JP2023516709A - アフリカ豚熱ウイルス感染に対するワクチン - Google Patents

Abstract

本発明は、弱毒化アフリカ豚熱ウイルスに関する。弱毒化ウイルスは、病原性ウイルスによるその後に行うチャレンジに対してブタを防御する。本発明はまた、アフリカ豚熱を治療及び/又は予防するのにそのような弱毒化ウイルスを使用することにも関する。【選択図】なし

Description

本発明は、弱毒化アフリカ豚熱ウイルスに関する。本発明の弱毒化ウイルスは、病原性ウイルスのその後のチャレンジに対してブタを防御する。本発明はまた、アフリカ豚熱を治療及び/又は予防のためのそのような弱毒化ウイルスの使用に関する。

アフリカ豚熱(ASF)
アフリカ豚熱は、二本鎖DNAウイルスであるアフリカ豚熱ウイルス(ASFV)によって引き起こされる家畜のブタの壊滅的な出血性疾患である。ASFVはアスファウイルス科(Asfarviridae)の唯一のメンバーであり、主に細胞の細胞質で複製する。ASFVの病原性株は感染の約5～14日以内に家畜のブタを殺滅するおそれがあり、死亡率は100%に近い。

ASFVは、イボイノシシ属 (Phacochoerus sp.)、カワイノシシ属(Potamocherus sp.)、及びヒメダニ属(Ornithodoros)の軟ダニ(ベクターであると考えられている)に感染し、これらにおいて複製することができるが、これらの種では、臨床的徴候が見られるとしてもごくわずかであり、長期の持続性感染が確立され得る。ASFVは、ヨーロッパの入植者がASFVの流行地域にブタを持ち込んだ後に初めて記載されたものであり、したがって「新興感染」の一例である。本疾患は現在のところ、多くのサブサハラ諸国及びサルデーニャのヨーロッパにおいて風土性のものである。ASFVは、2007年にトランスコーカサス地域のジョージアにこれがもたらされた後、ロシア連邦を始めとした近隣諸国を通して広範囲に拡散した。2012年にウクライナで最初のアウトブレイクが報告され、2013年にベラルーシで最初のアウトブレイクが報告された。2014年には、ウクライナのブタでさらなるアウトブレイクが報告され、リトアニア及びポーランドにおいてイノシシでの検出が報告された。

現在、ASFの治療法はない。入ってくるブタ及びブタ肉製品に関する制限、ブタへの給餌前にライセンスの下での廃棄動物製品の強制煮沸及び本疾患が診断された場合の屠殺政策の適用によって、アフリカ以外の国々において予防が国家ベースで試みられてきた。アフリカにおける予防は、イボイノシシ及びイボイノシシに汚染された材料に家畜の群れを近づけない方策に基づいている。

したがって、ASFV感染を制御し、疾患の拡散を予防するための改善された方策に対するするニーズある。

アフリカ豚熱ウイルス
ASFV分離株Benin 97/1(西アフリカ由来の高度病原ウイルス、群1)、分離株OURT88/3(ポルトガル由来の非病原、弱毒化ウイルス、群1)、及び分離株BA71V(Vero細胞組織培養適応非病原ウイルス、群1)の全ゲノム配列が比較されている(Chapmanら、2008 J. Gen. Virol. 89: 397-408)。

OURT88/3ゲノムでは、多重遺伝子族(MGF)360 18R(DP148R)遺伝子、EP153R遺伝子及びEP402R遺伝子がフレームシフト突然変異によってそれぞれ分断されている。加えて、以下のMGF遺伝子はOURT88/3ゲノムに存在しない: MGF 110 3L、6L、7L、8L、10L、11L及び12L、MGF 300 3L、MGF 360 5L、6L、7L、10L、11L、12L、13L、14L、20R、21R及び22R、並びにMGF 505 1R、2R及び6R。MGF 505 3R遺伝子も切断されている。

高病原性Lisboa60株と低病原性NH/P68株の配列も比較されている(Portugalら、2015 J. Gen. Virol. 96: 408-419)。

NH/P68ゲノムでは、MGF 360 18R(DP148R)遺伝子、EP153R遺伝子及びEP402R遺伝子は、未成熟終止コドンによってそれぞれ分断されている。加えて、以下のMGF遺伝子はNH/P68ゲノムに存在しない: MGF 110 3L、6L、7L、8L、10L、11L及び12L、MGF 360 5L、6L、7L、10L、11L、12L、13L、14L、20R、21R及び22R、並びにMGF 505 1R、2R及び6R。MGF 360 9L遺伝子及びMGF 505 3R遺伝子も切断されている。

病原性Benin 97/1分離株からDP148R遺伝子の欠失によって、病原性が減少し、親ウイルスのチャレンジに対する防御が誘導された(Reisら、2017 J. Virol. 91, 24: e01428-17)。

全体として、本発明は、DP148R、EP153R及びEP402Rの遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されているが、一方、特定のMGF遺伝子の発現及び/又は活性は破壊されていない弱毒化アフリカ豚熱ウイルスに関する。

本発明は、DP148R、EP153R及びEP402Rの遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されており、以下の遺伝子:
多重遺伝子族(MGF) 110 3L、6L、7L、8L、10L、11L及び12L、
MGF 360 5L、6L、7L、10L、11L、12L、13L、14L、20R、21R及び22R、並びに
MGF 505 1R、2R及び6R
のうちの1つ以上の機能性バージョンを含む、弱毒化アフリカ豚熱(ASF)ウイルスを提供する。

さらなる一態様では、本発明は、
DP148R、EP153R及びEP402Rの遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されており、以下の遺伝子:
多重遺伝子族(MGF) 110 11L及び12L、
MGF 360 6L、10L、11L、12L、13L及び14L、並びに
MGF 505 1R及び2R
のうちの1つ以上の機能性バージョンを含む、弱毒化アフリカ豚熱(ASF)ウイルスを提供する。

さらなる一態様では、本発明は、
DP148R、EP153R及びEP402Rの遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されており、以下の遺伝子:
多重遺伝子族(MGF) 110 5L、6L、8L及び12L、
MGF 360 6L、10L、11L、12L、13L、14L及び21R、並びに
MGF 505 1R及び2R
のうちの1つ以上の機能性バージョンを含む、弱毒化アフリカ豚熱(ASF)ウイルスを提供する。

本発明はまた、本発明の弱毒化ASFウイルスを含むワクチンを提供する。

本発明は、対象においてASFの治療及び/又は予防に使用するための本発明のワクチンを更に提供する。

本発明は、本発明によるワクチンの有効量を対象に投与するステップを含む、対象においてASFを治療及び/又は予防する方法を更に提供する。

本発明は、以下の遺伝子:DP148R、EP153R及びEP402Rの発現及び/又は活性を破壊するステップを含む、ASFウイルスを弱毒化する方法をなお更に提供する。

表面発現を検出するために、野生型CD2v遺伝子を含有する弱毒化ASFVで免疫したブタからの血清で染色した、野生型(A)CD2v又は突然変異型(B)CD2vを発現する非透過処理細胞の共焦点顕微鏡画像を示す図である。 HADアッセイからの例示的画像を示す図である。Vero細胞に、T7RNAポリメラーゼを発現する改変ワクシニアウイルスAnkaraを感染させ、C末端HAエピトープタグを備える野生型又は突然変異型CD2vの完全長タンパク質を発現するプラスミド(pcDNA3)をトランスフェクトした。ブタ赤血球を添加し、表面への赤血球の付着について細胞を観察した。赤血球のHADは、野生型Benin CD2vを発現するプラスミドをトランスフェクトした3個の細胞の周囲で見られる(A)。Dに突然変異したY102残基を有するCD2vを発現する1つの細胞の周囲に部分的なHADが見られる(B)。Rに突然変異した残基E99を有するCD2vを発現する細胞ではHADは見られない(C)。 様々な遺伝子型の異なるASFV分離株由来のCD2vリガンド結合ドメインのアミノ酸配列のアラインメントを表す図である。他の分離株におけるE99残基及び同等の残基が黄色で強調表示されている。 HADアッセイからの例示的画像を示す図である。Vero細胞に、T7RNAポリメラーゼを発現する改変ワクシニアウイルスAnkaraを感染させ、C末端HAエピトープタグを備えるBenin株又はGeorgia株由来の野生型又は突然変異型CD2v完全長タンパク質を発現するプラスミド(pcDNA3)をトランスフェクトした。ブタ赤血球を添加し、表面への赤血球の付着について細胞を観察した。赤血球のHADは、野生型Benin CD2vを発現するプラスミドをトランスフェクトした4個の細胞の周囲で(A)、及び野生型Georgia CD2vを発現するプラスミドをトランスフェクトした4個の細胞の周囲で(B)見られる。Rに突然変異した残基Q96を有するGeorgia CD2vを発現する細胞(C)では、及び非トランスフェクトのVero細胞(D)では、HADは見られない。 BeninΔCD2vウイルス(A)又はOURT88/3ウイルス(B)に感染した、CD2vE99Rを発現するWSL細胞を示す図であり、OURT88/3ウイルスは、EP153R遺伝子及びEP402R/CD2v遺伝子にフレームシフト分断を有する。HADは、BeninΔCD2vを感染させると見られるが、OURT88/3を感染させると見られない。 ASFV Benin 97/1野生型(B 左パネル)又はASFV Benin 97/1ΔDP148RΔEP153R-CD2vE99R(A、B 右パネル)に感染したブタ骨髄細胞を示す図である。 空のpcDNA3ベクター(陰性対照)又はDP148Rを発現するプラスミドをトランスフェクトしたHEK293T細胞におけるNF-κB依存性プロモーターからのルシフェラーゼ発現レベルを示す図である。細胞をIL-1β(A)又はTNF-α(B)で刺激して、NF-κB活性化を誘導した。或いは、NF-κB活性化を、NF-κB経路の主要な2つのキナーゼであるIKKα(C)又はIKKβ(D)の過剰発現によって誘導した。 HAタグ化DP148Rをトランスフェクトし、HAタグ(赤色)及びNF-κBp65サブユニット(緑色)について染色したHeLa細胞の免疫蛍光画像を示す図である。核は青色で示される。細胞を無刺激(上段)として又はTNFα(中段)若しくはIL-1β(下段)で刺激して、NF-κBの活性化及び核へのp65の移行を誘導した。矢印は、DP148Rを発現する細胞を指し示す。DP148Rを発現する刺激細胞では、p65は核に移行しない。 BeninΔDP148RΔEP153RΔCD2v(A群)及びBeninΔDP148RΔEP153R-CD2vE99R(B群)のウイルスでブタを免疫、ブースト及びチャレンジするのに使用された実験プロトコルを表す図である。 免疫及びチャレンジの間のA群(A)及びB群(B)並びに対照群E(C)のブタの直腸体温を示す図である。 免疫及びチャレンジの間のA群(A)及びB群(B)並びに対照群E(C)のブタの臨床スコアを示す図である。 免疫及びチャレンジの間のA群(A)及びB群(B)のブタのウイルス血症を示す図である。 VP72(B646L)主要カプシドタンパク質に基づく市販の競合ELISAを使用して測定された、免疫及びチャレンジの間のA群(A)及びB群(B)のブタの抗体応答を示す図である。 免疫及びチャレンジの間のA群(A)及びB群(B)の細胞性免疫応答を示す図である。末梢血単核細胞を、A群及びB群のブタから免疫前、ブースト時及びチャレンジ時に収集し、ASFV Beninウイルスで刺激した。IFNガンマ産生細胞の数をElispotアッセイによって測定した。 死後にE群、A群及びB群からのブタで見出されたASFV特異的病変の数を示す図である。 BeninΔDP148R(A)、BeninΔDP148RΔCD2v(B)、BeninΔDP148RΔEP153RΔCD2v(C)及びBeninΔDP148RΔEP153R-CD2vE99R(D)による免疫後の血中のウイルスゲノムを直接比較する図である。

アフリカ豚熱ウイルス(ASFV)
アフリカ豚熱ウイルス(ASFV)は、アフリカ豚熱(ASF)の病原体である。ASFVのゲノム構造は、Chapmanら、2008 J. Gen. Virol. 89: 397-408に詳述の通り、当技術分野で知られている。ASFVは、少なくとも150の遺伝子を含有する線状ゲノムを有する、正二十面体の大型の二本鎖DNAウイルスである。遺伝子の数は、ウイルスの分離株によってわずかに異なる。ASFVは、他の大型のDNAウイルスと、例えばポックスウイルス、イリドウイルス及びミミウイルスと類似性を有する。他のウイルス性出血熱と共通して、複製の主たる標的細胞は単球、マクロファージ系統のものである。

主要なカプシドタンパク質p72をコードするB646L遺伝子のC末端領域の配列の多様性に基づいて、22のASFV遺伝子型(I～XXII)が特定されている。全てのASFV p72遺伝子型が東アフリカ及び南アフリカで広まってきている。遺伝子型Iは、ヨーロッパ、南アメリカ、カリブ海及び西アフリカで広まってきている。遺伝子型VIIIは、東アフリカの4か国に限局されている。

いくつかの遺伝子型由来の株の例を下に示す:
遺伝子型I: OURT88/3; Brazil/79; Lisbon/60; BA715; Pret; Benin 97/1; IC/1/96; IC/576; CAM/82; Madrid/62; Malta/78; ZAR85; Katange63; Togo; Dakar59; Ourt88/1; BEN/1/97; Dom_Rep; VAL/76; IC/2/96; Awoshie/99; NIG/1/99; NIG/1/98; ANG/70; BEL/85; SPEC120; Lisbon/57; ASFV-Warm; GHA/1/00; GAM/1/00; Ghana; HOL/86; NAM/1/80; NUR/90/1; CAM/4/85; ASFV-Teng; Tegani; ASFV-E75。
遺伝子型II: Georgia 2007/1; POL/2015/Podlaskie (Polish株); Belgium/Etalle/wb/2018; ASFV/Kyiv/2016/131; China/2018/AnhuiXCGQ
遺伝子型III: BOT 1/99
遺伝子型IV: ASFV-War; RSA/1/99/W
遺伝子型VI: MOZ 94/1
遺伝子型VII: VICT/90/1; ASFV-Mku; RSA/1/98
遺伝子型VIII: NDA/1/90; KAL88/1; ZAM/2/84; JON89/13; KAV89/1; DEZda; AFSV-Mal; Malawi LIL 20/1
遺伝子型IX: UGA/1/95
遺伝子型X: BUR/1/84; BUR/2/84; BUR/90/1; UGA/3/95; TAN/Kwh12; HindeII; ASFV-Ken; Virulent Uganda 65。

ASFV分離株
本発明の弱毒化ASFウイルスは、野生型ASFウイルス分離株に由来し得るが、そのゲノムに突然変異を含んでおり、その結果、DP148R、EP153R及びEP402Rの遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されている。

「野生型」という用語は、ウイルスは(ある時点で)野外に存在し、自然宿主、例えば家畜のブタ、ダニ又はイボイノシシから分離されたことを示す。現在までに記載されているASFV分離株について、それらのGenbank受託番号と一緒に、下の表1に概説する。

本発明の弱毒化ASFVのゲノムは、任意のASFV遺伝子型に相当し得る。本発明の弱毒化ASFVのゲノムは、任意のASFV遺伝子型に本質的に相当し得る。

「に相当する」という用語は、本発明の弱毒化ASFVのゲノムの残部が野生型株(すなわち、ある時点で野外に存在したウイルス)と同じであることを意味する。「ゲノムの残部」とは、破壊されたDP148R、EP153R及びEP402Rの遺伝子以外の全ての遺伝子を指す。換言すれば、本発明の弱毒化ASFVの遺伝子は、DP148R、EP153R及びEP402Rの遺伝子を除いて、野生型株の遺伝子と同じであり得る。一実施形態では、本発明の弱毒化ASFVの遺伝子は、DP148R、EP153R及びEP402Rを除いて、野生型株の遺伝子と同じである。

破壊されたDP148R、EP153R及びEP402Rの遺伝子もまた野生型株に相当し得る。一実施形態では、DP148R、EP153R及びEP402Rの遺伝子は、野生型株に相当し得る。そのような一実施形態(すなわち、DP148R、EP153R及びEP402Rが野生型株に相当する場合)では、DP148R、EP153R及びEP402Rの発現及び/又は活性を、遺伝子間領域、例えばプロモーターにおける1つ以上の突然変異によって破壊することができる。換言すれば、DP148R、EP153R及びEP402Rの遺伝子は野生型ゲノムと同じであるが、それらの発現又は活性は非遺伝子配列の突然変異によって変更される。したがって、本発明の弱毒化ASFVの遺伝子は全て、野生型株の遺伝子と同じであってもよい。一実施形態では、本発明の弱毒化ASFVの全ての遺伝子は、野生型株の遺伝子と同じである。

「に本質的に相当する」という用語は、「に相当する」と同じことを意味するが、ゲノムの残部が1つ以上の突然変異を含み得ることをさらなる例外とする。1つ以上の突然変異は、他の遺伝子に存在し得る(すなわち、DP148R、EP153R及びEP402Rの遺伝子に存在しない)。

弱毒化ASFVのゲノムは、遺伝子型Iに相当するか又は本質的に相当し得る。弱毒化ASFVのゲノムは、遺伝子型IIに相当するか又は本質的に相当し得る。弱毒化ASFVのゲノムは、遺伝子型IIIに相当するか又は本質的に相当し得る。弱毒化ASFVのゲノムは、遺伝子型IVに相当するか又は本質的に相当し得る。弱毒化ASFVのゲノムは、遺伝子型Vに相当するか又は本質的に相当し得る。弱毒化ASFVのゲノムは、遺伝子型VIに相当するか又は本質的に相当し得る。弱毒化ASFVのゲノムは、遺伝子型VIIに相当するか又は本質的に相当し得る。弱毒化ASFVのゲノムは、遺伝子型VIIIに相当するか又は本質的に相当し得る。弱毒化ASFVのゲノムは、遺伝子型IXに相当するか又は本質的に相当し得る。弱毒化ASFVのゲノムは、遺伝子型Xに相当するか又は本質的に相当し得る。

弱毒化ASFVのゲノムは、遺伝子型Iに相当するか又は本質的に相当し得る。弱毒化ASFVのゲノムは、遺伝子型IIに相当するか又は本質的に相当し得る。

好ましくは、弱毒化ASFVのゲノムは、遺伝子型Iに相当するか又は本質的に相当し得る。

本発明の弱毒化ASFVのゲノムは、病原性ASFV株のゲノムに相当するか又は本質的に相当し得る。既知の病原性ASFウイルス株としては: Georgia 2007/1、Benin 97/1、Kenyan、Malawi Lil20/1、Pretorisuskop/96/4及びTengani 62が挙げられる。弱毒化ASFVのゲノムは、Benin 97/1株のゲノムに相当するか又は本質的に相当し得る。弱毒化ASFVのゲノムは、Georgia 2007/1株のゲノムに相当するか又は本質的に相当し得る。

弱毒化ASFVのゲノムは、Benin 97/1株のゲノムに相当するか又は本質的に相当し得る。

本発明の弱毒化ASFVのゲノムは、病原性が現在不明であるASFV株、例えば、Mkuzi、Warmbaths、及びWarthogのゲノムに相当するか又は本質的に相当し得る。

一実施形態では、本発明の弱毒化ASFVのゲノムは、OURT88/3のゲノムに相当しない。一実施形態では、本発明の弱毒化ASFVのゲノムは、NH/P68のゲノムに相当しない。一実施形態では、本発明の弱毒化ASFVはOURT88/3ではない。一実施形態では、本発明の弱毒化ASFVはNH/P68ではない。一実施形態では、本発明の弱毒化ASFVは、OURT88/3でもNH/P68でもない。

アフリカ豚熱ウイルスBenin 97/1病原分離株の完全なゲノムは、Genbank Locus: AM712239.1に与えられている。完全なBA71分離ゲノムは151のオープンリーディングフレーム(ORF)をコードし、Benin 97/1分離株は157のORFをコードし、OURT88/3分離株は151のORFをコードする。

多重遺伝子族(MGF)
ASFVは、ゲノムの左右の可変領域に存在する5つの多重遺伝子族を含有する。MGFは、遺伝子に存在するコドンの平均数にちなんで命名されている: MGF100、110、300、360、及び505/530。MGF300、360及び505/530のメンバーのN末端領域は、互いに有意な類似性を共有している。MGF360族及び505族は、感染細胞の生存の促進及びI型インターフェロン応答の抑制に関与する宿主域の機能にとって必須である遺伝子をコードすることが示されてきた。

本発明による弱毒化ASFVは、以下の遺伝子:
多重遺伝子族(MGF) 110 3L、6L、7L、8L、10L、11L及び12L、
MGF 360 5L、6L、7L、10L、11L、12L、13L、14L、20R、21R及び22R、並びに
MGF 505 1R、2R及び6R
のうちの1つ以上の機能性バージョンを含む。

さらなる一態様では、本発明は、
DP148R、EP153R及びEP402Rの遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されており、以下の遺伝子:
多重遺伝子族(MGF) 110 11L及び12L、
MGF 360 6L、10L、11L、12L、13L及び14L、並びに
MGF 505 1R及び2R
のうちの1つ以上の機能性バージョンを含む、弱毒化アフリカ豚熱(ASF)ウイルスを提供する。

適切には、一実施形態では、本発明は、
DP148R、EP153R及びEP402Rの遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されており、以下の遺伝子:
多重遺伝子族(MGF) 110 5L、6L、8L及び12L、並びに
MGF 360 6L、10L、11L、12L、13L、14L及び21R、並びに
MGF 505 1R及び2R
のうちの1つ以上の機能性バージョンを含む、ASFVを提供する。

適切には、一実施形態では、本発明は、
DP148R、EP153R及びEP402Rの遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されており、以下の遺伝子:
多重遺伝子族(MGF) 110 6L、8L及び12L、並びに
MGF 360 6L、10L、11L、12L、13L、14L及び21R、並びに
MGF 505 1R及び2R
のうちの1つ以上の機能性バージョンを含む、ASFVを提供する。

適切には、一実施形態では、本発明は、
DP148R、EP153R及びEP402Rの遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されており、以下の遺伝子:
多重遺伝子族(MGF) 110 12L、並びに
MGF 360 6L、10L、11L、12L、13L、14L、並びに
MGF 505 1R及び2R
のうちの1つ以上の機能性バージョンを含む、ASFVを提供する。

適切には、一実施形態では、本発明は、
DP148R、EP153R及びEP402Rの遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されており、以下の遺伝子:
多重遺伝子族(MGF) 360 6L、10L、11L、12L、13L、及び14L、並びに
MGF 505 1R及び2R
のうちの1つ以上の機能性バージョンを含む、ASFVを提供する。

様々なASFV株のゲノムにおけるこれらの遺伝子のいくつかの位置を下の表2に提供する。相当するBenin 97/1遺伝子に対する遺伝子の配列同一性も提供する。

様々な株由来のこれらの遺伝子の遺伝子(すなわちヌクレオチド)配列を下に示す。

MGF 110 5L遺伝子配列

一実施形態では、本発明の弱毒化ASFVは、MGF 110 5Lの機能性バージョンを含む。適切には、MGF 110 5Lの機能性バージョンは、配列番号266、267、268、269、270、271、272、273、274又は275の配列を含む。適切には、MGF 110 5Lの機能性バージョンは、配列番号266、267、268、269、270、271、272、273、274又は275と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含む。適切には、MGF 110 5Lの機能性バージョンは、配列番号266、267、268、269、270、271、272、273、274又は275の配列からなる。

MGF 110 6L遺伝子配列

一実施形態では、本発明の弱毒化ASFVは、MGF 110 6Lの機能性バージョンを含む。適切には、MGF 110 6Lの機能性バージョンは、配列番号35、36、37、38、39、40、41、42又は43の配列を含む。適切には、MGF 110 6Lの機能性バージョンは、配列番号35、36、37、38、39、40、41、42又は43と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含む。適切には、MGF 110 6Lの機能性バージョンは、配列番号35、36、37、38、39、40、41、42又は43の配列からなる。

MGF 110 7L遺伝子配列

一実施形態では、本発明の弱毒化ASFVは、MGF 110 7Lの機能性バージョンを含む。適切には、MGF 110 7Lの機能性バージョンは、配列番号247、248、249、250、251、252、253、254、255又は256の配列を含む。適切には、MGF 110 7Lの機能性バージョンは、配列番号247、248、249、250、251、252、253、254、255又は256と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含む。適切には、MGF 110 7Lの機能性バージョンは、配列番号247、248、249、250、251、252、253、254、255又は256の配列からなる。

MGF 110 8L遺伝子配列

一実施形態では、本発明の弱毒化ASFVは、MGF 110 8Lの機能性バージョンを含む。適切には、MGF 110 8Lの機能性バージョンは、配列番号44、45、46、47、48、49又は50の配列を含む。適切には、MGF 110 8Lの機能性バージョンは、配列番号44、45、46、47、48、49又は50と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含む。適切には、MGF 110 8Lの機能性バージョンは、配列番号44、45、46、47、48、49又は50の配列からなる。

MGF 110 12L遺伝子配列

一実施形態では、本発明の弱毒化ASFVは、MGF 110 12Lの機能性バージョンを含む。適切には、MGF 110 8Lの機能性バージョンは、配列番号276、277、278、279、280、281、282、283、284、285又は286の配列を含む。適切には、MGF 110 12Lの機能性バージョンは、配列番号276、277、278、279、280、281、282、283、284、285又は286と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含む。適切には、MGF 110 12Lの機能性バージョンは、配列番号276、277、278、279、280、281、282、283、284、285又は286の配列からなる。

MGF 360 6L遺伝子配列

一実施形態では、本発明の弱毒化ASFVは、MGF 360 6Lの機能性バージョンを含む。適切には、MGF 360 6Lの機能性バージョンは、配列番号51、52、53、54、55、56、57、58、59、60又は61の配列を含む。適切には、MGF 360 6Lの機能性バージョンは、配列番号51、52、53、54、55、56、57、58、59、60又は61と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含む。適切には、MGF 360 6Lの機能性バージョンは、配列番号51、52、53、54、55、56、57、58、59、60又は61の配列からなる。

MGF 360 10L遺伝子配列

一実施形態では、本発明の弱毒化ASFVは、MGF 360 10Lの機能性バージョンを含む。適切には、MGF 360 10Lの機能性バージョンは、配列番号62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73又は74の配列を含む。適切には、MGF 360 10Lの機能性バージョンは、配列番号62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73又は74と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含む。適切には、MGF 360 10Lの機能性バージョンは、配列番号62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73又は74の配列からなる。

MGF 360 11L遺伝子配列

一実施形態では、本発明の弱毒化ASFVは、MGF 360 11Lの機能性バージョンを含む。適切には、MGF 360 11Lの機能性バージョンは、配列番号75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86又は87の配列を含む。適切には、MGF 360 11Lの機能性バージョンは、配列番号75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86又は87と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含む。適切には、MGF 360 11Lの機能性バージョンは、配列番号75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86又は87の配列からなる。

MGF 360 12L遺伝子配列

一実施形態では、本発明の弱毒化ASFVは、MGF 360 12Lの機能性バージョンを含む。適切には、MGF 360 12Lの機能性バージョンは、配列番号88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99の配列を含む。適切には、MGF 360 12Lの機能性バージョンは、配列番号88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含む。適切には、MGF 360 12Lの機能性バージョンは、配列番号88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99の配列からなる。

MGF 360 13L遺伝子配列

一実施形態では、本発明の弱毒化ASFVは、MGF 360 13Lの機能性バージョンを含む。適切には、MGF 360 13Lの機能性バージョンは、配列番号100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110又は111の配列を含む。適切には、MGF 360 13Lの機能性バージョンは、配列番号100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110又は111と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含む。適切には、MGF 360 13Lの機能性バージョンは、配列番号100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110又は111の配列からなる。

MGF 360 14L遺伝子配列

一実施形態では、本発明の弱毒化ASFVは、MGF 360 14Lの機能性バージョンを含む。適切には、MGF 360 14Lの機能性バージョンは、配列番号112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122又は123の配列を含む。適切には、MGF 360 14Lの機能性バージョンは、配列番号112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122又は123と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含む。適切には、MGF 360 14Lの機能性バージョンは、配列番号112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122又は123の配列からなる。

MGF 360 21R遺伝子配列

一実施形態では、本発明の弱毒化ASFVは、MGF 360 21Rの機能性バージョンを含む。適切には、MGF 360 21Rの機能性バージョンは、配列番号124、125、126、127、128、129、130、131、132又は133の配列を含む。適切には、MGF 360 21Rの機能性バージョンは、配列番号124、125、126、127、128、129、130、131、132又は133と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含む。適切には、MGF 360 21Rの機能性バージョンは、配列番号124、125、126、127、128、129、130、131、132又は133の配列からなる。

MGF 505 1R遺伝子配列

一実施形態では、本発明の弱毒化ASFVは、MGF 505 1Rの機能性バージョンを含む。適切には、MGF 505 1Rの機能性バージョンは、配列番号134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145又は146の配列を含む。適切には、MGF 505 1Rの機能性バージョンは、配列番号134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145又は146と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含む。適切には、MGF 505 1Rの機能性バージョンは、配列番号134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145又は146の配列からなる。

MGF 505 2R遺伝子配列

一実施形態では、本発明の弱毒化ASFVは、MGF 505 2Rの機能性バージョンを含む。適切には、MGF 505 2Rの機能性バージョンは、配列番号147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157又は158の配列を含む。適切には、MGF 505 2Rの機能性バージョンは、配列番号147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157又は158と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含む。適切には、MGF 505 2Rの機能性バージョンは、配列番号147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157又は158の配列からなる。

MGF 505 6R遺伝子配列

一実施形態では、本発明は、Benin 97/1株由来の以下の配列のうちの1つ以上、例えば全てを含むASFVを提供する:
配列番号55(MGF 360 6L)、配列番号68(MGF 360 10L)、配列番号78(MGF 360 11L)、配列番号96(MGF 360 12L)、配列番号108(MGF 360 13L)及び配列番号120(MGF 360 14L)、並びに
配列番号141(MGF 505 1R)及び配列番号151(MGF 505 2R)。

一実施形態では、本発明は、China/2018/AnhuiXCGQ株由来の以下の配列のうちの1つ以上、例えば全てを含むASFVを提供する:
配列番号52(MGF 360 6L)、配列番号63(MGF 360 10L)、配列番号76(MGF 360 11L)、配列番号89(MGF 360 12L)、配列番号101(MGF 360 13L)、配列番号113(MGF 360 14L)及び配列番号125(MGF 360 21R)、並びに
配列番号135(MGF 505 1R)及び配列番号148(MGF 505 2R)。

一実施形態では、本発明は、Georgia 2007/1株由来の以下の配列のうちの1つ以上、例えば全てを含むASFVを提供する:
配列番号51(MGF 360 6L)、配列番号62(MGF 360 10L)、配列番号75(MGF 360 11L)、配列番号88(MGF 360 12L)、配列番号100(MGF 360 13L)、配列番号112(MGF 360 14L)及び配列番号124(MGF 360 21R)、並びに
配列番号134(MGF 505 1R)及び配列番号147(MGF 505 2R)。

一実施形態では、本発明は、Ken05/Tk1株由来の以下の配列のうちの1つ以上、例えば全てを含むASFVを提供する:
配列番号35(MGF 110 6L)、配列番号44(MGF 110 8L)、並びに
配列番号58(MGF 360 6L)、配列番号65(MGF 360 10L)、配列番号86(MGF 360 11L)及び配列番号130(MGF 360 21R)、並びに
配列番号145(MGF 505 1R)及び配列番号156(MGF 505 2R)。

一実施形態では、本発明は、Ken06.Bus株由来の以下の配列のうちの1つ以上、例えば全てを含むASFVを提供する:
配列番号36(MGF 110 6L)、並びに
配列番号61(MGF 360 6L)、配列番号64(MGF 360 10L)、配列番号87(MGF 360 11L)、配列番号99(MGF 360 12L)、配列番号111(MGF 360 13L)、配列番号123(MGF 360 14L)及び配列番号132(MGF 360 21R)、並びに
配列番号144(MGF 505 1R)及び配列番号158(MGF 505 2R)。

一実施形態では、本発明は、Kenya 1950株由来の以下の配列のうちの1つ以上、例えば全てを含むASFVを提供する:
配列番号37(MGF 110 6L)、配列番号45(MGF 110 8L)、並びに
配列番号60(MGF 360 6L)、配列番号66(MGF 360 10L)、配列番号85(MGF 360 11L)、配列番号98(MGF 360 12L)、配列番号110(MGF 360 13L)、配列番号122(MGF 360 14L)及び配列番号131(MGF 360 21R)、並びに
配列番号143(MGF 505 1R)及び配列番号157(MGF 505 2R).

一実施形態では、本発明は、L60株由来の以下の配列のうちの1つ以上、例えば全てを含むASFVを提供する:
配列番号54(MGF 360 6L)、配列番号67(MGF 360 10L)、配列番号77(MGF 360 11L)、配列番号95(MGF 360 12L)、配列番号107(MGF 360 13L)及び配列番号119(MGF 360 14L)、並びに
配列番号140(MGF 505 1R)及び配列番号150(MGF 505 2R)。

一実施形態では、本発明は、Malawi Lil-20/1 (1983)株由来の以下の配列のうちの1つ以上、例えば全てを含むASFVを提供する:
配列番号38(MGF 110 6L)、配列番号46(MGF 110 8L)、並びに
配列番号59(MGF 360 6L)、配列番号74(MGF 360 10L)、配列番号84(MGF 360 11L)、配列番号97(MGF 360 12L)、配列番号109(MGF 360 13L)、配列番号121(MGF 360 14L)及び配列番号133(MGF 360 21R)、並びに
配列番号146(MGF 505 1R)及び配列番号155(MGF 505 2R).

一実施形態では、本発明は、Mkuzi 1979株由来の以下の配列のうちの1つ以上、例えば全てを含むASFVを提供する:
配列番号39(MGF 110 6L)、配列番号47(MGF 110 8L)、並びに
配列番号57(MGF 360 6L)、配列番号69(MGF 360 10L)、配列番号79(MGF 360 11L)、配列番号94(MGF 360 12L)、配列番号106(MGF 360 13L)、配列番号118(MGF 360 14L)及び配列番号128(MGF 360 21R)、並びに
配列番号138(MGF 505 1R)及び配列番号149(MGF 505 2R)。

一実施形態では、本発明は、Pretorisuskop/96/4株由来の以下の配列のうちの1つ以上、例えば全てを含むASFVを提供する:
配列番号40(MGF 110 6L)、配列番号48(MGF 110 8L)、並びに
配列番号56(MGF 360 6L)、配列番号70(MGF 360 10L)、配列番号81(MGF 360 11L)、配列番号93(MGF 360 12L)、配列番号105(MGF 360 13L)、配列番号117(MGF 360 14L)及び配列番号127(MGF 360 21R)、並びに
配列番号142(MGF 505 1R)及び配列番号153(MGF 505 2R)。

一実施形態では、本発明は、Tengani 62株由来の以下の配列のうちの1つ以上、例えば全てを含むASFVを提供する:
配列番号41(MGF 110 6L)、並びに
配列番号71(MGF 360 10L)、配列番号82(MGF 360 11L)、配列番号90(MGF 360 12L)、配列番号102(MGF 360 13L)、配列番号114(MGF 360 14L)及び配列番号126(MGF 360 21R)、並びに
配列番号136(MGF 505 1R)及び配列番号152(MGF 505 2R).

一実施形態では、本発明は、Warmbaths株由来の以下の配列のうちの1つ以上、例えば全てを含むASFVを提供する:
配列番号42(MGF 110 6L)、配列番号49(MGF 110 8L)、並びに
配列番号53(MGF 360 6L)、配列番号73(MGF 360 10L)、配列番号80(MGF 360 11L)、配列番号92(MGF 360 12L)、配列番号104(MGF 360 13L)、配列番号116(MGF 360 14L)及び配列番号129(MGF 360 21R)、並びに
配列番号137(MGF 505 1R)及び配列番号154(MGF 505 2R)。

一実施形態では、本発明は、Warthog株由来の以下の配列のうちの1つ以上、例えば全てを含むASFVを提供する:
配列番号43(MGF 110 6L)、配列番号50(MGF 110 8L)、並びに
配列番号72(MGF 360 10L)、配列番号83(MGF 360 11L)、配列番号91(MGF 360 12L)、配列番号103(MGF 360 13L)、配列番号115(MGF 360 14L)、並びに
配列番号139(MGF 505 1R)。

それらの遺伝子の翻訳生成物(すなわちタンパク質配列)を下に示す:
Benin 97/1 MGF遺伝子のタンパク質配列

MGF 110 5Lタンパク質配列

MGF 110 12Lタンパク質配列

MGF 360 12Lタンパク質配列

MGF 360 13Lタンパク質配列

MGF 360 14Lタンパク質配列

MGF 505 1Rタンパク質配列

DP148R
DP148R遺伝子は、ASFVゲノムの右端近く、Benin 97/1ゲノムの位置177915～178679に位置する。DP148R遺伝子はMGF 360 18Rと呼ばれることもある。DP148Rは、感染後の早い時期に発現する。DP148Rタンパク質のアミノ酸配列には、他のタンパク質との有意な類似性はない。二次構造は主にらせん状であると予測されるが、シグナルペプチド又は膜貫通ドメインについては明らかにされていない。

DP148RはI型インターフェロンを阻害する。DP148Rはまた、NF-κB転写因子の活性化も阻害する(図7を参照のこと)。DP148Rは、NF-κBのp65サブユニットの核移行を阻害する(図8を参照のこと)。NF-κBは、ウイルス感染に対する宿主の自然免疫系応答の一部としてインターフェロン及び炎症誘発性サイトカインの発現を制御する。DP148RによるNF-κBの阻害は、ASFVに感染した細胞によって産生されるI型インターフェロン(IFN)並びに炎症誘発性サイトカイン及びケモカインの量の低下をもたらし、ASFVが宿主の自然免疫応答を回避することが可能となり、その結果、ウイルスの複製の助力となり且つ適応応答の発達を破壊すると考えられる。

様々なASFV株由来のDP148R遺伝子のゲノムにおける遺伝子(すなわちヌクレオチド)配列及び位置を下に提示する。

一実施形態では、本発明は、DP148R遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されている弱毒化ASFウイルスを提供する。適切には、DP148R遺伝子は、配列番号287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299又は300の配列を含む。適切には、DP148R遺伝子は、配列番号287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299又は300と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含む。適切には、DP148R遺伝子は、配列番号287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299又は300の配列からなる。

Benin 97/1 DP148Rタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号11として下に表す:

適切には、DP148R遺伝子は、配列番号11の配列を含むタンパク質をコードする。適切には、DP148R遺伝子は、配列番号11と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含むタンパク質をコードする。適切には、DP148R遺伝子は、配列番号11の配列からなるタンパク質をコードする。

他のゲノム由来のDP148Rのオーソログの配列は、74～99%の間のアミノ酸同一性を共有する。他のASFV分離株由来のDP148Rのオーソログの遺伝子を、配列番号12～19として下に表し、ASFVゲノムにおけるそれらの位置を指示する。

適切には、DP148R遺伝子は、配列番号12の配列を含むタンパク質をコードする。適切には、DP148R遺伝子は、配列番号13の配列を含むタンパク質をコードする。適切には、DP148R遺伝子は、配列番号14の配列を含むタンパク質をコードする。適切には、DP148R遺伝子は、配列番号15の配列を含むタンパク質をコードする。適切には、DP148R遺伝子は、配列番号16の配列を含むタンパク質をコードする。適切には、DP148R遺伝子は、配列番号17の配列を含むタンパク質をコードする。適切には、DP148R遺伝子は、配列番号18の配列を含むタンパク質をコードする。適切には、DP148R遺伝子は、配列番号19の配列を含むタンパク質をコードする。適切には、DP148R遺伝子は、配列番号301の配列を含むタンパク質をコードする。適切には、DP148R遺伝子は、配列番号302の配列を含むタンパク質をコードする。適切には、DP148R遺伝子は、配列番号303の配列を含むタンパク質をコードする。適切には、DP148R遺伝子は、配列番号304の配列を含むタンパク質をコードする。適切には、DP148R遺伝子は、配列番号305の配列を含むタンパク質をコードする。

EP153R
EP153R遺伝子は、感染の早期と後期両方で発現する。EP153Rは8CRと呼ばれることもある。EP153Rタンパク質はC型レクチンである。C型の動物レクチンは、血清、細胞外マトリックス及び細胞膜に見出され、糖鎖リガンドの受容体として働くと考えられている。EP153Rタンパク質は、C型レクチンドメイン、細胞付着配列(RGD)及び膜貫通ドメインを含み、T細胞活性化に関与するCD44分子と類似性を有する。

様々なASFV株由来のEP153R遺伝子のゲノムにおける遺伝子(すなわちヌクレオチド)配列及び位置を下に提示する。

一実施形態では、本発明は、EP153R遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されている弱毒化ASFウイルスを提供する。適切には、EP153R遺伝子は、配列番号204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215又は216の配列を含む。適切には、EP153R遺伝子は、配列番号204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215又は216と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含む。適切には、EP153R遺伝子は、配列番号204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215又は216の配列からなる。

ASFVの様々な株由来のEP153Rタンパク質の受託番号を下の表3に列記する。

様々なASFV株由来のEP153Rタンパク質のアミノ酸配列を下に表す。

適切には、EP153R遺伝子は、配列番号20、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227又は228の配列を含むタンパク質をコードする。適切には、EP153R遺伝子は、配列番号20、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227又は228と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含むタンパク質をコードする。適切には、EP153R遺伝子は、配列番号20、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227又は228の配列からなるタンパク質をコードする。

EP153Rは免疫原性である(すなわち、免疫応答を誘発する)(Burmakinaら、2019 J. Gen. Virol. 100: 259-265)。EP153Rは、ASFV感染中にカスパーゼ-3活性化を阻害し、それによってアポトーシスに及ぼす阻害効果を有する。血球吸着にはEP153Rが必要である。EP153Rはまた、感染細胞におけるMHC-I発現も阻害する。

EP402R
EP402R遺伝子は、ウイルスの外層に組み込まれており、哺乳動物のTリンパ球表面接着受容体CD2に部分的に類似しているタンパク質をコードする。特に、EP402Rタンパク質のN末端細胞外領域は、CD2の細胞外リガンド結合領域に類似の2つの免疫グロブリン様(Ig様)ドメインから構成される。EP402Rタンパク質のN末端細胞外ドメインは、「リガンド結合ドメイン」と呼ばれることがある。EP402Rタンパク質の細胞質ドメインは、CD2とは異なる。EP402Rタンパク質は、この類似性のためにCD2vと呼ばれることがある。

EP402Rは免疫原性である(すなわち、免疫応答を誘発する)(Nethertonら、2019 Front. Immunol. 10, 1318)。EP402Rは血球吸着に必要であり、ウイルスの侵入又は拡散においてある役割を有する可能性がある。EP402Rは宿主タンパク質AP-1に結合することができる。EP402Rの機能は、哺乳動物のCD2が細胞外接着分子に結合するのと同じ様式で、その細胞外のN末端、Ig様ドメインがリガンドに結合することによって、媒介され得る。

様々なASFV株由来のEP402R遺伝子のゲノムにおける遺伝子(すなわちヌクレオチド)配列及び位置を下に提示する。

一実施形態では、本発明は、EP402R遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されている弱毒化ASFウイルスを提供する。適切には、EP402R遺伝子は、配列番号229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240又は241の配列を含む。適切には、EP402R遺伝子は、配列番号229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240又は241と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含む。適切には、EP402R遺伝子は、配列番号229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240又は241の配列からなる。

Benin 97/1株由来のEP402Rタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号21として下に表す。

適切には、EP402R遺伝子は、配列番号21の配列を含むタンパク質をコードする。適切には、EP402R遺伝子は、配列番号21と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含むタンパク質をコードする。適切には、EP402R遺伝子は、配列番号21の配列からなるタンパク質をコードする。

Benin 97/1 EP402Rのリガンド結合ドメインは、配列番号34として下に提示される配列番号21のアミノ酸1～198によって形成される。

適切には、EP402Rタンパク質のリガンド結合ドメインは、配列番号34の配列を含む。適切には、EP402Rタンパク質のリガンド結合ドメインは、配列番号34と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含む。適切には、EP402Rタンパク質のリガンド結合ドメインは、配列番号34の配列からなる。

他のASFV分離株由来のオーソロガスEP402R遺伝子を、配列番号22～30として下に表す。

他の株由来のEP402Rタンパク質のリガンド結合ドメインは、図3に示すように、Benin 97/1 EP402Rタンパク質の配列とのアラインメントによって容易に特定できる。

一実施形態では、本発明は、EP402R遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されている弱毒化ASFウイルスを提供する。適切には、EP402R遺伝子は、配列番号22の配列を含むタンパク質をコードする。適切には、EP402R遺伝子は、配列番号23の配列を含むタンパク質をコードする。適切には、EP402R遺伝子は、配列番号24の配列を含むタンパク質をコードする。適切には、EP402R遺伝子は、配列番号25の配列を含むタンパク質をコードする。適切には、EP402R遺伝子は、配列番号26の配列を含むタンパク質をコードする。適切には、EP402R遺伝子は、配列番号27の配列を含むタンパク質をコードする。適切には、EP402R遺伝子は、配列番号28の配列を含むタンパク質をコードする。適切には、EP402R遺伝子は、配列番号29の配列を含むタンパク質をコードする。適切には、EP402R遺伝子は、配列番号30の配列を含むタンパク質をコードする。適切には、EP402R遺伝子は、配列番号242の配列を含むタンパク質をコードする。適切には、EP402R遺伝子は、配列番号243の配列を含むタンパク質をコードする。適切には、EP402R遺伝子は、配列番号244の配列を含むタンパク質をコードする。適切には、EP402R遺伝子は、配列番号245の配列を含むタンパク質をコードする。適切には、EP402R遺伝子は、配列番号246の配列を含むタンパク質をコードする。

血球吸着
血球吸着とは、ASFVに感染した細胞がその表面に赤血球(erythrocytes)(赤血球(red blood cells))を吸着する現象である。ASFVによって誘導される血球吸着の程度は、本明細書に記載のような血球吸着アッセイを使用して測定することができる。例えば、細胞にタンパク質をトランスフェクトさせるか又はASFVを感染させ、次いで赤血球を添加し、イメージングによって血球吸着の程度を検出することができる。このようにして、様々なタンパク質及びウイルスを、血球吸着に及ぼすそれらの影響について試験することができる。

EP402R及びEP153Rは、ASFV感染細胞の血球吸着を媒介する際に関与する。

一実施形態では、本発明は、血球吸着の減少を有する弱毒化ASFウイルスを提供する。

本発明の弱毒化ASFウイルスの一実施形態では、EP153R遺伝子及び/又はEP402R遺伝子が血球吸着を媒介する能力を破壊することができる。一実施形態では、EP153R遺伝子が血球吸着を媒介する能力を破壊することができる。一実施形態では、EP402R遺伝子が血球吸着を媒介する能力を破壊することができる。

血球吸着を減少させる又は血球吸着を媒介する能力を破壊するとは、本発明の弱毒化ASFVに感染した細胞又は突然変異型の非機能性EP153Rタンパク質若しくはEP402Rタンパク質をトランスフェクトした細胞では、野生型ASFVに感染した細胞又は野生型のEP153Rタンパク質若しくはEP402Rタンパク質をトランスフェクトした細胞よりも、細胞の表面に吸着する赤血球が少ないことを意味する。感染した/トランスフェクトした細胞の表面に吸着した赤血球の数を、少なくとも50、60、70、80又は90%低下させ得る。一実施形態では、血球吸着が消失する、すなわち、本発明の弱毒化ASFVに感染した細胞の表面に、又は突然変異型の非機能性EP153Rタンパク質若しくはEP402Rタンパク質をトランスフェクトした細胞の表面に赤血球はまったく吸着しない。

遺伝子発現
本発明の一実施形態の弱毒化アフリカ豚熱(ASF)ウイルスは、DP148R、EP153R及びEP402Rの遺伝子の破壊された発現及び/又は活性を有する。これらの遺伝子は、本明細書において「破壊された遺伝子」と呼ぶことがある。

一実施形態では、本発明は、DP148R、EP153R及びEP402Rの遺伝子の発現が破壊されている弱毒化ASFVを提供する。

遺伝子に関する「発現」という用語は、ASFウイルスが遺伝子の産物、例えばRNA及び/又はタンパク質を産生する能力を指す。遺伝子の発現の破壊とは、遺伝子産物の産生が低下することを意味する。遺伝子の発現を、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%及び/又は少なくとも95%低下させ得る。遺伝子の発現を、遺伝子産物、例えばRNA及び/又はタンパク質の産生が完全に消失する(すなわち、遺伝子産物がまったく産生されない)程度まで低下させ得る。遺伝子発現の破壊によって、遺伝子が破壊されていない場合の遺伝子の発現と比べて、遺伝子の発現が低下する。例えば、突然変異遺伝子は、遺伝子の野生型バージョンと比較して低下した発現を示し得る。

発現が破壊されている遺伝子は、完全には転写及び翻訳されないことがある。遺伝子の転写を、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%及び/又は少なくとも95%低下させ得る。遺伝子の転写は消失することがある(すなわち、遺伝子は転写されないことがある)。遺伝子の翻訳を、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%及び/又は少なくとも95%低下させ得る。遺伝子の翻訳は消失することがある。遺伝子は転写されるが翻訳されないことがある。遺伝子は転写及び翻訳され得るが、タンパク質が迅速に分解されてその機能を実行することできないことがある。遺伝子は転写及び翻訳され得るが、タンパク質が非機能性の場合がある。

遺伝子発現は、当技術分野で知られる技術によって測定することができる。例えば、遺伝子から転写されたmRNAの量を、例えば、定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)を使用することによって定量化することができる。代替的に又は付加的に、タンパク質の量を、例えばウェスタンブロッティング又は質量分析法を使用することによって、定量化することができる。

遺伝子活性
一実施形態では、本発明は、DP148R、EP153R及びEP402Rの遺伝子の活性が破壊されている弱毒化ASFVを提供する。

遺伝子に関する「活性」という用語は、当該遺伝子がその機能を実行する能力を指す。異なる遺伝子は異なる活性、すなわちそれらが果たす異なる機能を有する。所与の遺伝子は多重の活性を有していてもよく、遺伝子活性の破壊は、それらの活性のうちの1つ以上の破壊を意味する。遺伝子のうちの1つ以上の活性を破壊してもよいが、一方、1つ以上の他の活性は破壊されない。遺伝子活性の破壊によって、遺伝子が破壊されていない場合の遺伝子の活性と比べて、遺伝子の活性は低下する。例えば、突然変異遺伝子は、当該遺伝子の野生型バージョンと比較して低下した活性を示し得る。遺伝子活性を、遺伝子活性が完全に消失する程度まで低下させ得る。

本発明による弱毒化ASFVは、破壊された遺伝子の非機能性バージョンを含んでもよい。

遺伝子産物量の低下は、遺伝子がその活性のうちの1つ以上を効果的に実行することができないことを意味するため、遺伝子の発現の破壊によってその遺伝子の活性も破壊され得る。

遺伝子発現及び/又は活性は、ASFVゲノムを突然変異させることによって、すなわちASFVゲノムを突然変異させることによって破壊される。「突然変異」とは、公知のASFV遺伝子型に対するASFVゲノムのヌクレオチド配列の変化を意味する。突然変異には、1つ以上のヌクレオチドを異なるヌクレオチドへ変化させること(すなわち、置換)、ヌクレオチドを付加すること、ヌクレオチドを欠失させること及び/又はこれらの組合せが含まれる。

一実施形態では、本発明の弱毒化ASFウイルスは、DP148R、EP153R及びEP402Rの遺伝子の発現及び/又は活性を破壊する突然変異を含む。

遺伝子の発現及び/又は活性は、遺伝子のmRNAへの転写を破壊することによって、すなわち、遺伝子転写を低下させること、例えば遺伝子転写を完全に消失させることによって破壊され得る。遺伝子の発現及び/又は活性は、mRNAのタンパク質への翻訳を破壊することによって破壊され得る。一実施形態では、弱毒化ASFウイルスは、遺伝子の転写及び/又は翻訳を低下させる突然変異を含む。一実施形態では、弱毒化ASFウイルスは、遺伝子が転写及び/又は翻訳されないこと(すなわち、転写及び/又は翻訳の完全な消失)をもたらす、突然変異を含む。

遺伝子の発現及び/又は活性は、遺伝子に関連する非コード配列、例えばプロモーターを突然変異させることによって破壊され得る。一実施形態では、弱毒化ASFウイルスは、1つ以上の破壊された遺伝子のプロモーターに突然変異を含む。

遺伝子発現及び/又は活性を、1つ以上の破壊された遺伝子のコード配列を突然変異させることによって破壊してもよい。

DP148Rの活性
本発明の弱毒化ASFVの一実施形態では、DP148R活性を破壊することができる。

一実施形態では、破壊され得るDP148Rの活性とは、I型インターフェロンを阻害するその能力である。換言すれば、DP148RがI型インターフェロンを阻害する能力を低下させ得る。DP148RがI型インターフェロンを阻害する能力を、少なくとも50、60、70、80又は90%低下させ得る。DP148RがI型インターフェロンを阻害する能力を完全に消失させ得る。

一実施形態では、破壊され得るDP148Rの活性とは、NF-κB活性を阻害するその能力である。一実施形態では、本発明は、DP148R遺伝子がNFκB活性を阻害する能力が破壊されている弱毒化ASFウイルスを提供する。NFκB活性は、本明細書に記載のルシフェラーゼレポーターアッセイを使用して測定することができる。

NFκB活性を阻害する能力の破壊とは、NFκB活性を阻害する能力が低下していることを意味する。換言すれば、本発明の弱毒化ASFウイルスのDP148R遺伝子は、DP148R遺伝子の野生型バージョンがなし得る程にはNFκB活性を阻害しない。NFκB活性を阻害する能力を、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%又は少なくとも90%低下させ得る。一実施形態では、DP148R遺伝子がNFκB活性を阻害する能力を消失させることができる、すなわち、DP148R遺伝子はNFκB活性を阻害しない。その場合、NFκBの活性は、DP148R遺伝子が存在しないのと同様に高いことになる。阻害の低下とは、NFκB活性がDP148R遺伝子の野生型バージョンによるものよりも高いことを意味する。NFκB活性は、DP148R遺伝子の野生型バージョンによるものの2倍高い、例えば、3倍高い、4倍高い、5倍高い又は6倍高いものとし得る。

NFκBは、種々の遺伝子の転写を活性化する転写因子であり、ウイルス感染に対する宿主の自然免疫系応答の一部として、インターフェロン及び炎症誘発性サイトカインの発現を制御する。NFκB活性の阻害とは、その標的遺伝子の発現の活性化を低下させることを意味する。NFκB標的遺伝子発現の活性化の程度は、NFκBを活性化可能なプロモーターがルシフェラーゼレポーターに連結されている、ルシフェラーゼレポーターアッセイを使用して測定することができる。

一実施形態では、破壊され得るDP148Rの活性とは、NFκBのp65サブユニットの核への移行を阻害するその能力である。一実施形態では、本発明は、DP148R遺伝子がNFκBのp65サブユニットの核への移行を阻害する能力が破壊されている、弱毒化ASFウイルスを提供する。核へのp65の移行は、本明細書に記載のNF-κB活性化因子で刺激された細胞の免疫蛍光によって測定することができる。核に移行するp65の相対量及び絶対量は、当技術分野で知られる差次的細胞溶解条件を使用して、核を開けるか又は核をインタクトのままとしておき、次いで当技術分野で知られる技法、例えばウェスタンブロッティング又は質量分析法を使用してp65の量を定量化することによって、定量化することができる。例えば、野生型又は突然変異型のDP148Rタンパク質を発現する細胞を刺激してNF-κBを活性化し、次いで差次的に溶解して、全細胞溶解物、細胞質画分及び核画分を生成することができる。次いで、各画分のp65の量を、異なる条件(野生型又は突然変異型のDP148Rタンパク質)について定量化することができる。

p65の核への移行を阻害する能力の破壊とは、p65の核への移行を阻害する能力が低下することを意味する。換言すれば、本発明の弱毒化ASFウイルスにおけるDP148R遺伝子のバージョンは、DP148R遺伝子の野生型バージョンがなし得るほどにはp65の核への移行を阻害しない。P65の核への移行を阻害する能力を、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%又は少なくとも90%だけ低下させ得る。一実施形態では、DP148R遺伝子がP65の核への移行を阻害する能力を消失させることができる、すなわち、DP148R遺伝子はP65の核への移行を阻害しない。その場合、DP148R遺伝子が存在しなかったのと同じ程度にP65が核へ移行することになる。阻害の低下とは、核に移行するp65の割合がDP148R遺伝子の野生型バージョンによるものよりも高いことを意味する。核に移行するp65の割合は、DP148R遺伝子の野生型バージョンによるものの2倍高い、例えば、3倍高い、4倍高い、5倍高い又は6倍高いものとし得る。

EP153Rの活性
本発明の弱毒化ASFVの一実施形態では、EP153R活性を破壊することができる。

一実施形態では、破壊され得るEP153Rの活性とは、血球吸着を媒介するその能力である。換言すれば、EP153Rが血球吸着を媒介する能力を低下させ得る。EP153Rが血球吸着を媒介する能力を、少なくとも50、60、70、80又は90%低下させ得る。EP153Rが血球吸着を媒介する能力を完全に消失させ得る。

一実施形態では、破壊され得るEP153Rの活性とは、カスパーゼ-3を阻害するその能力である。換言すれば、EP153Rがカスパーゼ-3を阻害する能力を低下させ得る。EP153Rがカスパーゼ-3を阻害する能力を、少なくとも50、60、70、80又は90%低下させ得る。EP153Rがカスパーゼ-3を阻害する能力を完全に消失させてもよい。カスパーゼ-3活性は、当技術分野で知られるアッセイ、例えばHurtadoら(Hurtadoら、2004 Virology 326: 160-170)により記載のアッセイによって測定することができる。例えば、17kDaの切断された活性型カスパーゼ-3断片及び34kDaの不活性型プロカスパーゼ-3タンパク質を、ウエスタンブロット又は質量分析法を使用して定量化し且つ比較してカスパーゼ-3の活性化の程度を確認することができる。代替的に又は付加的に、細胞抽出物のカスパーゼ-3が蛍光基質を切断する能力は、高速液体クロマトグラフィーを使用して測定することができる。

一実施形態では、破壊され得るEP153Rの活性とは、MHC-I発現を阻害するその能力である。換言すれば、EP153RがMHC-I発現を阻害する能力を低下させ得る。EP153RがMHC-I発現を阻害する能力を、少なくとも50、60、70、80又は90%低下させ得る。EP153RがMHC-I発現を阻害する能力を完全に消失させてもよい。MHC-I発現を、当技術分野で知られるアッセイ、例えばHurtadoら(Hurtadoら、2011 Arch. Virol. 156(2): 219-234)により記載のアッセイによって測定することができる。例えば、MHC-Iの細胞表面発現は、非透過処理細胞の抗体染色、これに続くフローサイトメトリーを使用して測定することができる。

EP402Rの活性
本発明の弱毒化ASFVの一実施形態では、EP402R活性が破壊されている。

一実施形態では、破壊されているEP402Rの活性とは、血球吸着を媒介するその能力である。換言すれば、EP402Rが血球吸着を媒介する能力を低下させ得る。EP402Rが血球吸着を媒介する能力を、少なくとも50、60、70、80又は90%だけ低下させ得る。EP402Rが血球吸着を媒介する能力を完全に消失させてもよい。

破壊されているEP402Rの活性とは、EP402Rタンパク質がその細胞外N末端Ig様ドメイン(すなわち、そのリガンド結合ドメイン)を介してリガンドを結合する能力であり得る。したがって一実施形態では、本発明は、EP402R遺伝子がEP402Rタンパク質によるリガンド結合を破壊する1つ以上の突然変異を含む、弱毒化ASFウイルスを提供する。EP402Rタンパク質が1つ以上のリガンドを結合する能力を破壊してもよい。EP402Rが1つ以上のリガンドを結合する能力を、少なくとも50、60、70、80又は90%低下させ得る。EP402Rタンパク質が1つ以上のリガンドを結合する能力を完全に消失させてもよい。EP402Rタンパク質が1つ以上のリガンドを結合する能力を、他のリガンドを結合する能力を保持しながら完全に消失させてもよい。一実施形態では、本発明は、EP402R遺伝子がEP402Rタンパク質によるリガンド結合を破壊する1つ以上の突然変異を含む、弱毒化ASFウイルスを提供する。リガンド結合は、例えば、免疫沈降、表面プラズモン共鳴及び/又は等温熱量測定であるアッセイを使用して測定することができる。

遺伝子の機能性バージョン
本発明の弱毒化ASFVは、以下の遺伝子:
多重遺伝子族(MGF) 110 3L、6L、7L、8L、10L、11L及び12L、
MGF 360 5L、6L、7L、10L、11L、12L、13L、14L、20R、21R及び22R、並びに
MGF 505 1R、2R及び6R
のうちの1つ以上の機能性バージョンを含む。

一部の実施形態では、本発明の弱毒化ASFVは、以下の遺伝子: MGF 110 3L、6L、7L、8L、10L、11L及び12L; MGF 360 5L、6L、7L、10L、11L、12L、13L、14L、20R、21R及び22R;並びにMGF 505 1R、2R及び6Rのうちの1つ以上の機能性バージョンを含むことができる。適切には、弱毒化ASFVは、以下の遺伝子: MGF 110 3L、6L、7L、8L、10L、11L及び12L; MGF 360 5L、6L、7L、10L、11L、12L、13L、14L、20R、21R及び22R;並びにMGF 505 1R、2R及び6Rのうちの、2つ以上、例えば3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、9つ以上、10以上、11以上、12以上、13以上、14以上、15以上、16以上、17以上、18以上、19以上、20以上、21又は22の機能性バージョンを含む。一実施形態では、弱毒化ASFVは、以下の遺伝子: MGF 110 3L、6L、7L、8L、10L、11L及び12L; MGF 360 5L、6L、7L、10L、11L、12L、13L、14L、20R、21R及び22R;並びにMGF 505 1R、2R及び6Rのうちの全ての機能性バージョンを含む。

遺伝子の「機能性バージョン」という表現は、その発現及び活性が破壊されていない遺伝子を指す。遺伝子の機能性バージョンは、遺伝子発現又は遺伝子活性が破壊されるような様式で突然変異していなくてもよい。遺伝子の機能性バージョンは、なんら突然変異を含まなくてもよい。遺伝子の機能性バージョンのコード配列は、完全であり且つ非分断であってよい。遺伝子の機能性バージョンは、完全に転写され且つ翻訳されていてもよい。

遺伝子の機能性バージョンは、野生型ASFV分離株の遺伝子に相当し得る。遺伝子の機能性バージョンは、病原性ASFV株の遺伝子に相当し得る。遺伝子の機能性バージョンの配列は、野生型ASFV分離株又は病原性ASFV株の遺伝子の配列と同一とし得る。遺伝子の機能性バージョンの配列は、本発明の弱毒化ASFVが由来する野生型ASFV分離株の遺伝子の配列と同一とし得る。遺伝子の機能性バージョンは、野生型ASFV分離株の遺伝子の天然の変異体とし得る。

遺伝子の機能性バージョンは突然変異を含んでもよい。しかし、突然変異によって遺伝子の発現又は活性が損なわれてはならない。換言すれば、突然変異は遺伝子の機能に影響を与えてはならない。遺伝子の機能性バージョンは、1つ以上の同義的な突然変異(すなわち、当該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を変更しない突然変異)を含んでもよい。遺伝子の機能性バージョンは1つ以上のサイレント突然変異を含んでもよく、これは同義であっても非同義であってもよい。遺伝子の機能性バージョンは、遺伝子の発現又は活性を破壊しない欠失を含んでもよい。遺伝子の機能性バージョンは、遺伝子の発現又は活性を破壊しない1つ以上の一塩基多型(SNP)を含んでもよい。

欠失
本発明の弱毒化ASFVでは、遺伝子の発現及び/又は活性が欠失によって破壊されてもよい。換言すれば、遺伝子の発現及び/又は活性が、欠失である突然変異によって破壊されてもよい。

本発明の弱毒化ASFVは、欠失によって遺伝子の機能性バージョンを欠くように作製してもよい。換言すれば、ASFVが遺伝子の機能性バージョンを欠くことをもたらす突然変異は、欠失であってもよい。

「欠失」とは、ASFVゲノムヌクレオチド配列の一部の除去を意味する。欠失は連続的であることもあり、又は配列の複数のセクションの欠失を含むこともある。欠失によって、本明細書に記載の方法のいずれかで遺伝子発現及び/又は活性を破壊してもよい。欠失によって、本明細書に記載の方法のいずれかで、ASFVが遺伝子の機能性バージョンを欠くことをもたらしてもよい。

欠失によって、遺伝子のmRNAへの転写を破壊してもよい。例えば、遺伝子のプロモーターを欠失すると、転写が破壊されることになる。欠失によって、mRNAのタンパク質への翻訳を破壊してもよい。例えば、開始コドンを欠失すると、翻訳が破壊されることになる。遺伝子の発現及び/又は活性を、遺伝子に関連する非コード配列、例えばプロモーターを欠失させることによって破壊してもよい。

遺伝子の発現及び/又は活性を、遺伝子のコード配列を欠失させることによって破壊してもよい。ASFVを、遺伝子のコード配列を欠失させることによって、遺伝子の機能性バージョンを欠くように作製してもよい。コード配列の欠失は部分的であってもよい(すなわち、コード配列の一部が欠失している)。欠失によって、例えば、遺伝子のコード配列の少なくとも50、60、70、80又は90%を除去することができる。欠失は完全であってもよく、その場合、野生型分離株の相当するゲノムと比較した場合、遺伝子のコード配列の100%が存在しない。

コード配列の欠失は連続的であることもあり、又はコード配列の複数のセクションの欠失を含むこともある。欠失が遺伝子の発現及び/又は活性を破壊する、すなわち、機能性遺伝子産物、例えばタンパク質がもはや遺伝子から産生されないように、十分な量のコード配列が、欠失によって除去されることが求められる。「遺伝子の欠失」(例えば「部分的に欠失している」)という表現は、遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されるような十分な量のコード配列の欠失を指す。遺伝子の発現及び/又は活性を破壊するのに欠失させる必要があるコード配列の量は、極めて小さくてもよい。例えば、単に開始コドン(ATG)を欠失させることは、遺伝子の発現及び/又は活性を破壊してウイルスを弱毒化するのに十分であり得る。

遺伝子の部分的及び完全な欠失は、当技術分野で既知の技法、例えばCre-LoxP及びFlp-FRTのシステムを介した条件付きターゲティングを使用して、又は操作されたヌクレアーゼ、例えば、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)及びCRISPR-CasシステムのCasを使用する二本鎖切断(DSB)並びに修復を誘導することによって、行うことができる。DSB修復を利用して、DSBのいずれかの側に隣接する配列と相同である配列内に所望の突然変異ヌクレオチド配列を含むベクターを供給することにより、所望の突然変異を導入することができる。これにより、所望の突然変異がDSBの部位に挿入される。ヌクレアーゼ、例えば上のものを操作して、ゲノム内の特定の部位にDSBを誘導することができる。例えば、既知のタンパク質単位を組み合わせることによってキメラメガヌクレアーゼを容易に生成することができ、その結果、目的の遺伝子又はゲノム領域内の標的認識配列を認識することができる。ZFNは、特定の配列を標的とするように設計することもでき、その結果、例えばジンクフィンガーユニットを既知の特異性と組み合わせてDNAの特定の領域に結合することができる。TALENは、ヌクレアーゼドメインをDNA結合TALE(転写活性化因子様エフェクター)ドメインに融合させることによって設計された人工制限酵素である。TALEドメインは、単一塩基を認識するアミノ酸反復のタンデムアレイであり、DNAの特定の領域を標的とするように設計することができる。CRISPR-Casシステムは、Cas(CRISPR-関連タンパク質)ヌクレアーゼ及び、CRISPR(クラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の反復)RNA配列から構成されるが、この配列によって、Casタンパク質がCRISPR配列に相補的なDNAの特定の鎖を認識及び切断するように誘導する。そのため、一本鎖ガイドRNA(sgRNA)を、DNAの特定の領域に結合し、Casを誘導してDSBを導入するように設計することできる。したがって、遺伝子のヌクレオチド(例えば、DNA又はcDNA)配列が知られていることを条件として、既知のヌクレアーゼ系を利用して、遺伝子に部分的又は完全な欠失を導入することができる。

本発明の弱毒化ASFウイルスの一実施形態では、DP148R、EP153R及びEP402Rの遺伝子は、少なくとも部分的に欠失であるとし得る。

DP148R遺伝子は少なくとも部分的に欠失させてもよい。EP153R遺伝子は少なくとも部分的に欠失していてもよい。EP402R遺伝子は少なくとも部分的に欠失していてもよい。DP148R遺伝子及びEP153R遺伝子はそれぞれ、少なくとも部分的に欠失していてもよい。DP148R、EP153R及びEP402Rの遺伝子はそれぞれ、少なくとも部分的に欠失でしていてもよい。

本発明の弱毒化ASFウイルスの一実施形態では、DP148R、EP153R及びEP402Rの遺伝子は、完全に欠失していてもよい。

DP148R遺伝子は完全に欠失していてもよい。EP153R遺伝子は完全に欠失していてもよい。EP402R遺伝子は完全に欠失していてもよい。DP148R遺伝子及びEP153R遺伝子はそれぞれ、完全に欠失していてもよい。DP148R、EP153R及びEP402Rの遺伝子はそれぞれ、完全に欠失していてもよい。

分断
遺伝子の発現及び/又は活性を、遺伝子の分断によって破壊してもよい。換言すれば、遺伝子の発現及び/又は活性を破壊する突然変異は、遺伝子を分断する突然変異であってもよい。

本発明の弱毒化ASFVの一実施形態では、DP148R、EP153R及びEP402Rの遺伝子を分断してもよい。DP148R遺伝子を分断してもよい。EP153R遺伝子を分断してもよい。EP402R遺伝子を分断してもよい。DP148R遺伝子及びEP153R遺伝子をそれぞれ分断してもよい。DP148R、EP153R及びEP402Rの遺伝子を、それぞれ分断してもよい。

「分断」とは、機能性遺伝子産物、例えばタンパク質がもはや産生されないように、突然変異が遺伝子のコード配列を変更することを意味する。「分断」という用語は、遺伝子を分断する突然変異を指して本明細書で使用することができる。遺伝子の発現及び/又は活性を破壊する、すなわち、機能性遺伝子産物、例えばタンパク質が遺伝子からもはや産生されないような様式で、突然変異によってコード配列が分断されることが求められる。

分断によって、遺伝子産物の産生を完全に消失させてもよい。例えば、遺伝子産物がタンパク質である場合、分断によってmRNAがナンセンスとなり、その結果、mRNAが分解されること及びタンパク質が翻訳されないことが引き起こされ、それによってタンパク質産生が消失し得る。分断は、産生される遺伝子産物を変更することがある。分断は、遺伝子が転写及び/又は翻訳されないことの原因となり得る。

分断は、点突然変異(すなわち、単一ヌクレオチドの置換、挿入又は欠失)であってもよい。分断は欠失であってもよい。遺伝子は、遺伝子の分断につながる多重の突然変異を含んでもよい。

分断はフレームシフト突然変異であってもよい。フレームシフトは、フレームシフトの下流のコドンが異なるアミノ酸として読み取られることの原因となる。産生されたタンパク質は非機能性となり得る。

分断は、開始コドンの突然変異であってもよい。開始コドンは通常ATGである。開始コドンの突然変異(例えば、1つ、2つ又は3つのヌクレオチドの点突然変異)は、そのコドンで翻訳が開始しないことになることを意味する。翻訳は、更に下流の後続の開始コドンで開始することがある。後続の開始コドンがフレーム中にある場合、N末端が切断されているバージョンのタンパク質が生成され、したがってこれは非機能性となり得る。後続の開始コドンがフレーム中にない場合、まったく異なるタンパク質又はナンセンスタンパク質が生成され、これは非機能性となり得る。後続の開始コドンがない場合、翻訳は完全に消失し、タンパク質は生成されない。

分断は終止コドン(TAG、TAA又はTGA)の突然変異であってもよい。終止コドンの突然変異(ノンストップ突然変異とも呼ばれる)によって、翻訳されるべきではない配列へのmRNAの継続的翻訳が引き起こされる。結果的に生じるタンパク質は、その過剰な長さに起因して非機能性となり得る。

アミノ酸の変化
本発明の弱毒化ASFウイルスの一実施形態では、EP402R遺伝子は、EP402Rタンパク質のリガンド結合ドメイン中の1つ以上のアミノ酸を変化させる1つ以上の突然変異を含む。適切には、EP402R遺伝子は、EP402Rタンパク質のリガンド結合ドメインにおいて、1つ以上のアミノ酸(例えば2個以上、3個以上、4個以上又は5個以上のアミノ酸)を変化させる1つ以上の突然変異(例えば2つ以上、3つ以上、4つ以上又は5つ以上の突然変異)を含む。

EP402Rタンパク質のリガンド結合ドメイン中の1つ以上のアミノ酸を変化させることよって、EP402Rタンパク質の発現及び/又は活性を破壊することが求められる。一実施形態では、EP402Rタンパク質のリガンド結合ドメイン中の1つ以上のアミノ酸を変化させることによって、EP402Rタンパク質によって媒介される血球吸着を破壊し得る。一実施形態では、EP402Rタンパク質のリガンド結合ドメイン中の1つ以上のアミノ酸を変化させることによって、EP402Rタンパク質によるリガンド結合を破壊し得る。

一実施形態では、リガンド結合ドメインにおける1つ以上の突然変異は、本明細書に記載の欠失であっても分断であってもよい。例えば、EP402Rタンパク質のリガンド結合ドメインのコード配列の一部の欠失よって、リガンド結合ドメインからコードされたアミノ酸が不存在となり、このことによってリガンド結合が破壊され得る。

一実施形態では、突然変異のうちの1つ以上が点突然変異であってもよい。適切には、突然変異のうちの1つ以上は、単一のアミノ酸を異なるアミノ酸に変化させる点突然変異であってもよい。そのようなアミノ変化は、置換と呼ぶことができる。単一のアミノ酸でも変化させることによって、EP402Rタンパク質の活性、例えばリガンド結合活性を破壊することができる。例えば、荷電することができるアミノ酸を反対の荷電を有することができるアミノ酸に変化させることによって、EP402Rリガンドドメインの折り畳みを破壊することができ、その結果、結合ポケットが変形し、このことによってリガンド結合が妨げられる。代替的に又は付加的に、反対の電荷を有することができるアミノ酸での置換は、リガンドの静電結合を妨げ得る。別の可能性は、小側鎖を備えるアミノ酸を嵩高い側鎖を備えるアミノ酸に変化させることによって、その逆もしかりであるが、EP402Rリガンド結合ドメインの折り畳みを破壊し、その結果、結合ポケットが形成されず、このことによってリガンド結合が妨げられ得る。

したがって、一実施形態では、リガンド結合ドメイン中の1つ以上の変化したアミノ酸は、正に荷電したアミノ酸に変化する負に荷電したアミノ酸を含んでもよい。一実施形態では、リガンド結合ドメイン中の1つ以上の変化したアミノ酸は、負に荷電したアミノ酸に変化する正に荷電したアミノ酸を含んでもよい。正に荷電したアミノ酸(すなわち、正電荷を有することができるアミノ酸)には、ヒスチジン(H)、リジン(K)及びアルギニン(R)が含まれる。負に荷電したアミノ酸(すなわち、負電荷を有することができるアミノ酸)には、アスパラギン酸(D)及びグルタミン酸(E)が含まれる。

一実施形態では、リガンド結合ドメイン中の1つ以上の変化したアミノ酸は、嵩高い側鎖を備えるアミノ酸に変化する小側鎖を備えるアミノ酸を含んでもよい。一実施形態では、リガンド結合ドメイン中の1つ以上の変化したアミノ酸は、小側鎖を備えるアミノ酸に変化する嵩高い側鎖を備えるアミノ酸を含んでもよい。嵩高い側鎖を備えるアミノ酸には、トリプトファン(W)が含まれる。小側鎖を備えるアミノ酸には、グリシン(G)及びアラニン(A)が含まれる。

一実施形態では、リガンド結合ドメイン中の1つ以上の変化したアミノ酸は、疎水性側鎖を備えるアミノ酸に変化する親水性側鎖を備えるアミノ酸を含むことができる。一実施形態では、リガンド結合ドメイン中の1つ以上の変化したアミノ酸は、親水性側鎖を備えるアミノ酸に変化する疎水性側鎖を備えるアミノ酸を含むことができる。疎水性側鎖を備えるアミノ酸には、アラニン(A)、バリン(V)、イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、及びトリプトファン(W)が含まれる。親水性側鎖を備えるアミノ酸には、アルギニン(R)、ヒスチジン(H)、リジン(K)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、セリン(S)、スレオニン(T)、アスパラギン(N)及びグルタミン(Q)が含まれる。

アミノ酸E99をRに又はアミノ酸Y102をDに変化させることは、Benin 97/1株由来のEP402Rタンパク質が血球吸着を媒介する能力を破壊する(図4、5、及び6を参照のこと)。更に、アミノ酸Q96をRに変化させることは、Georgia 2007/1株由来のEP402Rタンパク質が血球吸着を媒介する能力を破壊する(図4Cを参照のこと)。したがって、一実施形態では、1つ以上の突然変異は、Benin 97/1 EP402Rタンパク質(配列番号11)のE99及び/又はY102に相当する、EP402Rタンパク質中の位置でアミノ酸を変化させる。換言すれば、本発明の弱毒化ASFウイルスによって発現されるEP402Rタンパク質は、任意のASFウイルス株由来のEP402Rタンパク質であり得、変化しているアミノ酸は、本明細書において配列番号11として提示されている、Benin 97/1株由来のEP402Rタンパク質のアミノ酸配列のE99及び/又はY102に相当する。位置E99及び位置Y102は、Benin 97/1 EP402Rタンパク質のそれぞれ位置99及び位置102にてのアミノ酸であるグルタミン酸及びチロシンを指す。一実施形態では、1つ以上の突然変異は、Benin 97/1株のEP402Rタンパク質の位置E99及び/又は位置Y102で、又は他の任意のASFV株のEP402Rタンパク質の相当する位置でアミノ酸を変化させる。一実施形態では、1つ以上の突然変異は、Benin 97/1 EP402Rタンパク質(配列番号11)のE99及びY102に相当する、EP402Rタンパク質中の位置でアミノ酸を変化させる。一実施形態では、1つ以上の突然変異は、Benin 97/1 EP402Rタンパク質(配列番号11)のE99に相当する、EP402Rタンパク質中の位置でアミノ酸を変化させる。一実施形態では、1つ以上の突然変異は、Benin 97/1 EP402Rタンパク質(配列番号11)のY102に相当する、EP402Rタンパク質中の位置でアミノ酸を変化させる。

アミノ酸がBenin 97/1 EP402Rタンパク質のE99及び/又はY102に相当するかどうかは、配列アラインメントによって評価され得る。例えば、図3に、Benin、Mkuzi、Warmbaths、Tengnani、Warthog、Georgia及びMalawiの各株由来のEP402Rタンパク質のアラインメントを示す。Benin 97/1 EP402Rタンパク質のE99に相当する、各株由来のEP402Rタンパク質中のアミノ酸は、Benin E99残基の下に示されているアミノ酸である(黄色で強調表示)。Benin 97/1 EP402Rタンパク質のY102に相当する、各株由来のEP402Rタンパク質中のアミノ酸は、Benin Y102残基の下に示されているアミノ酸である(黄色で強調表示されたアミノ酸の右側の3つのアミノ酸)。Benin 97/1 EP402RのE99及びY102に相当する、図3の株由来のEP402Rタンパク質のアミノ酸を下の表4に示す。

Benin 97/1 EP402RのE99及びY102に相当するアミノ酸は、図3に示され、上の表4に列挙されたもの以外の株(例えば、本明細書の表1に列挙された他の株)由来のEP402Rタンパク質に存在する。当業者であれば、配列アラインメントを使用して、所与の株、例えば表1からの株由来のEP402Rタンパク質中のどのアミノ酸がBenin 97/1 EP402RのE99又はY102に相当するかを容易に決定することができる。相当するアミノ酸は、Benin 97/1 EP402RのE99又はY102と同一であってもよい。例えば、Benin 97/1 EP402RのE99に相当するアミノ酸は、E(グルタミン酸)であってもよい。相当するアミノ酸は、E99又はY102に類似していてもよい。適切には、相当するアミノ酸はE99又はY102と同じ電荷を有する。適切には、E99に相当するアミノ酸はQ(グルタミン)である。適切には、Y102に相当するアミノ酸はW(トリプトファン)である。「Benin 97/1 EP402Rタンパク質のE99及び/又はY102に相当する」という表現は、Benin 97/1 EP402Rタンパク質のE99及び/又はY102Dを包含する。

一実施形態では、1つ以上の突然変異は、Benin 97/1 EP402Rタンパク質(配列番号11)の位置E99及び/又は位置Y102でアミノ酸を変化させる。一実施形態では、1つ以上の突然変異は、Benin 97/1 EP402Rタンパク質(配列番号11)の位置E99でアミノ酸を変化させる。一実施形態では、1つ以上の突然変異は、Benin 97/1 EP402Rタンパク質(配列番号11)の位置Y102でアミノ酸を変化させる。一実施形態では、1つ以上の突然変異は、Georgia 2007/1 EP402Rタンパク質(配列番号24)の位置Q96でアミノ酸を変化させる。

一実施形態では、1つ以上の突然変異は、Benin 97/1 EP402Rタンパク質(配列番号11)のN16、I19、W21、Y76、E99、Y102及び/又はN108に相当する、EP402Rタンパク質中の位置でアミノ酸を変化させる。一実施形態では、1つ以上の突然変異は、Benin 97/1株のEP402Rタンパク質の位置N16、I19、W21、Y76、E99、Y102及び/又はN108で、又は他の任意のASFV株のEP402Rタンパク質中の相当する位置でアミノ酸を変化させる。一実施形態では、1つ以上の突然変異は、Georgia 2007/1 EP402Rタンパク質(配列番号24)のS15、W19、Q96、N104、及び/又はK108Dに相当する、EP402Rタンパク質中の位置でアミノ酸を変化させる。一実施形態では、1つ以上の突然変異は、Georgia 2007/1 EP402Rタンパク質(配列番号24)のEP402Rタンパク質の位置S15、W19、Q96、N104、及び/又はK108Dで、又は他の任意のASFV株のEP402Rタンパク質中の相当する位置でアミノ酸を変化させる。一実施形態では、1つ以上の突然変異は、N10遺伝子型IX EP402Rタンパク質(配列番号27)のW20、Q112、N121及び/又はR125に相当する、EP402Rタンパク質中の位置でアミノ酸を変化させる。一実施形態では、1つ以上の突然変異は、N10遺伝子型IX EP402Rタンパク質(配列番号27)のEP402Rタンパク質の位置S15、W19、Q96、N104、及び/又はK108D、又は配列番号27における相当する位置で、又は他の任意のASFV株のEP402Rタンパク質中の相当する位置でアミノ酸を変化させる。これらのアミノ酸はEP402Rタンパク質のリガンド結合ドメイン中にあり、表面露出である。

適切には、突然変異は、Benin 97/1 EP402Rタンパク質(配列番号11)中の位置に相当する位置で、N16R、I19R、W21D、Y76D、E99R、Y102D及び/又はN108Rから選択される。適切には、突然変異は、Georgia 2007/1 EP402Rタンパク質(配列番号11)中の位置に相当する位置のE99R及びN108Rの組合せである。

適切には、突然変異は、Georgia 2007/1 EP402Rタンパク質(配列番号24)中の位置に相当する位置で、S15R、W19D、Q96R、N104R及び/又はK108Dから選択される。適切には、突然変異は、Georgia 2007/1 EP402Rタンパク質(配列番号24)中の位置に相当する位置のQ96R及びN104Rの組合せである。

適切には、突然変異は、N10遺伝子型IX EP402Rタンパク質(配列番号27)中の位置に相当する位置で、W20D、Q112R、N121R及び/又はR125Dから選択される。適切には、突然変異は、N10遺伝子型IX EP402Rタンパク質(配列番号27)中の位置に相当する位置のQ112R及びN121Rの組合せである。

適切には、弱毒化ASFVが遺伝子型Iである場合、1つ以上の突然変異は、Benin 97/1 EP402Rタンパク質(配列番号11)のY76、E99、Y102及び/又はN108に相当する、EP402Rタンパク質中の位置でアミノ酸を変化させる。適切には、弱毒化ASFVが遺伝子型Iである場合、突然変異は、Benin 97/1 EP402Rタンパク質(配列番号11)中の位置に相当する位置でY76D、E99R、Y102D及び/又はN108Rから選択される。

適切には、弱毒化ASFVが遺伝子型IIである場合、1つ以上の突然変異は、Georgia2007/1 EP402Rタンパク質(配列番号24)のS15、W19、Q96、N104及び/又はK108Dに相当する、EP402Rタンパク質中の位置でアミノ酸を変化させる。適切には、弱毒化ASFVが遺伝子型IIである場合、突然変異は、Georgia 2007/1 EP402Rタンパク質(配列番号24)中の位置に相当する位置で、S15R、W19D、Q96R、N104R及び/又はK108Dから選択される。適切には、弱毒化ASFVが遺伝子型IIである場合、突然変異は、Georgia 2007/1 EP402Rタンパク質(配列番号24)中の位置に相当する位置のQ96R及びN104Rの組合せであるとし得る。

一実施形態では、E99に相当する位置のアミノ酸はRに変化し及び/又はY102に相当する位置のアミノ酸はDに変化する。一実施形態では、E99に相当する位置のアミノ酸はRに変化する。一実施形態では、Y102に相当する位置のアミノ酸はDに変化する。一実施形態では、Benin 97/1 EP402RのE99はRに変化し及び/又はBenin 97/1 EP402RのY102はDに変化する。一実施形態では、Benin 97/1 EP402RのE99はRに変化する。一実施形態では、Benin 97/1 EP402RのY102はDに変化する。一実施形態では、Georgia2007/1 EP402RのQ96はRに変化する。

E99R置換を含むBenin 97/1株由来のEP402Rタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号31として下に表す。

一実施形態では、EP402R遺伝子は、配列番号31の配列を含むタンパク質をコードする。適切には、EP402R遺伝子は、配列番号31と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含むタンパク質をコードし、ここで、アミノ酸99はRである。適切には、EP402R遺伝子は、配列番号31の配列からなるタンパク質をコードする。

Y102D置換を含むBenin 97/1株由来のEP402Rタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号32として下に表す。

一実施形態では、EP402R遺伝子は、配列番号32の配列を含むタンパク質をコードする。適切には、EP402R遺伝子は、配列番号32と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含むタンパク質をコードし、ここで、アミノ酸102はDである。適切には、EP402R遺伝子は、配列番号32の配列からなるタンパク質をコードする。

Q96R置換を含むGeorgia 2007/1株由来のEP402Rタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号33として下に表す。

一実施形態では、EP402R遺伝子は、配列番号33の配列を含むタンパク質をコードする。適切には、EP402R遺伝子は、配列番号33と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含むタンパク質をコードし、ここで、アミノ酸96はRである。適切には、EP402R遺伝子は、配列番号33の配列からなるタンパク質をコードする。一実施形態では、EP402R遺伝子は、配列番号31、32又は33から選択される配列を含むタンパク質をコードする。

突然変異の組合せ
本明細書に記載の遺伝子発現及び/又は活性を破壊する突然変異は、本発明の弱毒化ASFVにおいて組み合わせてもよい。換言すれば、本発明の弱毒化ASFVにおけるDP148R、EP153R及びEP402Rの遺伝子のそれぞれを、他の遺伝子のいずれかと同じタイプの突然変異によって、又は他の遺伝子のいずれかと異なるタイプの突然変異によって破壊してもよい。

例えば、本発明の弱毒化ASFVでは、DP148Rをプロモーター配列の突然変異によって破壊することができ、EP153Rを完全な欠失によって破壊することができ、EP402Rをそのリガンド結合ドメイン中のアミノ酸変化によって破壊することができる。代替の例として、DP148Rを部分的な欠失によって破壊することができ、EP153Rを分断によって破壊することができ、EP402Rを完全な欠失によって破壊することができる。

一実施形態では、本発明は、弱毒化ASFVであって、
DP148R遺伝子及びEP153R遺伝子はそれぞれ完全に欠失しており、
EP402R遺伝子はBenin 97/1 EP402Rタンパク質(配列番号11)のE99に相当する、EP402Rタンパク質中の位置でアミノ酸をRに変化させる突然変異を含み;且つ
以下の遺伝子:
MGF 110 3L、6L、7L、8L、10L、11L及び12L、
MGF 360 5L、6L、7L、10L、11L、12L、13L、14L、20R、21R及び22R、並びに
MGF 505 1R、2R及び6R
のうちの1つ以上の機能性バージョンを含む、
弱毒化ASFVを提供する。

弱毒化ASFVは、本明細書に記載のMGF遺伝子のうちの1つ以上の機能性バージョンを含み得る。

一実施形態では、本発明は、弱毒化ASFVであって、
DP148R遺伝子及びEP153R遺伝子はそれぞれ完全に欠失しており、
EP402R遺伝子はBenin 97/1 EP402Rタンパク質(配列番号11)のE99に相当する、EP402Rタンパク質中の位置でアミノ酸をRに変化させる突然変異を含み;且つ
以下の遺伝子:
MGF 110 3L、6L、7L、8L、10L、11L及び12L、
MGF 360 5L、6L、7L、10L、11L、12L、13L、14L、20R、21R及び22R、並びに
MGF 505 1R、2R及び6R
のうちの1つ以上の機能性バージョンを含む、
弱毒化ASFVを提供する。

弱毒化ASFVは、本明細書に記載のMGF遺伝子のうちの1つ以上の機能性バージョンを含み得る。

一実施形態では、本発明は、弱毒化ASFVであって、
DP148R遺伝子及びEP153R遺伝子はそれぞれ完全に欠失しており、
EP402R遺伝子は、Benin 97/1 EP402Rタンパク質(配列番号11)のY102にあたるEP402Rタンパク質中の位置でアミノ酸をDに変化させる突然変異を含み;且つ
以下の遺伝子:
MGF 110 3L、6L、7L、8L、10L、11L及び12L、
MGF 360 5L、6L、7L、10L、11L、12L、13L、14L、20R、21R及び22R、並びに
MGF 505 1R、2R及び6R
のうちの1つ以上の機能性バージョンを含む、
弱毒化ASFVを提供する。

弱毒化ASFVは、本明細書に記載のMGF遺伝子のうちの1つ以上の機能性バージョンを含み得る。

ワクチン/医薬組成物
本発明はまた、本発明の弱毒化ASFウイルスを含むワクチンを提供する。

本明細書で使用される「ワクチン」という用語は、対象に投与された場合に防御免疫応答を誘導又は刺激する調剤を指す。ワクチンは、生物体を特定の疾患、本件ではASFに対して免疫性にすることができる。したがって、本発明のワクチンは、その後に行うASFウイルスチャレンジに対して防御的である免疫応答を対象において誘導する。本発明の弱毒化ASFVを含むワクチンは、複数のASFウイルス遺伝子型に対する交差防御免疫応答を誘導し得る。一実施形態では、単一遺伝子型の本発明の弱毒化ASFVを含むワクチンは、複数のASFウイルス遺伝子型に対する交差防御免疫応答を誘導できてもよい。

ワクチンは、複数の弱毒化ASFウイルスを含んでもよい。複数の弱毒化ASFウイルスは、複数の様々な分離株、例えば、病原性が高い又は不明の様々な分離株に相当し得る。そのようなワクチンは、複数のASFウイルス遺伝子型に対する交差防御免疫応答を誘導できてもよい。

ワクチンは、アフリカ豚熱を予防する上で有用であり得る。したがって、本発明は、対象においてアフリカ豚熱の治療及び/又は予防に使用するための本発明のワクチンを提供する。

本発明はまた、本発明の1つ以上の弱毒化ASFウイルスを含む医薬組成物も提供する。医薬組成物は、アフリカ豚熱を治療するために使用され得る。

ワクチン又は医薬組成物は、本発明のうちの1つ以上の弱毒化ASFウイルス並びに、場合により1つ以上のアジュバント、賦形剤、担体及び希釈剤を含んでもよい。医薬賦形剤、担体又は希釈剤の選択は、意図する投与経路及び標準的な薬務に関連して選択することができる。医薬組成物は、担体、賦形剤又は希釈剤として(又はそれらに加えて)、適切な任意の結合剤、滑沢剤、懸濁化剤、コーティング剤、可溶化剤及び他の担体剤を含んでもよい。医薬組成物は通常、製造及び貯蔵の条件下で無菌且つ安定であることが求められる。非経口投与用の製剤には、限定するものではないが、懸濁剤、液剤、油性又は水性ビヒクル中のエマルジョン、ペースト剤、埋込型徐放性又は生分解性製剤が含まれる。無菌の注射用製剤は、非毒性で非経口的に許容される希釈剤又は溶媒を使用して調製してもよい。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される分散剤、湿潤剤、懸濁剤、等張剤、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、担体、賦形剤、塩、又は用いられる投薬量及び濃度で対象にとって無毒である安定剤を含んでもよい。好ましくは、そのような組成物は、例を挙げると非経口(例えば、皮下、皮内又は静脈内注射)又は髄腔内投与ための、投与の所与の方法及び/又は部位に適合する、疾患の治療に使用するための薬学的に許容される担体又は賦形剤を更に含むことができる。

ワクチン又は医薬組成物は、1つ以上の本発明の弱毒化ASFウイルスを有効量で含み得る。

一実施形態では、本発明は、対象に投与された場合に、病原性ASFウイルスによるその後に行うチャレンジに対して防御的である免疫応答を誘導する、本発明の弱毒化ASFウイルスを提供する。一実施形態では、本発明は、対象に投与された場合に、ワクチンの弱毒化ASFウイルスとは異なる遺伝子型の病原性ASFウイルスによるその後に行うチャレンジに対し防御的である免疫応答を誘導する、本発明の弱毒化ASFウイルスを提供する。

予防/治療の方法
本発明はまた、本発明の弱毒化ウイルス、ワクチン又は医薬組成物の有効量を対象に投与することによって、対象においてASFを予防及び/又は治療する方法も提供する。

「予防する」という用語は、ASFの感染を防ぐこと、遅延させること、妨害すること又は妨げることを指すことを意図している。ワクチンは、例えば、感染性ASFVが細胞に侵入する可能性を予防又は低減し得る。

「治療する」という用語は、現存のASF感染の少なくとも1つの症状を軽減又は緩和することを指すことを意図している。

対象は、ASF感染に感受性のある任意の動物とし得る。ASF感受性動物には、家畜のブタ、イボイノシシ、カワイノシシ及びダニが含まれる。

本発明に従ってワクチン接種される対象は、家畜のブタとし得る。

投与
本発明のワクチンを、簡便な任意の経路によって、例えば筋肉内注射によって投与することができる。他の適切な投与経路には、鼻腔内、経口、皮下、経皮及び膣(例えば、人工授精中)が含まれる。一実施形態では、経口投与は、ワクチンを動物飼料又は飲料水に添加することを含む。別の実施形態では、ワクチンを、野生動物用の餌、例えばイノシシ、野生のブタ、カワイノシシ又はイボイノシシに適した餌に添加してもよい。

ブタの免疫の用量は、ブタ1匹当たり10⁴ HAD₅₀又はTCID₅₀未満としてもよい。例えば、用量は、10²～10³の間のHAD₅₀又はTCID₅₀としてもよい。用量は、ブタ1匹当たり約10² HAD₅₀又はTCID₅₀とし得る。用量は、獣医の健全な判断の範囲内で獣医が決定してよい。

ワクチンはプライムブーストレジーム（prime-boost regime）に従って投与してもよい。例えば、第1の接種の後、しばらく(例えば、約7、14、21又は28日)の後、対象は第2のブースト投与を受けることができる。通常、ブースト投与はプライミング投与よりも高用量である。ブースト用量は、ブタ1匹当たり組換え弱毒化ウイルスの約10²、10³若しくは10⁴ HAD₅₀又はTCID₅₀とし得る。

弱毒化ウイルスの調製方法
本発明はまた、DP148R、EP153R及びEP402Rの遺伝子の発現及び/又は活性を破壊するステップを含む、ASFウイルスを弱毒化する方法も提供する。

遺伝子発現及び/又は活性の破壊は、本明細書に記載の方法のいずれかでASFVゲノムに突然変異を起こさせることによってなし得る。

DP148R、EP153R及び/又はEP402Rの遺伝子は、部分的に欠失していても完全に欠失していてもよい。

DP148R遺伝子は、少なくとも部分的に欠失していても完全に欠失していてもよい。EP153R遺伝子は、少なくとも部分的に欠失していても完全に欠失していてもよい。EP402R遺伝子は、少なくとも部分的に欠失していても完全に欠失していてもよい。DP148R遺伝子及びEP153R遺伝子は、少なくとも部分的に欠失していても完全に欠失していてもよい。DP148R、EP153R及びEP402Rの遺伝子はそれぞれ、部分的に欠失していても完全に欠失していてもよい。破壊された遺伝子のうちの1つ以上(例えば2つ以上又は3つ全て)のコード配列は、少なくとも部分的に欠失していても完全に欠失していてもよい。

DP148R、EP153R及び/又はEP402Rの遺伝子を分断してもよい。

DP148R遺伝子を分断してもよい。EP153R遺伝子を分断してもよい。EP402R遺伝子を分断してもよい。DP148R遺伝子及びEP153R遺伝子を分断してもよい。DP148R、EP153R及びEP402Rの遺伝子を、それぞれ分断してもよい。破壊された遺伝子のうちの1つ以上(例えば2つ以上、又は3つ全て)のコード配列を分断してもよい。

一実施形態では、ASFウイルスを弱毒化する方法は、EP402R遺伝子が血球吸着を媒介する能力を破壊することを含む。

一実施形態では、ASFウイルスを弱毒化する方法は、EP402Rタンパク質によるリガンド結合を破壊する1つ以上の突然変異をEP402R遺伝子に導入することを含む。

一実施形態では、ASFウイルスを弱毒化する方法は、EP402Rタンパク質のリガンド結合ドメイン中の1つ以上のアミノ酸を変化させる1つ以上の突然変異をEP402R遺伝子に導入することを含む。突然変異は、本明細書に記載の突然変異のうちの1つ以上とし得る。

一実施形態では、ASFウイルスを弱毒化する方法は、EP402Rタンパク質のR96、E99及び/又はY102の各位置でアミノ酸を変化させることを含む。

一実施形態では、ASFウイルスを弱毒化する方法は、位置R96でアミノ酸をQに、位置E99でアミノ酸をRに、及び/又は位置Y102でアミノ酸をDに変化させることを含む。適切には、方法は、位置R96でアミノ酸をQに変化させることを含む。適切には、方法は、位置E99でアミノ酸をRに変化させることを含む。適切には、方法は、位置Y102でアミノ酸をDに変化させることを含む。

一実施形態では、ASFウイルスを弱毒化する方法は、DP148R遺伝子を完全に欠失させること、EP153R遺伝子を完全に欠失させること、及びEP402Rタンパク質の位置R96でアミノ酸をQに変化させる突然変異をEP402R遺伝子に導入することを含む。一実施形態では、ASFウイルスを弱毒化する方法は、DP148R遺伝子を完全に欠失させること、EP153R遺伝子を完全に欠失させること、及びEP402Rタンパク質の位置E99でアミノ酸をRに変化させる突然変異をEP402R遺伝子に導入することを含む。一実施形態では、ASFウイルスを弱毒化する方法は、DP148R遺伝子を完全に欠失させること、EP153R遺伝子を完全に欠失させること、及びEP402Rタンパク質の位置Y102でアミノ酸をDに変化させる突然変異をEP402R遺伝子に導入することを含む。

ウイルス遺伝子の突然変異の方法は当技術分野で知られている。特に、ウイルス遺伝子の欠失の方法は当技術分野で知られている。例えば、相同組換えを使用することができるが、この場合、関連する遺伝子を欠いている状態でトランスファーベクターを創り出し、これを使用してウイルス感染細胞にトランスフェクトする。配列の新規の部分を発現する組換えウイルスを次いで選択してもよい。例えばATG開始コドンの欠失により、遺伝子発現を分断するために、同様の手順を使用することができる。

遺伝子の「機能を保持する」とは、弱毒化プロセスの間、遺伝子の発現及び活性が影響を受けないことを意味する。結果として得られる弱毒化ウイルスは、遺伝子の機能性バージョンを発現するはずである。適切には、機能が保持されることになる遺伝子は、弱毒化の方法によって変更されない。適切には、機能が保持されることになる遺伝子の配列は、弱毒化の方法によって変更されない。

一部の実施形態では、ASFウイルスを弱毒化する方法は、以下の遺伝子: MGF 110 3L、6L、7L、8L、10L、11L及び12L; MGF 360 5L、6L、7L、10L、11L、12L、13L、14L、20R、21R及び22R;並びにMGF 505 1R、2R及び6Rのうちの1つ以上の機能を保持することを含み得る。適切には、以下の遺伝子のうちの2つ以上、例えば3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、9つ以上、10以上、11以上、12以上、13以上、14以上、15以上、16以上、17以上、18以上、19以上、20以上、21又は22の機能が保持される:MGF 110 3L、6L、7L、8L、10L、11L及び12L; MGF 360 5L、6L、7L、10L、11L、12L、13L、14L、20R、21R及び22R;並びにMGF 505 1R、2R及び6R。一実施形態では、ASFウイルスを弱毒化する方法は、以下の遺伝子:MGF 110 3L、6L、7L、8L、10L、11L及び12L; MGF 360 5L、6L、7L、10L、11L、12L、13L、14L、20R、21R及び22R;並びにMGF 505 1R、2R及び6Rの全ての機能を保持することを含み得る。

本開示は、本明細書において開示される例示の方法及び材料によって限定されるものではなく、本開示の実施形態を実践又は試験するにあたって、本明細書に記載のものと類似する又は等価である任意の方法及び材料を使用することができる。数値範囲は、範囲を定義する数値を包括する。別途記載のない限り、それぞれ、任意の核酸配列は左から右に5'から3'方向で記載されており、アミノ酸配列は左から右にアミノからカルボキシの方向で記載されている。

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「a」、「an」及び「the」は、文脈が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。

本明細書において使用される「含む(comprising)」、「含む(comprises)」及び「で構成される(comprised of)」という用語は、「含む(including)」、「含む(includes)」又は「含有する(containing)」、「含有する(contains)」と同義であり、包含的又はオープンエンドであり、さらなる記載されていないメンバー、要素又は方法のステップを除外するものではない。「含む(comprising)」、「含む(comprises)」及び「で構成される(comprised of)」という用語はまた、「からなる(consisting of)」という用語を含む。

本明細書で論議される刊行物は、本出願の出願日前の刊行物の開示のためにのみ提供されるものである。本明細書には、そのような刊行物が、本明細書に添付の特許請求の範囲に対して先行技術を構成すると認めたものと解釈されるべき記載はない。

ここで、本発明を実施例によって更に説明するが、実施例は当業者の本発明の実施を補助することを意味するものであって、本発明の範囲をいかようにも制限することを意図するものではない。

[実施例]
[実施例1]
HADを減少させるEP402R/CD2v突然変異型の特定
突然変異を、アフリカ豚熱ウイルス(ASFV)Benin分離株EP402Rタンパク質(CD2v)で行い、血球吸着(HAD)に及ぼすそれらの影響について試験した。

CD2vの細胞外N末端IgG様、リガンド結合ドメインのモデルを生成し、これを使用してCD2vのそのリガンドへの結合に関与する機能性アミノ酸残基を予測した。これらの残基を個別に突然変異させて、一連の突然変異型CD2vタンパク質を生成した。

Vero細胞に、T7RNAポリメラーゼを発現する改変ワクシニアウイルスAnkaraを感染させ、C末端HAエピトープタグを備える野生型又は突然変異型CD2v完全長タンパク質を発現するプラスミド(pcDNA3)をトランスフェクトした。ブタ赤血球を添加し、表面への赤血球の付着について細胞を観察した。野生型又は突然変異型CD2vタンパク質の発現を、透過処理細胞を使用する共焦点顕微鏡と、HAタグを認識する抗体及び二次抗体を使用するウェスタンブロッティングの両方によって確認した。野生型又は突然変異型CD2vの細胞表面発現はまた、野生型CD2v遺伝子を含有する弱毒化ASFVで免疫したブタからの血清及び二次抗体で、非透過処理細胞を染色することによっても確認した(図1)。

残基E99又はY102の突然変異によって、HADが抑制された。図2に、HADアッセイからの例示的画像を示す。図2Aに、野生型Benin CD2vを発現するプラスミドをトランスフェクトした細胞を示す。赤血球のHADが3個の細胞の周囲に見られる。図2Bに、Y102残基がDに突然変異したCD2vを発現する細胞を示す。1つの細胞の周囲に部分的なHADが見られる。図2Cに、残基E99がRに突然変異したCD2vを発現する細胞を示す。HADは見られない。

CD2vの残基E99は、種々の遺伝子型の様々なASFV分離株由来のCD2vリガンド結合ドメインのアミノ酸配列のアラインメントによって示されるように、ASFVにおいて強く保存されている(図3)。他の分離株(図3で黄色で強調表示)の相当する残基は、同一(E)であるか又は同じ電荷(Q)を有するか、いずれかである。

Georgia CD2vのBenin CD2vE99に相当する残基Q96をRに突然変異させ、突然変異タンパク質がHADを誘導する能力について、上記のHADアッセイを使用して試験した。Georgia CD2vにおけるQ96の突然変異によって、HADが抑制された。図4に、ブタ赤血球によるVero細胞のHADアッセイからの例示的画像を示す。図4Aに、野生型Benin CD2vを発現するプラスミドをトランスフェクトしたVero細胞を示す。赤血球のHADが4個の細胞の周囲に見られる。図4Bに、野生型Georgia CD2vを発現するVero細胞を示す。HADが2個の細胞の周囲に見られる。図4Cに、残基Q96がRに突然変異したGeorgia CD2vを発現するVero細胞を示す。HADは見られない。図4Dに、非トランスフェクトVero細胞を示す。HADは見られない。

同じアッセイを使用して、以下の突然変異がBeninのHADに影響すると判定した: N16R、I 19R、W21D、Y 76D、E99R、Y102D。加えて、E99R + N108Rの組合せによって、BeninのHADに影響すると判定した。

以下の突然変異がGeorgiaのHADに影響すると判定した: S15R、W19D、Q96R、N104R及びK108D。加えて、S15R + W19D及びQ96R + N104Rの組合せが、GeorgiaのHADに影響すると判定した。

以下の突然変異が、N10遺伝子型IXのHADに影響すると判定した: W20D、R125D、Q112R + N121R。

[実施例2]
機能性DP148R、EP153R及びEP402Rを欠くASFVの生成
HADを誘導する能力は、CD2vE99R突然変異型を発現するWSL細胞にBeninΔCD2vウイルスを感染させることによって回復することができた(図4A)。

しかし、HADは、CD2vE99R突然変異型を発現するWSL細胞にOURT88/3ウイルスを感染させることによって、回復することはできなかった(図4B)。OURT88/3は、EP153R遺伝子及びEP402R/CD2v遺伝子にフレームシフト分断を有しており、このことが示唆するところは、CD2vE99R突然変異型によって引き起こされるHADをレスキューする際のEP153Rの役割である。

これらの結果に基づいて、弱毒BeninΔDP148Rウイルスをバックボーンとして使用して、2種の遺伝子欠失Beninウイルスを構築した。一方のウイルスは、DP148Rに加えて、EP153R及びEP402Rのさらなる欠失(BeninΔDP148RΔEP153RΔCD2v)を有し、第2のウイルスは、EP153Rが欠失し、野生型EP204R遺伝子をCD2vE99R突然変異型を発現する遺伝子に置き換えたものである

Benin CD2vE99R突然変異タンパク質は、図6Aに示すように、細胞表面で発現した。ブタ骨髄細胞にBeninΔDP148RΔEP153R-CD2vE99Rを感染させ、これを、感染後8時間目に固定及び透過処理し、次いで抗体で染色したが、この抗体は、CD2vE99R遺伝子と二次抗体と共にインフレームで融合されたHAタグを認識するものである。CD2vE99Rは細胞表面に赤色で示されている。mNeon greenをEP153R遺伝子の場所に挿入したが、これは緑色で示されている。核DNA及びウイルスの細胞質ファクトリー（factory）は青色に染色されている。感染細胞の数を示すために、右側のパネルにはより大きな視野を表示する。

これらのウイルスに感染した細胞は、HADを誘発しなかった。図6Bに、野生型Benin 97/1ウイルス(左パネル)又はBeninΔDP148RΔEP153R-CD2vE99R(右パネル)に感染したブタ骨髄細胞を示す。赤血球がBenin 97/1感染細胞の周囲にロゼットを形成しているのが見られるが(左パネル)、突然変異型CD2vE99Rを発現するウイルスに感染した細胞の周囲には見られない(右パネル)。右下の挿入図に、細胞が感染したことを確認するために、mNeonタンパク質を発現するBeninΔDP148RΔEP153R-CD2vE99Rに感染した細胞を示す。

[実施例3]
DP148Rは、p65サブユニットの核移行を阻害することにより、NF-κBの活性化を阻害する
HEK293T細胞に、NF-κB依存性ルシフェラーゼレポータープラスミド、及びDP148R遺伝子をコードするプラスミド又は陰性対照として空のプラスミド(pcDNA3)いずれかをトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、細胞をIL-1β(図7A)又はTNF-α(図7B)で8時間処理して、NF-κB活性化を誘導した。細胞溶解の後、ルシフェラーゼ活性を測定した。図7A及び図7Bが示すところは、DP148Rの存在下で、ルシフェラーゼ値はpcDNA3をトランスフェクトした細胞から得られた値よりも有意に低かったことである。このことが指摘するところは、DP148RはNF-KB媒介性シグナル伝達を阻害することができることである。

一組の代替実験では、NF-κB活性化を、NF-κBシグナル伝達経路の2つの主要なキナーゼ、すなわちIKKα(図7C)及びIKKβ(図7D)の過剰発現によって代わりに誘導した。図7C及び図7Dが示すところは、ここでも、DP148Rの存在下で、ルシフェラーゼ値はpcDNA3をトランスフェクトした細胞から得られた値よりも有意に低かったことであり、このことが指摘するところは、DP148Rがキナーゼ活性化のレベルでNF-κB経路を阻害することができることである。

DP148RがNF-κBの活性化を阻害するメカニズムを更に解明するために、NF-κBのp65サブユニットの核移行に及ぼすDP148Rの影響について調査した。HeLa細胞にHAタグ化DP148Rを発現するプラスミドをトランスフェクトし、次いでTNF-アルファ又はIL-1βで刺激してNF-κBを活性化した。非刺激細胞を陰性対照として使用した。細胞を固定し、透過処理し、次いで抗HAタグ抗体及び適当な二次抗体を使用してHAタグ化DP148Rについて染色した。NF-κBのp65サブユニットを一次抗体及び二次抗体で染色した。図8に、細胞の免疫蛍光画像を示す。HAタグ化DP148Rを赤色で示し、p65を緑色で示し、核を青色で示す。DP148R未発現細胞において、非刺激細胞では、p65は細胞質に留まるが、TNF-アルファ又はIL-1ベータによる刺激の後に核に移行する。対照的に、DP148Rを発現する細胞においては、p65の核移行は刺激時に観察されず、細胞質においてより低い量のp65が検出される。結果が示すところは、DP148RはNF-κBの効率的な阻害剤であり、これはNF-κB依存性の遺伝子の活性化を阻害し得ることである。これらには、例えば、炎症誘発性サイトカイン及びケモカインが含まれる。

[実施例4]
機能性DP148R、EP153R及びEP402Rの欠如は、ASFVを弱毒化し、チャレンジに対する防御を誘導する
ワクチン接種実験プロトコル
大ヨークシャー種（large white）/ランドレース種ブタの群を、10⁴ TCID50 BeninΔDP148RΔEP153RΔCD2v(A群-8匹のブタ)及びBeninΔDP148RΔEP153R-CD2vE99R(B群-6匹のブタ)で筋肉内免疫した。

ブタを、免疫後21日目(10⁴ TCID50/ml)及び28日目(10⁶ TCID50/ml)にブーストし、次いで、免疫後45日目に10³ TCID50/mlの病原性Benin 97/1親株でチャレンジした。並行して、3匹の非免疫ブタ(対照E群)を設定した。

実験プロトコルを図9に表す。

体温
直腸体温を、A群及びB群及び対照E群の全てのブタについて毎日記録した(図10)。A群では、チャレンジ前に体温の上昇は見られなかった。チャレンジ後3日目に1匹のブタで、チャレンジ後4日目に残りのブタで、41℃以上の体温上昇が見られた。2匹のブタ(A3及びA4)が、チャレンジ後5日目に人道的エンドポイントに達し、殺処分された。残りのブタは、40.6℃の体温が3日目の間持続したブタA7を除いて、全体として2日の間40.5℃を超える高い体温を有した。その後、チャレンジ後20日目の実験終了まで、体温が更に上昇することなく全頭が生存した(図10A)。

B群の3匹のブタは、免疫後5日目に40.5℃を超える体温の上昇を有した。1匹のブタは、チャレンジ後3日目までに41.1℃の体温を有し、動物が人道的エンドポイントで殺処分されるまで、この体温は更に2日維持された。生存した他の全てのブタから、1匹はチャレンジ後4日目に40.5℃を超える体温が1日あり、3匹は2日(4日目及び5日目)の体温上昇があり、1匹は体温上昇がなかった。全ての生存動物について、実験の終わり(チャレンジ後20日目)までさらなる体温上昇はなかった(図10B)。

対照ブタは、チャレンジ後4日目から40.5℃を超える体温を有し、チャレンジ後6日目に人道的エンドポイントで殺処分した(図10C)。

臨床スコア
体温の上昇並びにその他の徴候、例えば嗜眠及び食欲不振を含めて、臨床スコアを毎日収集した(図11)。A群では、チャレンジ前に徴候は見られなかった。チャレンジ後、全てのブタで臨床スコアが見られたが、体温の上昇と同時であり、人道的エンドポイントで殺処分した2匹のブタでより高いレベルに到達した(図11A)。

B群では、体温の上昇と同時に免疫後のブタに軽度の徴候が見られた。チャレンジ後、人道的エンドポイントで殺処分したブタ及び、臨床的徴候を有さなかった体温の上昇を示さなかったブタを除いて、軽度の徴候が見られた(図11B)。

ウイルス血症
血中のウイルスゲノムのレベルをqPCRによって測定した(図12)。チャレンジ前のA群のブタの血中からは、ウイルスゲノムは検出されなかった。チャレンジ後3日目又は4日目から様々なレベルのゲノムが検出された。殺処分したブタにおいて最大レベルが検出された(1ml当たり約10e6ゲノムコピー)。他のブタでは、検出された最大レベルは、およそ1ml当たり10e2～1ml当たり10e5.5の間で変動した。ウイルスゲノムのレベルは、チャレンジ後20日目に終了するまで低下し、2匹のブタでは検出不能となり、終了時にレベルが依然として10e4.5であった1匹のブタを除いて、他のブタでは10e2.6に減少した(図12A)。

B群では、免疫後6日目に3匹のブタからの血中に低レベルのウイルスゲノムが検出された。チャレンジ後、ウイルスゲノムが、チャレンジの後7日目から低レベル(1ml当たり10e4ゲノムコピー未満)で検出された(図12B)。

抗体応答
ASFV特異的抗体応答を、VP72(B646L)主要カプシドタンパク質に基づく市販の競合ELISAを使用して測定した(図13)。A群では、抗体応答が、第1のブーストの後及び第2のブーストの直前に、免疫後27日目に最初に検出された。実験の残りの間、レベルが維持された(図13A)。

B群のブタでは、抗体応答は14日目(ブーストの1週間前)までに検出されそして上昇し、21日目～28日目の後ではプラトーを維持した(図13B)。

細胞媒介性免疫応答
末梢血単核細胞を、A群及びB群のブタから免疫前、ブースト時及びチャレンジ時に収集し、ASFV Beninウイルスで刺激した。IFNガンマ産生細胞の数をElispotアッセイによって測定した(図14)。A群では、低レベルのIFNガンマ産生細胞が免疫後及びブースト前に誘導され、これらはチャレンジ前に全てのブタで一様に上昇した(図14A)。B群では、応答はブタ同士の間でさらに多様であり、ブタはブースト前により高い数のIFNガンマ産生細胞を有していた。しかし、チャレンジの時点で、これらの数は1匹のブタを除く全てのブタでわずかに減少していた。人道的エンドポイントで殺処分したブタ(B4)はより少ない数のIFNガンマ産生細胞を有していたが、チャレンジを生き延びたブタ(B5)と数の点では類似していた(図14B)。

死後における肉眼的病変のスコア化
対照の非免疫ブタ(E群)は、肥大した且つ出血性のリンパ節及び脾臓を始めとした急性ASFVの典型的な病変を示した。チャレンジを生き延びたブタは、ASFV特異的病変がある場合も軽微であった(図15)。人道的エンドポイントで殺処分したブタは、より高いスコアを示したが、対照ブタよりも低かった(データ示さず)。

ウイルス血症の比較
図16では、異なるウイルスによる免疫後の血中のウイルスゲノムを直接に比較している。BeninΔDP148Rによる免疫は、中等度レベルのウイルスゲノムを一過性に誘導し、このレベルは60日にわたりゆっくりと低下する。複製又は検出可能なチャレンジウイルスの増加は見られない(図16A)。EP402R/CD2v遺伝子(BeninΔDP148RΔCD2vウイルス)の欠失によって、血中のゲノムの持続性が劇的に減少し(最大で約15日)、一部のブタでレベルが減少する。チャレンジ後にウイルスゲノムは検出されなかった(図16B)。三重欠失BeninΔDP148RΔEP153RΔCD2vは、免疫後に血中に検出可能なゲノムを誘導せず、チャレンジ後に中等度～低レベルを誘導し、実験の終了までに低レベル又は検出不能レベルに低下する(図16C)。BeninΔDP148RΔEP153R-CD2vE99Rウイルスは、免疫後に血中の一過性低レベルのウイルスゲノムを誘導し、チャレンジ後低レベルを誘導する(図16D)。

上の本明細書において言及した全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の記載の方法及びシステムに関する各種の改変及び変更は、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく当業者にとって明白であろう。本発明を特定の好ましい実施形態に関連付けて説明してきたが、特許請求している発明は、そのような特定の実施形態に不当に制限されるべきものではないことを理解されたい。実際、ウイルス学、分子生物学又は関連分野の当業者であれば明白である、本発明を実施するための記載されている様式の各種改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。

Claims (31)

1. DP148R、EP153R及びEP402Rの遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されている弱毒化アフリカ豚熱(ASF)ウイルスであって、
   以下の遺伝子:
   多重遺伝子族(MGF) 110 3L、6L、7L、8L、10L、11L及び12L、
   MGF 360 5L、6L、7L、10L、11L、12L、13L、14L、20R、21R及び22R、並びに
   MGF 505 1R、2R及び6R
   のうちの1つ以上の機能性バージョンを含む、弱毒化アフリカ豚熱(ASF)ウイルス。
2. DP148R遺伝子及び/又はEP153R遺伝子は少なくとも部分的に欠失している、請求項1に記載の弱毒化ASFウイルス。
3. DP148R遺伝子及び/又はEP153R遺伝子は完全に欠失している、請求項2に記載の弱毒化ASFウイルス。
4. DP148R遺伝子及び/又はEP153R遺伝子は分断されている、請求項1に記載の弱毒化ASFウイルス。
5. DP148R遺伝子がNF-κB活性を阻害する能力は破壊されている、請求項1から4のいずれか一項に記載の弱毒化ASFウイルス。
6. DP148R遺伝子がNF-κB活性のp65サブユニットの核への移行を阻害する能力は破壊されている、請求項1から5のいずれか一項に記載の弱毒化ASFウイルス。
7. EP153R遺伝子及び/又はEP402R遺伝子が血球吸着を媒介する能力は破壊されている、請求項1から4のいずれか一項に記載の弱毒化ASFウイルス。
8. EP402R遺伝子は、EP402Rタンパク質によるリガンド結合を破壊する1つ以上の突然変異を含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の弱毒化ASFウイルス。
9. EP402R遺伝子は、EP402Rタンパク質のリガンド結合ドメイン中の1つ以上のアミノ酸を変化させる1つ以上の突然変異を含む、請求項6に記載の弱毒化ASFウイルス。
10. 1つ以上の突然変異は、Benin 97/1 EP402Rタンパク質(配列番号11)のE99及び/又はY102に相当する、EP402Rタンパク質中の位置でアミノ酸を変化させる、請求項7に記載の弱毒化ASFウイルス。
11. E99に相当する位置のアミノ酸はRに変化し、及び/又はY102にあたる位置のアミノ酸はDに変化している、請求項8に記載の弱毒化ASFウイルス。
12. EP402R遺伝子は少なくとも部分的に欠失している、請求項1から6のいずれか一項に記載の弱毒化ASFウイルス。
13. EP402R遺伝子は完全に欠失している、請求項10に記載の弱毒化ASFウイルス。
14. DP148R、EP153R及びEP402R以外の全てのASFウイルス遺伝子の機能性バージョンを含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の弱毒化ASFウイルス。
15. 請求項1から12のいずれか一項に記載の弱毒化ASFウイルスを含むワクチン。
16. 対象においてアフリカ豚熱の治療及び/又は予防に使用するための、請求項13に記載のワクチン。
17. 請求項13に記載のワクチンの有効量を対象に投与するステップを含む、対象においてアフリカ豚熱を治療及び/又は予防する方法。
18. 対象が家畜のブタである、請求項14に記載の使用のためのワクチン、又は請求項15に記載の方法。
19. ワクチンはプライムブーストレジームに従って投与される、請求項14若しくは16に記載の使用のためのワクチン、又は請求項15若しくは16に記載の方法。
20. 以下の遺伝子:
    DP148R
    EP153R及び
    EP402R
    の発現及び/又は活性を破壊するステップを含む、ASFウイルスを弱毒化する方法。
21. DP148R遺伝子及び/又はEP153R遺伝子は少なくとも部分的に欠失している、請求項18に記載の方法。
22. DP148R遺伝子及び/又はEP153R遺伝子は完全に欠失している、請求項19に記載の方法。
23. DP148R遺伝子及び/又はEP153R遺伝子は分断されている、請求項18に記載の方法。
24. EP402R遺伝子が血球吸着を媒介する能力を破壊することを含む、請求項18から21のいずれか一項に記載の方法。
25. EP402Rタンパク質によるリガンド結合を破壊する1つ以上の突然変異をEP402R遺伝子に導入することを含む、請求項18から22のいずれか一項に記載の方法。
26. EP402Rタンパク質のリガンド結合ドメイン中の1つ以上のアミノ酸を変化させる1つ以上の突然変異をEP402R遺伝子に導入することを含む、請求項23に記載の方法。
27. EP402Rタンパク質のR96、E99及び/又はY102の各位置でアミノ酸を変化させることを含む、請求項24に記載の方法。
28. 位置R96でアミノ酸をQに、位置E99でアミノ酸をRに、及び/又は位置Y102でアミノ酸をDに変化させることを含む、請求項25に記載の方法。
29. EP402R遺伝子は少なくとも部分的に欠失している、請求項18から23のいずれか一項に記載の方法。
30. EP402R遺伝子は完全に欠失している、請求項28に記載の方法。
31. EP402R遺伝子は分断されている、請求項28に記載の方法。

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