KR20230013017A - 아프리카 돼지 열병 바이러스 감염에 대한 백신 - Google Patents

아프리카 돼지 열병 바이러스 감염에 대한 백신 Download PDF

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아누시아 라타크리쉬난
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위앤 젠크 루이
신지 이케미즈
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Abstract

본 발명은 약독화된 아프리카 돼지 열병 바이러스에 관한 것이다. 약독화된 바이러스는 병독성 바이러스에 의한 후속 챌린지로부터 돼지를 방어한다. 본 발명은 또한 아프리카 돼지 열병을 치료 및/또는 예방하기 위한 상기 약독화된 바이러스의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 특정 아미노산 치환을 포함하는 아프리카 돼지 열병 바이러스의 EP402R 단백질 뿐만 아니라, 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 단백질을 포함하는 아프리카 돼지 열병 바이러스에 관한 것이다.

Description

아프리카 돼지 열병 바이러스 감염에 대한 백신
본 발명은 약독화된 아프리카 돼지 열병 바이러스에 관한 것이다. 약독화된 바이러스는 병독성 바이러스에 의한 후속 챌린지로부터 돼지를 방어한다. 본 발명은 또한 아프리카 돼지 열병을 치료 및/또는 예방하기 위한 상기 약독화된 바이러스의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 특정 아미노산 치환을 포함하는 아프리카 돼지 열병 바이러스의 EP402R 단백질 뿐만 아니라, 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 단백질을 포함하는 아프리카 돼지 열병 바이러스에 관한 것이다.
아프리카 돼지 열병 ( ASF )
아프리카 돼지 열병은 이중-가닥 DNA 바이러스인 아프리카 돼지 열병 바이러스 (ASFV)에 의해 가축용 돼지에서 유발되는 치명적인 출혈성 질환이다. ASFV는 우세하게 세포의 세포질에서 복제하는 아스파비리다에(Asfarviridae) 과의 유일한 구성원이다. ASFV의 병독성 균주는 감염 후 약 5-14일 이내에 가축용 돼지를 죽일 수 있으며, 치사율은 100%에 달한다.
ASFV는 와트호그 (파코초에루스 종(Phacochoerus sp .)), 부시피그 (포타모초에루스 종(Potamochoerus sp .)) 및 오르니토도로스(Ornithodoros) 종의 연진드기 (벡터로 간주)에서 감염 및 복제할 수 있지만, 이러한 종에서는 임상 징후가 관찰되는 경우는 거의 없으며, 장기간 지속적인 감염이 확립될 수 있다. ASFV는 유럽 정착민이 돼지를 ASFV 고유 지역으로 가져온 후 처음 기재되었으며, 따라서, "신종 감염"의 한 예이다. 상기 질환은 현재 사하라 사막 이남의 많은 국가와 사르데냐의 유럽에서 풍토병이다. ASFV는 2007년 트랜스 코카서스 지역의 조지아에 도입된 후 러시아 연방을 비롯한 주변 국가로 광범위하게 퍼졌다. 2012년, 우크라이나에서 첫 발병이 보고되었으며, 2013년에는 벨로루시에서 첫 발병이 보고되었다. 2014년에는 우크라이나의 돼지에서 추가 발병이 보고되었으며, 리투아니아와 폴란드의 멧돼지에서 검출되었다. 2018년, ASFV는 중국으로 확산되었고, 이후 중국과 다른 여러 아시아 국가 (몽골, 베트남, 캄보디아, 미얀마, 한국 및 북한, 인도네시아, 필리핀, 파푸아뉴기니, 동티모르)로 광범위하게 퍼졌다.
현재 ASF에 대한 치료법은 없다. 아프리카 이외의 국가에서는 수입 돼지 및 돼지고기 제품에 대한 반입 제한, 돼지에게 먹이기 전에 허가 하에 폐축산물을 강제로 끓이기, 질환 진단시 도축 정책을 적용하는 등 국가 차원에서 예방을 시도하고 있다. 아프리카에서 방지는 와트호그, 및 와트호그에 오염된 물질을 무리에서 멀리 떨어뜨리는 조치를 기반으로 한다.
따라서, ASFV 감염을 제어하고, 질환 확산을 예방하기 위한 개선된 조치가 요구된다.
아프리카 돼지 열병 바이러스 ( ASFV )
ASFV 분리주 Benin 97/1 (서아프리카로부터의 고병원성 바이러스, 그룹 1), 분리주 OURT88/3 (포르투갈로부터의 비-병원성, 약독화된 바이러스, 그룹 1) 및 분리주 BA71V (Vero 세포 조직 배양 적합화된 비-병원성 바이러스, 그룹 1)의 완전 게놈 서열을 비교하였다 (Chapman et al. 2008 J. Gen. Virol. 89: 397-408). 유전자형 II 분리주 Georgia 2007/1의 완전한 게놈 또는 서열분석되었다 (Chapman et al. 2011 Emerg Infect Dis 17(4): 599-605).
OURT88/3 게놈에서 다중유전자 패밀리 (MGF) 360 18R (DP148R) 유전자, EP153R 유전자 및 EP402R 유전자는 각각 프레임 시프트 돌연변이에 의해 중단된다. 추가로, 하기 MGF 유전자는 OURT88/3 게놈에 부재한다: MGF 110 3L, 6L, 7L, 8L, 10L, 11L 및 12L, MGF 300 3L, MGF 360 5L, 6L, 7L, 10L, 11L, 12L, 13L, 14L, 20R, 21R 및 22R, 및 MGF 505 1R, 2R 및 6R. MGF 505 3R 유전자 또한 말단절단되어 있다.
고병독성 Lisboa60 균주 및 저병독성 NH/P68 균주의 서열 또한 비교하였다 (Portugal et al. 2015 J. Gen. Virol. 96: 408-419).
NH/P68 게놈에서, MGF 360 18R (DP148R) 유전자, EP153R 유전자 및 EP402R 유전자는 각각 조기 정지 코돈에 의해 중단된다. 추가로, 하기 MGF 유전자는 NH/P68 게놈에 부재한다: MGF 110 3L, 6L, 7L, 8L, 10L, 11L 및 12L, MGF 360 5L, 6L, 7L, 10L, 11L, 12L, 13L, 14L, 20R, 21R 및 22R, 및 MGF 505 1R, 2R 및 6R. MGF 360 9L 및 MGF 505 3R 유전자 또한 말단절단되어 있다.
고병독성 BA71 균주 및 저병독성 BA71V 균주의 서열도 비교하였다 (Rodriguez et al. 2015 PLoS ONE 10(11): e0142889).
병독성 Benin 97/1 분리주로부터의 DP148R 유전자의 결실은 병독성을 감소시키고, 모체 바이러스에 의한 챌린지로부터의 방어를 유도하였다 (Reis et al. 2017 J. Virol. 91, 24: e01428-17).
감염된 동물 및 백신접종받은 동물 감별(Differentiation of Infected and Vaccinated Animals: DIVA) 백신
DIVA 백신 (마커 백신으로도 지칭)을 통해 야생형 병원체로 감염된 동물을 백신으로 면역화된 동물과 감별할 수 있다. DIVA 백신에는 야생형 병원체에 존재하는 적어도 하나의 면역원성 항원 (DIVA 마커)이 결여되어 있다. 야생형 병원체로 감염된 동물은 DIVA 마커에 대한 항체를 생산하는 반면, 백신접종받은 동물은 상기 항체를 생산하지 않는다. DIVA 마커에 대한 항체는 혈청학적 검정법을 사용하여 검출할 수 있다. 따라서, 두 동물 그룹 모두 병원체의 다른 면역원에 대한 항체가 있음에도 불구하고, (DIVA 마커에 대한 항체가 있는) 감염된 동물은 (DIVA 마커에 대한 항체가 없는) 백신접종받은 동물로부터 감별될 수 있다.
DIVA 마커는 면역원성이어야 하지만, 유전자의 결실이 백신의 방어 능력에 영향을 미치지 않아야 한다.
일반적으로, 본 발명은 유전자 EP153R 및 EP402R의 발현 및/또는 활성이 파괴되는 반면, 특정 MGF 유전자의 발현 및/또는 활성은 파괴되지 않는 약독화된 아프리카 돼지 열병 바이러스에 관한 것이다.
본 발명은 또한 백신접종받은 동물로부터의 감염된 동물 감별 (DIVA) 돌연변이와 함께 조합하여 EP153R 및 EP402R 유전자의 발현 및/또는 활성의 파괴가 아프리카 돼지 열병 바이러스를 약독화시킬 수 있다는 결정에 관한 것이다. 본 발명은 특히 K145R 유전자의 DIVA 돌연변이에 관한 것이다.
본 발명은 또한 혈구흡착을 파괴하는, 아프리카 돼지 열병 바이러스의 EP402R 단백질 중의 특정 아미노산 변이의 결정에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 상기 아미노산 변이를 포함하는 EP402R 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 EP402R 단백질 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 아프리카 돼지 열병 바이러스를 포함한다.
추가로, 본 발명은 EP402R의 아미노산 변이는 아프리카 돼지 열병 바이러스를 약독화시키는 EP153R 유전자의 활성 및/또는 발현 파괴 및/또는 DIVA 돌연변이와 함께 조합될 수 있다는 점에서 상기한 것과의 조합에 관한 것이다.
본 발명의 약독화된 아프리카 돼지 열병 바이러스는 본원 실시예에서 입증된 바와 같이, 백신에서 사용될 때, 야생형 아프리카 돼지 열병 바이러스 균주에 의한 감염으로부터 방어를 제공하는 바 특히 유익하다.
한 측면에서, 본 발명은 유전자 EP153R 및 EP402R의 발현 및/또는 활성이 파괴되고; 하기 유전자:
다중유전자 패밀리 (MGF) 110 3L, 6L, 7L, 8L, 10L, 11L 및 12L,
MGF 360 5L, 6L, 7L, 10L, 11L, 12L, 13L, 14L, 20R, 21R 및 22R, 및
MGF 505 1R, 2R 및 6R 중 하나 이상의 기능성 버전을 포함하는 것인, 약독화된 아프리카 돼지 열병 (ASF) 바이러스를 제공한다.
본 발명은 또한 유전자 EP153R 및 EP402R의 발현 및/또는 활성이 파괴되고; 하기 유전자:
다중유전자 패밀리 (MGF) 110 5L, 6L, 8L 및 12L,
MGF 360 6L, 10L, 11L, 12L, 13L, 14L 및 21R, 및
MGF 505 1R 및 2R 중 하나 이상의 기능성 버전을 포함하는 것인, 약독화된 ASF 바이러스를 제공한다.
본 발명은 또한 유전자 EP153R 및 EP402R의 발현 및/또는 활성이 파괴되고; 하기 유전자:
다중유전자 패밀리 (MGF) 110 11L 및 12L,
MGF 360 6L, 10L, 11L, 12L, 13L, 및 14L, 및
MGF 505 1R 및 2R 중 하나 이상의 기능성 버전을 포함하는 것인, 약독화된 ASF 바이러스를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 유전자 EP153R 및 EP402R의 발현 및/또는 활성이 파괴되고, DIVA 돌연변이를 포함하는 것인, 약독화된 ASF 바이러스를 제공한다. 일부 실시양태에서, DIVA 돌연변이가 K145R 유전자의 발현을 파괴시킨다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 아미노산 변이가 EP402R 단백질의 리간드 결합을 파괴시키는 것인, 리간드 결합 도메인 중 하나 이상의 아미노산 변이를 포함하는 EP402R 단백질을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 Georgia 2007/1 EP402R 단백질 (서열식별번호(SEQ ID No.) 24)의 Q96 및/또는 W99에 상응하는 위치에 아미노산 변이를 포함하는 EP402R 단백질을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 EP402R 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 EP402R 단백질을 포함하는 ASF 바이러스를 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 ASF 바이러스를 제공한다.
본 발명은 또한 대상체에서 질환을 치료 및/또는 예방하는 데 사용하기 위한 본 발명의 ASF 바이러스, 및 대상체에서 질병을 치료 및/또는 예방하기 위한 의약의 제조를 위한 본 발명의 ASF 바이러스의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 ASF 바이러스를 포함하는 제약 조성물로서, 상기 제약 조성물은 대상체에서 질환을 치료 및/또는 예방하는 데 사용하기 위한 것인 제약 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 ASF 바이러스를 포함하는 백신으로서, 상기 백신은 대상체에서 아프리카 돼지 열병을 치료 및/또는 예방하는 데 사용하기 위한 것인 백신을 제공한다.
본 발명은 또한 대상체에게 유효량의 본 발명에 따른 제약 조성물, 또는 유효량의 본 발명에 따른 백신을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 아프리카 돼지 열병을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 EP402R 단백질의 리간드 결합 도메인 중 하나 이상의 아미노산(들)을 변이시키는 단계를 포함하고, 여기서, 아미노산 변이는 EP402R 단백질의 리간드 결합을 파괴시키는 것인, 본 발명의 ASF 바이러스를 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 Georgia 2007/1 EP402R 단백질 (서열식별번호 24)의 Q96 및/또는 W99에 상응하는 위치에서 EP402R 단백질 중 하나 이상의 아미노산(들)을 변이시키는 단계를 포함하는, 본 발명의 ASF 바이러스를 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 EP402R 단백질의 리간드 결합 도메인 중 하나 이상의 아미노산(들)을 변이시키는 단계를 포함하고, 여기서, 아미노산 변이는 EP402R 단백질의 리간드 결합을 파괴시키는 것인, 혈구흡착을 유도하는 ASF 바이러스의 능력을 감소시키는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 Georgia 2007/1 EP402R 단백질 (서열식별번호 24)의 Q96 및/또는 W99에 상응하는 위치에서 EP402R 단백질 중 하나 이상의 아미노산(들)을 변이시키는 단계를 포함하는, 혈구흡착을 유도하는 ASF 바이러스의 능력을 감소시키는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 EP153R 및 EP402R 유전자의 발현 및/또는 활성을 파괴시키는 단계를 포함하는, ASF 바이러스를 약독화시키는 방법을 제공한다.
도 1은 표면 발현을 검출하기 위해 야생형 CD2v 유전자를 함유하는 약독화된 ASFV로 면역화된 돼지로부터의 혈청으로 염색된 야생형 (a) 또는 돌연변이체 (b) CD2v를 발현하는 비-투과성 세포의 공초점 현미경 이미지를 보여주는 것이다.
도 2는 HAD (혈구흡착) 검정법으로부터의 예시적인 이미지를 보여주는 것이다. Vero 세포를 T7RNA 폴리머라제를 발현하는 변형된 백시니아 바이러스 앙카라(Ankara)로 감염시키고, C-말단 HA 에피토프 태그가 있는 야생형 또는 돌연변이체 CD2v 전장 단백질을 발현하는 플라스미드 (pcDNA3)로 형질감염시켰다. 돼지 적혈구를 첨가하고, 적혈구의 표면에의 부착에 대해 세포를 관찰하였다. 야생형 Benin CD2v를 발현하는 플라스미드로 형질감염된 3개의 세포 주위에서 적혈구의 HAD가 관찰된다 (a). Y102 잔기가 D로 돌연변이된 CD2v를 발현하는 한 세포 주위에서 부분적인 HAD가 관찰된다 (b). 잔기 E99가 R로 돌연변이된 CD2v를 발현하는 세포의 경우 HAD는 관찰되지 않는다 (c).
도 3은 다양한 유전자형의 상이한 ASFV 분리주로부터의 CD2v 리간드 결합 도메인의 아미노산 서열의 정렬을 도시한 것이다. E99 및 다른 분리주 중의 상응하는 잔기는 황색으로 강조 표시되어 있다.
도 4는 HAD 검정법으로부터의 예시적인 이미지를 보여주는 것이다. Vero 세포를 T7RNA 폴리머라제를 발현하는 변형된 백시니아 바이러스 앙카라로 감염시키고, C-말단 HA 에피토프 태그가 있는 Benin 또는 Georgia 균주로부터의 야생형 또는 돌연변이체 CD2v 전장 단백질을 발현하는 플라스미드 (pcDNA3)로 형질감염시켰다. 돼지 적혈구를 첨가하고, 적혈구의 표면에의 부착에 대해 세포를 관찰하였다. 야생형 Benin CD2v를 발현하는 플라스미드로 형질감염된 4개의 세포 주위에서 (a), 및 야생형 Georgia CD2v를 발현하는 플라스미드로 형질감염된 2개의 세포 주위에서 (b) 적혈구의 HAD가 관찰된다. 잔기 Q96이 R로 돌연변이된 Georgia CD2v를 발현하는 세포 (c), 또는 형질감염되지 않은 Vero 세포 (d)의 경우 HAD는 관찰되지 않는다.
도 5는 K145R (a) 또는 B125R (b)을 발현하는 플라스미드로 형질감염된 Vero 세포를 보여주는 것이다. 녹색 염색은 발현된 단백질을 표시하는 것이고, 청색 DAPI 염료는 DNA를 검출하는 것이다.
도 6은 Vero 세포에서 발현되고, ASFV로 면역화된 돼지로부터의 항혈청에 의해 검출된 K145R (a) 및 B125R (b)을 보여주는 것이다. 세포를 고정시키고, 투과시키고, 발현된 단백질을 검출하기 위해 항-항-HA(적색)로 염색하고, 약독화된 유전자형 I Benin97/1 유전자 결실 ASFV 균주로 면역화된 돼지로부터의 혈청 (녹색)으로 염색하였다. 면역화 이전 및 면역화 후 38일째 수집된 혈청으로 염색된 세포의 이미지를 보여주는 것이다. DNA는 청색으로 염색된다.
도 7은 HAD 검정법으로부터의 예시적인 이미지를 보여주는 것이다. 대조군으로서 야생형 Georgia 2007/1 ASFV (a), 또는 GeorgiaΔK145RΔEP153RCD2vQ96R ASFV (b)로 돼지 골수 세포를 감염시키고, 돼지 적혈구를 첨가하였다. 감염 후 1일째 야생형 Georgia 2007/1로 감염된 세포에서는 HAD가 관찰되지만 (a), 감염 후 1일째 GeorgiaΔK145RΔEP153RCD2vQ96R로 감염된 세포에서는 관찰되지 않는다 (b).
도 8은 GeorgiaΔK145RΔEP153RCD2vQ96R ASFV (그룹 K)로 돼지를 면역화, 부스팅 및 챌린지하는 데 사용된 실험 프로토콜을 도시한 것이다.
도 9는 면역화 및 챌린지 동안 대조군, 비-면역화된 그룹 M (a) 및 GeorgiaΔK145RΔEP153RCD2vQ96R로 면역화된 그룹 K (b) 중의 돼지의 직장 체온을 보여주는 것이다.
도 10은 면역화 및 챌린지 동안 대조군, 비-면역화된 그룹 M (a) 및 GeorgiaΔK145RΔEP153RCD2vQ96R로 면역화된 그룹 K (b) 중의 돼지의 임상 점수를 보여주는 것이다.
도 11은 (챌린지 전 GeorgiaΔK145RΔEP153RCD2vQ96R로 면역화된) 그룹 K 및 그룹 M (비-면역화된 대조군)으로부터의 돼지에서 부검시 점수화된 상이한 기관의 육안 병변을 보여주는 것이다.
도 12는 VP72/B646L 주요 캡시드 단백질을 기반으로, 상업적으로 이용가능한 경쟁 ELISA를 사용하여 측정된, 면역화 및 챌린지 동안 그룹 K 중의 돼지의 항체 반응 (적색 파선)을 보여주는 것이다.
도 13은 면역화 및 챌린지 동안 그룹 K에서의 세포 매개 면역 반응을 보여주는 것이다. 말초 혈액 단핵 세포를 면역화 이전, 부스트 및 챌린지에 수집하고, ASFV 유전자형 I Benin 97/1 (적색 막대) 또는 ASFV 유전자형 II Georgia 2007/1 (녹색 막대)로 자극하였다. IFN 감마 생산 세포의 개수를 Elispot 검정법에 의해 측정하였다
도 14는 시간 경과에 따른, Georgia 2007/1 분리주로의 자극 후의 상이한 돼지에 대한 IFN 감마 생산 세포의 개수를 보여주는 것이다.
도 15는 면역화 및 챌린지 후 상이한 시점 (일째) (x축)에 전혈 중에서 검출된 감염성 바이러스의 수준을 보여주는 것이다. 돼지 골수 세포 중 한계 희석에 의해 바이러스 역가를 측정하고, 형광에 의해 감염된 세포를 검출하고, y축 상에 TCID50/ml로 표시한다. 상이한 돼지에 대한 값은 도면 상에 표시된 바와 같이 상이한 색상으로 제시된다.
아프리카 돼지 열병 바이러스
아프리카 돼지 열병 바이러스 (ASFV)는 아프리카 돼지 열병 (ASF)의 병원체이다. ASFV의 게놈 구조는 문헌 [Chapman et al. 2008 J. Gen. Virol. 89: 397-408]에 설명되어 있는 바와 같이, 관련 기술분야에 공지되어 있다. ASFV는 적어도 150개의 유전자를 포함하는 선형 게놈을 가진 큰 20면체 이중-가닥 DNA 바이러스이다. 유전자 개수는 바이러스의 다른 분리주마다 약간씩 상이하다. ASFV는 다른 대형 DNA 바이러스, 예컨대, 폭스바이러스, 이리도바이러스 및 미미바이러스와 유사하다. 다른 바이러스성 출혈열과 마찬가지로, 복제의 주요 표적 세포는 단핵구, 대식세포 계통의 세포이다.
주요 캡시드 단백질 p72를 코딩하는 B646L 유전자의 C-말단 영역의 서열 변이에 기초하여, 22개의 ASFV 유전자형 (I-XXII)이 확인되었다. 모든 ASFV p72 유전자형은 동부 및 남부 아프리카에서 유행하고 있다. 유전자형 I은 유럽, 남미, 카리브해 및 서부 아프리카에서 유행하고 있다. 유전자형 II는 유럽 및 아시아의 여러 국가에서 유행하고 있다. 유전자형 IX는 여러 동아프리카 국가에 국한되어 있다.
일부 유전자형의 균주의 예는 하기에 제시되어 있다:
유전자형 I : OURT88/3; Brazil/79; Lisbon/60; BA715; Pret; Benin 97/1; IC/1/96; IC/576; CAM/82; Madrid/62; Malta/78; ZAR85; Katange63; Togo; Dakar59; Ourt88/1; BEN/1/97; Dom_Rep; VAL/76; IC/2/96; Awoshie/99; NIG/1/99; NIG/1/98; ANG/70; BEL/85; SPEC120; Lisbon/57; ASFV-Warm; GHA/1/00; GAM/1/00; Ghana; HOL/86; NAM/1/80; NUR/90/1; CAM/4/85; ASFV-Teng; Tegani; ASFV-E75.
유전자형 II: Georgia 2007/1; POL/2015/Podlaskie (폴란드 균주); Belgium/Etalle/wb/2018; ASFV/Kyiv/2016/131; China/2018/AnhuiXCGQ
유전자형 III: BOT 1/99
유전자형 IV: ASFV-War; RSA/1/99/W
유전자형 VI: MOZ 94/1
유전자형 VII: VICT/90/1; ASFV-Mku; RSA/1/98
유전자형 VIII: NDA/1/90; KAL88/1; ZAM/2/84; JON89/13; KAV89/1; DEZda; AFSV-Mal; Malawi LIL 20/1
유전자형 IX: UGA/1/95
유전자형 X: BUR/1/84; BUR/2/84; BUR/90/1; UGA/3/95; TAN/Kwh12; HindeII; ASFV-Ken; 병독성 Uganda 65.
한 실시양태에서, 본 발명의 ASF 바이러스는 약독화될 수 있다. 본 발명의 약독화된 ASF 바이러스는 임의의 조합으로 본원에 기재된 임의의 변형/돌연변이를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 변형/돌연변이는 ASF 바이러스를 약독화시킬 수 있다.
ASFV 분리주
본 발명의 약독화된 ASF 바이러스는 유전자 EP153R 및 EP402R의 발현 및/또는 활성이 파괴되도록 그의 게놈에 돌연변이를 포함함으로써, 야생형 ASF 바이러스 분리주로부터 유래가능하거나, 또는 유래된 것일 수 있다. 바이러스는 또한 예컨대, K145R 유전자의 발현을 파괴시키는 DIVA 돌연변이와 같은 DIVA 돌연변이를 포함할 수 있다.
"야생형"이라는 용어는 바이러스가 필드에 (어느 지점에) 존재했으며, 예컨대, 가축용 돼지, 진드기 또는 와트호그와 같은 천연 숙주에서 단리되었음을 나타낸다. 현재까지 기재된 ASFV 분리주는 진뱅크 수탁(Genbank Accession) 번호와 함께 하기 표 1에 요약되어 있다.
<표 1>
Figure pct00001
Figure pct00002
본 발명의 약독화된 ASFV의 게놈은 임의의 ASFV 유전자형에 상응할 수 있다. 본 발명의 약독화된 ASFV의 게놈은 본질적으로 임의의 ASFV 유전자형에 상응할 수 있다.
"~에 상응하는"이라는 용어는 본 발명의 약독화된 ASFV의 게놈의 나머지 부분이 야생형 균주(즉, 필드의 어느 지점에 존재했던 바이러스)와 동일하다는 것을 의미한다. "게놈의 나머지 부분"은 유전자 EP153R 및 EP402R 이외의 모든 다른 유전자를 지칭할 수 있다. "게놈의 나머지 부분"은 유전자 EP153R, EP402R 및 K145R 이외의 모든 다른 유전자를 지칭할 수 있다. 다시 말해, 본 발명의 약독화된 ASFV의 유전자는 본 발명에 따라 파괴되는 유전자를 제외하면, 야생형 균주의 유전자와 동일할 수 있다. 본 발명의 약독화된 ASFV의 유전자는 유전자 EP153R 및 EP402R을 제외하면, 야생형 균주의 유전자와 동일한 것일 수 있다. 본 발명의 약독화된 ASFV의 유전자는 유전자 EP153R, EP402R 및 K145R을 제외하면, 야생형 균주의 유전자와 동일한 것일 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 약독화된 ASFV의 유전자는 EP153R 및 EP402R을 제외하면, 야생형 균주의 유전자와 동일한 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 약독화된 ASFV의 유전자는 EP153R, EP402R 및 K145R을 제외하면, 야생형 균주의 유전자와 동일한 것이다.
파괴된 유전자는 또한 야생형 균주에 상응할 수 있다. 한 실시양태에서, 유전자 EP153R 및 EP402R은 야생형 균주에 상응한다. 상기 실시양태에서 (즉, EP153R 및 EP402R이 야생형 균주에 상응하는 경우), EP153R 및 EP402R의 발현 및/또는 활성은 예컨대, 프로모터와 같은 유전자간 영역 및/또는 비-코딩 서열에서 하나 이상의 돌연변이에 의해 파괴될 수 있다. 다시 말해, EP153R 및 EP402R 유전자는 야생형 게놈과 동일하지만, 비유전자 서열의 돌연변이에 의해 발현 또는 활성이 변경된다. 따라서, 본 발명의 약독화된 ASFV의 유전자는 모두 야생형 균주의 유전자와 동일한 것일 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 약독화된 ASFV의 유전자는 모두 야생형 균주의 유전자와 동일한 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 약독화된 ASFV의 유전자는 모두 K145R 유전자를 제외하면, 야생형 균주의 유전자와 동일한 것이다.
"본질적으로 ~에 상응하는"이라는 용어는 게놈의 나머지 부분이 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다는 추가적 예외를 제외하면, "~에 상응하는"과 동일한 것을 의미한다. 하나 이상의 돌연변이는 다른 유전자에 있을 수 있다 (즉, 유전자 EP153R 및 EP402R에는 없을 수 있거나, 또는 유전자 EP153R, EP402R 및 K145R에는 없을 수 있다).
약독화된 ASFV의 게놈은 유전자형 I에 상응하거나, 또는 본질적으로 그에 상응할 수 있다. 약독화된 ASFV의 게놈은 유전자형 II에 상응하거나, 또는 본질적으로 그에 상응할 수 있다. 약독화된 ASFV의 게놈은 유전자형 III에 상응하거나, 또는 본질적으로 그에 상응할 수 있다. 약독화된 ASFV의 게놈은 유전자형 IV에 상응하거나, 또는 본질적으로 그에 상응할 수 있다. 약독화된 ASFV의 게놈은 유전자형 V에 상응하거나, 또는 본질적으로 그에 상응할 수 있다. 약독화된 ASFV의 게놈은 유전자형 VI에 상응하거나, 또는 본질적으로 그에 상응할 수 있다. 약독화된 ASFV의 게놈은 유전자형 VII에 상응하거나, 또는 본질적으로 그에 상응할 수 있다. 약독화된 ASFV의 게놈은 유전자형 VIII에 상응하거나, 또는 본질적으로 그에 상응할 수 있다. 약독화된 ASFV의 게놈은 유전자형 IX에 상응하거나, 또는 본질적으로 그에 상응할 수 있다. 약독화된 ASFV의 게놈은 유전자형 X에 상응하거나, 또는 본질적으로 그에 상응할 수 있다. 약독화된 ASFV의 게놈은 유전자형 XIV에 상응하거나, 또는 본질적으로 그에 상응할 수 있다.
약독화된 ASFV의 게놈은 유전자형 I에 상응하거나, 또는 본질적으로 그에 상응할 수 있다. 약독화된 ASFV의 게놈은 유전자형 II에 상응하거나, 또는 본질적으로 그에 상응할 수 있다.
바람직하게, 약독화된 ASFV의 게놈은 유전자형 II에 상응하거나, 또는 본질적으로 그에 상응할 수 있다.
본 발명의 약독화된 ASFV의 게놈은 병독성 ASFV 균주의 것에 상응하거나, 또는 본질적으로 그에 상응할 수 있다. 공지된 병독성 ASF 바이러스 균주는 Georgia 2007/1, Benin 97/1, Kenyan, Malawi Lil20/1, Pretorisuskop/96/4 및 Tengani 62를 포함한다. 약독화된 ASFV의 게놈은 Benin 97/1 균주의 것에 상응하거나, 또는 본질적으로 그에 상응할 수 있다.
약독화된 ASFV의 게놈은 Georgia 2007/1 균주의 것에 상응하거나, 또는 본질적으로 그에 상응할 수 있다.
본 발명의 약독화된 ASFV의 게놈은 그의 병독성이 현재 공지되어 있지 않은 ASFV 균주, 예를 들어: Mkuzi, Warmbaths 및 Warthog의 것에 상응하거나, 또는 본질적으로 그에 상응할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 약독화된 ASFV의 게놈은 OURT88/3의 것에 상응하지 않는다. 한 실시양태에서, 본 발명의 약독화된 ASFV의 게놈은 NH/P68의 것에 상응하지 않는다. 한 실시양태에서, 본 발명의 약독화된 ASFV는 OURT88/3이 아니다. 한 실시양태에서, 본 발명의 약독화된 ASFV는 NH/P68이 아니다. 한 실시양태에서, 본 발명의 약독화된 ASFV는 OURT88/3도 NH/P68도 아니다.
EP402R
특정 측면에서, 본 발명은 EP402R 유전자의 발현 및/또는 활성이 파괴된 ASF 바이러스를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 특정 아미노산 변이를 포함하는 EP402R 단백질을 제공한다.
EP402R 유전자는 바이러스의 외부 층에 혼입되고, 포유동물 T-림프구 표면 부착 수용체 CD2와 부분적으로 유사한 단백질을 코딩한다. 특히, EP402R 단백질의 N-말단 세포외 영역은 CD2의 세포외 리간드 결합 영역과 유사한 2개의 면역글로불린 유사 (Ig 유사) 도메인으로 이루어진다. EP402R 단백질은 이러한 유사성으로 인해 CD2v로 지칭될 수 있다. 따라서, 용어 "EP402R" 및 "CD2v"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. EP402R 단백질의 N-말단 세포외 도메인은 "리간드 결합 도메인"으로서 지칭될 수 있다. EP402R 단백질의 세포질 도메인은 CD2와 유사하지 않다.
EP402R은 면역원성이다 (즉, 면역 반응을 유발한다) (Netherton et al. 2019 Front. Immunol. 10, 1318). EP402R은 혈구흡착에 필요하고, 그에 직접적으로 관여하며 (Sereda et al. 2018 Slov. Vet. Res, 55(3) 141-150), 바이러스 진입 또는 확산에서 역할을 할 수 있다. 혈구흡착을 억제하는 ASFV 감염된 돼지로부터의 항체는 돼지 방어에서 EP402R에 대한 항체의 역할을 지원하는 다양한 균주에 대해 유도된 방어와 상관관계가 있을 수 있다 (Malogolovkin et al. 2015 J. Gen. Virol. 96(4) 866-873, Burmakina et al. 2016 J. Gen. Virol. 97(7) 1670-1675). EP402R은 숙주 단백질 AP-1에 결합할 수 있다. EP402R의 기능은 포유동물 CD2가 세포외 부착 분자에 결합하는 것과 동일한 방식으로 리간드에 결합하는 그의 세포외, N-말단, Ig 유사 도메인에 의해 매개될 수 있다.
EP402R 유전자 서열
상이한 ASFV 균주로부터의 EP402R 유전자의 게놈내 유전자 (즉, 뉴클레오티드) 서열 및 위치가 하기에 제시되어 있다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
한 실시양태에서, 본 발명은 EP402R 유전자의 발현 및/또는 활성이 파괴된 ASF 바이러스를 제공한다. 적합하게, EP402R 유전자는 서열식별번호 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240 또는 241의 서열을 포함한다. 적합하게, EP402R 유전자는 서열식별번호 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240 또는 241과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 적합하게, EP402R 유전자는 서열식별번호 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240 또는 241의 서열로 이루어진다.
본 발명의 ASFV의 한 실시양태에서, EP402R 유전자는 부분적으로 또는 완전히 결실될 수 있다. 적합하게, 서열식별번호 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240 또는 241의 서열의 일부 또는 그들 모두는 ASFV 게놈으로부터 제거된다. 적합하게, ASFV 게놈에는 상기 서열 중 임의의 것이 결여되어 있다.
EP402R 단백질 서열
상이한 ASFV 균주로부터의 EP402R 단백질의 아미노산 서열이 하기에 서열식별번호 21 내지 30 및 서열식별번호 242 내지 246으로 제시되어 있다.
Figure pct00007
Figure pct00008
한 실시양태에서, 본 발명은 EP402R 유전자의 발현 및/또는 활성이 파괴된 약독화된 ASF 바이러스를 제공한다. 적합하게, EP402R 유전자는 서열식별번호 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 242, 243, 244, 245 또는 246 중 임의의 것과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 단백질을 코딩한다. 적합하게, EP402R 유전자는 서열식별번호 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 242, 243, 244, 245 또는 246 중 임의의 것의 서열을 포함하는 단백질을 코딩한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 ASFV는 EP402R 단백질을 발현하지 않는다. 다시 말해, 본 발명의 ASFV는 서열식별번호 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 242, 243, 244, 245 또는 246의 서열을 갖는 단백질을 발현하지 않는다.
EP402R 돌연변이체 단백질
한 측면에서, 본 발명은 리간드 결합 도메인 중 하나 이상의 아미노산 변이를 포함하는 EP402R 단백질로서, 여기서, 아미노산 변이는 EP402R 단백질의 리간드 결합을 파괴하는 것인 EP402R 단백질을 제공한다.
EP402R의 리간드 결합 도메인은 위치 1 (N-말단)에서 시작하여 대략 위치 200까지 이어지는 아미노산에 의해 형성된다. 예를 들어, 하기 서열식별번호 34로 제공되는 Benin 97/1 EP402R의 리간드 결합 도메인은 서열식별번호 21의 아미노산 1-198에 의해 형성된다.
Figure pct00009
하기 서열식별번호 380으로 제공되는 Georgia 2007/1 EP402R의 리간드 결합 도메인은 서열식별번호 24의 아미노산 1-203에 의해 형성된다.
Figure pct00010
적합하게, EP402R 단백질의 리간드 결합 도메인은 서열식별번호 34 또는 380의 서열을 포함한다. 적합하게, EP402R 단백질의 리간드 결합 도메인은 서열식별번호 34 또는 380과 적어도 70%, 80%, 90% 또는 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 다른 균주로부터의 EP402R 단백질의 리간드 결합 도메인은 예컨대, 도 3에 제시된 바와 같이, Benin 97/1 EP402R 단백질 및/또는 Georgia 2007/1 EP402R 단백질의 서열과의 정렬에 의해 쉽게 확인될 수 있다.
적합하게, 야생형 EP402R 단백질과 비교하여 EP402R 단백질의 리간드 결합 도메인 중의 하나 이상의 아미노산 (예컨대, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 아미노산)이 변이된다. 한 실시양태에서, 리간드 결합 도메인 중 하나 이상의 아미노산이 결실된다 (즉, 완전히 제거된다). 한 실시양태에서, 리간드 결합 도메인 중 하나 이상의 아미노산이 상이한 아미노산으로 변이된다 (즉, 대체된다). 상기 아미노산 변이는 치환으로 지칭될 수 있다. EP402R 단백질의 리간드 결합 도메인 중 하나 이상의 아미노산의 변이는 EP402R 단백질의 발현 및/또는 활성을 파괴시킬 수 있다. 한 실시양태에서, EP402R 단백질의 리간드 결합 도메인 중 하나 이상의 아미노산의 변이는 EP402R 단백질에 의해 매개되는 혈구흡착을 파괴시킬 수 있다.
EP402R 단백질 중 아미노산 변이는 EP402R 단백질을 코딩한 서열 중 하나 이상의 돌연변이에 의해 유발된다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 본원에 기재된 바와 같은 결실 또는 중단일 수 있다. 예를 들어, EP402R 단백질의 리간드 결합 도메인에 대한 코딩 서열의 일부가 결실되면 리간드 결합 도메인으로부터 코딩된 아미노산이 부재하게 되며 (즉, 아미노산 변이), 이는 리간드 결합을 파괴시킬 수 있다.
한 실시양태에서, 돌연변이 중 하나 이상은 점 돌연변이일 수 있다. 적합하게, 돌연변이 중 하나 이상은 단일 아미노산을 상이한 아미노산으로 변이시키는 점 돌연변이일 수 있다. 심지어 단일 아미노산 변이만으로도 EP402R 단백질의 발현 및/또는 활성, 예컨대, 리간드 결합 활성은 파괴될 수 있다.
하나 이상의 아미노산 변이는 EP402R 단백질의 폴딩을 파괴시킬 수 있다. 폴딩 파괴는 EP402R 단백질이 전혀 폴딩하지 못함에 따라 이는 세포 단백질 분해 기계에 의해 분해된다는 것을 의미할 수 있다. 대안적으로, 폴딩 파괴는 EP402R 단백질이 다르게 폴딩되어 그의 기능을 손상시키거나, 또는 EP402R 단백질이 더 천천히 폴딩됨에 따라 올바르게 발현되지 않다는 것 (예컨대, 세포 표면에서 발현되지 않는다는 것)을 의미할 수 있다.
하전된 아미노산의 반대 전하를 갖는 아미노산으로의 변이는 EP402R 리간드-도메인의 폴딩을 파괴할 수 있으며, 이로써, 결합 포켓이 변형되고, 이는 입체 장애로 인한 리간드 결합을 방해할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 반대 전하를 갖는 아미노산으로의 치환은 리간드의 정전기적 결합을 방해할 수 있다. 또 다른 가능성은 작은 측쇄가 있는 아미노산의 벌키한 측쇄가 있는 아미노산으로의 변이, 또는 그 반대로 이루어지는 변이는 EP402R 리간드 결합 도메인의 폴딩을 파괴할 수 있으며, 이로써, 결합 포켓이 형성되지 않고, 이는 리간드 결합을 방해한다.
따라서, 한 실시양태에서, 리간드 결합 도메인 중 하나 이상의 변이된 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 변이되는 음으로 하전된 아미노산을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 리간드 결합 도메인 중 하나 이상의 변이된 아미노산은 음으로 하전된 아미노산으로 변이되는 양으로 하전된 아미노산을 포함할 수 있다. 양으로 하전된 아미노산 (즉, 양전하를 가질 수 있는 아미노산)은 히스티딘 (H), 리신 (K) 및 아르기닌 (R)을 포함한다. 음으로 하전된 아미노산 (즉, 음전하를 가질 수 있는 아미노산)은 아스파르트산 (D) 및 글루탐산 (E)을 포함한다.
한 실시양태에서, 리간드 결합 도메인 중 하나 이상의 변이된 아미노산은 벌키한 측쇄가 있는 아미노산으로 변이되는 작은 측쇄가 있는 아미노산을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 리간드 결합 도메인 중 하나 이상의 변이된 아미노산은 작은 측쇄가 있는 아미노산으로 변이되는 벌키한 측쇄가 있는 아미노산을 포함할 수 있다. 벌키한 측쇄가 있는 아미노산은 트립토판 (W)을 포함한다. 작은 측쇄가 있는 아미노산은 글리신 (G) 및 알라닌 (A)을 포함한다.
한 실시양태에서, 리간드 결합 도메인 중 하나 이상의 변이된 아미노산은 소수성 측쇄가 있는 아미노산으로 변이되는 친수성 측쇄가 있는 아미노산을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 리간드 결합 도메인 중 하나 이상의 변이된 아미노산은 친수성 측쇄가 있는 아미노산으로 변이되는 소수성 측쇄가 있는 아미노산을 포함할 수 있다. 소수성 측쇄가 있는 아미노산은 알라닌 (A), 발린 (V), 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y) 및 트립토판 (W)을 포함한다. 친수성 측쇄가 있는 아미노산은 아르기닌 (R), 히스티딘 (H), 리신 (K), 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E), 세린 (S), 트레오닌 (T), 아스파라긴 (N) 및 글루타민 (Q)을 포함한다.
아미노산 E99의 R로의 변이, 또는 아미노산 Y102의 D로의 변이는 Benin 97/1 균주로부터의 EP402R 단백질의 혈구흡착을 매개하는 능력을 파괴시킨다 (도 2 참조). 추가로, 아미노산 Q96의 R로의 변이는 Georgia 2007/1 균주로부터의 EP402R 단백질의 혈구흡착을 매개하는 능력을 파괴시킨다 (도 4 및 7 참조). Georgia 2007/1 EP402R의 아미노산 W99의 D로의 변이는 EP402R의 폴딩을 파괴시킬 수 있고, 이로써, 발현 및/또는 활성이 파괴될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 EP402R 단백질은 Georgia 2007/1 EP402R 단백질 (서열식별번호 24)의 Q96 및/또는 W99에 상응하는 위치에 아미노산 변이를 포함한다. Georgia 2007/1 EP402R 단백질의 Q96은 Benin 97/1 EP402R 단백질의 E99에 상응하고, Georgia 2007/1 EP402R 단백질의 W99는 Benin 97/1 EP402R 단백질의 Y102에 상응한다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 EP402R 단백질은 Benin 97/1 EP402R 단백질 (서열식별번호 21)의 E99 및/또는 Y102에 상응하는 위치에 아미노산 변이를 포함한다. 다시 말해, 본 발명의 약독화된 ASF 바이러스에 의해 발현된 EP402R 단백질은 임의의 ASF 바이러스 균주로부터의 EP402R 단백질일 수 있으며, 변이된 아미노산은 본원에서 서열식별번호 24로서 제공되는 Georgia 2007/1 EP402R 단백질의 아미노산 서열의 Q96 및/또는 W99에 상응한다. 대안적으로 표현하면, 본 발명의 약독화된 ASF 바이러스에 의해 발현된 EP402R 단백질은 임의의 ASF 바이러스 균주로부터의 EP402R 단백질일 수 있으며, 변이된 아미노산은 본원에서 서열식별번호 21로서 제공되는 Benin 97/1 균주로부터의 EP402R 단백질의 아미노산 서열의 E99 및/또는 Y102에 상응한다. 위치 Q96 및 W99는 각각 Georgia 2007/1 EP402R 단백질의 위치 96 및 99의 아미노산 글루타민 및 트립토판을 지칭한다. 위치 E99 및 Y102는 각각 Benin 97/1 EP402R 단백질의 위치 99 및 102의 아미노산 글루탐산 및 티로신을 지칭한다.
아미노산이 Georgia 2007/1 EP402R 단백질의 Q96 및/또는 W99에 (또는 Benin 97/1 EP402R 단백질의 E99 및/또는 Y102에) 상응하는지 여부는 서열 정렬에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 도 3은 Benin, Mkuzi, Warmbaths, Tengnani, Warthog, Georgia 및 Malawi 균주로부터의 EP402R 단백질의 정렬을 보여주는 것이다. Georgia 2007/1 EP402R 단백질의 Q96 및 Benin 97/1 EP402R 단백질의 E99에 상응하는, 각 균주로부터의 EP402R 단백질 중의 아미노산은 Benin E99 잔기 아래 제시된 아미노산 (황색으로 강조 표시)이다. Georgia 2007/1 EP402R 단백질의 W99 및 Benin 97/1 EP402R 단백질의 Y102에 상응하는, 각 균주로부터의 EP402R 단백질 중의 아미노산은 Benin Y102 잔기 아래 제시된 아미노산 (황색으로 강조 표시된 아미노산의 우측으로 3개의 아미노산). Georgia 2007/1 EP402R 단백질의 Q96 및/또는 W99, 및 Benin 97/1 EP402R 중 E99 및 Y102에 상응하는 도 3에서 상기 균주로부터의 EP402R 단백질 중의 아미노산은 하기 표 2에 제시되어 있다.
<표 2>
Figure pct00011
Georgia 2007/1 EP402R 단백질의 Q96 및/또는 W99, 및 Benin 97/1 EP402R의 E99 및 Y102에 상응하는 아미노산은 도 3에 제시되고, 상기 표 2에 열거된 것 이외의 다른 균주 (예컨대, 본원 표 1에 열거된 다른 균주)로부터의 EP402R 단백질에 존재한다. 통상의 기술자는 서열 정렬을 사용하여 주어진 균주, 예컨대, 표 1로부터의 균주로부터의 EP402R 단백질 중의 어느 아미노산이 Georgia 2007/1 EP402R 단백질의 Q96 및/또는 W99, 및 Benin 97/1 EP402R의 E99 또는 Y102에 상응하는지를 쉽게 결정할 수 있다. 상응하는 아미노산은 Georgia 2007/1 EP402R의 Q96 또는 W99, 또는 Benin 97/1 EP402R의 E99 또는 Y102와 동일할 수 있다. 예를 들어, Georgia 2007/1 EP402R의 Q96에 상응하는 아미노산은 또한 Q (글루타민)일 수 있다. 상응하는 아미노산은 Q96 또는 W99와 유사할 수 있다. 적합하게, 상응하는 아미노산은 Q96 또는 W99와 동일한 전하를 갖는다. 적합하게, Q96에 상응하는 아미노산은 E (글루탐산)이다. 적합하게, W99에 상응하는 아미노산은 Y (티로신)이다. "Georgia 2007/1 EP402R 단백질의 Q96 및/또는 W99에 상응하는"이라는 표현은 Georgia 2007/1 EP402R 단백질의 Q96 및/또는 W99를 포함한다. "Benin 97/1 EP402R 단백질의 E99 및/또는 Y102에 상응하는"이라는 표현은 Benin 97/1 EP402R 단백질의 E99 및/또는 Y102를 포함한다.
적합하게, Q96에 상응하는 위치의 아미노산은 R로, 또는 R의 보존적 대체인 아미노산으로 변이되고/거나, W99에 상응하는 위치의 아미노산은 D로, 또는 D의 보존적 대체인 아미노산으로 변이된다. "보존적 대체"인 아미노산은 다른 아미노산과 유사한 특징을 갖는다. 예를 들어, 보존적 대체는 유사한 전하 (양 또는 음), 유사한 소수성 (친수성 또는 소수성) 또는 유사한 분자 크기를 가질 수 있고, 또한 방향족이거나, 또는 상기 특징의 조합을 가질 수 있다. 적합하게, Q96에 상응하는 위치의 아미노산은 H, K 또는 R로 변이되고/거나, W99에 상응하는 위치의 아미노산은 D, E, N 또는 Q로 변이된다. 적합하게, Q96에 상응하는 위치의 아미노산은 R로 변이되고/거나, W99에 상응하는 위치의 아미노산은 D로 변이된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 EP402R 단백질은 서열식별번호 21 내지 30 또는 서열식별번호 242 내지 246 (즉, 본원에 기재된 바와 같은 상이한 ASFV 균주로부터의 EP402R 단백질의 서열) 중 임의의 것과 적어도 70%의 서열 동일성, 예컨대, 적어도 75%의 동일성, 예컨대, 적어도 80%의 동일성, 예컨대, 적어도 85%의 동일성, 예컨대, 적어도 90%의 동일성, 예컨대, 적어도 95%의 동일성, 예컨대, 적어도 96%의 동일성, 예컨대, 적어도 97%의 동일성, 예컨대, 적어도 98%의 동일성, 예컨대, 적어도 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게, 본 발명의 EP402R 단백질은 서열식별번호 21과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게, 본 발명의 EP402R 단백질은 서열식별번호 22와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게, 본 발명의 EP402R 단백질은 서열식별번호 23과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게, 본 발명의 EP402R 단백질은 서열식별번호 24와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게, 본 발명의 EP402R 단백질은 서열식별번호 25와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게, 본 발명의 EP402R 단백질은 서열식별번호 26과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게, 본 발명의 EP402R 단백질은 서열식별번호 27과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게, 본 발명의 EP402R 단백질은 서열식별번호 28과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게, 본 발명의 EP402R 단백질은 서열식별번호 29와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게, 본 발명의 EP402R 단백질은 서열식별번호 30과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게, 본 발명의 EP402R 단백질은 서열식별번호 242와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게, 본 발명의 EP402R 단백질은 서열식별번호 243과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게, 본 발명의 EP402R 단백질은 서열식별번호 244와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게, 본 발명의 EP402R 단백질은 서열식별번호 245와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게, 본 발명의 EP402R 단백질은 서열식별번호 246과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 기준 서열 (즉, 서열식별번호 21 내지 30 또는 서열식별번호 242 내지 246)과, 기준 서열과 100% 미만으로 동일한 서열 사이에 상이한 아미노산이 보존적 대체이다.
E99R 아미노산 변이를 포함하는 Benin 97/1 균주로부터의 EP402R 단백질의 아미노산 서열은 하기 서열식별번호 31로서 제시되어 있다.
Figure pct00012
Y102D 치환을 포함하는 Benin 97/1 균주로부터의 EP402R 단백질의 아미노산 서열은 하기 서열식별번호 32로서 제시되어 있다.
Figure pct00013
Q96R 치환을 포함하는 Georgia 2007/1 균주로부터의 EP402R 단백질의 아미노산 서열은 하기 서열식별번호 33으로서 제시되어 있다.
Figure pct00014
W99D 치환을 포함하는 Georgia 2007/1 균주로부터의 EP402R 단백질의 아미노산 서열은 하기 서열식별번호 379로서 제시되어 있다.
Figure pct00015
한 실시양태에서, 본 발명의 EP402R 단백질은 서열식별번호 31, 32, 33 또는 379 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다. 적합하게, 본 발명의 EP402R 단백질은 서열식별번호 31 (E99R 아미노산 변이를 갖는 Benin 97/1 EP402R 단백질)의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 그로 이루어진다. 적합하게, 본 발명의 EP402R 단백질은 서열식별번호 32 (Y102D 아미노산 변이를 갖는 Benin 97/1 EP402R 단백질)의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 그로 이루어진다. 적합하게, 본 발명의 EP402R 단백질은 서열식별번호 33 (Q96R 아미노산 변이를 갖는 Georgia 2007/1 EP402R 단백질)의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 그로 이루어진다. 적합하게, 본 발명의 EP402R 단백질은 서열식별번호 379 (W99D 아미노산 변이를 갖는 Georgia 2007/1 EP402R 단백질)의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 그로 이루어진다.
한 실시양태에서, 본 발명의 EP402R 단백질은 Benin 97/1 EP402R 단백질 (서열식별번호 21)의 N16, I19, W21, Y76, E99, Y102 및/또는 N108에 상응하는 EP402R 단백질 중의 위치에 하나 이상의 아미노산 변이를 포함한다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 Benin 97/1 균주의 EP402R 단백질의 위치 N16, I19, W21, Y76, E99, Y102 및/또는 N108, 또는 임의의 다른 ASFV 균주의 EP402R 단백질 중의 상응하는 위치의 아미노산을 변이시킨다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 Georgia 2007/1 EP402R 단백질 (서열식별번호 24)의 S15, W19, Q96, N104, 및/또는 K108D에 상응하는 EP402R 단백질 중의 위치의 아미노산을 변이시킨다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 Georgia 2007/1 EP402R 단백질 (서열식별번호 24)의 EP402R 단백질의 위치 S15, W19, Q96, N104, 및/또는 K108D, 또는 임의의 다른 ASFV 균주의 EP402R 단백질 중의 상응하는 위치의 아미노산을 변이시킨다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 N10 유전자형 IX EP402R 단백질 (서열식별번호 27)의 W20, Q112, N121 및/또는 R125에 상응하는 EP402R 단백질 중의 위치의 아미노산을 변이시킨다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 N10 유전자형 IX EP402R 단백질 (서열식별번호 27)의 EP402R 단백질의 위치 S15, W19, Q96, N104, 및/또는 K108D, 또는 임의의 다른 ASFV 균주의 EP402R 단백질 중의 상응하는 위치의 아미노산을 변이시킨다. 상기 아미노산은 EP402R 단백질의 리간드 결합 도메인 중에 존재하고, 표면 노출되어 있다.
적합하게, 돌연변이는 Benin 97/1 EP402R 단백질 (서열식별번호 11) 중의 위치에 상응하는 위치의 N16R, I19R, W21D, Y 76D, E99R, Y102D 및/또는 N108R로부터 선택된다. 적합하게, 돌연변이는 Georgia 2007/1 EP402R 단백질 (서열식별번호 11) 중의 위치에 상응하는 위치의 E99R 및 N108R의 조합이다.
적합하게, 돌연변이는 Georgia 2007/1 EP402R 단백질 (서열식별번호 24) 중의 위치에 상응하는 위치의 S15R, W19D, Q96R, N104R 및/또는 K108D로부터 선택된다. 적합하게, 돌연변이는 Georgia 2007/1 EP402R 단백질 (서열식별번호 24) 중의 위치에 상응하는 위치의 Q96R 및 N104R의 조합이다.
적합하게, 돌연변이는 N10 유전자형 IX EP402R 단백질 (서열식별번호 27) 중의 위치에 상응하는 위치의 W20D, Q112R, N121R 및/또는 R125D로부터 선택된다. 적합하게, 돌연변이는 N10 유전자형 IX EP402R 단백질 (서열식별번호 27) 중의 위치에 상응하는 위치의 Q112R 및 N121R의 조합이다.
적합하게, 약독화된 ASFV가 유전자형 I인 경우, 하나 이상의 돌연변이는 Benin 97/1 EP402R 단백질 (서열식별번호 11)의 Y76, E99, Y102, 및/또는 N108에 상응하는, EP402R 단백질 중의 위치의 아미노산을 변이시킨다. 적합하게, 약독화된 ASFV가 유전자형 I인 경우, 돌연변이는 Benin 97/1 EP402R 단백질 (서열식별번호 11) 중의 위치에 상응하는 위치의 Y76D, E99R, Y102D, 및/또는 N108R로부터 선택된다.
적합하게, 약독화된 ASFV가 유전자형 II인 경우, 하나 이상의 돌연변이는 Georgia 2007/1 EP402R 단백질 (서열식별번호 24)의 S15, W19, Q96, N104, 및/또는 K108D에 상응하는, EP402R 단백질 중의 위치의 아미노산을 변이시킨다. 적합하게, 약독화된 ASFV가 유전자형 II인 경우, 돌연변이는 Georgia 2007/1 EP402R 단백질 (서열식별번호 24) 중의 위치에 상응하는 위치의 S15R, W19D, Q96R, N104R 및/또는 K108D로부터 선택된다. 적합하게, 약독화된 ASFV가 유전자형 II인 경우, 돌연변이는 Georgia 2007/1 EP402R 단백질 (서열식별번호 24) 중의 위치에 상응하는 위치의 Q96R 및 N104R의 조합일 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 EP402R 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 적합하게, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호 229 내지 241 중 임의의 것 (즉, ASFV의 상이한 균주로부터의 EP402R 유전자의 코딩 서열)과 적어도 70%의 동일성, 예컨대, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 적합하게, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호 229 (즉, Georgia 2007/1 EP402R 유전자의 코딩 서열)과 적어도 70%의 동일성, 예컨대, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 적합한 벡터는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 세포, 예컨대, 관련 기술분야에 공지된 다른 세포 유형 중에서 박테리아, 효모 또는 척추동물 세포, 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 세포 유형에서에서 단백질 발현을 위한 플라스미드를 포함한다.
돌연변이된 EP402R을 포함하는 ASF 바이러스
또 다른 측면에서, 본 발명은 예컨대, 상기 기재된 바와 같은, 본 발명의 EP402R 단백질을 포함하는 ASF 바이러스를 제공한다. 유사한 측면에서, 본 발명은 예컨대, 상기 기재된 바와 같은, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 ASF 바이러스를 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 약독화된 ASF 바이러스로서, 여기서, 바이러스는 본 발명의 EP402R 단백질, 예컨대, 상기 기재된 EP402R 단백질을 발현하도록 돌연변이된 EP402R 유전자를 포함하는 것인, 약독화된 ASF 바이러스를 제공한다.
통상의 기술자는 본 개시내용으로부터 관련 기술분야에 공지된 분자 생물학 기술을 사용하여 EP402R 유전자의 코딩 서열을 적절하게 변형시킴으로써 본원에 기재된 임의의 아미노산 변이를 포함하는 EP402R 단백질을 발현하도록 ASF 바이러스가 돌연변이될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명은 본원에 개시된 본 발명의 임의의 EP402R 단백질을 포함하는 ASF 바이러스를 포함한다. 추가로, 통상의 기술자는 본원에 기재된 임의의 EP402R 단백질이 본원에 기재된 ASF 바이러스에 대한 다른 변형, 특히, K145R 및 EP153R 유전자의 변형과 함께 본 발명의 ASF 바이러스에서 조합될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 추가로, 본 발명의 아미노산 변이를 포함하는 EP402R 단백질을 포함하는 본 발명의 ASFV는 약독화될 수 있다.
본 발명의 ASF 바이러스의 한 실시양태에서, EP402R 유전자는 EP402R 단백질의 리간드 결합 도메인 중 하나 이상의 아미노산을 변이시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 적합하게, EP402R 유전자는 EP402R 단백질의 리간드 결합 도메인 중 하나 이상의 아미노산 (예컨대, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 아미노산)을 변이시키는 하나 이상의 돌연변이 (예컨대, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 돌연변이)를 포함한다.
본 발명의 ASF 바이러스의 실시양태에서, ASF 바이러스는 본원에 기재된 임의의 방식으로 EP402R 단백질 중 하나 이상의 아미노산을 변이시키는 하나 이상의 돌연변이를 EP402R 유전자 중에 포함한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, EP402R 유전자 중의 하나 이상의 돌연변이는 Georgia 2007/1 균주의 EP402R 단백질의 위치 Q96 및/또는 W99, 또는 임의의 다른 ASFV 균주의 EP402R 단백질 중의 상응하는 위치의 아미노산을 변이시킨다. 한 실시양태에서, EP402R 유전자 중의 하나 이상의 돌연변이는 Georgia 2007/1 균주 (서열식별번호 24)의 EP402R 단백질의 위치 Q96의 아미노산을 R로 변이시킨다.
EP402R의 활성
본 발명의 ASFV의 한 실시양태에서, EP402R 활성은 파괴된다.
한 실시양태에서, 파괴되는 EP402R의 활성은 혈구흡착을 매개하는 그의 능력이다. 다시 말해, 혈구흡착을 매개하는 EP402R의 능력은 감소될 수 있다. 혈구흡착을 매개하는 EP402R의 능력은 적어도 50, 60, 70, 80 또는 90%만큼 감소될 수 있다. 혈구흡착을 매개하는 EP402R의 능력은 완전히 폐기될 수 있다.
파괴되는 EP402R의 활성은 EP402R 단백질이 그의 세포외 N-말단 Ig 유사 도메인 (즉, 그의 리간드 결합 도메인)을 통해 리간드에 결합하는 능력일 수 있다. 따라서, 본 실시양태에서, 본 발명은 EP402R 유전자가 EP402R 단백질에 의한 리간드 결합을 파괴하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 것인 약독화된 ASF 바이러스를 제공한다. 하나 이상의 리간드에 결합할 수 있는 EP402R 단백질의 능력은 파괴될 수 있다. 하나 이상의 리간드에 결합할 수 있는 EP402R 단백질의 능력은 적어도 50, 60, 70, 80 또는 90%만큼 감소될 수 있다. 하나 이상의 리간드에 결합할 수 있는 EP402R 단백질의 능력은 완전히 폐기될 수 있다. 하나 이상의 리간드에 결합할 수 있는 EP402R 단백질의 능력은, 다른 리간드에 결합할 수 있는 능력은 보유하면서, 완전히 폐기될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명은 EP402R 유전자가 EP402R 단백질에 의한 리간드 결합을 파괴하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 것인 약독화된 ASF 바이러스를 제공한다. 리간드 결합은 예컨대, 면역침전, 표면 플라즈몬 공명 및/또는 등온 열량측정법과 같은 검정법을 사용하여 측정할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 EP402R 단백질에서 변이된 아미노산이 본원에 기재된 바와 같이 EP402R 상의 결합 표면을 변경함으로써 EP402R과 그의 리간드 사이의 상호작용을 직접 억제하는 것인 ASF 바이러스를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 EP402R 유전자의 발현 및/또는 활성이 파괴되지 않은 상응하는 ASF 바이러스와 비교하여 EP402R 단백질의 표면 발현이 감소된 ASF 바이러스를 제공한다. EP402R의 "표면 발현"은 ASF 바이러스에 감염된 세포의 표면에서의 EP402R 단백질의 발현을 지칭한다. EP402R의 표면 발현은 예컨대, 감염된 세포의 항체 염색과 같은 관련 기술분야에 공지된 기술에 의해 측정될 수 있다 (예를 들어, 도 8 및 실시예 3 참조).
EP153R
특정 측면에서, 본 발명은 EP153R 유전자의 발현 및/또는 활성이 파괴된 ASF 바이러스를 제공한다.
EP153R 유전자는 감염 초기 및 후기, 둘 모두에서 발현된다. EP153R은 8CR로도 지칭될 수 있다. EP153R 단백질은 C형 렉틴이다. C형 동물 렉틴은 혈청, 세포외 기질 및 세포막에서 발견되며, 탄수화물 리간드에 대한 수용체로 작용하는 것으로 간주된다. EP153R 단백질은 C형 렉틴 도메인, 세포 부착 서열 (RGD) 및 막횡단 도메인을 포함하며, T 세포 활성화에 관여하는 CD44 분자와 유사성을 갖는다.
상이한 ASFV 균주로부터의 EP153R 유전자의 게놈내 유전자 (즉, 뉴클레오티드) 서열 및 위치가 하기에 제시되어 있다.
Figure pct00016
Figure pct00017
한 실시양태에서, 본 발명은 EP153R 유전자의 발현 및/또는 활성이 파괴된 ASF 바이러스를 제공한다. 적합하게, EP153R 유전자는 서열식별번호 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215 또는 216의 서열을 포함한다. 적합하게, EP153R 유전자는 서열식별번호 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215 또는 216과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 적합하게, EP153R 유전자는 서열식별번호 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215 또는 216의 서열로 이루어진다.
본 발명의 ASFV의 한 실시양태에서, EP153R 유전자는 부분적으로 또는 완전히 결실될 수 있다. 적합하게, 서열식별번호 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215 또는 216의 서열의 일부 또는 그들 모두는 ASFV 게놈으로부터 제거된다. 적합하게, ASFV 게놈에는 상기 서열 중 임의의 것이 결여되어 있다.
ASFV의 상이한 균주로부터의 EP153R 단백질의 수탁 번호는 하기 표 3에 열거되어 있다.
<표 3>
Figure pct00018
상이한 ASFV 균주로부터의 EP153R 단백질의 아미노산 서열이 하기 제시되어 있다.
Figure pct00019
Figure pct00020
적합하게, EP153R 유전자는 서열식별번호 20, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225 226, 227 또는 228의 서열을 포함하는 단백질을 코딩한다. 적합하게, EP153R 유전자는 서열식별번호 20, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225 226, 227 또는 228과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 단백질을 코딩한다. 적합하게, EP153R 유전자는 서열식별번호 20, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225 226, 227 또는 228의 서열로 이루어진 단백질을 코딩한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 ASFV는 EP153R 단백질을 발현하지 않는다. 다시 말해, 본 발명의 ASFV는 서열식별번호 20, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225 226, 227 또는 228의 서열을 갖는 단백질을 발현하지 않는다.
EP153R은 면역원성이다 (즉, 면역 반응을 유발한다) (Burmakina et al. 2019 J. Gen. Virol. 100: 259-265). EP153R은 ASFV 감염 동안 카스파제-3 활성화를 억제하여 아폽토시스를 억제하는 효과가 있다. EP153R은 혈구흡착에 필요하다. EP153R은 또한 감염된 세포에서 MHC-I 발현을 억제한다.
EP153R의 활성
본 발명의 약독화된 ASFV의 한 실시양태에서, EP153R 활성은 파괴될 수 있다.
한 실시양태에서, 파괴될 수 있는 EP153R의 활성은 혈구흡착을 매개하는 그의 능력이다. 다시 말해, 혈구흡착을 매개하는 EP153R의 능력은 감소될 수 있다. 혈구흡착을 매개하는 EP153R의 능력은 적어도 50, 60, 70, 80 또는 90%만큼 감소될 수 있다. 혈구흡착을 매개하는 EP153R의 능력은 완전히 폐기될 수 있다.
한 실시양태에서, 파괴될 수 있는 EP153R의 활성은 카스파제-3을 억제하는 그의 능력이다. 다시 말해, 카스파제-3을 억제하는 EP153R의 능력은 감소될 수 있다. 카스파제-3을 억제하는 EP153R의 능력은 적어도 50, 60, 70, 80 또는 90%만큼 감소될 수 있다. 카스파제-3을 억제하는 EP153R의 능력은 완전히 폐기될 수 있다. 카스파제-3 활성은 예컨대, 후르타도(Hurtado) 등에 의해 기재된 바와 같이 (Hurtado et al. 2004 Virology 326: 160-170), 관련 기술분야에 공지된 검정법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 17 kDa의 절단된 활성 카스파제-3 단편 및 34 kDa의 불활성 프로카스파제-3 단백질을 웨스턴 블롯 또는 질량 분석법을 사용하여 정량화하고, 비교하여 카스파제-3의 활성화 정도를 확인할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 형광 기질을 절단할 수 있는 세포 추출물 중의 카스파제-3의 능력을 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 측정할 수 있다.
한 실시양태에서, 파괴될 수 있는 EP153R의 활성은 MHC-I 발현을 억제하는 그의 능력이다. 다시 말해, MHC-I 발현을 억제하는 EP153R의 능력은 감소될 수 있다. MHC-I 발현을 억제하는 EP153R의 능력은 적어도 50, 60, 70, 80 또는 90%만큼 감소될 수 있다. MHC-I 발현을 억제하는 EP153R의 능력은 완전히 폐기될 수 있다. MHC-I 발현은 예컨대, 후르타도 등에 의해 기재된 바와 같이 (Hurtado et al. 2011 Arch. Virol. 156(2): 219-234), 관련 기술분야에 공지된 검정법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, MHC-I의 세포 표면 발현은 투과되지 않은 세포의 항체 염색 후 유세포 분석법을 사용하여 측정할 수 있다.
DIVA 돌연변이
한 실시양태에서, 본 발명의 ASFV는 백신접종받은 동물로부터의 감염된 동물 감별 (DIVA) 돌연변이를 포함한다. DIVA 돌연변이는 ASF 바이러스를 포함하는 백신이 DIVA 백신으로 작용할 수 있게 하는 ASF 바이러스의 돌연변이이다 (즉, DIVA 백신으로 백신접종받은 대상체는 야생형 ASF 바이러스로 감염된 대상체로부터 감별될 수 있다).
한 실시양태에서, 본 발명은 유전자 EP153R 및 EP402R의 발현 및/또는 활성이 파괴되고; 하기 유전자:
다중유전자 패밀리 (MGF) 110 3L, 6L, 7L, 8L, 10L, 11L 및 12L,
MGF 360 5L, 6L, 7L, 10L, 11L, 12L, 13L, 14L, 20R, 21R 및 22R, 및
MGF 505 1R, 2R 및 6R 중 하나 이상의 기능성 버전을 포함하고;
DIVA 돌연변이를 포함하는 것인, 약독화된 ASF 바이러스를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 유전자 EP153R 및 EP402R의 발현 및/또는 활성이 파괴되고; 하기 유전자:
다중유전자 패밀리 (MGF) 110 11L 및 12L,
MGF 360 6L, 10L, 11L, 12L, 13L, 및 14L, 및
MGF 505 1R 및 2R 중 하나 이상의 기능성 버전을 포함하고;
DIVA 돌연변이를 포함하는 것인, 약독화된 ASF 바이러스를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 유전자 EP153R 및 EP402R의 발현 및/또는 활성이 파괴되고; 하기 유전자:
다중유전자 패밀리 (MGF) 110 5L, 6L, 8L 및 12L,
MGF 360 6L, 10L, 11L, 12L, 13L, 14L 및 21R, 및
MGF 505 1R 및 2R 중 하나 이상의 기능성 버전을 포함하고;
DIVA 돌연변이를 포함하는 것인, 약독화된 ASF 바이러스를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 리간드 결합 도메인 중에 하나 이상의 아미노산 변이를 포함하는 EP402R 단백질로, 여기서, 아미노산 변이는 EP402R 단백질의 리간드 결합을 파괴시키는 것인 EP402R 단백질 (즉, 본 발명의 EP402 단백질), 및/또는 상기 EP402R 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, DIVA 돌연변이를 추가로 포함하는 ASF 바이러스를 제공한다.
한 실시양태에서, DIVA 돌연변이는 K145R 유전자 및/또는 B125R 유전자의 발현을 파괴시킨다. 적합하게, DIVA 돌연변이는 K145R 유전자의 발현을 파괴시킨다. 적합하게, K145R 유전자는 부분적으로 결실된다. 적합하게, K145R 유전자는 완전히 결실된다. 적합하게, B125R 유전자는 부분적으로 결실된다. 적합하게, B125R 유전자는 완전히 결실된다.
K145R
K145R 유전자는 후기 유전자이다.
상이한 ASFV 균주로부터의 K145R 유전자의 유전자 (즉, 뉴클레오티드) 서열이 하기에 제시되어 있다.
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
한 실시양태에서, 본 발명의 ASFV는 K145R 유전자의 발현을 파괴시키는 DIVA 돌연변이를 포함한다. 다시 말해, ASFV에는 K145R 유전자의 기능성 버전이 결여되어 있다. 적합하게, K145R 유전자는 서열식별번호 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338 또는 339의 서열을 포함한다. 적합하게, K145R 유전자는 서열식별번호 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338 또는 339와 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 적합하게, K145R 유전자는 서열식별번호 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338 또는 339의 서열로 이루어진다.
본 발명의 ASFV의 한 실시양태에서, K145R 유전자는 부분적으로 또는 완전히 결실될 수 있다. 적합하게, 서열식별번호 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338 또는 339의 서열의 일부 또는 그들 모두는 ASFV 게놈으로부터 제거된다. 적합하게, ASFV 게놈에는 상기 서열 중 임의의 것이 결여되어 있다.
ASFV의 상이한 균주로부터의 K145R 단백질의 수탁 번호는 하기 표 4에 열거되어 있다.
<표 4>
Figure pct00024
상이한 ASFV 균주로부터의 K145R 단백질의 아미노산 서열이 하기 제시되어 있다.
Figure pct00025
Figure pct00026
한 실시양태에서, 본 발명의 ASFV는 K145R 단백질을 발현하지 않는다. 다시 말해, 본 발명의 ASFV는 서열식별번호 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351 또는 352의 서열을 갖는 단백질을 발현하지 않는다.
K145R은 숙주 소포체 (ER) 스트레스 반응을 억제한다 (Barber 2015 Stress modulators encoded by African swine fever virus; PhD thesis, St Georges, University of London, 2016). 이 반응은 언폴딩된 단백질의 축적으로 인해 발생하며, 상당량의 바이러스 단백질이 생성되기 때문에, 바이러스 감염 중에 활성화될 수 있다. ER 스트레스는 전사 인자 CCAAT-인핸서-결합 단백질 상동성 단백질 (CHOP)의 발현 증가 및 세포 핵에의 그의 축적을 유도한다. CHOP 활성은 궁극적으로 세포 아폽토시스를 초래하여 바이러스 복제를 제한한다.
K145R 기능은 CHOP에 대한 항체를 사용하는 면역형광 및 ER 스트레스 유도 후 세포 핵에의 그의 존재 평가, 및 루시페라제 유전자가 CHOP 프로모터의 제어하에 있는 루시페라제 리포터 검정법을 포함하는 방법에 의해 시험될 수 있다.
B125R
상이한 ASFV 균주로부터의 B125R 유전자의 유전자 (즉, 뉴클레오티드) 서열이 하기에 제시되어 있다:
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
한 실시양태에서, 본 발명의 ASFV는 B125R 유전자의 발현을 파괴시키는 DIVA 돌연변이를 포함한다. 다시 말해, ASFV에는 B125R 유전자의 기능성 버전이 결여되어 있다. 적합하게, B125R 유전자는 서열식별번호 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364 또는 365의 서열을 포함한다. 적합하게, B125R 유전자는 서열식별번호 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364 또는 365와 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 적합하게, B125R 유전자는 서열식별번호 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364 또는 365의 서열로 이루어진다.
본 발명의 ASFV의 한 실시양태에서, B125R 유전자는 부분적으로 또는 완전히 결실될 수 있다. 적합하게, 서열식별번호 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364 또는 365의 서열의 일부 또는 그들 모두는 ASFV 게놈으로부터 제거된다. 적합하게, ASFV 게놈에는 상기 서열 중 임의의 것이 결여되어 있다.
ASFV의 상이한 균주로부터의 B125R 단백질의 수탁 번호는 하기 표 5에 열거되어 있다.
<표 5>
Figure pct00030
상이한 ASFV 균주로부터의 B125R 단백질의 아미노산 서열이 하기 제시되어 있다.
Figure pct00031
Figure pct00032
한 실시양태에서, 본 발명의 ASFV는 B125R 단백질을 발현하지 않는다. 다시 말해, 본 발명의 ASFV는 서열식별번호 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377 또는 378의 서열을 갖는 단백질을 발현하지 않는다.
B125R은 감염된 멧돼지 세포 (WSL-R)에서 발현되는 가장 풍부한 바이러스 단백질 중 하나인 것으로 확인되었다 (Kaβler et al. 2018 Sci. Rep. 8: 1471). 도 5에 제시된 바와 같이, B125R 발현은 세포 표면에서 검출될 수 있으며, 이는 B125R이 항체에 노출될 가능성이 있고, 강한 항체 반응을 유도할 가능성이 있다는 것을 시사하는 것이다.
다중유전자 패밀리 ( MGF )
ASFV는 게놈의 좌측 및 우측 가변 영역에 존재하는 5개의 다중유전자 패밀리를 함유한다. MGF는 각 유전자에 존재하는 평균 코돈 개수를 따서 명명된다: MGF100, 110, 300, 360 및 505/530. MGF 300, 360 및 505/530 구성원의 N-말단 영역은 서로 상당한 유사성을 공유한다. MGF 360 및 505 패밀리는 감염된 세포 생존의 촉진 및 I형 인터페론 반응의 억제를 포함하는 숙주 범위 기능에 필수적인 유전자를 코딩한다.
본 발명에 따른 약독화된 ASFV는 하기 유전자:
다중유전자 패밀리 (MGF) 110 3L, 6L, 7L, 8L, 10L, 11L 및 12L,
MGF 360 5L, 6L, 7L, 10L, 11L, 12L, 13L, 14L, 20R, 21R 및 22R, 및
MGF 505 1R, 2R 및 6R 중 하나 이상의 기능성 버전을 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 유전자 EP153R 및 EP402R의 발현 및/또는 활성이 파괴되고; 하기 유전자:
다중유전자 패밀리 (MGF) 110 11L 및 12L,
MGF 360 6L, 10L, 11L, 12L, 13L, 및 14L, 및
MGF 505 1R 및 2R 중 하나 이상의 기능성 버전을 포함하는 것인, 약독화된 아프리카 돼지 열병 (ASF) 바이러스를 제공한다.
적합하게, 한 실시양태에서, 본 발명은 유전자 EP153R 및 EP402R의 발현 및/또는 활성이 파괴되고; 하기 유전자:
다중유전자 패밀리 (MGF) 110 5L, 6L, 8L, 및 12L, 및
MGF 360 6L, 10L, 11L, 12L, 13L, 14L 및 21R, 및
MGF 505 1R 및 2R 중 하나 이상의 기능성 버전을 포함하는 것인, ASFV를 제공한다.
적합하게, 한 실시양태에서, 본 발명은 유전자 EP153R 및 EP402R의 발현 및/또는 활성이 파괴되고; 하기 유전자:
다중유전자 패밀리 (MGF) 110 6L, 8L, 및 12L, 및
MGF 360 6L, 10L, 11L, 12L, 13L, 14L 및 21R, 및
MGF 505 1R 및 2R 중 하나 이상의 기능성 버전을 포함하는 것인, ASFV를 제공한다.
적합하게, 한 실시양태에서, 본 발명은 유전자 EP153R 및 EP402R의 발현 및/또는 활성이 파괴되고; 하기 유전자:
다중유전자 패밀리 (MGF) 110 12L, 및
MGF 360 6L, 10L, 11L, 12L, 13L, 14L, 및
MGF 505 1R 및 2R 중 하나 이상의 기능성 버전을 포함하는 것인, ASFV를 제공한다.
적합하게, 한 실시양태에서, 본 발명은 유전자 EP153R 및 EP402R의 발현 및/또는 활성이 파괴되고; 하기 유전자:
다중유전자 패밀리 (MGF) 360 6L, 10L, 11L, 12L, 13L, 및 14L, 및
MGF 505 1R 및 2R 중 하나 이상의 기능성 버전을 포함하는 것인, ASFV를 제공한다.
다양한 ASFV 균주의 게놈에서 상기 유전자 중 일부의 위치는 하기 표 6에 제시된다. 상응하는 Benin 97/1 유전자에 대한 각 유전자의 서열 동일성 또한 제시된다.
표 6a - MGF 360-10L
Figure pct00033
표 6b - MGF 360-11L
Figure pct00034
표 6c - MGF 360-12L
Figure pct00035
표 6d - MGF 360-13L
Figure pct00036
표 6e - MGF 360-14L
Figure pct00037
표 6f - MGF 505-1R
Figure pct00038
표 6g - MGF 505-2R
Figure pct00039
표 6h - MGF 505-3R
Figure pct00040
상이한 균주로부터의 상기 유전자의 유전자 (즉, 뉴클레오티드) 서열은 하기에 제시된다.
MGF 110 5L 유전자 서열
Figure pct00041
Figure pct00042
한 실시양태에서, 본 발명의 약독화된 ASFV는 MGF 110 5L의 기능성 버전을 포함한다. 적합하게, MGF 110 5L의 기능성 버전은 서열식별번호 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274 또는 275의 서열을 포함한다. 적합하게, MGF 110 5L의 기능성 버전은 서열식별번호 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274 또는 275와 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 적합하게, MGF 110 5L의 기능성 버전은 서열식별번호 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274 또는 275의 서열로 이루어진다.
MGF 110 6L 유전자 서열
Figure pct00043
Figure pct00044
한 실시양태에서, 본 발명의 약독화된 ASFV는 MGF 110 6L의 기능성 버전을 포함한다. 적합하게, MGF 110 6L의 기능성 버전은 서열식별번호 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 또는 43의 서열을 포함한다. 적합하게, MGF 110 6L의 기능성 버전은 서열식별번호 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 또는 43과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 적합하게, MGF 110 6L의 기능성 버전은 서열식별번호 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 또는 43의 서열로 이루어진다.
MGF 110 7L 유전자 서열
Figure pct00045
Figure pct00046
한 실시양태에서, 본 발명의 약독화된 ASFV는 MGF 110 7L의 기능성 버전을 포함한다. 적합하게, MGF 110 7L의 기능성 버전은 서열식별번호 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255 또는 256의 서열을 포함한다. 적합하게, MGF 110 7L의 기능성 버전은 서열식별번호 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255 또는 256과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 적합하게, MGF 110 7L의 기능성 버전은 서열식별번호 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255 또는 256의 서열로 이루어진다.
MGF 110 8L 유전자 서열
Figure pct00047
한 실시양태에서, 본 발명의 약독화된 ASFV는 MGF 110 8L의 기능성 버전을 포함한다. 적합하게, MGF 110 8L의 기능성 버전은 서열식별번호 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50의 서열을 포함한다. 적합하게, MGF 110 8L의 기능성 버전은 서열식별번호 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 적합하게, MGF 110 8L의 기능성 버전은 서열식별번호 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50의 서열로 이루어진다.
MGF 110 12L 유전자 서열
Figure pct00048
Figure pct00049
한 실시양태에서, 본 발명의 약독화된 ASFV는 MGF 110 12L의 기능성 버전을 포함한다. 적합하게, MGF 110 8L의 기능성 버전은 서열식별번호 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285 또는 286의 서열을 포함한다. 적합하게, MGF 110 12L의 기능성 버전은 서열식별번호 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285 또는 286과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 적합하게, MGF 110 12L의 기능성 버전은 서열식별번호 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285 또는 286의 서열로 이루어진다.
MGF 360 6L 유전자 서열
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
한 실시양태에서, 본 발명의 약독화된 ASFV는 MGF 360 6L의 기능성 버전을 포함한다. 적합하게, MGF 360 6L의 기능성 버전은 서열식별번호 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 또는 61의 서열을 포함한다. 적합하게, MGF 360 6L의 기능성 버전은 서열식별번호 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 또는 61과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 적합하게, MGF 360 6L의 기능성 버전은 서열식별번호 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 또는 61의 서열로 이루어진다.
MGF 360 10L 유전자 서열
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
한 실시양태에서, 본 발명의 약독화된 ASFV는 MGF 360 10L의 기능성 버전을 포함한다. 적합하게, MGF 360 10L의 기능성 버전은 서열식별번호 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 또는 74의 서열을 포함한다. 적합하게, MGF 360 10L의 기능성 버전은 서열식별번호 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 또는 74와 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 적합하게, MGF 360 10L의 기능성 버전은 서열식별번호 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 또는 74의 서열로 이루어진다.
MGF 360 11L 유전자 서열
Figure pct00058
Figure pct00059
Figure pct00060
Figure pct00061
한 실시양태에서, 본 발명의 약독화된 ASFV는 MGF 360 11L의 기능성 버전을 포함한다. 적합하게, MGF 360 11L의 기능성 버전은 서열식별번호 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86 또는 87의 서열을 포함한다. 적합하게, MGF 360 11L의 기능성 버전은 서열식별번호 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86 또는 87과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 적합하게, MGF 360 11L의 기능성 버전은 서열식별번호 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86 또는 87의 서열로 이루어진다.
MGF 360 12L 유전자 서열
Figure pct00062
Figure pct00063
Figure pct00064
Figure pct00065
한 실시양태에서, 본 발명의 약독화된 ASFV는 MGF 360 12L의 기능성 버전을 포함한다. 적합하게, MGF 360 12L의 기능성 버전은 서열식별번호 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 95, 96, 97, 98 또는 99의 서열을 포함한다. 적합하게, MGF 360 12L의 기능성 버전은 서열식별번호 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 95, 96, 97, 98 또는 99와 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 적합하게, MGF 360 12L의 기능성 버전은 서열식별번호 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 95, 96, 97, 98 또는 99의 서열로 이루어진다.
MGF 360 13L 유전자 서열
Figure pct00066
Figure pct00067
Figure pct00068
Figure pct00069
한 실시양태에서, 본 발명의 약독화된 ASFV는 MGF 360 13L의 기능성 버전을 포함한다. 적합하게, MGF 360 13L의 기능성 버전은 서열식별번호 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110 또는 111의 서열을 포함한다. 적합하게, MGF 360 13L의 기능성 버전은 서열식별번호 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110 또는 111과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 적합하게, MGF 360 13L의 기능성 버전은 서열식별번호 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110 또는 111의 서열로 이루어진다.
MGF 360 14L 유전자 서열
Figure pct00070
Figure pct00071
Figure pct00072
Figure pct00073
한 실시양태에서, 본 발명의 약독화된 ASFV는 MGF 360 14L의 기능성 버전을 포함한다. 적합하게, MGF 360 14L의 기능성 버전은 서열식별번호 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 또는 123의 서열을 포함한다. 적합하게, MGF 360 14L의 기능성 버전은 서열식별번호 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 또는 123과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 적합하게, MGF 360 14L의 기능성 버전은 서열식별번호 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 또는 123의 서열로 이루어진다.
MGF 360 21R 유전자 서열
Figure pct00074
Figure pct00075
Figure pct00076
한 실시양태에서, 본 발명의 약독화된 ASFV는 MGF 360 21R의 기능성 버전을 포함한다. 적합하게, MGF 360 21R의 기능성 버전은 서열식별번호 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132 또는 133의 서열을 포함한다. 적합하게, MGF 360 21R의 기능성 버전은 서열식별번호 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132 또는 133과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 적합하게, MGF 360 21R의 기능성 버전은 서열식별번호 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132 또는 133의 서열로 이루어진다.
MGF 505 1R 유전자 서열
Figure pct00077
Figure pct00078
Figure pct00079
Figure pct00080
Figure pct00081
Figure pct00082
한 실시양태에서, 본 발명의 약독화된 ASFV는 MGF 505 1R의 기능성 버전을 포함한다. 적합하게, MGF 505 1R의 기능성 버전은 서열식별번호 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145 또는 146의 서열을 포함한다. 적합하게, MGF 505 1R의 기능성 버전은 서열식별번호 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145 또는 146과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 적합하게, MGF 505 1R의 기능성 버전은 서열식별번호 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145 또는 146의 서열로 이루어진다.
MGF 505 2R 유전자 서열
Figure pct00083
Figure pct00084
Figure pct00085
Figure pct00086
Figure pct00087
한 실시양태에서, 본 발명의 약독화된 ASFV는 MGF 505 2R의 기능성 버전을 포함한다. 적합하게, MGF 505 2R의 기능성 버전은 서열식별번호 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157 또는 158의 서열을 포함한다. 적합하게, MGF 505 2R의 기능성 버전은 서열식별번호 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157 또는 158과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 적합하게, MGF 505 2R의 기능성 버전은 서열식별번호 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157 또는 158의 서열로 이루어진다.
MGF 505 6R 유전자 서열
Figure pct00088
Figure pct00089
Figure pct00090
Figure pct00091
한 실시양태에서, 본 발명의 약독화된 ASFV는 MGF 505 6R의 기능성 버전을 포함한다. 적합하게, MGF 505 6R의 기능성 버전은 서열식별번호 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264 또는 265의 서열을 포함한다. 적합하게, MGF 505 2R의 기능성 버전은 서열식별번호 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264 또는 265와 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 적합하게, MGF 505 6R의 기능성 버전은 서열식별번호 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264 또는 265의 서열로 이루어진다.
한 실시양태에서, 본 발명은 Benin 97/1 균주로부터의 하기 서열 중 하나 이상, 예컨대, 그들 모두를 포함하는 ASFV를 제공한다:
서열식별번호 55 (MGF 360 6L), 서열식별번호 68 (MGF 360 10L), 서열식별번호 78 (MGF 360 11L), 서열식별번호 96 (MGF 360 12L), 서열식별번호 108 (MGF 360 13L) 및 서열식별번호 120 (MGF 360 14L), 및
서열식별번호 141 (MGF 505 1R) 및 서열식별번호 151 (MGF 505 2R).
한 실시양태에서, 본 발명은 China/2018/AnhuiXCGQ 균주로부터의 하기 서열 중 하나 이상, 예컨대, 그들 모두를 포함하는 ASFV를 제공한다:
서열식별번호 52 (MGF 360 6L), 서열식별번호 63 (MGF 360 10L), 서열식별번호 76 (MGF 360 11L), 서열식별번호 89 (MGF 360 12L), 서열식별번호 101 (MGF 360 13L), 서열식별번호 113 (MGF 360 14L) 및 서열식별번호 125 (MGF 360 21R), 및
서열식별번호 135 (MGF 505 1R) 및 서열식별번호 148 (MGF 505 2R).
한 실시양태에서, 본 발명은 Georgia 2007/1 균주로부터의 하기 서열 중 하나 이상, 예컨대, 그들 모두를 포함하는 ASFV를 제공한다:
서열식별번호 51 (MGF 360 6L), 서열식별번호 62 (MGF 360 10L), 서열식별번호 75 (MGF 360 11L), 서열식별번호 88 (MGF 360 12L), 서열식별번호 100 (MGF 360 13L), 서열식별번호 112 (MGF 360 14L) 및 서열식별번호 124 (MGF 360 21R), 및
서열식별번호 134 (MGF 505 1R) 및 서열식별번호 147 (MGF 505 2R).
한 실시양태에서, 본 발명은 Ken05/Tk1 균주로부터의 하기 서열 중 하나 이상, 예컨대, 그들 모두를 포함하는 ASFV를 제공한다:
서열식별번호 35 (MGF 110 6L), 서열식별번호 44 (MGF 110 8L), 및
서열식별번호 58 (MGF 360 6L), 서열식별번호 65 (MGF 360 10L), 서열식별번호 86 (MGF 360 11L) 및 서열식별번호 130 (MGF 360 21R), 및
서열식별번호 145 (MGF 505 1R) 및 서열식별번호 156 (MGF 505 2R).
한 실시양태에서, 본 발명은 Ken06.Bus 균주로부터의 하기 서열 중 하나 이상, 예컨대, 그들 모두를 포함하는 ASFV를 제공한다:
서열식별번호 36 (MGF 110 6L), 및
서열식별번호 61 (MGF 360 6L), 서열식별번호 64 (MGF 360 10L), 서열식별번호 87 (MGF 360 11L), 서열식별번호 99 (MGF 360 12L), 서열식별번호 111 (MGF 360 13L), 서열식별번호 123 (MGF 360 14L) 및 서열식별번호 132 (MGF 360 21R), 및
서열식별번호 144 (MGF 505 1R) 및 서열식별번호 158 (MGF 505 2R).
한 실시양태에서, 본 발명은 Kenya 1950 균주로부터의 하기 서열 중 하나 이상, 예컨대, 그들 모두를 포함하는 ASFV를 제공한다:
서열식별번호 37 (MGF 110 6L), 서열식별번호 45 (MGF 110 8L), 및
서열식별번호 60 (MGF 360 6L), 서열식별번호 66 (MGF 360 10L), 서열식별번호 85 (MGF 360 11L), 서열식별번호 98 (MGF 360 12L), 서열식별번호 110 (MGF 360 13L), 서열식별번호 122 (MGF 360 14L) 및 서열식별번호 131 (MGF 360 21R), 및
서열식별번호 143 (MGF 505 1R) 및 서열식별번호 157 (MGF 505 2R).
한 실시양태에서, 본 발명은 L60 균주로부터의 하기 서열 중 하나 이상, 예컨대, 그들 모두를 포함하는 ASFV를 제공한다:
서열식별번호 54 (MGF 360 6L), 서열식별번호 67 (MGF 360 10L), 서열식별번호 77 (MGF 360 11L), 서열식별번호 95 (MGF 360 12L), 서열식별번호 107 (MGF 360 13L) 및 서열식별번호 119 (MGF 360 14L), 및
서열식별번호 140 (MGF 505 1R) 및 서열식별번호 150 (MGF 505 2R).
한 실시양태에서, 본 발명은 Malawi Lil-20/1 (1983) 균주로부터의 하기 서열 중 하나 이상, 예컨대, 그들 모두를 포함하는 ASFV를 제공한다:
서열식별번호 38 (MGF 110 6L), 서열식별번호 46 (MGF 110 8L), 및
서열식별번호 59 (MGF 360 6L), 서열식별번호 74 (MGF 360 10L), 서열식별번호 84 (MGF 360 11L), 서열식별번호 97 (MGF 360 12L), 서열식별번호 109 (MGF 360 13L), 서열식별번호 121 (MGF 360 14L) 및 서열식별번호 133 (MGF 360 21R), 및
서열식별번호 146 (MGF 505 1R) 및 서열식별번호 155 (MGF 505 2R).
한 실시양태에서, 본 발명은 Mkuzi 1979 균주로부터의 하기 서열 중 하나 이상, 예컨대, 그들 모두를 포함하는 ASFV를 제공한다:
서열식별번호 39 (MGF 110 6L), 서열식별번호 47 (MGF 110 8L), 및
서열식별번호 57 (MGF 360 6L), 서열식별번호 69 (MGF 360 10L), 서열식별번호 79 (MGF 360 11L), 서열식별번호 94 (MGF 360 12L), 서열식별번호 106 (MGF 360 13L), 서열식별번호 118 (MGF 360 14L) 및 서열식별번호 128 (MGF 360 21R), 및
서열식별번호 138 (MGF 505 1R) 및 서열식별번호 149 (MGF 505 2R).
한 실시양태에서, 본 발명은 Pretorisuskop/96/4 균주로부터의 하기 서열 중 하나 이상, 예컨대, 그들 모두를 포함하는 ASFV를 제공한다:
서열식별번호 40 (MGF 110 6L), 서열식별번호 48 (MGF 110 8L), 및
서열식별번호 56 (MGF 360 6L), 서열식별번호 70 (MGF 360 10L), 서열식별번호 81 (MGF 360 11L), 서열식별번호 93 (MGF 360 12L), 서열식별번호 105 (MGF 360 13L), 서열식별번호 117 (MGF 360 14L) 및 서열식별번호 127 (MGF 360 21R), 및
서열식별번호 142 (MGF 505 1R) 및 서열식별번호 153 (MGF 505 2R).
한 실시양태에서, 본 발명은 Tengani 62 균주로부터의 하기 서열 중 하나 이상, 예컨대, 그들 모두를 포함하는 ASFV를 제공한다:
서열식별번호 41 (MGF 110 6L), 및
서열식별번호 71 (MGF 360 10L), 서열식별번호 82 (MGF 360 11L), 서열식별번호 90 (MGF 360 12L), 서열식별번호 102 (MGF 360 13L), 서열식별번호 114 (MGF 360 14L) 및 서열식별번호 126 (MGF 360 21R), 및
서열식별번호 136 (MGF 505 1R) 및 서열식별번호 152 (MGF 505 2R).
한 실시양태에서, 본 발명은 Warmbaths 균주로부터의 하기 서열 중 하나 이상, 예컨대, 그들 모두를 포함하는 ASFV를 제공한다:
서열식별번호 42 (MGF 110 6L), 서열식별번호 49 (MGF 110 8L), 및
서열식별번호 53 (MGF 360 6L), 서열식별번호 73 (MGF 360 10L), 서열식별번호 80 (MGF 360 11L), 서열식별번호 92 (MGF 360 12L), 서열식별번호 104 (MGF 360 13L), 서열식별번호 116 (MGF 360 14L) 및 서열식별번호 129 (MGF 360 21R), 및
서열식별번호 137 (MGF 505 1R) 및 서열식별번호 154 (MGF 505 2R).
한 실시양태에서, 본 발명은 Warthog 균주로부터의 하기 서열 중 하나 이상, 예컨대, 그들 모두를 포함하는 ASFV를 제공한다:
서열식별번호 43 (MGF 110 6L), 서열식별번호 50 (MGF 110 8L), 및
서열식별번호 72 (MGF 360 10L), 서열식별번호 83 (MGF 360 11L), 서열식별번호 91 (MGF 360 12L), 서열식별번호 103 (MGF 360 13L), 서열식별번호 115 (MGF 360 14L), 및
서열식별번호 139 (MGF 505 1R).
상기 유전자의 번역 생성물 (즉, 단백질 서열)을 하기에 제시된다:
Benin 97/1 MGF 유전자 단백질 서열
Figure pct00092
Figure pct00093
MGF 110 5L 단백질 서열
Figure pct00094
Figure pct00095
MGF 110 12L 단백질 서열
Figure pct00096
MGF 360 12L 단백질 서열
Figure pct00097
Figure pct00098
MGF 360 13L 단백질 서열
Figure pct00099
Figure pct00100
MGF 360 14L 단백질 서열
Figure pct00101
Figure pct00102
Figure pct00103
MGF 505 1R 단백질 서열
Figure pct00104
Figure pct00105
Figure pct00106
DP148R
DP148R 유전자는 Benin 97/1 게놈 상의 위치 177915 내지 178679에, ASFV 게놈의 우측 단부 근부에 위치한다. DP148R 유전자는 또한 MGF 360 18R로도 지칭될 수 있다. DP148R은 감염 후 초기에 발현된다. DP148R 단백질의 아미노산 서열은 다른 단백질과 유의적인 유사성이 없고; 2차 구조는 주로 나선형인 것으로 예측되지만, 신호 펩티드 또는 막횡단 도메인은 분명하지 않다.
DP148R은 I형 인터페론을 억제한다. DP148R은 또한 NF-κB 전사 인자의 활성화를 억제한다 (도 7 참조). DP148R은 NF-κB의 p65 서브유닛의 핵 전위를 억제한다 (도 8 참조). NF-κB는 바이러스 감염에 대한 숙주의 선천 면역계 반응의 일부로서 인터페론 및 염증유발성 시토카인의 발현을 제어한다. DP148R에 의한 NF-κB의 억제는 ASFV에 감염된 세포에 의해 생성되는 I형 인터페론(IFN) 및 염증유발성 시토카인 및 케모카인의 양을 감소시키고, ASFV가 숙주의 선천성 면역 반응을 우회하도록 하여 바이러스 복제를 촉진하고, 적응 반응의 발생을 파괴시킨다.
상이한 ASFV 균주로부터의 DP148R 유전자의 게놈내 유전자 (즉, 뉴클레오티드) 서열 및 위치가 하기에 제시되어 있다.
Figure pct00107
Figure pct00108
Figure pct00109
Figure pct00110
상이한 ASFV 균주로부터의 DP148R 단백질의 아미노산 서열은 하기에 서열식별번호 11 내지 19 및 301 내지 305로서 제시되어 있다:
Figure pct00111
Figure pct00112
혈구흡착
혈구흡착은 ASFV에 감염된 세포가 그의 표면 상에 적혈구(erythrocyte) (적혈구(red blood cell))를 흡착하는 현상이다. ASFV에 의해 유도된 혈구흡착 정도는 예컨대, 본원에 기재된 바와 같은 혈구흡착 (HAD) 검정법을 사용하여 측정될 수 있다 (예를 들어, 실시예 1 및 3 참조). 예를 들어, 세포 (예컨대, Vero 세포 또는 돼지 골수 세포)를 단백질로 형질감염시키거나, 또는 ASFV에 감염시킨 후, 이어서, 적혈구를 첨가하고, 이미징에 의해 혈구흡착 정도를 검출할 수 있다. 이러한 방식으로, 상이한 단백질 및 바이러스를 그가 혈구흡착에 미치는 영향을 시험할 수 있다.
EP402R 및 EP153R은 ASFV 감염된 세포의 혈구흡착을 매개하는 데 관여한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 혈구흡착을 유도하는 ASF 바이러스의 능력이 EP153R 및 EP402R 유전자의 발현 및/또는 활성이 파괴되지 않은 상응하는 ASF 바이러스와 비교하여 감소된 약독화된 ASF 바이러스를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 EP153R 및 EP402R의 발현 및/또는 활성이 파괴되고;
하기 유전자:
다중유전자 패밀리 (MGF) 110 3L, 6L, 7L, 8L, 10L, 11L 및 12L,
MGF 360 5L, 6L, 7L, 10L, 11L, 12L, 13L, 14L, 20R, 21R 및 22R, 및
MGF 505 1R, 2R 및 6R 중 하나 이상의 기능성 버전을 포함하고;
혈구흡착을 유도하는 아프리카 돼지 열병 (ASF) 바이러스의 능력이 EP153R 유전자 및/또는 EP402R 유전자의 발현 및/또는 활성이 파괴되지 않은 상응하는 ASF 바이러스와 비교하여 감소된 약독화된 ASF 바이러스를 제공한다.
본 발명은 또한 유전자 EP153R 및 EP402R의 발현 및/또는 활성이 파괴되고;
하기 유전자:
다중유전자 패밀리 (MGF) 110 11L 및 12L,
MGF 360 6L, 10L, 11L, 12L, 13L, 및 14L, 및
MGF 505 1R 및 2R 중 하나 이상의 기능성 버전을 포함하고;
혈구흡착을 유도하는 ASF 바이러스의 능력이 EP153R 유전자 및/또는 EP402R 유전자의 발현 및/또는 활성이 파괴되지 않은 상응하는 ASF 바이러스와 비교하여 감소된 약독화된 ASF 바이러스를 제공한다.
본 발명은 또한 유전자 EP153R 및 EP402R의 발현 및/또는 활성이 파괴되고;
하기 유전자:
다중유전자 패밀리 (MGF) 110 5L, 6L, 8L 및 12L,
MGF 360 6L, 10L, 11L, 12L, 13L, 14L 및 21R, 및
MGF 505 1R 및 2R 중 하나 이상의 기능성 버전을 포함하고;
혈구흡착을 유도하는 ASF 바이러스의 능력이 EP153R 유전자 및/또는 EP402R 유전자의 발현 및/또는 활성이 파괴되지 않은 상응하는 ASF 바이러스와 비교하여 감소된 약독화된 ASF 바이러스를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 EP402R 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 ASF 바이러스로서, 혈구흡착을 유도하는 ASF 바이러스의 능력이 본 발명의 EP402R 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는 상응하는 ASF 바이러스와 비교하여 감소된 것인, ASF 바이러스를 제공한다.
본 발명의 약독화된 ASF 바이러스의 한 실시양태에서, EP153R 유전자 및/또는 EP402R 유전자의 혈구흡착을 매개하는 능력은 파괴될 수 있다. 한 실시양태에서, EP153R 유전자의 혈구흡착을 매개하는 능력은 파괴될 수 있다. 한 실시양태에서, EP402R 유전자의 혈구흡착을 매개하는 능력은 파괴될 수 있다.
혈구흡착을 감소시키거나, 또는 혈구흡착을 매개하는 능력을 파괴시킨다는 것은 본 발명의 ASFV로 감염된 세포가, 야생형 ASFV로, 또는 EP153R 및 EP402R 유전자의 발현 및/또는 활성이 파괴되지 않았거나, 또는 본 발명의 EP402R 단백질 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는, 본 발명의 ASFV에 상응하거나, 또는 본질적으로 그에 상응하는 ASF 바이러스로 감염된 세포보다 그의 표면에 더 적은 적혈구를 흡착한다는 것을 의미한다. 혈구흡착을 감소시키거나, 또는 혈구흡착을 매개하는 능력을 파괴시킨다는 것은 또한 돌연변이체, 비기능성 EP153R 또는 EP402R 단백질을 발현하도록 형질감염된 세포가 야생형 EP153R 또는 EP402R 단백질로 형질감염된 세포보다 그의 표면에 더 적은 적혈구를 흡착한다는 것을 의미한다. 감염된/형질감염된 세포의 표면에 흡착된 적혈구의 개수는 적어도 50, 60, 70, 80 또는 90%만큼 감소될 수 있다. 한 실시양태에서, 혈구흡착은 폐기되고, 즉, 본 발명의 약독화된 ASFV로 감염되거나, 또는 돌연변이체, 비기능성 EP153R 또는 EP402R 단백질로 형질감염된 세포의 표면에 어떤 적혈구도 흡착되지 않는다.
유전자 발현 및 활성
한 실시양태에서, 본 발명의 ASF 바이러스는 유전자 EP153R 및 EP402R의 파괴된 발현 및/또는 활성을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 ASF 바이러스는 유전자 EP153R, EP402R 및 K145R의 파괴된 발현 및/또는 활성을 갖는다. 이들 유전자는 본원에서 "파괴된 유전자"로서 지칭될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 유전자 EP153R 및 EP402R의 발현이 파괴된 ASFV를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 유전자 EP153R, EP402R 및 K145R의 발현이 파괴된 ASFV를 제공한다. 적합하게, EP153R 유전자의 발현이 파괴된 것이다. 적합하게, EP402R 유전자의 발현이 파괴된 것이다. 적합하게, K145R 유전자의 발현이 파괴된 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명은 유전자 EP153R 및 EP402R의 활성이 파괴된 ASFV를 제공한다.
유전자와 관련하여 "발현"이라는 용어는 유전자, 예컨대, RNA의 생성물 및/또는 단백질을 생산할 수 있는 ASF 바이러스의 능력을 지칭한다. 유전자 발현 파괴는 유전자 생성물 생산 감소를 의미한다. 유전자 발현은 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 및/또는 적어도 95%만큼 감소될 수 있다. 유전자 발현은 유전자 생성물, 예컨대, RNA 및/또는 단백질 생산이 완전히 폐기되는 (즉, 유전자 생성물이 전혀 생산되지 않는) 정도로 감소될 수 있다. 유전자 발현의 파괴는 파괴되지 않은 유전자 발현에 비해 유전자 발현을 감소시킨다. 예를 들어, 돌연변이된 유전자는 야생형 버전의 유전자와 비교하여 감소된 발현을 가질 수 있다.
발현이 파괴된 유전자는 완전히 전사 및 번역되지 않을 수 있다. 유전자 전사는 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 및/또는 적어도 95%만큼 감소될 수 있다. 유전자 전사는 폐기될 수 있다 (즉, 유전자는 전사되지 않을 수 있다). 유전자 번역은 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 및/또는 적어도 95%만큼 감소될 수 있다. 유전자 번역은 폐기될 수 있다. 유전자는 전사되지만, 번역되지 않을 수 있다. 유전자는 전사 및 번역되지만, 단백질이 너무 빠르게 분해되어 그의 기능을 수행하지 못할 수 있다. 유전자는 전사 및 번역되지만, 단백질은 비기능성일 수 있다.
유전자 발현은 관련 기술분야에 공지된 기술에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 유전자로부터 전사된 mRNA의 양은 예컨대, 정량적 중합효소 연쇄 반응 (qPCR)을 사용하여 정량화될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 단백질의 양은 예컨대, 웨스턴 블롯팅 또는 질량 분석법을 사용하여 정량화될 수 있다.
유전자와 관련하여 "활성"이라는 용어는 유전자 그의 기능을 수행할 수 있는 유전자의 능력을 지칭한다. 상이한 유전자는 상이한 활성, 즉, 그들이 수행하는 상이한 기능을 가지고 있다. 주어진 유전자는 다중 활성을 가질 수 있고; 유전자 활성의 파괴는 이러한 활성 중 하나 이상의 파괴를 의미한다. 하나 이상의 다른 활성은 파괴되지 않은 채로, 유전자의 하나 이상의 활성이 파괴될 수 있다. 유전자 활성의 파괴는 파괴되지 않은 경우 유전자의 활성에 비해 유전자의 활성을 감소시킨다. 예를 들어, 돌연변이된 유전자는 야생형 버전의 유전자와 비교하여 감소된 활성을 가질 수 있다. 유전자 활성이 완전히 폐기될 정도로 유전자 활성이 감소될 수 있다.
본 발명에 따른 ASFV는 비-기능성 버전의 파괴된 유전자를 포함할 수 있다.
감소된 양의 유전자 생성물이 유전자가 하나 이상의 그의 활성을 효과적으로 수행할 수 없다는 것을 의미하는 바, 유전자 발현의 파괴 또한 상기 유전자의 활성을 파괴시킬 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 약독화된 ASF 바이러스는 유전자 EP153R 및 EP402R의 발현 및/또는 활성을 파괴시키는 돌연변이를 포함한다.
유전자 발현 및/또는 활성은 mRNA로의 유전자 전사를 파괴시킴으로써, 즉, 유전자 전사를 완전히 폐기하는 것과 같이 유전자 전사를 감소시킴으로써 파괴될 수 있다. 유전자 발현 및/또는 활성은 mRNA의 단백질로의 번역을 파괴시킴으로써 파괴될 수 있다. 한 실시양태에서, 약독화된 ASF 바이러스는 유전자의 전사 및/또는 번역을 감소시키는 돌연변이를 포함한다. 한 실시양태에서, 약독화된 ASF 바이러스는 유전자가 전사 및/또는 번역되지 않도록 하는 (즉, 전사 및/또는 번역이 완전한 폐기되도록 하는) 돌연변이를 포함한다.
유전자 발현 및/또는 활성은 유전자와 연관된 비-코딩 서열, 예컨대, 프로모터를 돌연변이시킴으로써 파괴될 수 있다. 한 실시양태에서, 약독화된 ASF 바이러스는 파괴된 유전자 중 하나 이상의 프로모터에 돌연변이를 포함한다.
유전자 발현 및/또는 활성은 파괴된 유전자 중 하나 이상의 코딩 서열을 돌연변이시킴으로써 파괴될 수 있다.
유전자의 기능성 버전
본 발명의 약독화된 ASFV는 하기 유전자:
다중유전자 패밀리 (MGF) 110 3L, 6L, 7L, 8L, 10L, 11L 및 12L,
MGF 360 5L, 6L, 7L, 10L, 11L, 12L, 13L, 14L, 20R, 21R 및 22R, 및
MGF 505 1R, 2R 및 6R 중 하나 이상의 기능성 버전을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 약독화된 ASFV는 하기 유전자: MGF 110 3L, 6L, 7L, 8L, 10L, 11L 및 12L; MGF 360 5L, 6L, 7L, 10L, 11L, 12L, 13L, 14L, 20R, 21R 및 22R; 및 MGF 505 1R, 2R 및 6R 중 하나 이상의 기능성 버전을 포함할 수 있다. 적합하게, 약독화된 ASFV는 하기 유전자: MGF 110 3L, 6L, 7L, 8L, 10L, 11L 및 12L; MGF 360 5L, 6L, 7L, 10L, 11L, 12L, 13L, 14L, 20R, 21R 및 22R; 및 MGF 505 1R, 2R 및 6R 중 2개 이상, 예컨대, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개, 또는 22개의 것의 기능성 버전을 포함한다. 한 실시양태에서, 약독화된 ASFV는 하기 유전자: MGF 110 3L, 6L, 7L, 8L, 10L, 11L 및 12L; MGF 360 5L, 6L, 7L, 10L, 11L, 12L, 13L, 14L, 20R, 21R 및 22R; 및 MGF 505 1R, 2R 및 6R 모두의 기능성 버전을 포함한다. 적합하게, 본 발명의 약독화된 ASF 바이러스는 EP153R 및 EP402R 이외의 다른 모든 ASF 바이러스 유전자의 기능성 버전을 포함한다. 적합하게, 본 발명의 약독화된 ASF 바이러스는 EP153R, EP402R 및 K145R 이외의 다른 모든 ASF 바이러스 유전자의 기능성 버전을 포함한다.
유전자의 "기능성 버전"이라는 표현은 유전자의 발현 및 활성이 파괴되지 않는 유전자를 의미한다. 유전자의 기능성 버전은 유전자 발현 또는 유전자 활성을 파괴시키는 방식으로 돌연변이될 수 없다. 유전자의 기능성 버전은 돌연변이를 포함하지 않을 수 있다. 유전자의 기능성 버전의 코딩 서열은 완전하고, 비중단된 것일 수 있다. 유전자의 기능성 버전은 완전히 전사되고, 번역될 수 있다. 유전자의 기능성 버전은 완전 코딩 서열을 포함할 수 있다.
유전자의 기능성 버전은 야생형 ASFV 분리주 중의 유전자에 상응할 수 있다. 유전자의 기능성 버전은 병독성 ASFV 균주 중의 유전자에 상응할 수 있다. 유전자의 기능성 버전의 서열은 야생형 ASFV 분리주 또는 병독성 ASFV 균주 중의 유전자 서열과 동일할 수 있다. 유전자의 기능성 버전의 서열은 본 발명의 약독화된 ASFV의 유래 기점이 되는 야생형 ASFV 분리주 중의 유전자 서열과 동일할 수 있다. 유전자의 기능성 버전은 야생형 ASFV 분리주 중의 유전자의 천연 변이체일 수 있다.
유전자의 기능성 버전은 돌연변이를 포함할 수 있다. 그러나, 돌연변이는 유전자의 발현 또는 활성을 파괴하지 않아야 한다. 다시 말해, 돌연변이는 유전자의 기능에 영향을 미치지 않아야 한다. 유전자의 기능성 버전은 하나 이상의 동의 돌연변이 (즉, 유전자가 코딩하는 단백질의 아미노산 서열을 변경시키지 않는 돌연변이)를 포함할 수 있다. 유전자의 기능성 버전은 동의 또는 비동의일 수 있는 하나 이상의 침묵 돌연변이를 포함할 수 있다. 유전자의 기능성 버전은 유전자의 발현 또는 활성을 파괴시키지 않는 결실을 포함할 수 있다. 유전자의 기능성 버전은 유전자의 발현 또는 활성을 파괴시키지 않는 하나 이상의 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)을 포함할 수 있다.
돌연변이
유전자 발현 및/또는 활성은 ASFV 게놈을 돌연변이시킴으로써, 즉, ASFV 게놈의 뉴클레오티드 서열을 돌연변이시킴으로써 파괴된다. "돌연변이"는 공지된 ASFV 유전자형 대비 ASFV 게놈의 뉴클레오티드 서열의 변이를 의미한다. 돌연변이는 하나 이상의 뉴클레오티드를 상이한 뉴클레오티드로 변이 (즉, 치환), 뉴클레오티드 부가 (즉, 삽입), 뉴클레오티드 제거 (즉, 결실) 및/또는 이의 조합을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 ASF 바이러스는 유전자 EP153R 및 EP402R의 발현 및/또는 활성을 파괴시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 ASF 바이러스는 K145R 유전자의 발현을 파괴시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
유전자 발현 및/또는 활성을 파괴시키는 돌연변이는 ASFV 게놈의 비-코딩 서열에서 및/또는 ASFV 게놈의 코딩 서열에서 이루어질 수 있다. 본 발명의 약독화된 ASF 바이러스는 EP153R 유전자의 발현 및/또는 활성을 파괴시키는 하나 이상의 돌연변이를 비-코딩 영역에 및/또는 EP402R 유전자의 발현 및/또는 활성을 파괴시키는 하나 이상의 돌연변이를 비-코딩 영역에 포함할 수 있다. 본 발명의 ASF 바이러스는 K145R 유전자의 발현 및/또는 활성을 파괴시키는 하나 이상의 돌연변이를 비-코딩 영역에 포함할 수 있다.
본 발명의 ASF 바이러스는 EP153R 유전자의 발현 및/또는 활성을 파괴시키는 하나 이상의 돌연변이를 EP153R 유전자의 코딩 영역에 및/또는 EP402R 유전자의 발현 및/또는 활성을 파괴시키는 하나 이상의 돌연변이를 EP402R 유전자의 코딩 영역에 포함할 수 있다. 본 발명의 약독화된 ASF 바이러스는 K145R 유전자의 발현을 파괴시키는 하나 이상의 돌연변이를 K145R 유전자의 코딩 영역에 포함할 수 있다.
결실
본 발명의 ASFV에서, 유전자의 발현 및/또는 활성은 결실에 의해 파괴될 수 있다. 다시 말해, 유전자의 발현 및/또는 활성은 결실인 돌연변이에 의해 파괴될 수 있다. 본 발명의 ASFV는 결실에 의해 유전자의 기능성 버전이 결여되도록 만들 수 있다. 다시 말해, ASFV에 유전자의 기능성 버전이 결여되게 하는 돌연변이는 결실일 수 있다.
"결실"은 ASFV 게놈 뉴클레오티드 서열의 일부의 제거를 의미한다. 결실은 연속적일 수 있거나, 또는 복수의 서열 섹션의 결실을 포함할 수 있다. 결실은 본원에 기재된 임의의 방식으로 유전자 발현 및/또는 활성을 파괴할 수 있다. 결실은 본원에 기재된 임의의 방식으로 ASFV에 유전자의 기능성 버전이 결여되게 할 수 있다.
결실은 생성되는 유전자 생성물을 변경시킬 수 있다. 결실은 유전자가 전사 및/또는 번역되지 않도록 할 수 있다. 결실은 유전자의 mRNA로의 전사를 파괴할 수 있다. 예를 들어, 유전자의 프로모터의 결실이 전사를 파괴할 수 있다. 결실은 mRNA의 단백질로의 번역을 파괴할 수 있다. 예를 들어, 시작 코돈의 결실이 번역을 파괴할 수 있다. 유전자 발현 및/또는 활성은 예컨대, 프로모터와 같은 유전자와 연관된 비-코딩 서열을 결실시킴으로써 파괴될 수 있다.
유전자 발현 및/또는 활성은 유전자의 코딩 서열을 결실시킴으로써 파괴될 수 있다. 유전자의 코딩 서열을 결실시킴으로써 ASFV에 유전자의 기능성 버전이 결여되게 할 수 있다. "유전자의 결실" (예컨대, "부분적으로 결실된" 또는 "완전히 결실된")이라는 표현은 유전자의 발현 및/또는 활성이 파괴되도록 하는 충분한 양의 코딩 서열의 결실을 지칭한다.
코딩 서열의 결실은 부분적일 수 있다 (즉, 코딩 서열의 일부가 결실된다). 결실은 예를 들어, 유전자의 코딩 서열의 적어도 50, 60, 70, 80 또는 90%를 제거할 수 있다. 유전자 발현 및/또는 활성을 파괴시키기 위해 결실되어야 하는 코딩 서열의 양은 극소량일 수 있다. 예를 들어, 유전자의 부분적 결실은, 단 시작 코돈 (ATG)의 결실만으로도 유전자의 발현 및/또는 활성을 파괴시키는 데 충분하다면, 이를 의미할 수 있다. 다른 극단에서, 결실은 완전한 것일 수 있으며, 이 경우, 유전자의 코딩 서열의 100%가 결실된다 (즉, 야생형 분리주의 상응하는 게놈과 비교할 때, 코딩 서열 모두 부재). 다시 말해, "완전히 결실된"은 해당 유전자의 코딩 서열 모두가 결실된 것을 의미한다.
유전자의 부분적 및 완전한 결실은 관련 기술분야에 공지된 기술, 예컨대, Cre-LoxP 및 Flp-FRT 시스템을 통한 조건부 표적화를 사용하여, 또는 조작된 뉴클레아제, 예컨대, 메가뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성인자 유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) 및 CRISPR-Cas 시스템의 Cas를 이용하여 이중 가닥 파단 (DSB) 및 수복을 유도함으로써 이루어질 수 있다. DSB 수복은 DSB의 어느 한쪽에 플랭킹하는 서열과 상동성인 서열 내에 원하는 돌연변이된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 제공함으로써 원하는 돌연변이를 도입하기 위해 이용될 수 있다. 그 결과 원하는 돌연변이가 DSB 부위에 삽입된다. 상기와 같은 뉴클레아제는 게놈 내의 특정 부위에서 DSB를 유도하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 키메라 메가뉴클레아제는 관심 유전자 또는 게놈 영역 내의 표적 인식 서열을 인식하기 위해 공지된 단백질 유닛을 조합함으로써 쉽게 생성될 수 있다. ZFN은 또한 예를 들어, DNA의 특정 영역에 결합하기 위해 특이성이 공지된 아연 핑거 유닛을 조합하여 특정 서열을 표적화하도록 디자인될 수 있다. TALEN은 뉴클레아제 도메인을 DNA 결합 TALE (전사 활성인자 유사 이펙터) 도메인에 융합하여 디자인된 인공 제한 효소이다. TALE 도메인은 단일 뉴클레오티드를 인식하는 아미노산 반복부로 이루어진 탠덤 어레이이며, 이는 DNA의 특정 영역을 표적화하도록 디자인될 수 있다. CRISPR-Cas 시스템은 Cas (CRISPR-연관 단백질) 뉴클레아제, 및 CRISPR 서열에 상보적인 DNA의 특정 가닥을 인식하고 절단하도록 Cas 단백질을 가이드하는 CRISPR (일정한 간격을 두고 주기적으로 분포하는 짧은 회문 반복부) RNA 서열로 이루어진다. 따라서, 단일 가닥 가이드 RNA (sgRNA)는 DNA의 특정 영역에 결합하고, Cas가 DSB를 도입하게 가이드하도록 디자인될 수 있다. 따라서, 유전자의 뉴클레오티드 (예컨대, DNA 또는 cDNA) 서열이 공지되어 있다면, 공지된 뉴클레아제 시스템을 이용하여 유전자에 부분적 또는 전체 결실을 도입할 수 있다.
코딩 서열의 결실은 연속적일 수 있거나, 또는 복수의 코딩 서열 섹션의 결실을 포함할 수 있다. 결실은 결실이 유전자의 발현 및/또는 활성을 파괴하도록, 즉, 기능성 유전자 생성물, 예컨대, 단백질이 유전자로부터 더 이상 생성되지 않도록 충분한 양의 코딩 서열을 제거하여야 한다.
중단
유전자의 발현 및/또는 활성은 유전자의 중단에 의해 파괴될 수 있다. 다시 말해, 유전자의 발현 및/또는 활성을 파괴하는 돌연변이는 유전자를 중단시키는 것일 수 있다.
본 발명의 ASFV의 한 실시양태에서, 유전자 EP153R, EP402R 및 K145R은 각각 중단될 수 있다. EP153R 유전자는 중단될 수 있다. EP402R 유전자는 중단될 수 있다. K145R 유전자는 중단될 수 있다.
"중단"은 돌연변이가 기능성 유전자 생성물, 예컨대, 단백질이 더 이상 생성되지 않도록 유전자의 코딩 서열을 변경하는 것을 의미한다. 용어 "중단"은 유전자를 중단시키는 돌연변이를 지칭하기 위해 본원에서 사용될 수 있다. 돌연변이(들)는 유전자의 발현 및/또는 활성이 파괴되는, 즉, 유전자로부터 기능성 유전자 생성물, 예컨대, 단백질이 더 이상 생성되지 않도록 하는 방식으로 코딩 서열을 중단시켜야 한다.
중단은 유전자의 코딩 서열 내의 결실 (즉, 하나 이상의 뉴클레오티드의 제거) 뿐만 아니라, 유전자의 코딩 서열 내의 치환 (즉, 하나 이상의 뉴클레오티드의 상이한 뉴클레오티드로의 대체) 및 삽입 (즉, 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가)을 포함할 수 있다.
중단은 유전자 생성물 생성을 완전히 폐기할 수 있다. 예를 들어, 유전자 생성물이 단백질인 경우, 중단은 mRNA를 넌센스로 만들어 mRNA가 분해되고, 단백질이 번역되지 않도록 하여 단백질 생성을 폐기시킬 수 있다. 중단은 생성되는 유전자 생성물을 변경할 수 있다. 중단으로 유전자는 전사 및/또는 번역되지 않을 수 있다.
중단은 점 돌연변이 (즉, 단일 뉴클레오티드의 치환, 삽입 또는 결실)일 수 있다. 중단은 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입일 수 있다. 중단은 결실일 수 있다. 유전자는 유전자의 중단을 초래하는 다중 돌연변이를 포함할 수 있다.
중단은 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실에 의해 유발되는 프레임 시프트 돌연변이일 수 있다. 프레임 시프트에 기인하여 프레임 시프트 하류의 코돈은 상이한 아미노산으로 판독된다. 생성되는 단백질은 비-기능성일 수 있다.
중단은 시작 코돈의 돌연변이일 수 있다. 시작 코돈은 전형적으로 ATG이다. 시작 코돈의 돌연변이 (예컨대, 뉴클레오티드 중 1개, 2개 또는 3개의 점 돌연변이)는 번역이 해당 코돈에서 시작되지 않다는 것을 의미한다. 번역은 더 하류에 있는 후속 시작 코돈에서 시작될 수 있다. 후속 시작 코돈이 프레임 내에 있는 경우, N-말단이 말단절단된 단백질 버전이 생성되어 비-기능성일 수 있다. 후속 시작 코돈이 프레임 내에 있지 않다면, 완전히 상이하거나, 또는 넌센스 단백질이 생성되고, 이는 비-기능성일 수 있다. 후속 시작 코돈이 않다면, 번역이 완전히 폐기되고, 단백질은 생성되지 않는다.
중단은 정지 코돈 (TAG, TAA 또는 TGA)의 돌연변이일 수 있다. 정지 코돈의 돌연변이 (논스톱 돌연변이로도 지칭)에 기인하여 mRNA는 번역되지 않아야 하는 서열로 계속 번역된다. 생성된 단백질은 그의 과도한 길이로 인해 비-기능성일 수 있다.
아미노산 변이
본 발명의 ASF 바이러스의 실시양태에서, EP402R 유전자는 EP402R 단백질의 리간드 결합 도메인 중의 하나 이상의 아미노산을 변이시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. EP402R의 아미노산 변이는 본원 다른 곳에 상세히 설명되어 있다.
ASF 바이러스에서의 돌연변이 조합
본원에 기재된 유전자 발현 및/또는 활성을 파괴시키는 돌연변이는 본 발명의 ASFV에서 조합될 수 있다. 즉, 본 발명의 ASFV에서 EP153R 및 EP402R 유전자는 각각 다른 유전자 중 임의의 것과 동일한 유형의 돌연변이에 의해, 또는 다른 유전자 중 임의의 것과 상이한 유형의 돌연변이에 의해 파괴될 수 있다. 추가로, K145R 유전자는 다른 유전자 중 임의의 것과 동일한 유형의 돌연변이에 의해, 또는 다른 유전자 중 임의의 것과 상이한 유형의 돌연변이에 의해 파괴될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 ASFV에서, EP153R은 완전한 결실에 의해 파괴될 수 있고, EP402R은 그의 리간드 결합 도메인 중의 아미노산 변이에 의해 파괴될 수 있고, K145R은 프로모터 서열의 돌연변이에 의해 파괴될 수 있다. 대안적인 예로서, EP153R은 중단에 의해 파괴될 수 있고, EP402R은 완전한 결실에 의해 파괴될 수 있고, K145R은 부분적 결실에 의해 파괴될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은
EP153R 유전자가 완전히 결실되고,
EP402R 유전자가, Georgia 2007/1 EP402R 단백질 (서열식별번호 24)의 Q96에 상응하는 EP402R 단백질 중의 위치의 아미노산을 R로 변이시키는 돌연변이를 포함하는 것인 ASFV를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
EP153R 유전자 및 K145R 유전자가 각각 완전히 결실되고,
EP402R 유전자가, Georgia 2007/1 EP402R 단백질 (서열식별번호 24)의 Q96에 상응하는 EP402R 단백질 중의 위치의 아미노산을 R로 변이시키는 돌연변이를 포함하는 것인 ASFV를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
EP153R 유전자가 완전히 결실되고,
EP402R 유전자가, Georgia 2007/1 EP402R 단백질 (서열식별번호 24)의 W99에 상응하는 EP402R 단백질 중의 위치의 아미노산을 D로 변이시키는 돌연변이를 포함하는 것인 ASFV를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
EP153R 유전자 및 K145R 유전자가 각각 완전히 결실되고,
EP402R 유전자가, Georgia 2007/1 EP402R 단백질 (서열식별번호 24)의 W99에 상응하는 EP402R 단백질 중의 위치의 아미노산을 D로 변이시키는 돌연변이를 포함하는 것인 ASFV를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 EP153R 유전자 및 K145R 유전자가 각각 완전히 결실되고, 서열식별번호 33의 서열을 포함하는 EP402R 단백질을 포함하는 것인 ASFV를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 EP153R 유전자, EP402R 유전자 및 K145R 유전자가 각각 완전히 결실된 것인 ASFV를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은
ASFV 게놈이 Georgia 2007/1 균주의 것과 동일하되,
단, 예외적으로,
EP153R 유전자 및 K145R 유전자가 각각 완전히 결실되고,
EP402R 유전자가 EP402R 단백질의 Q96을 R로 변이시키는 돌연변이를 포함하는 것인 ASFV를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 EP153R 유전자 및 K145R 유전자가 각각 완전히 결실되고, 서열식별번호 33의 서열을 포함하는 EP402R 단백질을 포함하고, 여기서, ASFV의 게놈은 Georgia 2007/1 균주의 것에 상응하는 것인 ASFV를 제공한다.
의학적 용도, 백신 및 제약 조성물
본 발명에서, 대상체에서 질환을 치료 및/또는 예방하는 데 사용하기 위한 본 발명의 ASF 바이러스를 제공한다. 본 발명은 또한 대상체에서의 질환 치료 및/또는 예방용 위한 의약의 제조를 위한 본 발명의 ASF 바이러스의 용도를 제공한다. 적합하게, 질환은 아프리카 돼지 열병이다.
본 발명은 또한 본 발명의 약독화된 ASF 바이러스를 포함하는 백신을 제공한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "백신"은 대상체에게 투여될 때, 방어 면역 반응을 유도하거나, 자극하는 제제를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 백신은 부분적으로 방어 면역 반응을 유도한다. 일부 실시양태에서, 백신은 ASF 증상의 중증도 및/또는 지속 기간을 감소시키지만, ASF 증상을 완전히 폐기시키지는 못한다. 백신은 유기체가 특정 질환, 본 경우에는 ASF에 면역성을 나타내도록 만들 수 있다. 따라서, 본 발명의 백신은 대상체에서 후속 ASF 바이러스 챌린지로부터 방어하는 면역 반응을 유도한다. 본 발명의 약독화된 ASFV를 포함하는 백신은 복수의 ASF 바이러스 유전자형에 대한 교차-방어 면역 반응을 유도할 수 있다. 한 실시양태에서, 단일 유전자형의 본 발명의 약독화된 ASFV를 포함하는 백신은 복수의 ASF 바이러스 유전자형에 대한 교차-방어 면역 반응을 유도할 수 있다.
백신은 복수의 약독화된 ASF 바이러스를 포함할 수 있다. 복수의 약독화된 ASF 바이러스는 복수의 상이한 분리주, 예를 들어, 독성이 높거나, 알려지지 않은 상이한 분리주에 상응할 수 있다. 상기 백신은 복수의 ASF 바이러스 유전자형에 대한 교차-방어 면역 반응을 유도할 수 있다.
백신은 아프리카 돼지 열병 예방에 유용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 대상체에서 아프리카 돼지 열병을 치료 및/또는 예방하는 데 사용하기 위한 본 발명의 백신을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 하나 이상의 약독화된 ASF 바이러스(들)를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 제약 조성물은 아프리카 돼지 열병의 치료를 위해 사용될 수 있다.
백신 또는 제약 조성물은 본 발명의 하나 이상의 약독화된 ASF 바이러스(들) 및 임의적으로, 하나 이상의 애주번트, 부형제, 담체 및 희석제를 포함할 수 있다. 제약 부형제, 담체 또는 희석제의 선택은 의도된 투여 경로 및 표준 제약 관행과 관련하여 선택될 수 있다. 제약 조성물은 담체, 부형제, 또는 희석제로서 (또는 그에 추가로) 임의의 적합한 결합제(들), 활택제(들), 현탁화제(들), 코팅제(들), 가용화제(들) 및 다른 캐리어 작용제를 포함한다. 제약 조성물은 전형적으로 제조 및 보관 조건 하에서 멸균성이고, 안정하여야 한다. 비경구 투여용 제제는 현탁제, 액제, 유성 또는 수성 비히클 중의 에멀젼, 페이스트, 및 이식가능한 지속 방출형 또는 생분해성 제제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 멸균 주사용 제제는 비경구적으로 허용되는 비독성 희석제 또는 용매를 사용하여 제조될 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 사용된 투여량 및 농도에서 대상체에게 비독성인, 제약상 허용되는 분산화제, 습윤화제, 현탁화제, 등장제, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 담체, 부형제, 염, 또는 안정제를 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 조성물은 예를 들어, 비경구 (예컨대, 피하, 진피내, 또는 정맥내 주사) 또는 경막내 투여와 같은, 주어진 투여 방법 및/또는 투여 부위와 화합성을 나타내는, 질환 치료에 사용하기 위한 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
백신 또는 제약 조성물은 본 발명의 하나 이상의 약독화된 ASF 바이러스(들)를 유효량으로 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 대상체에게 투여될 때, 병독성 ASF 바이러스로의 후속 챌린지로부터 방어하는 면역 반응을 유도하는 본 발명의 약독화된 ASF 바이러스를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 대상체에 투여될 때, 백신의 약독화된 ASF 바이러스에 대한 상이한 유전자형의 병독성 ASF 바이러스로의 후속 챌린지로부터 방어하는 면역 반응을 유도하는 본 발명의 약독화된 ASF 바이러스를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 대상체에 투여될 때, 임의의 유전자형의 병독성 ASF 바이러스로의 후속 챌린지로부터 방어하는 면역 반응을 유도하는 본 발명의 약독화된 ASF 바이러스를 제공한다. 따라서, 본 발명은 아프리카 돼지 열병이 백신의 ASF 바이러스와 상이한 유전자형의 ASF 바이러스에 의해 유발되는 것인, 아프리카 돼지 열병 치료 및/또는 예방에서 사용하기 위한, 약독화된 ASF 바이러스를 포함하는 백신을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 아프리카 돼지 열병이 임의의 유전자형의 ASF 바이러스에 의해 유발되는 것인, 아프리카 돼지 열병 치료 및/또는 예방에서 사용하기 위한, 약독화된 ASF 바이러스를 포함하는 백신을 제공한다. 한 실시양태에서, 백신의 ASF 바이러스는 유전자형 II, 예컨대, Georgia 2007/1 균주에 상응하고, 백신은 유전자형 I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X 및/또는 XIV로의 감염에 대해 방어적이다. 한 실시양태에서, 백신의 ASF 바이러스는 유전자형 II, 예컨대, Georgia 2007/1 균주에 상응하고, 백신은 유전자형 I, IX, X, XIV, 및/또는 VIII로의 감염에 대해 방어적이다. 한 실시양태에서, 백신의 ASF 바이러스는 유전자형 II, 예컨대, Georgia 2007/1 균주에 상응하고, 백신은 유전자형 I, IX, 및/또는 X으로의 감염에 대해 방어적이다.
예방/치료 방법
본 발명은 또한 유효량의 본 발명의 약독화된 바이러스, 백신 또는 제약 조성물을 대상체에게 투여함으로써 대상체에서 ASF를 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공한다.
"예방하는"이라는 용어는 ASF의 발병을 방지, 지연, 방해 또는 저해하는 것을 지칭하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 백신은 감염성 ASFV가 세포에 진입할 가능성을 예방하거나, 또는 감소시킬 수 있다. 백신은 ASF 증상의 중증도 및/또는 지속 기간을 감소시킬 수 있다. 백신은 ASF 증상을 완전히 폐기시킬 수 있다.
"치료하는"이라는 용어는 기존 ASF 감염의 적어도 하나의 증상을 감소 또는 완화시키는 것을 지칭하는 것으로 의도된다.
대상체는 ASF 감염에 걸리기 쉬운 임의의 동물일 수 있다. ASF에 걸리기 쉬운 동물로는 가축용 돼지, 와트호그, 부시피그 및 진드기를 포함한다.
본 발명에 따라 백신접종받는 대상체는 가축용 돼지일 수 있다.
적합하게, 본원에 정의된 방어 면역은 예컨대, 백신접종받은 어미 돼지와 같은 백신접종받은 대상체로부터 초유를 먹인 새끼 돼지에게 부여될 수 있다.
투여
본 발명의 백신은 예컨대, 근육내 주사와 같은 임의의 편리한 경로에 의해 투여될 수 있다. 다른 적합한 투여 경로로는 비내, 경구, 피하, 경피 및 질 (예컨대, 인공 수정 동안)을 포함한다. 한 실시양태에서, 경구 투여는 동물 사료 또는 음용수에 백신을 첨가하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 백신은 야생 동물용 미끼, 예를 들어, 멧돼지, 야생 돼지, 부시피그 또는 와트호그에 적합한 미끼에 첨가될 수 있다.
돼지 면역화를 위한 용량은 돼지당 약 103 내지 약 106 HAD50 또는 TCID50일 수 있다. 돼지 면역화를 위한 용량은 돼지당 약 103 내지 약 106 TCID50일 수 있다. 돼지 면역화를 위한 용량은 돼지당 104 HAD50 또는 TCID50 미만일 수 있다. 예를 들어, 용량은 102-103 HAD50 또는 TCID50일 수 있다. 용량은 돼지당 약 102 HAD50 또는 TCID50일 수 있다. 용량은 수의사의 합리적인 판단 범위 내에서 수의사가 결정할 수 있다.
백신은 프라임-부스트 요법에 따라 투여될 수 있다. 예를 들어, 1차 접종 후, 대상체는 일정 시간 (예컨대, 약 7, 14, 21 또는 28일) 후에 2차 부스팅 투여를 받을 수 있다. 전형적으로, 부스팅 투여는 프라이밍 투여보다 더 높은 용량이다. 부스팅 용량은 돼지당 약 103 내지 약 106 HAD50 또는 TCID50일 수 있다. 부스팅 용량은 돼지당 약 103 내지 약 106 TCID50일 수 있다.
바이러스 제조 방법
본 발명은 또한 EP402R 단백질의 리간드 결합 도메인 중의 하나 이상의 아미노산을 변이시키는 단계를 포함하고, 여기서, 아미노산 변이는 EP402R 단백질의 리간드 결합을 파괴시키는 것인, 본 발명의 ASF 바이러스를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 EP402R 단백질의 리간드 결합 도메인 중의 하나 이상의 아미노산 변이를 변이시키는 단계를 포함하고, 여기서, 아미노산 변이는 EP402R 단백질의 리간드 결합을 파괴시키는 것인, 혈구흡착을 유도하는 ASF 바이러스의 능력을 감소시키는 방법을 제공한다.
EP402R 단백질의 리간드 결합 도메인 중의 아미노산 변이는 본원에 기재된 아미노산 변이 중 임의의 것일 수 있다. 상기 아미노산 변이는 본원에 기재된 바와 같이 ASFV 게놈을 돌연변이시킴으로써 이루어질 수 있다.
한 실시양태에서, 본 방법은 Georgia 2007/1 EP402R 단백질 (서열식별번호 24)의 Q96 및/또는 W99에 상응하는 위치의 EP402R 단백질 중의 하나 이상의 아미노산을 변이시키는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 EP153R 및 EP402R 유전자의 발현 및/또는 활성을 파괴시키는 단계를 포함하는, ASF 바이러스를 약독화시키는 방법을 제공한다. 적합하게, 본 방법은 혈구흡착을 매개하는 EP153R 유전자 및/또는 EP402R 유전자의 능력을 파괴시키는 단계를 포함한다.
유전자 발현 및/또는 활성 파괴는 본원에 기재된 임의의 방식으로 ASFV 게놈을 돌연변이시킴으로써 달성될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 방법은 DIVA 돌연변이를 ASF 바이러스 내로 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 적합하게, DIVA 돌연변이는 K145R 유전자의 발현을 파괴시킨다. 적합하게, K145R은 적어도 부분적으로 결실, 바람직하게, 완전히 결실된다. 적합하게, K145R 유전자는 중단된다. 적합하게, DIVA 돌연변이는 B125R 유전자의 발현을 파괴시킨다. 적합하게, B125R은 적어도 부분적으로 결실, 바람직하게, 완전히 결실된다. 적합하게, B125R 유전자는 중단된다.
ASFV를 제조 및/또는 약독화시키는 방법의 한 실시양태에서, EP153R 유전자는 적어도 부분적으로 결실, 바람직하게, 완전히 결실된다. 한 실시양태에서, EP153R 유전자는 중단된다.
ASFV를 제조 및/또는 약독화시키는 방법의 한 실시양태에서, EP402R 유전자는 적어도 부분적으로 결실, 바람직하게, 완전히 결실된다. 한 실시양태에서, EP402R 유전자는 중단된다. 적합하게, 본 방법은 하나 이상의 돌연변이를 포함하지 않는 상응하는 ASF 바이러스와 비교하여 EP402R 단백질의 표면 발현을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 EP402R 유전자에 도입시키는 단계를 포함한다. 적합하게, 본 방법은 EP402R 단백질에 의한 리간드 결합을 파괴시키는 하나 이상의 돌연변이를 EP402R 유전자에 도입시키는 단계를 포함한다. 적합하게, 본 방법은 EP402R 단백질의 리간드 결합 도메인 중의 하나 이상의 아미노산을 변이시키는 하나 이상의 돌연변이를 EP402R 유전자에 도입시키는 단계를 포함한다. 적합하게, 하나 이상의 아미노산은 상이한 아미노산으로 변이된다. 적합하게, 아미노산의 상이한 아미노산으로의 변이는 EP402R 상의 결합 표면을 변경함으로써 EP402R과 그의 리간드 사이의 상호작용을 직접 억제한다.
한 실시양태에서, 본 방법은 Georgia 2007/1 EP402R 단백질 (서열식별번호 24)의 Q96 및/또는 W99에 상응하는 위치의 EP402R 단백질 중의 아미노산을 변이시키는 단계를 포함한다. 적합하게, Georgia 2007/1 EP402R 단백질 (서열식별번호 24)의 Q96에 상응하는 위치의 EP402R 단백질 중의 아미노산은 R로, 또는 R의 보존적 대체인 아미노산으로 변이되고/거나, Georgia 2007/1 EP402R 단백질 (서열식별번호 24)의 W99에 상응하는 위치의 아미노산은 D, 또는 D의 보존적 대체인 아미노산으로 변이된다. 적합하게, Q96에 상응하는 위치의 아미노산은 H, K 또는 R로 변이되고/거나, W99에 상응하는 위치의 아미노산은 D, E, N 또는 Q로 변이된다. 적합하게, Q96에 상응하는 위치의 아미노산은 R로 변이되고/거나, W99에 상응하는 위치의 아미노산은 D로 변이된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 각각의 EP153R 및 K145R 유전자를 완전히 결실시키는 단계, Georgia 2007/1 EP402R 단백질 (서열식별번호 24)의 Q96에 상응하는 위치의 아미노산을 R로 변이시키고/거나, Georgia 2007/1 EP402R 단백질 (서열식별번호 24)의 W99에 상응하는 위치의 아미노산을 D로 변이시키는 단계를 포함하는, ASF 바이러스를 약독화시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 각각의 EP153R 및 K145R 유전자를 완전히 결실시키는 단계, Georgia 2007/1 EP402R 단백질 (서열식별번호 24)의 Q96에 상응하는 위치의 아미노산을 R로 변이시키는 단계를 포함하는, ASF 바이러스를 약독화시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 ASF 바이러스를 제조 및/또는 약독화시키는 방법은 임의의 유전자형의 ASF 바이러스 (즉, 유전자형 I 내지 XXIV 중 임의의 것의 ASF 바이러스)에 적용될 수 있다. 다시 말해, 임의의 유전자형의 ASF 바이러스는 본 발명의 방법의 변형의 대상이 될 수 있다. 임의의 유전자형의 ASF 바이러스는 본 방법에서 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 ASF 바이러스를 제조 및/또는 약독화시키는 방법은 유전자형 II의 ASF 바이러스에 적용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 ASF 바이러스를 제조 및/또는 약독화시키는 방법은 Georgia 2007/1 균주의 ASF 바이러스에 적용될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 각각의 EP153R 및 K145R 유전자를 완전히 결실시키는 단계, Georgia 2007/1 EP402R 단백질 (서열식별번호 24)의 Q96을 R로 변이시키고/거나, Georgia 2007/1 EP402R 단백질 (서열식별번호 24)의 W99를 D로 변이시키는 단계를 포함하는, Georgia 2007/1 균주의 ASF 바이러스를 약독화시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 각각의 EP153R 및 K145R 유전자를 완전히 결실시키는 단계, 및 Georgia 2007/1 EP402R 단백질 (서열식별번호 24)의 Q96을 R로 변이시키는 단계를 포함하는, Georgia 2007/1 균주의 ASF 바이러스를 약독화시키는 방법을 제공한다.
바이러스 유전자의 돌연변이 방법은 관련 기술분야에에 공지되어 있다. 특히, 바이러스 유전자의 결실 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 관련 유전자(들)가 누락된 전달 벡터가 생성되고, 바이러스 감염 세포를 형질감염시키는 데 사용되는 상동성 재조합이 사용될 수 있다. 이어서, 서열의 새로운 부분을 발현하는 재조합 바이러스가 선택될 수 있다. 예를 들어, ATG 시작 코돈의 결실에 의해 유전자 발현을 중단하기 위해 유사한 절차가 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, ASF 바이러스를 약독화시키는 방법은 하기 유전자: MGF 110 3L, 6L, 7L, 8L, 10L, 11L 및 12L; MGF 360 5L, 6L, 7L, 10L, 11L, 12L, 13L, 14L, 20R, 21R 및 22R; 및 MGF 505 1R, 2R 및 6R 중 하나 이상의 기능을 보유하는 단계를 포함할 수 있다. 적합하게, 하기 유전자: MGF 110 3L, 6L, 7L, 8L, 10L, 11L 및 12L; MGF 360 5L, 6L, 7L, 10L, 11L, 12L, 13L, 14L, 20R, 21R 및 22R; 및 MGF 505 1R, 2R 및 6R 중 2개 이상, 예컨대, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개, 또는 22개의 것의 기능이 보유된다. 한 실시양태에서, ASF 바이러스를 약독화시키는 방법은 하기 유전자: MGF 110 3L, 6L, 7L, 8L, 10L, 11L 및 12L; MGF 360 5L, 6L, 7L, 10L, 11L, 12L, 13L, 14L, 20R, 21R 및 22R; 및 MGF 505 1R, 2R 및 6R 모두의 기능을 보유하는 단계를 포함할 수 있다.
유전자의 "기능을 보유한다"는 것은 약독화 과정에서 유전자의 발현 및 활성이 영향을 받지 않는다는 것을 의미한다. 생성된 약독화된 바이러스는 유전자의 기능성 버전을 발현하여야 한다. 적합하게, 그 기능이 보유되어야 하는 유전자 약독화 방법에 의해 변경되지 않는다. 적합하게, 그 기능이 보유되어야 하는 유전자의 서열은 약독화 방법에 의해 변경되지 않는다.
본 개시내용은 본원에 개시된 예시적인 방법 및 물질에 의해 제한되지는 않으며, 본원에 기재된 것과 유사하거나, 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본 개시내용의 실시양태의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있다. 수치 범위는 그 범위를 정의하는 수치를 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 각각 임의의 핵산 서열은 5'에서 3' 방향으로 좌측에서 우측으로 작성되고; 아미노산 서열은 각각 아미노에서 카르복시 방향으로 좌측에서 우측으로 작성된다.
본원 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "하나"는 문맥상 달리 명확하게 지시하지 않는 한, 복수의 지시대상을 포함한다는 점에 주의하여야 한다.
본원에 사용된 바와 같이, "포함하는," "포함한다" 및 "~으로 구성된"이라는 용어는 "수반하는," "수반한다" 또는 "함유하는," "함유한다"와 동의어이고, 포괄적이거나, 또는 개방적이고, 추가의, 언급되지 않은 구성원, 요소 또는 방법 단계를 배제시키지 않는다. "포함하는," "포함한다" 및 "~으로 구성된"이라는 용어는 또한 "~으로 이루어진"이라는 용어도 포함한다.
본원에 논의된 공개문헌은 단지 본 출원의 출원일 이전에 상기 공개문헌의 개시를 위해서만 제공된다. 본원의 어느 것도 상기 공개문헌이 본원에 첨부된 청구범위에 대한 선행 기술을 구성한다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
추가 측면
본 발명은 또한 하기 넘버링된 항(paragraph (para))에서 정의된 바와 같은 추가 측면을 제공한다.
1. 유전자 EP153R 및 K145R의 발현 및/또는 활성이 파괴된, 약독화된 아프리카 돼지 열병 (ASF) 바이러스.
2. 제1항에 있어서, EP402R 유전자의 발현 및/또는 활성이 파괴되지 않은 것인, 약독화된 ASF 바이러스.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하기 유전자:
다중유전자 패밀리 (MGF) 110 3L, 6L, 7L, 8L, 10L, 11L 및 12L,
MGF 360 5L, 6L, 7L, 10L, 11L, 12L, 13L, 14L, 20R, 21R 및 22R, 및
MGF 505 1R, 2R 및 6R 중 하나 이상의 기능성 버전을 포함하는 것인 약독화된 ASF 바이러스.
4. 임의의 상기 항에 있어서, K145R 유전자가 적어도 부분적으로 결실, 바람직하게, 완전히 결실된 것인 약독화된 ASF 바이러스.
5. 제4항에 있어서, K145R 유전자가 중단된 것인 약독화된 ASF 바이러스.
6. 임의의 상기 항에 있어서, EP153R 유전자가 적어도 부분적으로 결실, 바람직하게, 완전히 결실된 것인 약독화된 ASF 바이러스.
7. 임의의 상기 항에 있어서, EP153R 유전자가 중단된 것인 약독화된 ASF 바이러스.
8. 임의의 상기 항에 있어서, EP153R 및 K145R 이외의 다른 모든 ASF 바이러스 유전자의 기능성 버전을 포함하는 약독화된 ASF 바이러스.
9. 임의의 상기 항에 있어서, 약독화된 ASF 바이러스의 게놈이 유전자형 II에 상응하거나, 또는 본질적으로 그에 상응하는 것인 약독화된 ASF 바이러스.
10. 제9항에 있어서, 약독화된 ASF 바이러스의 게놈이 Georgia 2007/1 균주의 것에 상응하거나, 또는 본질적으로 그에 상응하는 것인 약독화된 ASF 바이러스.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 항에 있어서, 대상체에서 질환을 치료 및/또는 예방하는 데 사용하기 위한 ASF 바이러스.
12. 대상체에서의 질환 치료 및/또는 예방용 의약의 제조를 위한 제1항 내지 제10항 중 어느 항에 따른 ASF 바이러스의 용도.
13. 제1항 내지 제10항 중 어느 항에 따른 ASF 바이러스를 포함하는 제약 조성물.
14. 제13항에 있어서, 대상체에서 질환을 치료 및/또는 예방하는 데 사용하기 위한 제약 조성물.
15. 제11항에 있어서, 제12항에 있어서, 또는 제14항에 있어서, 질환이 아프리카 돼지 열병인, ASF 바이러스, ASF 바이러스의 용도 또는 제약 조성물.
16. 제1항 내지 제10항 중 어느 항에 따른 ASF 바이러스를 포함하는 백신.
17. 제16항에 있어서, 대상체에서 아프리카 돼지 열병을 치료 및/또는 예방하는 데 사용하기 위한 백신.
18. 제17항에 있어서, 아프리카 돼지 열병이 백신의 ASF 바이러스와 상이한 유전자형의 ASF 바이러스에 유발되는 것인, 백신.
19. 대상체에게 유효량의, 제13항에 따른 제약 조성물, 또는 제16항에 따른 백신을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 아프리카 돼지 열병을 치료 및/또는 예방하는 방법.
20. 제11항에 있어서, 제12항에 있어서, 제14항에 있어서, 제17항에 있어서, 또는 제19항에 있어서, 대상체가 가축용 돼지인, ASF 바이러스, ASF 바이러스의 용도, 제약 조성물, 백신, 또는 방법.
21. 제17항, 제18항 또는 제20항 중 임의의 항에 있어서, 또는 제19항 또는 제20항에 있어서, 백신이 프라임-부스트 요법에 따라 투여되는 것인, 백신, 또는 방법.
22. EP153R 및 K145R 유전자의 발현 및/또는 활성을 파괴시키는 단계를 포함하는, ASF 바이러스를 약독화시키는 방법.
23. 제22항에 있어서, K145R 유전자가 적어도 부분적으로 결실, 바람직하게, 완전히 결실되는 것인 방법.
24. 제23항에 있어서, K145R 유전자가 중단되는 것인 방법.
25. 제22항 내지 제24항 중 어느 항에 있어서, EP153R 유전자가 적어도 부분적으로 결실, 바람직하게, 완전히 결실되는 것인 방법.
26. 제22항 내지 제25항 중 어느 항에 있어서, EP153R 유전자가 중단되는 것인 방법.
이제 본 발명은 실시예를 통해 추가로 설명될 것이며, 이는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 본 발명을 수행하는 데 도움을 주기 위한 것이며, 어느 방식으로든 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1 - HAD를 감소시키는 EP402R / CD2v 돌연변이체 확인
아프리카 돼지 열병 바이러스 (ASFV) Benin 분리주 EP402R 단백질 (CD2v)에서 돌연변이화하고, 상기 돌연변이가 혈구흡착 (HAD)에 미치는 효과에 대해 시험하였다.
CD2v의 세포외, N-말단, IgG 유사, 리간드 결합 도메인의 모델을 생성하고, CD2v가 그의 리간드에 결합하는 데 관여하는 기능성 아미노산 잔기를 예측하는 데 사용하였다. 이들 잔기를 개별적으로 돌연변이시켜 돌연변이체 CD2v 단백질 세트를 생성하였다.
Vero 세포를 T7RNA 폴리머라제를 발현하는 변형된 백시니아 바이러스 앙카라로 감염시키고, C-말단 HA 에피토프 태그가 있는 야생형 또는 돌연변이체 CD2v 전장 단백질을 발현하는 플라스미드 (pcDNA3)로 형질감염시켰다. 돼지 적혈구를 첨가하고, 적혈구의 표면에의 부착에 대해 세포를 관찰하였다. 투과성 세포를 사용하여 공초점 현미경법에 의해 및 HA 태그를 인식하는 항체 및 2차 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 야생형 또는 돌연변이체 CD2v 단백질의 발현을 모두 확인하였다. 야생형 또는 돌연변이체 CD2v의 세포 표면 발현은 또한 야생형 CD2v 유전자를 함유하는 약독화된 ASFV로 면역화된 돼지로부터의 혈청, 이어서, 2차 항체로 비투과성 세포를 염색함으로써 확인하였다 (도 1).
Benin CD2v 중 잔기 E99 또는 Y102의 돌연변이는 HAD를 폐기하였다. 2는 HAD 검정법으로부터의 예시적인 이미지를 보여주는 것이다. 2a는 야생형 Benin CD2v를 발현하는 플라스미드로 형질감염된 세포를 보여주는 것이다. 적혈구의 HAD는 3개의 세포 주위에서 관찰된다. 2b는 Y102 잔기가 D로 돌연변이된 CD2v를 발현하는 세포를 보여주는 것이다. 한 세포 주위에서 부분적인 HAD가 관찰된다. 2c는 잔기 E99가 R로 돌연변이된 CD2v를 발현하는 세포를 보여주는 것이다. HAD는 관찰되지 않는다.
Benin CD2v 잔기 E99는 다양한 유전자형의 상이한 ASFV 분리주로부터의 CD2v 리간드 결합 도메인의 아미노산 서열의 정렬에 의해 제시된 바와 같이, ASFV에서 강력하게 보존된다 ( 3). 다른 분리주의 등가의 잔기 (도 3에서 황색으로 강조 표시)는 동일하거나 (E), 또는 동일한 전하를 가진다 (Q).
Georgia CD2v 중의 Benin CD2v E99에 상응하는 잔기인 Q96은 R로 돌연변이되었고, 상기 기재된 HAD 검정법을 사용하여 HAD를 유도할 수 있는 돌연변이체 단백질의 능력을 시험하였다 (Vero 세포에서 플라스미드로부터 발현된 야생형 및 돌연변이체 CD2v 단백질). Georgia CD2v에서 Q96의 돌연변이는 HAD를 폐기하였다. 4는 돼지 적혈구가 있는 Vero 세포의 HAD 검정법으로부터의 예시적인 이미지를 보여주는 것이다. 4a는 야생형 Benin CD2v를 발현하는 플라스미드로 형질감염된 Vero 세포를 보여주는 것이다. 적혈구의 HAD는 4개의 세포 주위에서 관찰된다. 4b는 야생형 Georgia CD2v를 발현하는 Vero 세포를 보여주는 것이다. HAD는 2개의 세포 주위에서 관찰된다. 도 4c는 잔기 Q96이 R로 돌연변이된 Georgia CD2v를 발현하는 Vero 세포를 보여주는 것이다. HAD는 관찰되지 않는다. 도 4d는 형질감염되지 않은 Vero 세포를 보여주는 것이다. HAD는 관찰되지 않는다.
동일한 검정법을 사용하여, 하기 돌연변이가 Benin에서 HAD에 영향을 미치는 것으로 결정되었다: N16R, I 19R, W21D, Y 76D, E99R, Y102D. 추가로, E99R + N108R의 조합이 Benin에서 HAD에 영향을 미치는 것으로 결정되었다.
하기 돌연변이가 Georgia에서 HAD에 영향을 미치는 것으로 결정되었다: S15R, W19D, Q96R, N104R, 및 K108D. 추가로, S15R + W19D 및 Q96R + N104R의 조합이 Georgia에서 HAD에 영향을 미치는 것으로 결정되었다.
하기 돌연변이가 N10 유전자형 IX에서 HAD에 영향을 미치는 것으로 결정되었다: W20D, R125D, Q112R + N121R.
실시예 2 - DIVA 마커 스크리닝
백신접종받은 동물로부터의 감염된 동물 감별 (DIVA) 마커 역할을 하는 유전자의 경우, 유전자로부터 발현되는 단백질이 면역원성이어야 한다. 다시 말해, DIVA 단백질을 발현하는 바이러스로 감염된 대상체는 DIVA 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하여야 한다. 이러한 방식으로, DIVA 백신 (DIVA 마커 유전자가 결여된 바이러스)으로 백신접종받은 동물은 백신접종받은 동물의 혈청이 DIVA 마커 단백질에 대한 항체를 포함하지 않기 때문에, 야생형 바이러스 (DIVA 마커 유전자를 발현)로 감염된 동물로부터 감별될 수 있는 반면, 감염된 동물의 혈청은 DIVA 마커 단백질에 대한 항체를 포함할 것다.
DIVA 마커 역할을 할 수 있는 ASFV 유전자의 선택은 세포에서 각 유전자를 발현하고, 생성된 단백질이 이전에 ASFV로 감염된 돼지로부터 채취한 혈청에 의해 검출될 수 있는지 여부를 시험함으로써 스크리닝하였다. 혈청에 의한 검출은 감염된 돼지에서 ASFV에 의해 발현된 단백질이 감염된 돼지에서 항체 반응을 유도했다는 것을 나타낼 것이다. 따라서, 상기 단백질은 DIVA 마커의 후보였다.
특히, HA 또는 V5 에피토프 태그에 융합된 개별 ASFV 유전자 (공지된 필수 유전자 제외)를 코딩하는 71개의 플라스미드를 Vero 세포에 형질감염시켰다. 세포를 고정시키고, 투과시키고, 상이한 ASFV 균주로 감염된 돼지의 항혈청으로 염색한 후, 형광 표지된 2차 항체로 염색하였다. 공초점 현미경을 사용하여 발현된 유전자가 혈청에 의해 검출될 수 있는지 여부를 평가하였다. 동시에, 세포를 ASFV 유전자에 융합된 HA 또는 V5 태그에 대한 항체 및 다른 형광 표지된 2차 항체로 염색하여 단백질의 발현을 확인하였다.
세포 염색에 사용된 돼지 혈청은 하기 ASFV 균주로 면역화된 면역화 연구의 돼지로부터의 것이었다: BeninΔDP148R (돼지 5마리), BeninΔMGF (돼지 6마리), OURT88/3 (돼지 5마리) 및 GeorgiaΔMGF (돼지 4마리). 각 돼지에 대해, 면역화 전 혈청 샘플 (대조군으로서) 및 면역화 후, 챌린지 전 혈청 샘플을 사용하였다.
유전자의 초기 스크리닝은 BeninΔDP148R 면역화된 돼지로부터의 혈청 (0일째의 면역화 전 혈청, 면역화 후 38일째의 면역화 후 혈청)을 사용하여 수행하였다. ASFV 유전자 CP204L, B646L 및 E183L을 양성 대조군으로 사용하고, 면역화 후 혈청을 사용하여 검출하였다. 면역화 전 혈청은 어떤 유전자도 검출하지 못했다.
6개의 ASFV 유전자가 하기 표 7에 제시된 바와 같이 BeninΔDP148R 면역화 후 혈청을 사용하여 검출되었다 (++는 강한 검출을 나타내고, +는 약한 검출을 나타내고, -는 비검출을 나타낸다).
<표 7>
Figure pct00113
이어서, 초기 스크린에서 검출된 6개의 ASFV 유전자를 다른 3개의 면역화 연구의 돼지 혈청을 이용하여 시험하였다.
하기 표 8은 BeninΔMGF 바이러스로 면역화된 돼지 6마리로부터의 면역화 후 혈청을 사용한 ASFV 유전자의 검출을 보여주는 것이다 (15일에 부스팅, 면역화 후 38일째에 면역화 후 혈청 채취; 면역화 전 혈청은 음성이었다).
<표 8>
Figure pct00114
하기 표 9는 OURT88/3 바이러스로 면역화된 돼지 5마리로부터의 면역화 후 혈청을 사용한 ASFV 유전자의 검출을 보여주는 것이다 (면역화 후 20일째에 면역화 후 혈청 채취; 면역화 전 혈청은 음성이었고, 단, 돼지 2는 제외).
<표 9>
Figure pct00115
하기 표 10은 GeorgiaΔMGF 바이러스로 면역화된 돼지 4마리로부터의 면역화 후 혈청을 사용한 ASFV 유전자의 검출을 보여주는 것이다 (면역화 후 34일째에 면역화 후 혈청 채취; -3일째 채취된 면역화 전 혈청은 음성이었다). 돼지 2마리 (a)는 103 GeorgiaΔMGF로 면역화시켰고; 돼지 2마리 (b)는 104 GeorgiaΔMGF로 면역화시켰다.
<표 10>
Figure pct00116
K145R 단백질은 혈청의 65%에서 검출되었고, B125R은 혈청의 75%에서 검출되었다. B125R, B175L, E184L, H339R, K145R 및 M448R 유전자는 각각 개별적으로 결실되었다. B175L, E184L, H339R 또는 M448R 유전자는 결실될 수 없으며, 이는 바이러스 복제에 필수적이라는 것을 시사하는 것이다. 따라서, 스크린을 통해 K145R 및 B125R 유전자가 가장 유망한 잠재적 DIVA 마커인 것으로 확인되었다.
도 5는 세포에서 발현되는 K145R 및 B125R을 보여주는 것이다. Vero 세포를, HA 에피토프 태그가 프레임 내에서 융합된 K145R 또는 B125R을 발현하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 발현된 단백질은 HA에 대한 항체를 사용하여 투과된 세포에서 검출되었고, 공초점 현미경을 사용하여 이미징하였다. 녹색 염색은 발현된 단백질을 나타내고, 청색 DAPI 염색은 DNA를 검출한다. 5a는 K145R을 보여주고, 도 5b는 B125R을 보여주는 것이다.
도 6은 Vero 세포에서 발현되고, ASFV로 면역화된 돼지로부터의 항혈청에 의해 검출된 K145R(도 6a) 및 B125R(도 6b)의 스크리닝 과정의 예를 보여주는 것이다. 세포를 고정시키고, 투과시키고, 발현된 단백질을 검출하기 위해 항-HA (적색)로 및 약독화된 유전자형 I Benin97/1 유전자 결실 ASFV 균주 (녹색)로 면역화된 돼지의 혈청으로 염색하였다. 면역화 전 및 면역화 후 38일째에 수집된 혈청으로 염색된 세포의 이미지가 제시되어 있다. DNA는 청색으로 염색된다.
실시예 3 - 비-HAD ASFV GeorgiaΔK145RΔEP153RCD2vQ96R의 생성
상기 실시예에 기재된 관찰결과에 기초하여, K145R 및 EP153R 유전자가 결실되고, EP402R/CD2v 단백질이 Q96R 아미노산 치환을 포함하도록 돌연변이된 ASFV를 생성하였다. Georgia 2007/1 균주 (ASFV 유전자형 II의 균주)를 사용하였다. 따라서, ASFV는 GeorgiaΔK145RΔEP153RCD2vQ96R로 명명되었다.
HAD를 유도할 수 있는 GeorgiaΔK145RΔEP153RCD2vQ96R의 능력을 시험하였다. 돼지 골수 세포를 GeorgiaΔK145RΔEP153RCD2vQ96R 또는 대조군으로서 야생형 Georgia 2007/1로 감염시키고, 돼지 적혈구를 첨가하고, 표면에의 적혈구 부착에 대해 세포를 관찰하였다. HAD는 감염 후 1째일에 야생형 Georgia 2007/1로 감염된 세포에서 관찰된 반면 (도 7a - 적혈구가 감염된 세포 주위에 축적), 감염 후 1일째에 GeorgiaΔK145RΔEP153RCD2vQ96R로 감염된 세포에서는 HAD가 관찰되지 않았다 (도 7b).
실시예 4 - Georgia ΔK145RΔEP153RCD2vQ96R은 약독화된 것이고, 챌린지에 대한 방어를 유도한다.
백신접종 실험 프로토콜
체중이 17 내지 19 kg으로 다양한 7주령된, 6마리 라지 화이트(Large White)/랜드레이스(Landrace) 돼지 그룹 (그룹 K)을 GeorgiaΔK145RΔEP153RCD2vQ96R을 이용하여 1 ml당 104 TCID50으로 근육내 경로에 의해 면역화시키고, 21일 후 동일한 용량으로 동일한 경로에 의해 부스팅하였다. 추가로 18일 경과 후, 그룹 K의 면역화된 돼지 및 대조군의 비-면역 돼지 3마리 (그룹 M)를 병독성 유전자형 II ASF 바이러스 Georgia 2007/1을 이용하여 1 ml당 103 TCID50으로 근육내 경로에 의해 챌린지하였다. 추가로 20일 경과 후, 돼지에 대한 임상 시험을 중단하였다. 본 실험 프로토콜은 도 8에 도시되어 있다.
체온 및 임상 점수
돼지의 체온 ( 9)와 임상 점수 ( 10)는 표준 점수화 체계를 사용하여 매일 기록하였다 (King et al., 2011). 임상 점수는 체온 및 예컨대, 식욕 상실 또는 무기력과 같은 다른 징후를 포함한다.
비-면역 돼지인 대조군 M은 챌린지 후 4일째부터 체온 상승 (도 9a) 및 결식 및 무기력을 포함한 급성 ASFV의 전형적인 다른 임상 징후를 보였고, 챌린지 후 6일째 중간 정도의 중증도에서의 종점에서 안락사시켰다 (도 10a).
면역화된 그룹 K의 돼지 중 2마리는 면역화 후 11일째를 시작으로 2일 동안 체온이 40.6 초과로 일시적으로 상승하였다 ( 9b). 상기 돼지 및 그룹 K 중의 다른 모든 돼지는 부스트 후 또는 챌린지 후에 어떤 다른 임상 징후를 보이지 않았다 (도 10b).
이전 연구에서는 K145R 결실이 최소한의 직접적인 약독화 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다.
바이러스혈증 데이터는 도 15에 제시되어 있다.
사후에 육안 병변의 점수화
부검시, 표준화된 점수화 체계에 따라 상이한 기관 및 충치의 육안적 병변을 점수화하였다. 도 11에서, 점수는 y축에 표시되고, 돼지 마리수는 x축에 표시되어 있다. 그룹 K의 돼지 (GeorgiaΔK145RΔEP153RCD2vQ96R로 면역화)는 병변이 거의 없었으며, 주로 신장 또는 하악 림프절이 약간 확대되어 있었다. 대조적으로, 그룹 M 중의 대조군 비-면역 돼지는 비대성 및 출혈성 림프절 및 비장 비대를 포함하는 급성 ASFV의 전형적인 병변을 보였다.
면역화된 돼지의 항체 반응
면역화 전 및 면역화 후 상이한 시점 (일째), 부스트 및 챌린지에 그룹 K의 돼지로부터 수집된 혈청을 상업적 경쟁 ELISA 검정법을 사용하여 주요 ASFV 캡시드 단백질 VP72/B646L에 대한 항체 수준을 시험하였다. 도 12에서 차단율(%)은 y축에 표시되고, 면역화 후 경과일수는 x축에 표시되어 있다. 상이한 돼지에 대한 데이터는 상이한 색상으로 표시한 바와 같이 제시되어 있다. 회색 선은 양성 혈청의 검출을 위해 제조사가 명시한 컷-오프 값을 나타낸다. 결과는 면역화 후 14일째까지 값이 모든 돼지에 대해 양성이었고, 수준은 플래토에 도달하였고, 실험 동안 유지된 것으로 나타났다.
세포 매개 면역 반응
GeorgiaΔK145RΔEP153RCD2vQ96R로의 면역화 전, 부스트 전 및 Georgia 2007/1 바이러스로의 챌린지 전에 그룹 K의 돼지로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 수집하였다. PBMC를 ASFV로 자극하였고, 인터페론 감마 생산 세포의 개수를 ASFV에 대한 세포 면역 반응의 지표로서 측정하였다 (도 13).
PBMC를 모의 자극시키거나 (청색 막대), 또는 ASFV 유전자형 I Benin97/1 감염성 바이러스 (적색 막대) 또는ASFV 유전자형 II Georgia 2007/1 바이러스 (녹색 막대)로 자극시켰다. 인터페론 감마 생산 세포의 개수를 측정하였고, 106개 세포당 상기 세포의 개수는 y축에 표시되어 있다. 돼지 마리수는 x축에 제시되어 있다. 결과는 예상대로 면역화 전에는 검출가능한 IFN 감마 생산 세포가 매우 낮거나, 전혀 없는 것으로 나타났다 ( 13a). 부스트 전 21일째까지 IFN 감마 생산 세포의 개수는 자극에 사용된 ASFV 바이러스에 따라 약 100 내지 750개 세포 사이에서 다양하게 증가하였다 ( 13b). ASFV 자극 후 IFN 감마 생산 세포 개수는 챌린지 전 39일째 우수한 수준으로 유지되었다 (도 13c). IFN 감마 생산은 유전자형 I 및 유전자형 II 분리주, 둘 모두에 의해 자극되었고, 이는 교차-유전자형 세포 반응이 유도되었다는 것을 시사하는 것이다. 예상대로, 모의 자극은 검출가능한 반응을 일으키지 않았다.
도 14는 시간 경과에 따른, Georgia 2007/1 분리주를 사용한 자극 후의 상이한 돼지에 대한 IFN 감마 생산 세포 개수를 보여주는 것이다.
상기 명세서에서 언급된 모든 공개문헌은 본원에 참조로 포함된다. 본 발명의 기재된 방법 및 시스템의 다양한 수정 및 변형은 본 발명의 범주 및 정신을 벗어나지 않으면서 통상의 기술자에게 명백해질 것이다. 본 발명이 구체적인 바람직한 실시양태와 관련하여 기재되었지만, 청구된 바와 같은 본 발명은 그러한 구체적인 실시양태에 과도하게 제한되어서는 안된다는 것을 이해하여야 한다. 실제로, 바이러스학, 분자생물학 또는 관련 분야의 통상의 기술자에게 자명한 기재된 본 발명 수행 모드의 다양한 수정은 하기 청구범위의 범주 내에 포함되는 것으로 의도된다.
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fever virus <400> 27 Met Ile Ile Lys Leu Ile Phe Leu Ile Ser Phe Lys Met Ile Leu Gly 1 5 10 15 Ile Asp Tyr Trp Val Ser Leu Asn Asn Thr Ile Ile Leu Asp Ser Asn 20 25 30 Ile Thr Ile Asn Asn Ile Thr Asn Thr Thr Asn Asn Pro Thr Leu Asn 35 40 45 Gly Ile Phe Trp Asn Ile Tyr Asn Asn Ser Tyr Asn Asn Thr Phe Asn 50 55 60 Leu Leu Thr Thr Cys Gly Asn Thr Tyr Asn Ile Cys Ser Cys Ser Asn 65 70 75 80 Asn Tyr Asn Thr Ile Leu Phe Asn Tyr Asn Thr Thr Asn Asn Cys Ser 85 90 95 Leu Ile Ile Ser Pro His Asp Glu Lys Ile Phe Asp Thr Met Phe Gln 100 105 110 Ile Ile Tyr Leu Thr Asn Lys Ile Asn Tyr Thr Ile Arg Trp Leu Gln 115 120 125 Pro Val Asp Pro Pro Asn Ile Ser Phe Asn Asp Ser Asn Ser Leu Ile 130 135 140 Lys Cys Glu Lys Asn Asn Gly Thr Asn Thr Glu Ile Tyr Leu Tyr Leu 145 150 155 160 Asn Asp Thr Phe Ile Asn Asn Thr Asn Glu Asn Asp Leu Lys Tyr Tyr 165 170 175 Trp Asn Cys Ser Glu Leu Asn Tyr Asn Ile Thr Ala Thr Cys Ile Ile 180 185 190 Asn Asn Thr Leu Asn Ser Ala Asn Thr Thr Lys Val Ile Asn Cys Thr 195 200 205 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African swine fever virus <400> 152 atgttttccc ttcaagacct ttgccgaaag catcttttta ttcttcccga tgtttttggc 60 gagcatgtac tacaacgatt aggactgtat tggagatgtc acggctccct tcaacgcgta 120 ggagacgacc acatactcat acggcgggat ctcatccttt ccaccaacga ggccttaaga 180 atggcgggag aggaaggaaa caatgaagta gtaaagctct tgttactgtg gaagggaaat 240 cttcattacg ccgtcatagg agccttgcag ggtgatcaat atgacctgat ccataagtat 300 gaaaaccaaa tcggcgactt tcatcttatc ttaccattga ttcaagacgc gaaaacgttt 360 gaaaaatgcc atgctttaga acgtttttgt ggtgtttcat gtctgctaaa acatgctaca 420 aaatacaaca tgctccctgt tctccaaaaa taccaagaag agctgtccat gagagcatat 480 ctttgcgaaa ccctatttga actagcatgc ctatggcaga ggtatgatgt ccttaaatgg 540 atagagcaaa ccatgcatgt ttacgaccta aagattatgt ttaatattgc catctccaag 600 agggatctga ctatgtactc cttaggatat attttccttt ttgatagagg gaacaccgaa 660 gctacgttgc taacgcaata tctcgagaag acagcggcca aagggctcct ccactttgtg 720 ctagaaacgt taaaatacgg cggtaacata gatattgtcc tgacccaagc cgtaaagtac 780 aatcatagaa aacttttaga ttattttctg cgtcaactac ctcgtaaaca 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attatttatt tgtggtaaat aa 462 <210> 205 <211> 477 <212> DNA <213> African swine fever virus <400> 205 atgttttcta acaaaaagta catcggtctt atcaataaga aggagggttt gaaaaaaaaa 60 atagatgatt atagtatatt aataattgga atattaattg gaactaacat cttaagcctt 120 attataaata taataggaga gattaataaa ccaatatgtt accaaaatga tgataagata 180 ttttattgcc ctaaagattg ggttggatat aataatgttt gttattattt tggcaatgaa 240 gaaaaaaatt ataataatgc aagtaattat tgtaagcaat taaatagtac gcttactaat 300 aataatacta ttttagtaaa tcttactaaa acattaaatc ttactaaaac atataatcac 360 gaatctaatt attgggttaa ttattcttta attaaaaatg agtcagtact attacgtgat 420 agtggatatt acaaaaaaca aaaacatgta agtttattat atatttgtag taaataa 477 <210> 206 <211> 495 <212> DNA <213> African swine fever virus <400> 206 atgtattcta agaaaaagta catcggtctt attgacaaga actgtgaaaa aaaaatatta 60 gatgatgcta ctacaataaa aatttgttac atattaattg gaatattgat tggaactaat 120 attataactc ttatctataa tttcatattt tgggagaatt atataaaatg tatccaaaat 180 gatgataaga tgttttactg tcctaaagat tgggttgggt ataataatgc 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<213> African swine fever virus <400> 208 atgtatttta agaaaaaata catcggtctt attgataaga actgtgaaaa aaaaatatta 60 gatgattcta gtacaataaa aatttgttac atattaattg gaatattgat tggaactaat 120 atgataactc ttatttataa tttcatattc tgggataatt atataaaatg ttaccgaaat 180 aatgataaaa tgttttactg tcctaatgat tgggttggat ataataatat ttgttactat 240 tttagtaatg gtagtttttc taaaaattat acagctgcta gtaatttttg tagacaatta 300 aatggtacac ttgctaataa tgatactaat ttattaaatc taactaaaat atataataat 360 caatctatgt attgggttaa caatacggta atattacgtg gtgataataa atatagtcaa 420 aaagttaact atacagattt attatttatt tgtggtaaat aa 462 <210> 209 <211> 477 <212> DNA <213> African swine fever virus <400> 209 atgttttcta acaaaaagta catcggtctt atcaataaga aggagggttt gaaaaaaaaa 60 atagatgatt atagtatatt aataattgga atattaattg gaactaacat cttaagcctt 120 attataaata taataggaga gattaataaa ccaatatgtt accaaaatga tgataagata 180 ttttattgcc ctaaagattg ggttggatat aataatgttt gttattattt tggcaatgaa 240 gaaaaaaatt ataataatgc aagtaattat tgtaagcaat taaatagtac gcttactaat 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atagatgatt atagtatatt aataattgga atattaattg gaactaacat cttaagcctt 120 attataaata taataggaga gattaataaa ccaatatgtt accaaaataa tgataagata 180 ttttattgcc ctaaagattg ggttggatat aataatgttt gttattattt tagtaatgat 240 aatggcaata attatacaac tgcggataat aaatgtaaac aattaaataa tagtacactg 300 gctaataatc ttactgattt attaaatctt acgagtttct taaatcttac taaattatat 360 catcatcatt ctcattattg ggttaattat tctttaaata ataattattc agtaccatta 420 attgatagta aatataattt aaataggaaa aaaagtcact atacagattt actatttatt 480 tgcagcaaat aa 492 <210> 212 <211> 465 <212> DNA <213> African swine fever virus <400> 212 atgtatttta agaaaaaata catcggtctt attgataaga actgtgaaaa aaaaatatta 60 gatgattcta gtacaataaa aatttgttac atattaattg gaatattgat tggaactaat 120 atgataactc ttatttataa tttcatattc tgggataatt atataaaatg ttaccgaaat 180 aatgataaaa tgttttactg tcctaatgat tgggttggat ataataatgt ttgttactat 240 tttagtaatg gtagtttttt taaaaattat acagatgcta ataattattg taaaaaaata 300 aatagtactc ttgctaataa tgatactaat ttattaagtt taactaaaat atacaataat 360 caatctatgt attgggttaa caatacagta gcattacgtg gtgatagtgt atatgcacaa 420 agaaaagtta ataattcaga tctattattt atttgtagta aataa 465 <210> 213 <211> 465 <212> DNA <213> African swine fever virus <400> 213 atgtatttta agaaaaagta catcggtctt attgataaga actgtgaaaa aaaaatatta 60 gatgattgta ctacaataaa aatttgttac atattaattg gaatattgat tggaactaat 120 atgataactc ttatttataa tttcatattt tgggatcatt atatgacatg taacaaaaaa 180 gataagatgt tttactgtcc taaagattgg gttggatata ataatgtttg ttattatttt 240 agtaatgata gttttactaa gaattataca tatgcaagta attcttgtaa aaaaataaat 300 agtacacttg ctaataatga tactaattta ctaaatctta ttaaagtata taataatgta 360 tctgagtatt gggttaataa tacagtaaca ttacgtggtg atcataaata cataaataag 420 caaaataatt gtaatacaga atttttattt atttgtagta gatag 465 <210> 214 <211> 471 <212> DNA <213> African swine fever virus <400> 214 atgttttcta acaaaaagta tccgagtctt atcgaaaaaa aaatggatga cttgatgact 60 ttaaagtttt gttacatcat tattgcaatc ttgatcatga ctaatatttt tagccttgtt 120 gtgaatatat gggggggggg tgatcgacaa tcttatgaga 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fever virus <400> 226 Met Phe Ser Asn Lys Lys Tyr Pro Ser Leu Ile Glu Lys Lys Met Asp 1 5 10 15 Asp Leu Met Thr Leu Lys Phe Cys Tyr Ile Ile Ile Ala Ile Leu Ile 20 25 30 Met Thr Asn Ile Phe Ser Leu Val Val Asn Ile Trp Gly Gly Gly Asp 35 40 45 Arg Gln Ser Tyr Glu Asn Val Phe Tyr Cys Pro Lys Asp Trp Val Gly 50 55 60 Tyr Asn Asn Ala Cys Tyr Tyr Phe Ser Asn Asp Met Lys Asn Tyr Thr 65 70 75 80 Glu Ala Ser Asn Tyr Cys Lys Asn Leu Tyr Asn Ser Thr Ile Val Asn 85 90 95 Asn Asn Thr Asn Ile Val Asn Leu Thr Lys Thr Leu Asn Leu Thr Lys 100 105 110 Ile Tyr Asn His Glu Ser Asn Tyr Trp Val Asn Tyr Ser Leu Ile Asn 115 120 125 Asn Glu Ser Leu Thr Leu Arg Asp Ser Asn Phe Pro Ser Ser Gly Lys 130 135 140 Arg Thr Tyr Ile Asp Leu Leu Tyr Ile Cys Ser Ile 145 150 155 <210> 227 <211> 155 <212> PRT <213> African swine fever virus <400> 227 Met Tyr Phe Lys Lys Lys Tyr Ile Gly Leu Ile Asp Lys Asn Cys Glu 1 5 10 15 Lys Lys Ile Leu Asp Asp Cys Thr Thr Ile Lys Ile Cys Tyr Ile Leu 20 25 30 Ile Gly Ile Leu Ile Gly Thr 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aataatagta acattaacaa ttttacagct acatgtataa ttaataatac aattagtaca 540 tctaatgaaa caacacttat aaattgtact tatttaacat tgtcatctaa ctatttttat 600 acttttttta aattatatta tattccatta agcatcataa ttgggataac aataagtatt 660 cttcttatat ccatcataac ttttttatct ttacgaaaaa gaaaaaaaca tgttgaagaa 720 atagaaagtc caccacctga atctaatgaa gaagaacaat gtcagcatga tgacaccact 780 tccatacatg aaccatctcc cagagaacca ttacttccta agccttacag tcgttatcag 840 tataatacac ctatttacta catgcgtccc tcaacacaac cactcaaccc atttccctta 900 cctaaaccgt gtcctccacc caaaccatgt ccgccaccca aaccatgtcc tccacctaaa 960 ccatgtcctt cagctgaatc ctattctcca cccaaaccac tacctagtat cccgctacta 1020 cccaatatcc cgccattatc tacccaaaat atttcgctta ttcacgtaga tagaattatt 1080 taa 1083 <210> 230 <211> 1083 <212> DNA <213> African swine fever virus <400> 230 atgataatac ttattttttt aatattttct aacatagttt taagtattga ttattgggtt 60 agttttaata aaacaataat tttagatagt aatattacta atgataataa tgatataaat 120 ggagtatcat ggaatttttt taataattct tttaatacac tagctacatg tggaaaagca 180 ggtaactttt gtgaatgttc taattatagt acatcaatat ataatataac aaataattgt 240 agcttaacta tttttcctca taatgatgta tttgatacaa catatcaagt agtatggaat 300 caaataatta attatacaat aaaattatta acacctgcta ctcccccaaa tatcacatat 360 aattgtacta attttttaat aacatgtaaa aaaaataatg gaacaaacac taatatatat 420 ttaaatataa atgatacttt tgttaaatat actaatgaaa gtatacttga atataactgg 480 aataatagta acattaacaa ttttacagct acatgtataa ttaataatac aattagtaca 540 tctaatgaaa caacacttat aaattgtact tatttaacat tgtcatctaa ctatttttat 600 acttttttta aattatatta tattccatta agcatcataa ttgggataac aataagtatt 660 cttcttatat ccatcataac ttttttatct ttacgaaaaa gaaaaaaaca tgttgaagaa 720 atagaaagtc caccacctga atctaatgaa gaagaacaat gtcagcatga tgacaccact 780 tccatacatg aaccatctcc cagagaacca ttacttccta agccttacag tcgttatcag 840 tataatacac ctatttacta catgcgtccc tcaacacaac cactcaaccc atttccctta 900 cctaaaccgt gtcctccacc caaaccatgt ccgccaccca aaccatgtcc tccacctaaa 960 ccatgtcctt cagctgaatc ctattctcca cccaaaccac tacctagtat cccgctacta 1020 cccaatatcc cgccattatc tacccaaaat atttcgctta ttcacgtaga tagaattatt 1080 taa 1083 <210> 231 <211> 1170 <212> DNA <213> African swine fever virus <400> 231 atgataataa tccttatttt tttaatatat ttaaaactgg tcttaaataa taatattatt 60 atatggcatc ctactttaaa tgaaacaatt tttttaaatg ttacaactat agggaatatt 120 agtggtctat tttggaatac atattataat aataatcgta gtgaacttac taagtgcgga 180 atatataata attattgttc atgtgatagt cttaatacat cattgtataa tataaataat 240 tgtagtttag ttatttttcc aaataataca aaaatattta atacaatata tgaattaata 300 tattcaggta atcaaactaa ttatacaata aaattgctag aatctactac tcctccaaat 360 attacatata attgtactac atctgtaata acatgtaaaa aaaataatgg gacaaatact 420 aatatatttt taactataaa taatacgatt gttaattcta ctaatgaaga tgttatttac 480 tactattgga atagaagtga atttaataac tttacagcta catgtatgat taataataca 540 attaattcat caaatatatc agaaattata gactgtacta atacattatt attaaacagt 600 tatttagact tttttcaagt agccggttat atgttttata tgataatttt tattgtaact 660 ggaataacag taagtatttt tatttcaatc ataacttttt tatctttacg aaaaagaaaa 720 aaacatgttg aagaaataga aagtctacca cctgaatcta atgaagaaga atgtcagcat 780 gatgatgaca ccacttccat acatgaacca tcccccagag aaccattact tcctaaacct 840 tacagtcgtt atcagtataa tacacctatt tactacatgc gtccctcaac acaaccactc 900 aacccatttc ccctacctaa accatgccca ccacctaaac cgtgtccgcc acccaaacca 960 tgtcctccac ccaaaccatg cccgccaccc aaaccatgcc cgccacctaa accatgtcct 1020 ccacctgaat catgttcttc acctgaatca tgttcttcac ctgaatcata ttctccaccc 1080 aaaccactac ctagtatccc gctgctaccc aatatcccgc cattatctac acaaaatatt 1140 tcgcttattc atgtagatag aattatttaa 1170 <210> 232 <211> 1221 <212> DNA <213> African swine fever virus <400> 232 atgataatgt tcataacact tattttttta agttatatta atatagtttt aagtaataat 60 tattgggcta gacttaacga aacaataact ttaaatagta acattactaa tgatactaat 120 aatgaattag gtatattttg gaattcttat aataatactt attataataa tacatttaat 180 aatattgcta tatgtggaaa aaaaggtatt ttttgtgaat gtaatattaa ttataataca 240 tctatatcta atacatctat atctaataca tcaatatata atgtaacaaa taattgtagt 300 ttaacgattt ttctttatga tgataatata tttaaaacat atcaattagt atatcagaat 360 tacaaaatta attatacaat aaacttatta ttacctgtta cttctccaaa tattacatat 420 aattgtacta actctttaat aacatgtgaa aaaaatgatg ggacaaacac taatatgttt 480 ttatctataa ataatataac cattaatcat actaatcaag atattcttac ttactattgg 540 aataatagtg agtttaataa ttttacagct acatgtatga ttaataatac acttaattca 600 gcaaatacca caaaagttat caattgcact aatccattat taaattctta ccaaaattat 660 tttcttgaaa atattcatac attattttat atcataattt ttattgtgag tggattaata 720 gcaagtattt ttatttcaat tataactttt ttatctttac gaaaaagaaa aaaacatgtt 780 gaagaaatag aaagtccacc acctgaatct aatgaagaag aacaatgtca gcatgatgac 840 accacttcca tacatgaacc atctcccaga gaaccattac ttcctaaacc ttacagtcgt 900 tatcaatata atacacctat ttactacatg cgtccctcaa cacaaccact caacccattt 960 cccctaccta acccatgtcc tccacctaaa ccgtgtcctc cacccaaacc atgcccgcca 1020 cctaaaccat gtcccccacc caaaccatgc ccgccaccta aaccgtgtcc tccacccaaa 1080 ccatgtccac cacctaaacc atgttcttca cctgaatcat attctccacc caaaccacta 1140 cctagtatcc cgctactacc caatatccca ccattatcta cacaaaatat ttcacttatt 1200 catgtagata gaattattta a 1221 <210> 233 <211> 1122 <212> DNA <213> African swine fever virus <400> 233 atgataataa tagttatttt tttaatgtgt ttaaaaatag ttttaaacaa tattataata 60 tggagtactt taaatcaaac tgtattttta aataatattt ttacaattaa tgatacatat 120 ggtggtctat tttggaatac atattatgat aataatcgta gtaattttac ttattgtgga 180 atagcaggaa attattgttc atgttgtggt cataacatat cattgtataa tacaacaaat 240 aattgtagtt taattatttt tcctaacaat acagaaatat ttaatagaac atatgaatta 300 gtatatttgg acaaaaaaat taattataca gtaaaactat taaaatctgt tgattcccca 360 actattacat ataattgtac taattcttta ataacatgta aaaataataa tgggacaaat 420 gttaatatat atttaattat taataataca attagttcat tgaatgaaac agaaaatata 480 aattgtacta atccaatatt aaaatatcaa aattatttat ccacattatt ttatatcata 540 atttttattg tgagtggatt aataataggt atttttattt caatcatatc tgtattatct 600 atacgaagaa aaagaaaaaa acatgttgaa gaaatagaaa gtccaccacc ctctgaatct 660 aatgaagaag atatttctca cgatgacacc acttccatac atgaaccatc tcccagagaa 720 ccattacttc ctaagcctta cagtcgttat cagtataata cacctattta ctacatgcgt 780 ccctcaacac aaccactcaa cccatttccc ctacctaaac catgcccgcc acctaaacca 840 tgtcctccac ccaagccatg cccgccaccc aaaccatgtc ctccacctaa accgtgttct 900 ccacccaaac cgtgtcgtcc acctaaacca tgtcctccac ctaaaccatg tcctccacct 960 aaaccatgtc ctccacctaa accatgtcct ccatccaaac catgtccttc acctgaatcc 1020 tattctccac ccaaaccact acctagtatc ccgttactac ccaatatccc gccattatct 1080 acacaaaata tttcgcttat tcatgtagat agaattattt aa 1122 <210> 234 <211> 1209 <212> DNA <213> African swine fever virus <400> 234 atgataataa tagttatttt tttaatgtgt ttaaaaatag ttttaaacaa tattataata 60 tggagtactt taaatcaaac tgtattttta aataatattt ttacaattaa tgatacatat 120 ggtggtctat tttggaatac atattatgat aataatcgta gtaattttac ttattgtgga 180 atagcaggaa attattgttc atgttgtggt cataacatat cattgtataa tacaacaaat 240 aattgtagtt taattatttt tcctaacaat acagaaatat ttaatagaac atatgaatta 300 gtatatttgg acaaaaaaat taattataca gtaaaactat taaaatctgt tgattcccca 360 actattacat ataattgtac taattcttta ataacatgta aaaataataa tgggacaaat 420 gttaatatat 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atgataataa aggttatttt tttagttttc tttaaaatgg ttttaagtaa tattataata 60 tggagtactt taaataacac aatatattta aatattaatt attcagatag taatttatat 120 actggtctat tttggaataa atattataat aatactcgta ataattttac tacttgtgta 180 acatcaaata gtagctattg tacatgtaaa ggccataaca catcattgta taatataaca 240 aataattgta gtttaatcat ttttccaaat aatacaaaaa tatttaatac aacatatgaa 300 ttagtatatt taaataataa aattaattat acaatacaaa tggtacaacc tgttgatcct 360 ccaattatta tatataatga tactaataat tctttaataa catgtgaaaa aaataatgga 420 acgaatactg aaatctattt atatttaaat gatacattta ttaataatac taatgaaaat 480 agtattaaat actattggaa ttgtagcgaa ttaaaccata atattacaac tacatgtatt 540 attaataata cacttaattc ggcaaatacc acaaaagtta taaattgcac taatctattg 600 ttaaaatctg accaaaatta ttttcttaaa aatattcata cattatttta tatcataatt 660 tttattgtgg gtggaacatt aataagcatt attatatcaa tcataacttt tttatcttta 720 cgaaaaagaa aaaaacatgt tgaagaaata gaaagtccac caccctctga atctaatgaa 780 gaagaacatt gtcagcatga tgataccact tccatacatg aaccatctcc cagagaacca 840 ttacttccta agccttacag tcgttatcag tataatacac ctatttacta catgcgtccc 900 tcaacacaac cactcaaccc atttccccta cctaaaccat gtcctccacc taaaccgtgt 960 cctccaccca aaccatgtcc tccacctaaa ccgtgtcctc cacctaaacc gtgtccccca 1020 cctaaaccat gtccttcacc tgaatcccat tctccaccca aaccactacc tagtatcccg 1080 ctgctaccca atattccccc attatctaca caaaatattt cgcttattca tgtagataga 1140 attatttaa 1149 <210> 236 <211> 1128 <212> DNA <213> African swine fever virus <400> 236 atgataataa tacttatttt tttaataatt cctaacatag ttttaagtat tgattattgg 60 gttagtttta ataaaacaat aattttagat agtaatatta ctaatgataa taatgatata 120 aatggagtat catggaattt ccttaataat tctcttaata cactagctac atgtggaaaa 180 gcaggtaact tttgtgaatg ctctaattat agtacatcac tatataatat agcacataat 240 tgtagcttaa ctattttccc tcataatgat gtatttggta caccatatca agtagtatgg 300 aatcaaataa ttaattatac aataaaatta ttaacacctg ttactccccc aaatattaca 360 tataattgta ctaatttttt aataacatgt aaaaaaaata atggaacaaa tactattata 420 tatttcaata taaatgatac taatgttaaa tatactaatg aaagtatact tgaatataac 480 tggaataata gtaactttaa 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attatctaca 1140 caaaatattt cgcttattca cgtagataga attatttaa 1179 <210> 240 <211> 1146 <212> DNA <213> African swine fever virus <400> 240 atgataatta aacttatttt tttaatttgt ttcaaaatag ttttaagtat taattattgg 60 gttaggtata atgatacagt aactttaaat agtaatatca atagcgagac agaaggtata 120 ttttggaatt tttataataa tacttttaat actattgcca catgtggaaa aaaaaataat 180 gtttgtgaat gttctaatta tgataaatcc ttatataata taacaaataa ttgtagttta 240 acaatttttc caaataatac aaaaatattt aatacaacat atcaattagt atattcacgc 300 aatagaatta attacacaat aaatttgtta ttacctgtta catctccaat tattacatat 360 aattgtactc aatctttaat aacatgtgaa aaaactaatg gaacaaatat tcatttattc 420 ttaaatttaa atgatacaat taatgaatat actaacaaaa gttttctcaa ttactattgg 480 aatagtagtg agttaaataa tatttttctt gctacatgta ttattaataa tacacttaat 540 tcagcaaata ctacaaaagt tatcaattgc actaacccat tattaaaatc ttaccaaaat 600 tattttcttg aaaatattca tacattattt tatatgataa tttttattgt atctggaata 660 acaataagta tttttatatc aatcataact tttttatctt tacgaaaaag aaaaaaacat 720 gttgaagaaa tagagagtcc 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virus <400> 242 Met Ile Ile Leu Ile Phe Leu Ile Phe Ser Asn Ile Val Leu Ser Ile 1 5 10 15 Asp Tyr Trp Val Ser Phe Asn Lys Thr Ile Ile Leu Asp Ser Asn Ile 20 25 30 Thr Asn Asp Asn Asn Asp Ile Asn Gly Val Ser Trp Asn Phe Phe Asn 35 40 45 Asn Ser Phe Asn Thr Leu Ala Thr Cys Gly Lys Ala Gly Asn Phe Cys 50 55 60 Glu Cys Ser Asn Tyr Ser Thr Ser Ile Tyr Asn Ile Thr Asn Asn Cys 65 70 75 80 Ser Leu Thr Ile Phe Pro His Asn Asp Val Phe Asp Thr Thr Tyr Gln 85 90 95 Val Val Trp Asn Gln Ile Ile Asn Tyr Thr Ile Lys Leu Leu Thr Pro 100 105 110 Ala Thr Pro Pro Asn Ile Thr Tyr Asn Cys Thr Asn Phe Leu Ile Thr 115 120 125 Cys Lys Lys Asn Asn Gly Thr Asn Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ile Asn 130 135 140 Asp Thr Phe Val Lys Tyr Thr Asn Glu Ser Ile Leu Glu Tyr Asn Trp 145 150 155 160 Asn Asn Ser Asn Ile Asn Asn Phe Thr Ala Thr Cys Ile Ile Asn Asn 165 170 175 Thr Ile Ser Thr Ser Asn Glu Thr Thr Leu Ile Asn Cys Thr Tyr Leu 180 185 190 Thr Leu Ser Ser Asn Tyr Phe Tyr Thr Phe Phe Lys Leu Tyr Tyr Ile 195 200 205 Pro 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<213> African swine fever virus <400> 256 atgctggtga ttatcctggg aattattggc ctgctggcca gtagcaacct ggtttcatcc 60 tccacttcta ctcgggtagg tggacatctt cctctaacat ttgatccccc cgagaatgaa 120 cttggatact ggtgcactta tgtggaaagc tgtcggttct gctgggattg tgaagatggg 180 atttgtacca gcagggtttg gggaaacaac tccacaagta ttgttgagaa tgactatgta 240 aaatattgtg aggtttcccg ctggggtaac ctatgtagat atgatgtgga ggagcacatt 300 taccatagca tgaactgctc tgacccaaag ccctggaatc cttataaaat tgcaaggaag 360 gagtggaaaa agaatgaaca tcccagaaag gatttgaaaa aagatgaatt ctag 414 <210> 257 <211> 1587 <212> DNA <213> African swine fever virus <400> 257 atgttctccc tacaggacct ctgtcggaag aacactttct tccttccaaa tgattttagc 60 aagcatactc tacaacggct ggggttgtat tggaaagagc atggatccgt ccatcgaata 120 gaaaaggaca gcataatgat acagaatgaa ttggttcttt ctatcaatga tgctttacag 180 cttgcaggag aggaggggga cacagatgtg gtacagctct tgttactatg ggagggaaat 240 ctgcattatg ccatcatagg agctttgaag actgagaatt ataatctagt atgtgagtac 300 catagccaaa ttcaggactg gcatattctc ctacccttga 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Ser Leu Tyr Asn Ile Asn Asn 65 70 75 80 Cys Ser Leu Val Ile Phe Pro Asn Asn Thr Lys Ile Phe Asn Thr Ile 85 90 95 Tyr Glu Leu Ile Tyr Ser Gly Asn Gln Thr Asn Tyr Thr Ile Lys Leu 100 105 110 Leu Glu Ser Thr Thr Pro Pro Asn Ile Thr Tyr Asn Cys Thr Thr Ser 115 120 125 Val Ile Thr Cys Lys Lys Asn Asn Gly Thr Asn Thr Asn Ile Phe Leu 130 135 140 Thr Ile Asn Asn Thr Ile Val Asn Ser Thr Asn Glu Asp Val Ile Tyr 145 150 155 160 Tyr Tyr Trp Asn Arg Ser Glu Phe Asn Asn Phe Thr Ala Thr Cys Met 165 170 175 Ile Asn Asn Thr Ile Asn Ser Ser Asn Ile Ser Glu Ile Ile Asp Cys 180 185 190 Thr Asn Thr Leu Leu Leu Asn Ser Tyr Leu Asp Phe Phe Gln Val 195 200 205 <210> 383 <211> 211 <212> PRT <213> African swine fever virus <400> 383 Met Ile Ile Lys Val Ile Phe Leu Val Phe Phe Lys Met Val Leu Ser 1 5 10 15 Asn Ile Ile Ile Trp Ser Thr Leu Asn Asn Thr Ile Tyr Leu Asn Ile 20 25 30 Asn Tyr Ser Asp Ser Asn Leu Tyr Thr Gly Leu Phe Trp Asn Lys Tyr 35 40 45 Tyr Asn Asn Thr Arg Asn Asn Phe Thr Thr Cys Val Thr Ser Asn Ser 50 55 60 Ser Tyr Cys Thr Cys Lys Gly His Asn Thr Ser Leu Tyr Asn Ile Thr 65 70 75 80 Asn Asn Cys Ser Leu Ile Ile Phe Pro Asn Asn Thr Lys Ile Phe Asn 85 90 95 Thr Thr Tyr Glu Leu Val Tyr Leu Asn Asn Lys Ile Asn Tyr Thr Ile 100 105 110 Gln Met Val Gln Pro Val Asp Pro Pro Ile Ile Ile Tyr Asn Asp Thr 115 120 125 Asn Asn Ser Leu Ile Thr Cys Glu Lys Asn Asn Gly Thr Asn Thr Glu 130 135 140 Ile Tyr Leu Tyr Leu Asn Asp Thr Phe Ile Asn Asn Thr Asn Glu Asn 145 150 155 160 Ser Ile Lys Tyr Tyr Trp Asn Cys Ser Glu Leu Asn His Asn Ile Thr 165 170 175 Thr Thr Cys Ile Ile Asn Asn Thr Leu Asn Ser Ala Asn Thr Thr Lys 180 185 190 Val Ile Asn Cys Thr Asn Leu Leu Leu Lys Ser Asp Gln Asn Tyr Phe 195 200 205 Leu Lys Asn 210 <210> 384 <211> 205 <212> PRT <213> African swine fever virus <400> 384 Met Ile Ile Lys Leu Ile Phe Leu Ile Cys Phe Lys Ile Val Leu Ser 1 5 10 15 Ile Asn Tyr Trp Val Arg Tyr Asn Asp Thr Val Thr Leu Asn Ser Asn 20 25 30 Ile Asn Ser Glu Thr Glu Gly Ile Phe Trp Asn Phe Tyr Asn Asn Thr 35 40 45 Phe Asn Thr Ile Ala Thr Cys Gly Lys Lys Asn Asn Val Cys Glu Cys 50 55 60 Ser Asn Tyr Asp Lys Ser Leu Tyr Asn Ile Thr Asn Asn Cys Ser Leu 65 70 75 80 Thr Ile Phe Pro Asn Asn Thr Lys Ile Phe Asn Thr Thr Tyr Gln Leu 85 90 95 Val Tyr Ser Arg Asn Arg Ile Asn Tyr Thr Ile Asn Leu Leu Leu Pro 100 105 110 Val Thr Ser Pro Ile Ile Thr Tyr Asn Cys Thr Gln Ser Leu Ile Thr 115 120 125 Cys Glu Lys Thr Asn Gly Thr Asn Ile His Leu Phe Leu Asn Leu Asn 130 135 140 Asp Thr Ile Asn Glu Tyr Thr Asn Lys Ser Phe Leu Asn Tyr Tyr Trp 145 150 155 160 Asn Ser Ser Glu Leu Asn Asn Ile Phe Leu Ala Thr Cys Ile Ile Asn 165 170 175 Asn Thr Leu Asn Ser Ala Asn Thr Thr Lys Val Ile Asn Cys Thr Asn 180 185 190 Pro Leu Leu Lys Ser Tyr Gln Asn Tyr Phe Leu Glu Asn 195 200 205 <210> 385 <211> 203 <212> PRT <213> African swine fever virus <400> 385 Met Ile Ile Leu Ile Phe Leu Ile Phe Ser Asn Ile Val Leu Ser Ile 1 5 10 15 Asp Tyr Trp Val Ser Phe Asn Lys Thr Ile Ile Leu Asp Ser Asn Ile 20 25 30 Thr Asn Asp Asn Asn Asp Ile Asn Gly Val Ser Trp Asn Phe Phe Asn 35 40 45 Asn Ser Phe Asn Thr Leu Ala Thr Cys Gly Lys Ala Gly Asn Phe Cys 50 55 60 Glu Cys Ser Asn Tyr Ser Thr Ser Ile Tyr Asn Ile Thr Asn Asn Cys 65 70 75 80 Ser Leu Thr Ile Phe Pro His Asn Asp Val Phe Asp Thr Thr Tyr Gln 85 90 95 Val Val Trp Asn Gln Ile Ile Asn Tyr Thr Ile Lys Leu Leu Thr Pro 100 105 110 Ala Thr Pro Pro Asn Ile Thr Tyr Asn Cys Thr Asn Phe Leu Ile Thr 115 120 125 Cys Lys Lys Asn Asn Gly Thr Asn Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ile Asn 130 135 140 Asp Thr Phe Val Lys Tyr Thr Asn Glu Ser Ile Leu Glu Tyr Asn Trp 145 150 155 160 Asn Asn Ser Asn Ile Asn Asn Phe Thr Ala Thr Cys Ile Ile Asn Asn 165 170 175 Thr Ile Ser Thr Ser Asn Glu Thr Thr Leu Ile Asn Cys Thr Tyr Leu 180 185 190 Thr Leu Ser Ser Asn Tyr Phe Tyr Thr Phe Phe 195 200 <210> 386 <211> 204 <212> PRT <213> African swine fever virus <400> 386 Met Ile Ile Ile Leu Ile Phe Leu Ile Ile Pro Asn Ile Val Leu Ser 1 5 10 15 Ile Asp Tyr Trp Val Ser Phe Asn Lys Thr Ile Ile Leu Asp Ser Asn 20 25 30 Ile Thr Asn Asp Asn Asn Asp Ile Asn Gly Val Ser Trp Asn Phe Leu 35 40 45 Asn Asn Ser Leu Asn Thr Leu Ala Thr Cys Gly Lys Ala Gly Asn Phe 50 55 60 Cys Glu Cys Ser Asn Tyr Ser Thr Ser Leu Tyr Asn Ile Ala His Asn 65 70 75 80 Cys Ser Leu Thr Ile Phe Pro His Asn Asp Val Phe Gly Thr Pro Tyr 85 90 95 Gln Val Val Trp Asn Gln Ile Ile Asn Tyr Thr Ile Lys Leu Leu Thr 100 105 110 Pro Val Thr Pro Pro Asn Ile Thr Tyr Asn Cys Thr Asn Phe Leu Ile 115 120 125 Thr Cys Lys Lys Asn Asn Gly Thr Asn Thr Ile Ile Tyr Phe Asn Ile 130 135 140 Asn Asp Thr Asn Val Lys Tyr Thr Asn Glu Ser Ile Leu Glu Tyr Asn 145 150 155 160 Trp Asn Asn Ser Asn Phe Asn Asn Phe Thr Ala Thr Cys Ile Ile Asn 165 170 175 Asn Thr Ile Asn Ser Ser Asn Asp Thr Gln Thr Ile Asp Cys Ile Asn 180 185 190 Thr Leu Leu Ser Ser Tyr Leu Asp Phe Phe Gln Val 195 200

Claims (82)

  1. 유전자 EP153R 및 EP402R의 발현 및/또는 활성이 파괴되고;
    하기 유전자:
    다중유전자 패밀리 (MGF) 110 3L, 6L, 7L, 8L, 10L, 11L 및 12L,
    MGF 360 5L, 6L, 7L, 10L, 11L, 12L, 13L, 14L, 20R, 21R 및 22R, 및
    MGF 505 1R, 2R 및 6R 중 하나 이상의 기능성 버전을 포함하는,
    약독화된 아프리카 돼지 열병 (ASF) 바이러스.
  2. 제1항에 있어서, 백신접종받은 동물로부터의 감염된 동물 감별(Differentiation of Infected from Vaccinated Animals: DIVA) 돌연변이를 추가로 포함하는 약독화된 ASF 바이러스.
  3. 유전자 EP153R 및 EP402R의 발현 및/또는 활성이 파괴되고, DIVA 돌연변이를 포함하는 약독화된 ASF 바이러스.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, DIVA 돌연변이가 K145R 유전자의 발현을 파괴시키는 것인 약독화된 ASF 바이러스.
  5. 제4항에 있어서, K145R 유전자가 적어도 부분적으로 결실, 바람직하게, 완전히 결실된 것인 약독화된 ASF 바이러스.
  6. 제4항에 있어서, K145R 유전자가 중단된 것인 약독화된 ASF 바이러스.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, EP153R 유전자가 적어도 부분적으로 결실, 바람직하게, 완전히 결실된 것인 약독화된 ASF 바이러스.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, EP153R 유전자가 중단된 것인 약독화된 ASF 바이러스.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 혈구흡착을 유도하는 ASF 바이러스의 능력이, EP153R 유전자 및/또는 EP402R 유전자의 발현 및/또는 활성이 파괴되지 않은 상응하는 ASF 바이러스와 비교하여 감소된 것인, 약독화된 ASF 바이러스.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, EP402R 단백질의 표면 발현이 EP402R 유전자의 발현 및/또는 활성이 파괴되지 않은 상응하는 ASF 바이러스와 비교하여 감소된 것인, 약독화된 ASF 바이러스.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, EP402R 유전자가 EP402R 단백질에 의한 리간드 결합을 파괴시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 것인, 약독화된 ASF 바이러스.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, EP402R 유전자가 EP402R 단백질의 리간드 결합 도메인 중의 하나 이상의 아미노산을 변이시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 것인 약독화된 ASF 바이러스.
  13. 제12항에 있어서, 하나 이상의 아미노산이 상이한 아미노산으로 변이된 것인 약독화된 ASF 바이러스.
  14. 제13항에 있어서, 상이한 아미노산으로의 변이가 EP402R 상의 결합 표면을 변경함으로써 EP402R과 그의 리간드 사이의 상호작용을 직접 억제하는 것인 약독화된 ASF 바이러스.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 돌연변이가 Georgia 2007/1 EP402R 단백질 (서열식별번호(SEQ ID No.) 24)의 Q96 및/또는 W99에 상응하는 EP402R 단백질 중의 위치의 아미노산을 변이시키는 것인 약독화된 ASF 바이러스.
  16. 제15항에 있어서, Q96에 상응하는 위치의 아미노산이 R로, 또는 R의 보존적 대체인 아미노산으로 변이되고/거나, W99에 상응하는 위치의 아미노산이 D, 또는 D의 보존적 대체인 아미노산으로 변이된 것인 약독화된 ASF 바이러스.
  17. 제16항에 있어서, Q96에 상응하는 위치의 아미노산이 H, K 또는 R로 변이되고/거나, W99에 상응하는 위치의 아미노산이 D, E, N 또는 Q로 변이된 것인 약독화된 ASF 바이러스.
  18. 제17항에 있어서, Q96에 상응하는 위치의 아미노산이 R로 변이되고/거나, W99에 상응하는 위치의 아미노산이 D로 변이된 것인 약독화된 ASF 바이러스.
  19. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, EP402R 유전자가 적어도 부분적으로 결실, 바람직하게, 완전히 결실된 것인 약독화된 ASF 바이러스.
  20. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, EP402R 유전자가 중단된 것인 약독화된 ASF 바이러스.
  21. 제1항 및 제7항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, EP153R 및 EP402R 이외의 다른 모든 ASF 바이러스 유전자의 기능성 버전을 포함하는 약독화된 ASF 바이러스.
  22. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, EP153R, EP402R 및 K145R 이외의 다른 모든 ASF 바이러스 유전자의 기능성 버전을 포함하는 약독화된 ASF 바이러스.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 약독화된 ASF 바이러스의 게놈이 유전자형 II에 상응하거나, 또는 본질적으로 그에 상응하는 것인 약독화된 ASF 바이러스.
  24. 제23항에 있어서, 약독화된 ASF 바이러스의 게놈이 Georgia 2007/1 균주의 것에 상응하거나, 또는 본질적으로 그에 상응하는 것인 약독화된 ASF 바이러스.
  25. 리간드 결합 도메인에 하나 이상의 아미노산 변이를 포함하며, 여기서 아미노산 변이가 EP402R 단백질의 리간드 결합을 파괴시키는 것인, EP402R 단백질.
  26. Georgia 2007/1 EP402R 단백질 (서열식별번호 24)의 Q96 및/또는 W99에 상응하는 위치에 하나 이상의 아미노산 변이를 포함하는 EP402R 단백질.
  27. 제26항에 있어서, Q96에 상응하는 위치의 아미노산이 R로, 또는 R의 보존적 대체인 아미노산으로 변이되고/거나, W99에 상응하는 위치의 아미노산이 D, 또는 D의 보존적 대체인 아미노산으로 변이된 것인 EP402R 단백질.
  28. 제27항에 있어서, Q96에 상응하는 위치의 아미노산이 H, K 또는 R로 변이되고/거나, W99에 상응하는 위치의 아미노산이 D, E, N 또는 Q로 변이된 것인 EP402R 단백질.
  29. 제28항에 있어서, Q96에 상응하는 위치의 아미노산이 R로 변이되고/거나, W99에 상응하는 위치의 아미노산이 D로 변이된 것인 EP402R 단백질.
  30. 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호 21 내지 30 또는 서열식별번호 242 내지 246 중 임의의 것과 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 EP402R 단백질.
  31. 제30항에 있어서, 서열식별번호 31, 32, 33 또는 379 중 임의의 것의 아미노산 서열을 포함하는 EP402R 단백질.
  32. 제25항 내지 제31항 중 어느 한 항의 EP402R 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  33. 제32항에 있어서, 서열식별번호 229 내지 241 중 임의의 것과 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  34. 제32항 또는 제33항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  35. 제25항 내지 제31항 중 어느 한 항의 EP402R 단백질을 포함하는 ASF 바이러스.
  36. 제32항 또는 제33항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 ASF 바이러스.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 혈구흡착을 유도하는 ASF 바이러스의 능력이, 제25항 내지 제31항 중 어느 한 항의 EP402R 단백질, 또는 제32항 또는 제33항의 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는 상응하는 ASF 바이러스와 비교하여 감소된 것인 ASF 바이러스.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 약독화된 것인 ASF 바이러스.
  39. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, DIVA 돌연변이를 추가로 포함하는 ASF 바이러스.
  40. 제39항에 있어서, DIVA 돌연변이가 K145R 유전자의 발현을 파괴시키는 것인 ASF 바이러스.
  41. 제40항에 있어서, K145R 유전자가 적어도 부분적으로 결실, 바람직하게, 완전히 결실된 것인 ASF 바이러스.
  42. 제40항에 있어서, K145R 유전자가 중단된 것인 ASF 바이러스.
  43. 제35항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, EP153R 유전자의 발현 및/또는 활성이 파괴된 것인 ASF 바이러스.
  44. 제43항에 있어서, EP153R 유전자가 적어도 부분적으로 결실, 바람직하게, 완전히 결실된 것인 ASF 바이러스.
  45. 제43항에 있어서, EP153R 유전자가 중단된 것인 ASF 바이러스.
  46. 제35항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, ASF 바이러스 게놈이 유전자형 II에 상응하거나, 또는 본질적으로 그에 상응하는 것인 ASF 바이러스.
  47. 제46항에 있어서, ASF 바이러스 게놈이 Georgia 2007/1 균주의 것에 상응하거나, 또는 본질적으로 그에 상응하는 것인 ASF 바이러스.
  48. 제1항 내지 제24항 및 제35항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 질환을 치료 및/또는 예방하는 데 사용하기 위한 ASF 바이러스.
  49. 대상체에서의 질환 치료 및/또는 예방용 의약의 제조를 위한 제1항 내지 제24항 및 제35항 내지 제47항 중 어느 한 항의 ASF 바이러스의 용도.
  50. 제1항 내지 제24항 및 제35항 내지 제47항 중 어느 한 항의 ASF 바이러스를 포함하는 제약 조성물.
  51. 제50항에 있어서, 대상체에서 질환을 치료 및/또는 예방하는 데 사용하기 위한 제약 조성물.
  52. 제48항, 제49항 및 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 질환이 아프리카 돼지 열병인, ASF 바이러스, ASF 바이러스의 용도 또는 제약 조성물.
  53. 제1항 내지 제24항 및 제35항 내지 제47항 중 어느 한 항의 ASF 바이러스를 포함하는 백신.
  54. 제53항에 있어서, 대상체에서 아프리카 돼지 열병을 치료 및/또는 예방하는 데 사용하기 위한 백신.
  55. 제54항에 있어서, 아프리카 돼지 열병이 백신의 ASF 바이러스와 상이한 유전자형의 ASF 바이러스에 유발되는 것인 백신.
  56. 대상체에게 유효량의, 제50항에 따른 제약 조성물, 또는 제53항에 따른 백신을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 아프리카 돼지 열병을 치료 및/또는 예방하는 방법.
  57. 제48항, 제49항, 제51항, 제52항 및 제54항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 가축용 돼지인, ASF 바이러스, ASF 바이러스의 용도, 제약 조성물, 백신 또는 방법.
  58. 제54항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 백신이 프라임-부스트 요법에 따라 투여되는 것인, 백신 또는 방법.
  59. EP402R 단백질의 리간드 결합 도메인 중의 하나 이상의 아미노산을 변이시키는 단계를 포함하고, 여기서, 아미노산 변이가 EP402R 단백질의 리간드 결합을 파괴시키는 것인, 제35항 내지 제47항 중 어느 한 항의 ASF 바이러스를 제조하는 방법.
  60. Georgia 2007/1 EP402R 단백질 (서열식별번호 24)의 Q96 및/또는 W99에 상응하는 위치의 EP402R 단백질 중의 하나 이상의 아미노산을 변이시키는 단계를 포함하는, 제35항 내지 제47항 중 어느 한 항의 ASF 바이러스를 제조하는 방법.
  61. EP402R 단백질의 리간드 결합 도메인 중의 하나 이상의 아미노산 변이를 변이시키는 단계를 포함하고, 여기서, 아미노산 변이가 EP402R 단백질의 리간드 결합을 파괴시키는 것인, 혈구흡착을 유도하는 ASF 바이러스의 능력을 감소시키는 방법.
  62. Georgia 2007/1 EP402R 단백질 (서열식별번호 24)의 Q96 및/또는 W99에 상응하는 위치의 EP402R 단백질 중의 아미노산을 변이시키는 단계를 포함하는, 혈구흡착을 유도하는 ASF 바이러스의 능력을 감소시키는 방법.
  63. 제59항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, EP153R 유전자의 발현 및/또는 활성을 파괴시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  64. EP153R 및 EP402R 유전자의 발현 및/또는 활성을 파괴시키는 단계를 포함하는, ASF 바이러스를 약독화시키는 방법.
  65. 제64항에 있어서, 혈구흡착을 매개하는 EP153R 유전자 및/또는 EP402R 유전자의 능력을 파괴시키는 단계를 포함하는 방법.
  66. 제59항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, DIVA 돌연변이를 ASF 바이러스 내로 도입하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  67. 제66항에 있어서, DIVA 돌연변이가 K145R 유전자의 발현을 파괴시키는 것인 방법.
  68. 제67항에 있어서, K145R 유전자가 적어도 부분적으로 결실, 바람직하게, 완전히 결실된 것인 방법.
  69. 제67항에 있어서, K145R 유전자가 중단된 것인 방법.
  70. 제63항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, EP153R 유전자가 적어도 부분적으로 결실, 바람직하게, 완전히 결실된 것인 방법.
  71. 제63항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, EP153R 유전자가 중단된 것인 방법.
  72. 제64항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, EP402R 유전자가 적어도 부분적으로 결실, 바람직하게, 완전히 결실된 것인 방법.
  73. 제64항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, EP402R 유전자가 중단된 것인 방법.
  74. 제64항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 돌연변이를 포함하지 않는 상응하는 ASF 바이러스와 비교하여 감소된 EP402R 단백질의 표면 발현을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 EP402R 유전자에 도입하는 단계를 포함하는 방법.
  75. 제64항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, EP402R 단백질에 의한 리간드 결합을 파괴시키는 하나 이상의 돌연변이를 EP402R 유전자에 도입하는 단계를 포함하는 방법.
  76. 제74항 또는 제75항에 있어서, EP402R 단백질의 리간드 결합 도메인 중의 하나 이상의 아미노산을 변이시키는 하나 이상의 돌연변이를 EP402R 유전자에 도입하는 단계를 포함하는 방법.
  77. 제76항에 있어서, 하나 이상의 아미노산을 상이한 아미노산으로 변이시키는 것인 방법.
  78. 제77항에 있어서, 상이한 아미노산으로의 변이가 EP402R 상의 결합 표면을 변경함으로써 EP402R과 그의 리간드 사이의 상호작용을 직접 억제하는 것인 방법.
  79. 제75항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, Georgia 2007/1 EP402R 단백질 (서열식별번호 24)의 Q96 및/또는 W99에 상응하는 위치의 EP402R 단백질 중의 아미노산을 변이시키는 단계를 포함하는 방법.
  80. 제59항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, Georgia 2007/1 EP402R 단백질 (서열식별번호 24)의 Q96에 상응하는 위치의 EP402R 단백질 중의 아미노산을 R로, 또는 R의 보존적 대체인 아미노산으로 변이시키고/거나, Georgia 2007/1 EP402R 단백질 (서열식별번호 24)의 W99에 상응하는 위치의 아미노산을 D로, 또는 D의 보존적 대체인 아미노산으로 변이시키는 단계를 포함하는 방법.
  81. 제80항에 있어서, Q96에 상응하는 위치의 아미노산을 H, K 또는 R로 변이시키고/거나, W99에 상응하는 위치의 아미노산을 D, E, N 또는 Q로 변이시키는 것인 방법.
  82. 제81항에 있어서, Q96에 상응하는 위치의 아미노산을 R로 변이시키고/거나, W99에 상응하는 위치의 아미노산을 D로 변이시키는 것인 방법.
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