KR20230125825A - 포도씨 추출물 제조 방법 및 이렇게 수득된 추출물 - Google Patents

포도씨 추출물 제조 방법 및 이렇게 수득된 추출물 Download PDF

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KR20230125825A
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산드로 산티넬로
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디스틸러리 보놀로 움베르토 - 에스.피.에이. - 콘 시글라
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Abstract

선택된 비발효 마르(marc)로부터 포도씨 추출물을 제조하는 방법이 기재되어 있으며, 상기 방법은 포도씨 선택, 체질, 탈수, 수성 용매에서의 추출, 막을 통한 접선 미세-, 한외- 및 나노여과 및 분무 건조의 단계를 포함한다.
이렇게 수득된 추출물은 안과 질환의 위험을 예방하고 상부 호흡기의 바이러스 감염의 초기 단계를 제어하는 데 유용한 활성 물질의 분석 프로파일을 갖는다.

Description

포도씨 추출물 제조 방법 및 이렇게 수득된 추출물
본 발명은 선택된 비발효 마르(marc)로부터 포도씨 추출물을 제조하는 방법, 및 이렇게 수득된 추출물 및 이의 건강기능식품 및 약학 조성물에서의 용도에 관한 것이다.
비티스 비니페라(Vitis vinifera L.)의 상이한 재배종으로부터 유래되고 카테콜 기원의 폴리페놀을 함유하는 포도씨로부터 수득된 추출물은 만성 말초 정맥 기능부전을 치료하기 위한 약물 및 보충제/식품 보충제(건강기능식품), 특히 심혈관 건강과 관련된 것 둘 다로서 오랫동안 사용되어 왔다. 이러한 마지막 사용은 1990년대 초반부터 역학적 관찰과 관련하여 큰 영향을 발견하였다. 사실, 이러한 맥락에서, 프랑스 인구에서 관찰된 고 섭취량의 식이 지방과 비교하여 퇴행성 심혈관 질환의 낮은 발생률은, 특히 포도의 가공으로부터 유래되고 특히 레드 와인에 존재하는, 폴리페놀, 특히 카테킨 및 에피카테킨으로부터 유래된 올리고머 프로시아니딘(oligomeric procyanidins)의 동시 섭취와 처음으로 관련되었다. 다수의 문헌 데이터는 이제 심혈관계 및 시각 기능에 대한 유익한 효과를 생성할 뿐만 아니라 예를 들어 바이러스 감염 제어와 관련된 이의 새로운 적용을 나타내는 데 있어서 올리고머 프로시아니딘의 중요한 역할을 지지하기 위해 이용가능하다.
약학 및 건강기능식품 분야 둘 다에서 통상적으로 사용되고 기존의 선행 기술에 따라 제조된 포도씨 추출물은 2 내지 10의 중합도를 갖는 올리고머 형태, 중합체 형태 및 무엇보다 15 내지 30%의 일관된 함량의 카테킨 및 에피카테킨과 같은 단량체 플라바놀을 함유한다. 후자의 생성물은 바람직하지 않은 것으로 간주되고, 시장으로부터 유일한 성분으로서 활성 성분으로서 카테킨을 함유하는 약학 생성물의 회수를 야기하는 부작용의 공지된 사례가 있다. 또한, 용매의 가변 혼합물에 의해 특정 올리고머 분획을 선택적으로 수득하기 위한 다수의 시도가 이루어졌다. 예를 들어, 미국 특허 5,484,594에서, 단량체 함량은 추출물의 1.5%를 초과하지 않는 것으로 보고되었지만, 상기 방법은 유기 용매, 예컨대 아세톤, 메탄올 또는 다른 알코올의 혼합물을 사용하는 단량체 성분의 선택적 추출을 수반하고, 따라서 이들 추출물을 건강기능식품 사용에 부적합하게 만든다.
또한, 보다 최근에는 흡착 크로마토그래피 수지에 대한 예비 수성 추출 및 후속 정제 단계 및 히드로알코올성 혼합물을 사용한 용리의 조합된 사용에 의한 시도가 이루어졌지만, 이 경우에도 10% 미만의 단량체 플라바놀 함량을 갖는 추출물이 수득되지 않았다(WO 2016/020855 A1).
CN106496176A에서, 99.5%의 순도로 분말화된 프로안토시아니딘이 수득된 것으로 확인되었다. 상기 기술된 추출방법은 포도씨를 전처리하는 단계, 물 추출 및/또는 초음파 추출에 의해 전처리된 포도씨를 추출하여 추출물을 수득하는 단계; 추출물을 미세여과막, 한외여과막 및 나노여과막을 순차적으로 여과하여 여과액을 수득하는 단계; 고분자 수지를 사용하여 여과액을 흡착하고, 이어서 프로시아니딘이 풍부한 용출액의 용출 및 수집을 위해 에탄올을 사용하는 단계; 프로안토시아니딘이 풍부한 용출액을 원심분리, 분리 및 농축하고 역삼투압 3단계로 농축하여 추출물을 수득하고 동결건조법 또는 마이크로웨이브법을 사용하여 추출물을 건조하여 프로안토시아니딘 분말을 수득하는 단계를 포함한다. 그러나, 에탄올이 용출액의 용출 및 수집에 사용되는 것으로 관찰될 뿐만 아니라, 이 방법은 상당히 긴 단계의 순서를 필요로 하며, 이는 또한 고가일 뿐만 아니라 복잡하여 이 방법을 모두 비경제적으로 만든다.
따라서, 포도씨에 존재하는 올리고머 프로시아니딘의 선택적 추출을 위한 특정한 수의 절차가 존재함에도 불구하고, 단량체 형태의 함량이 낮고 동시에 생물학적 활성 올리고머 형태의 천연 성분이 중요한 추출물을 수득하는 산업적 측면은 만족스럽지 않은 채로 남아있다. 또한, 추출 절차의 허용 가능성의 측면, 예컨대 사용된 용매 및 관련 제품 분야, 특히 기능식품 분야에서 동일한 추출물을 사용할 수 있게 만드는 오염물의 수준은 여전히 만족스럽지 않은 것으로 간주되어야 한다.
따라서, 본 발명의 목적은 공지된 추출 방법의 한계 및 단점을 극복하는 것이다.
상기 목적은 청구항 1에 보고된 바와 같이, 포도씨 추출물을 제조하는 방법에 의해 달성되었다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 이러한 방법에 의해 수득가능한 포도씨 추출물에 관한 것이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 이러한 포도씨 추출물, 및 적합한 부형제를 포함하는 약학 또는 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
하기 상세한 설명으로부터 명백한 바와 같이, 혁신적인 추출 방법은 선택적 막을 사용한 접선 여과와 결합된 주입 기술에 의해 개발되었고, 이는 낮은 함량의 단량체 플라바놀(≤5%) 및 높은 함량의 올리고머 프로시아니딘(≥95%)을 갖는 추출물을 수득하는 것을 가능하게 한다. 또한, 주입 및 추출 용매로서 물만의 사용을 포함하는 본 방법은 국제 규정을 준수하고 기준 제품 분야, 특히 건강기능식품 분야에서 사용가능한 오염물의 허용 한계를 갖는 추출물을 수득하는 것을 가능하게 한다.
본 발명의 특징 및 이점은 하기 상세한 설명, 예시적이고 비제한적인 실시예에 의해 제공된 구현예, 및 첨부 도면으로부터 명백해질 것이며, 여기서:
- 도 1은 높은 단량체 역가('RP')를 갖는 상업적 추출물의 HPLC-GPC 프로파일과 비교하여 실시예 1에서 수득된 포도씨 추출물의 HPLC-GPC 프로파일을 도시하고,
- 도 2는 실시예 1의 6회의 별개의 반복의 포도씨 추출물의 거의 중첩가능한 FTIR 스펙트럼을 도시하여, 방법의 재현성을 확인하고,
- 도 3의 A 및 B는 음이온 모드에서 LC-Chip/ESI-QTOF-MS에 의해 수행된 분석 데이터의 정량적 처리에 의해 수득된 것으로, 총 프로시아니딘(도 3의 A) 및 단량체 카테킨, 총 프로시아니딘, 카테킨 및 갈산으로 에스테르화된 카테킨 각각(도 3의 B)의 함량의 비교를 도시한다.
따라서, 본 발명은 포도씨 추출물의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:
i. 포도 압착에서 파생된 마르(marc)를 제공하고 상기 마르에 기계적 체질을 가하여, 포도나무의 기계적 전정(pruning)으로부터 생성된 줄기, 껍질 및 다른 잔류물로부터 포도씨를 분리하는 단계,
ii. 이렇게 분리된 포도씨를 건조하여 8% 미만의 잔류 습도로 낮추는 단계,
iii. 적어도 80°C의 온도에서 적어도 1시간 동안 3.0-3.5의 pH에서 물에 상기 포도씨를 주입하는 단계,
iv. 단계 iii.에서 수득된 수용액을 상기 포도씨로부터 분리하는 단계,
v. 상기 수용액에 0.2 미크론(micron) 막을 통한 접선 미세여과를 가한 다음, 투과물을 수집하고 저장하는 단계,
vi. 상기 투과물에 300 kDalton의 컷오프로 접선 한외여과를 가한 다음, 잔류물을 수집하고 보존하는 단계,
vii. 상기 잔류물에 접선 나노여과를 가하여, 잔류수를 제거하여, 포도씨 추출물을 수득하는 단계, 및 선택적으로
viii. 상기 추출물을 농축하고 분무 건조하여, 분말을 수득하는 단계
를 포함한다.
특히, 단계 i에서, 먼저 본 발명의 방법에서 시작될 마르가 선택된다. 바람직하게는, 이탈리아 북동부의 품질 보증(신선도, 프로시아니딘 역가)에 대해 미리 선택된 단일 저장고(cellars)로부터 수득된 마르이며, 생산 현장(증류기)에서 압착한 직후에 전달되고 그의 형태학적 측면에 기초하여 선택된다. 이어서, 마르에 기계적 체질을 가하여, 기계적 전정으로부터 생긴 줄기, 껍질 및 다른 잔류물을 제거한다. 효율을 개선하기 위해, 상이한 다공도를 갖는 2개의 체를 사용하여 이 단계를 수행하는 것이 바람직하다.
단계 ii에서, 포도씨는 바람직하게는 70-110°C의 온도에서 건조되고, 이어서 냉각되어, 잔류 습도가 8% 미만임을 확인한다.
바람직하게는, 그의 산출 온도, 바람직하게는 30-60°C의 온도, 및 프로시아니딘 역가, 바람직하게는 ≥5%가 또한 확인된다.
단계 iii에서, 포도씨는 적어도 80°C의 온도에서 적어도 1시간 동안, 3.0-3.5의 pH에서 물에 주입된다. 이는 바람직하게는 배치 시스템, 특히 내부 교반 시스템을 갖는 주입기로 수행될 수 있는 실제 추출 단계이다. 바람직한 구현예에서, 교반은 15분마다 1분 동안 활성화된다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 방법은 주입 및 추출 용매로서 물만의 사용을 포함한다. 물이 본 발명의 방법에서 사용되는 유일한 용매이기 때문에, 이는 따라서 다른 용매 또는 혼합물이 본 방법의 임의의 단계에서 사용되지 않음을 의미한다.
바람직하게는, 단계 iii은 주위 압력에서 약 90°C의 물 온도에서 약 2시간 동안 수행된다.
목적하는 pH는 바람직하게는 인산을 첨가함으로써 달성되고 유지된다.
추출 수율을 개선하기 위해, 단계 iii 전에 및/또는 단계 iii 동안, 초음파를 이용한 재순환을 이용하여 가수분해 효소(예를 들어, 펙티나제, 셀룰라제, 아밀로펙티나제)로의 처리를 수행하는 것이 가능하다(그러나 엄격하게 필요하지는 않음).
바람직하게는, 단계 iii의 말기에, 수득된 용액은 약 2 mm의 구멍을 갖는 그릴 상에서 여과함으로써 배출되고, 주입은 또 다른 2시간 동안 반복된다. 말기에, 제2 추출물의 용액은 배출되고, 약 2 mm의 구멍을 갖는 그릴 상에서 여과된다.
이러한 의미에서, 단계 iii은 또한 이중 주입 혼합기가 제공된 시스템으로 구성될 수 있고, 따라서 전체 효율을 증가시킨다.
단계 iv에서, 단계 iii의 수성 추출 용액은 포도씨로부터 분리된다.
바람직하게는, 이러한 용액은 이후 60°C 미만의 온도로 냉각되도록 둔다.
단계 v에서, 상기 수성 추출 용액은 0.2 미크론 막을 통해 접선 미세여과되고, 투과물을 수집 및 보존한다.
실제로, 접선 미세여과를 이용하여 하기를 수득한다:
- 잔류물, 즉 0.2 미크론 기공을 통과하지 않는 분획, 및
- 투과물, 즉 0.2 미크론 기공을 통과하는 분획(이는 수집 탱크로 보내짐).
바람직하게는, 잔류물은 90°C에서 물로 세척한 후 정용여과(diafiltration) 공정에 적용되고, 다시 접선 미세여과에 적용된다. 이렇게 수득된 추가의 투과물은 잔류 잔류물이 폐기되는 동안 이전의 투과물과 결합된다. 이는 방법의 최종 수율 및 전체 효율을 증가시킨다.
바람직한 구현예에서, 접선 미세여과의 투과물은 추출물에 함유되었을 가능성이 있는 살충제의 95% 이상을 제거하는 열분해 수지의 고정상에 여과된다. 용리 비는 바람직하게는 고정 상의 1 부피 상에서 시간당 5 부피이다. 이후, 수지는 예를 들어, 흡착된 원소를 제거하는 120°C에서 증기 처리에 의해 재생되고, 수지는 다시 작동된다. 이들 구현예에서, 투과물은 이어서 55°C 미만으로 냉각된다.
단계 vi에서, 상기 투과물은 300 kDalton의 컷오프(cut off)로 접선 한외여과되고, 잔류물을 수집 및 보존한다.
따라서, 이 단계에서, 투과물, 즉 막에 의해 보유되지 않은 분획은 폐기되고, 이렇게 수득된 잔류물은 폐(lung)에 저장되고, 바람직하게는 접선 한외여과를 통해 부분적으로 통과된다. 폐기된 투과물은 단량체 플라바놀로 강하게 농축되고, 잔류물은 올리고머 프로시아니딘으로 농축된다.
단량체 플라바놀은 DA201E 수지, 즉 고도로 소수성인 폴리스티렌/비닐벤젠계 수지를 사용하여 접선 한외여과 투과물로부터 회수될 수 있고, 이후 희석된 소다 용액으로 용리되고, 이후 중화를 위해 양이온 수지 상에서 통과된다. 이어서, 이 용액은 가능하게는 접선 나노여과 이후의 단계에서 사용되어 가변 단량체 플라바놀(예를 들어, 40%) 및 프로시아니딘 함량(예를 들어, 60%)을 갖는 최종 생성물을 제공할 수 있다.
바람직하게는, 잔류물은 제2 한외여과 단계(정용여과)를 거치며, 이는 그 순도를 증가시키고, 최종 농축 전에 세척 단계 동안 일정한 부피를 유지하기 위해 90°C의 물의 점진적인 첨가를 필요로 한다.
단계 vii.에서, 상기 잔류물은 이어서 접선 나노여과를 거치고, 잔류수를 제거하고, 이에 따라 포도씨 추출물을 수득한다.
실제로, 접선 나노여과는 또한 미네랄 염과 같은 작은 분자를 제거한다. 물은 투과물로서 폐기되는 반면, 잔류물은 본 발명에 따른 포도씨 추출물을 형성한다.
바람직한 구현예에서, 접선 나노여과의 잔류물은 25°C의 온도에서 작동하는 진공 농축기로 보내진다. 이렇게 수득된 농축물은 0-2°C로 냉각되고, 작은 탱크에 놓여지고 냉각실에 저장된다.
바람직하게는, 잔류물은 심지어 농축되고, 분무-건조기 시스템으로 건조를 위해 보내진다.
바람직한 구현예에서, 상기 분무-건조기 시스템은 하기 작동 조건으로 설정된다:
- 입구 공기 온도: 190°C
- 출구 온도: 80°C
- 공기와의 접촉시간 : 약 2초
- 잔류물의 중량에 의한 공기 부피: 약 300 m³/kg
이렇게 수득된 건조 추출물은 실온에서 안정하다.
마지막으로, 이렇게 수득된 포도씨 추출물, 즉 건조 분말 형태의 포도씨 추출물은 바람직하게는 1 kg 포맷의 알루미늄을 갖는 다층 필름 장벽으로의 포장 공정을 따른다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 본질적으로 상기 기재된 단계 i. 내지 viii.로 구성된다. 본 발명의 목적을 위해, 표현 "본질적으로 구성된다(essentially consists of)"는 단계 i. 내지 viii.가 본 발명의 포도씨 추출물을 수득하기 위한 유일한 결정 단계이고, 다른 가능한 단계는 단지 부수적 및/또는 최종 포장인 것을 의미한다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 상기 기재된 단계 i. 내지 viii.로 구성된다.
상기 기재된 바와 같은 본 발명의 방법의 바람직하고 유리한 측면은 단계 i. 내지 viii.로 본질적으로 구성된 방법의 구현예뿐만 아니라 단계 i. 내지 viii.로 구성된 방법의 구현예에 대해 유사하게 바람직하고 유리한 것으로 이해되어야 한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 이러한 방법에 의해 수득가능한 포도씨 추출물에 관한 것이며, 상기 추출물은 추출물의 중량을 기준으로 ≤ 5 중량%의 단량체 플라바놀 및 ≥ 95 중량%의 올리고머 프로시아니딘을 포함한다.
언급된 바와 같이, 본 발명의 방법은 용매로서 물만을 사용하기 때문에, 이러한 방법에 의해 수득가능한 포도씨 추출물은 유리하게는 임의의 미량의 바람직하지 않은 용매를 함유하지 않는다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 포도씨 추출물은 기껏해야 미량의 물을 포함할 수 있으며, 대신에 유기 용매가 완전히 없다.
단량체 플라바놀의 양은 (건조 염기 상에서) HPLC에 의해 측정된다.
올리고머 프로시아니딘의 양은 베이트-스미스(Bate-Smith) 방법에 따라 측정된다.
바람직하게는, 상기 추출물은 ≥ 80 중량%의 총 폴리페놀, 예컨대 카테킨(방법: 폴린-시오칼테우(Folin-Ciocalteu) 시약에 의함; 정확도 ± 15)을 포함한다.
바람직하게는, 상기 추출물은 (건조 염기 상에서) HPLC에 의해 측정된 0.05-0.5 중량%의 갈산을 포함한다.
바람직하게는, 상기 추출물은 (건조 염기 상에서) HPLC에 의해 측정된 1.0-5.0 중량%의 단량체(에피카테킨+카테킨)를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 포도씨 추출물은:
≥ 80%의 카테킨으로서의 총 폴리페놀 - 폴린-시오칼테우 시약
≥ 95% 올리고머 프로시아니딘 - 베이트 스미스(Bate Smith)
0.05-0.5% 갈산 - (건조 염기 상에서) HPLC
1.0-5.0% 단량체(에피카테킨+카테킨) - (건조 염기 상에서) HPLC
1.0-5.0% 이량체(프로시아니딘 B1 + 프로시아니딘 B2) - (건조 염기 상에서) HPLC
를 특징으로 한다.
하기 실시예로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 포도씨 추출물은 유리하게는 높은 항산화 용량을 가지며, 추가로 상기 기재된 제조 방법의 편의성을 뒷받침한다. 실제로, 이러한 높은 항산화 용량은 본 발명의 방법이 어떠한 방식으로도 이들 특성을 변경시키지 않았지만, 반대로 이들을 증진시켰음을 확인시켜 준다.
추가의 측면에서, 본 발명은 이러한 포도씨 추출물, 및 적합한 부형제를 포함하는 약학 또는 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
용어 "부형제"는 약학 또는 건강기능식품 제형에 사용하기에 적합한 화합물 또는 각각의 혼합물을 의미한다. 예를 들어, 약학 제형에 사용하기 위한 부형제는 일반적으로 대상체에서 부작용을 유발하지 않아야 하고, 활성 성분의 효능을 유의하게 억제하지 않아야 한다.
적합한 부형제는 산성화제, 산도 교정제, 케이킹방지제, 항산화제, 첨가제, 저항성제, 겔화제, 글레이징제, 개질 전분, 봉쇄제, 증점제, 감미제, 티너, 용매, 붕해제, 슬립제, 염료, 결합제, 윤활제, 안정화제, 흡수제, 보존제, 습윤제, 향미제, 필름-형성 물질, 유화제, 습윤제, 방출 지연제 및 이들의 혼합물이다.
바람직하게는, 상기 부형제는 전분, 개질 전분, 셀룰로스, 개질 셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 펙틴, 트라가칸트, 만니톨, 인산이칼슘, 잔탄 검, 카라기난, 알긴산나트륨, 구아 검, 말토덱스트린, 이산화규소 또는 이들의 혼합물이다.
본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 실제로, 경구 투여를 위해, 성분은, 예를 들어 연질 겔 캡슐, 정제, 미니-정제, 마이크로-정제, 과립, 마이크로-과립, 펠렛, 다중-입자, 미분화된 입자, 분말, 용액, 현탁액, 분산액, 에멀젼, 겔, 점적제 또는 에어로졸의 형태로 봉입된 하나 이상의 부형제와 혼합될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 적어도 하나의 다른 식물 추출물, 예컨대 빌베리 추출물을 더 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 퀘르세틴, 글리시리진산, 아스타잔틴 및 이들의 혼합물로부터 선택된 적어도 하나의 활성 성분을 더 포함한다.
본 발명의 목적을 위해, 표현 "더 포함한다"는 포도씨 추출물에 성분이 존재하는지 여부와 관계없이 조성물에 성분이 추가로 첨가됨을 의미한다.
본 발명의 조성물은 단위 용량 형태일 수 있다.
바람직하게는, 상기 단위 용량은 본 발명의 포도씨 추출물 20 내지 200 mg을 포함한다.
바람직하게는, 상기 단위 용량은 퀘르세틴 20 내지 200 mg을 포함한다.
바람직하게는, 상기 단위 용량은 글리시리진산 1 내지 100 mg을 포함한다.
바람직하게는, 상기 단위 용량은 아스타잔틴 0.1 내지 20 mg을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 단위 용량의 경우에도, 본 발명의 조성물은 본 발명의 포도씨 추출물, 퀘르세틴 및 글리시리진산을 포함한다. 이들 구현예는 바이러스 감염의 치료에 유리한 적용을 발견한다.
용어 "치료"는 감염성 질환, 예를 들어 환자의 병태의 개선 또는 질환의 진행의 지연을 앓고 있는 환자, 인간 및 동물 둘 모두에게 이익을 부여할 수 있는 본 발명의 조성물의 효과를 지칭한다. 이러한 조성물은 또한 감염에 대한 예방적 뿐만 아니라 치유적 효과를 가질 수 있다. 본 명세서에서, 용어 "감염" 또는 이의 동의어 "감염성 질환"은 또 다른 숙주 유기체 내의 또는 상의 미생물의 침습, 콜로니화 및/또는 증식을 의미한다. 용어 "감염"은 바이러스, 특히 호흡기 바이러스에 의해 야기되는 감염성 질환을 지칭한다. 본 발명의 목적을 위해, 바이러스는 바람직하게는 호흡기 세포융합 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 메타뉴모바이러스, 리노바이러스, 아데노바이러스 및 코로나바이러스로부터 선택된다.
코로나바이러스 및 인플루엔자 바이러스 둘 모두는 (숙주 세포의 세포막 시스템으로부터 유래된) 지질 이중층-기반 케이싱에 의해 구조적으로 특징지어진다. 지질 이중층은 또한 외향으로 돌출될 수 있는 당단백질을 함유하고, 많은 경우에 각각의 숙주 세포의 고도로 반응성인 인식, 연관된 물리적 상호작용, 후속 접착 및 따라서 또한 숙주 세포 내로의 바이러스의 침습을 담당한다. 이들 단백질의 예는 인플루엔자 바이러스로부터의 헤마글루티닌 및 코로나바이러스로부터의 S 단백질이다. 비말 감염을 통한 이러한 바이러스의 입증된 관련 진입점은 비인두 영역이고, 따라서 바이러스는, 인플루엔자 바이러스의 경우 기관지 영역인 반면 SARS-Cov-2의 경우 비인두 영역인 상피 숙주 세포의 후속 콜로니화의 측면에서 분화된다.
이를 기반으로, 코로나바이러스-19 팬데믹에 대한 효과적인 전략으로서 바이러스 입자의 침투에 대한 비강 영역, 입 및 목의 보호를 고려하는 것이 가능한 것으로 보인다. 이러한 접근법은 또한 감염 초기에 바이러스 복제를 제어하는 능력에 의해 강화되어야 한다.
이와 관련하여, 다수의 식물이 비인두 영역을 통한 바이러스의 감염 및 전파의 제1 단계에 대항하는 특정 목적을 위해 지시되는 것으로 보이는 흥미로운 생물학적 특성을 가짐이 최근에 밝혀졌다. 이러한 의미에서, 임의의 이론에 구속되기를 바라지 않으면서, 상기 바람직한 구현예의 포도씨 프로시아니딘, 퀘르세틴 및 글리시리진산의 조합은 숙주 세포 내로의 바이러스 침투의 억제, 뿐만 아니라 비인두 영역에서 감염의 초기 단계에서 바이러스 복제를 억제하는 능력에 기여하는 것으로 여겨지며, 감염을 제어하기 위한 유효한 전략을 나타낸다.
이들 구현예의 조성물은 서방성 경구 정제 또는 심지어 비강/경구 스프레이의 형태일 수 있다. 투여량은 침투 및 바이러스 복제 둘 모두에 대해 보고된 억제성 시험관내 농도에 기초하여 계산될 수 있고, 비인두강의 점막에 의해 덮인 영역을 고려하여 부피가 100 mL를 초과하지 않는다.
다른 바람직한 구현예에서, 단위 투여량의 경우에도, 본 발명의 조성물은 본 발명의 포도씨 추출물, 및 빌베리 추출물, 아스타잔틴 또는 둘 모두를 포함한다.
이들 구현예는 녹내장의 치료에서 유리한 적용을 발견한다.
녹내장은 현재 세계에서 실명의 주요 원인 중 하나이다. 녹내장의 가장 흔한 유형인 개방각 녹내장(OAG)은 시신경 헤드(ONH)의 느린 진행성 리모델링 및 시신경 디스크의 증가된 굴착에 상응하는 시신경 시야의 변화와 함께 시신경 섬유층(RNFL)의 손실을 특징으로 한다. 일차 OAG는 안압이 > 21 mmHg일 때 고압 OAG(POAG) 및 안압이 정상 범위(<21 mmHg) 내에 있을 때 정상 긴장 녹내장(NTG)으로 나누어졌다.
OAG는 미지의 병인의 다인성 시신경병증이고; 상승된 안압은 질환에 대한 가장 중요한 위험 인자이지만, 고안압증(ocular hypertension)을 녹내장성 시신경병증 및 연관된 시야 손실과 연결하는 정확한 경로는 아직 밝혀지지 않았다. 안압은 또한 임상적으로 치료가능하고 쉽게 측정가능하기 때문에 가장 연구된 위험 인자이다. NTG 환자에서 측정된 안압 이외의 메커니즘은 또한 녹내장성 손상에 기여할 수 있다.
POAG의 원인으로서 상정된 2가지 가능한 메커니즘이 있다:
● ONH에서 허혈을 야기하는 혈관 기능장애 - 혈액 공급의 만성 손상은 또한 진행된 연령, 전신 혈관 질환, 근시와 같은 다른 위험 인자와 연관된다. 가장 관련된 병인적 원인 중 하나인 것에 더하여, 혈관 기능장애는 또한 신경 조직의 손상에 기여하는 부수적인 현상이다. 결과적으로, 혈관 기능장애의 조절, 특히 안구 혈류를 개선하는 것은 녹내장에 대한 2차 치료 옵션이 되고 있다.
● 축삭의 압박을 야기하는 기계적 기능장애.
이제 신뢰할 수 있는 증거의 신체는 특히 노화 과정 동안 흔한 혈관 기능장애가 주로 혈관 구조 변화 및 내피 기능장애로 인한 것이라는 아이디어를 뒷받침한다.
후자는 NO 및 ET-1의 생산 및 방출의 균형에 크게 의존한다.
이를 기초로, 어떠한 이론에도 구속되기를 바라지 않으면서, 본 발명의 상기 구현예에 존재하는 일부 식물성 유도체, 예컨대 안토시아노사이드 및 프로시아니딘은 내피 기능장애 및 혈관 구조 변화의 감소에 기여하고, 결과적으로 손상되고 상승된 안구내 혈류역학적 압력의 감소에 기여하는 것으로 여겨진다.
특히, 안토시아노사이드는 담도 모세혈관의 과투과성을 조절하는 반면, 포도씨 추출물의 프로시아니딘은 내피 기능 및 혈류역학을 동시에 개선할 수 있다. 이들 조합된 효과, 즉 담도체의 모세관 여과의 정상화에 수렴하고 아스타잔틴의 작용과 평행한 효과는 안구내 압력 및 관련 손상의 감소에서 함께 작용할 수 있다.
상기 나타낸 바와 같은 방법의 단계, 추출물, 조성물 및 상대적 용도의 바람직한 측면의 모든 가능한 조합이 또한 기재되고, 따라서 유사하게 바람직하다는 것이 이해되어야 한다.
또한, 방법 및 추출물에 대해 바람직하고 유리한 것으로 확인된 모든 측면이 조성물 및 이의 활성 화합물 및 이의 용도에 대해 유사하게 바람직하고 유리한 것으로 간주되어야 한다는 것이 이해되어야 한다.
하기는 예시적인 목적으로 제공된 본 발명의 연구 실시예이다.
실시예
실시예 1.
본 발명에 따른 포도씨 추출물의 제조
이탈리아 북동부의 품질 보증(신선도, 프로시아니딘 역가)에 대해 미리 선택된 단일 저장고(cellars)로부터 수득된 마르는 생산 장소(증류기)에서 압착한 직후 전달되고 이의 형태학적 측면을 기초로 선택된다. 이어서, 마르는 상이한 직경의 기공을 갖는 2개의 체에 의해 체질되어 기계적 전정(pruning)으로부터 생성된 줄기, 껍질 및 다른 잔류물을 제거한다. 이어서, 포도씨를 건조(70-110°C)시킨 다음, 40°C, 잔류 습도(<8%) 및 프로시아니딘 역가(≥ 5%)에서 이의 출구 온도의 제어로 냉각시킨다.
방법:
추출은 배치 시스템으로 수행된다.
800 kg의 선택된 건조 포도씨를 취하고, 약 5,000 리터 및 처음 3,200 리터의 탈염 뜨거운 물(90/95°C)의 추출 혼합기에 넣고, 인산으로 (pH 3.0-3.5까지) 산성화시킨다. 추출기에는 뜨거운 물과 프로그래밍된 방식으로 활성화될 수 있는 내부 교반기가 공급될 수 있는 재킷이 제공된다. 현재 상태에서, 혼합은 15분마다 1분 동안 활성화된다. 추출 수율을 개선하기 위해, 추출 방법의 시작 전에 가수분해 효소(펙티나제, 셀룰라제, 아밀로펙티나제)를 사용하는 단계를 도입 및/또는 실제 추출 공정 동안 초음파 시스템으로의 재순환을 사용하는 것이 또한 가능하다(다만 필수적이지는 않음).
2시간의 추출 종료시, 수득된 용액을 대략 2mm의 공극률을 갖는 그릴 상에서 여과함으로써 배출시키고, 제2 추출을 인산으로 산성화된(pH를 3.0-3.5로 유지) 3,000 리터의 탈염수를 사용하여 90°C에서 또 다른 2시간 동안 수행하고, 종료시 제2 추출물의 용액을 약 2mm의 구멍을 갖는 그릴 상에서 여과함으로써 배출시킨다.
상기 기재된 추출 방법은 또한 이중 주입 혼합기가 제공된 시스템으로 구성될 수 있으며, 이는 방법 자체의 효율을 증가시킨다.
추출된 종자를 약 500 리터의 물의 제거로 폐기하고, 60°C 미만으로 냉각시킨 후, 2개의 추출 용액을 0.2 미크론 막을 통해 접선 미세여과 시스템으로 보내고, 이로부터 2개의 분획을 수득하였다:
● 잔류물, 즉, 0.2 미크론 기공을 통과하지 않은, 약 200 리터는 90°C에서 400 리터의 탈염수로 세척한 후(다시 미세여과를 수행함) 정용여과 공정을 거치고, 수득된 추가의 투과물은 이전의 투과물과 합쳐지고, 잔류물 잔류는 폐기됨.
● 투과물, 0.2 미크론 기공을 통과한, 약 5,900 리터는 수집 탱크로 보내짐.
접선 미세여과의 투과물을, 가능하게는 추출물에 함유된 살충제를 포함하는 95% 초과의 오염물을 제거하는 열분해된 수지의 고정 상으로 보내고, 용리 비는 1 부피의 수지에 대해 시간당 5 부피이다. 이어서, 수지를 120°C에서 증기 처리로 재생시키고, 이는 수지 상에 흡착된 오염물을 제거하여 이들을 다시 작동시킨다.
이어서, 열분해된 수지 상에서 처리된 용액을 55°C 미만으로 냉각시키고, 300 kDalton의 컷오프를 갖는 접선 한외여과 시스템으로 보낸다. 이렇게 수득된 잔류물을 폐(lung)에 저장하고 접선 한외여과를 다시 부분적으로 통과시키면서 (막을 통과하는) 투과물을 폐기한다.
단량체 플라바놀이 풍부한 한외여과 투과물은 DA201E 수지에 의해 회수할 수 있으며, 이후 희석된 소다 용액으로 용출하고 후속적으로 중화를 위해 양이온성 수지를 통과시킨다. 이어서, 이 용액을 가능하게는 하기 나노여과 단계에서 사용하여 단량체 플라바놀(예를 들어, 40%) 및 프로시아니딘(예를 들어, 60%)의 가변 함량을 갖는 최종 생성물을 생성할 수 있다.
이 한외여과 단계의 끝에서 잔류물 약 1,100리터가 수득되며, 이는 순도를 높이고 탱크에 90°C의 뜨거운 물 2,000L를 점진적으로 추가해야 하는 제2 한외여과 단계(정용여과)를 거치며, 한외여과는 잔류물을 농축하고 항상 일정한 부피를 유지하기 위해 2,000리터의 물을 버릴 때까지 작업을 계속한다.
이어서, 한외여과 잔류물을 물 및 미네랄 염과 같은 소분자를 제거하고 물의 양을 감소시킴으로써 폴리페놀의 순도를 추가로 증가시키는 나노여과를 거친다. 물을 투과물로서 폐기하고, 잔류물로서의 생성물 약 300 리터를 다음 단계로 보낸다.
나노여과의 잔류물은 25°C의 온도에서 작동하는 진공 농축기로 보내진다. 농축기는 약 90-100 리터의 농축물을 생성한다. 농축물을 0-2°C로 냉각시키고, 작은 탱크에 넣고, 냉각실에 저장한다.
농축된 액체 생성물은 하기 작동 조건 하에 작동하는 분무-건조기 시스템으로 건조를 위해 보내진다:
- 입구 공기 온도: 190°C
- 출구 온도: 80°C
- 공기 생성물 접촉 시간 : 약 2초
- 생성물 중량에 의한 공기 부피: 약 300 m³/kg
마지막으로, 1 kg 포맷의 포장 공정은 알루미늄을 갖는 폴리라미네이트 필름 장벽을 사용하여 따른다. 이 마지막 단계로부터, 예상되는 폴리페놀 프로파일을 갖는 오렌지-밝은 갈색 색상의 약 30-35 kg의 건조 포도씨 추출물이 수득되고 표 1에 보고된다.
성분 방법 결과
총 폴리페놀(카테킨)
(프로시아니딘)		 Folin-Ciocalteu 시약
(정확도 ± 15%)		 ≥80%
올리고머 프로시아니딘 Bate Smith ≥95%
갈산 HPLC (건조 염기 상) 0.05-0.5%
단량체 (에피카테킨+카테킨) HPLC (건조 염기 상) 1.0-5.0%
이량체 (프로 B1 + 프로 B2) HPLC (건조 염기 상) 1.0-5.0%
이렇게 수득된 생성물은 실온에서 안정하다.
추출물의 특성:
상기와 같이 수득된 추출물은 하기 분석 기술에 의해 특징지어졌다: HPLC-GPC (도 1), FTIR (도 2) 및 질량 분광측정법 (도 3).
이러한 분석의 결과를 5-15% 단량체 및 ≥85% 올리고머 프로시아니딘을 포함하는 기준 상업용 포도씨 추출물 (reference commercial grape seed extract, 간단히 'RP')과 비교하였다.
특히 도 3으로부터 관찰될 수 있는 바와 같이, 실시예 1로부터 수득된 추출물은 약 99%의 프로시아니딘의 백분율을 나타낸 반면, 단량체 카테킨의 백분율은 약 1%였다.
실시예 2.
항산화능 평가
DPPH 시험
DPPH 시험은 분석될 샘플을 DPPH [2,2-디페닐-1-피크릴히드라질, PM 394.33, C18H72N5O6]의 용액과 반응시키고, UV에서 DPPHㆍ라디칼의 517에서의 피크의 감소를 분석함으로써 항산화력을 결정할 수 있게 한다. 라디칼에 수소 원자를 전달할 수 있는 항산화 화합물은 용액의 흡광도의 손실을 야기한다. 517 nm에서의 DPPHㆍ 라디칼 피크의 감소는 이어서 소정의 인큐베이션 시간 후에 분광광도법에 의해 분석된다. 이러한 감소 (변색)는 샘플에 존재하는 항산화 부하에 비례한다. 결과는 또한 IC50, 즉 DPPHㆍ의 초기 50% 감소를 야기하는 항산화 화합물의 농도로서 표현될 수 있다.
실시예 1에 기재된 방법에 따라 수득된 3개의 샘플을 시험하였고, 상대적 결과는 하기 표에 보고되었다:
ORAC 시험
ORAC 방법 (산소 라디칼 흡광도 용량)은 퍼옥실 라디칼에 대한 라디칼 포획 용량을 결정하기 위한 가장 통상적인 방법 중 하나이다. 시험의 원리는 아조 화합물의 열 분해에 의해 생성된 퍼옥실 라디칼의 일정한 유동 하에 형광 표적 분자 (예를 들어 플루오레세인)의 형광 강도의 감소의 측정에 기초한다. 결과는 이 화합물을 기준 표준으로서 사용하여 등가의 트롤록스®(Trolox®) 마이크로몰로서 표현된다.
실시예 1에 기재된 방법에 따라 수득된 3개의 샘플을 시험하였고, 상대적 결과는 하기 표에 보고되었다:
실시예 3.
하기 활성 성분 및 적합한 부형제를 포함하는 단위 투여 형태의 하기 조성물:
을 제조하였다.
이 조성물은 바이러스 질환, 특히 호흡기 질환의 치료에 사용될 수 있다.
실시예 4.
하기 활성 성분 및 적합한 부형제를 포함하는 단위 투여 형태의 하기 조성물:
을 제조하였다.
이 조성물은 안구 질환, 특히 녹내장의 치료에 사용될 수 있다.
실시예 5.
하기 활성 성분 및 적합한 부형제를 포함하는 단위 투여 형태의 하기 조성물:
을 제조하였다.
이 조성물은 안구 질환, 특히 녹내장의 치료에 사용될 수 있다.

Claims (9)

  1. 포도씨 추출물(grape seed extract)의 제조 방법으로서,
    i. 포도 압착에서 파생된 마르(marc)를 제공하고 상기 마르에 기계적 체질을 가하여, 포도나무의 기계적 전정(pruning)으로부터 생성된 줄기, 껍질 및 다른 잔류물로부터 포도씨를 분리하는 단계,
    ii. 이렇게 분리된 포도씨를 건조하여 8% 미만의 잔류 습도로 낮추는 단계,
    iii. 적어도 80°C의 온도에서 적어도 1시간 동안 3.0-3.5의 pH에서 물에 상기 포도씨를 주입하는 단계,
    iv. 단계 iii.에서 수득된 수용액을 상기 포도씨로부터 분리하는 단계,
    v. 상기 수용액에 0.2 미크론(micron) 막을 통한 접선 미세여과를 가한 다음, 투과물을 수집하고 저장하는 단계,
    vi. 상기 투과물에 300 kDalton의 컷오프(cut off)로 접선 한외여과를 가한 다음, 잔류물을 수집하고 보존하는 단계,
    vii. 상기 잔류물에 접선 나노여과를 가하여, 잔류수를 제거하여, 포도씨 추출물을 수득하는 단계, 및 선택적으로
    viii. 상기 추출물을 농축하고 분무 건조하여, 분말을 수득하는 단계
    를 포함하는, 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    단계 iii. 전에 및/또는 단계 iii. 동안, 가수분해 효소, 예컨대 펙티나제, 셀룰라제 또는 아밀로펙티나제로의 처리가 수행되는, 제조 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    단계 v.의 상기 접선 미세여과의 투과물이 열분해된 수지의 고정 상으로 보내져, 상기 추출물에 존재할 수 있는 오염물을 제거하는, 제조 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득가능한 포도씨 추출물로서,
    상기 추출물은 추출물의 중량을 기준으로 ≤ 5 중량%의 단량체 플라바놀(flavanols) 및 ≥ 95 중량%의 올리고머 프로시아니딘(oligomeric procyanidins)을 포함하는, 포도씨 추출물.
  5. 제4항의 포도씨 추출물 및 적합한 부형제를 포함하는, 약학 또는 건강기능식품 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    퀘르세틴 및 글리시리진산을 더 포함하는, 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    바이러스 감염의 치료에 사용하기 위한, 조성물.
  8. 제5항에 있어서,
    빌베리 추출물, 아스타잔틴, 또는 둘 다를 더 포함하는, 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    녹내장의 치료에 사용하기 위한, 조성물.
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