KR20230124002A - 포매 매질을 사용하여 조직 샘플을 광학적으로 투명화하기위한 방법 - Google Patents
포매 매질을 사용하여 조직 샘플을 광학적으로 투명화하기위한 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 광학 현미경검사 조사를 위한 생물학적 또는 인간 조직의 투명한 조직 샘플을 제조하기 위한 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 a) 조직 샘플을 탈수 용매를 사용하여 탈수하는 단계, 및 b) 탈수된 조직 샘플을 벤즈알데히드-아니솔 에테르를 함유하는 포매 매질 내로 옮김으로써 상기 탈수된 조직 샘플을 투명화하는 단계를 갖는다. 포매 매질로서 현재까지 종래 사용된 벤질 벤조에이트/벤질 알콜 혼합물 및 메틸 살리실레이트-벤질 벤조에이트 혼합물과 비교하여, 벤즈알데히드-아니솔 에테르는 디벤질 에테르와 정확히 동일한 방식으로 순수한 물질로서 사용가능하다는 이점을 갖는다: 순수한 물질은 목적하는 굴절률을 이미 갖기 때문에, 굴절률은 포매 매질을 혼합함으로써 설정될 필요가 없다. 또한, 본 발명에 따른 벤즈알데히드-아니솔 에테르는 이전에 알려져 있는 포매 매질보다 더 빠르게 탈수된 조직에 침투하고, 또한 조직을 더 빠르게 투명하게 만든다.
Description
본 발명은 청구범위 제1항의 전문(preamble)에 따른 방법, 제10항에 청구된 바와 같은 생물학적 조직 샘플을 제조하기 위한 키트, 및 제13항에 청구된 바와 같은 용도에 관한 것이다.
조직 샘플이, 예를 들어 광 시트 현미경검사에 의해 3차원 이미지화를 겪을 수 있도록 하기 위해 투명한 생물학적 조직 샘플이 필요하다. 생물학적 제제에서의 투명도의 달성은, 특히 생물학적 제제로부터의 혈액 색소 헤모글로빈 및 지질의 헴 기(heme group)의 제거를 필요로 한다. "탈수" 과정에서, 조직은 수혼화성 유기 용매 및 물의 다양한 혼합물로 처리된다. 상기 처리는 조직으로부터 물을 완전히 제거하기 위해 유기 용매의 비율을 증가시키면서 수행된다. 여기서, 예를 들어 테트라히드로푸란, 메탄올, 이소프로판올, tert-부탄올 및 에탄올의 다수의 선택사항(option)이 있다. 에탄올은 현재 병리학에서 조직 투명화(clearing)를 위해 가장 통상적으로 사용되는 탈수 매질이다. 모든 "탈수" 과정의 최종 결과는 무수 샘플이다.
다양한 투명화 방법에서의 최종 단계는 굴절률을 현미경검사를 겪는 조직의 굴절률로 조정하는 것이다. 탈수된 조직의 굴절률은 Spalteholz ("Ueber das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Praeparaten" [On the transparency of human and animal preparations], published by S. Hirzel, 1911, German Reich Patent No. 229044)에 따르면, 뼈의 경우 n = 1.547이다. 다른 조직의 굴절률은 실험적으로 결정된 최적의 혼합물을 기반으로 대략적으로 n = 1.551에서 추정될 수 있다. 이러한 높은 굴절률은, 일반적으로 물과 비혼화성인 방향족 화합물의 사용을 요구한다. 이 조사를 위해, Spalteholz는 윈터그린 오일(wintergreen oil) (메틸 살리실레이트) 및 벤질 벤조에이트 또는 이소사프롤(isosafrole)의 혼합물을 다양한 조직에 맞춤화된 혼합 비(ratio)로 사용하였다.
Spalteholz 방법의 변형은 문헌 [Dodt, Leischner, Schierloh, Jaehrling, Mauch, Deininger, Deussing, Eder, Zieglgaensberger, and Becker "Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain". Nat Methods. 2007; 4(4): 331-6.)]으로부터 알려져 있으며, 여기에서 "Murray's clear" (n = 1.559의 굴절률을 갖는 벤질 벤조에이트 및 벤질 알콜의 2:1 혼합물)이 포매 매질(embedding medium)로서 사용된다. 또 다른 변형은 문헌 [Becker, Jaehrling, Saghafi, Weiler, and Dodt "Chemical Clearing and Dehydration of GFP Expressing Mouse Brains" (2012) PLoS ONE 7(3): e33916. https://doi.org/10.1371/journal.pone.003391]로부터 알려져 있다. Spalteholz 포매 매질 및 다수의 다른 방향족 화합물이 시험된다. 디벤질 에테르 (DBE, 굴절률 n = 1.562)가 가장 적합한 화합물로서 나타났으며, 조직 투명화에서 사실상의 최적 표준이 되었다. DBE의 이점은 또한, 용액은 혼합될 필요가 없고 이어서 이의 굴절률이 확인되기 때문에 사용하기에 용이하고; 이는 순수한 물질의 형태로 직접 사용될 수 있다는 것이다.
WO 2017/093323 A1로부터, 그때까지 통상적으로 사용되는 포매 매질에 대한 비독성 대안으로서 에틸 신나메이트 (ECi) 및 관련 신나밀 에스테르의 사용이 알려져 있다. 이는 디벤질 에테르, 벤질 알콜 또는 벤질 벤조에이트와 같은 조직 치료에 사용되는 다른 방향족 화합물보다 더 낮은 급성 및 만성 독성을 나타낸다. 순수한 물질로서 이는 목적하는 굴절률을 달성하기 때문에, 혼합 단계 및 따라서 작업 단계 및 가능한 오류 원인이 제거된다.
따라서, 탈수된 샘플을 위한 포매 매질로서 적합한 순수한 액체 물질의 선택은 현재 디벤질 에테르 및 에틸 신나메이트의 2종의 화합물로 제한된다. 그러나, 상기 2종의 물질 모두는 결점을 갖는다: 디벤질 에테르는 독성이다. 에틸 신나메이트는 낮은 독성을 갖지만, 이의 융점은 6 내지 9℃이며, 따라서 에틸 신나메이트를 사용하여 투명화된 샘플은 냉장고에서 보관될 수 없는데, 포매 매질은 거기서 결정화될 것이기 때문이다. 에틸 신나메이트는 또한 비교적 높은 증기압을 갖는다.
본 발명의 목적은, 상기 단점을 극복하고, 특히 포매 매질로서 혼합물을 제조해야 하는 것보다 더 적은 노력을 수반하고, 높은 독성을 갖는 포매 매질을 피하며, 탈수된 조직 샘플의 냉장 보관을 허용하는, 광학 현미경검사에 의한 조사를 위한 생물학적 조직의 투명한 조직 샘플을 제조하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적은 청구범위 제1항에 청구된 바와 같은 방법에 의해 본 발명에 따라 달성된다. 상기 목적은 또한 제10항에 청구된 바와 같은 키트 및 제13항에 청구된 바와 같은 용도에 의해 달성된다.
추가 구현예는 종속항의 발명대상(subject matter)이거나 또는 하기에 기술된다.
광학 현미경검사에 의한 조사를 위한 생물학적 조직의 투명한 조직 샘플을 제조하기 위한 본 발명에 따른 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 상기 조직 샘플을 탈수 용매로 탈수하는 단계, 및
b) 탈수된 조직 샘플을 조직과 일치하는 굴절률을 갖는 액체 포매 매질에 위치시킴으로써 상기 탈수된 조직 샘플을 투명화하는 단계.
포매 매질은, 바람직하게는 3-메톡시벤즈알데히드, 4-메톡시벤즈알데히드, 2-히드록시-5-메톡시벤즈알데히드 및 4-에톡시벤즈알데히드로부터 선택된 벤즈알데히드 아니솔 에테르를 포함한다.
본 발명에 따른 방법의 목적은 광학 현미경검사를 위한 생물학적 또는 인간 조직 샘플에서 광학 투명도를 달성하는 것이다. 생물학적 조직은, 예를 들어 인간 조직 또는 동물 조직이다.
투명화 방법의 투명화 단계는 굴절률을 현미경검사를 겪는 조직의 굴절률로 조정하는 것이다. 이를 위해, 조직 샘플은 굴절률의 조정을 위한 용액인 포매 매질로 옮겨진다. 포매 매질은 탈수 단계에서 사용되는 용매와 혼화성이어야 한다.
일 구현예에서, 포매 매질은 벤즈알데히드 에테르 10 부피% 내지 100 부피%, 및 약 1.3, 바람직하게는 약 1.5의 굴절률을 갖는 광학적으로 적합한 불활성 유기 용매 0 부피% 내지 90 부피%를 함유한다. 예를 들어, 포매 매질은 벤즈알데히드 에테르 90 부피% 내지 100 부피%를 함유한다.
또 다른 구현예에서, 포매 매질은 벤즈알데히드 에테르 10 부피% 내지 100 부피%, 및 약 2.0, 바람직하게는 약 1.65의 굴절률을 갖는 광학적으로 적합한 불활성 유기 용매 0 부피% 내지 90 부피%를 함유한다. 예를 들어, 포매 매질은 벤즈알데히드 에테르 90 부피% 내지 100 부피%를 함유한다.
본 발명에 따른 모든 백분율은 부피 기준 백분율 (vol%)이다.
바람직한 구현예에서, 포매 매질은 본 발명의 벤즈알데히드 아니솔 에테르로 이루어지며, 즉 벤즈알데히드 아니솔 에테르가 순수한 물질로서 사용된다. 여기서, 순수한 물질은 기술적으로 이용가능한 순도의 벤즈알데히드 아니솔 에테르를 의미하는 것으로서 이해된다.
벤즈알데히드 에테르는 벤즈알데히드 아니솔 에테르이다. 벤즈알데히드 아니솔 에테르는 바람직하게는 3-메톡시벤즈알데히드 (메타-아니스알데히드; CAS 번호 591-31-1), 4-메톡시벤즈알데히드 (파라-아니스알데히드; CAS 번호 123-11-5), 2-히드록시-5-메톡시벤즈알데히드 (6-히드록시-m-아니스알데히드; CAS 번호 672-13-9) 및 4-에톡시벤즈알데히드 (호모아니스알데히드; CAS 번호 10031-82-0)로부터 선택된다. 기술 제품으로서의 3-메톡시벤즈알데히드는 약 97.0%의 순도를 갖는다. 기술 제품으로서의 4-메톡시벤즈알데히드는 약 97.0%의 순도를 갖는다. 기술 제품으로서의 2-히드록시-5-메톡시벤즈알데히드는 약 98.0%의 순도를 갖는다. 기술 제품으로서의 4-에톡시벤즈알데히드는 약 99%의 순도를 갖는다.
탈수 단계 a)의 목적은 수분 무함유 조직 샘플을 얻는 것이다. 조직 샘플은 일 구현예에서, 조직으로부터 물을 제거하기 위해 바람직하게는, 감소하는 물 시리즈, 즉 증가하는 비율의 수혼화성 유기 용매를 함유하는 혼합물에서 다양한 탈수 조성물로의 다수의 계대배양(passage)으로 처리된다. 탈수 매질로서 알콜, 케톤 또는 에테르가 사용된다. 적합한 탈수 용매는, 예를 들어 에탄올, 메탄올, 이소프로판올, tert-부탄올 (IUPAC: 2-메틸프로판-2-올), 테트라히드로푸란 또는 아세톤이다.
여기서, 탈수 매질은 하기 성질을 갖는다: 1. 탈수 매질은, 물 및 고정제(fixative)가 증가하는 농도 시리즈에 의해 조직으로부터 점진적으로 제거될 수 있도록 하기 위해 물과 완전히 혼화성이고; 2. 탈수 매질은, 탈수된 조직의 굴절률로 조정된 굴절률을 갖는 포매 매질과 완전히 혼화성이다.
대안적인 구현예에서, 탈수 단계 a)는 2,2-디메톡시프로판 (DMP)을 사용하여 수행되며, 이는 조직 중에 존재하는 물과의 화학 반응에 의해 조직으로부터 상기 물을 제거한다.
본 발명에 따른 방법에서, 수분 무함유 조직 샘플을 얻기 위한 탈수 단계 a)는 일 구현예에서 하기 탈수 조성물의 사용을 포함한다:
- 에탄올의 증가하는 농도를 갖는 수성 에탄올로 구성되며, 여기서 탈수 조성물의 에탄올 농도는 30 부피% 내지 100 부피% 범위이거나, 또는
- 테트라히드로푸란의 증가하는 농도를 갖는 수성 테트라히드로푸란으로 구성되며, 여기서 탈수 조성물의 테트라히드로푸란 농도는 30 부피% 내지 100 부피% 범위이거나, 또는
- 메탄올의 증가하는 농도를 갖는 수성 메탄올로 구성되며, 여기서 탈수 조성물의 메탄올 농도는 30 부피% 내지 100 부피% 범위이거나, 또는
- 또 다른 알콜, 케톤 또는 에테르의 수성 혼합물로 구성되며, 여기서 탈수 조성물의 용매 농도는 30 부피% 내지 100 부피% 범위이다.
본 발명에 따른 방법의 대안적인 구현예에서, > 2%의 잔류 수분 함량을 갖는 조직 샘플을 얻기 위한 탈수 단계 a)는 하기 탈수 조성물을 사용하여 수행된다:
- 에탄올의 증가하는 농도를 갖는 수성 에탄올로 구성되며, 여기서 탈수 조성물의 에탄올 농도는 50 부피% 내지 98 부피%, 바람직하게는 70 부피% 내지 98 부피%, 보다 바람직하게는 75 부피% 내지 98 부피% 범위이거나, 또는
- 또 다른 알콜, 케톤 또는 에테르의 수성 혼합물로 구성되며, 여기서 탈수 조성물의 용매 농도는 50 부피% 내지 98 부피%, 바람직하게는 70 부피% 내지 98 부피%, 보다 바람직하게는 75 부피% 내지 98 부피% 범위이다.
바람직하게 사용되는 탈수 조성물은 탈수 단계의 최종 단계에서도 여전히 2 내지 30 부피%의 물을 함유한다. 이 구현예에서, 예를 들어 4 내지 6 부피%의 잔류 수분 함량을 갖는 변성 에탄올을 사용하는 것이 또한 가능하다.
본 발명에 따른 방법의 추가의 대안적인 구현예에서, 탈수 단계 a)는 구배 혼합기에서 수행된다. 이를 위해, 조직 샘플은 혼합 용기 (구배 혼합기)에 위치된다. 탈수 용매는 5 부피% 내지 20 부피%의 잔류 수분 함량에 도달할 때까지 유입구를 통해 도입된다. 탈수 용매는 100 부피%의 용매 농도 또는 2 부피% 내지 50 부피%의 잔류 수분 함량을 가질 수 있다. 하나의 변형에서, 구배 혼합기에서의 조직 샘플은 시작 시 50 부피%의 용매 농도를 갖는 탈수 용매 내로 직접 도입된 다음, 구배가 작은 증분으로 증가한다.
조직 샘플은 바람직하게는, 처음에 고순도 용매 중에서 인큐베이션(incubation)되지 않고 구배 혼합기로부터 포매 매질로 직접 옮겨진다. 바람직하게는, 고순도 용매 중에서의 인큐베이션 단계는 단계 a) 또는 단계 b)에서 일어나지 않는다.
이러한 방식으로 조직 샘플의 투명화가 가능하다는 것은 놀랍다. 선행기술에 따르면, 구배 혼합기에서의 방법은 하기와 같이 진행된다: 조직 샘플을 혼합 용기 (구배 혼합기)에 위치시킨다. 용기는, 예를 들어 상단에 유입구 및 측면 유출구를 갖는다. 50% 에탄올 중 샘플을 이 혼합 용기에 위치시키고, 고농도 (용매의 > 95 부피%)에서 유입구를 통해 정량 펌프로 도입되는 경우, 100 부피%의 값을 얻기 위해 점진적으로 시도하는 구배가 구축된다. 이는 샘플이 유리하게 꾸준히 증가하는 에탄올 함량을 공급받도록 한다. 혼합물로 100%에 도달하는 것은 불가능하기 때문에, 샘플은 일반적으로 후속으로 고순도 에탄올 중에서 인큐베이션된다. 선행기술에 따르면, 이 인큐베이션 단계는 다수의 횟수로 반복된다. 따라서, 정량 펌프는 비용의 이유로 기술 등급의 에탄올로 일상적으로 채워질 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 1. 무수 에탄올을 사용하는 최종 (선택적으로(optionally) 반복되는) 인큐베이션 단계는 불필요해지고, 2. 에탄올 함량이 약 80% 초과인 경우, 구배 혼합기로 도달한 종말점은 단계 b)에서 조직 샘플을 추가로 투명화하기에 충분하다.
추가의 대안적인 구현예에서, 탈수 단계 a)는 단일 계대배양으로 수행된다. 2회 이상의 계대배양을 포함하는 탈수 시리즈는 사용되지 않고; 대신에, 단계 a)에 따른 탈수는 조직 샘플을 적어도 70 부피%의 용매 농도를 갖는 탈수 용매에 위치시킴으로써 단일 계대배양으로 수행된다. 이 구현예는 물을 거의 흡수하지 않는 치밀한 조직을 갖는 조직 샘플에 특히 적합하다. 후속 단계 b)에서, 조직 샘플은 완전한 탈수를 위해 다시 고순도 용매 중에서의 인큐베이션 없이 즉시 포매 매질에 위치된다. 이는 상당한 시간 절약 및 동시에 또한 사용되는 시약에 대한 상당한 절약을 낳는다. 시약에 대한 절약은 첫째로, 필요한 용매의 더 적은 양에 기인한다. 둘째로, 더 이상 고순도 무수 용매를 사용할 필요가 없고; 대신에 기술 등급의 용매가 사용될 수 있다. 에탄올의 경우, 예를 들어 고가의 100% 고순도 에탄올을 사용하는 것이 필요하지 않고; 대신에 훨씬 저렴한 변성 에탄올이 사용될 수 있다. 선행기술에 따르면, 고순도 무수 용매를 사용한 인큐베이션은 물의 최종 흔적을 완전히 제거하기 위해 반복되며, 다수의 프로토콜 또한 동일한 이유로 포매 매질 중에서 인큐베이션을 반복한다. 본 발명의 두 구현예 모두에서 조직으로부터 잔류 수분의 확실한 제거를 위한 최종 인큐베이션이 생략되기 때문에, 본 발명의 방법은 시약에 대한 절약을 낳는다.
본 발명에 따른 방법의 일 구현예에서, 조직 샘플은, 이것이 단계 a)에서 탈수되고 단계 b)에서 광학적으로 투명화되기 전에,
·고정되고, 및/또는
·포름알데히드로 고정되고, 및/또는
·세척되고, 및/또는
·물로 세척되고, 및/또는
·비이온성 세제를 함유하는 알칼리 수용액 중에서 인큐베이션되고, 및/또는
·세제 용액을 사용하여 탈지되고 (탈지), 및/또는
·유기 용매를 사용하여 탈지되고 (탈지), 및/또는
·산화 시약을 사용하여 표백되고, 및/또는
·아미노 알콜을 사용하여 탈색된다.
본 발명에 따른 방법의 일 구현예에서, 조직 샘플은, 이것이 단계 a)에서 탈수되고 단계 b)에서 광학적으로 투명화되기 전에, 고정되고, 고정제는 하기로부터 선택된다:
- 가교 고정제, 예컨대 포름알데히드, 글루타르알데히드, 아크롤레인, 카르보디이미드, 디에틸 피로카보네이트, 비스이미도에스테르 또는 글리옥살 또는 이들의 혼합물, 및/또는
- 응고 고정제, 예컨대 알콜 및 다른 유기 용매, 산, 포타슘 디크로메이트, 납 니트레이트, 구리 술페이트, 및 수은 클로라이드 및 이들의 혼합물.
본 발명에 따른 방법은 바람직하게는, 조직 준비 단계 후 및 전기영동 단계 후에 수행된다. 따라서, 본 발명에 따른 방법에서 처리된 조직 샘플은 이미 전처리된 것일 것이다. 전기영동에 의한 전처리는 바람직하게는 DE 10 2016 123 458 B3에 기술된 전기영동 투명화 방법에 따라 수행된다. 전기영동 투명화의 성능에 대해, 특허 명세서 DE 10 2016 123 458 B3을 참조하고, 이의 내용은 본 출원에 통합된다.
본 발명에 따른 방법에서, 광학적으로 투명화된 조직 샘플은 바람직하게는 추가 단계에서, 샘플의 내부 구조의 이미지를 얻기 위해 광학 현미경 하에 조사되며, 상기 광학 현미경은 바람직하게는 광 시트 현미경, 공초점 현미경, 2 광자 현미경 또는 광학 투영 단층촬영 (optical projection tomography; OPT) 현미경이다.
현재까지 사용된 포매 매질인 디벤질 에테르 (DBE)는 n = 1.562의 굴절률을 갖는다. 제2 순수 물질인 에틸 신나메이트는 n = 1.559의 굴절률을 갖는다. 본 발명의 벤즈알데히드 아니솔 에테르 중에서, 예를 들어 3-메톡시벤즈알데히드는 n = 1.552의 굴절률을 갖고, 2-히드록시-5-메톡시벤즈알데히드는 n = 1.580의 굴절률을 갖는다. 탈수된 조직 샘플의 조직 투명화를 위한 포매 매질로서 본 발명의 벤즈알데히드 아니솔 에테르의 사용은 메틸 살리실레이트/벤질 벤조에이트 및 에틸 신나메이트로 처리된 조직 샘플의 투명도와 적어도 동일한, 일부 경우에 더 우수한 투명도를 달성하였다.
Spalteholz에 의한 연구는 이전에, 상이한 조직의 굴절률은 서로 약간 상이하다는 것을 제안하였다. Spalteholz의 1911년 원본 간행물은 일련의 인간 조직을 메틸 살리실레이트 및 BB의 최적 혼합 비를 기반으로 실험적으로 결정된 증가하는 굴절률의 순서로 열거한다: 어린 배아 (중량에 따라 5:1 내지 3:1) < 성인 탈회된 뼈 (5:3) n = 1.547 < 오래된 배아와 거의 동일한 성인 근육 (2:1) < 뇌 및 척수 (1:1). 이러한 변동성은 상이한 조직의 투명도 및 현미경검사에 의한 상기 조직의 조사, 및 특히 현미경을 사용하여 수행될 수 있는 정량적 분광 결정에 직접적인 영향을 미친다. 본 발명에 따른 방법은, 조직의 굴절률에 근접하도록 조직 유형에 따라 선택될 수 있는 포매 매질로서 다양한 순수한 물질이 사용되는 이점을 제공한다.
현재까지 포매 매질로서 전형적으로 사용되는 혼합물인 벤질 벤조에이트/벤질 알콜 혼합물 (BABB) 및 메틸 살리실레이트/벤질 벤조에이트와 비교하여, 벤즈알데히드 아니솔 에테르는, 디벤질 에테르와 마찬가지로, 이들이 순수한 물질의 형태로 사용될 수 있다는 이점을 갖는다: 목적하는 굴절률이 순수한 물질에 의해 이미 달성되기 때문에, 포매 매질의 혼합을 통해 굴절률이 설정될 필요가 없다. 이는 혼합 단계 및 따라서 불필요한 작업 단계 및 가능한 오류 원인을 제거한다.
놀랍게도, 본 발명의 벤즈알데히드 아니솔 에테르는 현재까지 알려져 있는 포매 매질보다 훨씬 더 신속하게 탈수된 조직에 침투하고, 조직을 신속하게 투명하게 만든다. 이는 샘플의 제조 시 시간을 절약하여, 샘플이 광학 현미경 하의 조사에 보다 신속하게 제공되도록 한다. 이에 따라, 광학 현미경검사 조사의 결과 또한 보다 신속하게 이용가능하게 된다. 탈수된 조직의 밀도는, 조직 중에 여전히 존재하는 탈수 용매, 예를 들어 에탄올의 밀도에 의해 결정된다. 포매 매질은 전형적으로 더 높은 밀도를 갖기 때문에, 조직 샘플 내로의 포매 매질의 완전한 침투는 포매 매질에서의 조직 샘플의 침강에 의해 용이하게 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 2-히드록시-5-메톡시벤즈알데히드를 사용하여, 포매 매질은 단 30 내지 45분 후에 조직 샘플 내로의 완전한 침투를 달성하며, 즉 조직 샘플은 용기 바닥에 놓여 있다. 반면에, 디벤질 에테르 또는 메틸 살리실레이트/벤질 벤조에이트 혼합물과 같은 종래의 포매 매질을 사용하는 경우, 이 방법 단계는 전형적으로 수시간에서 밤새 걸린다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은, 포매 매질이 조직 샘플의 조직 내로 보다 신속하게 확산되어 샘플의 제조 시 상당한 시간 절약을 달성한다는 이점을 제공한다. 따라서, 조직 샘플은 광학 현미경검사에 의해 보다 신속하게 조사될 수 있다.
조직 샘플이 잔류 물을 함유하고, 이 물이 더 이상 용해될 수 없는 포매 매질로서의 유기 용매로 옮겨지는 경우, 물은 조직 내에 포획되게 되고, 이러한 불완전한 혼화성으로 인하여, 탁도가 발생하여 투명도에 불리하게 영향을 미친다. 따라서, 현재까지 샘플의 투명도에 불리하게 영향을 미치는 것을 피하기 위해 조직 샘플이 고순도 에탄올로 다수의 횟수로 인큐베이션되고, 종종 후속적으로 포매 매질로 반복적으로 인큐베이션되는 것이 관례였다. 선행기술에 따르면, 이미 설명된 바와 같이, 물의 최종 흔적을 완전히 제거하기 위해 고순도 무수 용매를 사용한 인큐베이션이 반복되며, 다수의 프로토콜 또한 동일한 이유로 포매 매질 중에서 인큐베이션을 반복한다.
조직의 투명화는 본 발명에 따라 벤즈알데히드 아니솔 에테르를 사용하여 수행된다. 놀랍게도, 잔류 물을 함유하는 조직 샘플의 경우에도 또한 우수한 투명도가 달성될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 2 내지 5 부피%의 작은 잔류 수분 함량에서는, 투명도에 대한 불리한 영향이 관찰되지 않으며, 처리되는 조직의 유형에 따라 최대 20 부피% 또는 최대 30 부피%의 높은 수분 함량에서도, 여전히 광학 현미경검사에 의한 샘플의 조사를 허용하는 오직 매우 낮은 탁도가 관찰된다.
따라서, 본 발명에 따른 방법은 조직 샘플을 탈수하기 위한 특히 신속하고 단순한 방법을 제공하는데, 이는 현재까지 알려져 있는 모든 포매 매질과 달리 최대 10 부피%의 낮은 잔류 수분 함량이 광학 현미경검사의 결과에 불리한 영향을 미치지 않으며, 더 많은 양의 잔류 물을 갖는 경우에도 조직 샘플에서 허용가능한 투명도가 달성되기 때문이다.
본 발명에 따른 방법은 또한, 종래의 포매 매질을 사용하는 투명화 방법과 비교하여 단순화된 절차를 허용한다. 선행기술에 따르면, 조직 샘플은 탈수 동안 용기로부터 탈수 용매의 증가하는 농도를 갖는, 예를 들어 에탄올의 증가하는 농도를 갖는 용기로 옮겨진다. 이는 상당히 많은 개별 단계를 필요로 하며, 이들은 별개의 단계이다. 또한, 고순도 용매, 예를 들어 고순도 에탄올의 사용은 최종 단계(들)에서 항상 필요하다.
본 발명에 따른 방법에서, 물의 잔류 함량을 갖는 탈수 용매를 사용하는 것이 또한 가능하다. 예를 들어, 고순도 에탄올 대신에 변성된 95 내지 97%의 기술 등급의 에탄올이 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 또한, 사용되는 용매의 비용을 절감시킨다.
본 발명에 따른 방법은 또한, 구배 혼합기를 사용하는 경우 단순화된 절차를 허용하는데, 고순도 용매를 사용한 후속의 완전한 탈수에 대한 필요성이 또한 없기 때문이다.
또한, 벤즈알데히드 아니솔 에테르는 낮은 독성을 갖는다. 이는, 현미경에서의 조직 샘플이 사용자의 기도 바로 아래에 위치하여 사용자가 샘플로부터 올라오는 증기를 흡입할 수 있기 때문에, 포매 매질로서 사용되는 경우 유리하다. 유럽화학물질청 ECHA에 따르면, 파라-아니스알데히드의 독성은, 디벤질 에테르 또는 벤질 벤조에이트/벤질 알콜 혼합물과 달리 독성학적 우려를 갖지 않는다.
광학 현미경검사를 위한 생물학적 조직 샘플을 제조하기 위한 본 발명에 따른 키트는
- 상기 조직 샘플을 탈수하기 위한 탈수 용매, 및
- 탈수된 조직 샘플을 포매 매질에 위치시킴으로써 상기 탈수된 조직 샘플을 투명화하기 위한 포매 매질을 포함하며,
여기서
포매 매질은, 3-메톡시벤즈알데히드, 4-메톡시벤즈알데히드, 2-히드록시-5-메톡시벤즈알데히드 및 4-에톡시벤즈알데히드로부터 선택된, 상술한 바와 같은 벤즈알데히드 아니솔 에테르이다. 벤즈알데히드 아니솔 에테르는 바람직하게는 상술한 농도 및 순도로 이용된다.
키트에서의 탈수 용매는 에테르, 케톤 또는 알콜이고, 바람직하게는 용매는 에탄올, 메탄올, 이소프로판올, tert-부탄올, 2,2'-티오디에탄올, 트리클로로에탄올, 테트라히드로푸란 및 아세톤으로부터 선택된다.
본 발명에 따르면, 3-메톡시벤즈알데히드, 4-메톡시벤즈알데히드, 2-히드록시-5-메톡시벤즈알데히드 및 4-에톡시벤즈알데히드로부터 선택된 벤즈알데히드 아니솔 에테르는 광학 현미경검사에 의한 조사를 위한 생물학적, 특히 인간 조직 샘플을 제조하기 위한 포매 매질로서 사용된다.
본 발명에 따라 사용되는 벤즈알데히드 아니솔 에테르는 바람직하게는 상술한 농도 및 순도로 사용된다.
실시예 1
약 0.25 ml (0.5 x 0.5 x 1 cm3)의 부피를 갖는 여러 조직 샘플 (돼지 폐)을 무수 에탄올 중에서 탈수하고, 촬영하였다. 에탄올로 탈수된 조직 샘플은 도 1 좌측에 도시되어 있다.
이어서, 탈수된 조직 샘플을 3시간 동안 각각의 포매 매질 5 ml에 위치시켰다. 사용된 포매 매질은 본 발명에 따른 2-히드록시-5-메톡시벤즈알데히드, 및 비교예로서 2-히드록시-5-메톡시벤즈알데히드의 굴절률로 조정된 굴절률을 갖는 벤질 벤조에이트와 메틸 살리실레이트의 혼합물이었다. 투명화 단계의 결과 또한 촬영하였다. 결과는 도 1 우측에 도시되어 있다. 메틸 살리실레이트/벤질 벤조에이트를 사용한 투명화는 조직 샘플에서 이미 우수한 투명도를 낳는다는 것이 밝혀졌다. 그러나, 본 발명의 2-히드록시-5-메톡시벤즈알데히드로 달성된 투명도는 훨씬 더 우수하였다.
실시예 2
약 0.25 ml (0.5 x 0.5 x 1 cm3)의 부피를 갖는 여러 조직 샘플 (돼지 폐)을, 포매 매질로서 2-히드록시-5-메톡시벤즈알데히드, 에틸 신나메이트 및 디벤질 에테르를 사용하여 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조하였다.
이어서, 조직 샘플을 밤새 무수 에탄올 중에 보관하였고, 따라서 다시 포매 매질을 조직 샘플에서 세척하였다. 조직 샘플을 규정된 수분 함량을 갖는 에탄올로 옮겨, 조직 내 규정된 잔류 수분 함량을 달성하고, 2시간 동안 인큐베이션한 다음, 촬영을 위해 각각의 포매 매질에 다시 위치시켰다. 조직 샘플을 95 부피%, 90 부피% 및 80 부피%의 에탄올 함량을 갖는 에탄올에 위치시켰다. 결과를 촬영하였으며, 이는 도 2에 도시되어 있다. 제1 행은 포매 매질에서 100% 탈수된 조직 샘플을 나타내고, 제2 행은 포매 매질에서 5 부피%의 수분 함량을 갖는 에탄올 중에서 인큐베이션된 조직 샘플을 나타내고, 제3 행은 포매 매질에서 10 부피%의 수분 함량을 갖는 에탄올 중에서 인큐베이션된 조직 샘플을 나타내고, 제4 행은 포매 매질에서 20%의 수분 함량을 갖는 에탄올 중에서 인큐베이션된 조직 샘플을 나타낸다. 하단 행은 무수 에탄올 중, 즉 이들이 각각의 포매 매질에 위치되기 전의 동일한 조직 샘플을 나타낸다. 모든 샘플은 에탄올에서 완전히 탈수되는 경우 동일한 불투명도를 갖는다.
선행기술로부터 알려져 있는 포매 매질 디벤질 에테르 및 에틸 신나메이트는 잔류 수분이 없거나 또는 오직 매우 적은 양의 잔류 수분이 있는 경우에만 목적하는 투명도를 달성하는 것으로 밝혀졌다. DBE의 경우, 5 부피%의 잔류 수분 함량은, 샘플이 더 이상 투명하지 않아 현미경 하에 조사될 수 없도록 하기에 충분하다. 95%의 잔류 수분 함량에서, ECi 또한 이미 명확한 혼탁을 나타내며, 조직 샘플은 더 이상 완전히 투명하지 않다. 반면에, 2-히드록시-5-메톡시벤즈알데히드를 사용하여 투명화된 조직 샘플은 10 부피%의 잔류 수분 함량 (90 부피%의 에탄올)에서도 완전히 투명하게 유지되고, 오직 20%의 잔류 수분 (80%의 에탄올 함량)에서 약간 혼탁을 나타낸다.
실시예 3
약 0.25 ml (0.5 x 0.5 x 1 cm3)의 부피를 갖는 조직 샘플을 무수 에탄올에서 탈수하였다. 이어서, 이들을 샘플 용기 내 포매 매질로 옮겼다. 사용된 포매 매질은 본 발명에 따른 2-히드록시-5-메톡시벤즈알데히드, 및 비교예로서 디벤질 에테르 및 메틸 살리실레이트와 벤질 벤조에이트의 혼합물이었다. 2-히드록시-5-메톡시벤즈알데히드의 경우, 조직 샘플은 15분 후에 이미 명백하게 표면 아래로 침강되었고, 조직 유형에 따라 30 내지 45분 후에 용기 바닥 상에 놓여 있는 것이 관찰되었다. 디벤질 에테르에서, 조직 샘플은 메틸 살리실레이트/벤질 벤조에이트 및 DBE의 혼합물에 요구되는 시간에 필적할 만하게, 바닥으로 침강되는 데 수시간이 걸렸다.
추가 실험에서, 조직 샘플 중 탈수 용매 에탄올이 포매 매질에 의해 대체되는 속도를 결정하였다. 사용된 포매 매질은 본 발명에 따른 2-히드록시-5-메톡시벤즈알데히드, 및 비교예로서 디벤질 에테르 및 에틸 신나메이트였다. 조직 샘플을 15분, 30분 및 70분 동안 포매 매질에 위치시킨 다음, 촬영하였다. 결과는 도 3에 도시되어 있다. 상단 행에서, 조직 샘플은 15분 동안 투명화 후 촬영되었다. 중앙 행에서, 조직 샘플은 30분 동안 투명화 후 촬영되었다. 하단 행에서, 조직 샘플은 70분 동안 투명화 후 촬영되었다. 2-히드록시-5-메톡시벤즈알데히드로 처리된 조직 샘플은 70분 후에 이미 투명해진 반면, ECi로 처리된 샘플은 오직 약간의 투명도를 나타내고, DBE로 처리된 조직 샘플은 아직 전혀 투명하지 않은 것을 볼 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 투명화 방법은 조직 샘플의 훨씬 더 신속한 투명화를 달성한다.
본 발명은 상술한 구현예 중 하나에 제한되지 않지만, 다양한 방식으로 변형될 수 있다.
방법 단계를 포함하여 청구범위, 설명 및 도면으로부터 명백한 모든 특징 및 이점은 그 자체로 또는 다양한 조합으로 본 발명에 필수적일 수 있다.
Claims (13)
- 광학 현미경검사에 의한 조사를 위한 생물학적 조직의 투명한 조직 샘플을 제조하기 위한 방법으로서,
a) 상기 조직 샘플을 탈수 용매로 탈수하는 단계, 및
b) 탈수된 조직 샘플을 3-메톡시벤즈알데히드, 4-메톡시벤즈알데히드, 2-히드록시-5-메톡시벤즈알데히드 및 4-에톡시벤즈알데히드로부터 선택된 벤즈알데히드 아니솔 에테르를 포함하는 포매 매질(embedding medium)에 위치시킴으로써 상기 탈수된 조직 샘플을 투명화(clearing)하는 단계를 포함하는 방법. - 제1항에 있어서, 상기 포매 매질이 상기 벤즈알데히드 아니솔 에테르 10 부피% 내지 100 부피%, 및 약 1.3, 바람직하게는 1.5의 굴절률을 갖는 광학적으로 적합한 불활성 유기 용매 0 부피% 내지 90 부피%를 함유하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 포매 매질이 상기 벤즈알데히드 아니솔 에테르 10 부피% 내지 100 부피%, 및 약 2.0, 바람직하게는 1.65의 굴절률을 갖는 광학적으로 적합한 불활성 유기 용매 0 부피% 내지 90 부피%를 함유하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포매 매질이 3-메톡시벤즈알데히드, 4-메톡시벤즈알데히드, 2-히드록시-5-메톡시벤즈알데히드 및 4-에톡시벤즈알데히드로부터 선택된 벤즈알데히드 아니솔 에테르로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탈수 단계 a)가 수성 알콜, 케톤 또는 에테르로 구성된 탈수 조성물의 사용을 포함하고, 상기 탈수 조성물은, 알콜, 케톤 또는 에테르의 수성 혼합물로서, 상기 탈수 조성물의 용매 농도는 50 부피% 내지 98 부피%, 바람직하게는 70 부피% 내지 98 부피%, 보다 바람직하게는 75 부피% 내지 98 부피%인 수성 혼합물이며, 바람직하게는 에탄올의 증가하는 농도를 갖는 수성 에탄올의 수성 혼합물로서, 상기 탈수 조성물의 에탄올 농도는 50 부피% 내지 98 부피% 범위인 수성 혼합물인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탈수 단계 a)가 구배 혼합기에서 수행되고, 상기 조직 샘플이 상기 탈수 단계의 시작 시 50 부피%의 용매 농도를 갖는 탈수 용매 내로 직접 도입된 다음, 구배가 작은 증분으로 증가되는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직 샘플이, 단계 a)에서 탈수되고 단계 b)에서 광학적으로 투명화되기 전에,
· 고정되고, 및/또는
· 포름알데히드로 고정되고, 및/또는
· 세척되고, 및/또는
· 물로 세척되고, 및/또는
· 알칼리 수용액 중에서 인큐베이션(incubation)되고, 및/또는
· 세제 용액을 사용하여 탈지되고, 및/또는
· 유기 용매를 사용하여 탈지되고, 및/또는
· 산화 시약을 사용하여 표백되고, 및/또는
· 아미노 알콜을 사용하여 탈색되는 것을 특징으로 하는, 방법. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직 샘플이, 단계 a)에서 탈수되고 단계 b)에서 광학적으로 투명화되기 전에, 고정되고, 고정제가 하기로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법:
- 포름알데히드, 글루타르알데히드, 아크롤레인, 카보디이미드, 디에틸 피로카보네이트, 비스이미도에스테르 또는 글리옥살 또는 이들의 혼합물과 같은 가교 고정제, 및/또는
- 알콜 및 다른 유기 용매, 산, 포타슘 디크로메이트, 납 니트레이트, 구리 술페이트 및 수은 클로라이드 및 이들의 혼합물과 같은 응고 고정제. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 광학적으로 투명화된 조직 샘플의 내부 구조의 이미지를 얻기 위해 상기 광학적으로 투명화된 조직 샘플이 추가 단계에서 현미경 하에 조사되며, 상기 현미경은 광학 현미경인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 광학 현미경검사를 위한 생물학적 조직 샘플을 제조하기 위한 키트로서,
- 상기 조직 샘플을 탈수하기 위한 탈수 용매, 및
- 탈수된 조직 샘플을 포매 매질에 위치시킴으로써 상기 탈수된 조직 샘플을 투명화하기 위한 포매 매질을 포함하며,
상기 탈수 용매는 알콜, 케톤 또는 에테르이고,
상기 포매 매질은 3-메톡시벤즈알데히드, 4-메톡시벤즈알데히드, 2-히드록시-5-메톡시벤즈알데히드 및 4-에톡시벤즈알데히드로부터 선택된 벤즈알데히드 아니솔 에테르인, 키트. - 제10항에 있어서, 상기 벤즈알데히드 아니솔 에테르가 3-메톡시벤즈알데히드, 4-메톡시벤즈알데히드, 2-히드록시-5-메톡시벤즈알데히드 및 4-에톡시벤즈알데히드로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 키트.
- 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 탈수 용매가 에탄올, 메탄올, 테트라히드로푸란, 이소프로판올, tert-부탄올, 2,2'-티오디에탄올, 트리클로로에탄올 및 아세톤으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 키트.
- 광학 현미경검사에 의한 조사를 위한 생물학적 조직 샘플을 제조하기 위한 포매 매질로서의, 3-메톡시벤즈알데히드, 4-메톡시벤즈알데히드, 2-히드록시-5-메톡시벤즈알데히드 및 4-에톡시벤즈알데히드로부터 선택된 벤즈알데히드 아니솔 에테르의 용도.
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