KR20110019058A

KR20110019058A - 락토바실러스 루테리로부터 분리 정제된 글루타미나제 및 이의 정제 방법

Info

Publication number: KR20110019058A
Application number: KR1020090076626A
Authority: KR
Inventors: 소재성; 전정민
Original assignee: 인하대학교 산학협력단
Priority date: 2009-08-19
Filing date: 2009-08-19
Publication date: 2011-02-25

Abstract

본 발명은 락토바실러스 루테리로부터 분리 정제되어 글루타미나제 단위 활성이 높은 글루타미나제 및 이의 정제 방법에 관한 것이다.

본 발명에 의하여 높은 활성을 가지는 글루타미나제를 천연 식품 첨가제로 사용하여 글루타민으로부터 글루타민산염을 생산할 수 있으며, 이는 기존의 인공 식품 첨가제에 의한 부작용이나 병적 증세를 회피할 수 있다.

락토바실러스 루테리, 글루타미나제, 정제

Description

락토바실러스 루테리로부터 분리 정제된 글루타미나제 및 이의 정제 방법{Glutaminase purified from Lactobacillus reuteri and method for purification thereof}

현재 각종 식품 첨가제로 화학조미료인 MSG(Monosodium glutamate; 모노소듐 글루타민산염)가 널리 사용되고 있으며, 그 소비량은 꾸준히 증가하고 있다. 그러나 화학적인 방법으로 합성한 MSG를 식품 첨가제로 사용하였을 때 경우에 따라 독성을 나타내기도 한다(Tiziana P et al.,Food Chemistry 104(4):1712-1717, 2007). 그리고 화학조미료(MSG)를 과다섭취함으로써, MSG에 민감한 사람들에게서 '중국 음식점 증후군(Chinese Restaurant Syndrome)', '암과의 관련성'(고온에서는 발암물질로 변할 수있음), '천식과의 관련성' 등이 나타난다고 보고된 바 있다.

이에, 최근 식품 첨가제나 성분으로서 인체 내 건강에 이로움을 주는 천연 식품 첨가제에 대한 관심이 대두하고 있다. 식생활의 서구화에 따라 각종 성인병 발병의 주요 원인이 식생활에 있다는 것이 밝혀지면서 생명체(동물, 식물, 미생물)와 효소로부터 인체의 생리기능을 향상시키는 기능성 물질을 찾는 연구가 함께 이루어지고 있다. 그 중에서 음식의 맛을 증진시킬 수 있는 상업적으로 중요한 효소로 알려져 있는 글루타미나제(glutaminase) 효소를 대표적인 예로 들 수 있다.

글루타미나제는 L-글루타민을 L-글루타민산염으로 탈아민화시키는 촉매역할을 하며, 식품에 첨가하였을 때 맛을 증진시키는 효과를 가지고(Hodson & Linden, Physiology & Behavior 89(5):711-717, 2006), 일반적으로 간장과 같은 발효식품에 맛을 제공하는 중요한 효소로 알려져 있다. 상기 글루타민산염의 소듐 염 성분은 음식에 첨가하였을 때 맛을 내는 역할을 하며, 효모나 곰팡이뿐만 아니라 박테리아를 포함한 미생물 어디에나 포함되어 있어, 발효식품의 첨가제로 널리 쓰인다(Naohisa M et al., J. Bioscience & Bioengineering, 2005). 글루타민산염 생성에 가장 큰 역할을 수행하는 글루타미나제는 대체로 온도나 열에 대한 안정성을 보이며, 염에 대한 내성이 높아 식품가공과정에서의 환경 변화 조건에 견딜 수 있기 때문에(Lapufade P et al., Appl Environ Microbiol 64:2485-2489, 1998) 식품첨가제로서 사용이 가능하다. 또한 아스파라기나제(asparaginase)와 결합하여 백혈병 치료에 효과적일 수 있다는 연구 결과도 나타나 있다.(Masuo N et al., Bioscience & Bioengineering, 2005).

인간의 구강계, 소화계 및 비뇨 생식계의 정상균총으로 서식하는 락토바실러스 속 유산균(Lactobacillus spp.)은 젖산을 생성하여 pH를 산성화시켜 병원성을 무력화시키며, 락토바실러스 속 유산균에 의해 생성된 항생물질인 박테리오신(bacterocin)은 여러 가지 병원성 균의 생육을 억제한다(Goossens D et al., Dig Dis Sci 37:44-50, 2005; Hiller SL et al., Clin Infect Dis 16:S273-281, 1991; Karine V et al., J Bacteriol 70:2057-2064, 2002; Ouwehand AC et al., Antonie van Leeuvenhoek 82:279-289, 2002). 이와 같은 특징을 갖는 락토바실러스 속 유산균은 인간과 동물의 식이요법 치료제와 정장제로 사용되는 프로바이오틱스(probiotics)로 많은 연구가 되어있다(Talarico TL et al., Antimicrob Agents Chemother 32:1854-1858, 1988; Wolf BW et al., Food Chem Toxicol 36:1085-1094, 1998).

프로바이오틱스 균주의 대표적인 예로, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus) 및 락토바실러스 델브루에키이(Lactobacillus delbrueckii) 같은 몇몇 종은 염에 내성이 높고, 열에 대한 안정성도 높은 것으로 연구되었다(Erwin G et al., J Bacteriol 180:4718-4723, 1998; Jaya P et al., Appl Envir Microbiol 69:917-925,2003).

그러나 상기 프로바이오틱스 균주에서 글루타미나제를 직접 분리하여 그 특성을 확인하고, 식품첨가제로서의 가능성을 확인한 연구는 진행된 바 없다.

이에 본 발명자들은 락토바실러스 루테리로부터 글루타미나제를 특정 방법을 통하여 직접 분리 정제하면 우수한 글루타미나제 활성을 얻을 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명은 락토바실러스 루테리로부터 분리 정제되어 글루타미나제 단위 활성이 15 U/mg 이상인 글루타미나제 및 이의 정제 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 락토바실러스 루테리로부터 분리 정제되어 글루타미나제 단위 활성이 15 U/mg 이상인 글루타미나제를 특징으로 한다.

또한 본 발명은 락토바실러스 루테리의 배양액을 원심분리하여 세포덩어리 침전물을 수득하고, 상기 침전물을 완충용액에 현탁시킨 후, 프로타민 설페이트 처리하고, 음이온 교환 수지 크로마토그래피로 용출액을 얻고, 상기 용출액을 겔 여과 크로마토그래피를 수행하여 락토바실러스 루테리로부터 글루타미나제를 정제하는 방법을 또다른 특징으로 한다.

락토바실러스 루테리는 고기나 유제품으로부터 분리되었고 각종 식품첨가제로 사용되고 있으며, 본 발명에서는 락토바실러스 루테리 KCTC 3594로부터 글루타미나제를 정제하여 사용할 수 있다.

상기 정제된 글루타미나제는 락토바실러스 루테리 배양액보다 월등한 글루타미나제 활성을 가지며, pH 7 ~ 9 및 30 ~ 50 ℃ 의 범위에서 최적 활성을 나타낸다. 또한 이미 알려진 바와 같이 내염성을 가지며, 0 ~ 5 중량% NaCl에서 최적 활성을 나타낸다.

본 발명에 따라 락토바실러스 루테리로부터 글루타미나제를 분리 정제하는 방법은 다음과 같다.

배양된 락토바실러스 루테리를 원심분리하여 세포덩어리 침전물을 수득하고, 상기 침전물을 완충용액에 현탁시킨다. 이후, 프로타민 설페이트 용액을 1 mg의 단백질 당 0.01 mg ~ 0.5 mg 이 되도록 첨가한다.

상기 프로타민 설페이트 용액 처리된 현탁액을 완충용액으로 미리 평형시킨 음이온 교환 컬럼, 바람직하게는 DEAE 컬럼에 로딩시키고, NaCl 완충 용액으로 농도 구배 용출을 실시하여 용출액을 얻는다. 각각의 용출된 분획들은 280 nm에서 흡광도를 측정하고, 각 분획의 글루타미나제 활성을 측정하여, 일정 활성 이상의 용출액을 모아서 농축한다. 이후 상기 농축액에서 겔 여과 크로마토그래피에 의하여 효소를 분리하는데, 이때 컬럼으로는 슈퍼로스(Superose) 12HR 컬럼을 사용하는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 주어진 것이며 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

[실시예]

1. 락토바실러스 루테리의 배양

락토바실러스 루테리 KCTC 3594를 37 ℃ 혐기성 조건에서 1.5% 한천 도말된 MRS 평판 배지에서 배양하였다. 상기 MRS는 1 L를 기준으로 글루코오스 20 g, 펩톤 NO.3 10 g, 육즙 10 g, 효모추출물 5 g, 아세트산나트륨 5 g, 인산일수소칼 륨(K₂HPO₄) 2 g, 트윈 80 1 g, 미량 염류 용액(CaCl₂ 5 g, FeSO₄ 125 mg, CaSO₄ 75 mg, MnSO₄ 4.3 mg, ZnSO₄ 108 mg, Na₂MoO₄·2H₂0 125 mg, 니트릴아세테이트 7 g) 2 mL를 포함하도록 하였다. 상기 세포는 증식이 정치단계에 이르게 된 후 수거된다.

한편 많은 양의 락토바실러스 루테리 KCTC 3594 세포를 얻기 위하여 세포를 연속적으로 배양시켰다. MRS 한천 평판 배지 위의 콜로니는 새로운 MRS 브로쓰(broth) 5 mL에 옮겨지고 37 ℃에서 24시간 동안 배양되었다. 이후 5 mL 배양액의 10 %(v/v)를 70 mL MRS 배지에 주입하고 정치 배양하였다. 이후 70 mL 배양액의 10 %(v/v)는 3 L MRS 배지에 주입하여 희석하고 37℃에서 24시간 동안 배양시켰다. 상기 희석된 배양액을 10분간 8000 × g에서 원심분리하여 세포 덩어리(cell pellet)를 침전시켰다. 상기 세포 덩어리는 60 mL TE 완충 용액(20 mM Tris-HCl; pH 7.5)으로 2회 세척하고, 60 mL TE 완충 용액으로 현탁하였다. 이후 고압 호모게나이져(Emulsi Flex C-3, Avestin)로 15000 psi의 압력에서 3회 균질화하여 세포 현탁액(crude cell extract)을 얻었으며, 이는 -70℃에서 보관되었다.

2. 글루타미나제의 정제

(1) 프로타민 설페이트 처리

2.5%(w/v) 프로타민 설페이트 용액을 상기 세포 현탁액에 1 mg의 단백질 당 0.1 mg 프로타민 설페이트가 존재하도록 첨가하고 4℃에서 20분간 혼합시켰다. 상기 혼합물을 8000 × g, 4℃에서 10분간 원심분리하고 상등액을 얻어 이를 -70℃에서 동결시켰다. 이후 동결된 상등액을 37℃에서 30분간 녹이고 다시 8000 × g에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻고, 이를 0.22 ㎛ 크기의 마이크로필터를 사용하여 여과시켰다.

(2) 약 음이온 교환 크로마토그래피

상기 여과된 상등액으로부터 글루타미나제 효소를 정제하기 위하여 FPLC 를 사용하였다. 구체적으로 TE 완충 용액(50 mM Tris-HCl 및 5 mM EDTA, pH 7.5)를 30분간 1 mL/min로 흘려주어 평형화된 DEAE 컬럼(0.7 × 2.5 cm, Agen Bio HiTrap - DEAE - FF, GE Healthcare)에 상기 여과된 상등액을 로딩시키고, 농도 구배(0 ~ 0.1 M)를 가지는 NaCl 완충 용액을 40분 동안 1 mL/min 의 속도로 흘려주어 용출시켰으며 그 결과를 도 1에 나타내었다. 상기 도 1에서 보는 바와 같이, 0번부터 6번 분획까지는 컬럼을 안정화 시키기 위해 샘플 없이 평형 완충 용액을 흘려주었으며, 6번 분획이 시작되는 구간부터 NaCl 완충용액을 농도를 증가시켜 24번 분획까지 샘플을 얻었으며, 24번 분획 이후부터 컬럼에 남아있는 나머지 단백질을 제거하기 위해 NaCl 완충용액 농도를 점차 증가시켜 NaCl 농도 1 M로 50번 분획까지 씻어주었다. 결국 실질적으로 용출이 일어난 구간은 6번 분획부터 24번 분획까지의 구간이다. 상기 각 분획 1mL 를 8,000 × g에서 원심분리하고 4℃에서 보관하였다. 각 분획별로 후술하는 글루타미나제 활성 측정 방법에 의하여 글루타미나제 활성을 측정한 결과, 분획 중 0.35 M NaCl 농도에서 가장 높은 2.887 U/mL 의 활성을 나타내며, 0.1 M ~ 0.2 M 사이의 첫 번째 피크에서는 활성이 나타나지 않았으며, 0.2 M NaCl 분획에서는 0.164 U/mL 의 낮은 활성이 나타났다. 이후 1 U/mL 이상의 활성을 가지는 분획을 모아서 Ultrafree 30K NMWL membrane filter(Millpore, Bedford, USA)로 원심분리하여 5 mL로 농축하였다.

(3) 겔 여과 크로마토그래피

TE 완충 용액(20 mM Tris-HCl, 0.1 M NaCl, 10% 에틸렌글리콜 및 5 mM EDTA, pH 7.5)를 1시간 동안 0.3 mL/min으로 흘려주어 평형화된 슈퍼로스(Superose) 12HR 컬럼(10 mm x 30 mm, Pharmacia Biotech)에 상기 농축된 5mL의 농축액을 로딩시키고, 상기 TE 완충 용액을 3시간 동안 0.2 mL/min으로 흘려주어 용출시켜 최종적으로 정제된 글루타미나제 분획(1.5mL)을 얻었다.

3. 각 정제과정에서의 시료의 특성 확인

(1) 단백질 농도의 확인

각각의 샘플의 총 단백질의 농도는 소의 혈청 알부민을 사용한 브래드포드(Bradford) 방법에 의하여, FPLC 과정에서 280nm 에서의 단백질 흡수를 확인함으로써 측정되었다. 각 정제 단계의 세포 추출 시료의 단백질 중량을 하기 표 1에 나타내었다.

(2) 글루타미나제 활성 측정

37℃에서 5분 동안 2 중량% L-글루타민 용액 0.1 mL 및 100mM Tris-HCl 완충 용액(pH 7.5)이 혼합된 용액을 평형시킨 후, 상기 실시예 2에서의 각 정제 단계의 세포 추출 시료 0.1 mL 를 첨가하고 10분간 37℃에서 반응시켰다. 반응물을 3분간 가열하여 반응을 중지시킨 후, 5분간 8000 × g에서 원심분리하고 상등액 50㎕를 취하여 하이드록실아민 완충 용액(0.25M 하이드록실 아민 및 20mM EDTA, pH 8.0) 1 mL, 10 mM NAD⁺ 용액 0.5 mL, 1 mL 증류수 및 20 U/ml 글루탐산탈수소효소(glutamate dehydrogenase, GLDH) 혼합물에 첨가하였다. 37℃에서 30 분간 반응시킨 후 340 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 글루타미나제 활성에서 1 U(unit)은 37℃에서 1분간 1μmol 의 NADH를 생성하기 위하여 요구되는 글루타미나제의 양으로 정의된다.

각 시료의 글루타미나제 활성은 하기 표 1에 정리하였다.

정제단계	총 단백질 (mg)	총 활성 (U)	단위 활성 (U/mg)	수율 (%)	활성비교 (fold)
세포 현탁액 (실시예 1)	941.9	747.41	0.79	100	1
프로타민 설페이트 처리 (실시예 2(1))	72.7	716.48	9.86	96	12.4
약 음이온 크로마토그래피 (실시예 2(2))	0.3	4.61	15.37	0.6	19.4
겔 여과 크로마토그래피 (실시예 2(3))	0.1	1.64	16.4	0.2	20.7

세포 현탁액 차체는 단위 활성이 0.79 U/mg에 불과하였으나, 프로타민 설페이트 처리를 거친 경우 9.86 U/mg로 약 12.4 배 증가하였다. 또한 약 음이온 교환 크로마토그래피에 의하여 정제된 시료는 단위 활성이 15.37 U/mg 에 이르렀으며, 이는 세포 현탁액 자체에 비하여 19.4배나 증가하였다.

또한 겔 여과 크로마토그래피에 의한 크로마토그램은 도 2에 나타내었다. 정제된 글루타니마제는 2개의 피크에서 용출되었으나, 각각의 피크는 완전하게 분리되어 나타나지 않고 중첩되어 나타났다. 또한 글루타미나제 활성은 두 번째 피크에서 1.64 U/mL로 나타났으며, 상기 표 1에서 보는 바와 같이 단위 활성은 16.40 U/mg 로서 세포 현탁액 자체에 비하여 20.7 배 상승하였음을 확인하였다.

(3) 분자량 측정

각 정제 단계의 세포 추출 시료에서의 효소 분자량을 확인하기 위하여 12% 폴리아크릴아미아드 겔을 사용하고 코마시 블루(Coomassie blue) R-250으로 착색함으로써 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis)를 수행하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

상기 도 3에서 보는 바와 같이 최종 정제된 글루타미나제는 70 및 50 kDa에서 주된 밴드가 나타남을 확인하였다.

4. 글루타미나제의 최적 활성 조건

상기 실시예 의 방법으로 글루타미나제 활성을 측정함에 있어서, L-글루타민 용액과 Tris-HCl 완충 용액이 혼합된 용액에 시료를 첨가한 후, pH 를 3, 5, 7, 9 및 11로 보정하여 최종 정제된 글루타미나제 시료의 활성을 측정하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

상기 도 4에서 나타난 바와 같이 락토바실러스 루테리 KCTC 3594에서 분리된 글루타미나제는 pH 7.5에서 최적 활성을 나타내는 것을 확인하였다.

또한 L-글루타민 용액과 Tris-HCl 완충 용액이 혼합된 용액에 시료를 첨가한 후, 반응 온도를 20, 30, 40, 50 및 60℃로 보정하여 최종 정제된 글루타미나제 시료의 활성을 측정하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

상기 도 5에서 나타난 바와 같이 락토바실러스 루테리 KCTC 3594에서 분리된 글루타미나제는 40 ℃에서 최적 활성을 나타내는 것을 확인하였다.

그리고, L-글루타민 용액과 Tris-HCl 완충 용액이 혼합된 혼합 용액에 시료를 첨가한 후, NaCl의 농도를 5, 10, 15 및 20 중량%로 보정하여 최종 정제된 글루타미나제 시료의 활성을 측정하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

상기 도 6에서 나타난 바와 같이 락토바실러스 루테리 KCTC 3594에서 분리된 글루타미나제는 NaCl 5 중량% 에서 최적 활성을 나타내는 것을 확인하였다.

도 1은 실시예 3의 약 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 분획물의 특징을 나타낸 그래프이다. 상기 그래프에서 점선은 NaCl의 농도 구배, 실선은 280 nm 에서의 흡광도 및 막대그래프는 글루타미나제 활성을 나타낸다.

도 2은 실시예 3의 겔 여과 크로마토그래피에 의한 분획물의 특징을 나타낸 그래프이다. 상기 그래프에서 실선은 280 nm 에서의 흡광도 및 막대그래프는 글루타미나제 활성을 나타낸다.

도 3은 실시예 3에서의 각 시료의 SDS-PAGE 실시한 사진이다. 상기 사진에서 1번은 기준 시료, 2번 시료는 실시예 1의 세포 현탁액, 3번 시료는 실시예 2(1)의 프로타민 설페이트 처리 시료, 4번 시료는 실시예 2(2)의 약 음이온 교환수지 크로마토그래피에 의하여 정제된 시료, 및 5번 시료는 실시예 2(3)의 겔 여과 크로마토그래피에 의하여 정제된 시료를 나타낸다.

도 4는 락토바실러스 루테리 KCTC 3594에서 분리된 글루타미나제의 활성을 pH에 따라 나타낸 그래프이다.

도 5는 락토바실러스 루테리 KCTC 3594에서 분리된 글루타미나제의 활성을 온도에 따라 나타낸 그래프이다.

도 6는 락토바실러스 루테리 KCTC 3594에서 분리된 글루타미나제의 활성을 NaCl의 농도에 따라 나타낸 그래프이다.

Claims

락토바실러스 루테리로부터 분리 정제되어 글루타미나제 단위 활성이 15 U/mg 이상인 글루타미나제.
제 1 항에 있어서, 상기 락토바실러스 루테리는 락토바실러스 루테리 KCTC 3594인 것을 특징으로 하는 글루타미나제.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 글루타미나제 활성은 0 ~ 5 중량% NaCl 농도, 30 ~ 50 ℃ 온도, pH 7 ~ 9 범위에서 유지되는 것을 특징으로 하는 글루타미나제.
1) 락토바실러스 루테리의 배양액을 원심분리하여 세포덩어리 침전물을 수득하여 상기 침전물을 완충용액에 현탁시켜 세포 현탁액을 얻는 단계;

2) 상기 세포 현탁액에 프로타민 설페이트를 처리하는 단계;

3) 음이온 교환 수지 크로마토그래피로 용출액을 얻는 단계; 및

4) 상기 용출액을 겔 여과 크로마토그래피를 수행하는 단계

를 포함하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 루테리로부터 글루타미나제를 정제하는 방법.
제 4 항에 있어서, 제 3) 단계의 음이온 교환 수지 크로마토그래피는 DEAE 컬럼을 사용하고, NaCl 완충 용액으로 농도구배를 형성하여 용출시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서, 제 4) 단계의 겔 여과 크로마토그래피는 슈퍼로스(Superose) 컬럼을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.