KR20230026965A - 폴리 a 테일을 안정적으로 유지하는 방법 - Google Patents

폴리 a 테일을 안정적으로 유지하는 방법 Download PDF

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KR20230026965A
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최영준
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권용민
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에스케이바이오사이언스(주)
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Abstract

본 발명은 폴리 A 테일을 안정적으로 유지하는 방법에 관한 것이다.

Description

폴리 A 테일을 안정적으로 유지하는 방법{A method for retaining poly A tail stable}
본 발명은 폴리 A 테일을 안정적으로 유지하는 방법에 관한 것이다.
mRNA는 최근 의약품의 주약 성분 (API, Active Pharmaceutical Ingredient)으로 주목받고 있다. mRNA에는 폴리 A 테일(poly(A) tail)이라는 구성요소가 필요한데, 폴리 A 테일은 RNA의 안정성과 번역과정에 중요한 역할을 한다. mRNA 백신을 구성하는 mRNA의 경우 폴리 A 테일의 길이는 120개가 표준 사이즈(standard size)로 인식되고 있다 (Mol Ther Nucleic Acids. 2021 Dec 3;26:945-956). 세포내에서 전사되는 mRNA는 폴리 A 신호(PolyA signal)가 존재하며 전사과정 이후 폴리 A 테일이 더해지는 과정을 거친다. 인비트로 전사(In Vitro Transcription, IVT)에 의해 제작되는 mRNA에도 체내 안정성 및 번역 효율을 높이기 위해 폴리 A 테일이 필요하다.
폴리 A 테일을 더하는 방법은 2가지로 구분될 수 있다. 한 가지는 IVT 이후 polyA 폴리머라제(polymerase)를 사용하여 폴리 A 테일을 합성하는 방법이고 다른 한 가지는 IVT에 사용하는 주형(template)에 아데닌 반복서열을 포함시켜 IVT를 통해 폴리 A 테일이 생성되도록 하는 방법이다.
전자의 경우 폴리 A 폴리머라제(polyA polymerase)를 활용하여 mRNA에 폴리 A 테일을 합성하는 별도의 과정이 필요하며, 생성된 폴리 A 테일의 길이는 일정하지 않을 수 있다. 하지만, 후자의 경우, IVT과정 이외 별도의 과정이 필요하지 않으며, 생성되는 폴리 A 테일의 길이가 일정하게 제작될 수 있다. 그러므로, 공정의 효율성 및 폴리 A 테일 길이의 균일성 측면에서, 주형(template)에 폴리 A 테일 서열이 포함되도록 하는 것이 선호될 수 있다.
이를 위해서는 플라스미드(plasmid) DNA에 폴리 A 테일 서열을 클로닝하고 유지해야 하는데, 일반적인 방식으로 대장균을 활용하여 이러한 과정을 진행할 경우, 재조합(recombination) 및 결손(deletion)이 일어나므로 mRNA 백신에 사용하기 위한 표준 사이즈인 100개 이상의 아데닌 반복서열이 포함된 플라스미드 DNA를 확보하는 것이 어렵다.
이러한 문제를 해결하고자 아데닌 반복 서열 사이에 링커 서열을 포함시켜 안정성을 높이는 방법이 고안되었으나(RNA. 2019 Apr;25(4):507-518. doi: 10.1261/rna.069286.118. Epub 2019 Jan 15.) 아데닌 반복서열로만 이루어진 폴리 A 테일이 자연계에 존재하는 본래의 모습이므로 폴리 A 테일 사이에 링커 서열을 포함시키지 않고 플라스미드에 클로닝 및 유지하기 위한 다른 방법의 개발이 여전히 요구된다.
본 발명의 목적은 폴리 A 테일을 안정적으로 유지하는 방법에 관한 것이다.
본 발명을 구현하는 하나의 양태는 폴리 A 테일을 플라스미드에서 안정적으로 유지하는 방법이다.
하나의 구체예에서, 상기 방법은 폴리 A 테일 (poly(A) tail) 을 코딩하는 서열이 포함된 플라스미드로 형질전환된 세포주를 31 ℃ 이하의 온도 조건에서 배양하는 단계를 포함한다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 배양하는 단계는 (1) 상기 세포주를 31 ℃이하의 온도 조건으로 회복시키는 것을 포함한다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 방법은 상기 (1)의 회복 단계 이후, (2) 상기 세포주를 31 ℃이하의 온도 조건으로 고체 배지에서 배양하여 콜로니를 형성하는 것을 포함한다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 배양은 (3) 상기 (2) 의 고체 배지 배양으로 형성된 콜로니를 31 ℃ 이하의 온도 조건으로 액체 배지에서 배양하는 단계를 더 포함한다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 방법은 (1) 폴리 A 테일을 코딩하는 서열을 포함하는 플라스미드로 형질전환된 세포주를 31 ℃이하의 온도 조건으로 회복시키는 단계; (2) 회복된 세포주를 31 ℃이하의 온도 조건으로 고체배양을 통해 콜로니를 형성하는 단계; 및 (3) 31 ℃이하의 온도 조건으로 액체배양을 수행하는 단계를 포함한다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 액체 배지에서 배양하는 단계는 계대배양하는 것을 포함한다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 단계 (1) 내지 (3) 의 온도 조건은 16 ℃내지 31 ℃이다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 단계 (1) 내지 (3) 의 온도 조건은 19 ℃내지 25 ℃이다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 세포주는 대장균(E.coli)이다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 형질전환은 열충격(heat shock) 또는 전기천공(electroporation)을 이용해 폴리 A 테일을 코딩하는 서열을 포함하는 플라스미드를 세포주에 도입하는 것을 포함한다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 도입은 37 ℃내지 42℃의 온도에서 수행된다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 방법은 배양된 세포주를 보존하는 단계를 더 포함한다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 보존하는 단계는 세포주를 동결 및/또는 건조하는 것을 포함한다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 배양은 보존된 균주를 배양하여 활성화하는 단계를 포함한다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 방법은 플라스미드로 형질전환된 세포주를 37 ℃이상의 온도에서 배양하는 단계를 포함하는 방법에 비해 플라스미드 내 폴리 A 테일의 안정성이 증가한 것을 특징으로 한다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 폴리 A 테일은 20 내지 400개의 아데닌(A)을 포함한다.
본 발명을 구현하는 다른 하나의 양태는 mRNA 생산을 위한 플라스미드의 대량 생산방법이다.
하나의 구체예에서, 상기 방법은 폴리 A 테일 (poly(A) tail) 을 포함하는 mRNA를 코딩하는 서열이 포함된 플라스미드로 형질전환된 세포주를 31 ℃ 이하의 온도조건에서 배양하는 단계를 포함한다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 mRNA는 면역원성 조성물 및/또는 치료제의 일 구성성분이다.
본 발명을 구현하는 다른 하나의 양태는, 폴리 A 테일을 포함하는 mRNA의 생산방법이다.
하나의 구체예에서, 상기 방법은 폴리 A 테일 (poly(A) tail) 을 포함하는 mRNA를 코딩하는 서열이 포함된 플라스미드를 형질전환된 세포주를 31 ℃ 이하의 온도 조건으로 배양하는 단계를 포함한다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 방법은 세포주로부터 플라스미드를 회수하여 인비트로(in vitro)에서 전사를 수행하는 것을 포함한다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 mRNA는 면역원성 조성물 및/또는 치료제의 일 구성성분이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
또한, 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명의 하나의 양태는 폴리 A 테일을 플라스미드에서 안정적으로 유지하는 방법이다.
상기 방법은 폴리 A 테일 (poly(A) tail) 을 코딩하는 서열이 포함된 플라스미드로 형질전환된 세포주를 31 ℃ 이하의 온도 조건에서 배양하는 단계를 포함한다.
본 발명에서 용어 “폴리 A 테일(poly A tail)”은 전형적으로 RNA 분자의 3'말단에 위치하는 아데닐산(adenylate) 잔기들의 연속 또는 불연속 서열을 지칭한다. 폴리 A 테일은 mRNA의 3', 예를 들어 3'UTR의 뒤에 이어질 수 있다. 이러한 폴리 A 테일은 약 20개 이상, 25개 이상, 40개 이상, 60개 이상, 80개 이상, 또는 100개 이상의 아데닐(A) 뉴클레오타이드로 구성되거나 이를 포함할 수 있다.
일 구현예로, 폴리 A 테일은 20 내지 400개의 아데닌(A)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 20 내지 300개, 40 내지 200개, 50 내지 190개, 60 내지 180개, 70 내지 170개, 60 내지 160개, 70 내지 150개, 80 내지 140개의 아데닌을 포함할 수 있다. 그 예로 약 120개의 아데닌을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
일 구현예로, 폴리 A 테일의 뉴클레오티드의 개수를 기준으로 전형적으로 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%는 A 뉴클레오티드이지만, 나머지 뉴클레오티드는 A 뉴클레오티드 이외의 뉴클레오티드, 예컨대 U, T 또는 C 일 수 있다. 일 예로, 폴리 A 테일은 mRNA의 분해를 지연시키도록 하는 변형을 포함할 수 있다.
본 발명에서 폴리 A 테일을 포함하는 플라스미드는 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 목적하는 mRNA를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 일 구현예로, 상기 플라스미드는 클로닝에 활용하기 용이한 제한효소 결합부위를 포함할 수 있다.
일 구현예로, 상기 플라스미드는 형질 전환 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 포함할 수 있다. 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성과 같은 선택 가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있으며, 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다. 그러나 전술한 예시에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 플라스미드는, 플라스미드에 폴리 A 테일을 코딩하는 서열을 도입하여 플라스미드를 제조할 수 있다.
일 예로, 폴리 A 테일을 코딩하는 서열을 PCR로 증폭하고, 제한효소를 처리한 후, 제한효소가 처리된 플라스미드와 연결하여 폴리 A 테일 (poly(A) tail) 을 코딩하는 서열이 포함된 플라스미드를 준비할 수 있다. 일 예로, 상기 폴리 A 테일을 코딩하는 서열의 상단에 mRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 연결되어 있을 수 있다. 일 예로, 상기 플라스미드는 폴리 A 테일을 코딩하는 서열의 상단에 mRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 서열이 포함된, 목적하는 mRNA를 전사하기 위한 주형으로 사용 될 수 있다.
본 발명의 폴리 A 테일 (poly(A) tail) 을 코딩하는 서열이 포함된 플라스미드로 형질전환된 세포주는 폴리 A 테일을 코딩하는 서열을 포함하는 플라스미드를 세포주에 도입(introduce)하여 준비 될 수 있다.
본 발명에서 폴리 A 테일을 코딩하는 서열을 포함하는 플라스미드를 세포주에 도입하는 것은 세포주를 플라스미드로 형질전환하는 것으로도 칭해질 수 있다.
본 발명에서 플라스미드의 “도입” 혹은 “형질전환”은 세포주에 플라스미드를 전달하는 것을 의미한다. 이와 같은 도입은 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다. 플라스미드를 세포주에 도입하기 위해 세포를 DNA 분자에 투과적일 수 있도록 처리하는 과정을 거칠 수 있고, 이러한 과정을 거친 세포를 컴피턴트 세포(competent cell)라고 한다.
일 구현예로, 상기 도입은 열충격(heat shock) 또는 전기천공법(electroporation)을 이용한 것일 수 있다.
열충격을 이용한 플라스미드 전달은 DNA와 세포를 혼합하고 순간적으로 열을 가하여 수행된다. 일 예로 상기 열충격에 의한 도입은 약 37 ℃ 이상의 온도조건에서 수행될 수 있고, 구체적으로는 약 37℃ 내지 42℃의 온도조건에서 수행될 수 있다. 열충격을 가하기 이전 및/또는 이후 얼음에서 세포를 식히는 단계가 포함될 수 있다.
전기천공법은 전기를 이용하여 플라스미드를 전달하는 방법으로, 짧고 높은 전압의 전기 펄스 자극을 인가하여 세포막 막전위에 변화를 주면, 나노미터 크기의 작은 기공이 세포막의 표면에 생성되어 DNA 투과율이 높아지게 된다. 일 예로 상기 전기천공에 의한 도입은 약 37 ℃ 이상의 온도조건에서 수행될 수 있고, 구체적으로는 약 37℃ 내지 42℃의 온도조건에서 수행될 수 있다. 전기 자극을 가하기 이전 및/또는 이후로 얼음에서 세포를 식히는 단계가 포함 될 수 있다.
다른 예로, CaCl2침전법, CaCl2방법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등을 사용할 수 있다. 그러나 이에 제한되는 것은 아니다.
mRNA 백신 등 치료 목적의 mRNA의 경우, mRNA의 안정성 및 번역 효율성을 위해 폴리 A 테일이 안정적으로 필요하며, 본 출원인은 새롭게 상기 플라스미드에 존재하는 폴리 A 테일을 코딩하는 서열이 소실되지 않고 안정적으로 클로닝 및 대량 생산, 유지할 수 있는 방법으로 클로닝된 대장균의 배양 방법을 제공한다.
본 발명에서 폴리 A 테일을 코딩하는 서열을 포함하는 플라스미드가 도입된 세포주를 31 ℃ 이하의 온도 조건에서 배양하는 단계는, 다음 단계 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다:
(i) 세포주를 회복(recovery)하는 단계,
(ii) 세포주를 고체 배지에서 배양하는 단계, 및
(iii) 세포주를 액체 배지에서 배양하는 단계.
상기 (i) 세포주를 회복(recovery)하는 단계는 형질전환 후 컴피턴트(competent) 상태에 있던 세포주를 배지에서 배양하여 생리학적 기능을 회복하도록 하는 단계이다. 일 예로 회복 단계의 배지는 비선택 배지일 수 있다.
일 예로, 상기 회복 단계에서의 배양 온도는 약 31 ℃ 이하, 예를 들어 약 16 ℃내지 31 ℃, 약 16 ℃내지 30 ℃, 약 16 ℃내지 29 ℃, 약 16 ℃내지 28 ℃, 약 16 ℃내지 27 ℃, 약 16 ℃내지 26 ℃, 약 16 ℃내지 25 ℃, 약 17 ℃ 내지 25℃, 약 18 ℃ 내지 25℃, 또는 약 19 ℃ 내지 25℃ 일 수 있다.
일 예로, 상기 회복 단계에서의 배양 시간은 약 5 분 내지 2 시간 일 수 있다.
상기 (ii) 세포주를 고체 배지에서 배양하는 단계를 통해 형질전환된 세포주를 배양하여 콜로니를 형성할 수 있다.
“콜로니”는 목적하는 플라스미드가 도입된 세포주의 군집을 의미한다.
“고체 배지”는 “고형 배지”로도 지칭할 수 있다. 고체 배지 배양에서 균주의 생육 여부와 플라스미드의 도입 여부를 확인할 수 있으며, 플라스미드의 도입 여부를 확인하기 위해 선택배지(selective medium)를 사용할 수 있다. 일 예로, 선택배지에는 항생제가 포함될 수 있다.
일 예로, 상기 고체 배지에서 배양하는 단계의 온도는 약 31 ℃ 이하, 예를 들어 약 16 ℃내지 31 ℃, 약 16 ℃내지 30 ℃, 약 16 ℃내지 29 ℃, 약 16 ℃내지 28 ℃, 약 16 ℃내지 27 ℃, 약 16 ℃내지 26 ℃, 약 16 ℃내지 25 ℃, 약 17 ℃ 내지 25℃, 약 18 ℃ 내지 25℃, 또는 약 19 ℃ 내지 25℃ 일 수 있다.
상기 (iii) 세포주를 액체 배지에서 배양하는 단계를 통해 세포주의 대량 배양이 가능하다. 상기 액체 배지에서 배양하는 단계는 상기 (ii)의 고체 배지 배양 단계에서 수득한 단일 콜로니를 배양하는 것일 수 있다.
일 예로, 상기 액체 배지에서 배양하는 단계의 온도는 약 31 ℃ 이하, 예를 들어 약 16 ℃내지 31 ℃, 약 16 ℃내지 30 ℃, 약 16 ℃내지 29 ℃, 약 16 ℃내지 28 ℃, 약 16 ℃내지 27 ℃, 약 16 ℃내지 26 ℃, 또는 약 16 ℃내지 25 ℃, 약 17 ℃ 내지 25℃, 약 18 ℃ 내지 25℃, 또는 약 19 ℃ 내지 25℃ 일 수 있다.
일 예로, 상기 액체 배지에서 배양하는 단계는 계대배양하는 단계를 포함할 수 있다. 계대배양(subculture) 이란 원래 배양에서 일부 세포를 새로운 배지로 이식하여 새롭게 배양하는 것을 의미한다. 계대배양을 통해 세포의 밀도를 적절하게 조절할 수 있다. 일 예로, 상기 계대배양은 2회 또는 3회, 또는 그 이상 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 당업자가 적절히 조절할 수 있다.
본 발명의 방법은 상기 배양된 세포주를 보존하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 보존하는 단계는 세포주를 동결 및/또는 건조하는 것을 포함한다. 동결보존제는 예를 들어 글리세롤(glycerol) 또는 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide)와 같이 당업계에 공지된 물질을 사용할 수 있다.
전술한 구체예 중 어느 하나의 구체예로, 상기 배양은 보존된 균주를 배양하여 활성화하는 단계를 포함한다. 보존된 균주는 동결되거나, 건조된 상태일 수 있다. 상기 활성화하는 단계에서의 배양은 고체배양 또는 액체배양일 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면 배양된 세포주를 보존하고 활성화하는 단계에 있어서 플라스미드 내 폴리 A 테일이 안정적으로 유지될 수 있다.
본 발명의 배양 단계에서 사용되는 배지는 세포주를 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 포함할 수 있다. 예를 들어 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지가 사용될 수 있다. 또한, 배양 단계에서 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다.
본 발명의 세포주는 특별히 제한되는 것은 아니지만, 대장균(E.coli)일 수 있다. 대장균은 DNA의 대량 생산이나 클로닝에 널리 사용되는 숙주 세포로, 본 발명의 세포주는 야생형 대장균뿐만 아니라 클로닝에 유리한 특성을 갖도록 조작한 변이형 대장균 역시 포함할 수 있다. 그 예로 RecA를 결실시킨 균주를 사용할 수 있다. 그러나 이에 제한되는 것은 아니다.
플라스미드에 포함된 폴리 A 테일은 세포주 내에서 재조합(recombination) 또는 결실(deletion) 등으로 인해 길이가 짧아질 수 있다. 그러나 본 발명의 방법을 통해 세포를 배양할 경우, 플라스미드에 포함된 폴리 A 테일의 길이를 안정적으로 유지할 수 있다.
일 예로, 상기 방법은 플라스미드가 도입된 세포주를 37 ℃이상의 온도에서 배양하는 단계를 포함하는 방법에 비해, 플라스미드 내 폴리 A 테일의 안정성이 증가한 것을 특징으로 한다. 상기 배양은 (i) 세포주를 회복(recovery)하는 단계, (ii) 세포주를 고체 배지에서 배양하는 단계, 및 (iii) 세포주를 액체 배지에서 배양하는 단계 중 1 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 mRNA 생산을 위한 플라스미드의 대량 생산방법이다.
상기 방법은 폴리 A 테일 (poly(A) tail) 을 포함하는 mRNA를 코딩하는 서열이 포함된 플라스미드로 형질전환된 세포주를 31 ℃ 이하의 온도조건에서 배양하는 단계를 포함한다.
폴리 A 테일 (poly(A) tail), 플라스미드, 세포주, 배양 및 온도 조건에 대해서는 전술한 바와 같다.
일 예로, 생산된 플라스미드는 인비트로(in vitro)에서 mRNA를 합성하기 위한 주형으로 사용 될 수 있다. 일 예로 상기 방법은 플라스미드를 세포로부터 회수하는 단계를 더 포함할 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 상기 플라스미드를 주형으로 합성된, 폴리 A 테일을 포함하는 mRNA는 면역원성 조성물의 일 구성성분으로 사용될 수 있다.
일 예로, 상기 플라스미드를 주형으로 합성된, 폴리 A 테일을 포함하는 mRNA는 치료제의 일 구성성분으로 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 mRNA 생산방법이다.
상기 방법은 폴리 A 테일 (poly(A) tail) 을 포함하는 mRNA를 코딩하는 서열이 포함된 플라스미드를 형질전환된 세포주를 31 ℃ 이하의 온도 조건으로 배양하는 단계; 및 상기 세포주의 플라스미드를 주형으로 전사(transcription)를 수행하는 단계를 포함한다.
상기 폴리 (A) 테일 및 이를 포함하는 mRNA, 플라스미드, 세포주, 배양 및 온도 조건에 대해서는 전술한 바와 같다.
일 예로, 상기 배양 단계 이후 플라스미드는 세포주로부터 회수 될 수 있다.
일 예로, 상기 전사 단계는 인비트로(in vitro)에서 수행될 수 있다.
일 예로, 상기 생산 방법은 생산된 mRNA를 제제화 하는 단계를 더 포함할 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 있다. 그 예로, 상기 제조방법은 mRNA를 지질 나노입자에 포함된 형태로 제조하는 단계를 포함할 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 상기 생산된 폴리 A 테일을 포함하는 mRNA는 면역원성 조성물의 일 구성성분으로 사용될 수 있다.
일 예로, 상기 생산된 폴리 A 테일을 포함하는 mRNA는 치료제의 일 구성성분으로 사용될 수 있다.
본 발명의 방법을 통해 폴리 A 테일을 용이하게 클로닝 할 수 있고, 폴리 A 서열이 안정적으로 유지될 수 있다.
도 1은 섭씨 37도 조건에서 DH5alpha를 이용한 poly(A) 서열 클로닝시 콜로니 PCR결과를 확인한 것이다.
도 2는 섭씨 37도 조건에서 Stbl3를 이용한 poly(A) 서열 클로닝시 콜로니 PCR결과를 확인한 것이다.
도 3은 저온 조건에서 poly(A) 서열 클로닝시 콜로니 PCR결과를 확인한 것이다.
도 4는 폴리 A 테일 (poly(A) tail) 을 코딩하는 서열이 포함된 플라스미드로 형질전환된 세포주를 다양한 온도조건에서 배양할 경우 A124±1 비율을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 준비된 스탁을 13, 16, 19, 22, 25도 조건에서 200rpm으로 48시간동안 배양하면서 정해진 시간에 OD600을 측정한 온도별 배양곡선 결과를 나타내는 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
비교예 1. 일반 균주를 이용한 통상조건의 클로닝
Poly(A) 서열이 삽입된 Plasmid DNA를 확보하기 위해 통상적으로 사용하는 DH5alpha 균주와 방법을 이용하였다.
Poly(A) 절편 및 접합체 준비
Plasmid에 삽입할 Poly(A) 절편을 준비하기 위해 서열번호 1과 서열번호 2의 서열로 이루어진 DNA oligo (코스모진텍 주문제작)를 1:1 molar ratio로 혼합하고 95도에서 분당 -1도씩 온도를 낮추어 annealing시키고, Klenow large fragment (NEB)로 gap부위를 채워서 double strand polyA DNA 절편을 제작하였다. 이후 제한효소 SacII와 HindIII (NEB)로 절단 후 T4 DNA ligase를 활용하여 동일한 제한효소로 절단된 plasmid (pSKBS01, 서열번호 3)에 삽입시켜 접합체를 준비하였다.
형질전환 (DH5alpha)
준비된 접합체를 대장균 DH5alpha (Enzynomics, CP010)에 형질전환하였다. 얼음에서 형질전환용 대장균에 접합체를 넣고 30분동안 정치 후 섭씨 42도에서 30초간 열 충격을 주었다. 이후 2분간 얼음에서 식힌 후 SOC배지를 첨가하고 섭씨 37도에서 1시간 동안 회복시킨 후 항생제 선택 고형배지에 대장균을 도말하였다. 대장균이 도말된 배지는 섭씨 37도에서 배양하여 콜로니가 생성되도록 하였다.
Poly(A) 서열 삽입 확인
형질전환 후 선택배지에 형성된 콜로니는 콜로니 PCR을 통해 poly(A) 절편의 삽입 가능성 여부를 파악하고 난 후, 절편의 삽입가능성이 확인된 콜로니에서 plasmid를 분리한 후 염기서열 분석을 통해 삽입된 서열을 확인하였다.
콜로니 PCR은 M13-Foward와 M13-Reverse 프라이머 (서열번호 4,5)를 사용하였고, poly(A)가 삽입되었을 경우 550bp의 크기의 PCR product가 생성되며, 삽입되지 않은 plasmid의 경우 446 bp의 크기가 생성되도록 하였다. 40개 콜로니에 대해 PCR을 진행하고 agarose젤에서 PCR product를 확인하였다. 콜로니 PCR결과, 19개는 명확히 446 bp를 보여 poly(A) 가 삽입되지 않은 것을 알 수 있었다. 나머지 21개는 multiband의 양상을 보이지만, 550 bp 크기의 PCR product가 포함되어 보였다 (도 1). 절편 삽입가능성이 확인된 이들 21개는 섭씨 37도에서 액체 배양 후 plasmid를 분리하여 sanger sequencing을 이용해 염기서열분석을 진행하였다.
하지만, 염기서열을 분석한 모든 콜로니에서 poly(A) 서열이 삽입되지 않았음을 확인하였다.
이는 통상 조건의 클로닝 시에는 폴리 A 테일이 모두 소실되는 것을 뒷받침하는 결과이다.
비교예 2. 불안정한 절편 클로닝에 특화된 균주를 이용한 클로닝
poly(A) 서열이 삽입된 plasmid DNA를 확보하기 위해서, 반복서열을 포함한 불안정한 절편 클로닝에 특화된 균주 중 하나인 Stbl3 균주를 사용하였다. 형질전환 시 배양온도는 앞선 비교예1과 동일하게 섭씨 37도로 진행하였다.
형질전환 (Stbl3)
비교예1에서 준비한 접합체를 대장균 Stbl3 (Invitrogen, C737303)에 형질전환하였다. 얼음에서 형질전환용 대장균에 접합체를 넣고 30분동안 정치 후 섭씨 42도에서 42초간 열충격을 주었다. 이후 2분간 얼음에서 식힌 후 SOC배지를 첨가하고 섭씨 37도에서 1시간동안 회복시킨 후 항생제 선택 고형배지에 대장균을 도말하였다. 대장균이 도말된 배지는 섭씨 37도에서 배양하여 콜로니가 생성되도록 하였다.
Poly(A) 서열 삽입 확인
비교예1과 동일한 방법으로 콜로니 PCR을 진행하였다. 25개 콜로니에 대해 PCR을 진행하고 agarose젤에서 PCR product를 확인하였다. 17개는 명확히 446 bp를 보여 poly(A) 가 삽입되지 않을 것을 알 수 있었다. 나머지 8개는 multiband의 양상을 보이지만, 550 bp 크기의 PCR product가 포함되어 보였다 (도 2). 절편 삽입가능성이 확인된 이들 8개는 섭씨 37도에서 액체 배양 후 plasmid를 분리하여 sanger sequencing을 이용해 염기서열분석을 진행하였다.
하지만, 염기서열을 분석한 모든 콜로니에서 poly(A) 서열이 삽입되지 않았음을 확인하였다.
이는 불안정한 절편을 안정적으로 클로닝할 수 있는 특수 균주 역시 폴리 A 테일을 모두 소실시키는 것으로, 안정적인 mRNA 백신을 제조하기에는 불안정함을 뒷받침하는 결과이다.
실시예 1. 저온조건을 이용한 클로닝
상기 비교예로부터, poly(A) 서열을 대장균에 도입한 후 섭씨 37도에서 배양하는 통상적인 방법으로는 poly(A) 서열이 제대로 삽입되거나 안정적으로 유지되지 않는 문제가 있음을 확인하였다.
이에 안정적인 폴리 A 테일 유지를 위한 방법을 새롭게 정립하였다. 이를 위해, 형질전환시 대장균 배양온도를 통상의 섭씨 37보다 낮게 적용하였다.
형질전환 (DH5alpha, Stbl3)
비교예1에서 준비한 접합체를 대장균 DH5alpha (Enzynomics, CP010)와 Stbl3 (Invitrogen, C737303)에 각각 형질전환하였다. 대장균 배양 온도를 제외한 다른 조건은 비교예 1, 2에 언급한 조건과 동일하게 진행하였다. 대장균에 열 충격 후 섭씨 25도에서 회복시켰으며, 항생제 선택 고형배지에 대장균을 도말한 후 섭씨 25도에서 배양하여 콜로니가 생성되도록 하였다.
Poly(A) 서열 삽입 확인
비교예 1과 동일한 방법으로 콜로니 PCR을 진행하였다. 각 균주당 10개 콜로니에 대해 PCR를 진행하고 agarose젤에서 PCR product를 확인하였다.
DH5alpha 에서는 5개, Stbl3에서는 7개가 명확히 446 bp를 보여 poly(A) 가 삽입되지 않은 것을 알 수 있었고, 나머지 콜로니에서는 비교예1, 2에서 와는 달리 multiband의 양상이 아닌 명확한 550 bp 크기의 PCR product가 관찰되었다 (도 3). 절편 삽입가능성이 확인된 이들 콜로니는 섭씨 25도에서 액체 배양 후 plasmid를 분리하여 sanger sequencing을 이용해 염기서열분석을 진행하였다.
실험 결과, 염기서열을 분석한 모든 콜로니에서 poly(A) 서열이 삽입되었음을 확인하였다.
이를 통해, 일반균주 및 불안정한 절편 클로닝에 특화된 균주 모두에서 poly(A) tail을 안정적으로 클로닝하기 위해서는 섭씨 37도보다 낮은 저온 조건이 유리함을 확인하였다.
실시예 2. 온도조건 탐색: 일반 균주를 이용한 형질전환 및 서열확인
poly(A) tail을 안정하게 유지할 수 있는 온도범위를 탐색하기 위해, 다양한 온도 조건에서 poly(A) tail을 포함하는 plasmid DNA를 형질전환 및 액체 배양을 진행하고, 이들의 염기서열을 분석하여 poly(A) tail이 유지됨을 확인하였다.
형질전환 (DH5alpha)
앞서 기술한 방식(비교예 1)을 이용하여 poly(A) tail의 길이가 124개인 plasmid DNA를 제작하였고, plasmid DNA를 대장균 DH5alpha (Enzynomics, CP010)에 형질전환 하였다. 대장균에 plasmid DNA를 넣고 얼음에서 30분동안 정치 후 섭씨 42도에서 40초간 열충격을 주었다. 이후 얼음에서 2분간 식힌 후 SOC 배지를 첨가하고 섭씨 37도, 34도, 32도, 31도, 28도, 25도, 22도, 19도에서 각각 1시간 동안 배양하여 회복시킨 후 항생제 선택 고형배지에 대장균을 도말하였다. 대장균이 도말된 배지는 대장균을 회복시킨 온도와 동일한 온도에서 배양하여 콜로니가 생성되도록 하였다.
Poly(A) 서열의 길이 확인
염기서열 분석을 위한 plasmid를 분리하기 위해서 고형배지에 생성된 콜로니를 24개 또는 25개씩 선택하여, 고형배지를 배양한 온도와 동일한 온도에서 액체 배양하였다. 액체 배양 후 plasmid를 분리하여 poly(A) 서열의 길이 및 염기서열을 sanger sequencing을 이용해 분석하였다. 염기서열 분석에는 Atail-seq-R (서열번호 6) 프라이머를 사용하였다.
염기서열분석 결과 섭씨 37도에서는 poly(A) 서열이 유지되지 않았으나, 섭씨 31도 이하에서 배양 시 poly(A) 길이의 안정성이 크게 증가되는 것을 확인하였다. 이로써 poly(A) 서열의 안정성은 대장균 배양 온도가 낮아짐에 따라 증가함을 확인하였다.
sanger sequencing을 이용한 염기서열 분석에서 한가지 서열이 길게 반복된 주형을 분석할 때 polymerase의 미끄러짐 현상으로 인해 분석 결과에서 뉴클레오타이드 한 개가 빠지거나 더해져서 분석될 수 있다(https://www.nucleics.com/DNA_sequencing_support/DNA-sequencing-AT-slippage.html). 그러므로, 삽입한 poly (A) 서열의 길이에서 오차범위 1개 이내인 A124±1 비율을 지표로 하였다. 그 결과를 표 1과 도 4에 나타내었다.
DH5alpha에서 온도별 형질전환 후 poly(A) 서열의 길이
　콜로니# 형질전환 및 배양온도
19℃ 22℃ 25℃ 28℃ 31℃ 32℃ 34℃ 37℃
1 n/a 123 121 26 123 19 19 19
2 124 92 124 123 15 17 19 n/a
3 122 122 117 15 121 17 19 15
4 19 102 124 n/a 123 19 19 19
5 122 124 122 122 19 9 9 19
6 123 124 122 124 121 15 n/a 15
7 n/a 124 57 19 122 16 17 24
8 n/a 124 122 121 15 19 15 15
9 19 120 124 122 123 17 n/a 15
10 124 122 125 123 19 15 19 15
11 124 124 123 123 123 n/a 15 19
12 123 124 124 121 112 19 19 18
13 122 90 123 121 19 121 122 17
14 n/a 119 106 19 123 15 19 20
15 124 123 124 15 15 n/a 19 20
16 123 123 19 122 122 n/a 19 18
17 122 35 108 122 19 19 n/a 19
18 125 122 66 19 19 n/a n/a 17
19 123 123 44 19 123 19 19 17
20 123 15 17 15 120 27 15 18
21 123 19 120 122 121 n/a n/a 13
22 n/a 15 124 119 122 n/a n/a 36
23 121 123 124 123 19 19 15 17
24 15 n/a 122 122 19 n/a n/a 16
25 19 15 n/a 　 n/a 106 n/a 　 19 n/a 　
A124±1 비율 55.0% 45.8% 41.7% 21.7% 24.0% 0.0% 0.0% 0.0%
* n/a: sanger sequencing결과 mixed peak으로 분석에서 제외
상기 표 1 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 폴리 A 테일 (poly(A) tail) 을 코딩하는 서열이 포함된 플라스미드로 형질전환된 세포주를 31 ℃ 이하의 온도 조건에서 배양할 경우 A124±1 비율이 21.7 내지 55.0%로 나타나 플라스미드에서 폴리 A 테일이 안정적으로 유지됨을 알 수 있다. 다만, 16℃ 미만의 온도조건에서는 대장균의 생장이 거의 일어나지 않기 때문에(비특허문헌 1, Acta Alimentaria 50 (2021) 2, 180-188), 16℃ 미만 온도조건은 대량의 백신제품 생산공정에 적용할 수 없다. 16℃ 미만 온도조건이 공정적용에 적절하지 않음은 후술하는 실시예 5에서도 재차 확인할 수 있다.
실시예 3. 계대배양시 안정성: 불안정한 절편 유지에 특화된 균주를 이용한 형질전환 및 계대배양
저온조건에서 연속된 계대배양시 poly(A) 서열이 온전히 유지될 수 있는지 확인해 보기 위해서, 불안정한 절편 유지에 특화된 균주 중 하나인 NEB stable 균주를 이용하여 섭씨 37도와 섭씨 25도에서 형질전환 및 계대배양을 진행하였다.
형질전환 (NEB stable)
실시예 2에서 사용한 plasmid DNA를 대장균 NEB stable (NEB, C3040H)에 형질전환 하였다. 얼음에서 형질전환용 대장균에 plasmid DNA를 넣고 30분동안 정치 후 섭씨 42도에서 40초간 열 충격을 주었다. 이후 5분간 얼음에서 식힌 후 NEB 10-beta/Stable Outgrowth 배지를 첨가하고 섭씨 37도 혹은 25도에서 1시간 동안 회복시킨 후 항생제 선택 고형 배지에 대장균을 도말하였다. 대장균이 도말된 배지는 대장균을 회복시킨 온도와 동일한 온도에서 배양하여 콜로니가 생성되도록 하였다.
형질전환 후 poly(A) 서열의 길이 확인
각각의 온도에서 형질전환 후 생성된 콜로니 중 25개를 선택하여 고체 배양한 온도와 동일한 온도에서 액체 배양하였다. plasmid를 분리하여 Sanger sequencing 이용하여 poly(A) 서열의 길이를 분석하였다. 염기서열 분석에는 3UTR-Xba1-F (서열번호 7) 프라이머를 사용하였다. 앞서 실시예 2에서 통상적으로 사용하는 DH5alpha에서 얻은 결과에 비해 섭씨 37도에서 형질전환시 poly(A) 서열의 길이가 120개 이상 유지된 콜로니 비율이 비교적 높은 것을 확인할 수 있었다. 불안정한 절편 유지에 특화된 균주를 사용하여 이러한 결과가 나온 것으로 생각할 수 있다.
하지만, A124±1 비율을 통해 확인할 수 있는 바와 같이, 형질전환에 사용한 plasmid가 본래 가지고 있던 poly(A) 124개에 근접하여 유지된 콜로니는 섭씨 25도에 비해 섭씨 37도에서는 현저히 낮으므로, 균주와 무관하게 poly(A) 서열의 길이 유지에 저온이 유리함을 다시 한번 확인할 수 있었다.
NEB stable에서 형질전환시 온도에 따른 poly(A) 서열의 길이 변화
콜로니# 배양온도
섭씨 25도 섭씨 37도
1 62 120
2 123 121
3 125 122
4 122 122
5 123 122
6 124 125
7 124 122
8 124 120
9 122 19
10 125 118
11 124 121
12 15 120
13 74 53
14 123 120
15 124 122
16 124 120
17 124 122
18 124 15
19 123 15
20 124 121
21 54 45
22 124 122
23 123 120
24 124 120
25 124 122
A124±1 비율 76.00% 4.00%
계대배양
앞서 형질전환 후 염기서열 분석을 통해 poly(A) 서열의 길이가 확인된 콜로니 중 섭씨 37도에서 6개, 섭씨 25도에서는 9개를 선택하였다. 선택된 콜로니의 배양액을 새로운 액체 배지에 1/1000의 부피로 접종한 후 동일한 온도에서 계대배양을 진행하였다. 섭씨 37도에서는 2회 계대배양을 섭씨 25도에서는 3회 계대배양을 거쳤다.
계대배양에 따른 poly(A) 서열의 길이 확인
계대배양 진행 중 일부의 배양액에서 plasmid를 분리하여 Sanger sequencing 이용하여 poly(A) 서열의 길이를 분석하였다. 염기서열 분석에는 3UTR-Xba1-F (서열번호 7) 프라이머를 사용하였다.
섭씨 37도에서 계대배양 진행 결과 대부분의 콜로니에서 poly(A) 서열의 길이가 유지되지 않는 것을 확인하였다 (표 3). 반면 섭씨 25도에서 계대배양을 진행하였을 때에는 모든 콜로니의 poly(A) 서열의 길이가 유지됨을 확인하였다(표 4).
섭씨 37도 계대배양시 poly(A) 서열의 길이 유지 결과
콜로니# 배양온도 37도 1차 배양액의 A 길이
±1 유지
1차 2차 3차
3 122 16 16 X
5 122 60 60 X
6 125 70 n/a X
7 122 124 122 O
15 122 60 62 X
22 122 123 122 O
섭씨 25도 계대배양시 poly(A) 서열의 길이 유지 결과
콜로니# 배양온도25도 1차 배양액의 A 길이
±1 유지
1차 2차 3차 4차
3 125 125 125 125 O
5 123 123 122 122 O
7 124 124 124 124 O
9 122 122 122 121 O
11 124 124 124 124 O
15 124 124 123 123 O
17 124 124 124 123 O
19 123 123 123 123 O
23 123 123 123 123 O
이를 통해 계대배양 시 31℃ 이하의 온도에서 배양하는 것이 플라스미드의 poly(A) 서열 유지에 적합한 조건임을 확인하였다.
실시예 4. 세포주 스탁 제조 후 안정성 확인
형질전환을 통해 제작한 세포주의 보관 용이성을 확인해 보기 위해, 앞서 실시예 3에서 25도 조건으로 A길이가 124개로 확인된 형질전환된 세포주를 글리세롤　스탁 (glycerol stock) 형태로 만들어 -70℃ 냉동고에 보관하였다. 냉동 상태로 보관된 스탁을 꺼내어 서로 다른 시험관에서 16도, 25도, 30도 조건에서 액체배양 후 각각의 plasmid를 분리하여 서열분석을 진행하였다. 배양된 대장균에서 분리한 plasmid에서 분석된 A 길이는 모두 124개로 스탁 제조 후 배양시 A 길이가 온전히 유지되는 것을 확인하였다.
스탁배양# 배양온도별 A 길이
16도 25도 30도
1 124 124 124
2 124 124 124
3 124 124 124
4 124 124 124
5 124 124 124
6 124 124 124
실시예 5. 온도별 배양곡선 확인
16도 미만 조건에서의 배양은 공정적용에 적절하지 않음을 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
실시예 2와 3에서 25도 조건으로 A길이가 124개로 확인된 형질전환된 세포주 DH5alpha와 NEB stable을 각각 글리세롤　스탁 (glycerol stock) 형태로 만들어 -70℃ 냉동고에 보관하였다. 온도별 배양곡선을 확인하기 위해서 스탁을 꺼내어 13, 16, 19, 22, 25도 조건에서 200rpm으로 48시간동안 배양하면서 정해진 시간에 OD600을 측정하였다. 실험결과 16도 미만인 13도에서는 세포의 성장이 거의 없는 것을 확인하였다 (도 5).
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
[서열목록]
서열번호 1
ATTTTCATTGCCCGCGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGTCTTCGATATCAAGCTTGGC
서열번호 2
GCCAAGCTTGATATCGAAGACTTT
서열번호 3 (pSKBS01)
TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCTAATACGACTCACTATAGGGAGAACTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAAGCCACCGGATCCTCTAGAAGCTCGCTTGTCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCATCGATAGCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCCCGCGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGTCTTCGATATCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTC
서열번호 4 (M13-Forward)
GTAAAACGACGGCCAGT
서열번호 5 (M13-Reverse)
CAGGAAACAGCTATGAC
서열번호 6 (Atail-seq-R)
TGGATAACCGTATTACCGCC
서열번호 7 (3UTR-Xba1-F)
TCCTCTAGAAGCTCGCTTGTCAATTTCTA

Claims (14)

  1. 폴리 A 테일 (poly(A) tail) 을 코딩하는 서열이 포함된 플라스미드로 형질전환된 세포주를 31 ℃ 이하의 온도 조건에서 배양하는 단계를 포함하는,
    폴리 A 테일을 플라스미드에서 안정적으로 유지하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 배양하는 단계는 (1) 상기 세포주를 31 ℃ 이하의 온도 조건으로 회복시키는 것을 포함하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 (1)의 회복 단계 이후 (2) 상기 세포주를 31 ℃ 이하의 온도 조건으로 고체 배지에서 배양하여 콜로니를 형성하는 것을 포함하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 배양은 (3) 상기 (2) 의 고체 배지 배양으로 형성된 콜로니를 31 ℃ 이하의 온도 조건으로 액체 배지에서 배양하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 액체 배지에서 배양하는 단계는 계대배양하는 것을 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 온도 조건은 16 ℃내지 31 ℃인, 방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 온도 조건은 19 ℃내지 25 ℃인, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 세포주는 대장균(E. coli)인, 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 형질전환은 열충격(heat shock) 또는 전기천공(electroporation)을 이용해 폴리 A 테일을 코딩하는 서열을 포함하는 플라스미드를 세포주에 도입하는 것을 포함하는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 도입은 37 ℃ 내지 42 ℃의 온도에서 수행되는, 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 방법은 폴리 A 테일 (poly(A) tail) 을 코딩하는 서열이 포함된 플라스미드로 형질전환된 세포주를 37 ℃ 이상의 온도 조건에서 배양하는 단계를 포함하는 방법에 비해 플라스미드 내 폴리 A 테일의 안정성이 증가한 것인, 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 폴리 A 테일은 20 내지 400개의 아데닌(A)을 포함하는, 방법.
  13. 폴리 A 테일 (poly(A) tail) 을 포함하는 mRNA를 코딩하는 서열이 포함된 플라스미드로 형질전환된 세포주를 31 ℃ 이하 온도조건에서 배양하는 단계를 포함하는,
    mRNA 생산을 위한 플라스미드의 대량 생산방법.
  14. 폴리 A 테일 (poly(A) tail) 을 포함하는 mRNA를 코딩하는 서열이 포함된 플라스미드로 형질전환된 세포주를 31 ℃ 이하의 온도 조건으로 배양하는 단계; 및
    상기 세포주의 플라스미드를 주형으로 전사(transcription)를 수행하는 단계를 포함하는,
    폴리 A 테일을 포함하는 mRNA의 생산방법.
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