KR20230131450A - N-카바밀-l-글루탐산을 포함하는 염증성 질환의 치료용 조성물 - Google Patents

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최은호
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Abstract

본 발명은 N-카바밀-L-글루탐산을 생합성하는 방법 및 이의 염증성 질환의 치료 용도에 관한 것이다.

Description

N-카바밀-L-글루탐산을 포함하는 염증성 질환의 치료용 조성물{Composition for treating inflammatory disease comprising N-carbamyl-L-glutamic acid}
N-카바밀-L-글루탐산을 생합성하는 방법 및 이의 염증성 질환의 치료 용도에 관한 것이다.
N-카바밀-L-글루탐산(N-carbamyl-L-glutamic acid, NCG)는 요소 회로에 관여하는 첫 번째 효소인 카르바밀 인산 합성효소-1을 활성화하는 N-아세틸글루타메이트의 대사적으로 안정한 유사체이다. NCG는 동물과 유아에게 독성이 없으며 세포와 미토콘드리아에 쉽게 침투한다. NCG 섭취시, 미성숙한 새끼 동물들의 공장(jejunum)에서 융모의 길이 또는 선와의 깊이가 증가한다는 보고가 있다. 이에 실제 NCG는 젖소, 육우, 신생 돼지 등의 중요한 사료 첨가제로 사용되어 우유 생산량을 늘리고, 임신율을 높이고, 이환율과 사망률을 낮추고, 출생체중과 성장률을 증가시키는 연구 결과가 보고되었다.
한편, 대장은 소화기관의 최고 말단에 존재하는 장기로 물, 비타민, 무기물 등을 흡수하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 대장에서는 유전적, 환경적 요인으로 인해 대장암, 대장용종, 과민성 장증후군, 궤양성 대장염 및 크론병 등의 다양한 질환이 유발된다.
그 중 궤양성 대장염은 만성 염증성 장 질환으로 대장에서 염증반응이 과하게 발생하여 설사, 하복부 통증, 복부 팽만감, 혈변 등의 증상을 주로 나타내며, 현재까지 정확한 발병 원인이 밝혀진 바 없다. 궤양성 대장염은 발병 기간에 따라 만성과 급성으로, 발병 원인을 기준으로 감염성과 비감염성으로 분류된다. 이 질병은 직장 부위에서 염증이 가장 먼저 발생하여 장벽이 무너지고 병원성 세균과 장내 세균이 체 내로 침입하여 면역반응이 과하게 발생하여 대장의 전반부로 그 범위가 확대된다. 궤양성 대장염 환자는 정상에 비해 10~20배 높은 대장암 발생위험을 가지고 있으며, 질병을 앓는 기간 및 부위의 면적이 증가할수록 위험도가 증가된다. 최근 한국을 포함한 아시아 국가에서 발병률이 증가하고 있으나 궤양성 대장염은 발병 후 완치가 불가한 질병으로, 이 질환의 치료 목표는 증상 완화 및 점막의 염증을 호전시켜 환자의 삶의 질을 높이는 것이다. 궤양성 대장염의 환자군은 크게 경증(Mild), 중증도(Moderate) 및 중증(Severe)의 단계로 나뉘며 단계별 표준적 치료가 요구된다. 궤양성 대장염의 경증 및 중증도 환자의 치료에 5-아미노실산(5-aminoslicylic acid, 5-ASA)제제가 사용되고 있으나, 환자의 20 내지 40%에 치료효과가 없거나 부작용이 발생하므로, 새로운 치료제 및 용법 개발이 필요하다. 현재까지 다양한 동물모델을 활용하여 발병 원인과 치료제에 대한 연구가 진행되고 있지만, 염증성 장 질환 중 특히 궤양성 대장염의 발병 원인은 다양하고 복잡한 특징이 있어 치료제 개발에 어려움을 겪고 있다. 따라서 기존 치료제의 부작용과 한계점을 극복할 수 있는 대안적 치료제 개발이 필요한 실정이다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 기존의 염증성 장 질환 치료제의 한계를 극복하기 위해 대안적 치료제를 모색한 결과, 락토바실러스 루테리 DS0384를 이용하여 NCG를 생합성할 수 있고, NCG는 궤양성 대장염 치료제의 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 N-카바밀-L-글루탐산을 생합성하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, N-카바밀-L-글루탐산의 신규 용도인 염증성 장 질환의 예방 또는 치료 용도를 제공하는 것이다. 또한, N-카바밀-L-글루탐산을 유효성분으로 포함하여 기존 염증성 장 질환 치료제의 부작용을 최소화하고 안정성을 확보한 염증성 장 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 이용한 적정 사용 용법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 락토바실러스 루테리 DS0384 균주를 배양하는 단계;를 포함하는 N-카바밀-L-글루탐산(N-carbamyl-L-glutamic acid)을 생산하는 방법을 제공한다.
또한, N-카바밀-L-글루탐산을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 약학적 조성물, 건강기능식품 조성물 또는 사료조성물일 수 있다.
본 발명에서는 종래 화학적 방법으로 제조할 수밖에 없었던 N-카바밀-L-글루탐산을 락토바실러스 루테리 DS0384 균주를 배양함으로써 생합성할 수 있는 장점이 있다. 또한, 상기 균주를 최적화 조건으로 배양함으로써, 유효성분인 N-카바밀-L-글루탐산을 효율적으로 생산할 수 있다.
또한, N-카바밀-L-글루탐산(N-carbamyl-L-glutamic acid)이 염증성 장 질환 동물 모델에서 조직학적인 병변을 개선하고, 염증 지표를 감소시켜 염증성 장 질환에 대한 치료 효과가 있음을 최초로 규명하였다. 또한, N-카바밀-L-글루탐산을 투여한 동물 모델에서 염증성 장 질환의 발병이 감소하여 염증성 장 질환에 대한 예방 효과가 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 N-카바밀-L-글루탐산을 유효성분으로 포함하는 조성물은 염증성 장 질환 중 궤양성 대장염에 대한 예방, 개선 또는 치료용 의약품, 식품 및 사료로 유용하게 사용될 수 있어, 관련 산업에 매우 유용하다.
또한, 본 발명에서는 염증성 장 질환에 대한 치료 효과를 나타낼 수 있는 적정 사용 용법을 확인하여, 본 발명의 조성물 또는 투여 용법을 이용하면 N-카바밀-L-글루탐산이 갖는 염증성 장 질환에 대한 치료 효과를 극대화시킬 수 있다.
도 1의 패널 a는 비피도박테리움 롱검(B. longum), 락토바실러스 가세리(L. gasseri), 락토바실러스 커바투스(L. curvatus), 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus) 및 본 발명의 락토바실러스 루테리 DS0384(L. reuteri) 균주의 배양액을 장 오가노이드에 처리한 다음, 장 오가노이드의 형태학적 변화를 현미경으로 확인한 결과(위쪽 데이터, Bright field, BF) 및 면역형광염색을 통해 성숙 장관 마커 단백질의 발현을 비교하여 나타낸 결과(아래쪽 데이터)이다. 스케일 바는 흑색 500 ㎛, 백색 100 ㎛이다. 도 1의 패널 b는 비피도박테리움 롱검(B. longum), 락토바실러스 가세리(L. gasseri), 락토바실러스 커바투스(L. curvatus), 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus) 및 락토바실러스 루테리 DS0384(L. reuteri) 균주의 배양액을 장 오가노이드에 처리한 다음, 장 오가노이드의 형태학적 변화를 확인하기 위해 장 오가노이드의 크기 변화(왼쪽 패널) 와 장 오가노이드의 발아(budding) 구조의 개수(오른쪽 패널)를 확인하여 비교한 그래프이다. 도 1의 패널 c는 본 발명의 락토바실러스 루테리 DS0384(L. reuteri) 균주를 처리한 장 오가노이드에서 성숙 장관 마커 유전자(CDX2, DPP4, OLFM4, DEFA5, CREB3L3, KRT20, LYZ, LCT, SLC5A1 및 MUC13)의 발현 수준을 qRT-PCR로 확인하여 대조군의 결과와 비교한 그래프이다.
도 2의 패널 a는 락토바실러스 루테리로 분류되는 DS0191, DS0195, DS0333, DS0354 및 본 발명의 락토바실러스 루테리 DS0384 균주의 배양액을 장 오가노이드에 처리한 다음, 장 오가노이드의 형태학적 변화를 현미경으로 확인한 결과(위쪽 데이터, Bright field, BF) 및 면역형광염색을 통해 성숙 장관 마커 단백질의 발현을 비교하여 나타낸 결과(아래쪽 데이터)이다. 스케일 바는 흑색 500 ㎛, 백색 100 ㎛이다. 도 2의 패널 b는 성숙 장관 마커 유전자(CDX2, DPP4, OLFM4, DEFA5, CREB3L3, KRT20, LYZ, LCT, SLC5A1 및 MUC13)의 발현 수준을 qRT-PCR로 확인하여 비교한 그래프이다.
도 3의 패널 a는 락토바실러스 루테리로 분류되는 DSP007, DS0337, KCTC3594 및 본 발명의 락토바실러스 루테리 DS0384 균주의 배양액을 장 오가노이드에 처리한 다음, 장 오가노이드의 형태학적 변화를 현미경으로 확인한 결과(위쪽 데이터, Bright field, BF) 및 면역형광염색을 통해 성숙 장관 마커 단백질의 발현을 비교하여 나타낸 결과(아래쪽 데이터)이다. 스케일 바는 흑색 500 ㎛, 백색 100 ㎛이다. 도 3의 패널 b는 성숙 장관 마커 유전자(CDX2, DPP4, OLFM4, DEFA5, CREB3L3, KRT20, LYZ, LCT, SLC5A1 및 MUC13)의 발현 수준을 qRT-PCR로 확인하여 비교한 그래프이다.
도 4는 락토바실러스 루테리 DS0384 균주를 각각 6시간, 12시간, 18시간 및 24시간 배양한 후 수득한 배양액을 장 오가노이드에 처리한 다음, 장 오가노이드의 형태학적 변화(스케일 바는 500 ㎛, 위쪽 패널) 및 배양 시간 별로 수득한 상기 락토바실러스 루테리 균주의 배양액을 처리한 장 오가노이드에서 나타나는 장 성숙 마커 유전자의 발현 양상을 qRT-PCR을 통해 확인하여 비교한 그래프이다(중간 패널). 또한, 장 오가노이드의 형태학적 변화를 확인하기 위해 장 오가노이드의 크기 변화를 표면적으로 비교한 결과와 장 오가노이드의 발아(budding) 구조의 개수 비교한 그래프이다(아래쪽 패널).
도 5는 모세관 전기영동 질량 분석기를 이용하여 락토바실러스 루테리 DS0384 균주 배양액에 포함된 대사산물을 히트맵으로 나타낸 결과로서, KCTC3594 균주에서는 나타나지 않는 14개의 대사산물은 붉은 색으로 표시하였다.
도 6의 패널 a는 락토바실러스 루테리 DS0384 균주의 배양액에만 동종 균주 대비 더 포함된 대사산물 중 차등적으로 많이 포함된 7개의 대사산물의 장 성숙 및 장 발달 효과를 장 오가노이드의 형태학적 변화를 현미경으로 확인한 결과(위쪽 데이터, Bright field, BF) 및 면역형광염색을 통해 성숙 장관 마커 단백질의 발현을 비교하여 나타낸 결과(아래쪽 데이터)이고, 도 6의 패널 b는 성숙 장관 마커 유전자(CDX2, DPP4, OLFM4, DEFA5, CREB3L3, KRT20, LYZ, LCT, SLC5A1 및 MUC13) 유전자의 발현 양상을 qRT-PCR을 통해 확인하여 비교한 그래프이다.
도 7은 NCG가 락토바실러스 루테리 DS0384 균주의 배양액과 유사한 수준으로 장관 성숙 및 장관 발달을 촉진하는 것을 장 오가노이드의 형태학적 변화를 현미경으로 확인한 결과(왼쪽 데이터, Bright field, BF) 및 면역형광염색을 통해 성숙 장관 마커 단백질의 발현을 비교하여 나타낸 결과(오른쪽 데이터)이다. 도 8은 NCG가 락토바실러스 루테리 DS0384 균주의 배양액과 유사한 수준으로 장관 성숙 및 장관 발달을 촉진하는 것을 확인하기 위해 장 오가노이드의 형태학적 변화는 장 오가노이드의 크기 변화와 장 오가노이드의 발아(budding) 구조의 개수를 확인한 그래프(위쪽 패널) 및 장관 성숙 마커의 발현 양상을 qRT-PCR로 비교한 결과를 나타낸 것이다(아래쪽 패널).
도 9a는 NCG 궤양성 대장염으로부터 보호 효능을 확인하기 위한 장 오가노이드 실험의 개략도로서, 궤양성 대장염의 대표 전염증성 사이토카인 (Ifnγ, Tnfα; I/T)를 처리하여 장내 염증과 유사한 장 오가노이드에 NCG를 동시 처리하여 장 오가노이드 상피세포의 표현형을 관찰한 실험을 나타낸 것이다.
도 9b는 NCG 궤양성 대장염 장 보호 효능을 확인하기 위한 실험에서, 정상 장 오가노이드, 대장염 유사 장 오가노이드, NCG 처리 장 오가노이드의 형태학적 변화를 나타낸 것이다.
도 9c는 대장염 유사 장 오가노이드 및 NCG 처리 장 오가노이드의 형태학적 변화를 확인하기 위해 장 오가노이드의 크기 변화(왼쪽 패널) 와 장 오가노이드의 발아 구조의 개수 변화(오른쪽 패널)을 확인하여 비교한 그래프이다.
도 9d는 대장염 유사 장 오가노이드 및 NCG 처리 장 오가노이드의 조직학적 형태 분석(H&E 염색)과 뮤신 염색(Alcian Blue-Periodic Acid Schiff staining; AB-PAS staining)을 통해 통해 뮤신을 분비하는 배상세포 및 장의 기능성을 확인한 결과이다.
도 9e는 면역형광염색을 통해 NCG 동시처리를 통해 대장염 유사 장 오가노이드에 비해 장벽의 기능성(ZO-1)이 회복되고, 장 줄기세포 증식 세포(Ki67)가 감소되지 않음을 확인한 것이다(왼쪽 패널). 장 상피 구조(ECAD)마커 대비 장벽 구조(ZO-1)의 발현양 비율을 확인하여 비교한 그래프(중간 패널) 및 각 현미경 사진에서 Ki67 마커 발현 세포의 수를 확인하여 비교한 그래프이다(오른쪽 패널).
도 9f는 유전자 수준에서, 전염증성 사이토카인(IL-1β, IL-6, IL-8, TNFα), 장 상피 세포 및 구조(VIL1, EPCAM, KRT20), 장벽 구조(CLAUDIN), 배상세포(MUC2), 파네스세포(LYZ)의 발현 양상을 qRT-PCR을 통해 확인하여 비교한 그래프이다.
도 10a는 NCG 궤양성 대장염 예방 또는 장 보호 효능을 확인하기 위한 실험의 개략도로서, 궤양성 대장염 예방 또는 장 보호 효능을 확인하기 위하여 NCG를 처리한 이후 궤양성 대장염을 유발하여 질환 표현형을 관찰한 실험을 나타낸 것이다.
도 10b는 NCG 궤양성 대장염 예방 또는 장 보호 효능을 확인하기 위한 실험에서, 정상군, 궤양성 대장염 대조군, NCG 처리 실험군의 몸무게 감소율을 나타낸 것이다.
도 10c는 NCG 궤양성 대장염 예방 또는 장 보호 효능을 확인하기 위한 실험에서, 정상군, 궤양성 대장염 대조군, NCG 실험군의 대장의 길이 및 분변 형태를 나타낸 결과이다.
도 10d는 NCG 궤양성 대장염 예방 또는 장 보호 효능을 확인하기 위한 실험에서, 정상군, 궤양성 대장염 대조군, NCG 처리에 의한 대장의 길이 변화를 보여주는 그래프이다
도 10e는 NCG 궤양성 대장염 예방 또는 장 보호 효능을 확인하기 위한 실험에서, 정상군, 궤양성 대장염 대조군, NCG 실험군을 조직학적 분석한 결과를 나타내는 것이다.
도 11a는 NCG의 궤양성 대장염의 치료효능을 확인하기 위한 실험의 개략도로서, 궤양성 대장염을 유발한 마우스 모델에 NCG를 10일간 처리하여 질환 표현형을 관찰한 실험을 나타낸 것이다.
도 11b는 NCG 장염 치료 효능을 나타내기 위한 실험에서, 정상군, 궤양성 대장염 대조군, NCG 처리 실험군의 몸무게 감소율을 나타낸 것이다.
도 11c는 NCG 장염 치료 효능을 나타내기 위한 실험에서, 정상군, 궤양성 대장염 대조군, NCG 실험군의 대장의 길이 및 분변 형태를 확인한 사진이다.
도 11d는 NCG 장염 치료 효능을 나타내기 위한 실험에서, 정상군, 궤양성 대장염 대조군, NCG 처리에 의한 대장의 길이 변화를 보여주는 그래프이다.
도 12a는 NCG 장염 치료 효능을 나타내기 위한 실험에서, NCG를 농도별로 처리한 실험군의 H&E 염색으로 장의 조직학적 변화를 나타내는 것이다.
도 12b는 NCG 장염 치료 효능을 나타내기 위한 실험에서, 대장 단면의 조직학적 형태 분석을 수치화한 그래프이다.
도 12c는 NCG 장염 치료 효능을 나타내기 위한 실험에서, 뮤신 염색(Alcian Blue-Periodic Acid Schiff staining; AB-PAS staining)을 통해 뮤신을 분비하는 배상세포의 감소 및 장의 기능성을 확인한 것이다.
도 12d는 MUC2 면역형광염색 결과를 나타낸 것으로서, 궤양성 대장염 대조군에 비해 100 mM NCG 처리군에서 정상군과 비슷한 수준으로 배상 세포가 나타나는 것을 확인하였다.
도 13는 100, 200 mM NCG 처리를 통해 궤양성 대장염 대조군에 비해 장벽의 기능성이 회복됨을 확인한 것이다. 장내 장벽의 구조 단백질인 ZO-1, CLDN1과, 장 상피 구조 단백질인 ECAD의 면역형광염색을 통해 대장염 대조군에 비해 NCG 실험군이 장 상피의 구조를 회복하고, 장벽 기능성 또한 회복한 것을 확인하였다.
도 14a는 정상군, 궤양성 대조군, NCG 처리 실험군의 염증성 지표(전염증성 사이토카인, 면역 세포 침윤)를 확인한 것으로서, 전염증성 사이토카인(TNFα, IFNγ, IL-17), 염증 관련 효소(iNOS) 분비와 면역세포(myeloid cells; CD11b+, macrophages; F4/80+)침윤을 확인하기 위하여 면역형광염색을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 14b는 유전자 수준에서 전염증성 사이토카인(Il-6, Il-1β, Tnfα, Il-17a) 및 산화 질소 지표 iNos의 발현을 확인한 도이다.
도 15a은 100mM NCG 처리를 통해 DSS 유도 염증성 장질환이 정상군 수준으로 완화된 것을 유전자 수준에서 확인한 것으로서, RNA 시퀀싱 데이터로부터 정상군, 궤양성 대장염 대조군, NCG 실험군의 유전체를 스피어만 상관계수(Spearman's correlation) 통해 비교 분석하여 총 21,823의 유전자를 분석한 결과를 나타낸 것이다. 빨간색은 샘플간 유사도가 가장 높음을 나타내고, 파란색은 샘플간 유사도가 가장 낮음을 나타낸 것이다.
도 15b는 정상군, 궤양성 대장염 대조군, NCG 실험군 중 차별적으로 발현된 유전자(2배 변화)의 주성분을 분석한 것으로서, PCA 플롯을 통해 각 유전자 그룹간 차이를 나타낸 것이다.
도 15c는 정상군, 궤양성 대장염 대조군, 100mM NCG 실험군의 유전자 발현 수준에서 비교한 데이터를 패턴 그래프와 히트맵으로 표현한 것이다.
도 15d는 정상군에 비해 대장염 대조군(PBS) 그룹에서 발현이 저하되고 100mM NCG 처리를 통해 정상군의 수준으로 발현이 증가하는 총 238 유전자의 GOterm 분석(Biological process)을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 15e는 Wnt 신호 경로(signaling pathway)에 관여하는 유전자 발현 수준을 비교한 데이터를 히트맵으로 표현한 것이다.
도 15f는 Wnt 신호 경로(signaling pathway)에 관여하는 유전자 중 주요 유전자(Fzd7, Tcf7, Ror1, Axin2)의 mRNA 발현 수준을 qPCR을 통해 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 15g는 면역형광화학염색을 통해 장 줄기세포의 증식 마커(Ki-67)의 발현을 비교한 결과이다.
도 15h는 Cps1 유전자의 발현 수준을 RNAseq 통해 측정한 결과를 나타낸 것으로, NCG는 궤양성 대장염의 지표 중 하나인 Cps1의 발현 수준에 영향을 미치지 않음을 보여주는 결과이다.
도 16a는 정상군에서 NCG 영향을 확인하기 위한 실험의 개략도로서, 정상군에 PBS 또는 NCG를 10일 동안 경구로 투여하여 정상군의 임상증상 관찰 및 분석을 진행한 실험을 나타낸 것이다
도 16b는 정상군에서 NCG 영향을 확인하기 위한 실험에서, 정상군, 100 mM NCG 처리 실험군의 몸무게 증감을 나타낸 것이다.
도 16c는 정상군에서 NCG 영향을 확인하기 위한 실험에서, 정상군, 100 mM NCG 처리 실험군의 대장의 길이 및 분변 형태를 확인한 사진이다.
도 16d는 정상군에서 NCG 영향을 확인하기 위한 실험에서 정상군, 100 mM NCG 처리 실험군의 H&E 염색에 의한 장의 조직학적 형태를 확인한 것으로, 정상군과 유사하게 음와와 융모구조를 유지하는 것을 확인하였다.
도 16e는 정상군에서 NCG 영향을 확인하기 위한 실험에서, 정상군, 100 mM NCG 처리 실험군의 AB-PAS 염색을 통해 뮤신을 분비하는 배상세포의 증감, 장의 기능성을 확인한 것으로, 정상군과 유사하게 100 mM NCG를 처리한 실험군에서도 배상세포의 형태 및 뮤신 분비 기능성이 유지되는 것을 확인하였다.
도 16f는 정상군에서 NCG 영향을 확인하기 위한 실험에서, 유전자 수준에서 전염증성 사이토카인(Il-6, Il-1β, Tnfα, Ifnγ, Il-17a) 및 염증 관련 효소(iNos)의 발현을 비교한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
1. N-카바밀-L-글루탐산의 신규 생산 방법
본 발명의 일 측면은, 락토바실러스 루테리 DS0384 균주를 배지에서 배양하는 단계;를 포함하는 N-카바밀-L-글루탐산을 생산하는 방법을 제공한다.
상기 N-카바밀-L-글루탐산(N-carbamyl-L-glutamic acid, NCG)는 요소 회로에 관여하는 첫 번째 효소인 카르바밀 인산 합성효소-1을 활성화하는 N-아세틸글루타메이트의 대사적으로 안정한 유사체로서 하기 화학식의 구조를 갖는다.
[화학식]
상기 락토바실러스 루테리는 DS0384 균주일 수 있고, 2020년 4월 6일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 수탁번호 KCTC 14164BP로 기탁된 것일 수 있다. 상기 락토바실러스 루테리 DS0384 균주는 락토바실러스 속으로 분류되는 미생물로, 인간 또는 인간을 제외한 동물에 독성을 나타내거나 질환을 유발하지 않는 미생물일 수 있으며, 장내에서 인간 또는 인간을 제외한 동물의 건강에 도움을 주는 유익균으로 작용할 수 있다. 또한, 상기 락토바실러스 루테리 DS0384 균주는 장 발달 또는 장 성숙을 촉진하고, 장 손상을 회복시키는 활성을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 락토바실러스 루테리 DS0384 균주의 균체를 포함하는 배양액이나, 상기 균주에 의해 생성되는 대사산물이 포함되는 배양액을 마우스에게 위관 영양(oral gavage)시켰을 때에도 소장 및 대장의 발달이 촉진되고, 성숙 장관 마커 유전자의 발현이 증가되는 것을 확인하였다. 특히, 상기 락토바실러스 루테리 DS0384 균주는, 다른 종으로 분류되는 유산균들에서는 나타내지 못하는 장 성숙 촉진 효과를 나타냈으며, 락토바실러스 루테리로 분류되는 7종의 미생물 배양액을 처리한 경우와 비교할 때에도 장의 성숙과 관련된 유전자, 단백질의 발현량이 현저하게 더 높게 나타나거나, 다른 미생물 배양액 처리군에서는 발현이 증가되지 않는 장관 성숙 관련 마커 유전자의 발현을 증가시키는 것으로 확인되었다(도 1 내지 도 3).
상기 락토바실러스 루테리 DS0384 균주를 배양함에 따라 상기 락토바실러스 루테리 DS0384 균주의 배양액은 상기 균주에 의해 생산되는 대사산물인 N-카바밀-L-글루탐산을 포함한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 동종 락토바실러스 루테리 균주 5종 중 락토바실러스 루테리 DS0384 균주의 배양액에만 존재하는 14개의 대사산물 중 N-카바밀-L-글루탐산이 포함되어 있는 것을 확인하였다. 또한, 락토바실러스 루테리 DS0384 균주의 배양액에만 존재하는 대산산물 중 N-카바밀-L-글루탐산을 이용하여 장 성숙 및 발달 촉진 효과 및 장 손상 회복 효과를 비교한 결과, N-카바밀-L-글루탐산만이 배양액과 동등한 수준으로 장 성숙 및 발달을 촉진하는 효과가 있어, 락토바실러스 루테리 DS0384 균주의 배양액의 장 성숙 및 발달을 촉진하는 효과를 나타내는 유효성분이 N-카바밀-L-글루탐산임을 규명하였다(도 5 및 도 6).
상기 배양액은 균주를 배양하여 수득된 배양액 자체, 또는 이로부터 균주를 제거하여 수득된 배양 상층액, 그리고 이들의 여과물, 농축물 또는 건조물을 의미하는 것으로, "배양 상층액", "조건 배양액" 또는 "조정 배지"와 혼용되어서 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 배양액은 상기 락토바실러스 루테리 DS0384를 배양하여 수득되는 것으로, 상기 균주의 세포를 포함하는 배양액 자체이거나, 또는 이로부터 세포를 제거하여 수득된 배양 상층액일 수 있으며, 또한 이들의 여과물, 농축물 또는 건조물일 수 있다. 상기 세포가 제거된 배양액은 락토바실러스 루테리 DS0384 균주에 의해 생산, 분비되는 성분, 예컨대 대사산물을 포함하며 이에 따라 장 발달 또는 장 성숙 활성, 염증성 질환의 예방 또는 치료 활성을 갖는 것일 수 있다.
상기 여과물은 락토바실러스 루테리 DS0384의 배양액으로부터 부유하는 고체 입자를 제거하여 침전물을 제외한 수용성의 상등액만을 얻는 것으로, 면, 나일론 등의 필터, 예컨대 0.2 ㎛ 내지 5 ㎛의 필터를 이용하여 입자를 걸러내거나 냉동여과법, 원심분리법 등을 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 농축물은 상기 배양액의 고형분 농도를 높이는 것으로, 상기 유산균 세포를 포함하는 배양액의 농축물이거나 유산균 세포를 제거한 배양 상층액의 농축물일 수 있다. 상기 농축물은 진공농축, 판형농축, 박막농축 등에 의해 농축된 것일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 예컨대 공지의 농축기를 이용하여 40 ℃ 내지 60 ℃의 온도에서 수행할 수 있다. 상기 농축물의 농도에 따라 본 발명의 조성물에 포함되는 배양액의 함량을 적절히 조절할 수 있다.
상기 배양은 통상적으로 락토바실러스 균주를 배양하는 배지에서 수행될 수 있다. 상기 배지는 락토바실러스 루테리 DS0384 균주의 생육에 필수적인 성분을 포함할 수 있다. 예컨대, 포도당, 아미노산, 효모추출물, 프로테우스펩톤, 폴리소르베이트 80, 암모늄시트레이트, 마그네슘 설페이트, 디포타슘포스페이트, 소듐 아세테이트 등의 성분을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며 상기 락토바실러스 루테리 DS0384 균주의 생육의 도움을 줄 수 있는 성분이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 배지의 pH는 pH 5 내지 7의 범위로 조정하여 사용할 수 있다.
상기 배양은 3시간 이상, 5시간 이상, 7시간 이상, 10시간 이상, 13시간 이상, 15시간 이상, 18시간 이상, 20시간 이상, 24시간 이상 동안 수행될 수 있고, 구체적으로 18시간 이상 수행될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 락토바실러스 루테리 DS0384 균주가 18시간 이상 배양하였을 때 장관 성숙 및 발달 촉진효과가 우수함을 확인하였다(도 4).
상기 N-카바밀-L-글루탐산을 생산하는 방법은 상기 균주의 배양액을 분리하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
상기 균주의 배양액을 분리하는 단계는 상기 배지에서 배양한 균주 세포와 균주가 생성한 대사산물을 분리하는 단계를 의미한다. 상기 배지에서 배양한 배양물 자체에서 부유하는 고체 입자를 제거하여 침전물을 제외한 배양 상등액만을 얻는 것으로, 균주와 이의 배양액을 원심분리 또는 여과하는 단계를 포함한다.상기 분리하여 수득한 배양 상등액을 농축하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 N-카바밀-L-글루탐산을 생산하는 방법은 상기 균주의 배양액에서 N-카바밀-L-글루탐산을 정제하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
상기 정제는 균주와 배양액의 혼합물 또는 상기 균주와 분리한 배양액에서 배양 혼합액에서 불순물 제거하고, N-카바밀-L-글루탐산을 분리하여 기능성 원료 또는 원료의약품으로 분리하는 것으로서 통상적인 미생물 배양액의 정제 방법을 이용할 수 있다. 상기 정제 공정을 통해서 제품의 안정성 및 생산 효율성이 증가할 수 있다. 예컨대 크로마토그래피 등을 이용할 수 있으나, 이에 한정되지 않고 미생물 배양액 정제 공정에 통상적으로 이용될 수 있는 방법을 포함한다.
본 발명을 통해 종래 화학적인 방법으로 생산할 수밖에 없었던 N-카바밀-L-글루탐산을 락토바실러스 루테리 균주를 배양함에 따라 생합성 할 수 있으며, 장내 유익균인 락토바실러스 루테리 균주가 대사산물로서 생성하는 안전한 생리활성 물질인 NCG를 효율적으로 생산할 수 있다.
2. N-카바밀-L-글루탐산의 신규 용도
본 발명의 다른 측면은, N-카바밀-L-글루탐산(N-carbamyl-L-glutamic acid)을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 N-카바밀-L-글루탐산(N-carbamyl-L-glutamic acid, NCG)은 “1. N-카바밀-L-글루탐산의 신규 생산 방법”항목에서 상술한 바와 같다.
본 발명에서 용어 “염증성 질환”은 세균의 침입에 의하여 신체에 형성되는 농양의 병리적 상태를 의미한다, 염증성 질환은 예컨대, 염증성 장 질환, 골관절염, 류마티스 관절염, 통풍, 강직성 척추염, 건염, 건막염, 류마티스 열, 루프스, 섬유근통(Fibromyalgia), 건선 관절염, 천식, 피부염, 아토피 등 급성 만성 염증질환 일 수 있고, 구체적으로 염증성 장 질환일 수 있다. 이에 한정되지 않고 신체 전반에 나타나는 모든 염증성 병리 상태를 모두 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 “장”은 위로부터 항문까지 뻗어 있는 소화관의 구역을 의미한다. 인간 및 기타 포유동물에 있어서, 장은 소장(인간에서는 십이지장, 빈창자 및 돌창자로 더욱 세분됨)과 대장(인간에서는 맹장과 결장으로 더욱 세분됨)의 2개의 구역으로 구성되어 있으며, 기타 포유동물은 더욱 복잡한 장을 지닐 수 있는데, 본 발명에서 장은 이들 모두를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 “염증성 장 질환”은 장에 염증이 생기는 원인불명의 만성 질환으로서, 장내 염증이 수개월 이상 지속돼 만성화되는 만성 소화기 질환을 모두 통칭한다. 상기 염증성 장 질환은 궤양성 대장염, 크론병 또는 베체트장염일 수 있다. 그러나 염증의 발생 원인과 관계없이 비정상적인 만성 염증이 장에서 발생한 질환이라면 모두 포함될 수 있다. 궤양성 대장염은 직장에서 대장의 근위부로 이어지는 대장 점막의 염증이 특징이고, 크론병은 구강에서 항문까지 위장관 전체에서 발생할 수 있다. 배체트병은 만성적으로 전신의 여러 장기에 걸쳐 다양하게 나타나는 염증성 질환이다. 그러나 이에 제한되는 것은 아니고 장관 내 비정상적인 만성 염증이 호전과 재발을 반복하는 질환을 모두 포함한다. 상기 염증성 장 질환의 증상으로는 설사, 점액변, 복통, 체중감소, 직장 출혈, 항문통, 변비, 복부종괴, 발열 등이 나타난다. 또한 염증 지표의 발현이 증가하고, 카르바밀 인산 합성효소-1(Cps1)의 발현이 증가하는 증상 등이 나타날 수 있다.
상기 N-카바밀-L-글루탐산은 염증성 장 질환에 대한 예방, 개선 또는 치료하는 효능이 있다.
본 발명에서 용어 "예방"은 조성물을 대상체에 투여하여 해당 질병 또는 부정적 상태를 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어 "치료"는 조성물을 대상체에 투여하여 기발병된 해당 질병 또는 부정적 상태의 증세를 호전시키는 모든 행위일 수 있다.
본 발명에서 용어 "개선"은 증세의 호전, 억제, 또는 지연을 포함하는 모든 행위를 의미하는 것으로, 상기 예방 또는 치료와 혼용되어서 사용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 전염증성 사이토카인과 N-카바밀-L-글루탐산을 장 오가노이드에 동시 투여한 결과, 대장염 대조군에 비해 장 상피 손상의 대표적 지표인 장 상피 형태학적 변화 및 장 오가노이드 발아 변화가 적고, 조직학적으로도 세포 괴사가 일어나지 않았고, 장 구조 및 장 줄기세포가 유지되었으며, 염증 지표(전염증성 사이토카인)의 발현이 감소됨을 확인하여, NCG가 대장염에 대한 예방 효과 또는 장을 보호하는 효과가 있음을 확인하였다(도 9a 내지 9f).
N-카바밀-L-글루탐산을 먼저 투여한 이후 궤양성 대장염을 유발한 동물 모델에서, 염증성 장 질환의 중요한 임상적 표지인 분변의 형태가 덩어리 형태이며, 체중 감소 정도 및 분변 내 잠혈이 대조군 대비 감소하였고, 조직학적으로도 세포 괴사가 일어나지 않고, 염증반응이 감소하였으며, 음와와 융모 구조가 유지되었다. 이를 통해 N-카바밀-L-글루탐산이 염증성 장 질환을 예방하고 장 보호 효과가 있음을 확인하였다(도 10a 내지 10e).
상기 N-카바밀-L-글루탐산은 염증성 장 질환에 대한 치료 효능이 있다. 염증성 장 질환의 치료란 기발병된 염증성 장 질환에 대해 염증성 장 질환의 대표적 임상 증상인 체중 감소, 분변 내의 잠혈, 묽은 분변의 형태, 장내 음와 및 융모의 구조 파괴 등과 같은 부정적 상태가 호전되는 모든 것을 의미한다(도 11b 내지 11c, 도 12, 도 13).
상기 N-카바밀-L-글루탐산은 염증 지표의 발현을 감소시키는 활성이 있다. 상기 염증 지표는 전염증성 사이토카인, 염증 관련 효소, 면역 세포의 침윤 현상일 수 있다. 상기 전염증성 사이토카인은 TNFα, IFNγ, Il-6, Il-8, Il-1β, IL-17 등 일 수 있고, 염증 관련 지표는 산화 질소를 생성하는 iNOs 일 수 있다. 또한, 골수 세포나 대식 세포와 같은 면역 세포의 침윤 현상이 감소할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 장 오가노이드에서 전염증성 사이토카인과 NCG를 동시 처리한 경우, 대조군에 비해 IL-1β, IL-6, IL-8 및 TNFα의 발현이 감소하였으며(도 9a 내지 9f), 궤양성 대장염 동물 모델에서 대표적인 염증 지표인 전염증성 사이토카인(Il-6, Il-1β, Tnfα, Il-17a) 및 산화 질소 지표 iNos의 발현양 또한 100 또는 200 mM NCG 처리 실험군에서 감소하였으며, 면역 세포(골수 세포(myeloid cells); CD11b+, 대식세포 macrophages; F4/80+)의 침윤 현상이 감소하여, 염증성 장 질환에 대한 치료 효과가 있음을 확인하였다(도 14).
상기 N-카바밀-L-글루탐산은 장벽 기능성을 회복시키는 활성이 있다. 장벽 기능성을 회복시킨다는 것은 염증으로 인해 손상된 장의 표면적을 증가시켜 장을 원래의 상태로 회복시키는 것이거나, 또는 손상으로부터 장을 보호하여 손상을 저감시키는 것일 수 있다. 또한, 상기 장벽 기능성의 회복은 손상이 발생한 장에서 장벽의 기능이나 증식과 관련된 유전자 또는 단백질 마커의 발현 또는 장내 점액층의 배상세포와 파네스세포의 발현을 증가시키는 것일 수 있다. 상기 장벽 기능 마커는 ZO-1 단백질 또는 CLDN1 단백질, 장 상피 구조 단백질(ECAD), 장 상피 세포 및 구조 유전자(VIL1, EPCAM, KRT20), 장벽 구조 유전자(CLAUDIN), 배상세포의 마커 유전자(MUC2), 파네스세포의 마커 유전자(LYZ)일 수 있고, 증식 마커는 장벽 증식 마커인 Ki67 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, NCG를 처리한 대장염 장 오가노이드에서, 대조군에 비해 장 상피 세포 및 구조(VIL1, EPCAM, KRT20), 장벽 구조(CLAUDIN), 배상세포(MUC2), 파네스세포(LYZ)의 발현이 증가함을 확인하였다(도 9f). 또한, 100, 200 mM NCG를 투여한 대장염 동물 모델에서 장벽 기능성 관련 단백질(ZO-1, CLDN1)과 장 상피 구조 단백질(ECAD)의 발현이 정상군과 유사한 정도로 증가함을 확인하여, 대조군에 비해 확연하게 장의 구조가 회복되었음을 확인하였다(도 13). 또한, 장 줄기세포 증식 마커인 Ki67 단백질의 발현이 증가함을 확인하였다(도 15g) 이를 통해, NCG는 궤양성 대장염에 대해 장 상피의 구조 및 장벽 기능성을 회복시키고, 장 줄기세포의 증식을 촉진시킴으로써 염증성 장 질환에 대한 치료 효과가 있음을 확인하였다.
상기 N-카바밀-L-글루탐산은 Wnt 신호 경로를 활성화시키는 특징이 있다. Wnt 신호 경로는 세포 안에서 세포의 증식, 분화, 사멸, 이동, 생존에 관련된 다양하고 중요한 기능을 수행하는 경로이며, 정확한 기작은 밝혀지지 않았지만 암이나 염증성 질환에서 면역반응을 조절하는 역할을 한다. N-카바밀-L-글루탐산은 Wnt 신호 경로를 활성화시켜 염증성 질환에서 면역 반응을 조절함으로써 염증성 질환에 대한 치료 효과를 나타낼 수 있다. 상기 Wnt 신호 경로 중 발현이 증가하는 유전자는 Fzd7, Tcf7, Ror1, Axin2 일 수 있다.
한편, 상기 N-카바밀-L-글루탐산은 염증성 장 질환에서 CPS1의 발현에 영향을 미치지 않는 특징이 있다. 카르바밀 인산 합성효소-1(Cps1)는 미토콘드리아 요소 회로에 관여하는 첫번째 효소로서, 장상피세포와 간세포에서 주로 발현되어 단백질은 암모니아를 해독하고 요소 회로의 다른 효소와 함께 아르기닌의 데노보(de novo) 공급원의 역할을 한다. Cps1은 궤양성 대장염과 같은 염증성 장 질환이나 소화기 암의 이형성 조직에서 발현이 증가하는 것으로 알려져 있다. N-카바밀-L-글루탐산은 Cps1을 활성화시키는 N-아세틸글루타메이트의 대사 유사체이지만, 상기 농도의 N-카바밀-L-글루탐산은 염증성 장 질환에서 Cps1의 발현 내지는 활성에 영향을 미치지 않는 특징이 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 궤양성 대장염 환자에서 발현이 증가하는 Cps1은 NCG를 처리하는 경우에 발현 수준에 변화가 없음을 확인하여, NCG의 염증성 장 질환에 대한 치료효과는 Cps1과 관련이 없음을 확인하였다(도 15h).
또한, 궤양성 대장염 동물 모델에서 대조군 대비 발현이 증감된 유전자를 생물정보학적으로 분석한 결과, N-카바밀-L-글루탐산이 염증성 장 질환에 대한 예방 또는 치료 효과를 나타내는 주요 기작은 Wnt 신호 경로임을 확인하였으며, Wnt 신호 경로의 주요 유전자(Fzd7, Tcf7, Ror1, Axin2)의 발현이 증가함을 확인하였다(도 15a 내지 15f).
상기 N-카바밀-L-글루탐산은 독성이 없고 안정성이 우수한 특징이 있다. N-카바밀-L-글루탐산은 유익한 미생물인 락토바실러스 루테리 균주가 생성한 것 또는 이와 화학적으로 동일한 것이므로 부작용 없이 안정하게 기존 염증성 장 질환의 대안치료제로서 이용될 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서 정상군에 N-카바밀-L-글루탐산을 투여한 결과, 대장의 길이, 음와 및 융모의 구조를 포함한 조직학적 변화 및 염증 지표의 발현 수준, 장벽 기능성 등에 유의한 변화가 없음을 확인하여 독성 및 부작용이 없음을 확인하였다(도 16a 내지 16f).
상기 N-카바밀-L-글루탐산은 조성물 내에 적절한 농도로 포함된 경우, 조성물에서 N-카바밀-L-글루탐산이 갖는 염증성 장 질환에 대한 예방, 개선 또는 치료 활성이 증가될 수 있다. 예컨대 1 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM 100mM로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 하한; 및 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 500 mM으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 상한으로부터 선택되는 농도 범위로 포함될 수 있다, 구체적으로, 1 mM 내지 300 mM, 20 mM 내지 250 mM, 50 mM 내지 300 mM, 50 mM 내지 250 mM, 100 내지 200 mM로 포함되었을 때 N-카바밀-L-글루탐산이 갖는 염증성 장 질환에 대한 치료 활성이 극대화될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 체중 20 내지 25g의 궤양성 대장염 동물 모델에 농도별 NCG(0, 1, 10, 100, 200, 250, 500 mM)를 경구투여한 결과, 다른 농도(1, 10, 250, 500 mM)를 투여한 경우보다 질환의 증상이 완화됨을 확인하여 치료 효과를 극대화할 수 있는 NCG의 적정 투여 농도 범위는 체중 20 내지 25g 당 100 내지 200 mM임을 확인하였다.
본 발명의 조성물은 상기와 같이 염증성 질환, 특히 염증성 장 질환에 대한 예방, 개선 또는 치료 효과가 우수한 N-카바밀-L-글루탐산을 유효성분으로 포함하고, 부작용이 없는 안전한 성분이므로 염증성 질환의 치료제로서 유용하게 이용될 수 있다.
상기 조성물은 약학적 조성물, 건강기능식품 조성물 또는 사료조성물일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조되는 것일 수 있다. 이 때, 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 젤(예컨대, 하이드로젤) 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 상기 약학적 조성물이 포함하는 N-카바밀-L-글루탐산은 콜로이드 현탁액, 분말, 식염수, 지질, 리포좀, 미소구체(microspheres), 또는 나노 구형입자와 같은 약학적으로 허용될 수 있는 담체에 운반될 수 있다. 이들은 운반 수단과 복합체를 형성하거나 관련될 수 있고, 지질, 리포좀, 미세입자, 금, 나노입자, 폴리머, 축합 반응제, 다당류, 폴리아미노산, 덴드리머, 사포닌, 흡착 증진 물질 또는 지방산과 같은 당업계에 공지된 운반 시스템을 사용하여 생체 내 운반될 수 있다.
이 외에도, 약학적으로 허용되는 담체는 제제시 통상적으로 이용되는 락토오스, 덱스트로스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아, 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성 셀룰로스, 폴리비닐 피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 레밍턴의 약학적 과학(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
상기 약학적 조성물은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 실제 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 생약 추출물 또는 생약 발효물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 염증성 질환의 예방 또는 개선을 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선치료, 호르몬치료, 화학치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
상기 약학적 조성물에 포함되는 유효성분의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요기간 등을 고려하여 결정할 수 있으며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다. 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나, 다른 장관 발달 장애의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물 내에 포함된 N-카바밀-L-글루탐산이 적절한 농도로 환자에 투여되었을 때, N-카바밀-L-글루탐산이 갖는 염증성 장 질환에 대한 예방, 개선 또는 치료 효과를 극대화시킬 수 있다. 예컨대 체중 25g 당 NCG가 N-카바밀-L-글루탐산이 1 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM 100mM로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 하한; 및 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 500 mM으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 상한으로부터 선택되는 농도 범위로 투여되었을 때, 구체적으로 1 mM 내지 300 mM, 20 mM 내지 250 mM, 50 mM 내지 300 mM, 50 mM 내지 250 mM, 100 내지 200 mM로 포함되었을 때, N-카바밀-L-글루탐산의 염증성 질환에 대한 치료 효과가 극대화될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율, 배설 속도, 질병 종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라 증감될 수 있다. 일례로 1일당 환자 체중 25g 당 N-카바밀-L-글루탐산이 1 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM 100mM로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 하한; 및 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 500 mM으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 상한으로부터 선택되는 농도 범위로 투여되었을 때, 구체적으로 1 mM 내지 300 mM, 20 mM 내지 250 mM, 50 mM 내지 300 mM, 50 mM 내지 250 mM, 100 내지 200 mM로 농도로 투여될 수 있다. 또한, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1일 수회, 예컨대 하루 2회 내지 3회 분할 투여될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 궤양성 대장염 동물 모델에서 체중 20 내지 25g 당 NCG가 100 내지 200 mM 농도로 200 ㎕씩 경구투여되었을 때 다른 농도(0, 1, 10, 250, 500mM) 농도로 투여된 경우보다 염증성 장 질환에 대한 예방 및 치료 효과가 우수함을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 약학적 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.
구체적으로, (1) 치료적 유효량의 N-카바밀-L-글루탐산을 투여함으로써 염증성 질환을 치료하는 약학적 조성물, 및 (2) N-카바밀-L-글루탐산을 환자 체중 25g당 0.001mM 내지 300mM 농도로 투여함을 지시하는 패키지 삽입물(package insert)을 포함하는 키트를 제공한다.
상기 약학적 조성물의 제형, 투여 방법, 투여량 및 조성물에 함유되는 유효성분의 농도에 관한 설명은 상기한 것과 동일하다. 상기 패키징 삽입물에는 상술한 투여량을 지시하는 내용이 포함된다. 본 발명의 키트는 약제 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 지시된 형태의 주의사항 등의 내용이 부착된 패키징 삽입물을 부착될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 약학적 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 대상은 인간 또는 인간을 제외한 동물일 수 있으며, 상기 대상은 염증성 질환 특히 염증성 장 질환의 발병 초기 또는 중기 단계의 인간 또는 인간을 제외한 동물일 수 있다.
상기 약학적 조성물의 제형, 투여 방법, 투여량 및 조성물에 함유되는 유효성분의 농도에 관한 설명은, 상기한 것과 동일하다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은, 인간 또는 인간을 제외한 동물의 염증성 질환을 예방하거나 개선할 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 건강기능식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 양은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 건강기능식품 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강을 목적으로 장기간 섭취하는 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있다.
상기 건강기능식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품은 프로바이오틱스 제제일 수 있으며, 예컨대 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료, 비타민 복합제 및 발효 식품등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다. 특히, 상기 발효 식품은 요구르트(하드 타입, 소프트 타입, 드링크 타입), 유산균 음료 등의 발효유, 치즈 또는 버터일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 발효 미생물 또는 유산균이 수행하는 발효에 의해 제조되는 어떠한 식품, 제품이라도 포함될 수 있다.
또한, 상기 건강기능식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 상기 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다. 이러한 상기 첨가되는 성분의 비율은 크게 중요하진 않지만 상기 건강기능식품 조성물 100 중량부에 대하여, 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 사료 조성물은, 인간을 제외한 동물에서 염증성 질환을 예방하거나 개선할 수 있으며, 이를 목적으로 사료첨가제 조성물로 첨가할 수 있다. 상기 사료첨가제는 사료관리법상의 보조사료에 해당한다.
본 발명에서 용어 "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미하며, 상기 동물은 인간을 제외한 동물이다. 상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되지 아니한다.
락토바실러스 루테리 균주의 대사체 중 N-카바밀-L-글루탐산의 장 성숙 촉진 효과 확인
[1-1] 인간 장 오가노이드의 분화
장 오가노이드는 인간 전분화능 줄기세포를 활용해 이를 분화시켜 제조하였다. 인간 전분화능 줄기세포의 분화를 위해 당업계에 알려진 방법(Nature 470, 105-109 (2011))을 이용하였다. 구체적으로, 인간 전분화능 줄기세포(H9 (WA09); WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)의 진정내배엽 유도를 위해, 100 ng/㎖의 액티빈(Activin) A와 함께 3일 동안 태아 소혈청(FBS, Thermo Scientific))이 포함된 배지를 상기 줄기세포에 처리하였고, 상기 태아 소혈청은 각각 0%, 0.2%, 2%로 농도를 높여가면서 처리하였다. 후장(hindgut) 스페로이드 형성을 위하여, 500 ng/㎖의 FGF4, 3 μM의 CHIR 99021 및 2%의 태아 소혈청이 포함된 분화배지를 이용하여 4일 동안 추가배양하였다. 분화가 유도되어 형성된 스페로이드를 마트리젤 돔 내부에 삽입시켜, 3차원 배양 환경에서 1× B27 첨가제(B27 supplement, Invitrogen), 100 ng/㎖ EGF(R&D Systems), 100 ng/㎖ Noggin(R&D Systems), 그리고 500 ng/㎖ R-스폰딘1(R-spondin1, R&D Systems)이 포함된 배양배지에서 배양하였고, 10일에 한번씩 계대배양하여 실험에 이용하였다.
[1-2] 락토바실러스 루테리 균주의 장 성숙 및 장 발달 효과 비교
상기 실시예 [1-1]에 따라 분화시킨 장 오가노이드를 대상으로 여러 종의 유산균 및 동종 락토바실러스 루테리 균주을 처리하고 이에 따른 장 오가노이드의 성숙 여부를 확인하였다.
총 5종의 유산균을 처리하여 각각의 효과를 확인하였고, 유산균 배양액을 처리한 장 오가노이드에서 형태학적 변화를 확인하고, 장의 성숙과 관련된 마커의 발현 여부를 면역형광염색법(immunocytochemistry, ICC)와 qRT-PCR을 통해 확인하였다. 사용한 유산균은 비피도박테리움 롱검 DS0431(B. longum DS0431, 신생아의 분변으로부터 분리), 락토바실러스 가세리 DS0444(L. gasseri DS0444, 모유로부터 분리), 락토바실러스 커바투스 AB70(L. curvatus AB70, 여성 생식기로부터 분리), 락토바실러스 람노서스 DS0979(L. rhamnosus DS0979, 모유로부터 분리) 및 본 발명의 락토바실러스 루테리 DS0384(L. reuteri DS0384, 신생아의 분변으로부터 분리) 균주를 이용하였다. 락토바실러스 루테리 DS0384 균주를 비롯한 5종의 유산균은 혐기 조건으로 37°C 에서 36시간동안 MRS 배지에서 배양하였다.
배양한 상기 5종 미생물 균주의 배양액을 원심분리기를 이용하여 10분간 12,000 rpm으로 원심분리시킨 후 상등액만을 수거하였다. 수거된 상등액을 65 ℃로 예열된 히트블럭(heat block)에서 30분 동안 저온멸균시킨 다음, 0.22 ㎛ syringe filter unit으로 필터링하여 불순물을 제거하였다. 이와 같은 방법으로 분리된 배양액을 상기 장 오가노이드의 배양 배지에 1/100 희석하여 처리하고, 총 20일 동안 2회 계대배양한 후, 장 오가노이드의 변화를 관찰하였다.
먼저, 장 오가노이드의 크기 변화와 발아(budding) 구조의 개수를 확인함으로써 장 오가노이드의 형태학적 변화를 확인하였다. 구체적으로, 장 오가노이드를 현미경으로 관찰하여 찍은 사진을 통해, 각 유산균 처리군별로 6개의 오가노이드의 크기를 측정하여 비교하였고, 발아(budding) 구조의 개수는 각 유산균 처리군별로 6개의 오가노이드에 대해서 각 오가노이드 1개당 생성된 발아(budding) 구조의 개수를 확인하였다.
그 결과, 다른 4가지 종류의 유산균 배양액을 처리한 경우와 비교할 때, 본 발명의 락토바실러스 루테리 DS0384 균주의 배양액을 처리하였을 때, 장 오가노이드가 더 크게 관찰되었고 발아 구조가 더 많이 형성된 것을 확인할 수 있었다(도 1의 a의 위 데이터, 도 1의 b). 대조군에서의 오가노이드 표면적은 0.30±0.02 ㎟으로 측정되었고, 비피도박테리움 롱검 균주 배양액 처리군의 경우 0.27±0.06 ㎟, 락토바실러스 가세리의 경우 0.24±0.05 ㎟, 락토바실러스 커바투스의 경우 0.56±0.08 ㎟, 락토바실러스 람노서스의 경우 0.41±0.10 ㎟, 그리고 락토바실러스 루테리 DS0384 균주 배양액 처리군의 경우 1.10±0.07 ㎟로 측정되어, 락토바실러스 커바투스와 락토바실러스 루테리 DS0384 균주 배양액 처리군에서 오가노이드 크기가 유의성 있게 증가하였고 그 중에서도 락토바실러스 루테리 DS0384 균주 배양액 처리군에서 오가노이드 표면적이 가장 많이 증가하였다(도 1의 b 왼쪽 패널). 발아 구조의 개수 측정 결과, 대조군에서 3.17±0.52개, 비피도박테리움 롱검은 2.33±0.61개, 락토바실러스 가세리는 2.50±0.37개, 락토바실러스 커바투스는 8.83±0.96개, 락토바실러스 람노서스는 4.33±0.78개, 그리고 락토바실러스 루테리 DS0384 균주는 19.67±2.20개의 발아 구조가 형성된 것으로 측정되었다. 락토바실러스 커바투스와 락토바실러스 루테리 DS0384 균주 배양액 처리군에서 발아 개수가 유의성 있게 증가하였고 그 중에서도 락토바실러스 루테리 DS0384 균주 배양액 처리군에서 가장 많이 증가한 것으로 확인되었다(도 1의 b 오른쪽 패널).
또한, 성숙한 장에서 발현되어 나타나는 성숙 장관 마커 단백질의 발현 정도를 면역형광염색을 통해 확인하였다. 마커 단백질로는 성숙 장 줄기세포 마커인 OLFM4, 성숙 파네스 세포(Paneth cell) 마커인 DEFA5, 성숙 장관 구조 단백질 마커인 KRT20, 그리고 점액 생성 세포 마커인 MUC13를 대상으로 하였다.
구체적으로, 상기와 같이 5종 유산균 배양액을 처리한 장 오가노이드를 4% PFA(paraformaldehyde)에 고정시킨 후 10-30%의 수크로오스 용액으로 동결 보호 처리하고 OCT 용액을 처리하여 동결시켰다. 동결된 장 오가노이드 조직을 마이크로톰(microtome)으로 10-20 ㎛ 두께로 절단시켜 박편을 만들고, 0.1%의 트리톤 X-100이 포함된 PBS를 처리하여 박편을 투과시킨 다음 4%의 BSA(bovine serum albumin)을 포함하는 PBS로 1시간 동안 블로킹 시켰다. 상기 4가지 표적 마커 단백질에 대한 1차 항체인 항-OLFM4 항체(ab85046, abcam, Cambridge, MA, USA), 항-DEFA5 항체(ab90802, abcam), 항-KRT20 항체(ab76126, abcam) 및 항-MUC13 항체(ab124654, abcam)를 각각 1:100으로 희석하여 사용하여 4 ℃에서 하룻밤 동안 반응시킨 다음, 2차 항체인 항-염소 항체(anti-goat IgG Alexa Fluor 488, A21467, Invitrogen), 항-토끼 항체(anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594, A21442, Invitrogen), 항-쥐 항체(anti-mouse IgG Alexa Fluor 594, A21203, Invitrogen) 를 각각 1:200 희석하여 사용하여 상온에서 1시간 동안 반응시켜 DAPI 염색으로 핵을 염색한 다음, 형광현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 다른 4가지 종류의 유산균 배양액을 처리한 군에서는 장관의 성숙과 관련된 단백질들의 발현이 관찰되지 않은 것에 반해, 본 발명의 락토바실러스 루테리 DS0384 균주 배양액을 처리한 군에서만 상기 OFLM4, DEFA5, KRT20 및 MUC13 단백질이 염색되어 나타나 장의 성숙 시에 나타나는 단백질들이 발현되어 만들어졌음을 확인할 수 있었다(도 1의 a의 아래 데이터).
나아가, 각 유산균 배양액 처리 장 오가노이드에서의 성숙 장관 마커 유전자들의 발현량을 qRT-PCR을 통해 확인하였다. 성숙 장관 마커 유전자는 CDX2, DPP4, OLFM4, DEFA5, CREB3L3, KRT20, LYZ, LCT, SLC5A1 및 MIC13 유전자를 대상으로 하였다. 배양액이 처리된 장 오가노이드로부터 RNA를 RNeasy 키트(Qiagen)로 제조사의 프로토콜에 따라 분리하여 추출하였고 cDNA 합성을 위한 키트(Superscript IV cDNA synthesis system, Invitrogen)를 이용해 mRNA를 역전사시켜 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 대상으로 하기 표 1에 따른 프라이머를 이용하여 PCR 기기(7500 Fast Real-time PCR system, Invitrogen)로 qRT-PCR을 수행하였다.
그 결과, 본 발명의 락토바실러스 루테리 DS0384 균주의 배양액을 처리한 경우, 대조군과 비교할 때 CDX2 유전자를 비롯한 10종의 장관 성숙 마커 유전자의 발현량이 모두 수배 내지 수천배 증가하여 유의적인 증가량을 확인할 수 있었다(도 1의 c).
서열번호 서열 이름 서열 (5'-> 3')
1 GAPDH forward primer GAAGGTGAAGGTCGGAGTC
2 GAPDH reverse primer GAAGATGGTGATGGGATTTC
3 CDX2 forward primer CTGGAGCTGGAGAAGGAGTTTC
4 CDX2 reverse primer ATTTTAACCTGCCTCTCAGAGAGC
5 DPP4 forward primer CAAATTGAAGCAGCCAGACA
6 DPP4 reverse primer GGAGTTGGGAGACCCATGTA
7 OLFM4 forward primer ACCTTTCCCGTGGACAGAGT
8 OLFM4 reverse primer TGGACATATTCCCTCACTTTGGA
9 DEFA5 forward primer CCTTTGCAGGAAATGGACTC
10 DEFA5 reverse primer GGACTCACGGGTAGCACAAC
11 CREB3L3 forward primer ATCTCCTGTTTGACCGGCAG
12 CREB3L3 reverse primer GTCGTCAGAGTCGGGGTTTG
13 KRT20 forward primer TGGCCTACACAAGCATCTGG
14 KRT20 reverse primer TAACTGGCTGCTGTAACGGG
15 LYZ forward primer AAAACCCCAGGAGCAGTTAAT
16 LYZ reverse primer CAACCCTCTTTGCACAAGCT
17 LCT forward primer GGCAGTCTGGGAGTTTTAGG
18 LCT reverse primer ATGCCAAAATGAGGCAAGTC
19 SLC5A1 forward primer GTGCAGTCAGCACAAAGTGG
20 SLC5A1 reverse primer ATGCACATCCGGAATGGGTT
21 MUC13 forward primer CGGATGACTGCCTCAATGGT
22 MUC13 reverse primer AAAGACGCTCCCTTCTGCTC
상기와 같은 실험 결과를 종합하여 볼 때, 신생아의 분변, 모유, 또는 여성 생식기로부터 분리된 다양한 종류의 유산균들 중에서도, 본 발명의 락토바실러스 루테리 DS0384 균주는 사람의 장 오가노이드에 처리하였을 때 장관의 성숙과 관련된 유전자, 단백질의 발현량을 유의적으로 증가시키는 것으로 확인되었고, 장 오가노이드의 크기를 증가시키고 발아 구조의 형성을 유도하는 등 실제로 장의 발달과 성숙을 촉진하는 효과가 있음을 알 수 있다.
[1-3] 락토바실러스 루테리 DS0384 균주의 장 오가노이드 성숙 촉진 효과 차이 확인
상기 실시예 [1-2]를 통해, 락토바실러스 루테리 DS0384 균주가 다른 종에 속하는 유산균들에 비해 장의 성숙과 발달을 촉진하는 효과가 우수한 것을 확인하였다. 이에, 본 발명의 DS0384 균주를 이와 동일한 종으로 분류되는 다른 균주들과 비교하여 장 오가노이드의 성숙 촉진 효과 차이를 비교 실험하였다.본 발명의 락토바실러스 루테리 DS0384 균주와 비교하기 위하여, 동일하게 락토바실러스 루테리로 분류되는 미생물 중에서, DS0191, DS0195, DS0333, DS0354 균주의 배양액을 장 오가노이드에 처리하고 DS0384 균주 배양액을 처리하였을 때의 효과와 비교하였다. 상기 실시예 [1-2]에서와 동일한 방법을 이용하여 실험하였고, 배양액 처리 후 장 오가노이드의 형태학적 변화를 확인하고, 성숙 장관 마커로 이용되는 단백질과 유전자의 발현량을 면역형광염색과 qRT-PCR을 통해 확인하였다.
그 결과, 다른 락토바실러스 루테리 균주들도 장 오가노이드의 발달을 어느 정도 촉진하는 효과가 있었으나, 본 발명의 DS0384 균주 배양액을 처리하였을 때 장 오가노이드의 구조가 가장 발달하는 것을 확인할 수 있었고(도 2의 a의 위 데이터), 면역형광염색 결과에서도 본 발명의 DS0384 균주 배양액 처리군에서만 OLFM4와 DEFA5 단백질 발현을 확인할 수 있었다(도 2의 a의 아래 데이터). qRT-PCR을 통해 확인한 마커 유전자 발현량 확인 결과에서도, 본 발명의 DS0384 균주 배양액 처리군에서는 8종 유전자 모두의 발현이 대조군에 비해 유의적으로 증가한 것과는 달리, 다른 루테리 균주 배양액 처리군에서는 일부 유전자들은 발현이 증가되지 않는 결과를 보였다(도 2의 b). 특히, DS0384 균주 배양액 처리군에서는 다른 루테리 균주 처리군과는 달리, OLFM4 유전자와 DEFA5 유전자 발현량이 현저하게 증가되어 나타나는 것으로 확인되었다. 상기 OLFM4 유전자는 사람의 소장 및 대장에서 높은 수준으로 발현되며 특히 장의 줄기세포에서 발현되는 마커 유전자에 해당하므로, 장의 발달과 분화에 밀접한 관련성이 있는 것으로 알려져 있다. 상기 DEFA5 유전자는 장의 표면에 풍부하게 존재하는 DEFA5(Defensin alpha 5) 단백질을 암호화하는 유전자로, 성숙한 파네스 세포(Paneth cell)에서 높은 수준으로 발현되는바 이의 마커로 이용된다. 따라서 OLFM4 유전자 및 DEFA5 유전자의 발현량이 다른 미생물 균주 배양액 처리군과는 달리 증가되는 특징을 나타내는 본 발명의 DS0384 균주는, 다른 균주과는 다른 방법으로도 장의 성숙 및 발달을 촉진할 수 있으며 이에 따라 성숙 촉진 효과가 더 현저하게 나타남을 확인할 수 있었다.
상기에서 확인한 4종의 루테리 균주와의 비교 실험 결과에 더하여, 락토바실러스 루테리 DSP007, DS0337 및 KCTC3594 균주와의 추가적인 비교 실험을 통해 락토바실러스 루테리 DS0384 균주의 효과를 재검증하였다. 마찬가지의 방법으로 장 오가노이드에 처리하여 형태학적 변화, 마커 단백질, 유전자의 발현량을 면역형광염색과 qRT-PCR로 확인하였다.
그 결과, 락토바실러스 루테리 DSP007, DS0337, KCTC3594 배양액 처리군에서는 장 오가노이드의 형태학적 성숙화가 적게 나타난 것과 달리, 본 발명 DS0384 균주 배양액 처리군에서는 장 오가노이드의 성숙이 눈에 띄게 확인되었으며, 면역형광염색 결과에서는 OLFM4, DEFA5, KRT20 및 MUC13 단백질의 발현이 DS0384 균주 배양액 처리군에서만 나타났다(도 3의 a). qRT-PCR 결과에서도, DS0384 균주 배양액 처리군에서는 대조군에 비해 10종의 성숙 장관 마커 유전자 발현이 현저하게 증가된 것으로 나타난 것에 반해, 다른 3 종류의 루테리 균주 처리군에서의 발현량은 본 발명 DS0384 균주 처리군에 비해 현저하게 적게 나타났고 오히려 대조군에 비해서도 더 적게 나타난 것을 확인할 수 있었다(도 3의 b).
상기 실험결과로부터, 특히, 루테리와 다른 종으로 분류되는 유산균 균주들에서는 장 성숙 촉진 효과가 나타나지 않았으며, 락토바실러스 루테리에 속하는 다른 종류의 균주 배양액 처리군들에 비해서도 DS0384 균주의 장 성숙 촉진 효과가 현저하게 우수한 것으로 나타나, 락토바실러스 루테리 DS0384 균주의 배양액은 장 성숙 또는 장 발달과 관련된 특이적인 활성 성분이 있는 것을 알 수 있었다.
[1-4] 락토바실러스 루테리 DS0384 균주의 배양 조건 최적화
락토바실러스 루테리 DS0384 균주의 배양 조건에 따른 장 성숙 촉진 효과를 확인하기 위해, 배양 시간을 달리하여 수득한 배양액에서 상기 실시예 [1-2]와 같은 방법으로 장 성숙 촉진 효과를 확인하였다.
구체적으로, 본 발명의 락토바실러스 루테리 DS0384 균주를 6시간, 12시간, 18시간 및 24시간 동안 배양하면서 각 시간 별로 수득한 배양액을 이용하여, 장 오가노이드에 처리하고 장 오가노이드의 형태적 변화와 함께 CDX2 유전자를 비롯한 10종의 장관 성숙 마커 유전자의 발현량을 상기 실시예 [1-2]와 동일한 방법으로 qRT-PCR을 통해 측정하였다.
그 결과, 상기 락토바실러스 루테리 DS0384 균주의 배양액을 처리한 경우 장 오가노이드의 형태적 변화가 확연하게 나타났을 뿐만 아니라, 상기 10종의 장관 성숙 마커 유전자의 발현량 역시 DS0384 균주의 배양액 처리군에서 현저하게 증가함을 확인할 수 있었다(도 4). 특히 상기 DS0384 균주 배양액을 18시간 이상 배양하여 수득한 배양액(18시간, 24시간 배양)을 처리한 장 오가노이드에서는 상기 성숙 장 마커 유전자의 발현량이 유의성 있게 증가하였다.
상기 실험 결과로 볼 때, 락토바실러스 루테리 DS0384 균주 또는 이의 배야액은 장 성숙 촉진 효과가 다른 락토바실러스 루테리 균주들보다도 우수한 균주임을 다시 한번 확인할 수 있었으며, 또한 상기 DS0384 균주를 18시간 이상, 예컨대 18시간 또는 24시간 배양한 후 수득한 이의 배양액에서 장 성숙 촉진 효과가 더욱 우수하게 나타나, DS0384 균주를 배양함에 따라 생성되는 대사산물이 증가함을 알 수 있었다.
[1-5] 락토바실러스 루테리 DS0384 균주의 대사체 분석
락토바실러스 루테리 DS0384 균주의 배양액에 존재하는 것으로 추정되는 특이적인 활성 성분을 통정하기 위해, 배양액에 존재하는 대사체 분석을 수행하였다.
락토바실러스 루테리 DS0384 균주의 배양액에 대하여 모세관 전기영동 질량 분석기(CE-TOFMS)를 이용하여 상기 균주의 대사체 분석을 수행하였다. 구체적으로, 이온성 대사체 분석을 수행하기 위해 락토바실러스 루테리 DS0384, KCTC3594 및 DS0195 균주의 배양액 상등액 80 μL을 내부 표준(1mM)을 포함하는 Mili-Q-water 20 μL 와 혼합한 뒤 제조사의 지침에 따라 모세관 전기영동 질량 분석 수행하였다.
질량 분석 결과, 양이온 모드에서 189개, 음이온 모드에서 86개로, 총 275개의 피크가 검출되었다. 각 피크는 m/z(질량 대 전하비)값, 피크 면적 및 마이그레이션 시간을 포함한 피크 정보를 기반으로 HMT 데이터베이스에 따라 분석하였고, 각 피크의 면적은 내부 표준 및 샘플의 양으로 정규화되어 각 대사산물의 상대적인 양을 측정하였다. 피크 분석을 통해 검출된 대사 산물을 VATED 소프트웨어를 사용하여 대사 경로 맵을 작성하였다.
이를 분석한 결과, 다른 락토바실러스 루테리 균주에 비해 DS0384의 배양액에서 14개의 대사산물이 더 검출되는 것으로 확인되었다(도 5).
[1-6] N-카바밀-L-글루탐산의 장 성숙 촉진 효과 확인
장의 성숙 또는 발달과 관련된 생리활성 대사산물을 동정하기 위해, 상기 실시예 [1-5]의 대사체 분석을 통해 DS0384의 배양액에서 다른 루테리 균주의 배양액 대비 더 많이 포함되어 있는 14개의 대사산물 중 차등적으로 많이 포함된 성분 7개를 선별하여 각각 장 오가노이드에 처리한 후 장 오가노이드의 성숙화 여부를 확인하였다.
상기 14개의 대사산물 중 차등적으로 많은 양으로 포함된 7개의 대사 산물(숙신산, 히스티딘, 잔틴, CMP, 6-ACA, NCG, 및 SCMC)을 이용하여 상기 실시예 [1-2]와 같은 방법으로 장 오가나이드에서 장 성숙 및 장 발달 촉진효과가 있는지 확인하였다.
7개의 대사산물은 제조사의 지침(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에 따라 합성하였다. 숙신산(1 mM), 히스티딘(100 μM), 잔틴(14 μM), CMP(1 mg/mL), 6-ACA(30 μM), NCG(1 mM), 및 SCMC(10 μM)는 인간 장 오가나이드 배양 배지에 첨가되었고, 배지는 매일 교체하였다. 각 대사산물을 처리한 인간 장 오가나이드 2세대동안 계대 배양하였다. 이 후 상기 실시예 [1-2]와 같은 방법으로, 각 대사산물을 처리한 오가노이드를 10μm 섹션으로 절단하여 샘플을 제조하고, 상기 샘플에 마커 단백질로는 성숙 장 줄기세포 마커인 OLFM4, 성숙 파네스 세포(Paneth cell) 마커인 DEFA5, 성숙 장관 구조 단백질 마커인 KRT20, 그리고 점액 생성 세포 마커인 MUC13를 표적으로 하는 1차 항체를 샘플에 처리하여 4°C에서 밤새 배양하였다. 이후 2차 항체를 처리하여 상온에서 1시간 동안 반응시켜 DAPI 염색으로 핵을 염색한 다음, 형광현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, N-카바밀-L-글루탐산(NCG)의 경우 다른 6개의 대사산물 보다 장 오가노이드 발아 구조 발달 및 마커 발현의 정도가 크게 증가하였다. 또한, 도 7 및 도 8에 나타난 바와 같이, NCG는 배양액을 처리한 실험군과 유사한 정도로 장 발달 및 장 성숙의 정도가 가장 우수하였다. 이를 통해, DS0384의 배양액에서 장 발달 및 성숙 효과를 나타내는 주요한 생리활성 성분이 N-카바밀-L-글루탐산(NCG)임을 알 수 있었다.
[2-1] 대장염 장 오가노이드의 제작
N-카바밀-L-글루탐산이 염증성 장 질환에 대해 치료 효과가 있는지 확인하기 위해, 먼저 대장염 장 오가노이드를 제작하였다.
상기 실시예 [1-1]에 따라 분화시킨 장 오가노이드를 배양한 10일 차에 전염증성 사이토카인(125 ng/ml IFNγ 및 125 ng/ml TNFα)을 3일간 처리하여 장 오가노이드에 대장염을 유발하였다.
전염증성 사이토카인과 NCG를 동시에 처리하여, NCG가 염증으로부터 장 보호 효능이 있는지 확인하였다. 하기 실시예 3와 같은 방법으로 정상 장 오가노이드, 대장염 장 오가노이드, 1 mM NCG 처리 장 오가노이드에서 형태학적 변화를 관찰하고, 조직학적 변화와 뮤신 염색을 통한 장 기능성 변화를 확인하였다. 장벽의 기능성(ZO-1)과 장 줄기세포 증식(Ki-67)을 확인하기 위해 면역형광염색을 한 다음, 형광현미경으로 관찰하였다. IL-1β, IL-6, IL-8 및 TNFα와 같은 염증의 지표 및 장 상피 구조(VIL1, EPCAM, KRT20), 장벽 기능성(CLAUDIN), 장 내 배상세포(MUC2), 파네스 세포(LYZ)의 발현 양상을 qRT-PCR을 통해 확인하였다.
[2-2] 궤양성 대장염 동물 모델의 제작
N-카바밀-L-글루탐산이 염증성 장 질환에 대해 치료 효과가 있는지 확인하기 위해 궤양성 대장염 동물 모델을 제작하였다.
구체적으로 실험은 5~7주령, 20~25g(20g 이상) 수컷 C57BL/6J 마우스(DBL, Eumseong, Korea)를 정상군, 대조군, 및 실험군으로 분류하여 진행하였다. 정상군 아무런 처치를 하지 않은 군이며, 대조군과 실험군은 2 내지 2.5% DSS를 음용수에 섞어 투여하여 궤양성 대장염을 유발하였다.
DSS 투여 후 초기 증상이 발현되는 3일 기간(4~6일차)의 무게 증가율 변화를 관찰하고, 세트별 해당일 무게 증감 평균의 표준편차를 계산하여 2회 이상 표준편차의 하한선을 벗어난 마우스는 실험분석에서 제외하였다. 초기 증상이 빠르게 유발된 마우스(2회 이상 표준편차의 하한선을 벗어난 마우스)는 IACUC 기준(20% 이상 체중 감소 마우스 인도적 조치)에서 대부분 제외해야 하는 그룹에 속하였다. 또한, 초기 DSS 유도 증상 기간(4~6일차) 표준편차에서 벗어난 마우스는 그룹내 큰 변동성을 야기하므로. 통계적 유의성을 확보하기 위하여 각 조건 별 3개 또는 이상 세트의 반복실험으로 구성하였고(그룹 당 n>6), 모든 실험은 KRIBB(Approval No: KRIBB-AEC-21245)의 기관 동물관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)로부터 승인을 받은 후에 수행하였다.
궤양성 대장염의 임상 증상은 DSS 또는 음용수를 투여하는 시점부터 마우스를 인도적으로 안락사 후 장을 분리하는 시점까지 총 15일간 장 염증 질환의 중요한 표지자인 체중 변화, 분변의 형태 및 분변 내 잠혈 여부를 매일 측정하여 평가하였다.
궤양성 대장염의 조직학적 분석 방법
[3-1] 조직 표본 준비
마우스의 복부를 정중절개하고 소화관을 전체적으로 적출하였다. 분리한 소화관 조직에서 대장의 길이를 측정하고, 적출한 대장을 두 부위(결장 근위부, 결장 원위부)로 나누어 시료를 채취하였으며, 10% 포르말린에 고정한 후 동결보호제로 수크로오스를 첨가하고 동결시켰다. 이 후, 영하 20℃에서 10 μm두께로 절단하여 절편을 조직 절편을 제작하였다.
[3-2] 조직학적 염색 및 병변 평가 방법
조직학적 분석을 위해, 냉동 조직 절편을 슬라이드 글라스에 접착시킨 후 헤마톡실린에서 3 내지 5분 동안 염색하고, 흐르는 물에 수세를 거친 후 에오신 염색을 진행하였다. 이 후, 에탄올(Ethanol)을 농도별로 거치면서 탈수(dehydration)시킨 후 크실렌(Xylene)을 이용하여 세척하고 봉입하였다. 슬라이드는 광학 현미경(BX53F, Olympus, Japan)을 이용하여, 조직학적 병변을 관찰하였다. 조직학적 병변은 하기 표 2와 같은 기준으로 염증반응의 감소, 면역세포 침투 완화, 배상세포 감소 완화, 음와와 융모 구조 유지 정도를 관찰한 후 수치화하였다.
조직학적 특징 점수 설명
상피층 소실
(Loss of epithelium)		 0 없음
1 0-5% 소실
2 5-10% 소실
3 10% 이상 소실
음와 손상(Crypt damage) 0 없음
1 0-10% 손상
2 10-20% 손상
3 Over 20% 손상
배상세포의 감소
(Depletion of goblet cells)		 0 없음
1 경증(Mild)
2 중증도(Moderate)
3 중증(Severe)
염증세포의 침투
(Infiltration of inflammatory cells)		 0 없음
1 경증(Mild)
2 중증도(Moderate)
3 중증(Severe)
[3-3] 뮤신 염색(AB-PAS staining)성숙한 배상세포에서 방출하는 뮤신 점액질을 염색하는 AB-PAS 염색 기법을 이용하여 장 오가노이드 및 동물 모델 장 조직에서 성숙한 기능성 배상세포를 관찰하였다. 상기와 같이 제작한 10 μm두께인 조직 절편을 슬라이드 글라스에 접착시킨 후 Alcian Blue PAS Stain Kit를 사용하여 염색을 진행하였다. 이 후, 에탄올(Ethanol)을 농도별로 거치면서 탈수(dehydration)시킨 후 크실렌(Xylene)을 이용하여 세척하고 봉입하였다. 슬라이드는 광학 현미경(BX53F, Olympus, Japan)를 이용하여 장 조직에서 뮤신 점액질을 관찰하였다.
[3-4] 조직 면역형광염색
먼저 상기 실시예 [3-1]과 같은 방법으로 제작한 조직 표본을 슬라이드에 접착시킨 후, 면역형광염색을 위해 0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 PBS로 투과시켰다. Tween 20이 함유된 PBS로 3회 수세 후, 4% BSA로 블로킹하고, 조직을 4℃에서 하룻밤 동안 1차 항체와 반응시켰다. 이후, 상온에서 1시간 동안 2차 항체와 반응시켰다. 사용한 1차 항체는 하기 표 3에 나타내었다. DAPI는 핵을 시각화하기 위해 추가하였다. 슬라이드는 EVOS FL Auto2(ThermoFisher)와 Axiovert 200M 현미경 (Carl Zeiss, Gottingen, Germany) 또는 형광 현미경(IX51, Olympus, Japan)을 통해 관찰하였다.
항체 Catalog No. 회사 희석
anti-E-cadherin AF648 R&D 1:200
anti-E-Cadherin 610182 BD Biosciences 1:200
anti-ZO-1 61-7300 Thermo Fisher Scientific 1:200
anti-Claudin-1 ab15098 abcam 1:200
anti-TNFα ab6671 abcam 1:200
anti-IL-17 ab79056 abcam 1:200
anti-IFNγ ab9657 abcam 1:100
anti-iNOS ab49999 abcam 1:200
anti-CD11b ab133357 abcam 1:200
anti-F4/80 ab6640 abcam 1:50
anti-Ki67 ab15580 abcam 1:500
anti-Ki67 AB9260 Chemicon 1:200
anti-Mucin2 sc-7314 Santa Cruz 1:50
궤양성 대장염의 유전적 분석 방법
[4-1] 정량적 실시간 RT-PCR(qRT-PCR)
전체 RNA는 easy-BLUE™ kit(iNtRON Biotechnology)를 이용해 세포로부터 추출하였고 TOPscript™ RT DryMIX(dT18)(Enzynomics)를 이용해 역전사 시켰다. qRT-PCR은 7500 Fast Real-time PCR 시스템(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)에서 공지된 방법으로 수행하였다(Cho et al., Oncotarget 6, 23837-23844, 2015). 모든 실험들은 3 번 반복했고, 각 타겟 유전자의 CT 값은 제조사가 제공한 소프트웨어를 이용해 계산하였다. 대장염 장 오가노이드의 분석에 사용된 프라이머는 표 4에, 궤양성 대장염 동물 모델의 분석에 사용된 프라이머는 하기 표 5에 나타내었다.
서열번호 서열 이름 서열 (5'-> 3')
1 GAPDH forward primer GAAGGTGAAGGTCGGAGTC
2 GAPDH reverse primer GAAGATGGTGATGGGATTTC
23 CLAUDIN forward primer CCGTTGGCATGAAGTGTATG
24 CLAUDIN reverse primer CATTGACTGGGGTCATAGGG
25 EPCAM forward primer TAAGGCCAAGCAGTGCAAC
26 EPCAM reverse primer GCGTTGTGATCTCCTTCTGA
27 IL-1β forward primer AATCTGTACCTGTCCTGCGTGTT
28 IL-1β reverse primer TGGGTAATTTTTGGGATCTACACT
29 IL-6 forward primer CTCCTTCTCCACAAGCGCC
30 IL-6 reverse primer AAGGCAGCAGGCAACACC
31 IL-8 forward primer AGTTTTTGAAGAGGGCTGAGA
32 IL-8 reverse primer TGCTTGAAGTTTCACTGGCATC
13 KRT20 forward primer TGGCCTACACAAGCATCTGG
14 KRT20 reverse primer TAACTGGCTGCTGTAACGGG
15 LYZ forward primer AAAACCCCAGGAGCAGTTAAT
16 LYZ reverse primer CAACCCTCTTTGCACAAGCT
33 MUC2 forward primer TGTAGGCATCGCTCTTCTCA
34 MUC2 reverse primer GACACCATCTACCTCACCCG
35 TNFα forward primer GGAGAAGGGTGACCGACTCA
36 TNFα reverse primer CTGCCCAGACTCGGCAA
37 VIL1 forward primer AGCCAGATCACTGCTGAGGT
38 VIL1 reverse primer TGGACAGGTGTTCCTCCTTC
서열번호 서열 이름 서열 (5'-> 3')
39 β-actin forward primer AGC CAT GTA CGT AGC CAT CC
40 β-actin reverse primer CTC TCA GCT GTG GTG GTG AA
41 Tnfα forward primer GAA CTG GCA GAA GAG GCA CT
42 Tnfα reverse primer AGG GTC TGG GCC ATA GAA CT
43 Il-6 forward primer AGT TGC CTT CTT GGG ACT GA
44 Il-6 reverse primer CAG AAT TGC CAT TGC ACA AC
45 Il-1β forward primer GCC CAT CCT CTG TGA CTC AT
46 Il-1β reverse primer AGG CCA CAG GTA TTT TGT CG
47 Il-17a forward primer GCT CCA GAA GGC CCT CAG A
48 Il-17a reverse primer AGC TTT CCC TCC GCA TTG A
49 Ifnγ forward primer GGC CAT CAG CAA CAA CAT AAG CGT
50 Ifnγ reverse primer ACC TGT GGG TTG TTG ACC T
51 iNos forward primer CGA GGA GCA GGT GGA AGA CT
52 iNos reverse primer TGG AAC TCT GGG CTG TCA GA
53 Fzd7 forward primer GAC CAA GCC ATT CCT CCG TG
54 Fzd7 reverse primer CAG GTA GGG AGC AGT AGG GTA
55 Tcf7 forward primer AGC TTT CTC CAC TCT ACG AAC A
56 Tcf7 reverse primer AAT CCA GAG AGA TCG GGG GTC
57 Ror1 forward primer TGA GCC GAT GAA TAA CAT CAC AA
58 Ror1 reverse primer CAG GTG CAT CAT TCT TGA ACC A
59 Axin2 forward primer TGA CTC TCC TTC CAG ATC CCA
60 Axin2 reverse primer TGC CCA CAC TAG GCT GAC A
[4-2] RNA 시퀀싱 및 RNA 정량
RNA 염기순서 결정과 정량화을 위해, RNA 샘플은 Agilent 2100 Bioanalyzer system(Agilent Biotechnologies, Palo Alto, USA)을 통해 RNA Integrity Number(RIN) 값이 7.5 이상인 것으로 준비하였다. mRNA 라이브러리는 Illumina TruSeq 키트를 통해 준비되었고, Illumina HiSeq2500 machines(Illumina, San Diego, CA, USA)을 통해 시퀀싱을 수행하였다. FastQC package를 통해 시퀀싱 퀄러티를 결정하고, 트림된 길이(trimmed read length)가 50 염기 이하는 제외하였다. 그 후 HISAT2(v2.0.5)를 통해 맵핑을 수행하였고, 인간 유전체 정보는 hg19를 활용하였다. Cuffquant와 Cuffnorm(Cufflinks v2.2.1)를 통해 샘플간 차별적으로 발현된 유전자(DEG: differentially expressed gene)를 분석하였다.
[4-3] 생물정보학적 분석
생물정보학적 분석은 IPA 분석 소프트웨어(Ingenuity systems, Redwood City, CA, USA), PANTHER(Protein ANalysis THrough Evolutionary Relationships, http://www.pantherdb.org) 데이터베이스 및 DAVID 생물정보학 리소스 6.7(http://david.abcc.ncifcrf.gov)를 사용하여 진행하였다. 계층적 클러스터링 및 히트 맵은 MeV v 4.9.0 소프트웨어를 이용하여 분석을 수행하였다.
[4-4] 통계 분석(Statistical analysis)
본 명세서에 기재된 모든 실험 결과는 평균에 대한 평균 ± 표준 오차(s.e.m)로 표현되며, 모든 실험은 최소 3회 반복되었다. P값은 양측 t-검정 또는 단측 ANOVA를 사용하여 결정하였다. 통계적 유의성에 대한 모든 분석은 달리 명시하지 않는 한 정상군 또는 대조군과 비교하여 계산하였다.
대장염 장 오가노이드에서 장 보호 효과 확인
먼저 NCG의 궤양성 대장염에 대한 장 보호 효능을 확인하기 위하여, NCG를 처리한 대장염 장 오가노이드에서 대장염을 평가하였다.
상기 실시예 [2-1]와 같이 장 오가노이드에 대해서 3일간 IFNγ/TNFα과 NCG를 동시에 처리하여, NCG가 염증으로부터 장 보호 효능이 있는지 관찰하였다. 그리고 상기 실시예 3에 기재된 바와 같이, 장의 주요 기능 중 하나인 뮤신의 분비 및 배상세포는 뮤신 점액질을 염색하는 기법(AB-PAS staining) 및 MUC2 면역형광분석을 수행하였다. 유전자 수준에서 qRT-PCR 분석을 통해 전염증성 사이토카인(IL-1β, IL-6, IL-8 및 Tnfα) 및 장 상피 세포 및 구조(VIL1, EPCAM, KRT20), 장벽 구조(CLAUDIN), 배상세포(MUC2), 파네스세포(LYZ)의 발현을 비교하였다.
그 결과, 장 오가노이드에서 전염증성 사이토카인(IFNγ/TNFα) 처리 72시간 후, 발아 구조와 오가노이드의 크기가 감소했으나, NCG 처리군은 정상적인 장 상피 구조와 유사하게 발아 구조 및 표면적이 유지되었다(도 9b 및 9c). H&E 염색 및 뮤신 염색을 통하여, NCG 처리군은 정상 장 오가노이드와 유사한 수준으로 배상세포 및 점액층이 유지됨을 확인하였다(도 9d). 또한, NCG 처리군은 대장염 유사 장 오가노이드에 비해 장벽의 기능성(ZO-1)이 회복되고, 장 줄기세포 증식 마커(ki-67)를 발현하는 세포가 감소되지 않고, 장 상피 구조(ECAD) 마커 대비 장벽 구조(ZO-1)의 발현양이 증가하였다(도 9e).
또한, 유전자 수준에서도 장 오가노이드에 대해 IFNγ/TNFα 처리하여 염증을 유발한 경우 IL-1β, IL-6, IL-8 및 TNFα와 같은 염증성 사이토카인의 발현이 증가하였으나, NCG 동시 처리에 의해 염증성 사이토카인의 발현은 감소하였다, 장 상피 세포 및 구조(VIL1, EPCAM, KRT20), 장벽 구조(CLAUDIN), 배상세포(MUC2), 파네스세포(LYZ)의 발현이 증가함을 확인하였다(도 9f),
위와 같은 결과를 통해, NCG는 대장염에 대해 장을 보호하는 효과가 있음을 확인하였다.
궤양성 대장염 보호제제로서 NCG 효과 확인 및 적정 투여 농도 분석
NCG의 궤양성 대장염에 대한 보호 효능을 확인하기 위하여, NCG를 경구투여한 동물 모델에서 궤양성 대장염을 평가하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1에서 준비한 체중 20~25g 마우스 중 실험군은 음용수를 8일간 처리하면서 다른 농도(0, 1, 10, 100, 200, 250, 500 mM)의 NCG를 매일 200 μl 경구투여 하였으며, 이후 7일간 2% DSS 음용수로 대장염을 유발하고, NCG 또한 7일간 경구투여하였다(도 10a). 대조군은 DSS를 처리한 후 PBS를 복강 내 주사하였다. 이 후 상기 실시예 2 및 실시예 3에 기재된 방법에 따라, 총 15일간 장 염증 질환의 중요한 표지인 체중 증감, 분변의 형태 및 분변 내 잠혈 여부를 관찰하였다.
그 결과, 대조군 및 다른 농도(1, 10, 250, 500 mM)의 실험군에 비해 100, 200 mM NCG 실험군에서 체중이 증가되었음을 확인하였다(도 10b). 또한, 궤양성 대장염 대조군과 비교하였을 때, 100, 200 mM NCG 투여 실험군에서 대장의 길이가 회복되며, 분변의 형태가 정상군과 같이 덩어리 형태로 변화함을 확인하였다(도 10c 및 10d).
또한, 상기 실시예 3에서와 같은 방법으로 조직학적으로 분석한 결과, 100, 200 mM의 NCG를 경구 투여한 실험군에서 대조군에 비해 염증반응이 감소하고, 면역세포의 침투 및 배상세포 감소 정도가 완화되고, 음와와 융모 구조가 유지됨을 확인하였다(도 10e). 위와 같은 실험 결과를 통해, NCG는 궤양성 대장염에 대해 치료 효과를 나타내며, 치료 효과를 나타낼 수 있는 NCG의 적정 농도 범위는 100 내지 200 mM임을 알 수 있었다.
궤양성 대장염 치료제로서 NCG의 효과 확인
[7-1] NCG의 투여에 의한 궤양성 대장염 치료 효과 확인
NCG의 궤양성 대장염에 대한 치료 효능을 확인하기 위하여, 궤양성 대장염 동물 모델에 NCG를 경구 투여하여 궤양성 대장염을 평가하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2에서 준비한 마우스에 2~2.5% DSS 음용수를 8일간 투여하여 대장염 유발 후 DSS 음용을 중지하고, 7일간 음용수를 투여하였다. 실험군은 궤양성 대장염 초기 증상인 무게 증가율 변곡점, 무른변 및 설사 관찰 시점인 5일차부터 다양한 농도(0, 10, 50, 100, 200, 500 mM)의 NCG를 10일간 매일 200 μl 경구투여 하였고, 대조군은 PBS를 복강내 주사하였다(도 11a). 상기 실시예 3 내지 4에 따라 총 15일간 장 염증 질환의 중요한 표지자인 체중 증감, 분변의 형태 및 분변 내 잠혈 여부를 관찰하고, 조직학적 분석 및 염증 지표의 유전자 발현 수준을 비교하였다.
그 결과, PBS 대조군에 비해 NCG를 투여한 실험군에서 대체로 몸무게 회복을 보였으나, 특히 100, 200 mM 실험군에서 유의적으로 체중이 증가함을 확인하였다(도 2b). 또한, 궤양성 대장염 대조군과 비교하였을 때, 100, 200 mM NCG 투여 실험군에서 대장의 길이가 회복되며, 분변의 형태가 정상군과 같이 덩어리 형태로 변화함을 확인하였다(도 11c 및 11d).
또한, 조직학적으로 분석한 결과, 100, 200 mM의 NCG를 경구 투여한 실험군에서 대조군에 비해 염증반응이 감소하고, 면역세포의 침투 및 배상세포감소가 완화되고, 음와와 융모 구조가 유지됨을 확인하였다(도 12a 및 12 b). 위와 같은 실험 결과를 통해, NCG는 궤양성 대장염에 대해 치료 효과를 나타내며, 치료 효과를 나타낼 수 있는 NCG의 적정 투여 범위는 100 내지 200 mM임을 알 수 있었다.
[7-2] NCG의 투여에 의한 장벽 기능 회복 효과 확인
NCG가 궤양성 대장염 모델에서 장벽의 기능을 회복시키는 효능이 있는지 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 3에 기재된 바와 같이, 장의 주요 기능 중 하나인 뮤신의 분비 및 배상세포는 뮤신 점액질을 염색하는 기법(AB-PAS staining) 및 MUC2 면역형광분석을 수행하였다.
그 결과, PBS 대조군 또는 다른 농도의 실험군보다 100, 200 mM의 NCG 실험군에서 유의하게 배상세포의 기능성 회복 정도가 우수하고 뮤신 분비가 증가한 것을 확인하였다. 특히, 100mM NCG 처리시, 장 상피 전반에 걸친 뮤신의 분비와 정상군과 유사한 수준의 배상세포 발현을 확인하였다(도 12c 및 12d).
또한, 도 13에 나타난 바와 같이 면역형광염색을 통해 장벽 기능성 관련 단백질(ZO-1, CLDN1)과 장 상피 구조 단백질(ECAD)의 발현이 증가함을 확인하여, 대조군에 비해 확연하게 장의 구조가 회복되었음을 확인하였다.
[7-3] NCG의 투여에 의한 염증도 완화 효과 확인
NCG가 궤양성 대장염의 염증에 미치는 영향을 평가하기 위해, 단백질 또는 유전자 수준에서 장내 전염증성 사이토카인, 염증 관련 효소의 분비 및 면역세포의 침윤현상을 관찰하여 염증도를 평가하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2와 방법으로 조직 면역형광염색 및 상기 실시예 3과 같은 방법으로 유전적 분석 방법을 통해 단백질 또는 유전자 수준에서 장내 전염증성 사이토카인, 염증관련 효소의 분비 및 면역세포의 침윤현상을 관찰하였다. 면역형광염색을 통해 전염증성 사이토카인(TNFα, IFNγ, IL-17), 염증 관련 효소(iNOS) 분비와 면역세포(myeloid cells; CD11b+, macrophages; F4/80+)침윤 현상을 분석하였다. 유전자 수준에서 qPCR 분석을 통해 전염증성 사이토카인(Il-6, Il-1β, Tnfα, Il-17a) 및 산화 질소 지표 iNos의 발현양을 측정하였다.
그 결과, 위와 같은 염증 현상 및 지표는 정상군에 비해 대장염 대조군에서 발현이 증가하고, 100mM 또는 200mM NCG 처리 실험군에서 확연히 감소하는 것을 확인하였다(도 14a). 또한, 유전자 수준에서도 전염증성 사이토카인(Il-6, Il-1β, Tnfα, Il-17a) 및 iNos의 발현양 또한 100 또는 200 mM NCG 처리 실험군에 감소함을 확인하였으며, 특히 100mM NCG 처리군에서 모든 염증 지표가 유의적으로 감소함을 확인하였다(도 14b).
위와 같은 실험결과를 통해, 처리 농도에 따라 NCG 치료 효과가 다름을 재차 확인하였으며, 특히 100 mM의 NCG가 궤양성 대장염 치료에 효과를 보이고 있음을 알 수 있었다.
궤양성 대장염 치료제로서 NCG의 주요 기작 분석
궤양성 대장염에서 NCG의 치료 효능의 주요 기작을 확인하기 위해, 정상군, 대장염 대조군, 100, 200 mM NCG 처리 실험군의 RNAseq 기반 유전체 분석을 진행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 3과 같은 방법으로 유전적 분석을 진행하였으며, RNA 시퀀싱 데이터로부터 정상군, 궤양성 대장염 대조군, NCG 실험군의 유전체를 스피어만 상관계수(Spearman’s correlation) 통해 비교 분석하여 총 21,823의 유전자 분석을 진행하였다(도 15a 및 15b). 대장염 대조군에서 감소하고, 100 mM NCG 실험군에서 정상군 수준으로 발현이 증가하는 유전자 238개를 DEG의 GO 분석을 수행한 결과, Wnt 신호 경로가 주요 기작임을 확인하였다(도 15c 내지 15e). 그러나 이에 반해 100 mM NCG 실험군에서 Cps1의 발현 수준은 궤양성 대장염 대조군과 비교하여 유의한 차이가 나지 않음을 확인하였다(도 15h).
유전체 분석 결과를 검증하기 위하여 qPCR 분석을 수행하였고 대장염 대조군에서 감소했던 Wnt 신호 경로와 관련 주요 유전자(Fzd7, Tcf7, Ror1, Axin2)들은 모두 100mM NCG 처리군에서 유의적으로 발현이 증가하였음을 확인하였다(도 15f). 또한, 면역형광화학염색을 통해 장 줄기세포의 증식 마커(Ki-67)의 발현을 확인한 결과, 정상군에 비해 대장염 대조군에서 감소하나, 100mM NCG 처리시 확연히 증가함을 확인하였다(도 15g).
위와 같은 결과를 통해, NCG는 적정농도인 100 mM 농도로 처리하였을 때, Cps1의 발현에 영향을 미치지 않으며 Wnt 신호 경로를 활성화시키거나 Ki-67의 발현을 증가시킴으로써 장 줄기세포의 증식을 촉진하고, 이를 통해 궤양성 대장염의 치료 효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있다.
NCG의 독성 및 부작용의 부존재 확인
정상군에서 NCG의 영향을 확인하기 위하여, 궤양성 대장염으로부터 보호 및 치료 효능이 있는 100mM NCG 처리 실험군의 표현형을 정상군과 비교하였다.
구체적으로, 정상군 마우스에 음용수 5일차부터 PBS 또는 NCG를 10일동안 경구로 투여하였으며, 10일간 임상적 증상을 관찰하였다(도 16a). 총 15일간의 체중 증감을 관찰한 결과, 정상군에 비해 100mM NCG 처리군에서 체중이 더 증가하는 양상을 보였으나, 9일차를 제외하고 대부분 유의적인 차이를 보이지는 않았다(도 16b). 또한, 적출한 대장의 길이에서는 유의한 차이가 없었으며, 분변의 형태도 덩어리 형태로 대조군과 유사하여 독성이 없음을 확인하였다(도 16c).
장의 조직학적 분석 결과도 마찬가지로, 정상군과 유사하게 100 mM NCG 처리에도 음와와 융모 구조를 유지하는 것을 확인하였으며, AB-PAS 염색과 MUC2 면역형광염색을 통해 배상세포의 증감에 큰 변화가 없는 것을 확인하여 뮤신의 분비 기능에 영향이 없음을 확인하였다(도 16d 및 16e).
유전자 수준에서 앞서 확인한 궤양성 대장염의 대표적 염증지표인 전염증성 사이토카인(Il-6, Il-1β, Tnfα, Ifnγ, Il-17a) 및 염증 관련 효소(iNOS)의 발현양에 유의적 변화가 없음을 확인하였다(도 16f). 위와 같은 실험결과로부터, 정상군에 상기 농도(100mM)의 NCG를 단독처리 하였을 때, 독성 및 부작용이 없음을 알 수 있었다.

Claims (15)

  1. 락토바실러스 루테리 DS0384 균주를 배양하는 단계;를 포함하는 N-카바밀-L-글루탐산(N-carbamyl-L-glutamic acid)을 생산하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 균주의 배양액을 분리하는 단계;를 더 포함하는 N-카바밀-L-글루탐산(N-carbamyl-L-glutamic acid)을 생산하는 방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 균주의 배양액에서 N-카바밀-L-글루탐산을 정제하는 단계;를 더 포함하는, N-카바밀-L-글루탐산(N-carbamyl-L-glutamic acid)을 생산하는 방법.
  4. N-카바밀-L-글루탐산(N-carbamyl-L-glutamic acid)을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 치료용 약학적 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 N-카바밀-L-글루탐산은 락토바실러스 루테리에 DS0384 균주에 의해 생산된 것인, 조성물.
  6. 청구항 4에 있어서,
    상기 염증성 질환은 염증성 장 질환인 것인, 조성물.
  7. 청구항 6에서,
    상기 염증성 장 질환은 궤양성 대장염 또는 크론병인 것인, 조성물.
  8. 청구항 4에서,
    상기 N-카바밀-L-글루탐산은 1mM 내지 300mM의 농도로 포함되는 것인, 조성물.
  9. 청구항 4에 있어서,
    상기 N-카바밀-L-글루탐산은, iNOs의 발현을 감소시키는 것인, 조성물.
  10. 청구항 4에 있어서,
    상기 N-카바밀-L-글루탐산은, ZO-1, CLDN1 및 ECAD으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현을 증가시키는 것인, 조성물.
  11. 청구항 4에 있어서,
    상기 N-카바밀-L-글루탐산은, TNFα, IFNγ, Il-6, Il-8, Il-1β 및 IL-17 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 전염증성 사이토카인의 발현을 감소시키는 것인, 조성물.
  12. 청구항 4에 있어서,
    상기 N-카바밀-L-글루탐산은 Fzd7, Tcf7, Ror1 및 Axin2으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현을 증가시키는 것인, 조성물.
  13. 청구항 4에 있어서,
    상기 N-카바밀-L-글루탐산은 VIL1, EPCAM, KRT20, CLAUDIN, MUC2, LYZ 및 Ki-67으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현을 증가시키는 것인, 조성물.
  14. N-카바밀-L-글루탐산(N-carbamyl-L-glutamic acid)을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  15. N-카바밀-L-글루탐산(N-carbamyl-L-glutamic acid)을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물.
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