HU230296B1 - Eljárás optikai vizsgálatok célját szolgáló, nagy vastagságú preparátumok előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya összetett hisztotechnikai eljárás, amely optikai, különösen fénymikroszkópos vizsgálatok célját szolgáló, nagy vastagságú preparátumok vízben, vagy vízben is oldódó anyagokkal történő átderítését, dehidrálását, konzerválását és lefedését, a preparátumok egészben történő festését, valamint a szövetek pillanatnyi alakját megőrző fixálását, továbbá biológiai szövetek élő állapotban történő optikai, különösen vitális mikroszkópos megfigyelése során a szövetek fiziológiás körülmények között történő átderítését és a preparátumok egyes komponenseinek törésmutatói között fennálló finom törésmutató különbségek szelektív meghatározását teszi lehetővé.

Description

A találmány tárgya olyan összetett hisztoteehnikai eljárás, amely optikai, vizsgálatok célját szolgáló, nagy vastagságú preparátumok létrehozását; ennek részeként vízoldékony vegyüiettel vagy vegyöietekkei történő átderitését, valamint fixálását, festését, dehidrálását, konzerválását, lefedését és tárolását, továbbá biológiai szövetek élő állapotban, fiziológiás körülmények között történő átderitését; az élő szövetek működés közben fennálló morfológia elrendeződésének megőrzését, továbbá preparátumok egyes komponensei törésmutatóinak szelektív meghatározásai teszi lehetőse

A technika állását illetően ismert tény, hogy nagy kiterjedésű, a szokásosnál lényegesen vastagabb preparátumoknak, (így pld. nagy vastagságú metszeteknek, nagyobb szövegblokkoknak, egész szeneknek, vagy akár egész szervezeteknek) optikai vizsgálatok számára valő alkalmassá tétele mindezidáig több tekintetben, a biológiai, és ezen belül a különösen szövettani preparációs technika legkevésbé megoldott problémái közé tartozott.

A legjelentősebb korlátok egyikét az ilyen jellegű preparátumok átlátszóvá tételének, (a hiszíotechnikai szakirodalomban alkalmazott szakkifejezéssel; átderítésének), nehézségei képezték.

Még kevésbé voltak meg a feltételei az átderített preparátumokon végzett, ún. vitális mikroszkópos vizsgálatoknak, azaz a biológiai szövetek élő állapotban történő fénymikroszkópos tanulmányozásának, ám nem volt lehetséges az igen vastag szövetrétegek egyenletes festése sem,

A szövettani preparátumok készítésének eddigi történetét végigkísérte az a probléma Is, hogy a szövetek fixálására használt vegyületek bizonyos mértékben mindég zsugorítanak, s ez a folyamat egyes fixálószerek esetében számottevő mértékű lehet, A kiterjedt preparátumok tárolása, valamint konzerválása szintén számos nehezen kezelhető problémát vetett fel.

Ismeretes ugyanakkor, hogy az optikai vizsgálatokhoz használt nagyhóeszkőzők rnéhxégélessége, (az egyidejűleg leképezhető réteg sastagságat nz optika egyik alapvető törvényének értelmében, a nagyítással inverz arányban áll, azaz. a nagyítás növelésével rohamosan csökken,

A fén> mikroszkópok eseteben. ennek következtében, a mélységélesség kiterjedése már a mikronos tartományban van. Ilyen eszközök alkalmazása tehát nagyobb vastagságú szövet rétegek egyidejű leképezését eleve nem tette lehetővé. így, az erre a célra alkalmas preparátumok létrehozásának problémái a háttérben maradtak, és az ezeknek nehézségeknek elhárítására tett kísérletek igy szintén várattak magukra, A mikroszkópos struktúrák térbeli felépítését sorozatmetszetek rendkívül körülményes és időigényes rekonstrukciója segítségével próbálták tanulmányozni,

A Stuber L Nagy G, és Petrák P, 1986-os szabadalma szerinti, sztereokonverter néven ismert eszköz alkalmazása azonban jelentősen megváltoztatja ezeket az optikai

2/26 viszonyokat. Amint az ma mar ismeretes, ennek a berendezésnek bármely nagyítórendszer sugármenetébe törtnő beiktatása ötszörösen megnöveli az adod eszköz hasznos nagyítását, s ugyanakkor a mélységélességnek a konvencionális optikai rendszerek esetében elkerülhetetlenül bekövetkező csökkenése teljes mértékben elmarad. Ez tehát azt. jelenti, hogy jelentős eltolódás jön létre az alkalmazott nagyítás és a hozzá tartozó mélységéi esség között, hiszen az ötszörösen megnövekedett nagyítás az eredeti nagyítási értékhez tartozó, egy nagyságrenddel (húsz-hartnincszorosan) nagyobb mélységélességgel kombinálódik.

Az optikai rendszer sugármenetét bármely önmagában ismert módszerrel megkettözve sztereo-vetület hozható létre, s a kép valódi háromdimenziós, (true 3D) látvány formájában szemlélhető. A fénymikroszkópok esetében ez azt jelenti, hogy létrejött az igen nagy nagyításé, s egyidejűleg rendkívül kiterjedt mélységélességü sztereomikroszkóp.

A sztereokonverter alkalmazása tehát a korábbiaktól jelentősen eltérő lehetőségeket biztosít az optikai vizsgalatok terén. Lehetővé teszi nagy vastagságú preparátumok tömeges mikroszkópos vizsgálatát, s nagy nagyítás mellett is lehetőséget nyújt a szövetek háromdimenziós struktúrájának tanulmányozására. ami a technikai lehetőségek hiányában eddig a természettudományok legkevésbé feltárt terüknél közé tartozott.

A jelen szabadalom első szerzőjének, dr, Stuber Istvánnak munkacsoportja a. sztereokonverter fejlesztésével és alkalmazásával párhuzamosan egy olyan, széleskörű, optikai, mechanikai, elektronikai és számítástechnikai eszközökből,valamint szoftverekből álló háromdimenziós megjelenítő, mérő-, modellező, mozgáselemzö, és műtéti navigációs rendszert, (a továbbiakban; háromdimenziós mérőrendszer), is kifejlesztett, amellyel kapcsolatban dr. Stuber István. Szabados László és dr. Korom Csaba 2008-ban találmányi bejelentést tettek.,

C rendszer alkalmazása lehetővé teszí, hogy a jelentősen megváltozott geometriájú sztereo-képpárokon precíziós háromdimenziós méréseket végezzünk, a létrejött térbeli ponthalmazokat háromdimenziós grafikai módszerek segítségévek plasztikus, valódi háromdimenziós, (true 3D) látvány formájába?'! szemlélhető, árnyékolt, szoborszerű felületek formájában íelenitsük meg. továbbá az mérések eredményét matematikailag elemezzük és modellezzük. Mindezeknek a lehetőségeknek az együttes alkalmazása a térbeli struktúrák vizsgálatának egészen új lehetőségeit kínálja.

Dr, Stuber István és munkatársai számára már a sztereokonverter feltalálásakor nyilvánvaló volt, hogy a továbbiakban elkerülhetetlen lesz a különösen vastag preparátumok készítésével kapcsolatos, korábban figyelmen kívül hagyott problémák megoldása,

Ezért a műszaki berendezések fejlesztésével párhuzamosan sorra hozták létre azokat, a jelen találmányi bejelentésben tárgyalt metódusokat, amelyek ezeket a nehézségeket hivatottak áthidalni. Ezek az eljárások szervesen kiegészítik a sztereokonverter alkalmazásával működő optikai rendszerek, és a háromdimenziós mérőrendszer működését, és lehetővé teszik az általuk kínált új lehetőségek kiaknázását

Az. hogy ezek a módszerek csak most kerülnek publikálásra, azzal az akaratlan előnnyel jár, hogy az eljárásokkal kapcsolatban szokatlanul bosszú távú és igen gazdag tapasztalatra volt módjuk szert tenni, s ez biztonsággal igazolta a/ok használhatóságát.

Mint ismeretes, egy preparátum átderítésének lényegét az képezi, hogy a

3/26 vizsgálandó anyagot annak törésmutatójával azonos, vagy ahhoz igen közel álló törésmutatójú folyadékkal, vagy folyékony halmazállapotú, majd később megszilárduló vegyszerrel itatjuk át, s ezáltal az anyag egyes komponensei között fennálló törésmutatókülönbségeket minél inkább kiegyenlítjük.

Ebben az esetben a preparátumon áthaladó fény nem szenved diffrakciót az anyag egyes, apró alkotóelemein, s nem szóródik szét annak belsejében, azaz nem válik áttetszővé. Utóbbi esetben ugyanis a vizsgált struktúrák' képe az optikai vizsgálatkor elmosódik,

A különlegesen vastag preparátumok kiderítésével kapcsolatos, idestova egy évszázadot átívelő problémák lényegét mindmáig az képezte, hogy nem sikerük olyan oldatot létrehozni, amelynek segítségével az átderítés vizes oldatban minden igényt kielégítő módon elvégezhető.

A gyakorlatban szinte kizárólagosan használt, 1914 óta ismert Spakeholtz-féle eljárásnak, valamint e technika módosításainak, amellett, hogy kiváló eredményt biztosítanak, súlyos, közös hátránya, hogy az áíderítést vízben egyáltalán nem oldódó folyadékokkal, (Gaulthería olajjal, meti Iszallci láttál, metilbenzoáttal, benzllbenzoáttal isosafrollak a Drahn-féle oldat esetében ietralinnal és naftahnnal, stb,) oldják üteg.

Az átderítés létrejöttének tehát elengedhetetlen feltétele az anyag tökéletes debidrálása, ahol minimális kompromisszumra sincs lehetőség, hiszen ha az anyag csak nyomnyí mennyiségben is vizet tartalak a preparátum opálosan áttetsző marad, s a dehídrálási meg kell Ismételni.

A vízelvonást a hisztotecbnika területén felszálló alkoholsorban szokás végezni, amelyből az anyag végül több váltás xilolon, vagy benzolon, mint intermedier folyadékon keresztüljut az átderitő oldatba. Az utolsó víznyomók eltávolítására preparátumok a xilolt megelőzően még xilol-fenol keverékbe kerülhetnek,

A több lépcsős, gondos dchidrálás azonban nagyobb szőveíblokkok, különösen pedig egész szervek, vagy szervkomplexusok esetében hónapokat is igénybe vehet. Ezért a Spalteholtz technika alkalmazása a gyakorlatban nem teszi lehetővé átderített preparátumok gyors és tömeges vizsgálatát.

A preparátumoknak azokat átderitő, és bizonyos idő elteltével megszilárduló folyadékba történő bezárása, ííusztotcehnikaí szakkifejezéssel: lefedése), a szövettan területén ma is elsősorban Canada balzsammal, ritkábban egyéb gyantákkal, újabban pedig egyre elterjedtebben különböző átlátszó műanyag oldatokkal történik. Ezeknek az eljárásoknak az alkalmazásával lefedett metszetek vastagsága azonban technikai okok miatt általában nem lépi át 150 mikronos határt

Éppen ezért a szövettani technika fejlődésének egészen korai korszakától, a XIX. század végétek a XX. század elejétől kezdve erőfeszítések történtek olyan, vízoldékony átderitő oldatok létrehozására, amelyek a hosszadalmas dchidrálás mellőzésével, közvetlenül a nedves anyagba behatolva, rövid időn belül számottevő átderitő hatást eredményeznek. Ezeket a próbálkozásokat azonban mindezidáig nem kísérte valós siker,

A hlszíoíechnika tudományágának első számú, igazodási pontként számon tartott alapműve Benno Romeis számos kiadást megért Mikroskoplsche Technik cimú kézikönyve, amely teljes kiterjedésében felöleli az ezen a tudományterületen a XX. század első évtizedeitől, a könyv általunk ismert utolsó kiadásáig, (I989~íg) terjedő időszakban

4/26 létrejött valamennyi szövetfeni technikai eljárást. Nagy biztonsággal fehéteíezhetjük tehát hogy az. ebben a szakkönyvben tárgyalt, átderítésí eljárásokon kívül az utóbbi időpontig nem születtek egyéb módszerek ennek a feladatnak a megoldására,

A Romeis tele kézikönyv tanúsága szerint biológiai anyagok vizes oldatban történő átderítésére korábban elsősorban a glicerint alkalmazták. Ez a vegyület azonban csak korlátolt mértékben felelt meg az elvárásoknak, hiszen törésmutatója is kissé alacsonyabb a kelleténél, ugyanakkor agresszív vizel vonó szer lévén, tömény oldatban alkalmazva, a preparátum túlzott zsugorodását okozza.

Glicerin és zselatin kombinációját tartalmazza a Kaiser által 1880-ban leírt kocsonyásán megszilárduló lefedő oldat, amely lórmaíinnal kezelve megkentemediL ám igy Is átlátszó marad. Az ily módon lefedett preparátumok vastagsága ugyanakkor szintén nem szokta meghaladni az 1-2 millimétert

Az Ápáthy-féle, gumiarábikumot és kristálycukrot tartalmazó, a XX. század első felében viszonylag eltcrjedten használt, mára azonban a hisztotechníkai gyakorlatból majdhogynem teljesen kiszorult gmniszirupot szintén csak szövettani metszetek esetében alkalmazták,

Szóba jött ezen kívül még a levulóz, amely alacsony (1,3 körüli) törésmutatója miatt szintén csak korlátolt mértékben bizonyult alkalmasnak. Ezeket a vegyületeket a jelen találmányi bejelentés szerinti eljárás keretben alkalmazott átderítö oldatnak az első két igénypontban megjelölt lényegi alkotóelemei közül kizártuk.

Amikor tehát a jelen találmányt leírás szerzői közül dr. Stuber István, diákkörösének, Mező Jánosnak közreműködésével felfedezte a írietanolamin igen erőteljes átderítö hatását, ez a megállapítás valóban újdonságot képezett, s új utat nyitott meg a vizoidékony átderitő oldatok fejlesztése terén,

Hasonló volt a helyzet az ezt követö,1995 és 1997 közötti periódusban is, amikor dr. Stuber István és közvetlen munkatársa, néhai dr. Magyar! József biológus számos újabb vegyüíetről állapította meg, hogy azok vizes oldatban átderítö hatással rendelkeznek.

Ekkor történt meg számos, különösen intenzív hatású, és egyes szövetféleségek specifikus vizsgálatára alkalmas összetett átderítö oldat kidolgozása, és ekkor születtek meg azok az alapvető felismerések is, amelyeknek figyelembe vételével a szóba jöhető vegyületek köre folyamatosan bővült, olyannyira, hogy mostanra már általános konzekvenciák levonása is lehetővé vált.

A szakirodalomban, ismereteink szerint, az utóbbi másfél évtizedben is csak elvétve jelentek meg olyan információk, amelyek vizes oldatok átderítö hatásával állnak kapcsolatban,

A legutóbbi években tűnt fel a piacon egy távol-keleti cég Focus Clear márkanéven ismert gyártmánya, amely ezt a célt szolgálja. Az oldat pontos összetétele azonban, ~ a tudományos életben meglehetősen szokatlan módon -, titkos.

A szakirodalom tanulmányozása alapján megállapítható, hogy a termék hátterében Ann-Shyn Chiang 2002.-ben megadott szabadalma áll. A szabadalom szerinti, átderitő hatású vizes oldat dimetil-szulfoxidot, diatrízoát savat, etilén-diamin tetraaeetátot, giucamint, béta-níkotlnamid adenin dinucleotid foszfátot, Na-diatrízoátot, és poüoxtalkalén származékokat, (Tween 20) tartalmaz. Önmagukban, vagy különböző kombinációikban.

5/26

A szerző azonban semmiféle felvilágosítási nem ad arra vonatkozólag, bogi az átderítő oldat a felsorolt vegyüieteket milyen kombinációkban és milyen arányban tartalmazza. Az oldat összetételének igy számtalan variációja, képzelhető ek

A Foeus Cíear néven ismert termék ezeknek valamelyikét képviseli, ám hogy melyiket, arra vonatkozólag mindezidáig nem sikerült információt szereznünk. Megpróbáltuk felvenni a kapcsolatot a gyártó céggel, hogy az. összetétel felől érdeklődjünk, ám megkeresésünkre nem érkezett válasz. így saját atderitő oldatainknak a Foeus Cíear elnevezésű oldattal való összehasonlítása csak bizonyos korlátok között lehetséges.

A jelen találmányi leírásban ismertetett technikai megoldásokkal ellentétben, AnnSbyn Chiang szabadalma az átderítés lebonyolításának egyetlen módjaként a preparátumnak az. oldatba történő belemerítését jelöli meg.

A szerző a Foeus Clear-t alkalmazza átderítő oldatként másik, Yuan~An Fiúval és

Shiue-Cheng Tanggal közös, 2012 április 5.-én US 2012/00815ISA 1 számon közzétett találmányi bejelentésében is.

Flama, FI,, Kurokawa, FF, Kawa.no, H, Ando,R., Sbimogori, T, Noda, lí, Fukami,

K.Sakane-Sawano A., Míyawakí, Aza Natúré Nenroseience c, folyórat online kiadásában 2011 augusztusában megjelent tanulmányában egy olyan, „Seale’' elnevezésű, központi idegrendszeri preparátumok fluoreszcens mikroszkópos vizsgálatára alkalmazott átderítő oldatot ismertet, amely ureát, glicerint, és Triton X-10Ö-aí tartalmaz.

A dimetil-sztüíoxídot, az edlén-diamin tctraaeetátot, és a Tween néven ismert detergenseket kísérleteink során magunk is rendszeresen alkalmaztuk oldataink alkotórészeként. Minthogy ezek a vegyületek szerepelnek az Ann-Shyn Chíang által szabadalmaztatott oldat komponensei között, ezért ezeket saját átderítö oldatainknak az első és második igénypontban szereplő lényegi komponensei közül szintén kizártuk.

A fentiek alapján megál lapítható tehát, hogy a jelen találmány lényegi komponensei közé tartozó, a találmányi leírás I, és 2, igénypontjában megnevezett, vízben vagy vízben is oldódó, átderitő hatású vegyületek más, önmagában ismert átderttő oldatuk Összetevői között nem fordulnak elő.

A jelen találmánnyal megoldandó feladat abban jelölhető meg, hogy a találmány tárgyát képező eljárás tegye lehetővé - optikai, különösen fénymikroszkópos vizsgálatok célját szolgáló, nagy vastagságú preparátumok vízben, vagy vízben is oldódó vegyülettel, vagy vegyületekkel történő átderhését. valamint fixálását, egészben történő festését, dehidralásat, kon/enalását lefedését, és tárolását, - továbbá biológiai szövetek élő állapotban történő optikai, előnyösen vitális mikroszkópos megfigyelése során a szövetek fiziológiás körülmények között történő átderitéséi; - a biológiai szövetek, élő állapotban fennálló morfológia elrendeződésének megőrzését, - valamint a vizsgált preparátumok egyeskomponenseinek törésmutatói között fennálló finom különbségek szelektív meghatározását.

6/26 'Ennek az összetett feladatnak a ntegoldása a jelen találmány szerinti eljárásnak megfelelően, a következőképpen valósítható meg:

A preparátumok átderitésre alkalmazott eljárás rendkívül egyszerű, Mikroszkópos vizsgálat esetén, az átderítő oldatot a tárgylemezre helyezett preparálumra ráesöppentjük, majd az anyagot fedőlemezzel lefedjük. vagy a preparátumot térfogata többszörösének megfelelő mennyiségű atderitő oldalba merítve, azzal átitatjuk. A folyadéknak az anyagba való behatolását zárt edényben létrehozott nyomással elősegíthetjük, ám a folyamat atmoszferikus körülmények között is rövid idő alatt lejátszódik.

Biológiai preparátumok esetében a másik lehetőség az adott szövetblokknak, szervnek, szervrendszernek, vagy akár egy teljes szervezetnek az érrendszeren, esetleg más biológiai csőrendszereken, (pld, tüdő esetében a tracheán, vagy a bronchusokon) keresztül, az álderttö oldattal, perfózlő formájában történő átáramoltatása, Hz a pertbndált szövetek azonnali, egyenletes átderítését eredményezi.

Az átderiteit preparálom kiterjedésének a gyakorlatban semmiféle korlátja nincsen. Labomtóri untunkban elvégeztük már emberi szív, valamint kisebb állatok egészben történő átderítését is. Elvben teljes emberi holttest átderítésének sincsen akadálya, ami így rendkívül szemléletes anatómiai preparátumok létrehozását eredményezheti,

Tapasztalataink szerint ezekkel az oldatokkal csak az agy és a gerincvelő szövetei nem deríthetek át közvetlenül, a központi idegrendszer szöveteinek különösen magas lipoid tartalma miatt. A zsírnemü komponenseket az átderítést megelőzően tehát zsíroldószerek segítségével, lehetőleg teljes mértékben ki kell vonni a szövetekből.

Az átderítő oldfok összetétele és tuhjdettságaí

Az előbbiekben említett, hosszá időszakon keresztül végzett kutatásaink során a vegyületek egyre szélesebb köréről állapítottuk meg, hogy azok erősen koncentrált oldataikban, vagy telített oldat formájában alkalmasak optikai vizsgálat célját szolgáló jó hatásfok ú átderi lésére,

Munkánk során végül is egy egészen általános elv bontakozott ki. Kísérleteink eredményei alapján azt a konzekvenciát vontuk le, hogy elvben mindazok a vegyületek, amelyek vízzel, vagy vízzel Is, átlátszó, un. valódi oldatot képeznek, megfelelő koncentrációban alkalmasak lehetnek arra, hogy azokat, önmagukban, vagy valamilyen összetett oldat komponenseként átderítés céljára alkalmazzuk, feltéve, hogy a preparátumot nem károsí tják.

Ez már önmagában is az. átderítő okiatok alkotóelemeinek, és azok különböző kombinációinak rendkívül széles körét jelenti. Ha pedig figyelembe vesszük, hogy az oldatokban a komponensek aránya, az oldatokkal kezelt, preparátumok egyedi jellegzetességeitől függően, egészen széles határok között változhat, a lehetséges hatékony kombinációk száma tovább sokszoroződik.

Mindez rendkívül plasztikus lehetőségeket kínál az átderíto oldatok egyedi változatainak létrehozása szempontjából s a jövőben további, kiterjedt kutatások tárgyát m

képezheti.

Ha a gyakorlatban azokat a vegyületeket, amelyek a vizsgált, (elsősorban biológiai eredetű) szöveteket valamilyen módon károsítják, az alkalmazandó vegyszerek sorából ki Is iktatjuk: továbbá, ba az erősebben mérgező vegyszerek felhasználásától gyakorlati, munkavédelmi okokból esetleg el is tekintünk, valamint a szóba jövő vegyületeket csak olyan kombinációkban elegyítjük, amelyben nem képeznek egymással az. optikai vizsgálatot akadályozó csapadékot, a fennmaradó lehetőségek még ekkor is rendkívüli bőségben állnak rendelkezésünkre.

A szóba jövő vegyületek közül azonban tételesen megnevezve csak azokat vontuk bt a jelen találmányi leírás oltalmi körébe, amelyekkel kapcsolatban a legkiterjedtebb kísérletes tapasztalatokkal rendelkezünk, s amelyeknek alkalmazásával már nags szarná mikroszkópos megfigyelést végeztünk, és morfológiai megállapításokat lettünk. Ezeknek a vegyszereknek az esetében tehát biztosan meggyőződhettünk arról, hogy azok az árderitö oldalok komponenseiként jó hatásfokkal alkalmazhatók.

Ezek a vegyületek a következők;

Szerves vegyületek: etanolamin (EA), dietanolamín, (DEÁ), írietanolamin (TEA), 2-ammo-2~metil~l-propanok 2-íem!~eiilalkohol, acélon, eldénglikol, propiiénglikol, (propán-1,2-diói) dibu.fi Iftalát, dibníilamm;- az alkoholok közül: etilalkohol, metdal.kohoi, bmilalkohol. i-buíifalkobol, propüalkohol, bpropilalkohol, amilalkohol és bamiialkohot,- a szerves savak közül: ecetsav. fejsav, citromsav, maleinsav, vaj sav, almasav, piroszőlősav és borostyánkősav, - az aminosavak közül: gliein, (gííkofcolí), alanin, prolin, hídroxiproiin,~ adetergensek köz.ül: dodeed-írimetll ammomumbromid. eetih-trimeííl-ammómumbromid, nátrium-laurdszarkozmáf, szaposin, ebeim, dezoxieholm, Teepol;

~ továbbá, hexametiléntetramin, tris-(hidroxi-metil)-aminometáit, hidroxllamin, hidrazmszniíát, trinálrinm-citrát, kálium-nátríam-tarfaráf, tiokarbamid,

-morfot i no pro pán -sz u 1 fon sav,

Szervetlen vegyületek; nátriumszulíáí, nátrlumszulfit, nátrium-íiosznlíát, káieiumk lórid, káhomkloríd, cinkkloríd, ammőniomklorid. ammóniumszulfát, ammöniumaeetáí, ammónium-magnézlum-ortofoszfát és bórsav.

Ezeket a vegyületeket soroltuk fel az 1, és 2, igénypontokban, mint a találmány tárgyát képező átderítö oldatok lényegi alkotóelemeit, (fö kötőanyagait).

Az átderítö oldatok összetételét illetően a kuiosszempontot mindenképpen az képezi, hogy az oldatokat alkotó vegyületeket nagy koncentrációban, vagy telített oldat formájában alkal.mazz.uk.

Hangsúlyoznunk kell tehát, hogy az a tény, hogy az összetett átderítő oldatokon belül a komponensek aránya a legszélesebb skálán változtatható, csak magukra az átderítő hatásért felelős vegyületekre, azoknak egymáshoz viszonyított arányára vonatkozik, az

8/26 esetlegesen használt oldószerre, (vízre, vagy egyéb vízben Is oldódó folyadékokra) sokkal kevésbé, Jő átderítö hatás elérése céljából ez oldószer mennyiségének általában alacsony szántén kelt maradnia.

Maga az oldószer folyékony halmazállapotú vegyületek, (pld. etanoiamínok, 2-amlno-2*metll-l-propánok 2-femTefilalkohök propán-1,2~diol, stb.) tömény állapotban történő elegyítésekor hiányozhat is.

<\z összetett oldatok tehát tömény, erősen koncentrált, vagy telített oldatok erősen változatos mennyiségének elegyítése révén jönnek létre.

A legkiterjedtebb tapasztalatokat az aminoalkohölok, azon belül az eianolamín, (EA), díetanolamin, (DEA) és a tri etanol amin, (TEA) átderítö oldatként való alkalmazásával kapcsolatban szereztük, s szokat máig ts s legkiválóbb hatású vegyületek között tartjuk számon.

Ezek a vegyszerek rendelkeznek mindazokkal a tulajdonságokkal, amelyek lehetővé teszik, hogy segítségükkel gyakorlatilag bármilyen kiterjedésű preparátumot igen rövid idő alatt üvegszerően áíderiísünk.

Nagyszámú mikroszkópos vizsgálatunk igazolta, hogy ezeknek a vegyüieteknek 1,5 közeli törésmutatója garantálja a szöveti struktúrák tökéletes atderitését, s így a mikroszkópos képen belül a képletek még nagy mélységben is élesen és kontrasztosan rajzolódnak ki.

Az előbbiekben említett hosszú időszakon belül ezeknek a vegyüieteknek mindössze néhány hátrányos tulajdonságát észleltük, amelyek azonban egyszerű technikai beavatkozásokkal könnyen kompenzálhatok. Az oldatok hosszabb idő, (hónapok, évek) alatt megbámulhatnak, ára a folyadék cseréje ezt a nehézséget teljes mértékben, kiküszöböli.

A vizsgálandó anyag hosszú időn keresztül történő tárolására a TEA önmagában való alkalmazása bizonyult a legmegfelelőbbnek, tekintve, hogy az EÁ~nál és a DEA-nái is kíméletesebben dehidrál, s így az anyag zsugorodása ennek az oldatnak az alkalmazása, révén minimalizálható a leginkább.

Ismeretes, hogy a trietanolamin (TEA) fémionokkal komplexeket képez, A komplex képződése közben az oldat, a fémion fajtájától függően eiszíneződhet, Ez a preparátum optikai vizsgálatát általában nem zavarja, amennyiben azonban Igen, a probléma az oldat lecserélésével szintén kiküszöbölhető.,

A TEA komplex képző aktivitása a „transzparens vitális mikroszkópia”, azaz. a biológiai szövetek élő állapotban történő átderítése és mikroszkópos vizsgálata során okozhat nehézségeket, hiszen a fémionoknak a sejtekből történő kivonása afiztológlás hatása lehet. Kísérleteink eredményei arra utalnak, hogy ezek a káros hatások elkerülhetők, ha a TEA komplex képző aktivitását előzetesen lekötjük, vagyis az átderítö oldathoz, annak a szövetekbe juttatását megelőzően fémsót adunk, olyan mennyiségben, hogy az. a TEA összes komplex kötő helyeinek fém ionokkal történő telítését biztosítsa.

Az EÁ-tó! a TEA irányában haladva, az etanolamin-vegyületek konzisztenciája fokozatosan kissé sűrűsödik; az etanolaminé viszonylag híg, míg a tríetanolamíné már inkább sűrű olajáéhoz hasonló. A három vegyület közül ezért az. EA behatolási sebessége a legnagyobb, s így annak átderítö hatása még gyorsabban megmutatkozik, mint a másik

9/26 két oldaté.

Megfigyeléseink szerint, az efanolanűn~sor vegyöleteinek egymással, Ingítatkm formájukban történő elegyítése általában az egyes komponensek saját konzisztenciájánál sűrűbb halmazállapotot eredményez, A három vegyület 1:1:1 arányú keveréke már kissé mézre emlékeztető sűrűségűvé válik.

Hasonló változás figyelhető meg ezeknek a vegyszereknek, vagy ezek kombinációinak tejsawal történő elegyítésekor is. A tejsavnak az E.A-hoz, DE.A-hoz, TEA-hoz, valamint azoknak keverékeihez történő hozzáadásakor jelentős höíejlödés lép fek a kihűlt keverék halmazállapota pedig észrevehetően sűrűbb, mint az etanolaminvegyületeké,

A tejsav e vegyűleíekkel szintén bármilyen arányban elegyíthető, s alkalmazása, (többek között magas törésmutatóra révén is), jói érzékelhetően javítja az átderltö oldat tulajdonságait. Ugyanakkor az oldathoz adva, egyúttal annak pH~ját is csökkenti.

Az etanolamin-sor tagjai lúgos vegyhatásúak. Ez. festetlen, vagy tussal ínjiclált szövetek esetében általában nem okoz problémát. A szövetek festésekor, az oldat plí-ját a festékoldat alkalmazásához szükséges értékre, az átderitő oldatnak élő szövetek megfigyeléséhez történő alkalmazásakor, (azaz fiziológiás átderltö oldat esetében) pedig a vizsgál! szövetekre jellemző fiziológiás, (általában semleges közeli) értékre kell beállítani,

A pH csökkentése erős savak, (elsősorban sósav), vagy gyenge savak, (eeetsav, fejsav, stb.), valamint pulferek alkalmazásával lehetséges.

A vegyületek konzisztenciája lehetővé teszi azoknak az anyagba történő meglehetősen gyors behatolását, olyannyira, hogy az átderitő hatás az. anyag külső rétegében már az oldatba merítést követő néhány percen belül jól megfigyelhető. Tapasztalataink szerint több milliméter vastag szövetblokkok átlátszóvá tétele legföljebb néhány órás, egész állati szervek átderííése ís maximum egy~két napos időtartamot igényel.

Az oldat melegítése, (pld. 37 C fokos termosztátban), továbbá kis mennyiségű detergensnek, (előnyösen egyidejűleg egynél több detcrgenst alkalmazva), vagy hexametilén-tetraminnak, vagy ezek kombinációinak az. oldathoz adása a folyadék behatolását elősegíti, s így az. átderítés sebességét fokozhatja.

Kísérleteink során számos, vízben, vagy vízben is oldódó, nagy törésmutatójú, folyékony szerves vegyületről, többek között a 2-amino~2<-metil-l~propanoIről, a 2-íenil~etilal kohóiról, az etilénglikolröl, a propilénglikolról a dibutilfialáírők a dibutiiamínról. állapítottuk meg, hogy igen kifejezett átderltö hatást mutatnak. Ezek a vegyületek az etanolaminokhoz hasonlóan önmagukban is alkalmasak lehetnek átderítésre. Kombinációik ugyanakkor általában még intenzívebb hatást fejtenek ki. Ezek a vegyszerek szintén a legkülönbözőbb arányokban szerepelhetnek az átderitő oldatokban.

Korábban képviselt, (és az ennek a találmányi leírásnak az. első, 2011. december 11,én benyújtott változatában Is megjelenített) álláspontunkkal szemben, ma már inkább azt a felfogást valljuk, hogy egy több komponensből összeállított átderitő oldat esetében valójában nem teljesen indokolt annak összetevőit éles határral elkülönítve, lő hatóanyagokra és adalékanyagokra elválasztani.

Az utóbbi évek során szerzett tapasztalataink ugyanis arra mutatnak, hogy az átderítésre alkalmazható vegyületek igen széles körén belül az egyes komponensek aránya

10/26 széles skálán belül változhat. A legnagyobb mennyiségben jelen lévő, s így fő hatóanyagoknak, (vagyis az átderítö oldat lényegi komponenseinek) nevezhető, és a kisebb mennyiségben előforduló, s ezért adalékanyagként említhető vegyöletek között a határ tehát olyan mértékben elmosódik, hogy azok merev elkülönítése már kissé mesterkéltnek tűnhet.

Adalékanyagnak így valójában azok a vegyöletek tekinthetők, amelyeket az oldat többi összetevőihez képest sokszorosan kisebb mennyiségben alkalmazunk, s igy azoknak a törésmutatót befolyásoló hatása már valóban elenyésző, hatásuk tehát elsősorban más területeken mutatkozik meg, Ugyanaz a vegyüiet tehát, koncentrációjától függően, egyes esetekben az oldat lényegi alkotóelemeként, (fő hatóanyagaként) jelenhet meg, máskor, kis koncentrációban alkalmazva, az adalékanyag szerepét töltheti be.

Kísérleteink során számos vegyszerrel kapcsolatban találtuk úgy, hogy azok más komponenseknél lényegesen kisebb mennyiségben alkalmazva is előnyösen befolyásolják, az átderítö oldal tulajdonságaik fokozzák annak átderítő hatását, növelik a törésmutatóját, elősegítik az oldat behatolását, javítják az oldatok konzisztenciáját, vagy különböző módokon előnyösen befolyásolják a mikroszkópos kép optikai tulajdonságait.

Ilyennek bizonyultak többek között a hexametílén-tetramin. az aeeton, a 2-ammo-2-metn-l-propánok a 2-feníl-etilalkohok a díbutílftalák a irís-(hidroxi-metíhanűnomeíán. az eülénglíkok a propüénglíkol, \alamint különböző deíergensek, t köztük a dodecil-trimetü ammóniumbromid, eetíi-trimetü-ammóniumbromíd, nátriumlaurílszarkozínát, szaponín, eholin, dezoxieholin, és a Teepoi).

Hasonló hatást fejt ki az átderítés céljára önmagában ismert vegyületek közül az etiléntóiamin-tetraaeelát, a dímetil-szulíoxid, a glicerin, a gumiarábíkum a szacharóz, és a levulóz. Ugyanezt tapasztaltak azonban más mono- és oligoszaeharidok, (különösen a fruktóz), valamint a nagy mennyiségű szaeharidot tartalmazó méz, valamint átlátszó, szűrt gyümölcslevek esetében ís.

Úgy találtuk, hogy az összetett átderítö oldatok adalékanyagként alkalmazott komponensei között viszonylag alacsonyabb törésmutatójú vegyületeknek is létjogosultsága van, hiszen azok a nagyobb törésmutatójú oldatok hatását potencírozhatják, optikai hatásukat előnyösen befolyásolhatják.

A rövidebb széniáncú alkoholok, mint például az etil-, metii-, prop.il-, i-propíl, butik i-butil-alkohol átderítö hatása biológia szövetek esetében általában kissé korlátozott, ám más vegyületekkel együtt alkalmazva azok optikai hatását számottevően javíthatják.

Az átderítö oldatok lényegi komponensei és az adalékanyagok közötti határ elmosódásának icüegzetes példáját képezi, hogy tapasztalataink szerint az alkohol vegyületek fog esiszolaíok esetében, önmagukban, vagy koncentrált oldataik formájában meglepően jó átderítö hatást mutatnak, olyannyira, hogy használatuk esetén a denünesatomák, és a eemeutoeyíák a mikroszkópos vizsgálat során több rétegben élesen leképeződnek.

Az amílalkohol ugyanakkor önmagában is alkalmasnak tűnik a lágy szövetek átderítésére. Úgy találtuk, hogy a fenolnak és. omolnak az oldatokhoz adása, amellett, hogy azokat a hefertozödéstől megóvja, az átderítö oldatok optikai paramétereit is ja\ ttja

A viszonylag alacsonyabb törésmutatóin vegyületek felhasználhatók arra a célra is, hogy az oldathoz lépcsőnként adagolva, törésmutatójának pontos beállítását elősegítsek

11/26

A vizes oldatban átderítesre alkalmas vegyszerek körének különösen nagymértékű kibővülését azonban az a felismerés tett lehetővé, hogy nagy koncentrációban, vagy telített oldat formájában alkalmazva a szilárd halmazállapotú, szervetlen és szerves vegyületeknek elvben, szinte bármelyike alkalmas lehet, önálló átderíto oldatként vagy összetett átderíto oldatok alkotórészeként való felhasználásra,

A hangsúly az átderíto oldatok összetételét illetően tehát azon van, hogy? a vizes oldatokat nagy töménységben használjak, úgy ahogyan az a szövettani technika torén egyébként kevésbé szokásos.

Az, hogy egv vegyüiet színes oldatot képez, az átderítés szempontjából általában nem jelent hátrányt. Színes oldat alkalmazása olykor egy enesen előnyös ís lehet, hiszen szinszúroként viselkedhet, s a mikroszkópos kép kontoísztosságát fokozhatja.

Az átderítesre alkalmas vizes oldatok egy különleges, ám tapasztalataink szerint a gyakorlatban igen jól használható csoportját alkotják a vegyületeknek azok. a természetben előforduló, vagy gyárilag előállított keverékei, amelyek szintén valódi oldatot alkotó vegyületeket tartalmaznak, viszonylag nagy koncentrációban.

A természetes keverékek közül ilyen a méz, a szúrt állapotban átlátszó gyömöless/örpök, a gyárilag előállított keverékek közül a szintetikus gyümölcs ízű szörpök, továbbá a nagy számban és változatos összetételben hozzáférhető, detergensek különböző kombinációit képviselő foU'ékony szappanok, mosogatószerek, és egveb tisztítószerek.

Kísérleteink során megállapítottuk, hogy bizonyos vegyületek együttes alkalmazása esetén, az átderítö oldat összetételétől, és a komponensek arányától függően az oldat fő hatásán, a vizsgáit anyag átlátszóvá tételén kívül egyéb előnyös optikai hatások ís fellépnek, amelyek a vi zsgáit, struktúrák képi megjelenését tovább javítják, s így azok megfigy elését elősegítik,

Mikroszkopos vizsgálatok estén ilyen hatás mindenekelőtt a struktúrák kontrasztosságának fokozódása, Tapasztalataink szerint az általunk alkalmazott több koraponenses átderítö oldatok egy része szemmel láthatóan megnöveli a vizsgáit képletek kontrasztosságát, s ezáltal azok élesebb rajzolattal jelennek meg.

Úgy találtuk, hogy ez a hatás gyakran oly an mértékű lehet, hogy natív, (vagyis nem festett) anyagok íénymikroszkőpos vizsgálatakor, egyszerű áteső fénnyel történő megvilágítás esetén a kép már kissé a fáziskoníraszty vagy interferencia kontraszt megvilágításkor láthatóhoz hasonló benyomást kelt.

Lehetséges, hogy a kép kontrasztosságának megnövekedése kelti a szemlélőben az esetek egy részében azt a benyomást, hogy a képletek bizonyos átderítö oldaiok alkalmazásakor optikailag nagyobb feloldással jelennek meg, mint más alkalommal.

Nem zárjak ki azonban annak a lehetőségét sem, hogy egyes esetekben az optikai télbontás valódi növekedéséről van szó, hiszen gyakorta tapasztaljuk, hogy egy oldat összetételének, valamint komponensei arányának megváltoztatásakor a kép kontrasztossága inkább csökken, s ennek ellenére finomabb struktúrák válnak megfigyelhetövé, mint más esetekben, E szubjektív megfigyeléseket a jövőben természetesen objektív mérésekkel kell megerősíteni.

Áteső fényben, ferde megvilágítást alkalmazva, az átderítö oldatok jelentős mértékben fokozhatják a vizsgált képletek felszínén megjelenő, s azok dombormű-szerű

12/26 benyomását eredményező ámyékoltság mértékéi. Isméi csak elősegítve azok megfigyelését,

Ugv tapasztaltuk, hogy az átderitő oldathoz adalékanyagként detergensekei adva, már azoknak kis mennyiségben történő alkalmazása Is gyakran eredményez hasonló optikai hatásokat, A mikroszkópos kép optikai benyomása eltérő lehet, attól függően, hogy a detergensekei milyen kombinációkban és egymáshoz képest milyen arányban alkalmazzuk.

Néhai munkatársunk, dr. Magyar? József megállapítása szerint a detergens kombinációk eltérően viselkednek aszerint, hogy azokon belül mennyiségileg a. kationos vegyületek, pld. dodeeil-trímetd-ammónium bromid, vagy cetil-trimeli 1 ammőniumbromid, vagy az anionos detergensek, pld. Tween, Teepol, vannak-e túlsúlyban.

Ö tisztázta azt Is. hogy trisz-(hidroxi-metil)-amínomelánnak és detergenseknek kis mennyiségben, együttesen az átderitő oldathoz adása különösen előnyős hatású ebben a tekintetben, s egyúttal az oldatnak az anyagba, történő behatolását is meggyorsítják.

Azt, hogy ezek az előnyös optikai hatások milyen mechanizmus révén jönnek létre, további kísérleteknek kell tisztázniuk, Ennek egyik feltételezhető magyarázata esetleg az lehet, hogy az átderitő oldatok egyes komponensei a finom szufeeeUuláris struktúrák, a sejtorgandlumok összességében rendkívül nagy felületein egyenetlenül oszlanak el, s az oldat egyes komponensei ezeken a felületeken molekuláris vastagságú, (esetleg rendezett struktúrájú) hártyát képeznek, amelynek törésmutatója a környezetétől enyhén eltérő. Ez pedig az adott felület optikai tulajdonságait megváltoztathatja.

Ugyanennek az elvnek az alapján az is elképzelhető, hogy akár egyetlen, vízben, vagy egyéb vízzel is elegyedő oldószerben) oldott vegyidet koncentrációja szelektíve niegnövekedjen a s/nhceliuláris struktúrák felületén. Erre utalhat, hogy csak propán-1,2dióit tartalmazó vizes oldatban ez a hatás megjelenik,

Az alábbiakban a találmány oltalmi körébe eső, átderitő hatású vég}·öleteket különböző kombinációkban és mennyiségben, tartalmazó, jelentős átderitő hatást biztosító összetett oldatok néhány soroljuk fel;

A TEA (1 rész), n-amihdkohol, (1 r.), i-amilalkőhol (Ír.), dlbutilfialát (2 r.) és 2leml-etilaikohol (0,25 r,) keveréke az üvegéhez hasonló, nagy törésmutatójú átderitő folyadékot alkot.

Az üveggel azonos, vagy ahhoz erősen hasonló törésmutatójú oldatok többek között a műszaki élet területén, üveganyagokban keletkező zárványok vizsgálatánál Is alkalmazhatók lehetnek.

Magas törésmutatójú oldal keletkezik TEA (1 r.), EA, (0.1-0,2 ró, dimetil-szulfoxid, (5 rj. i-propilalkohol (0.1 r) és acélon, (0,05 r.) elegyítésekor is. .Az oldat a preparátumba Igen könnyen behatol, s ferde megvilágítással végzett fényűnkroszkópos vizsgálat során a mikroszkópos struktúrák árnyékolását észrevehető mértékben javítja.

Igen jó hatású, nagy törésmutatójú átderitő oldat jön létre TEA és 2-ammo-2-metíl~l-propanol elegyítése révén is. Alkoholok, pld, butílalkohol, tll, í~ proptlalkohol hozzáadása az oldat optikai paramétereit tovább javítja.

Nagy törésmutatójú oldatot alkot a 2-fenil-et.ilaikohoi és dihutíl-ftalát 1:1 arányú η/26 keveréke is.

Kísérleteink során megállapítottuk. hogy az eülénglikol és a propilénghkol, vagy ezek keveréke EA-val, DE A-val, TEA-val, vagy ezek kombinációit tartalmazó oldatokkal magas arányban, (akár őt ven százalékban is), elegyítve jő átderítö hatást eredményez. így az. etanolamin-vegyűletek egy része ezekkel a lényegesen olcsóbb vegyszerekkel pótolható, ami nagyobb szervek átmentésekor előnyös lehet.

Az átderítö oldatként önmagában ismert glicerin más vegyületekkei kombinálva javíthatja az átderítö oldatok optikai tulajdonságait, s igy, ha önmagában való alkalmazásának korlátái vannak is, összetett oldatok részeként alkalmazása előnyös lehet.

Kísérleteink arra mutatnak, hogy az EA, DEA, ill. TEA glicerinnel csak részben helvettesühetö.

< ................ ·

Kutatásaink sorár? több olyan átderítö oldatot hoztunk létre, amely egyes szövetféleségek, valamint a szövetek egyes struktúráinak vizsgálatára specifikusan alkalmasnak bizonyultak.

Ilyen oldat többek között a glxin. (glikokol.1), erősen koncentrált, vagy telheti oldata, amely natív preparátumon, az anyag teljes vastagságában meglepően élesen és kontraszíosan rajzolja ki a vázizom harántcsíkolatát.

A korábban említett alkoholokon kls öl a eiukkloriu és a kálciumkloríd telhet? oldütahiuk, valamint e két végsőiéi keverékének alkalmazásais a fogcsiszolótok igenje hatásfokú átderitését, és a struktúrák kommsztos megjelenítését eredményezi.

Hasonló hatást fejt ki az EA, DEA és TEA egyenlő arányú keverékét, valamint 2~amino-2-metil~l -propánok, butilalkohoh, oligoszaeharidokat, és nátrium-káliumtartarátot tartalmazó átderítő oldat is.

A cinkkloríd és kaleiumklorid keveréke pollen szemcsék átderitésére is különösén alkalmasnak tűnik.

Igen jő átderítö hatást tapasztalhatunk pollen szemcséknél kálimn-nátrium-tariarátot, valamint 3-morfblinopropán-szulfonsavaí, dodeclKtrímetil-an^móníuinbromídot és íriszHdroximetil-amiomeiánt tartalmazó oldat alkalmazása esetén.

A dodecihtrímetll-anu’nóninnibromid, (amelyet egyébként kis mennyiségben deiergens hatása miatt használunk több átderítő oldatunkban) telített oldatként önmagában is kiváló átderítö hatást mutat, többek között pollen szemcsék esetében is.

A pollen szemcsék jól átderíthetők alanint és glicínt tartalmazó oldatokban, valamint trinátrium-citrát telített oldatában, továbbá EÁ-t, DEÁ-t, TEÁ-í és propán-1,2-cholt tartalmazó oldatban is. Hasonlóan jó hatást fejt ki a 3-morfoiinopropán-szulfonsav nagy koncentrációjú, vagv telített oldata. Ehhez, az oldathoz egyenlő arányban EÁ-L DEÁ-t és TEÁ-t, 2 -amino-2-metil-i-propanoh, valamint kisebb mennyiségű szacharózt adva. az. átderítö hatás tovább javuk

Vese preparátumok igen jó hatásfokú átderitését teszi lehetővé többek között a TEA, valamint 2-a?nino-2-metíl-l~prop;mok butilalkohol, amilalkohol és tejsav keverékéből álló oldat.

Tapasztalataink azt mutatják, hogy a jelen találmányi leírás szerinti átderítö oldatok többsége a biológiai anyagok széles körében alkalmazható jó hatásfokkal. Ennek tipikus példáját képezi a TEA és a 2-fenii-etiialkobolt I ;1 arányú keveréke, amely szinte általános átderítö hatást fejt ki, és a szövetek többsége, de ugyanígy rovarok, pollen szemcsék és

14/26 egyéb növényi struktúrák, valamint papír, szövetszáíak stb, esetében is azok üvegszernen átlátszóvá válását eredményezi. Az oldathoz 0,54 rész propán 1,2,-dióit adva, az áíderltő hatos tovább fokozódik.

A preparátumok felese

A különösen vastag preparátumok, egész szervek, és szervrendszerek egyenletes megfestését mindezidáig gyakorlatilag lehetetlenné tevő nehézségek mindenekelőtt abból adódtak, hogy ha a preparátumot a festékoldatokba a szokásos módon belementjük, és az oldatoknak az anyagba történő behatolását a komponensek fizikai eloszlására és a diffúzióra bízzuk, akkor a szövet felszíne felöl annak belseje felé áramló oldat először a szövetblokk perifériás rétegével találkozik, és festékmoíekulák itt megkötődnek. Az anyag belső rétegei felé haladó oldat így folyamatosan egyre kevesebb festékmolekulát tartalmaz.

E folyamat eredményeképpen a preparátum perifériás rétegei túllestodnek., a centrális területek pedig aíuifestődnek. A külső régiókban fellépő, jelentős mértékű lülíesíődés az adott réteg mikroszkópos vizsgálatát bizonyos határ felett mát ugyanúgy zavarja, sőt akár lehetetlenné is teszi, mint a íestődésnek az anyag centrumában fellépő túlzottan halvány, vagy teljesen hiányzó volta.

Ugyanezek, az egyenetlen eloszlásból adódó hátrányok természetesen a 'festési eljárások során alkalmazott egyéb oldatoknak, (pld, öblítő, cserző, oxidáld, redukáld, impregnáló, stb, oldatok), de általában bármely hisztoteehmkai kezelés során alkalmazod oldatnak a preparátumba történő behatolása során Is megmutatkoznak.

Hasonló a helyzet a hisztokémiai reakciók, és az ezekkel kapcsolatos festési eljárások terén is. Ezért alakulhatott ki az, az általános felfogás, hogy a hisztokémiai reakciókat legfeljebb 20 mikron vastag metszeteken végzik,

A jelen találmány szerinti eljárás részeként, ez a káros effektus jelentősen csökkenthető azáltal, hogy a festések, hisztokémiai reakciók, és egyéb hisztoteehmkai kezelések során alkalmazott oldatokat erősen hígítva, a szövettani technika terén használt szokásos töménységhez képest jelentősen alacsonyabb koncentrációban alkalmazzuk, s az oldatokkal történő kezelést a szokásosnál lényegesen hosszabb időn keresztül végezzük, Emellett, szükség esetén, a folyamatok előrehaladását az anyag körül létesített túlnyomás, és szívás segítségével is támogathatjuk.

A probléma gyakorlatilag teljes kiküszöbölése azonban úgy érhető el, hogy a jelen találmány szerinti eljárás részeként, a festéshez, és egyéb hisztotechnikat kezelésekhez szükséges oldatokat a biológiai anyagokon, perfúziö formájába» áramoltatjuk át,

A perfúzió előnyösen az érrendszerbe, vagy más biológiai esőrendszerbe, (tüdő esetében például a tracheába, vagy a bronchusokba) bekötöd kanülőn keresztül, nyomás alatt valósítható meg. A festék eloszlásának egyenletessé tételét ezúttal ís elősegíthetjük a szokásosnál hígabb oldatok alkalmazásával, és a folyadékok hosszabb időn keresztül történő átáramoltatásával, továbbá külső nyomás vagy szívás alkalmazásával Ebben az esetben elsősorban a preparátumra kívülről gyakorolt szívásnak van jelentősége, amely az oldatoknak az anyagon való áthaladását gyorsíthatja.

15/26

Kiegészítő eljárások

A jelen találmány szerinti eljárás részeként több olyan kiegészítő eljárást is alkalmazhatunk, amelyek az kiderítést megelőzően, vagy azzal egyidejűleg végrehajtva tovább javítják az átderítea anyagok vizsgálhatóságát, s lehetővé teszik, hogy a szöveti struktúrák egyes specifikus morfológia jellemzőit behatóbban tanulmányozzuk.

ismeretes, hogy a hosszabb ideje formaimban tárolt, túlfixáit szövettani anyagok felhasználhatósága erősen romlik. Bár a jelen találmány szerinti kiderítő oldat, alapos kimosás után, még ilyen preparátumok esetében is képes jelentős mértékű kiderítést biztosítani, kísérleteink során olyan vegyületeket kerestünk, amelyekkel kezelve a túlfixáit anyag konzisztenciája lazítható, megkönnyítve ezáltal az átderítő oldat behatolását. Vizsgálataink során megállapítottuk, hogy a hidroxilamln, és a liidrazinszulfát, valamint ezek kombinációja megfelel ennek a célnak.

Hasonlóképpen szükségesnek tűnt, hogy olyan kiegészítő eljárást vegyünk igénybe, amely a rovarok kitínpáncéljának fellazítása révén azok áíderitését elősegítheti. Kísérleteink során a lítium vegyületek (pld. litlumszulfát, liilumhídroxtd. iítiurafortniát), továbbá a tetrameíil-ammónium-ludroxid, az utóbbinak nátriumszilikáttal, (vízüveggel) és Ί'ΕΑ-val való kombinációja bizonyultak alkalmasnak erre a célra,

Aíderíteít veseszöveten belük a tubulusok térbeli topográfiájának részletes vizsgálatát teszi lehetővé a dr. Síuber István által 1985 -ben létrehozott, szintén kiegészítő eljárásnak tekinthető metódus, t Stuber 1, 1985, 1986,).

Ennek lényegét az képezi hogy az átdorítést megelőzően, vagy azzal egy időben, a félbevágott vesét, vagy annak szeleteit bídrogén-peroxidot, vagy ezt a vegyületet is tartalmazó oldatba merítjük, vagy a vesét, annak erein keresztül ezekkel az, oldatokkal perfundáljuk.

Az eljárás során a hidrogén-peroxldból oxigén képződik, s ez, a szövetek között díifimdárí a \ égül a \esetubulusok lumeneben gy ülik össze, s azokban vogigkúszs a, a mikroszkópban meső fénnyel meg\ ilágiőa. az átderített szögeteken belül, elnyújtott, csillogó buborékok formájában, hosszú szakaszokon kirajzolja a csatornák térbeli lefutását.

Az oxígénfojlődés intenzitását jelentősen fokozza, ha a szöveteket előzőleg káliumpermanganáttal kezeljük, mert a kicsapódó, finom eloszlású mangándioxíd nagy felülete, katalitikus hatása révén, a hldrogén-peroxid bomlási sebességét fokozza.

Hasonló eljárást alkalmazunk csont csiszolatokon, a csontszövet eortiealis állományában futó Havers és Volkmann csatornák, valamint a fog eslszolatokon, a deríti ne sátornak lefutásának vizsgálatára is, ,

A esiszolatot, (a csatornák üregét előzőleg esetleg enzimatikus emésztéssel megtisztítva), vízben is oldódó illékony folyadékba, előnyösen dietilén-aminba, vagy alkoholokba, különösen etil-, propii-, t~propii~, butil-, és. i-butiialkoholba merítjük. A kezelés során az. oldószer a kemény szövetekből a vizet eltávolítja.

Ezt követően a preparátumot a folyadékból kivéve, levegőn megszáritjúk, (a száradást esetleg enyhe melegítéssel, vagy levegő ráíújásávn! meggyorsítva). Az elpárolgó oldószer helyére a csont-, vagy dentinesatornákba légbuborékok nyomulnak be, amelyek az kiderítést követően, a mikroszkópos vizsgálat során, több rétegben követhetővé teszik a

16/26 csatornák lefutását,

A preparátum átderitésnek és egyúttal tartósításnak egy különleges esetét képezi az, a dr. Stuber István által szintén 1985-ben létrehozott, és eddig nem publikált eljárás, asnely lehetővé teszi, hogy a tödőszöveí mikroszkópos szerkezetét a belégzés állapotában fennálló, eredeti térbeli geometriai struktúrájának megfelelően őrizzük meg.

Erre a szövettan területén korábban ismert módszerek nem voltak alkalmasak, hiszen a mellkas megnyitásakor a tüdő eleve összeesik, majd a léghólvagok a szövettani. fixálás során tovább zsugorodnak, így a valós geometriai helyzettől eltérően, ahol a gömbölyded alveolusok egymást poligonális slklapokkal határolt testekké préselik össze, s így falaik átmetszeteinek a mikroszkópos képen egyenes vonalakkal határolt, vékony struktúrákként kellene megjelenniük, a konvencionális módszerekkel készített tüdő metszeten a léghőlyagok falai erősen torzult, zegzugos struktúrákként mutatkoznak.

Az eljárás során a tüdőt először esetleg az érrendszeren, vagy a tracheán keresztül átáramoltatott festékoldatokkal megfestjük, majd, szintén a tracheába kötött kanül segítségével, a szervbe nyomás alatt, átderitő oldattal kevert, felmelegített, s ezáltal folyékonnyá vált zseiaítnoldatot juttatunk. A tüdő ennek során felfúvódik, és alakja, a maximális belégzés állapotára jellemző alakot tesz fel. A kitágulás csúcspontján a fél folyékony oldat a szöveteken átszürodve. a tüdő felszínén kicsordul.

Ekkor a preparátumot hirtelen mélyhűtőbe helyezve, vagy hideg folyadékba merítve, a zselatin felszmi retege eleg gyorsan megszilárdul althoz, hogy a szerv belsejében elhelyezkedő oldat már ne tudjon eltávozni, A preparátum hűtése ezután már meg is szüntethető, hiszen a zselatin szobahőmérsékleten is teljes egészében kocsonyássá válik, és a szerv alakját megőrzi.

Amennyiben a felület hűtését nem azonhal kezdjük meg, hanem a szöveteken átdiffundáló feltöltő oldat egy részét hagyjuk kifolyni, a tüdő telítettsége különböző mértékben csökkenthető, s igy, a feltöltő oldat megdermesztésekor, a szerv különböző belégzettségi állapotaiban fixált struktúráját van módunkban vizsgálni.

Az átderítö oldat és zselatin keverékébe ágyazott tüdőszövetet átvilágítva, annak makroszkópos szerkezete tanulmányozható. Ennek hatásfokát növeli, ha a preparátumot átlátszó edényben, valamely átderítö oklatba merítjük.

Az átderíteh szervből szeleteket metszve, s azokat fénymikroszkóppal, előnyösen a sztereokonverter beiktatásával vizsgálva, a tüdő valós, háromdimenziós szövettani szerkezete ismerhető meg.

A szövettani metszetek készítése során lefedésnek nevezett eljárás lényege, hogy a preparátumot, (általában tárgylemezre helyezve), olyan, kezdetben folyékony vagy félfolyékony oklatba helyezik, amely később, az oldószer elpárolgása során megszilárdul, s így a preparátum megőrzését és könnyű kezelhetőségét biztosítja. Az preparátumot fedőlemezzel borítják be. Mint már említettük, a szövettani technika terén e célra használt vegyületek túlnyomó része vízben oldhatatlan, s így azokat szerves oldószerekben, (leggyakrabban xiloiban. vagy benzolban) feloldd a használják.

A vizoidékony vegyületek közük - kevésbé elterjedte» -, a zselatint, ennek

17/26 glicerinnel való keverékét, valamint ritkán a poHvinilalkoholt, (PVA) alkamazzák.

Saját tapasztalataink szerint a jelen találmányi leírás szerinti átderitő oldatok, különösen az EA, DBA és a TEA valamint azok különböző kombinációjú és arányú elegyel zselatinnal keverve igen jó hatásfokú lefedő oldatot képeznek, amely beszáradva tömör, gumihoz hasonló állagú masszát képez, és a preparátumot, különösen fedöiernezzei lefedve, jól megőrzi.

Az etanolaoűn-vegyüleíek és zselatin keverékéből álló lefedő oldat jelentős előnye, hogy abban kifejezetten nagy térfogatú preparátumok, (akár egész szervek) fs megőrizhetők. Alkalmazások ily módon átlátszó edényben tárolt, makroszkópos preparátumok létrehozását is lehetővé teszi. Ugyanerre a szerves oldószereken alapuló, konvencionális lefedő oldatok esetében, technikai okok miatt, kevésbé van lehetőség.

Hasonlóan jó eredményeket kaptunk a lefedő oldatként önmagában ismert polivmílalkoholnak a. jelén találmány szerinti átderitő oldatokkal történő kombinálása esetért is.

Kísérleteink során megállapítottuk, hogy cellulóz származékok, különösen a karboximefíl-ceiluíúz, átderítő oldatokkal kombinálva szintén jól alkaimazhatők lefedésre. Úgy találtuk azonban» hogy mindezek a vegyszerek, különböző kombinációikban együttesen alkalmazva is jól használhatók lefedés és a preparátumok eltartása céljára,

A jelen találmány szerinti átderitő oldatok alapvető közös tulajdonsága, hogy azokat, erősen koncentrált oldataik formájában alkalmazzuk, így ezek az oldatok a bennük kezelt preparátumból minden esetben vizet vonnak el, vagyis az anyagot dehidrálják. Biológiai szövetek kezelésekor alapvető követelmény, hogy a dehidráció minél lassabban és kíméletesebben menjen végbe, mert ez a szövetek zsugorodásnak mértékét csökkenti.

A vízelvonó hatás intenzitása azonban vegyületenként változó. Úgy találtuk, hogy az. EA, DEA és TEA alkalmazása ebből a szempontból is különösen előnyös, hiszen diszkréten és egyenletesen vonják ki a vizet az. anyagból, s tgy a dehidráció során fellépő zsugorodás nem jelentős mértékű, A három vegyület közül e téren a TEA alkalmazása bizonyult a legjobb hatásfokúnak.

A minél kíméletesebben dehidráló vegyszerek használata mellett a zsugorító halas elkerülésének, vagy legalább is minél alacsony szintre csökkentésének, másik módja, ha a kezelést több lépcsőben, felszálló higítási sort alkalmazva, (vagyis a preparátumot fokozatosan egyre nagyobb koncentrációjú oldatokba helyezve.} végezzük.

Ugyanennek a problémának fokozott jelentősége van akkor, ha az átderitő oldatokat élő szöveteken, különösen ún. vitális mikroszkópos vizsgálatok során használjuk, hiszen ebben az esetben a vízelvonás az élettani funkciókat is károsan befolyásolhatja. Az oldatnak felszálló hígítást sor formájában a feltárt területre juttatása a hátrányos hatásokat ebben az esetben is jelentősen csökkentheti, E vizsgálatok során az oldatban oldószerként gyakorlatilag csak. vizet alkalmazhatunk, hiszen egyéb vízzel is elegyedő oldószerek, (mint pld. az alkoholok)» a szövetekre szintén dehidráló hatást gyakorolnának.

In vivő vizsgálat esetében annak megállapítására kell törekedni, hogy melyik az átderitő oldatnak az a megengedhető legmagasabb koncentrációja, amely még nem váltja

18/26 ki a biológiai funkciók nem kívánatos mértékű károsodását.

Eltávolított szövetek esetében, mikroszkópos preparátum készítésekor, ezzel ellentétben a cél általában a szövetek teljes dehídrálása, hiszen ez a preparátum eltarthatóságát javítja, Ilyenkor tehát az oldat koncentrációjának növelését általában nem szükséges korlátozni. Ennek fokozatos, felszálló hígítás! sor alkalmazása révén történő megvalósítása azonban a zsugorodás csökkentése céljából ebben az esetben is célszerű,

Áz etanolamin-sorhoz tartozó vegyületek, (EA, DEA, TEA), tehát átderítö hatásuktól függetlenül, nagy kiterjedésű anyagok esetén is alkalmazható, jő hatásfokú, s ugyanakkor igen kíméletes, és kevéssé zsugorító dehidráló szemek is tekinthetők,

A Spalteholtz technikával és az azzal rokon eljárásokkal ellentétben, a víztelenítésnek ez esetben azonban nem kell megelőznie az átderítést. A két folyamat, párhuzamosan zajlik; az átderítő hatás már a folyamat megkezdésekor megjelenik, és már a víznek az anyagból való teljes kivonását megelőzően is igen nagymértékűvé válik.

Az anyag teljes dehídrálása egyúttal a preparátumnak a klasszikus rögzítőszerekhen, (formaiin, kálium-bikromát, pikrinsav, stb.) történő, és számos másodlagos problémát okozó fixálását ís helyettesíti, hiszen a. vízelvonás az anyag bomlását, maeeráeíóját szintén meggátolja, s az anyag a debidrálás során tömör, keménygumi-szerű konzisztenciát vesz fel. Ezáltal jól kezelhető, többek között kézzel kényelmesen szeletelhető.

Az eianobumnokkah különösen a TEA-val kapcsolatos, hosszá időt felölelő tapasztalataink azt mutatják, hogy ez az vegyszer, egyúttal tökéletesen konzervál is, hiszen nagyszámú megfigyelés alkalmával egyetlen esetben sem fordult elő, hogy a preparátumokat, gombás, vagy bakteriális fertőzés támadta volna meg.

összességében tehát kijelenthető,, hogy ezek az átderítő oldatok meglepően széleskörű hatást fejtenek ki. hiszen az anyagok átlátszóvá tételéú kívül, egyúttal a szövettani preparátumok kezelésének több alapvető folyamatát, nevezetesen a fixálását a dehidrálásí és a konzerválást is biztosítják. Ügy találtuk azonban, hogy más átderítö oldatok hatása is hasonlóan kiterjedi lehet.

Intermedier vegyületek vegyületeket alkalmazó

és «éra vlzoldéknav között

Az átderílésre használt vegyszerek egy részének, (pld. az etanol áramoknak) azaz előnyös tulajdonsága, hogy vízben és egyéb, vízzel is elegyedő folyadékokban is oldódnak, lehetővé teszi, hogy intermedier vegyüfeteket Iktassunk be a vizoidékony átderítö oldatok és a konvencionális szövettani technika terén alkalmazott, vízben nem oldódó folyadékok közé, s ezzel átjárhatóságot képezzünk a kétféle preparáciős technológia között.

Ezeket az átderítö oldatokat debidrálás céljából töményen alkalmazva, és a kezelés során néhányszor cserélve, a preparátum teljes víztelenítése érhető el. Ezt követően a preparátumot olyan, szintén töményen alkalmazott intermedier folyadékba vihetjük át, amely az átderítö oldatban, és a konvencionális átderítési és lefedési technikáknál alkalmazott, nem vizoidékony szerves oldószerekben, (elsősorban xííoiban és benzolban) egyaránt oldódik,

Az EA, DEA és TEA esetében ilyen például a dietilén-arain, továbbá a szövettani technika terén általánosan alkalmazott alkoholok, (többek között az etil-, metil-, propik ipropilalkohok stb.) A közvetítő folyadék az. átderítö oldat vegyületek és az oldószerként alkalmazott vizet egyaránt kivonja a preparátumból.

Ezt követően, a preparátum, (legcélszerűbben néhány váltás xílolon, vagy benzolon keresztül), már a szövettani technika területén használt, nem vízoldékony vegyületek bármelyikébe átkerülhet, így többek között a Spaltehohz technika, valamint annak változatai esetében alkalmazott, a korábbiakban említett, vízben nem oldódó átderítö oldatok valamelyikébe. Áz átderitő hatás fennmaradásához feltétlenül szükséges, hogy az; anyag már teljesen dehidrált állapotban legyen.

Az intermedier folyadékból a preparátum olyan folyadékokba is átvihető, (a gyakorlatban elsősorban szintén xilolba és benzolba), amelyekben a hlszíoieehnika torén lefedésre általánosan használt vegyszerek, (Canada balzsam, stb.) oldódnak, $ amelyekkel az. intermedier vegyület is elegyedik. Innen kiemelve, és tárgylemezre helyezve, a preparátum már a konvencionális módszerekkel lefedhető,

A klasszikus lefedő oldatokon kívül, magunk, kísérleteink során, egyéb, xi lóiban, vagy benzolban oldott vegyüieteket, valamint azok kombinációit is jó eredménnyel alkalmaztuk lefedés céljára, (Többek között fenyőgyantát, annak Canada balzsammal alkotott keverékét, különböző műanyagokat, pld. a restaurátor szakmában eitetjedten használt „Paralold’ néven ismert keveréket, stb,).

Biológiai anyag

élettani körülmények között ^háromdimenziós * és sztereo-

A jelen találmány szerinti átderítö oldatok egyik legjelentősebb alkalmazási területe a biológiai anyagok élő állapotban, átderítés mellett történő vizsgálata lehet. Ennek lehetősége egészen új perspektívákat nyithat a természettudományos vizsgálatok terén.

A vitális mikroszkópia jelenleg ismert formájának, elsősorban Cbambers és Zweiíáeh munkásságának köszönhető megjelenése korábban frontáttörést okozott a fénymikroszkopos vizsgálatok terén. Az új módszer lényege az volt, hogy sztereomikroszkóp alatt megpróbálták élő állatokon megfigyelni a szervezet működésének bizonyos morfológiai jellemzőit.

A bevezetőben említett optikai és preparáclós technikai nehézségek azonban, összegződve, súlyos korlátok közé szorították ennek a nagyszerű eljárásnak a fejlődését, s igy a vitális mikroszkópia a gyakorlatban elsősorban a mikroeirkulácíó vizsgálatára, a hajszálér-hálózatok működésének, a vőrösvértestek áramlásának megfigyelésére korlátozódott, és egyes speciális, áttetsző preparátumok kivételével, (mint pld. a békák nyelve), ez. is csak a kapilláris-hálózatok legfelszinesebb rétegei esetében volt lehetséges. Ezért a vitális mikroszkópia tudományága az Idők során kissé háttérbe is szorult.

.A problémát részben a konvencionális fénymikroszkóp igen kis mélységélessége jelentette, jelentős nehézséget okozott azonban a vízoldékony vegyüieteket tartalmazó átderitő oldatok hiánya ís.

A helyzetet tovább bonyolította, hogy az átderítö oldatnak ez esetben fiziológiás jellegűnek kell léimé, azaz. a vizsgálat során biztosítania kell a szövetekre jellemző élettani körülmények fennmaradását: a szükséges ionok jelen létét a fiziológiás pB-ί, a megfelelő ozmotikus nyomást, stb. Emellett olyan adalékanyagokat is tartalmaznia keik amelyek az áíderitésért felelős vegyületek esetleges afiziologiás hatását, (például az ionesatornák működésének gátlását, stb,), kompenzálják.

Kísérleteink során sikerült létrehoznunk olyan oldatokat, amelyek jó hatásfokkal biztosítják ezeknek az alapvető élettani feltételeknek a jelenlétét. Az oldatok továbbfejlesztésének lehetőségei ugyanakkor igen széles körűek,

Ezeknek a fiziológiás átderííő oldatoknak az esetében a pB beállítása elsősorban sósavval történik, hiszen ebből, (erős sav lévén), kis mennyiség szükséges a megfelelő pH eléréséhez, s így az oldat felhígulása elkerülhető. Az oldatokban emellett egyéb, a szervezetben is jelen lévő gyenge savak, mint tejsav, ecetsav. stb, is helyet kaphatnak. Előnyösnek találtuk a maleinsav alkalmazását ís, A pB stabilizálásához a vizsgált szövetek tulajdonságaihoz alkalmazkodó, a fiziológia kutatások terén használt pufferek is igénybe vehetők.

Az átderitő oldatnak az adott szerv felszínére juttatásához, továbbá annak meggátiása céljából, hogy az oldat az. adott területről elfolyjon, a szerv alakjához aikalmazkodóan kiképzett edényeket, küvettákat célszerű alkalmazni, melyeknek elhelyezése során el kell kerülni a szervhez futó erek megtörését, vagy kompresszióját.

Az edény, a jobb optikai vizsgálbatőság érdekében esetleg átlátszó .lemezzel lefedhető lehet, s a vele egybeépített optikai elemek, (tükör, prizma, lenese, száloptika, stb.) segítségével a vizsgált terület megvilágítását is elősegítheti.

Mindezek a lehetőségek összességükben az élő szövetek yízsgálatának egészen öj perspektíváit jelenthetik, s egy „háromdimenziós transzparens vitális mikroszkópiá”” nak nevezhető új tudományág kialakulásához vezethetnek.

A szövetek pílbnafnyi morfológiai állapotának rögzítése

A jeleit találmány szerinti eljárás részeként, a szöveteknek folyékony nitrogén, oxigén, stb. segítségével történő hirtelen iefagyaszíásával a szövetek működés közben, az adott pillanatban fennálló morfológia elrendeződését, mintegy pillanatfelvétel formájában, hirtelen fixáljuk, s az anyagot, ezután úgy dolgozzuk fel, hogy alakja a továbbiakban már ne változzon meg. Ebhez, a preparátumot úgy kell dehidrálnunk, hogv hőmérséklete az eljárás során ne emelkedjen többé a fagypont, fölé, s ezáltal a szövetekben található jég halmazállapotú víz ne olvadhasson fel.

E.z úgy valósítható meg, hogy a lefagyasztott anyagot az önmagában ismert lioftUzáeió segítségévek vagy 0 Celsius fok alatti hőmérsékletű, vízben oldódó folyadékba helyezve dehidráljuk. Ezt kővetőért a preparátumot már átderlthef jük.

Amennyiben az e célra alkalmazott átderitő oldat vizet nem tartalmaz, (tehát. pld. az etanol amin-sor tagjait, és a bennünk oldódó vegyületeket tömény állapotban alkalmazzuk), az átderúés során a szöveti struktúráknak a lefagyaszíás pillanatában fennálló alakja már nem változik meg, A dehidráció révén ez az eljárás egyúttal szintén

21/26 biztosítja a szövetek fixálását és konzerválását is.

Ez a lehetőség a „transzparens vitális mikroszkópos vizsgálatok esetében különös jelentőséget nyer, s kiszélesíti e vizsgálatoknak az előző pontban vázolt lehetőségeit, hiszen módot nyújt arra, hogy a mikroszkópos vizsgálat során megfigyelt képletek fiziológiás körülmények között fennálló, vagy kísérleti beavatkozással célzottan megváltoztatott morfológiai struktúráját pillanatnyi helyzetében rögzítsük.

Így mód nyílhat arra, hogy, többek között, az izomrostok ingerléssel kiváltott kontrakciója során fellépő alakváltozásokat, az erek átmérőjének kémiai vegyületek hatására fellépő változásait, valamint mindezeknek a folyamatoknak a keringés eloszlására gyakorolt hatását, de ugyanígy például a bélholyhok mozgásait, stb,, ne csak a kísérlet során, élő állaton vizsgálhassuk, hanem azoknak a lefagyasztás révén rögzüli alakját fénymikroszkóp segítségével is tanulmányozhassuk.

Természetesen a transzparens vitális mikroszkópos vizsgálatok során is lehetőség van arra, hogy a megfigyeléshez alkalmazott sztereómik.rosz.k6p sugármenetébe a sztereókon vértért beiktassuk, valamint arra, hogy a vizsgált képletekről sztereofotőpárokat, sőt azok mozgásait ís ábrázoló sztereo-videofelvételekeí készítsünk, majd e felvételeket a háromdimenziós mérőrendszer segítségével az előbbiekben említett módon feldolgozzuk, s azokon, többek között, háromdimenziós mozgáselemzéseket is végezzünk.

Az előbbiekben felsorolt lehetőségek együttesen már a morfológia egy új területének megnyílását, az, eddig a gyakorlatban szinte nem létező „valódi háromdimenziós» (írue 3Ö) kvantitatív morfológia” tudományágának kifejlődését eredményezhetik.

Bgyes szöveti komponensek törésmutatóinak szelektív meghatározása,, („mikrorefraktometría”)

A jelen találmány szerinti átderitö oldatok egy másik előnyős alkalmazása lehet a vizsgált preparátumok, előnyösen biológiai szövetek, egyes, mikroszkópos méretű komponensei, (biológiai, anyagok esőiében pld. a sejtek alkotóelemek kötőszövet} rostok, sth.), egymástól esak igen kismértékben eltérő törésmutatóinak szelektív meghatározása.

Az e célra szolgáló, „nnkrorefraktoí«etriá*’>»ak nevezhető eljárás lényege, hogy az. átderítő oldat valamelyik változatából igen kis léptékű hígítás! sort. készítünk, és az egyes oldatok törésmutatóját, refraktométer segítségével megmérjük. Ezután az anyagból készült metszeteket, vagy vastagabb szeleteket a hígitásí sor egyes oldataiba helyezve, mikroszkópos vizsgálattal megállapítjuk, hogy az egyes, enyhén elférő törésmutatójú oldatokban a szöveteknek mely komponensei válnak optikailag a leginkább átlátszónkká, s ezáltal a legkevésbé láthatókká, vagyis melyek azok a szöveti elemek, amelyeknek törésmutatója a leginkább egybeesik az adott oldat törésmutatójával.

Összegezve megállapíthatjuk tehát, hogy a jelen találmány tárgyát képező eljárás a biológiai, különösen szövettani preparátumok előállításának szinte minden fázisában, (az anyagok fixálása, dehidrálása, festése, átderitése, konzerválása, lefedés és tárolása terén) új technikai lehetőségeket kínál, s egyúttal több olyan kiegészítő eljárást is magába lóglak amelyek a biológiai anyagok optikai vizsgálatának minőségét tovább javíthatják.

22/26

A fentiekben elmondottak alapján okkal feltételezhető, hogy a találmány szerinti eljárás alkalmazása jelentős mértékben elősegítheti olyan,, különösen vastag, s ennek ellenére átlátszó, szükség szerint az anyag egész tefiedelmében egyenletesen megfestett preparátumok létrehozását, amelyeken lehetővé válik a morfológiai struktúrák valós térbeli szerkezetének tanulmányozása.

E módszerek alkalmazása lehat a tudománynak és az. iparnak mindazokon a. területein előrelépést jelenthet, ahol optikai, s ezen belül, főként fénymikroszkópos vi zsgál a tok zaj ianak.

Alkalmazási területe így tehát igen széles körre, az orvostudományon és más természettudományokon kívül, a műszaki élet. az ipar, (különösen a könnyűipar), a gyógyszergyártás, valamint a mezőgazdaság területére is kiterjedhet, s ezeken a területeken többek között a tudományos kutatás, a terápia, az anyagvizsgálatok, a minőség-ellenőrzés, a gyártásközi ellenőrzés és a gyártmányfejlesztés keretében nyerhet felhasználást.

Irodalom jegyzék:

Aan-Shyn Chiang: US Pat. No. 6,472,216,, (2002), - Taiwan E.C.O. patent 206390).

Hanta, Η,, Kurokawa, IL. Kawano, H, Andodt, Shímogorí, Γ, Noda, H., Enkami, K, Sákaue-Savano A„ Mijawaki, AcSeale: a Chemical approaeh fór iluorescens imaging and reeonstmeíion of transparent mouse brain

Natúré Neuroscíenee, (2011)

Romels Mikroskopische Teehmk, 17, átdolgozott kiadás

Szerkesztő: P, Bőek: Urban und Schwarzenberg, München, Wien, Baltimore, (1089),

Stuber L: Oxlgénfeltöltés: új módszer vesetubülusok térbeli topográfiájának vizsgálatára Magyar Élettani Társaság Vándorgyűlése, Budapest, (1685 >

Stuber, L: Autoinflatiőn by oxi gén: a new menüs of the three-dimensíonal investigation of renaie tubnles

Seventh International Symposium of Morphological Sciences, Brüsszel, (1986)

Stuber 1. Nagy G, Petrák P; 5153/86, (1986);- EU Pat. No. 0412077, - US Pat.No. 4.927,253, - Ü'S Pat. No. 5,059,011, - Austr. Pat. No, 611661,- .lap. Pat. No. 2926685 Stuber L, Korom Cs„ Szabados L.: PÖ80Ö650, (2008.)

Yuan-An Liu, Ann-Shyn Chiang, Shiue ChengTang, Pub, No.US 20.12/0081538 Al,

Claims (14)

1. L igénypont: ki.járás optikai vizsgálatok célját szolgáló, nagy vastagságú prepurátuntok létrehozására, azzal jellemezve, hogy a preparálandó anyagot előzetes fixálást követően, vagy fixálás netótö, megfestve. x agy testes nelh.nl,- olyan átdcrífn oldattal itatjuk át, amely vízben, vagy vízben is oldódó vegyületet, úgymint - elattolarnini. dietanolamim, trieautoLmínt, kamine-d-meh I-1 -prop<eaolf,
2. 2- ieuil-etilalkoholt, díhuúlítalátot, díhuúkmmtt, etilettglikelt. propilengiikolt, {propán-l,2~diolt}, .teutont. etilalkoholt, metihikuhoh, butilalkoholt, i-butialkoholt, propilalkohoú, i-propilalkoholt, amiiaikoholt, i-amilulkohulk eeefsuxaL íejs.n<<t, eurontsatal, tnaleinsavat, vajsavyt. almasavat, piros/oloscnat, borost)ankosasai, gileim, .dánná, ,ο o ,e.egíe-av.m ptolmt, hie.ovptmtnt, eodze; 1-ütmefa e.nmee.umbto.n.dok eetii~triroeüi-ammóntutnbromidot, nátrium-iaurils/arkozínátot. s/aoomm, eholinu dezosieholint, Teepoík hexametilén-teíranűnt, tris-{hidroxuna'íútemhueusci.im. Irinát? íum-eitr.úot, hshOuiaunnt. hidia/ius/ulfátot kahum-n,ítr;um-fart,u'átot, iiekurbumidoi
3. 3- nuaióhnopropán'Szultbnsavaí, nátríomszulfátok nátnumszulfstoL náiriumtíoszalkuot, kaleiutnkloridot. kaliumkloridot, einkkloridot, ammoniums/ultníoi, ammotntanklondot. ammoniutn-magneztum-onoÍOSzfátot, ammóniumacetálot, bórsavat.- \„g\ e, emel, a \„esukte\ne\ ki es bozo k> nh. s„esoie e- ertmu km erekét kute tea, m tememen. \ag\ nagy keneentmeípm, sagy telített vizes oldat lormmubam

   2, igénypont: Eljárás biológiai anyagok élő állapotban történő átderítésére, azzal jellemezve, hogy a preparálandó anyagot fixálás nélkül, megfestve, vagy testes nélkül >d\;m oldattal itatjuk át, amely vízben, xttgy vízben is oidodo vegyületei, úgymint et.mrhsmm:, d.ettnolammf. ktetanolanúnk eeetsmat, tejsavat, ehromsmat, nmlemsavat, vajsavat, almasavat, piroszőlősavat borostyánkősavak glioinf, alanink aszparaginsavat, prolink hídroxiprolmk trls-(hídroxi~meíii)~ammometánk kálelumklorldot, káliumkloridot. náíriumszuifáiok irinátrium-eitrátot, hálmm-nátrium-tartarátok náiriumfioszulíafot, nátriumszulfhok ehtkkloridok ammóníumszulfátot, ammóníumkloridot, amrnóuiurnaeefátoi, bórsavat.

   z-amino-z-metií-i-propánok, 2-íenil-eh íal koholt, dibutilftalátok dihuülanüitk vfílenglíkolí, p^pduigltkolt, yvopan- U-diolO .teutont etilalkoholt, metii,db mólt, bunhikoholf, ubtdínlkehnls·,propdaikoTkdk i-ptopihlkoüolt. mmlalkukolt, i-anthalkehoh. dodeeii-írimetii ammóniumbromídot, cetil-trsmeül-arnmóníumhrormáoh nátrium-laurílszarkozináfok szaporánk eholínf, dozoxiehollnt, Tecpolk hexametiiéu-teírammí, tiokarbantidof, 3-morfolinopropán-szulfonsavat, - vagy ezeknek a vegyületeknek különböző kombinációjú és atanyó keverékét tartalmazza, olyan vizes oldat formájában, amelynek pli-ját erős, vagy gyenge savval, \<m> s,ool kai az adott hiológao „to>.tg eseteden íi/telogusnuk tekinthető ertekm akit jnk Iv, >-s - a s.'owtek eloltani l-drölményuinek fenntartását biztosító, és s/ukseg eseten ,u atderito oldat adztológín. hutásait kompenzáló vegyületet, vagy vegyületeket ts nupaba fogl Jó. az adott V ev a ν' ay uJo dereng utol u- au '-g ,.e. korulmeuxettől ingj o ess,etetek; h aologt <s oldattal keverjük,

   3. igénypont: .ve 1 vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kezelendő anyagnak tsz átderítö oldattal történő átitatását úgy végezzük, hogy az anyagot atmoszferikus nyomáson. \ úgy túlnyomás alak az. oldatba belementjük, vagy a folyadékot az anyagra ráütniük, vagy a fohadeksá a.' érrendszeren, vagy más biológiai csőrendszeren keresztül az anyagon períüziö formájában átáramoitatjuk, vagy ezeket az eljárásokat kombinálva alkalmazzuk.
4. 4. igénypont: Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy amennyiben , , í for mold, f s. <a u <· ηοοηο '> komplex képző < hmn κ íu*. I v. ma ?

   semlegesítjük, hogy az, oldathoz az. összes komplex kötőhelyek fém ionokkal történő telítéséhez, szükséges mennyiségű íemsót adunk,

   S< igénypont: Az. I. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a preparátumok festésekor a testes! eharax μ«η· alkatma ott oldatokat az atdentest ;neg,'I>vo's.g. vagy az átderitő oldattal s'gxJejüleg juttatjuk az anyagba, oly módon, hogy az. anyagot az oldatokba belemer?,mk, a. oldatot az anyagra ráöntjük, vagy az oldatot az érrendszeren, vagy más biológiai csőrendszeren keresztül az anyagon perfüzió formájában átáramoitatjuk.
5. 6. igénypont: Az 1, vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a preparátumok festésekor a féstékoidatokat a szokásos koncentrációban használjuk, és a festést a szokásos időtartamon keresztül végezzük, vagy a szokásosnál lényegesen higabb okiatokat, alkalmazunk, s ebben az. esetben a .festést a szokásosnál hosszabb időn keresztül folytatják, és a folyamatok előrehaladását szükség esetén az anyag körül létesített túlnyomás, vagy szívás segítségévei ís támogatjuk,
6. 7. igénypont: Az I. vagy 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a preparátumot az átderitő oldatokba merítve, vagy az. átderitő oldatokat és \ utoldekonx, ám beszáradáskor megszilárduló vegyületet, különösen zselatint., polívínílalkolmh. karboximetíl-eelluk'/t vagy ezek kombinációit tartalmazó lefedi* oldattal beborítva vizsgáljuk, * ugyanilyen módónt tároljuk.
7. 8. igénypont: Az L vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jel lemezve, hogy az átderitő okiatokbuk lug'tnssah lépcsőzetesen \aitozo törésmutatóm sorozatukat keszunnk. cs ezek törésmutatóit méréssel meghatározzuk, majd a vizsgálandó anyagot az egyes oldatokkal áthatva, a preparátumok egyes komponenseinek Inrésmutalóil szelektíve meghatározzuk, oly módon, hogy optikai, különösen fénymikroszkópos vizsgálat segítségén ol megállapítjuk, bogy az egyes okiatokban az. anyag mely komponensei válnak, a törésmutaw^nagyfokó azonossága miatt a legn agy ob b mérték ben átlát szóakká.
8. 9. igénypont: Az I. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, bogy az eljárás során az élő szövetek működés közben fennálló morfológiai elrendeződését megőrizzük, oly modm', hóm as o·^ .ke, m\,se'efag>a\z; ak mmd kdeink a ν.ρ\π.ηζ\,Aaf oz onnagfovt t Ismert hoftlizácló elvének megfelelően, vákuumban. szublimáció révén eltávolítjuk, vagy a szöveteket lefagyasztjuk, majd 0 Celsius fok alá hűtött, vízben oldódó folyadékba helyezve, a jégkristályokat az anyagból fagypont alatti hőmérsékleten eltávolítjuk, és a dehídrálást követően a preparátumot,átderítjük.

   19. Igénypont: A 2, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy biológiai anyagok éló állapotban történő atderítésekor, az átderitő anyagnak az adott szerv felszínére juttatásához és az adott területről való ei folyásának meggátlására, a szerv alakjához alkalmazkodóan kiképzett edényt használunk, amely átlátszó lemezzel is lefedhető, és a megvilágítást elősegítő optikai elemeket, t tükör, prizma, lenese száloptika, stb.) is magába foglalhat.

   ί l. igénypont: Az 1. vagy 2.igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az anyagnak az. átderltö oldatokban történt teljes debidrálását kővetően a preparátumot olyan, töményen alkalmazott intermedier folyadékba, különösen dieiilén-antinba, vagy alkohol vegyületbe visszük át, amely a jelen találmány szerinti átderitő oldatban, és a konvencionális átderitési, valamint .lefedési technikáknál alkalmazott. nem vizoldékony szerves oldószerben, különösen xilolban, vagy benzolban egyaránt oldódik, majd a preparátumot az utóbbi vegyület, vagy vegyületek. közbeiktatásával a konvencionális átderdesr technikánál alkalmazott, nem vizöidékony vcgvuletbe, külonöíen ntettIszolieílatba, menihen,maiba. beuzűbcn/oátbo, ttnltoliuha, tetrnhoha, Ι\ολ,utóiba, vagy ezek kévétekébe juhart a átdefttiűk es ebben az okimban tároljuk, vagy konveneitmahs lefedő oldattal, különösen í'tmada balzsammal, vagy szenes oldószerben, vagy szerves, oldószerek kévéi ékében oldott„Haralofdmúany ag keverékkel lefed fűk és igy toroljuk,
9. 12, igénypont: Az 1. vagy 2, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az áUentö okinként, vagy lefedő oldatként önmagában ismert vegyüietek köze¹ e dlmetibszalloviAn, gkeeunt. faktort, szacharózt. levtdo/s, guniiarahikumot pohvimlakoholt, uiien-vhun'in-tetraaeeíatot, \e,gy fueeth adaléka tyagkestt az l.v„gv ³ tgenyponmau s miepie vegyűletekkel kombinálva, azokénál lényegesen kisebb koneentiauobnm az összetett átderitő oldatokban adalékanyagként a.lkalmazzuk.
10. 13, igénypont Az 1. vagy 2. Igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tüdns/övétből készült prepámon,ok eseteben a \?,c^f\ emdeís Oetkezetet alakjai az eljár,..során megőrizzük oiy módon, hogy a tüdőbe a tracheán keresztül az 1. igény pont szerinti atdemo oldatok valamelyikévé! kombinált, feimelegitett folyékony zselabnoldatet juttatunk, majd a szervet hirtelen lehűtjük, és a szervet egészében, vagy a belőle készült szeleteket előny őscn átderitő oldatba helyezzük.
11. 14, igényponti Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, bo;.y rovarok kiderítésekor az úídcrtiö hutást u kitin páncél strukturálnák fellazítása révén fokozzak, oly nt'don, hogy a rovart bimm vegyűietet, előnyösen hüums/míatoí fítumhldrosidm, htinmtormíatet, továbbá tetrameiii-animónltnultidnixalot, nátriumsziükátet. vagy ezen vegy ideiek kombinációit tartalmazó oldatokkal ke, éljük .
12. 15, igénypont: zVz. 1. igénypont, szerinti eljáms, az, ai jellemezve, hogy fönnállóban fixált preparátumok esetében a fixálás hatását az, anyagnak hidroxilammt, vagy hldrazinszulfótot, vagy ezek kombinációját tartalmazó oldattal való kezelése révén csökkentjük.
13. 16. igénypont Az 1. igénypont, szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy csont csiszohriokbé! és fog csiszoiaíokfoól készült preparátumok esetében a csont kéregállományában található csatornák, valamint a denfncsatornák térbeli szerkezetéi, Iégbaborekokkal való fehőités segítségével tesszük láthatóvá, oly' módon, hogy a preparátumot vizöidékony, illékonyfolyadékba, (különösen díehíémaminba, vagy alkohol vegyületbe). vagy ilyen folyadékok keverékébe merítve dehidráljuk, majd a folyadékot a preparátumról elpárologtatjuk, s ezt kővetően a preparátumot átderif ük,
14. 17, igénypont. Az fi igénypont s/ernti eljárna, az, al jellemezve, hogy v e.veszüv vtbol készült preparátumok esetében a vesetubednsok térbeli lefutását oxigén buborékokkal történő feltöltes segítségével tesszük vizsgálhatóvá, oly módon, hogy az önmagában ismert eljárás szerint az anyagot, előnyösen kálium-permanganátíaí történő oxidációt követően, hidrogen-peroxidot, vagy Uidrogéii-pcroxidot ís tartalmazó oldatba merítjük, vagy ezt az. oldatot az érrendszeren \O'es ml a vev.be pittotpik, \ e m'. m d;ás,fi\,ü egytdem eg, vagy art követően a o.epammmef átderítö oldattal kezeljük, az e célra történő felhasználás szempontjából önmagában ismert kálíumhldroxíd helyett, vagy azzal egy üttesen, az I -vagy 2. igénypont szerinti vegyűietet, vagy vegyületeket alkalmazva.