KR20230126343A - 한국 재래닭의 유전적 배경을 판별하기 위한 snp 마커 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열번호 1 내지 146의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 있어서, 각 염기서열 중 100번째에 위치한 SNP (single nucleotide polymorphism) 염기를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 한국 재래닭의 유전적 배경을 판별하기 위한 SNP 마커 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

한국 재래닭의 유전적 배경을 판별하기 위한 SNP 마커 조성물 및 이의 용도{SNP marker composition for identifing genetic background of Korean native chicken and uses thereof}

본 발명은 한국 재래닭의 유전적 배경을 판별하기 위한 SNP (single nucleotide polymorphism) 마커 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

한국 재래닭(Korean native chicken)은 한국의 고유한 품종으로써 1,400년 전부터 한반도에서 사육된 것으로 추정되고 있다. 한국 재래닭은 현재 깃털색에 기반하여 5계통으로 보존되어지고 있으며, 한국의 가금 사업에서 중요하게 활용될 수 있는 잠재력 있는 유전자원이다.

2010년 10월 일본 나고야에서 개최된 생물다양성조약 제10회 제약국회의에서 생물다양성협약(Convention on Biological Diversity)에 따른 "유전자원으로의 접근과 이익공유 (Access and Benefit-sharing, ABS)"에 관한 의정서가 채택되었고, 2014년 10월 12일에 시행되었다. 이에 각국의 유전자원에 대한 "생물주권"을 인정하게 되어 고유의 유전자원에 대한 가치가 크게 신장되었다.

우리의 재래종을 보존하고 소비자에게 신뢰성을 얻기 위해서는 이력추적 시스템의 구축 및 도입이 시급한 상황이다. 실제로 소의 경우 2008년 12월, 돼지의 경우 2014년 12월 이력제 사업을 실행하였으며, 닭고기 및 계란 이력제 또한 2020년 1월부터 시행하기 시작하였다. 이에 재래종을 외래 품종과 정확하게 구분할 수 있는 판별 기법의 개발이 요구되고 있다.

일반적으로 개인의 유전자형 정보는 개체의 일생 동안 변하지 않는다. 따라서 유전정보를 이용한 품종 분류는 표현형 정보를 이용한 방법보다 정확하다고 판단된다. 초위성체(microsatellite, MS) 마커는 품종 식별을 위해 소, 돼지, 양, 염소, 말, 닭과 같은 가축에서 주로 사용되었다. 그러나 MS 마커는 유전자형 분석 오류율이 높고 복잡한 변이정보로, 이를 보완하기 위한 대체제의 필요성이 여러 번 제안되었다. 유전자형 분석 기술의 지속적인 발전으로 고품질의 대규모 DNA 염기서열 정보를 획득하게 되었으며, 분석 비용이 기하급수적으로 감소함에 따라 많은 양의 게놈 정보가 축적되었다(http://www.genome.gpaov/sequencingcosts/). 이러한 대규모 데이터를 처리하기 위해 빠르고 정확한 분석을 가능하게 하는 통계적 기법과 정밀한 알고리즘이 병행 개발되었으며, 이러한 기술에는 품종 식별 및 가축 분류를 위한 인공 지능(예: 기계 학습)이 포함된다.

머신 러닝 모델의 분류 알고리즘은 학습된 데이터를 기반으로 패턴을 식별하여 결과를 예측한다. 머신 러닝 기반의 대표적인 분류 모델로 SVM (Support Vector Machine), NB (Naive Bayes), DT (Decision Tree), RF (Random Forest) 또는 AB (Adaptive Boosting or AdaBoost) 등이 있다. 머신 러닝을 사용하여 구현된 이러한 분류 모델은 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)을 사용하여 대상 품종을 다른 품종과 구별하는 식별 기술로 적용할 수 있다.

한편, 한국공개특허 제2020-0072410호에는 '토종닭의 유전적 배경 또는 품종을 판별하기 위한 SNP 마커 세트 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1849235호에는 '비교유전체 방법을 이용한 재래닭, 청계, 레그호온 품종 판별용 분자 마커 조성물'이 개시되어 있으나, 본 발명의 '한국 재래닭의 유전적 배경을 판별하기 위한 SNP 마커 조성물 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 한국 재래닭에 대한 유전적 배경 또는 품종을 판별하기 위한 최적화된 SNP 마커의 조합을 개발하기 위해서, 전세계 닭을 대상으로 한 유전자형 데이터 세트 및 한국 재래닭 5계통에 대한 유전자형 데이터 세트를 이용하여 최적의 SNP 마커 조합을 도출하였으며, 머신 러닝 모델을 이용한 분류 작업 결과, 선택된 146개의 SNP 마커 조합이 한국 재래닭 5계통을 명확하게 구분할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 내지 146의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 있어서, 각 염기서열 중 100번째에 위치한 SNP (single nucleotide polymorphism) 염기를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 한국 재래닭의 유전적 배경을 판별하기 위한 SNP 마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 SNP 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는, 한국 재래닭의 유전적 배경을 판별하기 위한 SNP 칩(chip)을 제공한다.

또한, 본 발명은 한국 재래닭 의심 개체 또는 육계 신품종 개체에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 및 상기 분리된 게놈 DNA에서 서열번호 1 내지 146의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 SNP 염기의 유전자형을 결정하는 단계;를 포함하는, 한국 재래닭 또는 육계 신품종의 유전적 배경 판별 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 SNP 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한, 한국 재래닭의 유전자형 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 한국 재래닭의 유전자형 판별용 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 SNP 마커 조성물은 한국 재래닭의 이력시스템 구축에 적용되어 유통과정에서 부정 행위를 방지하는 수단으로 활용될 수 있어 한국 재래닭에 대한 소비자의 신뢰도를 상승시켜 가금 생산 농가의 소득 증대에 도움을 줄 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 한국 재래닭을 구별하기 위한 단일 염기 다형성 마커의 최적 조합을 확인하기 위한 작업 모식도이다. KNN: K-nearest neighbor classification, LDA: linear discriminant analysis, NB: naive Bayes, RF: random forest, SVM: support vector machine, QDA: quadratic discriminant analysis, KNC_G: 재래회갈색종, KNC_L: 재래흑색종, KNC_R: 재래적갈색종, KNC_W: 재래백색종, KNC_Y: 재래황갈색종.
도 2는 병합된 데이터의 주성분분석(PCA) 결과이다. (A)는 SYNBREED 및 한국 재래닭(KNC) 데이터를 이용한 PCA 분석 결과이고, (B)는 (A)의 결과에서 한국 재래닭을 강조하여 표시한 결과이다.
도 3은 SNP 가지치기(pruning)의 두 가지 전략으로 선별된 SNPs 마커를 이용한 주성분분석 결과이다.
도 4는 기능 선택(feature selection, FS)을 이용하여 선별된 각기 다른 SNP 마커 조합을 사용한 한국 재래닭(KNC) 5개 계통에 대한 주성분분석 결과이다. (A) KNC_G (34 SNPs); (B) KNC_L (32 SNPs); (C) KNC_R (30 SNPs); (D) KNC_W (33 SNPs); (E) KNC_Y (30 SNPs).
도 5는 최종 선택된 146개 SNP 마커 조합을 이용한 주성분분석 결과로, 한국 재래닭(KNC) 5개 순계가 구별되는 것을 확인할 수 있다.
도 6은 146개 SNP 마커 조합을 이용한 6개의 머신 러닝 모델별 한국 재래닭(KNC) 5개 계통의 분류 결과이다. (A)는 총 데이터에서 훈련용 데이터 세트 70%를 나타내며, (B)는 테스트 데이터 세트 30%를 나타낸다. (C)는 K-nearest neighbor (KNN) 모델을 이용한 분류 결과이고, (D)는 linear discriminant analysis (LDA) 모델을 이용한 분류 결과이고, (E)는 naive Bayes (NB) 모델을 이용한 분류 결과이고, (F)는 quadratic discriminant analysis (QDA) 모델을 이용한 분류 결과이고, (G)는 random forest (RF) 모델을 이용한 분류 결과이고, (H)는 support vector machine (SVM) 모델을 이용한 분류 결과이다. 붉은선은 머신 러닝 모델별 분류 추세선을 나타낸다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 146의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 있어서, 각 염기서열 중 100번째에 위치한 SNP (single nucleotide polymorphism) 염기를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 한국 재래닭의 유전적 배경을 판별하기 위한 SNP 마커 조성물을 제공한다.

본 발명의 SNP 마커 조성물에 있어서, 상기 연속된 뉴클레오티드는 8 내지 100개의 연속된 뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서 용어, "뉴클레오티드"는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이며, 특별하게 다르게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.

본 명세서에서 용어 "다형성(polymorphism)"이란 같은 종의 생물이라도 모습이나 고유한 특징이 다양하게 나타나는 것 또는 하나의 유전자 좌(locus)에 두 가지 이상의 대립 유전자(allele)가 존재하는 경우를 말하며, 다형성 부위 중에서 개체에 따라 단일 염기만 다른 것을 "단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)"이라 한다.

본 명세서에서 용어 "재래닭"은 예로부터 우리나라에서 사육되어온 닭으로 근래에 다른 품종과 섞임이 없이 순수 혈통을 유지하여 온 재래종 품종 또는 내종으로 사육유래가 명확하고 계대번식 및 세대별 검정기록이 있어야 하며, 매년 1세대 간격으로 계대를 유지하여 최소 7세대 이상 순수혈통으로 유지되어온 확실한 기록에 근거하고 품종고유의 특징을 가지고 있으며, 그 유전적 특성이 계대하여 유지되는 순수집단으로 실용계를 생산하기 위한 기초계통으로 이용되는 닭을 의미한다.

본 발명에 따른 SNP 마커 조성물에 있어서, 상기 한국 재래닭은 재래적갈색종, 재래황갈색종, 재래흑색종, 재래백색종 및 재래회갈색종일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 SNP 마커 조성물에 있어서, 상기 SNP 위치 염기는 서열번호 1 내지 146의 염기서열 모두 100번째로, 다형성 염기 정보는 표 1 내지 7의 SNP 염기서열 정보에서 [/]로 표시하였으며, 본 발명의 서열번호 1 내지 146의 염기서열은 상기 표에서 사선(/) 앞에 위치한 염기를 포함하는 서열을 의미한다.

본 발명은 또한, 상기 SNP (single nucleotide polymorphism) 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는, 한국 재래닭의 유전적 배경을 판별하기 위한 SNP 칩(chip)을 제공한다.

본 발명에서 용어, "SNP 칩"은 수십만 개의 SNP의 각 염기를 한번에 확인할 수 있는 DNA 마이크로어레이의 하나를 의미한다.

본 발명의 SNP 칩에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는, 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신 또는 알데히드 활성기가 코팅된 기판에 고정될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 폴리뉴클레오티드를 기판에 고정화시키는 방법으로는 피에조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅법(micropipetting), 핀(pin) 형태의 폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용할 수 있다. 또한, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼(silicon wafer), 유리, 석영(quartz), 금속 또는 플라스틱일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에 따른 SNP 칩은 전술한 것과 같이 염기서열 내에 SNP 염기를 포함하는 서열번호 1 내지 146의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 최소 조합으로 하여 구성될 수도 있고, 상기 146개의 폴리뉴클레오티드 외에 한국 재래닭의 유전적 배경을 판별할 수 있는 공지된 SNP 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 추가하로 포함하여 구성될 수도 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 한국 재래닭인 재래적갈색종, 재래황갈색종, 재래흑색종, 재래백색종 및 재래회갈색종간에 다형성을 나타내는 SNP 염기를 포함하고 있으므로, 본 발명에 따른 SNP 칩은 한국 재래닭의 판별에 유용하게 활용될 수 있다.

본 발명은 또한,

한국 재래닭 의심 개체 또는 육계 신품종 개체에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 및

상기 분리된 게놈 DNA에서 서열번호 1 내지 146의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 SNP (single nucleotide polymorphism) 염기의 유전자형을 결정하는 단계;를 포함하는, 한국 재래닭 또는 육계 신품종의 유전적 배경 판별 방법을 제공한다.

본 발명의 한국 재래닭 또는 육계 신품종의 판별방법에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 전술한 것과 같다.

또한, 상기 한국 재래닭은 재래적갈색종, 재래황갈색종, 재래흑색종, 재래백색종 및 재래회갈색종일 수 있으며, 상기 육계 신품종은 전술한 한국 재래닭을 이용하여 육성된 것으로 의심되는 품종일 수 있다.

본 발명의 한국 재래닭 또는 육계 신품종의 판별방법은 피검체(한국 재래닭 의심 개체 또는 육계 신품종 개체)로부터 분리한 게놈 DNA에서 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드의 SNP 염기의 유전자형의 결정을 통해, 피검체가 한국 재래닭인지, 혹은 한국 재래닭를 이용하여 육성된 품종인지를 판별할 수 있게 되는 것이다.

본 발명의 판별방법에 있어서, 피검체(한국 재래닭 의심 개체 또는 육계 신품종 개체)로부터 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 알려진 통상적인 방법을 통하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 조직 또는 세포로부터 DNA를 직접적으로 정제하거나 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 특정한 영역을 특이적으로 증폭하고 이를 분리함으로써 이루어질 수 있다. 본 발명에 있어서, DNA란 DNA 뿐만 아니라 mRNA로부터 합성되는 cDNA도 포함한다. 피검체로부터 핵산을 얻는 단계는 예를 들면, PCR 증폭법, 리가제 연쇄 반응(ligase chain reaction), 전사증폭(transcription amplification), 자가유지 서열복제(self-sustained sequence replication system; Guatelli 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87:1874-1878) 및 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification)이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

분리된 DNA의 유전자형 결정 즉, 염기서열의 분석은 당업계에 알려진 다양한 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 디데옥시법에 의한 직접적인 핵산의 뉴클레오티드 서열의 결정을 통하여 이루어지거나, SNP 부위의 서열을 포함하는 프로브 또는 그에 상보적인 프로브를 상기 DNA와 혼성화시키고 그로부터 얻어지는 혼성화 정도를 측정함으로써 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열을 결정/분석하는 방법 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 혼성화의 정도는 예를 들면, 검출가능한 표지를 표적 DNA에 표지하여, 혼성화된 표적 DNA 만을 특이적으로 검출함으로써 이루어질 수 있으며, 그외 전기적 신호 검출방법 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 명세서에서 용어 "프로브(probe)"는 타겟 핵산 서열에 실질적으로 상보적인 부위 또는 부위들을 포함하는 단일-가닥 핵산 분자를 의미한다. 또한, 용어 "혼성화(hybridization)"는 상보적인 단일 가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 완전히 매칭되거나 일부 미스매치로 실질적으로 매칭되는 2개의 핵산 가닥 사이에서 일어날 수 있다. 혼성화를 위한 상보성은 혼성화 조건, 특히 온도에 따라 달라질 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 한국 재래닭 또는 육계 신품종의 판별방법은 각 개체의 유전자형 분석 결과를 머신 러닝 모델을 통해 정확도 및 특이도를 검증할 수 있고, 상기 머신 러닝 모델은 RandomForest (RF), Quadratic discriminant analysis (QDA), Nave Bayes (NB), K-nearest neighbor (KNN), Linear discriminant analysis (LDA) 및 Support vector machine (SVM) 모델일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 상기 SNP (single nucleotide polymorphism) 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한, 한국 재래닭의 유전자형 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 프라이머 세트에 있어서, 상기 SNP 염기를 포함하는 폴리뉴클레오디드는 서열번호 1 내지 146의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서, 용어 "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다. 본 발명에 따른 프라이머 세트는 정방향 및 역방향 프라이머가 하나의 프라이머 세트를 이룰 수 있고, 대립유전자(allele) 특이적 정방향 프라이머 2개와 역방향 프라이머 1개가 하나의 프라이머 세트를 이룰 수도 있으며, 또는 ASP (SNPtype assay allele specific primer)1, ASP2, LSP (SNPtype assay locus specific primer) 및 STA (SNPtype assay specific target amplification primer) 프라이머가 하나의 프라이머 세트를 이루는 Fluidigm SNP 유전형 분석용 프라이머 세트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 한국 재래닭의 유전자형 판별용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

유전자형 분석 데이터

본 연구를 위해 두가지 세트의 데이터를 이용하였다(도 1). 데이터 set 1은 독일의 SYNBREED project에서 2009년부터 2014년동안 수집된 전세계 닭(총 174 breeds; 3,235 brids) 데이터이며 이들은 야생, 실용품종, 유럽, 아시아, 남아메리카 및 아프리카 계통으로 분류된다(Malomane et al., 2019 BMC genomics 20;1-15). 데이터 set 2는 2011년도에 국립축산과학원에서 수집된 총 443 마리의 5개의 순계(pure lines) 한국 재래닭 데이터이며, 각 계통별로 KNC_G (재래회갈색종) 81, KNC_L (재래흑색종) 70, KNC_R (재래적갈색종) 115, KNC_W (재래백색종) 90, 및 KNC_Y (재래황갈색종) 87 마리가 이용되었다(Cho et al., 2021 Genes 12(6);824).

모든 유전자형 데이터는 Affymetrix® Axiom™ Genome-Wide Chicken 600K chip을 이용하여 유전자형 데이터를 얻었으며 모든 품종에서 공통되는 총 544,830 SNPs 데이터를 획득하였다. 그 후, 많은 수의 데이터들이 오류없이 병합된 것을 확인하기 위해 주성분 분석(principal components analysis, PCA)을 수행하였다. 데이터의 병합과 PCA 분석은 PLINK1.9 소프트웨어를 이용하였으며 R 소프트웨어를 이용하여 시각화 하였다.

SNP 분석을 위한 QC (q uality control ) 및 pruning

유전자형(genotype) 데이터의 편향을 예방하기 위해 유전자형 분석 오류 비율(genotype call ratio)이 1% 이상(110,704 SNPs 제거)인 기준과 소수 대립유전자 빈도(minor allele frequency, MAF)가 0.05 이하(10,779 SNPs 제거)의 기준을 기반으로 SNPs를 필터링하였다. 다운스트림 분석을 위해 총 423,347개의 SNPs가 남았다.

한국 재래닭의 계통 별 특이적인 SNPs를 선발하기 위해 Case-Control GWAS (genome-wide association study)를 수행하였다. 분류하고자 하는 집단을 "Case" 집단으로 설정하고, 그 외 집단은 "Control" 집단으로 설정하여 분석을 진행하였다.

추출된 유의미한 SNPs는 분석 효율성 증대를 위해 SNP 가지치기(pruning)를 수행하였다. 가지치기 전략으로 2가지 시나리오를 구성하였는데, 첫 번째 시나리오(Ext_S1)에서는 GWAS의 p-value 값이 낮은 500개의 SNPs가 선발되었다. 두 번째 시나리오(Ext_S2)에서는 전체 게놈에 대한 연관 불균형(linkage disequilibrium, LD) 블록을 계산하여 유의미한 마커를 LD 블록 당 1개씩 선발하여 500개의 SNPs를 선발하였다. 각 시나리오에서 선택된 마커 집합에 대한 결과는 PCA를 통해 확인되었다.

기능 선택 (Feature selection, FS)

사전 선발된 후보 마커들은 품종 분류의 최적화를 위해 기계학습 알고리즘의 Feature selection을 실시하였다. 시나리오 2에서 선택된 마커 세트는 R 소프트웨어의 "randomForest" 패키지를 사용하여 Feature importance에 대해 점수를 부여하여 가장 영향력 있는 SNP를 식별하였다. 중요도가 높은 SNP 중 중요도 점수가 급감하는 지점을 임계점으로 특정하여 각 한국 재래닭(KNC) 계통에 대한 최적의 SNP 수로 선발하였다(Breiman, 2001 Machine learning 45;5-32).

식별 정확도 평가 (Evaluation of identification accuracy)

데이터 세트는 기능 선택(FS)에 의해 최종적으로 선택된 마커의 분류 정확도를 평가하기 위해 분할되었다. 데이터의 70%는 훈련 데이터 세트로 사용되었고 나머지 30%는 테스트 데이터 세트로 사용되었다. 분류 모델 1은 PCA의 주성분(PC) 1과 2를 사용하였으며, 분류 모델 2는 분류 정확도를 높이기 위해 PC 1~3을 사용하였다. 분류 평가는 RandomForest (RF), Quadratic discriminant analysis (QDA), Na

ve Bayes (NB), K-nearest neighbor (KNN), Linear discriminant analysis (LDA) 및 Support vector machine (SVM)의 6가지 기계 학습 모델을 사용하여 수행되었다. 데이터 분석은 R 소프트웨어용 "캐럿" 머신 러닝 패키지를 사용하여 수행되었다.

Model 1: Class∼PC1+PC2

Model 2: Class∼PC1+PC2+PC3

머신 러닝에서 일반적으로 사용되는 오차행렬(confusion matrix)을 사용하여 분류 정확도를 평가하였다. 본 발명에서 4가지 분류 값을 적용할 때 한국 재래닭(KNC) 모집단인 "Case" 그룹을 "True"로 지정하였고, KNC가 아닌 집단인 "Control" 그룹을 "False"로 지정하였다. True positive (TP)는 참값의 참예측, false positive (FP)는 거짓값의 참예측, false negative (FN)는 참값의 거짓예측, true negative (TN)는 거짓값의 거짓예측을 의미하고, 분류 정확도는 민감도(sensitivity), 특이도(specificity), 정밀도(positive predictive value), 음성예측도(negative predictive value), 및 균형정확도(balanced accuracy)의 5가지 지표를 사용하여 평가되었다.

실시예 1. 데이터 병합 및 주성분분석 결과

모든 데이터를 사용하기 위해 데이터 세트 1과 2의 600K SNP 유전자형 데이터를 병합하였다. Gallus_gallus-5.0 게놈 어셈블리의 염색체 및 물리적 위치 정보를 기반으로 모든 SNP를 병합하고 PCA 분석을 통해 확인하였다(도 2). 총 3,677 마리의 개체와 544,830개의 SNPs가 분석에 사용되었다. PCA 결과, 5개의 한국 재래닭(KNC) 계통이 다른 품종에 비해 독립적인 것을 확인하였다. KNC_L 계통을 제외한 모든 계통은 실용 갈색란 산란계 (Com_BL; Rhode Island Red)와 매우 유사한 것으로 확인되었다. 또한, 재래닭마다 고유한 유전자형 패턴을 가지고 있음을 확인하였고, 이는 고유 클러스터 형성에 반영되었다. PCA 결과 데이터 병합이 편향이나 오류 없이 수행되었음을 확인하였다(도 2).

실시예 2. Case-control GWAS 및 SNP 가지치기 결과

목표(Case) 품종에서 특정 SNP를 선택하기 위해 게놈 전체에 걸쳐 연관 분석을 수행했다. 목표 품종은 G, L, R, W 및 Y의 5개 KNC 라인으로 구성되었다. 다른 모든 품종은 대조군(Control)에 할당되었다. 총 257,490개의 중요한 SNPs와 100,967개의 LD 블록이 확인되었다(P < 0.01). 가장 큰 LD 블록은 127개의 SNPs로 구성되었고 가장 작은 LD 블록은 2개의 SNP로 구성되었다. SNP 가지치기의 경우 두 가지 시나리오에서 분석이 수행되었다. 이전 GWAS에서 P 값이 낮은 총 500개의 SNP가 시나리오 1에 대해 순차적으로 추출되었다. 시나리오 2의 경우 LD 블록을 기반으로 SNP 가지치기를 적용하여 P 값을 기반으로 500개의 SNP가 선택되었다. 추출된 마커 사이의 거리는 게놈 전체에 걸쳐 50 LD 블록당 가장 높은 유의성을 갖는 하나의 SNP를 선택하여 최소화되었다.

추출된 SNP의 PCA 결과에 따르면 KNC 그룹은 시나리오 1보다 시나리오 2에서 더 명확하게 분리되고 구별되었다(도 3). 도 3에 나타난 PC(주성분) 1과 PC 2 차원 결과는 시나리오 1과 시나리오 2 모두에서 Case와 Control 사이의 분리가 확인되었다. 시나리오 1에서는 Case 내에서 클러스터가 분리되는 경향이 확인되었지만, 클러스터는 KNC 계통 간에 분리를 확인할 수 없는 결과를 보여주었다. 시나리오 2에서는 KNC_G 및 KNC_W 라인을 제외한 모든 KNC 라인이 분리된 Case 그룹에서 특정 클러스터가 형성되었다. 그러나 PC 1-3의 3차원 플롯에서 KNC_G와 KNC_W 라인을 구별하는 것이 가능하였다. 이에 시나리오 2의 결과가 더 우수하다고 판단되었으며, 시나리오 2를 사용하여 예비 선택 마커 분석을 수행하였다.

실시예 3. 기능 선택 결과

마커 조합의 유용성을 향상시키기 위해 각 라인에 대해 기능 선택(FS)을 수행하였다. 이 선택은 RF (randomForest) 기계 학습 모델을 사용하여 SNP의 중요도 값을 계산하여 얻은 정보를 기반으로 수행되었다. 마커는 품종 분류 정확성의 안정성을 유지하기 위해 30-40개의 SNPs 그룹으로 선택되었다. KNC 라인 KNC_G, KNC_L, KNC_R, KNC_W 및 KNC_Y를 구별하는 34, 32, 30, 33 및 30개 SNPs 조합 [KNC_G: 서열번호 1 내지 34, KNC_L: 서열번호 35 내지 66, KNC_R: 서열번호 1, 16, 28 내지 30, 32, 39, 67 내지 89, KNC_W: 서열번호 25, 70, 90 내지 120, KNC_Y: 서열번호 1, 15, 38, 56, 121 내지 146]이 선발되었다. 이들 중 공통된 SNP가 13개 확인되어 총 146개의 SNPs 선택되었다(표 1 내지 7). 선택된 마커의 PCA 결과에서 KNC 계통을 명확하게 구별할 수 있음을 확인할 수 있었다(도 4 및 도 5).

실시예 4. 훈련 및 테스트 데이터 세트를 이용하여 선택된 마커 조합의 정확도 검증 결과

최종 마커 조합(146개 SNPs)의 한국 재래닭 품종 분류 정확도를 평가하였다. 6개의 서로 다른 기계 학습 모델(RF, QDA, KNN, LDA, SVM, NB)에 대한 전체 데이터의 70%를 훈련 데이터 세트로 사용하고 나머지 30% 데이터를 테스트 데이터 세트로 사용하여 분류 정확도를 측정하였다. 전체 데이터 세트는 범주(Case, Control) 샘플 수를 고려하여 분할되었다. 정확도를 측정하기 위해 동일한 샘플 구성을 모델 1과 2에 적용하였다. 모든 학습 모델에서 90% 이상의 품종 분류 정확도를 확인하였다(도 6). Model 1의 결과에서 SVM, RF, QDA 분류 모델의 정확도가 가장 높았고 LDA의 정확도가 가장 낮았다. Model 2의 결과에서 SVM, RF, KNN, NB 분류 모델이 가장 정확한 정확도를 보였다. Model 2의 결과는 Model 1의 결과보다 더 좋았다(표 8).

<110> The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC) <120> SNP marker composition for identifing genetic background of Korean native chicken and uses thereof <130> PN21341 <160> 146 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 200 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Gallus gallus domesticus <400> 1 ggaatattag gcacattgcc tgggttcacg gggcatgtgc cacctgcaag taaatgtcat 60 ttaaaatgtg gtgctagtgc agtagctaca tgctttgctc cttcaagcaa aattagtcaa 120 taaaatactg tcacaagatc cacttgttct taatgaagca ggagggaggg agacttcacg 180 ctgcaaagaa tttctgagat 200 <210> 2 <211> 200 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Gallus gallus domesticus <400> 2 aatggggcca ctgctggtga cagcagagta ggaatttgtg agactggcaa ctgcaaagaa 60 gcagaaaaca gaaatatttt caccacgaga gctttctggg aatggtcttt tatctcaggc 120 caaggcagag gcaagtaagg ggcaaatgcc tgagccttgt gctgggggac agtcactgct 180 atcccactgc aggacaggag 200 <210> 3 <211> 200 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Gallus gallus domesticus <400> 3 cactgctatt ttttgacctc aggttgtaga 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gallus domesticus <400> 123 ttactggaat tgaaactggc cctcaggtga agaagcagct tgcccagtac tcccccagta 60 caaattacaa atttaattta atttaattca ggacagaagc aaacacagag gattatctgg 120 gtaaactcca ctggctctaa cagcagtaaa tttcttgttc aaaccactta ggtctggtta 180 ctgcaaattc ctgtttagtt 200 <210> 124 <211> 200 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Gallus gallus domesticus <400> 124 tcaacactca gacatccatt tgtagtcccc tgaaagctct tactgctagg aagtcaagcc 60 tatgagcaca catgtagata cactttttcc aacacccatc actaactcac cagtgcattt 120 caactgaatg cataggcaag gatgtgcttc gtgaaatatt tcatctgccc cctacctgat 180 gattagtaaa tacaaccaga 200 <210> 125 <211> 200 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Gallus gallus domesticus <400> 125 cctgcttgtc agcattctgc ctatttgcaa tgagacttta tagtttcctt tcttactgtg 60 tgacagatcc ttgtgcatgg tattcaaaca aacacaacag caacagcaat ttcataaaca 120 ggaaactgac tgcaaagcca ctaaaacagg tgatggagag ttggagtcat ccttgcaaaa 180 ttatttgtaa cttcattttg 200 <210> 126 <211> 200 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Gallus gallus domesticus <400> 126 tggcaaatga attaaatgtg tgattatgtt taagaggaaa aagtataatg aaaaatcttt 60 aattcatgaa gaaaggcaca gcaatcacaa atacaagaac actaaatcca caaatattag 120 aattaggaac aaacccaatt ttctcagaga aaagcatctt gagattaatt catagagaca 180 ttggctttgc catctgccca 200 <210> 127 <211> 200 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Gallus gallus domesticus <400> 127 acgtgaaatt ttatcaaatg acttcaaaaa cgtaaaaatc caatacatca ttacaatggc 60 tgtgatgtct ttacaaatcc aaaacactgt tgtggtgtgg cctttctcat cttgttaact 120 tgtttctcca aagtgttctg accttaatat aatgtatttg ctaaaatgtt ttctctaaat 180 tgtcaaacta ctgctgtact 200 <210> 128 <211> 200 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Gallus gallus domesticus <400> 128 tcaagttaag caccaggaaa acccaagctg tgcgctgcaa ggctggcatg ggacaggtga 60 ctaccacccc acatacacag aaaaggttga aaggggtctc aaaggctgat atccccattt 120 agtgtcggga atttcctagc aagaaacagg aggactgaag tccacccagg cacaaaccaa 180 ggatggcatt cagcaccaga 200 <210> 129 <211> 200 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Gallus gallus domesticus <400> 129 tcaagtcctt ccaggaagag tccttcagca aattggctca tttagacaca acagccagaa 60 gcacagagag caaaaaaaaa aaaaggtttt gttcaaggag agcctctgta ttgtaaacag 120 gataaaaggg gatggaaaga gacacttatc actgtcttga tgtgtcccca ggtcattcct 180 gtgtagcatc tacaggagaa 200 <210> 130 <211> 200 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Gallus gallus domesticus <400> 130 caagctgaca ccttcagcaa agaattaaat ggaggaactc ttcccatggt attacttaca 60 agaaatttaa gcaattagtg tttgctgtct acaatcggag aatactgatc tccagtgatg 120 caatttaaaa gctcatgaga tgaaactaca gttaattata tacccttaac ttatttacct 180 atttcaatag caaggtaatt 200 <210> 131 <211> 200 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Gallus gallus domesticus <400> 131 agggctgatg tcgatgtggg aacttcagac atgaaggatg catcaacaac gagagctgca 60 cgatttgtag cagtctgtgc ctttcagcaa ggagctgggg agaactgctg cgctcccaca 120 gctctgtgtg caccgccctg catgcgctgc catgtattct tctccttctt tcctcttttc 180 ctctctgttt ttgaggtttc 200 <210> 132 <211> 200 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Gallus gallus domesticus <400> 132 ttcctatcta ttaaatattg tatcaatttg acagtactga aaatcagatt ctattaaata 60 attacccagt tttagcagta ccagcatgac agtccaccgg ctttatctaa gatattaaat 120 caagtagtca aaacctttaa tatcataaac tctgtgggac tgggtggatg aaagattggc 180 tcaagctggt acaaattttt 200 <210> 133 <211> 200 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Gallus gallus domesticus <400> 133 tggccaccca tcttttaatg cagcccagga tactgctggc cacctgggtt gcaagcacac 60 actgctggct tatgcccagc ttttcatcca tcaggatccg caagtcctgc tcctcatggc 120 tgcttctccc agtctgtatt catacctgcg attgccccaa ctcaagtgca ctaaagaaga 180 gatttgaatc ccctaattcc 200 <210> 134 <211> 200 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Gallus gallus domesticus <400> 134 tccaagtaat ttattttggc atcaaaactc ctgactcctt actggactgc tgcatctaat 60 tgtgactgct gcccagagag gctctggatg ccccatcccc ggaggtgttc aagaccagct 120 tgaatggagc cctgggcaac ctggactgga ctgcatctgg aggatcgggg ttggaacttg 180 gtgatccttg gggtcccttc 200 <210> 135 <211> 200 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Gallus gallus domesticus <400> 135 gtcagatact gtaggagaac agcgacctgt cctaacaatg tatgtatgtc ttgctggtac 60 cagttgttct ggagagcttt atgtgctccc aatattgcac caagacaaag tttaccctgc 120 aaagtgaagg aaaagtaagc agatataaaa tccttattaa aattctcctg aataatcaaa 180 gcaaagcctg cagccaggat 200 <210> 136 <211> 200 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Gallus gallus domesticus <400> 136 gactcaggca ccagtggcat cttgggcaca ggcgctacca agggtgagaa ggtaagcaag 60 gggctgttgg ggctgcctct ctcaccagtc tgcagcagtg tgttcacgtt tgactctcat 120 ctgtctccat ttctgttcca cagggggaga aaggtgaatt gggcatcaag gtgagcactg 180 ctggggagct gggcagggct 200 <210> 137 <211> 200 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Gallus gallus domesticus <400> 137 tgcagaagaa atatgcagct cttgtcacct ataatgtagg cctatttctt aaaggtatca 60 tttcatgtta tttatagctt agtctatcac gcaagtcagg gaaaaccaaa aagggtcatc 120 accagacacc tctggattaa aattaagaaa tacaagagct ttaatttctc tacatgccta 180 gctactgttc acctctaaga 200 <210> 138 <211> 200 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Gallus gallus domesticus <400> 138 aggtaaatat cgaaataaca aatgtgtgta cctgcatggg aagttggctg aggtttggcc 60 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tttttttttt tttttcattg tcagaaggac tgtatgataa 120 atattcatct gcagacttat catgctggaa ttttgggatg ctgatctaac agagagcaaa 180 ctgttttttt aggacaagtc 200 <210> 142 <211> 200 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Gallus gallus domesticus <400> 142 ctacaacaga gttaaatttc tcaaaacttg agggaaagag gttgtgatag gaaagatgga 60 gtaatctgga ttgcccctgt catgacccaa gctctgaggg aagcacccca aagacctgaa 120 gcctacttct tcccctaaat ccacagggaa atgactcgat gaaatgtggg cctttctagt 180 cttacacaag atgaactccc 200 <210> 143 <211> 200 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Gallus gallus domesticus <400> 143 aaaacccatc actaatgtat ctgtatgtac ccattctcag taaaagattt ctcagtaaaa 60 caaaactgta ccttcaagac ataaagtggt cgtttttcac atgatgatcc aatataaatt 120 ttctcaagta gatcagaatg aactctcact atttcttcca tccagtgata gatctgcaaa 180 gatgaggtgg aacaagtagt 200 <210> 144 <211> 200 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Gallus gallus domesticus <400> 144 ctttccgtgg aactagcacc aattattatt ttcaagactt actttgccca actaaatttc 60 atgctatgaa tggatagaac ttgattgact attgtaaagc gctcattcca ttaatcatca 120 attaatcagt tacacatcag tggttatttc agaagcgtga aacttgaggc tatttgaaac 180 cgacatcact gctattataa 200 <210> 145 <211> 200 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Gallus gallus domesticus <400> 145 ttaaattgga gcaagtgtgg ttactgaatt aatcctggtc tgccaagctg ggcttgtgtt 60 gtgtaaagga gagggcttgg atctatgctg tcttttcttg ttcatagggg ctgagtaaaa 120 aagttggggt gtcttcctcc atcctgcaag ggctttggat ctcctacagc actgagggtc 180 tttccatggc tttggcatcg 200 <210> 146 <211> 200 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Gallus gallus domesticus <400> 146 gtcatattag ttttgtgctc ataaatatat gtgtgctaaa acacaagcag atgagataac 60 aacaaatcag atataatgta tcacgaatat ctcaggcctg tagctgggtc atgtaatatg 120 cacctaaatc agatccttct agaataactc atctgtcatg aagagggagt atctaactct 180 tcctgactgg acaagagacg 200

Claims (8)

1. 서열번호 1 내지 146의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 있어서, 각 염기서열 중 100번째에 위치한 SNP (single nucleotide polymorphism) 염기를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 한국 재래닭의 유전적 배경을 판별하기 위한 SNP 마커 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 연속된 뉴클레오티드는 8개 내지 100개의 연속된 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 한국 재래닭의 유전적 배경을 판별하기 위한 SNP 마커 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 한국 재래닭은 재래적갈색종, 재래황갈색종, 재래흑색종, 재래백색종 및 재래회갈색종인 것을 특징으로 하는 한국 재래닭의 유전적 배경을 판별하기 위한 SNP 마커 조성물.
4. 제1항에 기재된 SNP (single nucleotide polymorphism) 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는, 한국 재래닭의 유전적 배경을 판별하기 위한 SNP 칩(chip).
5. 한국 재래닭 의심 개체 또는 육계 신품종 개체에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 및
   상기 분리된 게놈 DNA에서 서열번호 1 내지 146의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 SNP (single nucleotide polymorphism) 염기의 유전자형을 결정하는 단계;를 포함하는, 한국 재래닭 또는 육계 신품종의 유전적 배경 판별 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 한국 재래닭은 재래적갈색종, 재래황갈색종, 재래흑색종, 재래백색종 및 재래회갈색종인 것을 특징으로 하는 판별 방법.
7. 제1항에 기재된 SNP (single nucleotide polymorphism) 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한, 한국 재래닭의 유전자형 판별용 프라이머 세트.
8. 제7항의 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 한국 재래닭의 유전자형 판별용 키트.