CN117836418A - 稳定保持聚a尾的方法 - Google Patents
稳定保持聚a尾的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117836418A CN117836418A CN202280056262.2A CN202280056262A CN117836418A CN 117836418 A CN117836418 A CN 117836418A CN 202280056262 A CN202280056262 A CN 202280056262A CN 117836418 A CN117836418 A CN 117836418A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- poly
- tail
- plasmid
- culturing
- temperature
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 80
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 claims abstract description 72
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 92
- 108091036407 Polyadenylation Proteins 0.000 claims description 59
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 50
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 36
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 22
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 11
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 10
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 10
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 claims description 9
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 230000035939 shock Effects 0.000 claims description 9
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 claims description 5
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 71
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 39
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 31
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 11
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 11
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 8
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 7
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 7
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 108700021021 mRNA Vaccine Proteins 0.000 description 4
- 229940126582 mRNA vaccine Drugs 0.000 description 4
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 4
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 3
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710124239 Poly(A) polymerase Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 208000002720 Malnutrition Diseases 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical group C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 150000002314 glycerols Chemical class 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000001071 malnutrition Effects 0.000 description 1
- 235000000824 malnutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 208000015380 nutritional deficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007500 overflow downdraw method Methods 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N silicon carbide Chemical compound [Si+]#[C-] HBMJWWWQQXIZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910010271 silicon carbide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000013337 sub-cultivation Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/68—Stabilisation of the vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/69—Increasing the copy number of the vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/50—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating RNA stability, not being an intron, e.g. poly A signal
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种稳定保持聚(A)尾的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种稳定保持聚(A)尾(poly(A)tail)的方法。
背景技术
最近,mRNA作为活性药物成分(API)吸引了人们的注意。mRNA需要一种称为聚(A)尾的成分,其在RNA的稳定性和翻译过程中起着重要作用。在mRNA构成mRNA疫苗的情况下,聚(A)尾的长度被认为具有120的标准大小(Mol Ther Nucleic Acids.2021年12月3日;26:945-956)。在细胞内转录的mRNA具有聚(A)信号,并在转录过程之后进行聚(A)的添加过程。体外转录(IVT)产生的mRNA也需要聚(A)尾,以提高体内稳定性和翻译效率。
有两种方法可以添加聚(A)尾。一种方法是在IVT后使用聚(A)聚合酶合成聚(A),另一种方法则是在用于IVT的模板中包含腺嘌呤重复序列,从而通过IVT生成聚(A)。
在前一种情况下,需要单独的过程,以便使用聚(A)聚合酶在mRNA中合成聚(A),并且生成的聚(A)尾长度可能不恒定。然而,在后一种情况下,不需要除IVT过程之外的单独过程,并且生成的聚(A)尾的长度可以是恒定的。因此,就聚(A)尾长度的过程效率和均匀性而言,可能更倾向于在模板中包含聚(A)。
为了实现这一点,有必要克隆和维持质粒DNA中的聚(A)尾序列,但当以一般方式使用大肠杆菌进行该过程时,会发生重组和删除,并且很难获得含有100个或更多腺嘌呤重复序列的质粒DNA,所述质粒DNA是用于mRNA疫苗的标准大小。
为了解决这个问题,设计了一种方法,通过在腺嘌呤重复序列之间包含接头(linker)序列来增加稳定性(RNA.2019年4月;25(4):507-518,doi:10.1261/rna.069286.118.Epub 2019年1月15日),但仍然需要开发其他方法来克隆和维持不包含聚(A)尾间的接头序列的质粒中的聚(A)尾,因为仅包含腺嘌呤重复序列的聚(A)尾是自然界中存在的原始形式。
发明内容
[公开]
[技术问题]
本发明的目的涉及一种稳定保持聚(A)尾的方法。
[技术方案]
本发明提供了一种稳定保持聚(A)尾的方法。
[有益效果]
通过本发明的方法,可以容易地克隆聚(A)尾,并且可以稳定地保持聚(A)序列。
附图说明
图1示出了在37℃条件下使用DH5alpha克隆聚(A)序列时的菌落PCR结果;
图2示出了在37℃条件下使用Stbl3克隆聚(A)序列时的菌落PCR结果;
图3示出了在低温条件下克隆聚(A)序列时的菌落PCR结果;
图4示出了在不同温度条件下培养用含有编码poly(A)尾的序列的质粒转化的细胞系时,A124±1比率的比较结果图,以及
图5示出了在13℃、16℃、19℃、22℃和25℃条件下,在200rpm下培养48小时时,通过在预定时间测量OD600获得的各温度下培养曲线的结果图。
具体实施方式
体现本发明的一个方面是一种在质粒中稳定保持聚(A)尾的方法。
在一个实施方案中,所述方法包括在31℃或更低的温度条件下培养用质粒转化的细胞系,所述质粒含有编码聚(A)尾的序列。
在上述任一个实施方案中,所述培养步骤包括(1):在31℃或更低的温度条件下复苏细胞系。
在上述任一个实施方案中,所述方法包括(2):在(1)的复苏步骤后,在31℃或更低的温度条件下在固体培养基上培养细胞系以形成菌落。
在上述任一个实施方案中,所述培养还包括(3):在31℃或更低的温度条件下,在液体培养基中培养(2)固体培养基培养形成的菌落。
在上述任一个实施方案中,所述方法包括:(1)在31℃或更低的温度条件下,复苏用质粒转化的细胞系,所述质粒含有编码聚(A)尾的序列;(2)在31℃或更低的温度条件下,通过复苏细胞系的固体培养形成菌落;和(3)在31℃或更低的温度条件下进行液体培养。
在上述任一个实施方案中,在液体培养基中培养菌落的步骤包括进行再次培养(subculture)。
在上述任一个实施方案中,步骤(1)至(3)中的温度条件为16℃至31℃。
在上述任一个实施方案中,步骤(1)至(3)中的温度条件为19℃至25℃。
在上述任一个实施方案中,所述细胞系是大肠杆菌。
在上述任一个实施方案中,所述转化包括使用热激法或电穿孔法将质粒引入细胞系,所述质粒含有编码聚(A)尾的序列。
在上述任一个实施方案中,所述引入在37℃至42℃的温度下进行。
在上述任一个实施方案中,所述方法还包括保存所培养的细胞系。
在上述任一个实施方案中,所述保存步骤包括冷冻和/或干燥细胞系。
在上述任一个实施方案中,所述培养包括培养和激活保存的菌株。
在上述任一个实施方案中,与包括在37℃或更高温度下培养用质粒转化的细胞系的方法相比,所述方法增加了质粒中聚(A)尾的稳定性。
在上述任一个实施方案中,所述聚(A)尾包含20至400个腺嘌呤(A)。
体现本发明的另一方面是一种用于大规模生产用于mRNA生产的质粒的方法。
在一个实施方案中,所述方法包括在31℃或更低的温度条件下培养用质粒转化的细胞系,所述质粒含有编码mRNA的序列,所述mRNA含有聚(A)尾。
在上述任一个实施方案中,所述mRNA是免疫原性组合物和/或治疗剂的组分。
体现本发明的另一方面是生产含有聚(A)尾的mRNA的方法。
在一个实施方案中,所述方法包括在31℃或更低的温度条件下培养用质粒转化的细胞系,所述质粒含有编码mRNA的序列,所述mRNA含有聚(A)尾。
在上述任一个实施方案中,所述方法包括从细胞系中回收质粒并在体外进行转录。
在上述任一个实施方案中,所述mRNA是免疫原性组合物和/或治疗剂的组分。
在此之后,将更详细地描述本公开。同时,本发明中公开的每个描述和实施方案也可应用于其他描述和实施方案。也就是说,本发明中公开的各种元素的所有组合都落入本发明的范围。此外,本发明的范围不受以下具体描述的限制。
此外,本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文所述的本发明具体实施方案的许多等同方案。此外,这些等同方案应该被解释为落入本发明的范围内。
此外,本说明书中参考并引用了大量文献和专利文件。引用的文献和专利文件的披露通过引用全部并入本文,以更清楚地解释本发明的内容和本发明相关的技术领域的水平。
本发明的一个方面是一种在质粒中稳定保持聚(A)尾的方法。
所述方法包括在31℃或更低的温度条件下培养用质粒转化的细胞系,所述质粒含有编码聚(A)尾的序列。
在本发明中,术语“聚(A)尾”指通常位于RNA分子3′端的腺苷酸残基的连续或不连续序列。聚(A)尾可以跟随mRNA的3′,例如3′UTR。这样的聚(A)尾可以由约20或更多、25或更多、40或更多、60或更多、80或更多或100或更多个腺苷酸组成,或包含约20或更多、25或更多、40或更多、60或更多、80或更多或100或更多个腺苷酸。
在一个实施方案中,所述聚(A)尾可能含有20至400个腺嘌呤(A)。例如,所述聚(A)尾可包含20至300、40至200、50至190、60至180、70至170、60至160、70至150或80至140个腺嘌呤。例如,所述聚(A)尾可能含有约120个腺嘌呤,但不限于此。
在一个实施方案中,基于聚(A)尾的核苷酸数量,通常至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%为A核苷酸,但剩余核苷酸可能是A核苷酸以外的核苷酸,例如U、T或C。例如,所述聚(A)尾可能包含延迟mRNA降解的修饰。
在本发明中,含有聚(A)尾的质粒可以含有能够启动转录的启动子、调节这种转录的任何操纵子序列、编码所需mRNA的序列以及调节转录和翻译终止的序列。在一个实施方案中,所述质粒可能含有易于克隆的限制性酶结合位点。
在一个实施方案中,质粒可能含有一个选择标记物以确认转化。可以使用形成可选择表型(如耐药、营养不良和对细胞毒性药物的耐药性)的标记物,并且在用选择性药物治疗的环境中,只有表达可选择标记物的细胞存活或显示其他表达特征,因此可以选择这样转化的细胞。然而,质粒不限于上述实例。
本发明的质粒可以通过在质粒中引入编码聚(A)尾的序列来产生。
例如,编码聚(A)尾的序列可以通过PCR扩增,用限制性酶处理,然后与限制性酶处理的质粒结合,以制备包含编码聚(A)尾序列的质粒。例如,编码mRNA的多核苷酸序列可以链接到编码聚(A)尾的序列顶部。例如,质粒可以用作转录所需mRNA的模板,所述质粒包含在编码聚(A)尾的序列顶部编码mRNA的多核苷酸序列。
本发明的用包含编码聚(A)尾的序列的质粒转化的细胞系可以通过将包含编码多条聚(A)尾序列的质粒引入细胞系来制备。
在本发明中,将包含编码聚(A)尾的序列的质粒引入细胞系也可被称为用质粒转化细胞系。
在本发明中,“引入”或“转化”质粒意味着将质粒递送至细胞系。这种引入可以根据本领域的常规方法容易地进行。为了将质粒引入细胞系,可以对细胞进行治疗,使其可渗透DNA分子,并且经历此过程的细胞被称为感受态细胞。
在一个实施方案中,可以使用热激法或电穿孔法进行引入。
使用热激法的质粒递送通过将DNA和细胞混合并瞬间加热来进行。例如,通过热激法引入可在约37℃或更高的温度条件下进行,特别是在约37℃至42℃的温度条件下。可包括在应用热激法之前和/或之后在冰上冷却细胞。
电穿孔法是一种利用电递送质粒的方法,当应用短的高压电脉冲来改变细胞膜的膜电位时,细胞膜表面形成纳米尺寸的孔,DNA渗透性增加。例如,通过电穿孔法的引入可在约37℃或更高的温度条件下进行,特别是在约37℃至42℃的温度条件下。可包括在应用电刺激之前和/或之后在冰上冷却细胞。
作为另一个实例,CaCl2沉淀法、Hanahan法,其中在CaCl2法中使用称为DMSO(二甲基亚砜)的还原物质以提高效率、磷酸钙沉淀法、原生质体融合法、使用硅碳化物纤维的搅拌法、使用PEG的转化法、硫酸葡聚糖、脂质体和干燥/抑制介导的转化法。然而,所述引入并不局限于此。
在用于治疗目的的mRNA(如mRNA疫苗)的情况下,mRNA稳定性和翻译效率需要稳定的聚(A)尾,本案申请人新提供了一种培养大肠杆菌的方法,所述大肠杆菌通过一种允许稳定克隆、大规模生产和维持,而不会丢失编码质粒中存在的聚(A)尾序列的方法克隆。
在本发明中,在31℃或以下的温度条件下引入了培养细胞系的步骤,所述细胞系中包含编码聚(A)尾的序列的质粒,可以包括以下步骤中的任何一个或多个:
(i)复苏细胞系,
(ii)在固体培养基上培养细胞系,以及
(iii)在液体培养基中培养细胞系。
步骤(i)复苏细胞系是在恢复生理功能的培养基中培养转化后处于感受态的细胞系的步骤。例如,恢复步骤中的培养基可能是非选择性培养基。
例如,复苏步骤中的培养温度可能约为31℃或更低,例如,约16℃至31℃、约16℃至30℃、约16℃至29℃、约16℃至28℃、约16℃至27℃、约16℃至26℃、约16℃至25℃、约17℃至25℃、约18℃至25℃或约19℃至25℃。
例如,复苏步骤中的培养时间可能为约5分钟至2小时。
菌落可以通过步骤(ii)在固体培养基上培养转化细胞系的形成。
“菌落”指已引入所需质粒的细胞系群。
“固体培养基”也可称为“固体类型培养基”。通过固体培养基培养,可以检查菌株生长的地方和质粒引入的地方,并且可以使用选择性培养基检查质粒是否引入。例如,选择性培养基可能含有抗生素。
例如,在固体培养基上培养细胞系的步骤中的温度可能为约31℃或更低,例如,约16℃至31℃、约16℃至30℃、约16℃至29℃、约16℃至28℃、约16℃至27℃、约16℃至26℃、约16℃至25℃、约17℃至25℃、约18℃至25℃或约19℃至25℃。
通过步骤(iii)在液体培养基中培养细胞系,细胞系可以大规模培养。在液体培养基中培养细胞系的步骤可以是培养步骤(ii)中在固体培养基上培养细胞系获得的单菌落。
例如,在液体培养基中培养细胞系的步骤中的温度可能为约31℃或更低,例如,约16℃至31℃、约16℃至30℃、约16℃至29℃、约16℃至28℃、约16℃至27℃、约16℃至26℃、约16℃至25℃、约17℃至25℃、约18℃至25℃或约19℃至25℃。
例如,在液体培养基中培养细胞系的步骤可能包括进行再次培养。再次培养是指将一些细胞从原始培养物移植到新鲜培养基中并重新培养细胞。细胞密度可以通过再次培养进行适当调整。例如,所述再次培养可以进行两次或三次或更多次,但不限于此,并且可以由本领域技术人员进行适当调整。
本发明的方法可以还包括保存所培养的细胞系。
所述保存步骤包括冷冻和/或干燥细胞系。作为低温保存剂,例如可以使用本领域已知的物质,如甘油或二甲基亚砜。
在上述任一个实施方案中,所述培养包括培养和激活保存的菌株。保存的菌株可能处于冷冻或干燥状态。激活步骤中的培养可以是固体培养或液体培养。
根据本发明的方法,质粒中的聚(A)尾可以在保存和激活培养细胞系的步骤期间稳定保持。
本发明培养步骤中使用的培养基可含有培养细胞系所需的营养物。例如,可以使用含有碳源、氮源、磷源、无机化合物、氨基酸、维生素和/或类似物的常规培养基。此外,在培养步骤中,可以以适当的方式向培养基中添加氢氧化铵、氢氧化钾、氨水、磷酸和硫酸等化合物,以调节培养基的pH值。
本本发明的细胞系不受特别限制,但可以是大肠杆菌。大肠杆菌是广泛用于大量生产或克隆DNA的宿主细胞,本发明的细胞系不仅包括野生型大肠杆菌,还包括经工程化具有有利于克隆的特征的突变型大肠杆菌。例如,可以使用RecA缺失的菌株。然而,所述细胞系不限于此。
质粒中包含的聚(A)尾可能通过细胞系重组、删除等变短。然而,当通过本发明的方法培养细胞时,可以稳定地保持质粒中包含的聚(A)尾的长度。
例如,与包括培养在37℃或更高温度下引入质粒的细胞系的方法相比,所述方法增加了质粒中聚(A)尾的稳定性。所述培养可能包括(i)复苏细胞系,(ii)在固体培养基上培养细胞系,或(iii)在液体培养基中培养细胞系中的一个或多个步骤。
本发明的另一方面是用于mRNA生产的大规模生产质粒的方法。
所述方法包括在31℃或更低的温度条件下培养用质粒转化的细胞系,所述质粒含有编码mRNA的序列,所述mRNA含有聚(A)尾。
聚(A)尾、质粒、细胞系、培养物和温度条件如上所述。
例如,所产生的质粒可以用作体外合成mRNA的模板。例如,所述方法可进一步包括从细胞中回收质粒。然而,所述方法并不限于此。
例如,含有聚(A)尾的mRNA,其使用质粒作为模板合成,可用作免疫原性组合物的组分。
例如,含有聚(A)尾的mRNA,其使用质粒作为模板合成,可用作治疗剂的组分。
本发明的另一方面是产生mRNA的方法。
所述方法包括在31℃或更低的温度条件下培养用转化的细胞系,所述质粒含有编码mRNA的序列,所述mRNA含有聚(A)尾;并使用细胞系的质粒作为模板进行转录。
含有聚(A)尾的mRNA、质粒、细胞系、培养物和温度条件如上所述。
例如,培养步骤后可从细胞系中回收质粒。
例如,转录步骤可以在体外进行。
例如,所述生产方法可能还包括制备生产的mRNA。当制备生产的mRNA时,通常使用稀释剂或赋形剂,如填料、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂和表面活性剂。例如,生产方法可包括生产mRNA,所述mRNA为包含于脂质纳米颗粒中的形式。然而,所述方法不限于此。
举例来说,生产的含有聚(A)尾的mRNA可用作免疫原性组合物的组分。
例如,生产的含有聚(A)尾的mRNA可用作治疗剂的组分。
[实施例]
在此之后,将参考实施例和实验实施例更详细地描述本发明。然而,这些实施例和实验实施例仅用于说明目的,本发明的范围不限于这些实施例和实验实施例。
对比例1:在正常条件下使用普通菌株克隆
为了确保插入聚(A)序列的质粒DNA安全,使用了常用的DH5α菌株和方法。
聚(A)片段和缀合物的制备
为了制备插入质粒中的聚(A)片段,由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2序列组成的DNA寡聚体(由Cosmogenetech定制)以1:1摩尔比混合,并通过将温度从95℃每分钟降低1℃进行退火,并用Klenow大片段(NEB)填充间隙以构建双链聚(A)DNA片段。随后,用限制性酶SacII和HindIII(NEB)切割双链聚(A)DNA片段,然后插入质粒pSKBS01得到SEQ ID NO:3,使用T4 DNA连接酶用相同的限制性酶切割以制备缀合物。
转化(DH5α)
制备的缀合物转化进大肠杆菌DH5α(Enzynomics,CP010)。将缀合物添加到大肠杆菌中,以便在冰上转化,并使混合物保持30分钟,然后在42℃下热激30秒。之后,将混合物在冰上冷却2分钟,加入SOC培养基,使大肠杆菌在37℃下复苏1小时,然后铺板于抗生素选择性固体培养基上。覆盖了大肠杆菌的培养基在37℃下培养,以产生菌落。
聚(A)序列插入的确认
转化后在选择性培养基上形成的菌落接受菌落PCR以确定插入聚(A)片段的可能性,然后从菌落中分离出质粒,确认具有片段插入的可能性,并通过碱基序列分析确认插入序列。
对于菌落PCR,使用M13正向和M13反向引物(SEQ ID NO:4和5),并对其进行控制,使得当质粒中插入聚(A)时产生550bp的PCR产物,当质粒中未插入聚(A)时产生446bp的PCR产物。在40个菌落上进行PCR,在琼脂糖凝胶上确认PCR产物。作为菌落PCR的结果,19个菌落明显具有446bp,表明聚(A)未插入,其余21个菌落具有多带模式,但似乎含有550bp大小的PCR产物(图1)。这21个菌落被确认具有片段插入的可能性,在37℃下进行液体培养,然后分离质粒,并使用Sanger测序进行碱基序列分析。
然而,已确认聚(A)序列未插入进行碱基序列分析的所有菌落。
此结果支持在正常条件下,全部聚(A)尾在克隆期间丢失。
对比例2:使用专门用于克隆不稳定片段的菌株克隆
为了保护插入聚(A)序列的质粒DNA,使用了STBL3菌株,这是专门用于克隆不稳定片段(包括重复序列)的菌株之一。转化过程中的培养温度为37℃,与比较例1相同。
转化(Stbl3)
比较例1中制备的缀合物转化进大肠杆菌Stbl3(Invitrogen,C737303)。将缀合物添加到大肠杆菌中于冰上进行转化,将混合物静置30分钟,然后在42℃下热激42秒。之后,将混合物在冰上冷却2分钟,加入SOC培养基,使大肠杆菌在37℃下复苏1小时,然后覆盖于抗生素选择性固体培养基上。覆盖了大肠杆菌的培养基在37℃下培养,以产生菌落。
聚(A)序列插入的确认
菌落PCR以与比较例1相同的方式进行。对25个菌落进行了PCR,在琼脂糖凝胶上确认PCR产物。17个菌落明显具有446bp,表明未插入聚(A)。剩余的八个菌落具有多带模式,但似乎含有550bp大小的PCR产物(图2)。这些八个菌落被确认具有片段插入的可能性,其在37℃下进行液体培养,然后分离质粒,并使用Sanger测序进行碱基序列分析。
然而,已确认聚(A)尾序列未插入进行碱基序列分析的所有菌落。
这一结果支持可以稳定克隆不稳定片段的特殊菌株也会丢失全部的聚(A)尾,并且对产生稳定的mRNA疫苗是不稳定的。
实施例1:使用低温条件克隆
从上述比较例中,证实了一个问题,即聚(A)序列不能通过常规方法适当插入或稳定保持,所述常规方法中,聚(A)序列被引入大肠杆菌,然后在37℃下培养大肠杆菌。
同样,新建立了一种稳定保持聚(A)尾的方法。因此,转化过程中的大肠杆菌培养温度下降到低于正常37℃。
转化(DH5α,Stbl3)
比较例1中制备的缀合物分别转化进大肠杆菌DH5α(Enzynomics,CP010)和Stbl3(Invitrogen,C737303)。除大肠杆菌培养温度外的条件与比较例1和2中提到的条件相同。热激后,允许大肠杆菌在25℃下复苏,置于抗生素选择性固体培养基上,然后在25℃培养以产生菌落。
聚(A)序列插入的确认
菌落PCR以与比较例1相同的方式进行。对每个菌株的10个菌落进行PCR,并在琼脂糖凝胶上确认PCR产物。
DH5α中的五个菌落和Stbl3中的七个菌落明显具有446bp,表明未插入聚(A),并且在比较例1和2中观察到与多带模式不同的清晰的大小为550bp的PCR产物(图3)。这些菌落被确认具有片段插入的可能性,在25℃下进行液体培养,分离质粒,并使用Sanger测序进行碱基序列分析。
实验的结果证实了聚(A)序列已插入进行碱基序列分析的所有菌落。
由此证实,低于37℃的低温条件具有优势,可以稳定克隆两种普通菌株和专门用于克隆不稳定片段的菌株中的聚(A)尾。
实施例2:温度条件探索:使用通用菌株进行转化和序列确认
为了探索聚(A)尾可以稳定维持的温度范围,在各种温度条件下,转化含有聚(A)尾的质粒DNA并进行液体培养,并分析其碱基序列以确认聚(A)尾被保持。
转化(DH5α)
使用前述方法(比较例1),构建具有长度为124的聚(A)尾的质粒DNA,并将质粒DNA转化进大肠杆菌DH5α(Enzynomics,CP010)。将质粒DNA添加到大肠杆菌中,使混合物在冰上静置30分钟,然后在42℃下热激40秒。之后,将混合物在冰上冷却2分钟,加入SOC培养基,并在37℃、34℃、32℃、31℃、28℃、25℃、22℃和19℃下分别培养大肠杆菌1小时,进行复苏,然后将其覆盖于抗生素选择性固体培养基上。覆盖有大肠杆菌的培养基在与大肠杆菌复苏以产生菌落的温度相同的温度下培养。
聚(A)序列长度的确认
为了分离用于碱基序列分析的质粒,选择在固体培养基上产生的24或25个菌落,并在与固体培养基培养温度相同的温度下进行液体培养。液体培养后,分离质粒,并使用Sanger测序分析聚(A)序列的长度和碱基序列。Atail-seq-R(SEQ ID NO:6)引物用于碱基序列分析。
作为碱基序列分析的结果,证实聚(A)序列不能在37℃保持,但在31℃或更低温度下培养时,聚(A)长度的稳定性显著增加。因此证实,随着大肠杆菌培养温度下降,聚(A)序列的稳定性增加。
当使用Sanger测序在碱基序列分析中对具有长重复序列的模板进行分析时,由于聚合酶滑动现象,分析结果中可能会省略或添加一个核苷酸(https://www.nucleics.com/DNA_sequencing_support/DNA-sequencing-AT-slippage.html)。因此,A124±1的比率被用作指标,其与插入的聚(A)序列的长度在1个误差范围内。结果如表1和图4所示。
[表1]
在不同温度下转化进DH5α后的聚(A)序列长度
*n/a:Sanger测序结果的混合峰值,从分析中排除
如表1和图4所示,可以看出,当在31℃或更低的温度条件下培养质粒转化细胞系时,所述质粒含有编码聚(A)尾的序列,A124±1比率为21.7%至55.0%,聚(A)尾在质粒中稳定保持。然而,由于大肠杆菌的生长很少发生在低于16℃的温度条件下(非专利文件1,ActaAlimentaria50(2021)2180-188),因此不能将低于16℃温度条件应用于疫苗产品的大规模生产过程。在下文描述的实施例5中可以再次看到,低于16℃的温度条件不适用于工艺应用。
实施例3:再次培养期间的稳定性:使用专门用于维持不稳定片段的菌株进行转化
和再次培养
为了检查在低温条件下连续再次培养期间聚(A)序列是否保持完整,在37℃和25℃下使用NEB稳定菌株进行转化和再次培养,NEB稳定菌株是专门用于保持不稳定片段的菌株之一。
转化(NEB稳定菌株)
将实施例2中使用的质粒DNA转化进NEB稳定大肠杆菌(NEB,C3040H)。将质粒DNA添加到大肠杆菌中,在冰上转化,并使混合物静置30分钟,然后在42℃下热激40秒。之后,将混合物在冰上冷却5分钟,加入NEB 10-beta/Stable Outgrowth培养基,并使大肠杆菌在37℃或25℃下复苏1小时,然后覆盖于抗生素选择性固体培养基上。覆盖有大肠杆菌的培养基在与大肠杆菌复苏以产生菌落的温度相同的温度下培养。
转化后聚(A)序列长度的确认
在每种温度下转化后产生的菌落中,选择25个菌落,并在与固体培养温度相同的温度下进行液体培养。分离质粒,使用Sanger测序分析聚(A)序列的长度。3UTR-Xba1-F(SEQID NO:7)引物用于碱基序列分析。与实施例2中常用的DH5α获得的结果相比,证实在37℃下转化期间保持聚(A)序列长度为120或更长的菌落比率相对较高。可以想象,这些结果是通过使用专门用于维持不稳定碎片的菌株获得的。
然而,从A124±1的比率可以看出,无论菌株如何,低温都有利于保持poly(A)序列的长度,因为与25℃相比,用于转化的质粒中最初含有的保持聚(A)数量接近124的菌落数量在37℃时明显较少。
[表2]
聚(A)序列长度的变化取决于转化进NEB稳定菌株期间的温度
/>
再次培养
在转化后通过碱基序列分析确认菌落中聚(A)序列的长度,选择37℃条件下的6个菌落,选择25℃条件下的9个菌落。将所选菌落的培养溶液接种到体积为1/1000的新鲜液体培养基中,然后在相同温度下再次培养。在37℃条件下进行再次培养两次,在25℃条件下再次培养三次。
确认再次培养的聚(A)序列长度
当进行再次培养时,从一些培养溶液中分离出质粒,并使用Sanger测序分析聚(A)序列的长度。3UTR-Xba1-F(SEQ ID NO:7)引物用于碱基序列分析。
作为37℃下再次培养的结果,证实聚(A)序列的长度在大多数菌落中没有保持(表3)。同时,当在25℃下进行再次培养时,证实所有菌落的聚(A)序列长度保持不变(表4)。
[表3]
37℃再次培养期间聚(A)序列长度的保持
/>
[表4]
25℃再次培养期间聚(A)序列长度的保持
由此证实,在31℃或更低的亚培养温度下培养是保持质粒聚(A)序列的合适条件。
实施例4:制备细胞系原液后的稳定性确认
为了检查通过转化构建的细胞系的易储存性,将转化的细胞系(在实施例3中,在25℃的条件下,其长度被确认为124)以甘油储备液的形式制备并储存在70℃的冰箱中。取出以冷冻状态储存的原液并在16℃、25℃和30℃的不同试管中进行液体培养,然后分离每个质粒并进行序列分析。从培养的大肠杆菌分离的质粒中分析的A长度均为124,这证实了当制备储备液并随后培养时,A长度保持完整。
[表5]
实施例5:不同温度下培养曲线的确认
进行以下实验以确认在低于16℃的条件下培养不适于工艺应用。
在实施例2和3中,在25℃的条件下,转化的细胞系DH5α和NEB稳定菌株,其A长度被确认为124,均以甘油储备液的形式制备,并储存在-70℃的冰箱中。为了确认在不同温度下的生长曲线,取出储备液并在13℃、16℃、19℃、22℃和25℃的条件下,在200rpm下培养48小时,并在生长过程中预先确定的时间测量OD600。作为实验结果,证实在13℃(其低于16℃)时几乎没有细胞生长(图5)。
基于上述描述,本领域技术人员将理解,本发明可以以不同的具体形式实施,而不改变其技术精神或基本特征。因此,应当理解,上述实施方案并非详尽无遗,而是各方面的说明。本发明的范围由所附权利要求定义,而不是由上述描述定义,因此,在权利要求的范围和界限内发生的所有变化和修改或这些范围和界限的等效物都旨在包含于权利要求。
/>
/>
Claims (14)
1.一种稳定保持质粒中聚(A)尾的方法,所述方法包括:
在31℃或更低的温度条件下培养用质粒转化的细胞系,所述质粒含有编码聚(A)尾的序列。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述培养步骤包括(1)在31℃或更低的温度条件下复苏细胞系。
3.根据权利要求2所述的方法,其中包括(2)在31℃或更低的温度条件下在固体培养基上培养细胞系,以在(1)的复苏步骤后形成菌落。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述培养还包括(3)在31℃或更低的温度条件下,在液体培养基中培养(2)固体培养基培养形成的菌落。
5.根据权利要求4所述的方法,其中所述在液体培养基中培养菌落的步骤包括进行再次培养。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中温度条件为16℃至31℃。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中温度条件为19℃至25℃。
8.根据权利要求1所述的方法,其中所述细胞系为大肠杆菌。
9.根据权利要求1所述的方法,其中所述转化包括使用热激法或电穿孔法将含有编码聚(A)尾序列的质粒引入细胞系。
10.根据权利要求9所述的方法,其中所述引入在37℃至42℃的温度下进行。
11.根据权利要求1所述的方法,其中与在37℃或更高温度下培养用质粒转化的细胞系的方法相比,所述质粒包含编码聚(A)尾的序列,所述方法增加了质粒中聚(A)尾的稳定性。
12.根据权利要求1所述的方法,其中所述聚(A)尾含有20至400个腺嘌呤(A)。
13.大规模生产用于mRNA生产的质粒的方法,所述方法包括:
在31℃或更低的温度条件下,培养用质粒转化的细胞系,所述质粒含有编码mRNA的序列,所述mRNA含有聚(A)尾。
14.一种生产含有聚(A)尾的mRNA的方法,所述方法包括:
在31℃或更低的温度条件下培养用质粒转化的细胞系,所述质粒含有编码mRNA的序列,所述mRNA含有聚(A)尾;和
使用细胞系的质粒作为模板进行转录。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR20210108264 | 2021-08-17 | ||
KR10-2021-0108264 | 2021-08-17 | ||
PCT/KR2022/012233 WO2023022490A1 (ko) | 2021-08-17 | 2022-08-17 | 폴리 a 테일을 안정적으로 유지하는 방법 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117836418A true CN117836418A (zh) | 2024-04-05 |
Family
ID=85239582
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202280056262.2A Pending CN117836418A (zh) | 2021-08-17 | 2022-08-17 | 稳定保持聚a尾的方法 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
KR (1) | KR20230026965A (zh) |
CN (1) | CN117836418A (zh) |
WO (1) | WO2023022490A1 (zh) |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7794971B1 (en) * | 2003-07-01 | 2010-09-14 | Epicentre Technologies Corporation | Compositions and methods for controlling copy number for a broad range of plasmids and uses thereof |
WO2016005004A1 (en) * | 2014-07-11 | 2016-01-14 | Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh | Stabilization of poly(a) sequence encoding dna sequences |
-
2022
- 2022-08-17 KR KR1020220102797A patent/KR20230026965A/ko not_active Application Discontinuation
- 2022-08-17 CN CN202280056262.2A patent/CN117836418A/zh active Pending
- 2022-08-17 WO PCT/KR2022/012233 patent/WO2023022490A1/ko active Application Filing
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20230026965A (ko) | 2023-02-27 |
WO2023022490A1 (ko) | 2023-02-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2833104T3 (es) | Cepa que tiene una productividad aumentada de l-valina y método de producción de L-valina mediante el uso de la misma | |
EP3475295B1 (en) | Novel nucleoside triphosphate transporter and uses thereof | |
ES2655764T3 (es) | Microorganismo recombinante que tiene una capacidad mejorada de producción de putrescina y un procedimiento para producir putrescina utilizando el mismo | |
Clarke et al. | Biochemical construction and selection of hybrid plasmids containing specific segments of the Escherichia coli genome. | |
ES2802949T3 (es) | Microorganismo con productividad de l-lisina aumentada y procedimiento para producir l-lisina utilizando el mismo | |
EP1942184B1 (en) | Transformant capable of carrying plasmid stably | |
CN114981409A (zh) | 用于基因组整合的方法和组合物 | |
EP2363473A1 (en) | Nitrile hydratase variant | |
ES2720032T3 (es) | Microorganismos que producen L-aminoácidos y proceso para producir L-aminoácidos usando los mismos | |
CN117836418A (zh) | 稳定保持聚a尾的方法 | |
CN111057672A (zh) | 重组菌株及其应用 | |
KR102433234B1 (ko) | L-시트룰린 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-시트룰린의 생산 방법 | |
JP5712495B2 (ja) | 薬剤耐性遺伝子を欠失又は不活性化させた微生物 | |
ES2734412T3 (es) | Microorganismo que tiene capacidad de producir O-succinilhomoserina o ácido succínico, y procedimiento de producción de ácido succínico u O-succinilhomoserina mediante el uso del mismo | |
US8999672B2 (en) | Compositions and processes for improved plasmid DNA production | |
JP5842691B2 (ja) | ヌクレアーゼ遺伝子を欠失または不活性化させたロドコッカス属細菌 | |
JP6944697B2 (ja) | 糸状菌におけるゲノム編集を用いる多段階による多重変異株の製造方法 | |
EP1234883B1 (en) | Expression control sequence | |
CN101899431B (zh) | 一种快速高效dna重组的方法及试剂盒 | |
US20240175038A1 (en) | Method for the production of seamless dna vectors | |
EP4306644A1 (en) | Corynebacterium glutamicum variant having improved l-lysine production ability, and method for producing l-lysine by using same | |
WO2022191779A1 (en) | Method for the production of seamless dna vectors | |
WO2008072891A1 (en) | Microorganism whose enzyme activity for nrfe is inactivated and process for producing l-tryptophan using the same | |
KR101970471B1 (ko) | Ctx 파지에 감염되고 콜레라 독소를 생산할 수 있는 비브리오 콜레라 균주 | |
EP0178744A2 (en) | Shuttle vector |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |