KR20230072455A - 태반 가수분해물 및 이의 제조방법 - Google Patents

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김태정
정순재
임민주
정경수
한혜정
김상규
김상현
카쿠타이이치
임홍석
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(주)녹십자웰빙
가부시끼가이샤니혼세이부쯔세이자이
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Abstract

본 발명은 동물 태반 파쇄물을 탈지하고 건조시켜, 동물 태반 파쇄물 분말을 얻는 단계; 상기 동물 태반 파쇄물 탈지 분말에 단백질 분해효소 산 용액을 처리하여 효소 분해하는 단계; 및 상기 분해물을 음이온 교환 수지와 접촉시켜 이온 교환하는 단계;를 포함함으로써, 약리 활성을 나타낼 수 있는 아미노산, 올리고펩티드를 다량으로 포함하는 태반 가수분해물을 제조할 수 있는 방법에 관한 것이다.

Description

태반 가수분해물 및 이의 제조방법
본 발명은 태반 가수분해물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
태반(placenta)은 임신한 포유류의 자궁에 생기는 기관으로 탯줄을 통하여 태아에게 영양분을 공급하고, 생명을 지탱하게 한다. 태반은 출산시 자궁으로부터 배출되며, 태반이 나오는 것을 후출산이라고 한다.
태반에는 필수 아미노산, 멜라토닌, RNA, DNA 등의 핵산 성분, 항산화 효소인 SOD(Super oxide Dismutase), 히알루론산(Hyaluronic acid), 항산화제, 면역보조인자(cytokine), 태반펩타이드, 인슐린유사성장촉진인자 (insulin-like-growth factor), 표피성장촉진인자(EGFS, Epidermal Growth factors) 및 독특한 노쇠세포활성인자(SCAFS, Senescent cell Activating factors) 등의 성장인자와 사이토카인 류가 포함되어 있어 피로회복, 면역 증강 등에 유용한 것으로 알려져 있다.
이러한 태반의 가공 방법으로서는, 강산(보통 3N 염산)이나 강알칼리를 이용하여 태반을 가수분해하여 그 산물을 얻는 방법이 이용되어 왔으나, 이 방법에서는 장시간 고온 처리를 행하는 과정에서 태반이 가지고 있는 각종 아미노산 등의 생리활성물질이 파괴되는 문제가 있다. 또한, 종래의 효소를 이용한 태반 가공 방법은 유효성분 추출에 장시간이 소요되는 문제가 있어 이를 개선할 수 있는 방법의 개발이 필요한 실정이다.
국내 특허출원 제 2000-0043588에서는 간암 치료 및 예방을 목적으로 자하거(태반) 가수분해물을 이용하였는데, 인체의 태반으로부터 사이토카인, 아미노산, 핵산염기, 당질 등의 각종 생체 활성 성분들을 추출한 자하거 가수분해물을 이용하였으며, 이 때 자하거를 아세톤으로 처리하여 탈지한 후, 불완전한 가수분해물이 생성되지 않도록 펩신과 염산으로 처리하는 충분한 가수분해 처리를 하였다고 기재하고 있으나 상세한 제조방법에 대한 기재가 없었다.
국내 특허출원 제 2007-0065779에 따르면 태반에 아세톤 및 정량의 정제수를 첨가하고 3~5시간 동안 40℃에서 탈지 반응시키고 이 탈지반응 산물을 80℃에서 8시간 건조시켜 탈지 태반 분말을 얻었으며, 태반 분말로부터 i) 태반 분말 40 내지 60 중량부에 대하여 단백분해효소 0.5 내지 8 중량부 및 물 30 내지 60 중량부를 첨가하여 가수분해하는 단계; ii) 상기 가수분해 산물을 감압농축하는 단계; 및 iii) 상기 감압농축물을 동결건조시키는 단계를 포함하는 태반 유래 화장품 또는 건강기능식품 원료용 조성물의 제조 방법을 기재하고 있다. 그렇지만 본 건 선행 발명의 실시예에서는 인간의 태반이 아닌 돼지 태반을 사용하였고, 산 추가 가수분해법으로 얻은 태반 추출물 대비 단백분해효소법에 의한 태반 추출물의 아미노산 함량이 높은 것으로 기재하고 있으나 단백질의 분해 과정 외에 다른 단계에 대한 비교나 분석을 하지 않았다.
태반의 구체적인 성분은 정확히 알려진 바 없으나, 선행특허출원 2003-0000173에 따르면, 정상분만한 산모의 자하거를 아세톤으로 탈지하고 염산으로 가수분해하여 1.0밀리리터 당 56 밀리그람 이상의 수용성 물질을 함유하며, 정량을 하였을 때, 아르기닌 0.01중량%, 리신 0.02중량%, 페닐알라닌 0.09중량%, 티로신 0.04중량%, 로이신 0.11중량%, 이소로이신 0.01중량%, 메치오닌 0.02중량%, 발린 0.02중량%, 글리신 0.02중량%, 프롤린 0.01중량%, 글루타민산 0.02중량%, 세린 0.03중량%, 트레오닌 0.02중량%, 아스파라긴산 0.21중량% 이상의 아미노산을 함유하고, 총질소 0.172 내지 0.816 w/v%를 함유하는 것으로 기재하고 있다.
단백질이나 펩타이드의 존재 유무에 대한 분석은 일반적으로 Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) 방법을 사용한다. 이는 전기영동 장치를 이용해 단백질을 분자량에 따라 분리하는 정성분석 방법으로 주요 단백질의 존재를 확인하는 방법이다. SDS-PAGE는 아크릴아마드(Acrylamide) 성분의 함량과 글라이신(Glycine) 혹은 트리신(Tricine)을 원료로 해서 단백질과 펩타이드의 분리에 적용하고 있다. 트리스-글라이신(Tris-glycine) 젤의 경우 분자량 10 kDa ~ 300 kDa의 단백질의 분리에 유용하게 사용하며, 트리스-트리신(Tris-tricine) 젤의 경우 분자량 2 kDa ~ 20 kDa의 펩타이드 분리에 유용하게 사용한다. SDS-PAGE를 통해 분리한 단백질/펩타이드는 쿠마시 염색법(Coomassie staining)을 통해 최종 단백질의 유무를 확인한다. 최근에는 Gel image program을 이용해 PAGE에서 분리된 단백질의 함량을 수치화 하기도 하지만, 밴드 분리와 염색법의 밴드 포화(band saturation) 등의 이유로 정확한 단백질의 함량 분석 방법에는 적용하기 어렵다. 분자량 2 kDa 이하의 펩타이드는 LC-MS 분석 방법을 통해 펩타이드의 존재 유무를 확인 할 수 있다.
태반 가수분해물의 제조 과정 중에 산 가수분해 과정이 진행되는데, 이것은 인간 태반 내에 펩타이드 혹은 아미노산이 다수 존재할 수 있음을 의미한다. 현재까지 알려진 펩타이드의 서열 규명에는 질량분석기(ESI-MS/MS; Electrospray Ionization)를 보편적으로 사용한다. 태반 가수분해물 내에 존재하는 단백질 혹은 펩타이드는 위 방법을 통해 확인 분석이 가능하다. 최종적으로 태반 가수분해물 내에 포함되어 있는 단백질 혹은 펩타이드에 관하여 SDS-PAGE 방법으로 존재유무를 확인하고, LC-MS 방법에 따라 저분자량의 펩타이드의 존재와 함량을 분석함으로써 태반 가수분해물 내에 포함된 단백질과 펩타이드를 모두 확인할 수 있다.
태반 중에는 다양한 인체의 생리 작용에 영향을 미치는 것으로 알려진 미네랄이 함유되어 있을 것으로 추정한다. 미네랄은 철분, 마그네슘, 칼슘, 아연, 셀레늄 등이 대표적으로 알려져 있다. 분유나 건강기능 식품 그리고 의약품 중의 미네랄의 함량 분석은 여러 가지 방법이 알려져 있으며 대표적인 방법으로 대한약전 중 일반시험법에 해당하는 방법을 참고해 보면 표준액을 농도별로 제조하여 각 농도에 해당하는 흡광도 값에서 검량선을 얻고 이 검량선 그래프 상에 시료의 흡광도 값을 읽어서 시료 중 해당 미네랄 성분의 함량을 확인하는 방식으로 측정하였다.
일반적으로 아미노산, 펩타이드 또는 단백질을 함유하는 조성물을 정제하는 과정에서는 이온교환크로마토그래피를 사용한다. 단백질과 펩타이드는 양쪽성 이온인 아미노산으로 이루어져 있어서 주변 환경의 pH에 따라 단백질과 펩타이드의 전하(net charge)가 바뀌게 되는데 중성을 띠게 하는 pI(등전점) 차이를 이용하여 이온이나 극성 물질을 분리한다. 이러한 분리 과정을 이온교환크로마토그래피라고 하며, 분리하고자 하는 단백질의 표면 전하를 기준으로 음이온교환체와 양이온교환체를 사용하는 크로마토그래피로 구분한다. 음이온교환크로마토그래피의 경우 등전점이 높은 단백질이 상대적으로 칼럼과 약하게 결합하고 있어서 낮은 염 농도에서도 용출될 수 있으므로 등전점이 높은 단백질부터 칼럼에서 용출되기 시작한다. 이온교환크로마토그래피의 이온교환체 즉 이온교환수지의 종류와 평형조건, 시료의 로딩 조건과 워싱을 어떻게 진행하는지 또는 용출액의 pH를 어떤 범위로 경사시키는지 버퍼의 종류와 용출 조건에 따라 얻어지는 생성물의 함량이 달라지게 된다.
본 발명에서는 태반을 가공하여 태반을 가수분해 시키거나 태반으로부터 유효한 효과를 가지는 의약품 조성물을 추출하는 과정에서 이온교환크로마토그래피의 최적 조건을 수립하고 이에 따라 얻어지는 태반 가수분해물 또는 태반 추출물 중의 단백질, 펩타이드 또는 미네랄의 함량을 확인하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 약리 활성을 나타낼 수 있는 아미노산, 올리고펩티드를 다량으로 포함하는 태반 가수분해물의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 동물 태반 파쇄물을 탈지하고 건조시켜, 동물 태반 파쇄물 분말을 얻는 단계;
상기 동물 태반 파쇄물 탈지 분말에 단백질 분해효소 산 용액을 처리하여 효소 분해하는 단계; 및
상기 분해물을 음이온 교환 수지와 접촉시켜 이온 교환하는 단계;를 포함하는 태반 가수분해물의 제조 방법.
2. 위 1에 있어서, 상기 탈지는 태반 파쇄물에 아세톤, 알코올 및 에스테르로 이루어진 군에서 선택된 유기 용매를 가하여 수행되는 것인 태반 가수분해물의 제조 방법.
3. 위 1에 있어서, 상기 탈지는 상기 태반 파쇄물에 아세톤, 알코올 또는 에스테르를 포함하는 유기 용매 중 어느 하나를 가하여 2시간 내지 8시간 동안 탈지시키는 단계 및 60 ~ 100℃에서 10시간 내지 24시간 건조시켜 상기 유기 용매를 제거하는 단계를 포함하여 수행되는 태반 가수분해물의 제조 방법.
4. 위 3에 있어서, 상기 탈지 및 유기 용매의 제거는 복수회 수행되고, 1회차 대비 2회차에서 보다 장시간 탈지하는 태반 가수분해물의 제조 방법.
5. 위 1에 있어서, 상기 단백질 분해효소는 파파인(Papain), 펩신(pepsin), 브로멜라인(Bromelain), 프로나제(Pronase) 또는 알카라제(Alcalase)인 태반 가수분해물의 제조 방법.
6. 위 1에 있어서, 상기 산 용액의 산 농도는 0.1 내지 10%인 태반 가수분해물의 제조 방법.
7. 위 1에 있어서, 상기 효소 분해시에 태반 파쇄물 탈지 분말 10 kg 내지 25 kg 대비 단백질 분해효소 0.5 kg 내지 3 kg을 처리하는 태반 가수분해물의 제조 방법.
8. 위 1에 있어서, 상기 음이온 교환 수지와의 접촉은 상기 분해물에 음이온 교환 수지를 첨가하거나, 상기 분해물을 음이온 교환 수지 칼럼에 통과시켜 수행되는 태반 가수분해물의 제조 방법.
9. 위 1에 있어서, 상기 이온 교환된 분해물에 염기를 첨가하여 pH를 조절하는 단계를 더 포함하는 태반 가수분해물의 제조 방법.
본 발명에서는 태반으로부터 태반 분말을 제조하는 방법, 태반 분말로부터 태반 가수분해물을 제조하는 방법을 제공하였고, 본 발명의 제조 방법을 통해 얻어지는 태반 가수분해물은 2mer 내지 5mer의 펩타이드를 함유하며 생리학적 활성이 높은 미네랄을 다량 함유하고 있어서, 본 발명의 태반 가수분해물을 함유하는 약학 조성물 또는 건강기능식품 조성물은 피로와 관련되는 증상이나 질환을 완화시킬 수 있으며 특히 간 질환에 효과가 있다. 또한 본 발명의 태반 가수분해물을 포함하는 화장품 조성물은 피부 노화 방지 및 주름 개선에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 태반 가수분해물을 TCA 침전 농축시킨 후 SDS-PAGE 단백질 분리 결과이다.
도 2는 본 발명의 태반 가수분해물을 Speedvac 농축시킨 후 SDS-PAGE 단백질 분리 결과이다.
도 3은 본 발명의 태반 가수분해물을 Speedvac 농축시킨 후 Tris-tricine 젤 전기영동을 통한 펩타이드 분리 결과이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 태반 가수분해물의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 동물 태반 파쇄물을 탈지하고 건조시켜, 동물 태반 파쇄물 분말을 얻는 단계; 상기 동물 태반 파쇄물 탈지 분말에 단백질 분해효소 산 용액을 처리하여 효소 분해하는 단계; 및 상기 분해물을 음이온 교환 수지와 접촉시켜 이온 교환하는 단계;를 포함한다.
태반은 인간을 포함하는 포유류 태반일 수 있고, 구체적으로는 인간 태반일 수 있다.
태반에서 융모 조직 또는 제대 조직을 사용할 수 있다.
탈지는 태반 파쇄물에 아세톤, 알코올 및 에스테르로 이루어진 군에서 선택된 용매를 가하여 수행되는 것일 수 있다. 구체적으로는 아세톤 또는 알코올을 사용할 수 있다. 알코올로는 에탄올을 사용할 수 있다.
용매는 예를 들면 태반 파쇄물 대비 2 내지 20 v/w 배, 4 내지 12 v/w 배의 양으로 가할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 용매의 양이 상기 범위 내인 경우 충분한 탈지 효과를 나타내면서, 추후 용매 제거가 용이할 수 있다.
탈지는 교반 하에 수행될 수 있다. 교반 시간은 2시간 내지 8시간이 바람직하다. 교반 시간이 너무 짧으면 충분한 양의 침전물을 얻을 수 없으며, 교반 시간이 너무 길면 전체 공정 시간이 길어지기 때문에 비효율적이다.
탈지는 태반 파쇄물에 아세톤, 알코올 또는 에스테르를 포함하는 유기 용매 중 어느 하나를 가하여 2시간 내지 8시간 동안 탈지시키는 단계 및 60℃ 내지 100℃에서 10시간 내지 24시간 건조시켜 상기 유기 용매를 제거하는 단계를 포함하여 수행될 수 있다.
탈지는 잔류 지방을 완전히 제거한다는 측면에서 복수회 수행될 수 있다. 예를 들면 2회 이상, 3회 이상, 4회 이상 수행될 수 있다. 그 상한은 예를 들면 6회, 5회, 4회 등일 수 있다. 복수회 탈지시에 각 탈지 공정은 상기 예시한 시간만큼 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
탈지를 복수회 수행하는 경우에 이후 회차에서 이전 회차 대비 탈지 시간을 더 길게할 수 있다. 예를 들어, 1회차 탈지 대비 2회차 탈지 시간을 더 길게할 수 있다.
탈지 이후에는 침전 용매를 제거한다. 용매의 제거는 원심분리로 수행될 수 있다.
탈지를 복수회 수행하는 경우 각 탈지 공정마다 그 사이에 용매 제거 공정이 수행될 수 있다.
건조 온도는 예를 들면 60℃ 내지 100℃일 수 있다. 상기 범위 내에서 60℃ 내지 100℃, 70℃ 내지 100℃, 80℃ 내지 100℃, 90℃ 내지 100℃ 등일 수 있다. 건조 온도가 상기 범위 내인 경우 충분히 건조되면서 태반 조직이 상하는 것을 방지할 수 있다.
건조 시간은 예를 들면 10시간 이상, 12시간 이상, 14시간 이상, 16시간 이상일 수 있다. 그 상한은 예를 들면 48시간, 36시간, 24시간 등일 수 있다.
이후 동물 태반 파쇄물 탈지 분말에 단백질 분해효소 산 용액을 처리하여 효소 분해한다.
단백질 분해효소는 예를 들면 파파인(Papain), 펩신(pepsin), 브로멜라인(Bromelain), 프로나제(Pronase) 또는 알카라제(Alcalase)가 사용될 수 있다.
단백질 분해효소 산 용액은 단백질 분해효소를 포함하는 산 용액으로서, 산은 예를 들면 염산, 질산, 황산, 초산 등일 수 있고, 구체적으로는 염산일 수 있다.
산 용액의 산 농도는 0.1 내지 10%일 수 있으며, 그 함량은 태반 분말의 건조함량 대비 0.2 ~ 20배(W/W)로 사용할 수 있다.
본 단계에서 태반 분말 10 ~ 25 kg 대비 단백질 분해효소 0.5 kg ~ 3 kg을 사용할 수 있다. 단백질 분해효소의 함량은 태반 분말의 건조함량 대비 0.01 ~ 5배(W/W)를 사용하는 것이 바람직한데, 단백질 분해효소의 함량이 너무 적을 경우에는 가수분해가 잘 이루어지지 않고, 가수분해 시간이 많이 필요하여 공정시간이 불필요하게 길어지는 문제가 있고, 반면에 단백질 분해효소의 함량이 너무 많을 경우에는 가수분해결과 태반 성분의 분자량이 작아져 원하는 충분한 효능을 발휘하지 못하는 문제가 생길 수 있다.
효소 분해는 추가 분해 반응이 나타나지 않을 때까지 수행될 수 있다. 이는 예를 들면 뷰렛 반응에 의해 추가 단백질 반응이 나타나지 않을 때까지 수행될 수 있다.
이후 상기 분해물을 음이온 교환 수지와 접촉시켜 이온 교환한다.
음이온 교환 수지의 처리는 가수분해액에 음이온 교환 수지를 첨가하거나, 가수분해액을 음이온 교환 칼럼에 통과시켜 수행될 수 있다.
이후, 여과, pH 조절, 가열멸균을 수행할 수 있다.
가수 분해물 용액의 온도를 높여 효소를 불활성화시키고 잔여물을 여과하여 제거시키는 과정이다. 이 때 온도는 70℃ 내지 100℃로 실시할 수 있다.
다음은 수산화나트륨 등의 염기를 pH 조절제로 첨가하여 pH를 높이는 공정이다. pH는 예를 들어 5.5 ~ 7.5로 조절할 수 있다. 본 발명의 조성물을 주사제 또는 경구용으로 사용하기 위해서는 상기 pH의 범위를 갖는 것이 적합하기 때문이다. 상기 공정을 통해 얻어지는 조성물에 정제수를 가하여 농도와 액량을 조절할 수 있다. 이 과정은 열처리로 이루어지는데, 고온 고압 멸균기에 안식향산나트륨과 같은 보존제를 첨가하여 가열 멸균하는 것이 바람직하다. 보존제는 본 발명의 조성물(ex. 의약 조성물 또는 식품 조성물이 허용하는 범위에서 통상적인 것을 사용할 수 있다.
상기 멸균 과정은, 바람직하게는 100 ~ 140℃에서 20 ~ 120분간 수행될 수 있다.
상기 본 발명의 방법에 따라 얻어지는 태반 가수분해물은 약리 활성을 나타낼 수 있는 아미노산, 올리고펩티드를 다량으로 포함하므로, 이는 건강기능식품의 원료로 사용될 수 있다.
상기 가수분해물로 제조되는 건강기능식품은 간 기능 개선에 도움을 줄 수 있다.
'건강 기능식품'은 '인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품' (대한민국 법률 제7428호인 건강기능식품에관한법률의 제3조 제1호)에 충족될 수 있는 것이다. 그리고 ‘기능’ 또는 '기능성'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 말한다. 즉, 건강한 사람들 또는 반 건강인의 보건 용도에 유용하게 사용될 수 있는 것을 의미한다.
건강기능식품 내 태반 가수분해물의 건조 함량은 전체 함량의 0.1 ~ 50 중량%가 바람직한데, 함량이 너무 적을 때는 상술한 태반 가수분해물의 효능이 불충분하게 발현되고, 또한 투여량이 많이 요구되기 때문에 투여상의 불편함이 있으며, 함량이 너무 많을 때는 용해도의 문제와 제품 제형상의 문제가 있다.
태반 가수분해물이 함유된 건강기능식품은 복용상의 편의를 위하여 정제, 당의정, 캡슐, 드링크 등의 제형을 갖는 기능성 식품으로 사용하는 것이 바람직하다.
실시예
1. 태반 분말의 제조
냉동보관된 인간 태반 200kg을 세척하고 해동 및 파쇄하여 태반 파쇄물을 얻었다.
얻어진 태반 파쇄물에 탈지 용매를 가하고 교반하여 탈지하였다. 탈지용매로는 아세톤, 알코올 또는 에스테르를 사용할 수 있다.
탈지용매는 태반 파쇄물 함량의 4배 내지 12배의 부피(v/w)로 사용하였고, 2 내지 8시간 교반하였다.
탈지는 2회로 나누어 수행하였다. 반복되는 탈지공정(제2회차 탈지공정)은 앞선 탈지공정(제1회차 탈지공정)에서 얻은 침전물에 다시 아세톤, 알코올 또는 에스테르를 투여하여 계속 교반하면서 침전물을 얻는 과정으로, 여기서 아세톤 양은 상기 앞선 탈지공정에서 사용한 양과 동일하지만, 교반 시간은 2 시간 내지 24시간으로 하였다.
이후 용매를 제거하고 건조하여 태반 파쇄물 분말을 얻었다.
2. 태반 가수분해물의 제조
상기 태반 파쇄물 분말에 산 용액을 첨가하여 산 가수분해를 수행하였다. 이때 단백질 분해효소도 함께 사용하였다.
산으로는 염산, 초산 또는 초산을 사용할 수 있고, 단백질 분해 효소로는 파파인, 펩신, 브로멜라인, 프로나제 또는 알카라제를 사용하였다.
본 단계에서 태반 분말 10 ~ 25 kg 대비 단백질 분해효소 0.5 kg ~ 3 kg을 사용하였다.
산은 0.1 ~ 10 %의 농도 범위로 사용하였고, 그 함량은 태반 분말의 건조함량 대비 0.2 ~ 20배(W/W)로 사용하였다.
뷰렛 반응을 통하여 더 이상 단백질 반응이 나타나지 않을 때까지 가수분해 시켰다. 가수분해 이후에 이온교환 과정을 거친다.
이온교환은 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하거나, 얻어진 가수분해물에 이온 교환 수지를 첨가하여 수행하였다.
음이온교환크로마토그래피를 사용하는 구체적 실시예는 하기 2개와 같으며, 이들은 각각 선택적으로 사용될 수 있다.
(1) 음이온교환 실시예 1
20mM Tris(pH7.5) 완충액으로 평형화된 Source Q (XK50/25, 500ml) 컬럼에 20mM Tris(pH7.5) 완충액 정용여과(ILDF, In-line diafiltration module)와 에탄올 처리한 태반 가수분해물을 10배 희석하여 12ml/min 유속으로 부하하여 결합시킨 후, 직선 농도구배 (염화나트륨 농도 0 M -> 1 M) 방법으로 18 컬럼 용량의 선형 농도구배를 이용하여 태반 가수분해물을 용출하였다.
(2) 음이온 교환 실시예 2
앞 단계에서 얻은 분획들을 NaOH를 이용하여 pH 5.8로 조정한 후, DEAE-세파로스 패스트 플로우(DEAE-sepharose fast flow) 칼럼 크로마토그래피를 다음과 같이 수행하였다. 즉, 상기 분획을 완충용액 2(20mM 소디움 아세테이트, pH 5.8)로 미리 평형화된 DEAE 세파로스 칼럼에 흡착시킨 후 염화나트륨 농도를 10 mM 씩 증가시키면서 차례로 용출시켜 태반 가수분해물을 용출시켰다.
(3) 음이온 교환 실시예 3
일반적으로 혼합액을 정제하는 수지의 매트릭스는 폴리스티렌 또는 폴리아크릴레이트에 DVB(Divinylbenzene)를 혼합시킨 매트릭스에 양이온교환수지인 경우 교환기(functional group)에 sulfonate(-SO3-), 음이온교환수지인 경우 교환기에 -N3(CH3)3Cl- (trimethylammonium), -N+(CH3)2C2H4OHCl- (dimethylethanolammonium), -(CH2)nN(CH3)2 (Tertiary Amine), 또는 -CH2NH(CH2CH2NH)nH(CH2)2NH2 (Secondary Amine)인 수지를 사용한다.
이후, 여과, pH 조절, 가열멸균을 수행하였다.
가수 분해물 용액의 온도를 높여 효소를 불활성화시키고 잔여물을 여과하여 제거시키는 과정이다. 이 때 온도는 70℃ 내지 100℃로 실시하였다. 이후 상기 가수 분해물 용액을 농축 및 여과하였다.
다음은 수산화나트륨과 같은 pH 조절제를 첨가하여 pH를 5.5 ~ 7.5로 조절하는 공정이다. 본 발명의 조성물을 주사제 또는 경구용으로 사용하기 위해서는 상기 pH의 범위를 갖는 것이 적합하기 때문이다. 상기 공정을 통해 얻어지는 조성물에 정제수를 가하여 농도와 액량을 조절할 수 있다. 이 과정은 열처리로 이루어지는데, 고온 고압 멸균기에 안식향산나트륨과 같은 보존제를 첨가하여 가열 멸균하는 것이 바람직하다. 보존제는 본 발명의 의약 조성물 또는 식품 조성물이 허용하는 범위에서 통상적인 것을 사용할 수 있다.
상기 멸균 과정은, 바람직하게는 100 ~ 140℃에서 20 ~ 120분간 가열 멸균시켰다.
실험예
1. 태반 가수분해물의 단백질과 펩타이드 존재 확인
TCA(Trichloroacetic acid) 침전법과 Speedvac 방법으로 태반 가수분해물 시료 중의 단백질과 펩타이드를 농축시켰다. SDS-PAGE의 염색법에 해당하는 쿠마시 염색은 감지 강도가 약 20ng 수준으로 알려져 있는데 본 발명의 태반 가수분해물 시료 중에 존재하는 미량의 단백질 또는 펩타이드를 확인하기 위해 위 두 가지 농축법을 사용하였다. 농축시킨 태반 가수분해물 시료는 단백질 분리용 Tris-glycine 젤과 펩타이드 분리용 Tris-tricine을 이용하여 각각 단백질과 펩타이드로 분리하였다.
1.1 TCA 침전
TCA 용액으로 Sigma T9159-100G를 사용하였다. TCA 침전을 통해 농축시킨 태반 가수분해물 시료 10μL를 로딩시킨 경우 특이적으로 확인되는 단백질 밴드가 Lane (2), (5), (8)에서와 같이 검출되지 않았다. 50μL와 100μL를 로딩시킨 시료에서는 분자량 5kDa ~ 35kDa까지 수직(vertical streaking) 밴드를 확인하였다(도 1 참조). 도면 중 시료 번호 30620은 본 발명의 태반 가수분해물에 해당하고, 677870 및 K018은 대조군에 해당하며 각기 생산 Lot가 다른 시료를 구분하기 위한 번호이다.
통상적인 단백질의 이동(migration) 패턴과 다른 형태의 밴드 패턴을 확인하였다. 확인한 밴드는 단백질 유무를 확인하기 위해 해당 밴드를 잘라서 In-gel digestion 과정을 거쳐 MALDI-TOF/TOF 분석을 실시하였다.
1.2 Speedvac 농축
도 2는 Speedvac system으로 농축시킨 본 발명의 태반 가수분해물 시료의 SDS-PAGE 분석 결과이다.
태반 가수분해물 시료 10μL를 로딩시켰을 때, 7 kDa 분자량을 확인하였고, 50μL 로딩 시료는 약 15 kDa, 100μL 로딩 시료는 약 20 kDa 분자량을 확인하였다(도 2 참조).
통상적으로 SDS-PAGE에서 특정 분자량의 밴드로 확인할 수 있으며, 로딩 시료의 양이 많을수록 동일 분자량에서 밴드의 두께가 증가하게 된다. 하지만 Speedvac 농축 시료는 시료의 로딩 양이 증가할수록 분자량이 증가하는 패턴으로 나타나게 되어 일반적인 SDS-PAGE와 다르다. 여기서 확인한 밴드는 단백질 유무를 확인하기 위해 해당 밴드를 잘라서 In-gel digestion 과정을 거쳐 MALDI-TOF/TOF 분석을 실시하였다.
1.3 Tris-tricine을 이용한 저분자량의 단백질과 펩타이드 확인
Speedvac system으로 농축시킨 본 발명의 태반 가수분해물 시료를 펩타이드 젤 (Tris-tricine) 분석 결과를 도 3에 해당한다.
태반 가수분해물 시료 10μL를 로딩한 레인(2)에서 0~7 kDa 분자량을 확인하였고, 50μL 로딩 레인(3)에서 0~15 kDa, 100μL 로딩 레인(4)에서 약 0~25kDa 분자량이 존재함을 확인하였다. 도 2의 SDS-PAGE와 유사한 형태이지만 낮은 분자량에서 보다 넓게 퍼지는 형태로 확인할 수 있다(도 3 참조).
본 실험에서의 펩타이드 젤 역시 통상적인 단백질의 migration 패턴과 달랐다. 여기서 확인한 밴드는 단백질 유무를 확인하기 위해 해당 밴드를 잘라서 In-gel digestion 과정을 거쳐 MALDI-TOF/TOF 분석을 실시하였다.
2. 태반 가수분해물에 존재하는 펩타이드 서열 분석
2.1 LC-MS/MS를 이용한 펩타이드 서열 분석
상기 실험예 1에서는 태반 가수분해물 내에 단백질과 펩타이드의 존재 여부만 확인하였고, 분자량 2kDa 이하의 펩타이드는 상기 방법으로 확인할 수 없다. 따라서 본 실시예에서는 LC-MS 분석을 실시하였다. LC-MS 분석을 통해 100개 이상의 펩타이드 서열의 존재를 확인하였고, MS/MS 분석을 실시하여 100개 이상의 펩타이드의 서열 정보를 확인하였다.
100개 이상의 펩타이드 분석 결과, 모두 1.5 kDa 이하의 분자량으로 존재하였고, 아미노산 5개(5mer) 이하 내지 2mer 이상의 펩타이드를 표 1로 정리하였다.
Figure pct00001
2.2 EIC 방법을 이용한 펩타이드 함량 비교
상기 실험예 2.1에서 분석한 펩타이드와 대조군 시료에서 얻은 펩타이드에 추가로 EIC ((Extracted Ion Chromatography)) 분석을 실시하였다.
태반 가수분해물 원액과 대조군 시료에서 동일한 펩타이드의 함량을 비교하였다. EIC 분석은 동일한 시료로 3회 반복 실시하여 EIC 분석법의 재현성을 먼저 확인하였으며, 각 펩타이드의 전체 함량 (total area)의 평균과 3회 반복시험에서 확인한 표준편차는 ±3% 이내로 확인하였다.
두 시료의 펩타이드 함량을 대비한 결과 본 발명의 태반 가수분해물의 전체 펩타이드 중 1% 이상 함량을 가지는 펩타이드, 0.5% ~ 1% 미만 펩타이드, 및 0.5% 미만 함량의 펩타이드를 각각 비교한 결과 대조군 대비 높은 함량을 가지는 것으로 확인하였다.
실험예 3. 미네랄의 종류 및 함량 분석
태반 가수분해물의 미네랄을 분석한 결과는 다음 표 2에 기재하였다. 미네랄 분석은 대한 약전 중 일반시험법을 참고하여 실시하였으며, 정상 성인의 혈장내 농도를 참고치로 기재하였다.
미네랄 분석 결과
30620 대조1 대조2 대조3 측정법 참고치 단위
마그네슘 1.70 0.1 0.29 0.25 Colorimetry 1.8~2.4 mg/dL
I.P (인) 3.4 2.5 2.8 0.3 UV 2.5~5.0 mg/dL
철 125 21 18 5 AAS 50~170 μg/dL
칼슘 6.8 0.2 4.2 3.4 Colorimetry 8.1~10.5 mg/dL
셀레늄 61 9 12 8 AAS 107~171 μg/L
망간 15.7 14.8 1.9 0.1 AAS 0.4~6.2 μg/L
아연 22 6 21 5 AAS 61~121 μg/dL
구리 2 1 - - AAS 70~130 μg/dL

Claims (9)

  1. 동물 태반 파쇄물을 탈지하고 건조시켜, 동물 태반 파쇄물 분말을 얻는 단계;
    상기 동물 태반 파쇄물 탈지 분말에 단백질 분해효소 산 용액을 처리하여 효소 분해하는 단계; 및
    상기 분해물을 음이온 교환 수지와 접촉시켜 이온 교환하는 단계;를 포함하는 태반 가수분해물 의 제조 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 탈지는 태반 파쇄물에 아세톤, 알코올 및 에스테르로 이루어진 군에서 선택된 유기 용매를 가하여 수행되는 것인 태반 가수분해물의 제조 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 탈지는 상기 태반 파쇄물에 아세톤, 알코올 또는 에스테르를 포함하는 유기 용매 중 어느 하나를 가하여 2시간 내지 8시간 동안 탈지시키는 단계 및 60 ~ 100℃에서 10시간 내지 24시간 건조시켜 상기 유기 용매를 제거하는 단계를 포함하여 수행되는 태반 가수분해물의 제조 방법.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 탈지 및 유기 용매의 제거는 복수회 수행되고, 1회차 대비 2회차에서 보다 장시간 탈지하는 태반 가수분해물의 제조 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 단백질 분해효소는 파파인(Papain), 펩신(pepsin), 브로멜라인(Bromelain), 프로나제(Pronase) 또는 알카라제(Alcalase)인 태반 가수분해물의 제조 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 산 용액의 산 농도는 0.1 내지 10%인 태반 가수분해물의 제조 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 효소 분해시에 태반 파쇄물 탈지 분말 10 kg 내지 25 kg 대비 단백질 분해효소 0.5 kg 내지 3 kg을 처리하는 태반 가수분해물의 제조 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 음이온 교환 수지와의 접촉은 상기 분해물에 음이온 교환 수지를 첨가하거나, 상기 분해물을 음이온 교환 수지 칼럼에 통과시켜 수행되는 태반 가수분해물의 제조 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 이온 교환된 분해물에 염기를 첨가하여 pH를 조절하는 단계를 더 포함하는 태반 가수분해물의 제조 방법.
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