50을 포함하고; 제2 항원 결합 영역은 서열번호 7 또는 56을 포함하는, 다중특이적 분자.
- 인간 CD96에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역; 및 인간 TIGIT에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자로서:
(a) 제1 항원 결합 영역은 아미노산 위치 239, 332, 및 366에서 아스파르테이트, 글루타메이트, 및 트립토판을 각각 포함하고;
(b) 제2 항원 결합 영역은 아미노산 위치 366, 368, 및 407에서 세린, 알라닌, 및 발린을 각각 포함하지만, 아미노산 위치 239, 330, 및 332에서 아스파르테이트, 류신, 및 글루타메이트를 각각 포함하지는 않고;
아미노산 위치는 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는, 다중특이적 분자. - 제83항에 있어서, 제1 항원 결합 영역은 서열번호 72, 83, 94, 또는 55를 포함하고; 제2 항원 결합 영역은 서열번호 103 또는 49를 포함하는, 다중특이적 분자.
- 인간 CD96에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 영역; 및 인간 TIGIT에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 다중특이적 분자로서:
(a) 제1 항원 결합 영역은 아미노산 위치 366, 368, 및 407에서 세린, 알라닌, 및 발린을 각각 포함하지만, 아미노산 위치 239, 330, 및 332에서 아스파르테이트, 류신, 및 글루타메이트를 각각 포함하지는 않고;
(b) 제2 항원 결합 영역은 아미노산 위치 239, 332, 및 366에서 아스파르테이트, 글루타메이트, 및 트립토판을 각각 포함하고,
아미노산 위치는 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링되는, 다중특이적 분자. - 제85항에 있어서, 제1 항원 결합 영역은 서열번호 67, 78, 89, 또는 49를 포함하고; 제2 항원 결합 영역은 서열번호 102 또는 55를 포함하는, 다중특이적 분자.
- 인간 TIGIT에 특이적으로 결합하는 단리된 항체로서, 상기 항체는 서열번호 40의 VH 아미노산 서열의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 서열번호 41의 VL 아미노산 서열의 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 단리된 항체.
- 제87항에 있어서, 항체는 서열번호 28, 29, 30, 31, 32, 및 33의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 아미노산 서열을 각각 포함하는, 단리된 항체.
- 제87항 또는 제88항에 있어서, 항체는 서열번호 40의 VH 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체.
- 제89항에 있어서, VH의 아미노산 서열은 서열번호 40의 아미노산 서열로 이루어지는, 단리된 항체.
- 제87항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호 41의 VL 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체.
- 제91항에 있어서, VL의 아미노산 서열은 서열번호 41의 아미노산 서열로 이루어지는, 단리된 항체.
- 인간 TIGIT에 특이적으로 결합하는 단리된 항체로서, 상기 항체는 서열번호 40 및 41의 아미노산 서열을 각각 포함하는 VH 및 VL을 포함하는, 단리된 항체.
- 제87항에 있어서, VH 및 VL의 아미노산 서열은 서열번호 40 및 41의 아미노산 서열로 각각 이루어지는, 단리된 항체.
- 제87항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 불변 영역을 포함하는, 단리된 항체.
- 제95항에 있어서, 항체는 IgG1 중쇄 불변 영역을 포함하는, 단리된 항체.
- 제96항에 있어서, 항체는 서열번호 57, 58, 59, 또는 60의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하는, 단리된 항체.
- 제96항에 있어서, IgG1 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 N297A 돌연변이를 포함하는, 단리된 항체.
- 제87항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 야생형 중쇄 불변 영역의 변이체인 중쇄 불변 영역을 포함하고, 변이체 중쇄 불변 영역은 야생형 중쇄 불변 영역이 FcγR에 결합하는 것보다 더 높은 친화도로 FcγR에 결합하는, 단리된 항체.
- 제99항에 있어서, FcγR은 FcγRIIB 또는 FcγRIIIA인, 단리된 항체.
- 제96항에 있어서, IgG1 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 S267E 및 L328F 돌연변이를 포함하는, 단리된 항체.
- 제96항에 있어서, IgG1 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 EU 넘버링 시스템에 따라 넘버링된 S239D, A330L, 및 I332E 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 단리된 항체.
- 제87항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호 107, 108, 109, 또는 110의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 단리된 항체.
- 제103항에 있어서, 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 107, 108, 109, 또는 110의 아미노산 서열로 이루어지는, 단리된 항체.
- 제87항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호 43 또는 44의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함하는, 단리된 항체.
- 제87항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 서열번호 8 또는 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 단리된 항체.
- 제106항에 있어서, 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 8 또는 9의 아미노산 서열로 이루어지는, 단리된 항체.
- 인간 TIGIT에 특이적으로 결합하는 단리된 항체로서, 상기 항체는 서열번호 107, 108, 109, 또는 110의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄; 및 서열번호 8 또는 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 단리된 항체.
- 제108항에 있어서, 중쇄의 아미노산 서열은 서열번호 107, 108, 109, 또는 110의 아미노산 서열로 이루어지고; 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 8 또는 9의 아미노산 서열로 이루어지는, 단리된 항체.
- 제108항 또는 제109항에 있어서, 중쇄 및 경쇄는 서열번호 107 및 8; 107 및 9; 108 및 8; 108 및 9; 109 및 8; 109 및 9; 110 및 8; 또는 110 및 9의 아미노산 서열을 각각 포함하는, 단리된 항체.
- 제110항에 있어서, 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 107 및 8; 107 및 9; 108 및 8; 108 및 9; 109 및 8; 109 및 9; 110 및 8; 또는 110 및 9의 아미노산 서열로 각각 이루어지는, 단리된 항체.
- 제87항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 다중특이적인, 단리된 항체.
- 제1항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 다중특이적 분자 또는 단리된 항체는 세포독성제, 세포증식억제제, 독소, 방사성 핵종, 또는 검출 가능한 표지에 접합되는, 다중특이적 분자 또는 단리된 항체.
- 제1항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 다중특이적 분자 또는 단리된 항체는 항체에 접합되는, 다중특이적 분자 또는 단리된 항체.
- 다음을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드:
(a) 제1항 내지 제86항, 제113항, 또는 제114항 중 어느 한 항의 다중특이적 분자의 VH, VL, 중쇄, 및/또는 경쇄;
(b) 제1항 내지 제86항, 제113항, 또는 제114항 중 어느 한 항의 다중특이적 분자의 제1 VH 및 제1 VL;
(c) 제1항 내지 제86항, 제113항, 또는 제114항 중 어느 한 항의 다중특이적 분자의 제2 VH 및 제2 VL;
(d) 제1항 내지 제86항, 제113항, 또는 제114항 중 어느 한 항의 다중특이적 분자의 제1 중쇄 및 제1 경쇄;
(e) 제1항 내지 제86항, 제113항, 또는 제114항 중 어느 한 항의 다중특이적 분자의 제2 중쇄 및 제2 경쇄. - 제87항 또는 제114항 중 어느 한 항의 단리된 항체의 VH 및/또는 VL, 또는 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
- 제115항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
- 제116항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
- 다음을 포함하는 재조합 숙주 세포:
(a) 제115항의 폴리뉴클레오티드;
(b) 제117항의 벡터;
(c) 제1항 내지 제86항, 제113항, 또는 제114항 중 어느 한 항의 제1 항원 결합 영역의 VH 및 VL을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 및 제1항 내지 제86항, 제113항, 또는 제114항 중 어느 한 항의 제2 항원 결합 영역의 VH 및 VL을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드;
(d) 제1항 내지 제86항, 제113항, 또는 제114항 중 어느 한 항의 제1 항원 결합 영역의 VH 및 VL을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 벡터, 및 제1항 내지 제86항, 제113항, 또는 제114항 중 어느 한 항의 제2 항원 결합 영역의 VH 및 VL을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 벡터;
(e) 제1항 내지 제86항, 제113항, 또는 제114항 중 어느 한 항의 제1 항원 결합 영역의 VH를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 제1항 내지 제86항, 제113항, 또는 제114항 중 어느 한 항의 제1 항원 결합 영역의 VL을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드, 제1항 내지 제86항, 제113항, 또는 제114항 중 어느 한 항의 제2 항원 결합 영역의 VH를 암호화하는 제3 폴리뉴클레오티드, 및 제1항 내지 제86항, 제113항, 또는 제114항 중 어느 한 항의 제2 항원 결합 영역의 VL을 암호화하는 제4 폴리뉴클레오티드;
(f) 제1항 내지 제86항, 제113항, 또는 제114항 중 어느 한 항의 제1 항원 결합 영역의 VH를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 벡터, 제1항 내지 제86항, 제113항, 또는 제114항 중 어느 한 항의 제1 항원 결합 영역의 VL을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 벡터, 제1항 내지 제86항, 제113항, 또는 제114항 중 어느 한 항의 제2 항원 결합 영역의 VH를 암호화하는 제3 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제3 벡터, 및 제1항 내지 제86항, 제113항, 또는 제114항 중 어느 한 항의 제2 항원 결합 영역의 VL을 암호화하는 제4 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제4 벡터;
(g) 제53항 내지 제56항 또는 제58항 내지 제74항 중 어느 한 항의 제1 항원 결합 영역의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 및 제53항 내지 제56항 또는 제58항 내지 제74항 중 어느 한 항의 제2 항원 결합 영역의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드;
(h) 제53항 내지 제56항 또는 제58항 내지 제74항 중 어느 한 항의 제1 항원 결합 영역의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 벡터, 및 제53항 내지 제56항 또는 제58항 내지 제74항 중 어느 한 항의 제2 항원 결합 영역의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 벡터;
(i) 제53항 내지 제56항 또는 제58항 내지 제74항 중 어느 한 항의 제1 항원 결합 영역의 중쇄를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 제53항 내지 제56항 또는 제58항 내지 제74항 중 어느 한 항의 제1 항원 결합 영역의 경쇄를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드, 제53항 내지 제56항 또는 제58항 내지 제74항 중 어느 한 항의 제2 항원 결합 영역의 중쇄를 암호화하는 제3 폴리뉴클레오티드, 및 제53항 내지 제56항 또는 제58항 내지 제74항 중 어느 한 항의 제2 항원 결합 영역의 VL을 암호화하는 제4 폴리뉴클레오티드; 또는
(j) 제53항 내지 제56항 또는 제58항 내지 제74항 중 어느 한 항의 제1 항원 결합 영역의 중쇄를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 벡터, 제53항 내지 제56항 또는 제58항 내지 제74항 중 어느 한 항의 제1 항원 결합 영역의 경쇄를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 벡터, 제53항 내지 제56항 또는 제58항 내지 제74항 중 어느 한 항의 제2 항원 결합 영역의 중쇄를 암호화하는 제3 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제3 벡터, 및 제53항 내지 제56항 또는 제58항 내지 제74항 중 어느 한 항의 제2 항원 결합 영역의 경쇄를 암호화하는 제4 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제4 벡터. - 다음을 포함하는 재조합 숙주 세포:
(a) 제116항의 폴리뉴클레오티드;
(b) 제118항의 벡터;
(c) 제87항 또는 제114항 중 어느 한 항의 단리된 항체의 VH 및 VL을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
(d) 제87항 또는 제114항 중 어느 한 항의 단리된 항체의 VH 및 VL을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 벡터;
(e) 제87항 내지 제114항 중 어느 한 항의 단리된 항체의 VH를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 및 제87항 내지 제114항 중 어느 한 항의 단리된 항체의 VL을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드; 또는
(f) 제87항 내지 제114항 중 어느 한 항의 단리된 항체의 VH를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 벡터, 및 제87항 내지 제114항 중 어느 한 항의 단리된 항체의 VL을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 벡터. - 제1항 내지 제86항, 제113항, 또는 제114항 중 어느 한 항의 다중특이적 분자, 제87항 내지 제114항 중 어느 한 항의 단리된 항체, 제115항 또는 제116항의 폴리뉴클레오티드, 제117항 또는 제118항의 벡터, 또는 제119항 또는 제120항의 숙주 세포; 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
- 다중특이적 분자 또는 단리된 항체를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 폴리뉴클레오티드가 발현되고 다중특이적 분자 또는 단리된 항체가 생산되도록 적절한 조건 하에 제119항 또는 제120항의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
- 다중특이적 분자를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 폴리뉴클레오티드가 발현되고 다중특이적 분자가 생산되도록 적절한 조건 하에 세포에서:
(a) 제1항 내지 제86항, 제113항, 또는 제114항 중 어느 한 항의 제1 항원 결합 영역의 VH 및 VL을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 및 제1항 내지 제86항, 제113항, 또는 제114항 중 어느 한 항의 제2 항원 결합 영역의 VH 및 VL을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드; 또는
(b) 제1항 내지 제86항, 제113항, 또는 제114항 중 어느 한 항의 제1 항원 결합 영역의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 및 제1항 내지 제86항, 제113항, 또는 제114항 중 어느 한 항의 제2 항원 결합 영역의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 단계를 포함하는, 방법. - 다중특이적 분자를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 폴리뉴클레오티드가 발현되고 다중특이적 분자가 생산되도록 적절한 조건 하에 세포에서:
(a) 제1항 내지 제86항, 제113항, 또는 제114항 중 어느 한 항의 제1 항원 결합 영역의 VH를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 제1항 내지 제86항, 제113항, 또는 제114항 중 어느 한 항의 제1 항원 결합 영역의 VL을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드, 제1항 내지 제86항, 제113항, 또는 제114항 중 어느 한 항의 제2 항원 결합 영역의 VH를 암호화하는 제3 폴리뉴클레오티드, 및 제1항 내지 제86항, 제113항, 또는 제114항 중 어느 한 항의 제2 항원 결합 영역의 VL을 암호화하는 제4 폴리뉴클레오티드; 또는
(b) 제1항 내지 제86항, 제113항, 또는 제114항 중 어느 한 항의 제1 항원 결합 영역의 중쇄를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 제1항 내지 제86항, 제113항, 또는 제114항 중 어느 한 항의 제1 항원 결합 영역의 경쇄를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드, 제1항 내지 제86항, 제113항, 또는 제114항 중 어느 한 항의 제2 항원 결합 영역의 중쇄를 암호화하는 제3 폴리뉴클레오티드, 및 제1항 내지 제86항, 제113항, 또는 제114항 중 어느 한 항의 제2 항원 결합 영역의 경쇄를 암호화하는 제4 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 단계를 포함하는, 방법. - 다중특이적 분자를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 다음을 포함하는, 방법:
(a) 제1 항원 결합 영역이 생산되는 조건 하에, 제1 세포에서 제1항 내지 제86항, 제113항, 또는 제114항 중 어느 한 항의 제1 항원 결합 영역의 VH 및 VL을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 단계;
(b) 제2 항원 결합 영역이 생산되는 조건 하에, 제2 세포에서 제1항 내지 제86항, 제113항, 또는 제114항 중 어느 한 항의 제2 항원 결합 영역의 VH 및 VL을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 단계; 및
(c) 다중특이적 분자가 생산되도록 적절한 조건 하에, 단계 (a) 및 (b)에서 생산된 제1 및 제2 항원 결합 영역을 접촉시키는 단계. - 다중특이적 분자를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 다음을 포함하는, 방법:
(a) 제1 항원 결합 영역이 생산되는 조건 하에, 제1 세포에서 제1항 내지 제86항, 제113항, 또는 제114항 중 어느 한 항의 제1 항원 결합 영역의 VH를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 및 제1항 내지 제86항, 제113항, 또는 제114항 중 어느 한 항의 제1 항원 결합 영역의 VL을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 단계;
(b) 제2 항원 결합 영역이 생산되는 조건 하에, 제2 세포에서 제1항 내지 제86항, 제113항, 또는 제114항 중 어느 한 항의 제2 항원 결합 영역의 VH를 암호화하는 제3 폴리뉴클레오티드, 및 제1항 내지 제86항, 제113항, 또는 제114항 중 어느 한 항의 제2 항원 결합 영역의 VL을 암호화하는 제4 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 단계; 및
(c) 다중특이적 분자가 생산되도록 하는 조건 하에, 단계 (a) 및 (b)에서 생산된 제1 및 제2 항원 결합 영역을 접촉시키는 단계. - 다중특이적 분자를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 다중특이적 분자가 생산되도록 하는 조건 하에, 제1항 내지 제86항, 제113항, 또는 제114항 중 어느 한 항의 제1 항원 결합 영역 및 제2 항원 결합 영역을 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
- 단리된 항체를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 폴리뉴클레오티드가 발현되고 항체가 생산되도록 적절한 조건 하에 세포에서:
(a) 제87항 또는 제114항 중 어느 한 항의 항체의 VH 및 VL을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 또는
(b) 제87항 또는 제114항 중 어느 한 항의 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 단계를 포함하는, 방법. - 단리된 항체를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 폴리뉴클레오티드가 발현되고 항체가 생산되도록 절절한 조건 하에 세포에서:
(a) 제87항 내지 제114항 중 어느 한 항의 항체의 VH를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드; 및 제87항 내지 제114항 중 어느 한 항의 항체의 VL을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드; 또는
(b) 제87항 내지 제114항 중 어느 한 항의 항체의 중쇄를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드; 및 제87항 내지 제114항 중 어느 한 항의 항체의 경쇄를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 단계를 포함하는, 방법. - 대상체에서 면역 반응을 강화시키는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제86항, 제113항, 또는 제제114항 중 어느 한 항의 다중특이적 분자, 제87항 내지 제114항 중 어느 한 항의 단리된 항체, 제115항 또는 제116항의 폴리뉴클레오티드, 제117항 또는 제118항의 벡터, 제119항 또는 제120항의 숙주 세포, 또는 제121항의 약학적 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제86항, 제113항, 또는 제제114항 중 어느 한 항의 다중특이적 분자, 제87항 내지 제114항 중 어느 한 항의 단리된 항체, 제115항 또는 제116항의 폴리뉴클레오티드, 제117항 또는 제118항의 벡터, 제119항 또는 제120항의 숙주 세포, 또는 제121항의 약학적 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제130항 또는 제131항에 있어서, 다중특이적 분자, 단리된 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포, 또는 약학적 조성물은 전신, 정맥내, 피하, 또는 종양내 투여되거나, 종양 배액 림프절에 전달되는, 방법.
- 제130항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 추가 치료제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제133항에 있어서, 추가 치료제는 화학요법제인, 방법.
- 제134항에 있어서, 추가 치료제는 관문 표적화제인, 방법.
- 제135항에 있어서, 관문 표적화제는 길항제 항-PD-1 항체, 길항제 항-PD-L1 항체, 길항제 항-PD-L2 항체, 길항제 항-CTLA-4 항체, 길항제 항-TIM-3 항체, 길항제 항-LAG-3 항체, 길항제 항-VISTA 항체, 길항제 항-TIGIT 항체, 길항제 항-CEACAM1 항체, 길항제 항-CD96 항체, 작용제 항-GITR 항체, 및 작용제 항-OX40 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제136항에 있어서, 추가 치료제는 항-PD-1 항체이고, 임의로 항-PD-1 항체는 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙인, 방법.
- 제133항에 있어서, 추가 치료제는 인돌아민-2,3-디옥시게나아제(IDO)의 억제제인, 방법.
- 제138항에 있어서, 억제제는 에파카도스타트, F001287, 인독시모드, 및 NLG919로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제133항에 있어서, 추가 치료제는 백신인, 방법.
- 제140항에 있어서, 백신은 항원성 펩티드와 복합체를 형성한 열충격 단백질을 포함하는 열충격 단백질 펩티드 복합체(HSPPC)를 포함하는, 방법.
- 제141항에 있어서, 열충격 단백질은 hsc70이고, 종양 연관 항원성 펩티드와 복합체를 형성하는, 방법.
- 제141항에 있어서, 열충격 단백질은 gp96이고, 종양 관련 항원 펩티드와 복합체를 형성하고, 임의로 HSPPC는 대상체로부터 얻은 종양으로부터 유래되는, 방법.
- 대상체에서 감염성 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제86항, 제113항, 또는 제제114항 중 어느 한 항의 다중특이적 분자, 제87항 내지 제114항 중 어느 한 항의 단리된 항체, 제115항 또는 제116항의 폴리뉴클레오티드, 제117항 또는 제118항의 벡터, 제119항 또는 제120항의 숙주 세포, 또는 제121항의 약학적 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
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