JP2023516713A - アフリカ豚熱ウイルス感染に対するワクチン - Google Patents

Abstract

本発明は、弱毒化アフリカ豚熱ウイルスに関する。弱毒化ウイルスは、病原性ウイルスによるその後に行うチャレンジに対してブタを防御する。本発明はまた、アフリカ豚熱を治療及び/又は予防するのにそのような弱毒化ウイルスを使用することにも関する。本発明はまた、特定のアミノ酸置換を含むアフリカ豚熱ウイルスのEP402Rタンパク質、並びにそのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチド及びそのようなタンパク質を含むアフリカ豚熱ウイルスにも関する。【選択図】なし

Description

本発明は、弱毒化アフリカ豚熱ウイルスに関する。本発明の弱毒化ウイルスは、病原性ウイルスのその後のチャレンジに対してブタを防御する。本発明はまた、アフリカ豚熱を治療及び/又は予防のためのそのような弱毒化ウイルスの使用に関する。本発明はまた、特定のアミノ酸置換を含むアフリカ豚熱ウイルスのEP402Rタンパク質、並びにそのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチド及びそのようなタンパク質を含むアフリカ豚熱ウイルスにも関する。

アフリカ豚熱(ASF)
アフリカ豚熱は、二本鎖DNAウイルスであるアフリカ豚熱ウイルス(ASFV)によって引き起こされる家畜のブタの壊滅的な出血性疾患である。ASFVはアスファウイルス科(Asfarviridae)の唯一のメンバーであり、主に細胞の細胞質で複製する。ASFVの病原性株は感染の約5～14日以内に家畜のブタを殺滅するおそれがあり、死亡率は100%に近い。

ASFVは、イボイノシシ属 (Phacochoerus sp.)、カワイノシシ属(Potamocherus sp.)、及びヒメダニ属(Ornithodoros)の軟ダニ(ベクターであると考えられている)に感染し、これらにおいて複製することができるが、これらの種では、臨床的徴候が見られるとしてもごくわずかであり、長期の持続性感染が確立され得る。ASFVは、ヨーロッパの入植者がASFVの流行地域にブタを持ち込んだ後に初めて記載されたものであり、したがって「新興感染」の一例である。本疾患は現在のところ、多くのサブサハラ諸国及びサルデーニャのヨーロッパにおいて風土性のものである。ASFVは、2007年にトランスコーカサス地域のジョージアにこれがもたらされた後、ロシア連邦を始めとした近隣諸国を通して広範囲に拡散した。2012年にウクライナで最初のアウトブレイクが報告され、2013年にベラルーシで最初のアウトブレイクが報告された。2014年には、ウクライナのブタでさらなるアウトブレイクが報告され、リトアニア及びポーランドにおいてイノシシでの検出が報告された。2018 年に ASFV は中国に広がり、それ以降、中国や他の多くのアジア諸国に広く広がっている（モンゴル、ベトナム、カンボジア、ミャンマー、北朝鮮、韓国、インドネシア、フィリピン、パプアニューギニア、東ティモール）。

現在、ASFの治療法はない。入ってくるブタ及びブタ肉製品に関する制限、ブタへの給餌前にライセンスの下での廃棄動物製品の強制煮沸及び本疾患が診断された場合の屠殺政策の適用によって、アフリカ以外の国々において予防が国家ベースで試みられてきた。アフリカにおける予防は、イボイノシシ及びイボイノシシに汚染された材料に家畜の群れを近づけない方策に基づいている。

したがって、ASFV感染を制御し、疾患の拡散を予防するための改善された方策に対するするニーズある。

アフリカ豚熱ウイルス
ASFV分離株Benin 97/1(西アフリカ由来の高度病原ウイルス、群1)、分離株OURT88/3(ポルトガル由来の非病原、弱毒化ウイルス、群1)、及び分離株BA71V(Vero細胞組織培養適応非病原ウイルス、群1)の全ゲノム配列が比較されている(Chapmanら、2008 J. Gen. Virol. 89: 397-408)。遺伝子型II分離株Georgia 2007/1 のゲノム全長も配列決定されている(Chapmanら、2011 Emerg. Infect. Dis. 17(4): 599-605)。

OURT88/3ゲノムでは、多重遺伝子族(MGF)360 18R(DP148R)遺伝子、EP153R遺伝子及びEP402R遺伝子がフレームシフト突然変異によってそれぞれ分断されている。加えて、以下のMGF遺伝子はOURT88/3ゲノムに存在しない: MGF 110 3L、6L、7L、8L、10L、11L及び12L、MGF 300 3L、MGF 360 5L、6L、7L、10L、11L、12L、13L、14L、20R、21R及び22R、並びにMGF 505 1R、2R及び6R。MGF 505 3R遺伝子も切断されている。

高病原性Lisboa60株と低病原性NH/P68株の配列も比較されている(Portugalら、2015 J. Gen. Virol. 96: 408-419)。

NH/P68ゲノムでは、MGF 360 18R(DP148R)遺伝子、EP153R遺伝子及びEP402R遺伝子は、未成熟終止コドンによってそれぞれ分断されている。加えて、以下のMGF遺伝子はNH/P68ゲノムに存在しない: MGF 110 3L、6L、7L、8L、10L、11L及び12L、MGF 360 5L、6L、7L、10L、11L、12L、13L、14L、20R、21R及び22R、並びにMGF 505 1R、2R及び6R。MGF 360 9L遺伝子及びMGF 505 3R遺伝子も切断されている。

高病原性BA71株と低病原性BA71V株の配列も比較されている(Rodriguezら、2015 PLoS ONE 10(11): e0142889)。

病原性Benin 97/1分離株からDP148R遺伝子の欠失によって、病原性が減少し、親ウイルスのチャレンジに対する防御が誘導された(Reisら、2017 J. Virol. 91, 24: e01428-17)。

感染動物とワクチン接種動物とを区別する（DIVA）ワクチン
DIVAワクチン(マーカーワクチンとも呼ばれる)によって、ワクチンで免疫した動物と野生型病原体に感染した動物の区別が可能となる。DIVAワクチンは、野生型病原体に存在する少なくとも1つの免疫原性抗原(DIVAマーカー)を欠く。野生型病原体に感染した動物はDIVAマーカーに対する抗体を産生するが、一方、ワクチン接種動物は産生しない。DIVAマーカーに対する抗体は、血清学的アッセイを使用して検出することができる。したがって、両群の動物ともに病原体のその他の免疫原に対する抗体を有しているにもかかわらず、感染動物(DIVAマーカーに対する抗体を有する)は、ワクチン接種動物(DIVAマーカーに対する抗体を有さない)と区別することができる。

DIVAマーカーは免疫原性であることが求められるが、当該遺伝子の欠失はワクチンの防御能力に影響を与えてはいけない。

全体として、本発明は、EP153R及びEP402Rの遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されているが、一方、特定のMGF遺伝子の発現及び/又は活性は破壊されていない弱毒化アフリカ豚熱ウイルスに関する。

本発明はまた、ワクチン接種動物から感染動物を区別する(DIVA)突然変異と組み合わせたEP153R遺伝子及びEP402R遺伝子の発現及び/又は活性の破壊が、アフリカ豚熱ウイルスを弱毒化することができるという判定に関する。本発明は、特にK145R遺伝子におけるDIVA突然変異に関する。

本発明はまた、血球吸着を破壊する、アフリカ豚熱ウイルスのEP402Rタンパク質における特定のアミノ酸変化の判定に関する。したがって、本発明は、そのようなアミノ酸変化を含むEP402Rタンパク質、そのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチド、並びにそのようなEP402Rタンパク質及びポリヌクレオチドを含むアフリカ豚熱ウイルスを含む。

更に、本発明は、EP402Rにおけるアミノ酸変化を、EP153R遺伝子の活性及び/又は発現の破壊及び/又はDIVA突然変異と組み合わせてアフリカ豚熱ウイルスを弱毒化することができるという点で、上記の組合せに関する。

本発明の弱毒化アフリカ豚熱ウイルスは、本明細書の実施例で実証されるように、ワクチンで使用される場合、野生型アフリカ豚熱ウイルス株による感染に対する防御を提供するので、特に有益である。

一態様では本発明は、EP153R遺伝子及びEP402R遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されている弱毒化アフリカ豚熱(ASF)ウイルスであって、
以下の遺伝子:
多重遺伝子族(MGF) 110 3L、6L、7L、8L、10L、11L及び12L、
MGF 360 5L、6L、7L、10L、11L、12L、13L、14L、20R、21R及び22R、並びに
MGF 505 1R、2R及び6R
のうちの1つ以上の機能性バージョンを含む、弱毒化ASFウイルスを提供する。

本発明はまた、
EP153R遺伝子及びEP402R遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されている弱毒化ASFウイルスであって、
以下の遺伝子:
多重遺伝子族(MGF) 110 5L、6L、8L及び12L、
MGF 360 6L、10L、11L、12L、13L、14L及び21R、並びに
MGF 505 1R及び2R
のうちの1つ以上の機能性バージョンを含む、弱毒化ASFウイルスも提供する。

本発明はまた、
EP153R遺伝子及びEP402R遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されている弱毒化ASFウイルスであって、
以下の遺伝子:
多重遺伝子族(MGF) 110 11L及び12L、
MGF 360 6L、10L、11L、12L、13L及び14L、並びに
MGF 505 1R及び2R
のうちの1つ以上の機能性バージョンを含む、弱毒化ASFウイルスも提供する。

別の態様では本発明は、弱毒化ASFウイルスであって、EP153R遺伝子及びEP402R遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されており且つDIVA突然変異を含む、弱毒化ASFウイルスを提供する。一部の実施形態では、DIVA突然変異はK145R遺伝子の発現を破壊する。

別の態様では本発明は、リガンド結合ドメイン中に1つ以上のアミノ酸変化を含み、ここで、アミノ酸変化がEP402Rタンパク質のリガンド結合を破壊している、EP402Rタンパク質を提供する。

別の態様では本発明は、Georgia 2007/1 EP402Rタンパク質(配列番号24)のQ96及び/又はW99に相当する位置にアミノ酸変化を含むEP402Rタンパク質を提供する。

本発明はまた、本発明のEP402Rタンパク質をコードするポリヌクレオチドも提供する。

本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターも提供する。

別の態様では本発明は、本発明のEP402Rタンパク質を含むASFウイルスを提供する。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むASFウイルスも提供する。

本発明はまた、対象において疾患の処置及び/又は予防に使用するための本発明のASFウイルス、並びに対象において疾患を処置及び/又は予防するための医薬の製造のための本発明のASFウイルスの使用も提供する。

本発明はまた、本発明のASFウイルスを含む医薬組成物、及び対象において疾患の処置及び/又は予防に使用するためのそのような医薬組成物を提供する。

本発明はまた、本発明のASFウイルスを含むワクチン、並びに対象においてアフリカ豚熱の処置及び/又は予防に使用するためのそのようなワクチンも提供する。

本発明はまた、本発明による医薬組成物又は本発明によるワクチンの有効量を対象に投与するステップを含む、対象においてアフリカ豚熱を処置及び/又は予防する方法も提供する。

別の態様では本発明は、本発明のASFウイルスを生成する方法であって、EP402Rタンパク質のリガンド結合ドメイン中の1つ以上のアミノ酸を変化させることを含み、ここで、アミノ酸変化がEP402Rタンパク質のリガンド結合を破壊している、方法を提供する。

別の態様では本発明は、本発明のASFウイルスを生成する方法であってGeorgia 2007/1 EP402Rタンパク質(配列番号24)のQ96及び/又はW99に相当する位置で、EP402Rタンパク質中の1つ以上のアミノ酸を変化させることを含む、方法を提供する。

別の態様では本発明は、ASFウイルスが血球吸着を誘導する能力を減少させる方法であって、EP402Rタンパク質のリガンド結合ドメイン中の1つ以上のアミノ酸を変化させることを含み、ここで、アミノ酸変化がEP402Rタンパク質のリガンド結合を破壊している、方法を提供する。

別の態様では本発明は、ASFウイルスが血球吸着を誘導する能力を減少させる方法であって、Georgia 2007/1 EP402Rタンパク質(配列番号24)のQ96及び/又はW99に相当する位置でEP402Rタンパク質中の1つ以上のアミノ酸を変化させることを含む、方法を提供する。

別の態様では本発明は、EP153R遺伝子及びEP402R遺伝子の発現及び/又は活性を破壊することを含む、ASFウイルスを弱毒化する方法を提供する。

表面発現を検出するために、野生型CD2v遺伝子を含有する弱毒化ASFVで免疫したブタからの血清で染色した、野生型(A)CD2v又は突然変異型(B)CD2vを発現する非透過処理細胞の共焦点顕微鏡画像を示す図である。 HAD（血球吸着）アッセイからの例示的画像を示す図である。Vero細胞に、T7RNAポリメラーゼを発現する改変ワクシニアウイルスAnkaraを感染させ、C末端HAエピトープタグを備える野生型又は突然変異型CD2vの完全長タンパク質を発現するプラスミド(pcDNA3)をトランスフェクトした。ブタ赤血球を添加し、表面への赤血球の付着について細胞を観察した。赤血球のHADは、野生型Benin CD2vを発現するプラスミドをトランスフェクトした3個の細胞の周囲で見られる(A)。Dに突然変異したY102残基を有するCD2vを発現する1つの細胞の周囲に部分的なHADが見られる(B)。Rに突然変異した残基E99を有するCD2vを発現する細胞ではHADは見られない(C)。 様々な遺伝子型の異なるASFV分離株由来のCD2vリガンド結合ドメインのアミノ酸配列のアラインメントを表す図である。他の分離株におけるE99残基及び相当する残基が黄色で強調表示されている。 HADアッセイからの例示的画像を示す図である。Vero細胞に、T7RNAポリメラーゼを発現する改変ワクシニアウイルスAnkaraを感染させ、C末端HAエピトープタグを備えるBenin株又はGeorgia株由来の野生型又は突然変異型CD2v完全長タンパク質を発現するプラスミド(pcDNA3)をトランスフェクトした。ブタ赤血球を添加し、表面への赤血球の付着について細胞を観察した。赤血球のHADは、野生型Benin CD2vを発現するプラスミドをトランスフェクトした4個の細胞の周囲で(A)、及び野生型Georgia CD2vを発現するプラスミドをトランスフェクトした2個の細胞の周囲で(B)見られる。Rに突然変異した残基Q96を有するGeorgia CD2vを発現する細胞(C)では、及び非トランスフェクトのVero細胞(D)では、HADは見られない。 K145R(A)又はB125R(B)を発現するプラスミドでトランスフェクトされたVero細胞を示す。発現したタンパク質は緑色に染色され、DNAの青色のDAPI染色で検出される。 Vero細胞で発現し、ASFVで免疫したブタからの抗血清によって検出されたK145R(A)及びB125R(B)を示す図である。細胞を固定し、透過処理し、発現タンパク質を検出するために抗HA(赤色)で染色し、弱毒化遺伝子型I Benin97/1遺伝子欠失ASFV株(緑色)で免疫したブタからの血清で染色した。免疫前及び免疫後38日目に採取した血清で染色した細胞の画像を示す。DNAは青色に染色されている。 HADアッセイからの例示的な画像を示す図である。ブタ骨髄細胞に、対照として野生型Georgia 2007/1 ASFV(A)、又はGeorgiaΔK145RΔEP153RCD2vQ96R ASFV(B)を感染させ、ブタ赤血球を添加した。HADは、感染後1日で野生型Georgia 2007/1に感染した細胞で観察されるが(A)、感染後1日でGeorgiaΔK145RΔEP153RCD2vQ96Rに感染した細胞では観察されない(B)。 GeorgiaΔK145RΔEP153RCD2vQ96R ASFV(K群)でブタを免疫し、ブーストし、チャレンジするのに使用した実験プロトコルを表す図である。 免疫及びチャレンジの間の対照、非免疫M群(A)及びGeorgiaΔK145RΔEP153RCD2vQ96Rで免疫したK群(B)における、ブタの直腸体温を示す図である。 免疫及びチャレンジの間の対照、非免疫M群(A)及びGeorgiaΔK145RΔEP153RCD2vQ96Rで免疫したK群(B)における、ブタの臨床スコアを示す図である。 K群(チャレンジ前にGeorgiaΔK145RΔEP153RCD2vQ96Rで免疫した)及びM群(非免疫対照)からのブタの剖検でスコア化された、様々な臓器の肉眼的病変を示す図である。 VP72/B646L主要カプシドタンパク質に基づく市販の競合ELISAを使用して測定した、免疫及びチャレンジの間のK群のブタの抗体応答(赤色の破線)を示す図である。 免疫及びチャレンジの間のK群における細胞性免疫応答を示す図である。末梢血単核細胞を、免疫前、ブースト及びチャレンジに採取し、ASFV遺伝子型I Benin 97/1(赤色バー)又はASFV遺伝子型II Georgia 2007/1(緑色バー)で刺激した。IFNガンマ産生細胞の数をElispotアッセイによって測定した。 経時的に、Georgia 2007/1分離株による刺激の後の別々のブタのIFNガンマ産生細胞の数を示す図である。 免疫及びチャレンジ後の様々な日にちで全血中に検出された感染性ウイルスのレベルを示す図である(x軸)。ウイルス力価をブタ骨髄細胞での限界希釈によって測定し、感染細胞は蛍光によって検出し、y軸に1ml当たりのTCID₅₀として示される。図に指示されているように、別々のブタの値を異なる色で示す。

アフリカ豚熱ウイルス(ASFV)
アフリカ豚熱ウイルス(ASFV)は、アフリカ豚熱(ASF)の病原体である。ASFVのゲノム構造は、Chapmanら、2008 J. Gen. Virol. 89: 397-408に詳述の通り、当技術分野で知られている。ASFVは、少なくとも150の遺伝子を含有する線状ゲノムを有する、正二十面体の大型の二本鎖DNAウイルスである。遺伝子の数は、ウイルスの分離株によってわずかに異なる。ASFVは、他の大型のDNAウイルスと、例えばポックスウイルス、イリドウイルス及びミミウイルスと類似性を有する。他のウイルス性出血熱と共通して、複製の主たる標的細胞は単球、マクロファージ系統のものである。

主要なカプシドタンパク質p72をコードするB646L遺伝子のC末端領域の配列の多様性に基づいて、22のASFV遺伝子型(I～XXII)が特定されている。全てのASFV p72遺伝子型が東アフリカ及び南アフリカで広まってきている。遺伝子型Iは、ヨーロッパ、南アメリカ、カリブ海及び西アフリカで広まってきている。遺伝子型IIは、ヨーロッパ及びアジアの多くの国で広まっている。遺伝子型IXは、東アフリカの数か国に限局されている。

いくつかの遺伝子型由来の株の例を下に示す:
遺伝子型I: OURT88/3; Brazil/79; Lisbon/60; BA715; Pret; Benin 97/1; IC/1/96; IC/576; CAM/82; Madrid/62; Malta/78; ZAR85; Katange63; Togo; Dakar59; Ourt88/1; BEN/1/97; Dom_Rep; VAL/76; IC/2/96; Awoshie/99; NIG/1/99; NIG/1/98; ANG/70; BEL/85; SPEC120; Lisbon/57; ASFV-Warm; GHA/1/00; GAM/1/00; Ghana; HOL/86; NAM/1/80; NUR/90/1; CAM/4/85; ASFV-Teng; Tegani; ASFV-E75。
遺伝子型II: Georgia 2007/1; POL/2015/Podlaskie (Polish株); Belgium/Etalle/wb/2018; ASFV/Kyiv/2016/131; China/2018/AnhuiXCGQ
遺伝子型III: BOT 1/99
遺伝子型IV: ASFV-War; RSA/1/99/W
遺伝子型VI: MOZ 94/1
遺伝子型VII: VICT/90/1; ASFV-Mku; RSA/1/98
遺伝子型VIII: NDA/1/90; KAL88/1; ZAM/2/84; JON89/13; KAV89/1; DEZda; AFSV-Mal; Malawi LIL 20/1
遺伝子型IX: UGA/1/95
遺伝子型X: BUR/1/84; BUR/2/84; BUR/90/1; UGA/3/95; TAN/Kwh12; HindeII; ASFV-Ken; Virulent Uganda 65。

一実施形態では、本発明のASFウイルスは弱毒化され得る。本発明の弱毒化ASFウイルスは、本明細書に記載の修飾/突然変異のいずれかを任意の組み合わせで含み得る。本明細書に記載の改変/変異は、ASFウイルスを弱毒化し得る。

ASFV分離株
本発明の弱毒化ASFウイルスは、野生型ASFウイルス分離株に由来するものとできる、又は由来し得るが、そのゲノムが突然変異を含むことにより、その結果、EP153R及びEP402Rの遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されている。ウイルスはまた、K145R遺伝子の発現を妨害するDIVA突然変異などのDIVA突然変異を含み得る。

「野生型」という用語は、ウイルスは(ある時点で)野外に存在し、自然宿主、例えば家畜のブタ、ダニ又はイボイノシシから分離されたことを示す。現在までに記載されているASFV分離株について、それらのGenbank受託番号と一緒に、下の表1に概説する。

本発明の弱毒化ASFVのゲノムは、任意のASFV遺伝子型に相当し得る。本発明の弱毒化ASFVのゲノムは、任意のASFV遺伝子型に本質的に相当し得る。

「に相当する」という用語は、本発明の弱毒化ASFVのゲノムの残部が野生型株(すなわち、野外においてある時点で存在したウイルス)と同じであることを意味する。「ゲノムの残部」とは、EP153R遺伝子及びEP402R遺伝子以外の全ての遺伝子を指し得る。「ゲノムの残部」とはEP153R、EP402R及びK145Rの各遺伝子以外の全ての遺伝子を指し得る。換言すれば、本発明の弱毒化ASFVの遺伝子は、本発明に従って破壊される遺伝子を除いて、野生型株の遺伝子と同じであるとし得る。本発明の弱毒化ASFVの遺伝子は、EP153R遺伝子及びEP402R遺伝子を除いて、野生型株の遺伝子と同じであるとし得る。本発明の弱毒化ASFVの遺伝子は、EP153R、EP402R及びK145Rの各遺伝子を除いて、野生型株の遺伝子と同じであるとし得る。一実施形態では本発明の弱毒化ASFVの遺伝子は、EP153R及びEP402Rを除いて、野生型株の遺伝子と同じである。一実施形態では本発明の弱毒化ASFVの遺伝子は、EP153R、EP402R及びK145Rを除いて、野生型株の遺伝子と同じである。

破壊された遺伝子もまた野生型株に相当し得る。一実施形態では、EP153R及びEP402Rの遺伝子は、野生型株に相当し得る。そのような一実施形態(すなわち、EP153R及びEP402Rが野生型株に相当する場合)では、EP153R及びEP402Rの発現及び/又は活性を、遺伝子間領域及び/又は非コード領域、例えばプロモーターにおける1つ以上の突然変異によって破壊することができる。換言すれば、EP153R及びEP402Rの遺伝子は野生型ゲノムと同じであるが、それらの発現又は活性は非遺伝子配列の突然変異によって変更される。したがって、本発明の弱毒化ASFVの遺伝子は全て、野生型株の遺伝子と同じであってもよい。一実施形態では、本発明の弱毒化ASFVの全ての遺伝子は、野生型株の遺伝子と同じである。一実施形態では、本発明の弱毒化ASFVの全ての遺伝子は、K145Ｒ遺伝子を除いて、野生型株の遺伝子と同じである。

「に本質的に相当する」という用語は、「に相当する」と同じことを意味するが、ゲノムの残部が1つ以上の突然変異を含み得ることをさらなる例外とする。1つ以上の突然変異は、他の遺伝子に存在し得る(すなわち、EP153R、EP402R及びK145Rの遺伝子に存在しない)。

弱毒化ASFVのゲノムは、遺伝子型Iに相当するか又は本質的に相当し得る。弱毒化ASFVのゲノムは、遺伝子型IIに相当するか又は本質的に相当し得る。弱毒化ASFVのゲノムは、遺伝子型IIIに相当するか又は本質的に相当し得る。弱毒化ASFVのゲノムは、遺伝子型IVに相当するか又は本質的に相当し得る。弱毒化ASFVのゲノムは、遺伝子型Vに相当するか又は本質的に相当し得る。弱毒化ASFVのゲノムは、遺伝子型VIに相当するか又は本質的に相当し得る。弱毒化ASFVのゲノムは、遺伝子型VIIに相当するか又は本質的に相当し得る。弱毒化ASFVのゲノムは、遺伝子型VIIIに相当するか又は本質的に相当し得る。弱毒化ASFVのゲノムは、遺伝子型IXに相当するか又は本質的に相当し得る。弱毒化ASFVのゲノムは、遺伝子型Xに相当するか又は本質的に相当し得る。弱毒化ASFVのゲノムは、遺伝子型XIVに相当するか又は本質的に相当し得る。

弱毒化ASFVのゲノムは、遺伝子型Iに相当するか又は本質的に相当し得る。弱毒化ASFVのゲノムは、遺伝子型IIに相当するか又は本質的に相当し得る。

好ましくは、弱毒化ASFVのゲノムは、遺伝子型IIに相当するか又は本質的に相当し得る。

本発明の弱毒化ASFVのゲノムは、病原性ASFV株のゲノムに相当するか又は本質的に相当し得る。既知の病原性ASFウイルス株としては: Georgia 2007/1、Benin 97/1、Kenyan、Malawi Lil20/1、Pretorisuskop/96/4及びTengani 62が挙げられる。弱毒化ASFVのゲノムは、Benin 97/1株のゲノムに相当するか又は本質的に相当し得る。

弱毒化ASFVのゲノムは、Georgia 2007/1株のゲノムに相当するか又は本質的に相当し得る。

本発明の弱毒化ASFVのゲノムは、病原性が現在不明であるASFV株、例えば、Mkuzi、Warmbaths、及びWarthogのゲノムに相当するか又は本質的に相当し得る。

一実施形態では、本発明の弱毒化ASFVのゲノムは、OURT88/3のゲノムに相当しない。一実施形態では、本発明の弱毒化ASFVのゲノムは、NH/P68のゲノムに相当しない。一実施形態では、本発明の弱毒化ASFVはOURT88/3ではない。一実施形態では、本発明の弱毒化ASFVはNH/P68ではない。一実施形態では、本発明の弱毒化ASFVは、OURT88/3でもNH/P68でもない。

EP402R
ある特定の態様では、本発明は、EP402R遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されたASFウイルスを提供する。

他の態様では、本発明は、特定のアミノ酸変化を含むEP402Rタンパク質を提供する。

EP402R遺伝子は、ウイルスの外層に組み込まれると共に哺乳動物のTリンパ球表面接着受容体CD2に部分的に類似しているタンパク質をコードする。特に、EP402Rタンパク質のN末端細胞外領域は、CD2の細胞外リガンド結合領域に類似の2つの免疫グロブリン様(Ig様)ドメインから構成される。EP402Rタンパク質は、この類似性のためにCD2vと呼ばれることがある。したがって、「EP402R」と「CD2v」という用語は、本明細書では交換可能に使用することができる。EP402Rタンパク質のN末端細胞外ドメインは、「リガンド結合ドメイン」と呼ばれることがある。EP402Rタンパク質の細胞質ドメインは、CD2とは異なる。

EP402Rは免疫原性である(すなわち、免疫応答を誘発する)(Nethertonら、2019 Front. Immunol. 10, 1318)。EP402Rは血球吸着にとって必要であり、これに直接関与し(Seredaら、2018 Slov. Vet. Res, 55(3) 141-150)、ウイルスの侵入又は拡散においてある役割を有する可能性がある。血球吸着を阻害するASFV感染ブタ由来の抗体は、ブタの防御においてEP402Rに対する抗体の役割を支える多様な株に対して誘導される防御と、相互に関連することができる(Malogolovkinら、2015 J. Gen. Virol. 96(4) 866-873、Burmakinaら、2016 J. Gen. Virol. 97(7) 1670-1675)。EP402Rは宿主タンパク質AP-1に結合することができる。EP402Rの機能は、哺乳動物のCD2が細胞外接着分子に結合するのと同じ様式で、その細胞外のN末端、Ig様ドメインがリガンドに結合することによって、媒介され得る。

EP402R遺伝子配列
様々なASFV株のゲノムにおけるEP402R遺伝子の遺伝子（すなわちヌクレオチド）配列及び位置を下記に示す。

一実施形態では本発明は、EP402R遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されている弱毒化ASFウイルスを提供する。適切には、EP402R遺伝子は、配列番号229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240又は241のいずれかと少なくとも70%、少なくとも80％、少なくとも90%、又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含む。適切には、EP402R遺伝子は、配列番号配列番号229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240または241からなる。

本発明のＡＳＦＶの実施形態において、EP402R遺伝子は、部分的または完全に欠失し得る。適切には、配列番号229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240又は241の配列の一部または全部がASFVゲノムから除去される。適切には、ASFVゲノムはこれらの配列のいずれも欠いている。

EP402Rタンパク質配列
様々なASFV株由来のEP402Rタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号21～30及び配列番号242～246として下に示す。

一実施形態では本発明は、EP402R遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されている弱毒化ASFウイルスを提供する。適切には、EP402R遺伝子は、配列番号21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、242、243、244、245又は246のいずれかと、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%又は95%の同一性を有する配列を含むタンパク質をコードする。適切には、EP402R遺伝子は、配列番号21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、242、243、244、245又は246のいずれかの配列を含むタンパク質をコードする。

一実施形態では本発明のASFVはEP402Rタンパク質を発現しない。換言すれば、本発明のASFVは、配列番号21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、242、243、244、245又は246の配列を持つタンパク質のいずれも発現しない。

EP402R突然変異タンパク質
一態様では本発明は、リガンド結合ドメイン中に1つ以上のアミノ酸変化を含み、ここで、アミノ酸変化がEP402Rタンパク質のリガンド結合を破壊している、EP402Rタンパク質を提供する。

EP402Rのリガンド結合ドメインは、1位(N末端)で始まり、およそ200位まで進行するアミノ酸によって形成される。例えば、Benin 97/1 EP402Rのリガンド結合ドメインは、配列番号34として下に提示される、配列番号21のアミノ酸1～198によって形成される。

Georgia 2007/1 EP402Rのリガンド結合ドメインは、配列番号380として下に提示される、配列番号24のアミノ酸1～203によって形成される。

適切には、EP402Rタンパク質のリガンド結合ドメインは配列番号34又は380の配列を含む。適切には、EP402Rタンパク質のリガンド結合ドメインは、配列番号34又は380と少なくとも70%、80%、90%又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含む。他の株由来のEP402Rタンパク質のリガンド結合ドメインは、図3に示すように、Benin 97/1 EP402Rタンパク質及び/又はGeorgia 2007/1 EP402Rタンパク質の配列とのアラインメントによって容易に特定し得る。

適切には、EP402Rタンパク質のリガンド結合ドメイン中の1つ以上のアミノ酸(例えば2個以上、3個以上、4個以上又は5個以上のアミノ酸)が、野生型EP402Rタンパク質と比較して変化している。一実施形態では、リガンド結合ドメイン中の1つ以上のアミノ酸が欠失している(すなわち、完全に除去されている)。一実施形態では、リガンド結合ドメイン中の1つ以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸に変化している(すなわち置換されている)。そのようなアミノ変化は置換と呼ばれることがある。EP402Rタンパク質のリガンド結合ドメイン中の1つ以上のアミノ酸を変化させることによって、EP402Rタンパク質の発現及び/又は活性を破壊することができる。一実施形態では、EP402Rタンパク質のリガンド結合ドメイン中の1つ以上のアミノ酸を変化させることによって、EP402Rタンパク質により媒介される血球吸着を破壊することができる。

EP402Rタンパク質中のアミノ酸変化は、EP402Rタンパク質をコードする配列の1つ以上の突然変異によって引き起こされる。一実施形態では1つ以上の突然変異は、本明細書に記載の欠失であっても分断であってもよい。例えば、EP402Rタンパク質のリガンド結合ドメインのコード配列の一部の欠失よって、リガンド結合ドメインからコードされたアミノ酸の非存在がもたらされることになり(すなわちアミノ酸を変化させる)、このことによってリガンド結合を破壊することができる。

一実施形態では、突然変異のうちの1つ以上が点突然変異であってもよい。適切には、突然変異のうちの1つ以上は、単一のアミノ酸を異なるアミノ酸に変化させる点突然変異であってもよい。単一のアミノ酸でも変化させることによって、EP402Rタンパク質の発現及び/又は活性、例えばリガンド結合活性を破壊することができる。

1つ以上のアミノ酸を変化させることによって、EP402Rタンパク質の折り畳みを破壊することができる。折り畳みの破壊とは、EP402Rタンパク質はまったく折り畳むことができず、その結果、それが細胞タンパク質分解機構によって分解されることになることを意味する。代替的に、折り畳みの破壊とは、EP402Rタンパク質は別様に折り畳まれ、その結果、その機能を損なうことを意味し得るか、又はEP402Rタンパク質はより緩慢に折り畳まれる可能性があり、したがって、正確に発現されない(例えば、細胞表面で発現されない)ことを意味し得る。

荷電アミノ酸を反対の荷電を備えるアミノ酸に変化させることによって、EP402Rリガンドドメインの折り畳みを破壊することができ、その結果、結合ポケットが変形し、このことにより、立体障害に起因してリガンド結合が妨げられる。代替的に又は付加的に、反対電荷を備えるアミノ酸での置換は、リガンドの静電結合を妨げることができる。別の可能性とは、小側鎖を備えるアミノ酸を嵩高い側鎖を備えるアミノ酸に変化させることによって、その逆もしかりであるが、EP402Rリガンド結合ドメインの折り畳みを破壊することができ、その結果、結合ポケットが形成せず、このことによりリガンド結合が妨げられる、ということである。

したがって一実施形態では、リガンド結合ドメイン中の1つ以上の変化したアミノ酸は、正に荷電したアミノ酸に変化する負に荷電したアミノ酸を含むことができる。一実施形態では、リガンド結合ドメイン中の1つ以上の変化したアミノ酸は、負に荷電したアミノ酸に変化する正に荷電したアミノ酸を含むことができる。正に荷電したアミノ酸(すなわち、正電荷を有することができるアミノ酸)には、ヒスチジン(H)、リジン(K)及びアルギニン(R)が含まれる。負に荷電したアミノ酸(すなわち、負電荷を有することができるアミノ酸)には、アスパラギン酸(D)及びグルタミン酸(E)が含まれる。

一実施形態では、リガンド結合ドメイン中の1つ以上の変化したアミノ酸は、嵩高い側鎖を備えるアミノ酸に変化する小側鎖を備えるアミノ酸を含むことができる。一実施形態では、リガンド結合ドメイン中の1つ以上の変化したアミノ酸は、小側鎖を備えるアミノ酸に変化する嵩高い側鎖を備えるアミノ酸を含むことができる。嵩高い側鎖を備えるアミノ酸には、トリプトファン(W)が含まれる。小側鎖を備えるアミノ酸には、グリシン(G)及びアラニン(A)が含まれる。

一実施形態では、リガンド結合ドメイン中の1つ以上の変化したアミノ酸は、疎水性側鎖を備えるアミノ酸に変化する親水性側鎖を備えるアミノ酸を含むことができる。一実施形態では、リガンド結合ドメイン中の1つ以上の変化したアミノ酸は、親水性側鎖を備えるアミノ酸に変化する疎水性側鎖を備えるアミノ酸を含むことができる。疎水性側鎖を備えるアミノ酸には、アラニン(A)、バリン(V)、イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、及びトリプトファン(W)が含まれる。親水性側鎖を備えるアミノ酸には、アルギニン(R)、ヒスチジン(H)、リジン(K)、アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、セリン(S)、スレオニン(T)、アスパラギン(N)及びグルタミン(Q)が含まれる。

アミノ酸E99をRに又はアミノ酸Y102をDに変化させることは、Benin 97/1株由来のEP402Rタンパク質が血球吸着を媒介する能力を破壊する(図2を参照のこと)。更に、アミノ酸Q96をRに変化させることは、Georgia 2007/1株由来のEP402Rタンパク質が血球吸着を媒介する能力を破壊する(図4及び7を参照のこと)。Georgia 2007/1 EP402Rのアミノ酸W99をDに変化させることは、EP402Rの折り畳みを破壊し、それ故、破壊された発現及び/又は活性につながり得る。したがって、一実施形態では本発明のEP402Rタンパク質は、Georgia 2007/1 EP402Rタンパク質(配列番号24)のQ96及び/又はW99に相当する位置にアミノ酸変化を含む。Georgia 2007/1 EP402Rタンパク質のQ96は、Benin 97/1 EP402Rタンパク質のE99に相当し、Georgia 2007/1 EP402Rタンパク質のW99は、Benin 97/1 EP402Rタンパク質のY102に相当する。したがって、一実施形態では本発明のEP402Rタンパク質は、Benin 97/1 EP402Rタンパク質(配列番号21)のE99及び/又はY102に相当する位置にアミノ酸変化を含む。換言すれば、本発明の弱毒化ASFウイルスによって発現されるEP402Rタンパク質は、任意のASFウイルス株由来のEP402Rタンパク質であり得、変化しているアミノ酸は、本明細書において配列番号24として提示されている、Georgia 2007/1 EP402Rタンパク質のアミノ酸配列のQ96及び/又はW99に相当する。代替的に表現すると、本発明の弱毒化ASFウイルスによって発現されるEP402Rタンパク質は、任意のASFウイルス株由来のEP402Rタンパク質であり得、変化しているアミノ酸は、本明細書において配列番号21として提示されている、Benin 97/1株由来のEP402Rタンパク質のアミノ酸配列のE99及び/又はY102に相当する。位置Q96及び位置W99は、Georgia 2007/1 EP402Rタンパク質のそれぞれ位置96及び位置99のアミノ酸であるグルタミン及びトリプトファンを指す。位置E99及び位置Y102は、Benin 97/1 EP402Rタンパク質のそれぞれ位置99及び位置102のアミノ酸であるグルタミン酸及びチロシンを指す。

アミノ酸がGeorgia 2007/1 EP402Rタンパク質のQ96及び/若しくはW99に(又はBenin 97/1 EP402Rタンパク質のE99及び/若しくはY102に)相当するかどうかは、配列アラインメントによって評価してもよい。例えば、図3に、Benin、Mkuzi、Warmbaths、Tengnani、Warthog、Georgia及びMalawiの株由来のEP402Rタンパク質のアラインメントを示す。Georgia 2007/1 EP402Rタンパク質のQ96及びBenin 97/1 EP402Rタンパク質のE99に相当する、各株由来のEP402Rタンパク質中のアミノ酸は、Benin E99残基の下に示されているアミノ酸である(黄色で強調表示)。Georgia 2007/1 EP402Rタンパク質のW99及びBenin 97/1 EP402Rタンパク質のY102に相当する、各株由来のEP402Rタンパク質中のアミノ酸は、Benin Y102残基の下に示されているアミノ酸である(黄色で強調表示されたアミノ酸の右側の3個のアミノ酸)。Georgia 2007/1 EP402Rタンパク質のQ96及び/又はW99並びにBenin 97/1 EP402RのE99及びY102に相当する、図3の株由来のEP402Rタンパク質のアミノ酸を下の表2に示す。

Georgia 2007/1 EP402Rタンパク質のQ96及び/又はW99並びにBenin 97/1 EP402RのE99及びY102に相当するアミノ酸は、図3に示され、上の表2に列挙されたもの以外の株(例えば、本明細書の表1に列挙された他の株)由来のEP402Rタンパク質に存在する。当業者であれば、所与の株、例えば表1からの株由来のEP402Rタンパク質中のどのアミノ酸が、Georgia 2007/1 EP402Rタンパク質のQ96及び/又はW99並びにBenin 97/1 EP402RのE99又はY102に相当するかを、配列アラインメントを使用して容易に決定することができる。相当するアミノ酸は、Georgia 2007/1 EP402Rタンパク質のQ96若しくはW99と又はBenin 97/1 EP402RのE99若しくはY102と同一であってもよい。例えば、Georgia 2007/1 EP402RのQ96に相当するアミノ酸は、Q(グルタミン)であってもよい。相当するアミノ酸は、Q96又はW99に類似していてもよい。適切には、相当するアミノ酸はQ96又はW99と同じ電荷を有する。適切には、Q96に相当するアミノ酸はE(グルタミン酸)である。適切には、W99に相当するアミノ酸はY(チロシン)である。「Georgia 2007/1 EP402Rタンパク質のQ96及び/又はW99に相当する」という表現は、Georgia 2007/1 EP402Rタンパク質のQ96及び/又はW99を包含する。「Benin 97/1 EP402Rタンパク質のE99及び/又はY102に相当する」という表現は、Benin 97/1 EP402Rタンパク質のE99及び/又はY102を包含する。

適切には、Q96に相当する位置のアミノ酸はRに若しくはRの保存的置換であるアミノ酸に変化し、及び/又はW99に相当する位置のアミノ酸はDに若しくはDの保存的置換であるアミノ酸に変化している。「保存的置換」であるアミノ酸は、もう一方のアミノ酸と類似の特徴を有する。例えば、保存的置換は、類似の電荷(正又は負)、類似の疎水性(親水性又は疎水性)又は類似の分子サイズを有する場合があり、芳香族である場合があり、又はこれらの特徴の組合せを有する場合がある。適切には、Q96に相当する位置のアミノ酸はH、K若しくはRに変化し、及び/又はW99に相当する位置のアミノ酸はD、E、N若しくはQに変化している。適切には、Q96に相当する位置のアミノ酸はRに変化し、及び/又はW99に相当する位置のアミノ酸はDに変化している。

一実施形態では本発明のEP402Rタンパク質は、配列番号21～30又は配列番号242～246(すなわち、本明細書に記載の様々なASFV株由来のEP402Rタンパク質の配列)のいずれかと、少なくとも70%の配列同一性、例えば少なくとも75%の同一性、例えば少なくとも80%の同一性、例えば少なくとも85%の同一性、例えば少なくとも90%の同一性、例えば少なくとも95%の同一性、例えば少なくとも96%の同一性、例えば少なくとも97%の同一性、例えば少なくとも98%の同一性、例えば少なくとも99%の同一性、を有するアミノ酸配列を含む。適切には、本発明のEP402Rタンパク質は、配列番号21と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。適切には、本発明のEP402Rタンパク質は、配列番号22と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。適切には、本発明のEP402Rタンパク質は、配列番号23と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。適切には、本発明のEP402Rタンパク質は、配列番号24と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。適切には、本発明のEP402Rタンパク質は、配列番号25と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。適切には、本発明のEP402Rタンパク質は、配列番号26と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。適切には、本発明のEP402Rタンパク質は、配列番号27と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。適切には、本発明のEP402Rタンパク質は、配列番号28と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。適切には、本発明のEP402Rタンパク質は、配列番号29と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。適切には、本発明のEP402Rタンパク質は、配列番号30と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。適切には、本発明のEP402Rタンパク質は、配列番号242と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。適切には、本発明のEP402Rタンパク質は、配列番号243と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。適切には、本発明のEP402Rタンパク質は、配列番号244と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。適切には、本発明のEP402Rタンパク質は、配列番号245と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。適切には、本発明のEP402Rタンパク質は、配列番号246と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

ある特定の実施形態では、参照配列(すなわち、配列番号21～30又は配列番号242～246)と、参照配列と100%未満同一である配列との間で異なるアミノ酸は、保存的置換である。

E99Rアミノ酸変化を含む、Benin 97/1株由来のEP402Rタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号31として下に表す。

Y102D置換を含む、Benin 97/1株由来のEP402Rタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号32として下に表す。

Q96R置換を含む、Georgia 2007/1株由来のEP402Rタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号33として下に表す。

W99D置換を含む、Georgia 2007/1株由来のEP402Rタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号379として下に表す。

一実施形態では本発明のEP402Rタンパク質は、配列番号31、32、33又は379のいずれかのアミノ酸配列を含む。適切には、本発明のEP402Rタンパク質は、配列番号31(E99Rアミノ酸変化を伴うBenin 97/1 EP402Rタンパク質)のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。適切には、本発明のEP402Rタンパク質は、配列番号32(Y102Dアミノ酸変化を伴うBenin 97/1 EP402Rタンパク質)のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。適切には、本発明のEP402Rタンパク質は、配列番号33(Q96Rアミノ酸変化を伴うGeorgia 2007/1 EP402Rタンパク質)のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。適切には、本発明のEP402Rタンパク質は、配列番号379(W99Dアミノ酸変化を伴うGeorgia 2007/1 EP402Rタンパク質)のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。

一実施形態では本発明のEP402Rタンパク質は、Benin 97/1 EP402Rタンパク質(配列番号21)のN16、I19、W21、Y76、E99、Y102及び/又はN108に相当するEP402Rタンパク質中の位置に1つ以上のアミノ酸変化を含む。一実施形態では1つ以上の突然変異は、Benin 97/1株のEP402Rタンパク質のN16、I19、W21、Y76、E99、Y102及び/又はN108の各位置で、又は他の任意のASFV株のEP402Rタンパク質の相当する位置で、アミノ酸を変化させる。一実施形態では1つ以上の突然変異は、Georgia 2007/1のEP402Rタンパク質(配列番号24)のS15、W19、Q96、N104及び/又はK108Dに相当するEP402Rタンパク質中の位置でアミノ酸を変化させる。一実施形態では1つ以上の突然変異は、Georgia 2007/1のEP402Rタンパク質(配列番号24)のS15、W19、Q96、N104及び/又はK108Dの各位置で、又は他の任意のASFV株のEP402Rタンパク質の相当する位置で、アミノ酸を変化させる。一実施形態では1つ以上の突然変異は、N10 Genotype IXのEP402Rタンパク質(配列番号27)のW20、Q112、N121及び/又はR125に相当するEP402Rタンパク質中の位置でアミノ酸を変化させる。一実施形態では1つ以上の突然変異は、N10 Genotype IXのEP402Rタンパク質(配列番号27)のS15、W19、Q96、N104及び/又はK108Dの各位置で、又は他の任意のASFV株のEP402Rタンパク質の相当する位置で、アミノ酸を変化させる。これらのアミノ酸はEP402Rタンパク質のリガンド結合ドメイン中にあり、表面露出である。

適切には、突然変異は、Benin 97/1 EP402Rタンパク質(配列番号11)中の位置に相当する位置で、N16R、I19R、W21D、Y76D、E99R、Y102D及び/又はN108Rから選択される。適切には、突然変異は、Georgia 2007/1 EP402Rタンパク質(配列番号11)中の位置に相当する位置のE99R及びN108Rの組合せである。

適切には、突然変異は、Georgia 2007/1 EP402Rタンパク質(配列番号24)中の位置に相当する位置で、S15R、W19D、Q96R、N104R及び/又はK108Dから選択される。適切には、突然変異は、Georgia 2007/1 EP402Rタンパク質(配列番号24)中の位置に相当する位置のQ96R及びN104Rの組合せである。

適切には、突然変異は、N10 Genotype IX EP402Rタンパク質(配列番号27)中の位置に相当する位置で、W20D、Q112R、N121R及び/又はR125Dから選択される。適切には、突然変異は、N10 Genotype IX EP402Rタンパク質(配列番号27)中の位置に相当する位置のQ112R及びN121Rの組合せである。

適切には、弱毒化ASFVが遺伝子型Iである場合、1つ以上の突然変異は、Benin 97/1 EP402Rタンパク質(配列番号11)のY76、E99、Y102及び/又はN108に相当する、EP402Rタンパク質中の位置でアミノ酸を変化させる。適切には、弱毒化ASFVが遺伝子型Iである場合、突然変異は、Benin 97/1 EP402Rタンパク質(配列番号11)中の位置に相当する位置でY76D、E99R、Y102D及び/又はN108Rから選択される。

適切には、弱毒化ASFVが遺伝子型IIである場合、1つ以上の突然変異は、Georgia 2007/1 EP402Rタンパク質(配列番号24)のS15、W19、Q96、N104及び/又はK108Dに相当する、EP402Rタンパク質中の位置でアミノ酸を変化させる。適切には、弱毒化ASFVが遺伝子型IIである場合、突然変異は、Georgia 2007/1 EP402Rタンパク質(配列番号24)中の位置に相当する位置で、S15R、W19D、Q96R、N104R及び/又はK108Dから選択される。適切には、弱毒化ASFVが遺伝子型IIである場合、突然変異は、Georgia 2007/1 EP402Rタンパク質(配列番号24)中の位置に相当する位置のQ96R及びN104Rの組合せであるとし得る。

本発明はまた、本発明のEP402Rタンパク質をコードするポリヌクレオチドも提供する。適切には、ポリヌクレオチドは、配列番号229～241(すなわち、ASFVの様々な株由来のEP402R遺伝子のコード配列)のいずれかと、少なくとも70%の同一性、例えば少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有する配列を含む。適切には、ポリヌクレオチドは、配列番号229(すなわち、Georgia 2007/1 EP402R遺伝子のコード配列)と、少なくとも70%の同一性、例えば少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有する配列を含む。

本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。適切なベクターは当技術分野で知られており、細胞での、例えば、当技術分野で知られている細胞型の内の細菌、酵母若しくは脊椎動物細胞又はその他の細胞型でのタンパク質発現用のプラスミドを含む。

突然変異EP402Rを含むASFウイルス
別の態様では本発明は、上記のように、本発明のEP402Rタンパク質を含むASFウイルスを提供する。同様の態様では本発明は、上記のように、本発明のポリヌクレオチドを含むASFウイルスを提供する。別の態様では本発明は本明細書に記載の弱毒化ASFウイルスを提供し、この場合、ウイルスは、本発明のEP402Rタンパク質、例えば上記のEP402Rタンパク質を発現するように突然変異されたEP402R遺伝子を含む。

当業者であれば、当技術分野で知られている分子生物学技法を使用してEP402R遺伝子のコード配列を適当に改変することにより、本明細書に記載のアミノ酸変化のいずれかを含むEP402Rタンパク質を発現するようにASFウイルスを突然変異させることができることを本開示から理解するであろう。したがって、本発明は、本明細書に開示の本発明の任意のEP402Rタンパク質を含むASFウイルスを包含する。加えて、当業者であれば、本明細書に記載の任意のEP402Rタンパク質を、本発明のASFウイルスにおいて、本明細書に記載のASFウイルスに対する他の改変、特にK145R遺伝子及びEP153R遺伝子の改変と組み合わせてもよいことを本開示から理解するであろう。更に、本発明のアミノ酸変化を伴うEP402Rタンパク質を含む本発明のASFVは弱毒化されてもよい。

本発明のASFウイルスの一実施形態では、EP402R遺伝子は、EP402Rタンパク質のリガンド結合ドメイン中の1つ以上のアミノ酸を変化させる1つ以上の突然変異を含む。適切には、EP402R遺伝子は、EP402Rタンパク質のリガンド結合ドメインにおいて、1つ以上のアミノ酸(例えば2個以上、3個以上、4個以上又は5個以上のアミノ酸)を変化させる1つ以上の突然変異(例えば2つ以上、3つ以上、4つ以上又は5つ以上の突然変異)を含む。

本発明のASFウイルスの実施形態では、ASFウイルスは、本明細書に記載の方法のいずれかでEP402Rタンパク質中の1つ以上のアミノ酸を変化させる、EP402R遺伝子中に1つ以上の突然変異を含む。例えば、一実施形態では、EP402R遺伝子中の1つ以上の突然変異は、Georgia 2007/1株のEP402Rタンパク質の位置Q96及び/若しくは位置W99で、又は他の任意のASFV株のEP402Rタンパク質の相当する位置で、アミノ酸を変化させる。一実施形態では、EP402R遺伝子中の1つ以上の突然変異は、Georgia 2007/1株のEP402Rタンパク質(配列番号24)の位置Q96にてのアミノ酸をRに変化させる。

EP402Rの活性
本発明のASFVの一実施形態では、EP402R活性が破壊されている。

一実施形態では、破壊されているEP402Rの活性とは、血球吸着を媒介するその能力である。換言すれば、EP402Rが血球吸着を媒介する能力を低下させ得る。EP402Rが血球吸着を媒介する能力を、少なくとも50、60、70、80又は90%低下させ得る。EP402Rが血球吸着を媒介する能力を完全に消失させ得る。

破壊されているEP402Rの活性とは、EP402Rタンパク質がその細胞外N末端Ig様ドメイン(すなわち、そのリガンド結合ドメイン)を介してリガンドに結合する能力であるとし得る。したがって、一実施形態では本発明は、EP402R遺伝子がEP402Rタンパク質によるリガンド結合を破壊する1つ以上の突然変異を含む、ASFウイルスを提供する。EP402Rタンパク質が1つ以上のリガンドに結合する能力を破壊し得る。EP402Rが1つ以上のリガンドに結合する能力を、少なくとも50、60、70、80又は90%低下させ得る。EP402Rタンパク質が1つ以上のリガンドに結合する能力を完全に消失させ得る。EP402Rタンパク質が1つ以上のリガンドに結合する能力を、他のリガンドに結合する能力を保持しながら完全に消失させ得る。一実施形態では本発明は、EP402R遺伝子がEP402Rタンパク質によるリガンド結合を破壊する1つ以上の突然変異を含む、弱毒化ASFウイルスを提供する。リガンド結合は、例えば、免疫沈降、表面プラズモン共鳴及び/又は等温熱量測定であるアッセイを使用して測定することができる。

一実施形態では本発明は、本明細書に記載のように、EP402Rタンパク質中の変化したアミノ酸がEP402R上の結合表面を変化させることによって、EP402Rとそのリガンドとの間の相互作用を直接阻害する、ASFウイルスを提供する。

一実施形態では本発明は、EP402R遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されていない相当するASFウイルスと比較して、EP402Rタンパク質の表面発現が減少している、ASFウイルスを提供する。EP402Rの「表面発現」とは、ASFウイルスに感染した細胞の表面でのEP402Rタンパク質の発現を指す。EP402Rの表面発現は、当技術分野で知られている技法、例えば感染細胞の抗体染色によって測定することができる(例えば、図8及び実施例3を参照のこと)。

EP153R
ある特定の態様では、本発明は、EP153R遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されたASFウイルスを提供する。

EP153R遺伝子は、感染の早期と後期両方で発現する。EP153Rは8CRと呼ばれることもある。EP153Rタンパク質はC型レクチンである。C型の動物レクチンは、血清、細胞外マトリックス及び細胞膜に見出され、糖鎖リガンドの受容体として働くと考えられている。EP153Rタンパク質は、C型レクチンドメイン、細胞付着配列(RGD)及び膜貫通ドメインを含み、T細胞活性化に関与するCD44分子と類似性を有する。

様々なASFV株由来のEP153R遺伝子のゲノムにおける遺伝子(すなわちヌクレオチド)配列及び位置を下に提示する。

一実施形態では本発明は、EP153R遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されているASFウイルスを提供する。適切には、EP153R遺伝子は、配列番号204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215又は216の配列を含む。適切には、EP153R遺伝子は、配列番号204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215又は216と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含む。適切には、EP153R遺伝子は、配列番号204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215又は216の配列からなる。

本発明のASFVの一実施形態では、EP153R遺伝子は、部分的に欠失していても完全に欠失していてもよい。適切には、配列番号204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215若しくは216の配列の一部又は全部が、ASFVゲノムから除去されている。適切には、ASFVゲノムはこれらの配列のいずれかを欠く。

ASFVの様々な株由来のEP153Rタンパク質の受託番号を下の表3に列記する。

様々なASFV株由来のEP153Rタンパク質のアミノ酸配列を下に表す。

適切には、EP153R遺伝子は、配列番号20、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227又は228の配列を含むタンパク質をコードする。適切には、EP153R遺伝子は、配列番号20、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227又は228と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含むタンパク質をコードする。適切には、EP153R遺伝子は、配列番号20、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227又は228の配列からなるタンパク質をコードする。

一実施形態では本発明のASFVはEP153Rタンパク質を発現しない。換言すれば、本発明のASFVは、配列番号20、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227又は228の配列を持つタンパク質のいずれも発現しない。

EP153Rは免疫原性である(すなわち、免疫応答を誘発する)(Burmakinaら、2019 J. Gen. Virol. 100: 259-265)。EP153Rは、ASFV感染中にカスパーゼ-3活性化を阻害し、それによってアポトーシスに及ぼす阻害効果を有する。血球吸着にはEP153Rが必要である。EP153Rはまた、感染細胞におけるMHC-I発現も阻害する。

EP153Rの活性
本発明の弱毒化ASFVの一実施形態では、EP153R活性を破壊し得る。

一実施形態では、破壊することができるEP153Rの活性とは、血球吸着を媒介するその能力である。換言すれば、EP153Rが血球吸着を媒介する能力を低下させ得る。EP153Rが血球吸着を媒介する能力を、少なくとも50、60、70、80又は90%低下させ得る。EP153Rが血球吸着を媒介する能力を完全に消失させ得る。

一実施形態では、破壊することができるEP153Rの活性とは、カスパーゼ-3を阻害するその能力である。換言すれば、EP153Rがカスパーゼ-3を阻害する能力を低下させ得る。EP153Rがカスパーゼ-3を阻害する能力を、少なくとも50、60、70、80又は90%低下させ得る。EP153Rがカスパーゼ-3を阻害する能力を完全に消失させ得る。カスパーゼ-3活性は、当技術分野で知られるアッセイ、例えばHurtadoら(Hurtadoら、2004 Virology 326: 160-170)により記載のアッセイによって測定することができる。例えば、17kDaの切断された活性型カスパーゼ-3断片及び34kDaの不活性型プロカスパーゼ-3タンパク質を、ウエスタンブロット又は質量分析法を使用して定量化し且つ比較してカスパーゼ-3の活性化の程度を確認することができる。代替的に又は付加的に、細胞抽出物のカスパーゼ-3が蛍光基質を切断する能力は、高速液体クロマトグラフィーを使用して測定することができる。

一実施形態では、破壊することができるEP153Rの活性とは、MHC-I発現を阻害するその能力である。換言すれば、EP153RがMHC-I発現を阻害する能力を低下させ得る。EP153RがMHC-I発現を阻害する能力を、少なくとも50、60、70、80又は90%低下させ得る。EP153RがMHC-I発現を阻害する能力を完全に消失させ得る。MHC-I発現を、当技術分野で知られるアッセイ、例えばHurtadoら(Hurtadoら、2011 Arch. Virol. 156(2): 219-234)により記載のアッセイによって測定することができる。例えば、MHC-Iの細胞表面発現は、非透過処理細胞の抗体染色、これに続くフローサイトメトリーを使用して測定することができる。

DIVA突然変異
一実施形態では本発明のASFVは、ワクチン接種動物と感染動物を区別する(DIVA)突然変異を含む。DIVA突然変異とは、ASFウイルスを含むワクチンがDIVAワクチンとして機能することを可能にする、ASFウイルスにおける突然変異である(すなわち、DIVAワクチンでワクチン接種された対象を、野生型ASFウイルスに感染した対象と区別することができる)。

一実施形態では本発明は、EP153R遺伝子及びEP402R遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されている弱毒化ASFウイルスであって、
以下の遺伝子:
多重遺伝子族(MGF) 110 3L、6L、7L、8L、10L、11L及び12L、
MGF 360 5L、6L、7L、10L、11L、12L、13L、14L、20R、21R及び22R、並びに
MGF 505 1R、2R及び6R
のうちの1つ以上の機能性バージョンを含み、
且つDIVA突然変異を含む、
弱毒化ASFウイルスを提供する。

一実施形態では本発明は、
EP153R遺伝子及びEP402R遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されている弱毒化ASFウイルスであって、
以下の遺伝子:
多重遺伝子族(MGF) 110 11L及び12L、
MGF 360 6L、10L、11L、12L、13L及び14L、並びに
MGF 505 1R及び2R
のうちの1つ以上の機能性バージョンを含み、
且つDIVA突然変異を含む、
弱毒化ASFウイルスを提供する。

一実施形態では本発明は、
EP153R遺伝子及びEP402R遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されている弱毒化ASFウイルスであって、
以下の遺伝子:
多重遺伝子族(MGF) 110 5L、6L、8L及び12L、
MGF 360 6L、10L、11L、12L、13L、14L及び21R、並びに
MGF 505 1R及び2R
のうちの1つ以上の機能性バージョンを含み、
且つDIVA突然変異を含む、
弱毒化ASFウイルスを提供する。

一実施形態では本発明は、ASFウイルスであって、リガンド結合ドメイン中に1つ以上のアミノ酸変化を含み、ここでアミノ酸変化がEP402Rタンパク質のリガンド結合を破壊している、EP402Rタンパク質(すなわち、本発明のEP402タンパク質)並びに/又は前記EP402Rタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、且つDIVA突然変異を更に含む、ASFウイルスを提供する。

一実施形態では、DIVA突然変異はK145R遺伝子及び/又はB125R遺伝子の発現を破壊する。適切には、DIVA突然変異はK145R遺伝子の発現を破壊する。適切には、K145R遺伝子は部分的に欠失している。適切には、K145R遺伝子は完全に欠失している。適切には、B125R遺伝子は部分的に欠失している。適切には、B125R遺伝子は完全に欠失している。

K145R
K145R遺伝子は後期遺伝子である。

様々なASFV株由来のK145R遺伝子の遺伝子(すなわちヌクレオチド)配列を下に示す。

一実施形態では本発明のASFVは、K145R遺伝子の発現を破壊するDIVA突然変異を含む。換言すれば、ASFVはK145R遺伝子の機能性バージョンを欠く。適切には、K145R遺伝子は、配列番号327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338又は339の配列を含む。適切には、K145R遺伝子は、配列番号327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338又は339と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含む。適切には、K145R遺伝子は、配列番号327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338又は339の配列からなる。

本発明のASFVの一実施形態では、K145R遺伝子は、部分的に欠失していても完全に欠失していてもよい。適切には、配列番号327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338若しくは339の配列の一部又は全部が、ASFVゲノムから除去されている。適切には、ASFVゲノムはこれらの配列のいずれかを欠く。

ASFVの様々な株由来のK145Rタンパク質の受託番号を下の表4に列記する。

様々なASFV株由来のK145Rタンパク質のアミノ酸配列を下に示す。

一実施形態では本発明のASFVはK145Rタンパク質を発現しない。換言すれば、本発明のASFVは、配列番号340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351又は352の配列を持つタンパク質のいずれも発現しない。

K145Rは、宿主の小胞体(ER)ストレス応答を阻害する(Barber 2015 Stress modulators encoded by African swine fever virus; PhD thesis, St Georges, University of London, 2016)。この応答は、非折り畳みタンパク質の蓄積によって引き起こされ、相当量のウイルスタンパク質が生成されることに起因して、ウイルス感染の間に活性化され得る。ERストレスは、転写因子CCAATエンハンサー結合タンパク質相同タンパク質(CHOP)の発現の上昇及び細胞の核におけるその蓄積につながる。CHOP活性は細胞アポトーシスを最終的にもたらし、したがってウイルス複製を制限する。

K145R機能は、CHOPに対する抗体を使用する免疫蛍光法、ERストレスの誘導の後の細胞の核内でのその存在の評価、及びルシフェラーゼ遺伝子がCHOPプロモーターの制御下にあるルシフェラーゼレポーターアッセイを始めとした方法によって試験することができる。

B125R
様々なASFV株由来のB125R遺伝子の遺伝子(すなわちヌクレオチド)配列を下に示す。

一実施形態では本発明のASFVは、B125R遺伝子の発現を破壊するDIVA突然変異を含む。換言すれば、ASFVはB125R遺伝子の機能性バージョンを欠く。適切には、B125R遺伝子は、配列番号353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364又は365の配列を含む。適切には、B125R遺伝子は、配列番号353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364又は365と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含む。適切には、B125R遺伝子は、配列番号353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364又は365の配列からなる。

本発明のASFVの一実施形態では、B125R遺伝子は、部分的に欠失していても完全に欠失していてもよい。適切には、配列番号353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364又は365の配列の一部又は全部が、ASFVゲノムから除去されている。適切には、ASFVゲノムはこれらの配列のいずれかを欠く。

ASFVの様々な株由来のB125Rタンパク質の受託番号を下の表5に列記する。

様々なASFV株由来のB125Rタンパク質のアミノ酸配列を下に表す。

一実施形態では本発明のASFVはB125Rタンパク質を発現しない。換言すれば、本発明のASFVは、配列番号366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377又は378の配列を持つタンパク質のいずれも発現しない。

B125Rは、感染したイノシシ細胞(WSL-R)で発現する最も多量に存在するウイルスタンパク質の1つとして特定された(Kasslerら、2018 Sci. Rep. 8: 1471)。図5に示すように、B125Rの発現を細胞表面で検出することができ、このことが指摘するところは、B125Rは抗体に曝露される可能性が高く、強力な抗体応答を誘導する可能性が高いということである。

多重遺伝子族(MGF)
ASFVは、ゲノムの左右の可変領域に存在する5つの多重遺伝子族を含有する。MGFは、遺伝子に存在するコドンの平均数にちなんで命名されている: MGF100、110、300、360、及び505/530。MGF300、360及び505/530のメンバーのN末端領域は、互いに有意な類似性を共有している。MGF360族及び505族は、感染細胞の生存の促進及びI型インターフェロン応答の抑制に関与する宿主域の機能にとって必須である遺伝子をコードすることが示されてきた。

本発明による弱毒化ASFVは、以下の遺伝子:
多重遺伝子族(MGF) 110 3L、6L、7L、8L、10L、11L及び12L、
MGF 360 5L、6L、7L、10L、11L、12L、13L、14L、20R、21R及び22R、並びに
MGF 505 1R、2R及び6R
のうちの1つ以上の機能性バージョンを含む。

さらなる一態様では、本発明は、
EP153R及びEP402Rの遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されており、以下の遺伝子:
多重遺伝子族(MGF) 110 11L及び12L、
MGF 360 6L、10L、11L、12L、13L及び14L、並びに
MGF 505 1R及び2R
のうちの1つ以上の機能性バージョンを含む、弱毒化アフリカ豚熱(ASF)ウイルスを提供する。

適切には、一実施形態では、本発明は、
EP153R及びEP402Rの遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されており、以下の遺伝子:
多重遺伝子族(MGF) 110 5L、6L、8L及び12L、並びに
MGF 360 6L、10L、11L、12L、13L、14L及び21R、並びに
MGF 505 1R及び2R
のうちの1つ以上の機能性バージョンを含む、ASFVを提供する。

適切には、一実施形態では、本発明は、
EP153R及びEP402Rの遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されており、以下の遺伝子:
多重遺伝子族(MGF) 110 6L、8L及び12L、並びに
MGF 360 6L、10L、11L、12L、13L、14L及び21R、並びに
MGF 505 1R及び2R
のうちの1つ以上の機能性バージョンを含む、ASFVを提供する。

適切には、一実施形態では、本発明は、
EP153R及びEP402Rの遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されており、以下の遺伝子:
多重遺伝子族(MGF) 110 12L、並びに
MGF 360 6L、10L、11L、12L、13L、14L、並びに
MGF 505 1R及び2R
のうちの1つ以上の機能性バージョンを含む、ASFVを提供する。

適切には、一実施形態では、本発明は、
EP153R及びEP402Rの遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されており、以下の遺伝子:
多重遺伝子族(MGF) 360 6L、10L、11L、12L、13L、及び14L、並びに
MGF 505 1R及び2R
のうちの1つ以上の機能性バージョンを含む、ASFVを提供する。

様々なASFV株のゲノムにおけるこれらの遺伝子のいくつかの位置を下の表6に提供する。相当するBenin 97/1遺伝子に対する遺伝子の配列同一性も提供する。

様々な株由来のこれらの遺伝子の遺伝子(すなわちヌクレオチド)配列を下に示す。

MGF 110 5L遺伝子配列

一実施形態では、本発明の弱毒化ASFVは、MGF 110 5Lの機能性バージョンを含む。適切には、MGF 110 5Lの機能性バージョンは、配列番号266、267、268、269、270、271、272、273、274又は275の配列を含む。適切には、MGF 110 5Lの機能性バージョンは、配列番号266、267、268、269、270、271、272、273、274又は275と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含む。適切には、MGF 110 5Lの機能性バージョンは、配列番号266、267、268、269、270、271、272、273、274又は275の配列からなる。

MGF 110 6L遺伝子配列

一実施形態では、本発明の弱毒化ASFVは、MGF 110 6Lの機能性バージョンを含む。適切には、MGF 110 6Lの機能性バージョンは、配列番号35、36、37、38、39、40、41、42又は43の配列を含む。適切には、MGF 110 6Lの機能性バージョンは、配列番号35、36、37、38、39、40、41、42又は43と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含む。適切には、MGF 110 6Lの機能性バージョンは、配列番号35、36、37、38、39、40、41、42又は43の配列からなる。

MGF 110 7L遺伝子配列

一実施形態では、本発明の弱毒化ASFVは、MGF 110 7Lの機能性バージョンを含む。適切には、MGF 110 7Lの機能性バージョンは、配列番号247、248、249、250、251、252、253、254、255又は256の配列を含む。適切には、MGF 110 7Lの機能性バージョンは、配列番号247、248、249、250、251、252、253、254、255又は256と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含む。適切には、MGF 110 7Lの機能性バージョンは、配列番号247、248、249、250、251、252、253、254、255又は256の配列からなる。

MGF 110 8L遺伝子配列

一実施形態では、本発明の弱毒化ASFVは、MGF 110 8Lの機能性バージョンを含む。適切には、MGF 110 8Lの機能性バージョンは、配列番号44、45、46、47、48、49又は50の配列を含む。適切には、MGF 110 8Lの機能性バージョンは、配列番号44、45、46、47、48、49又は50と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含む。適切には、MGF 110 8Lの機能性バージョンは、配列番号44、45、46、47、48、49又は50の配列からなる。

MGF 110 12L遺伝子配列

一実施形態では、本発明の弱毒化ASFVは、MGF 110 12Lの機能性バージョンを含む。適切には、MGF 110 8Lの機能性バージョンは、配列番号276、277、278、279、280、281、282、283、284、285又は286の配列を含む。適切には、MGF 110 12Lの機能性バージョンは、配列番号276、277、278、279、280、281、282、283、284、285又は286と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含む。適切には、MGF 110 12Lの機能性バージョンは、配列番号276、277、278、279、280、281、282、283、284、285又は286の配列からなる。

MGF 360 6L遺伝子配列

一実施形態では、本発明の弱毒化ASFVは、MGF 360 6Lの機能性バージョンを含む。適切には、MGF 360 6Lの機能性バージョンは、配列番号51、52、53、54、55、56、57、58、59、60又は61の配列を含む。適切には、MGF 360 6Lの機能性バージョンは、配列番号51、52、53、54、55、56、57、58、59、60又は61と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含む。適切には、MGF 360 6Lの機能性バージョンは、配列番号51、52、53、54、55、56、57、58、59、60又は61の配列からなる。

MGF 360 10L遺伝子配列

一実施形態では、本発明の弱毒化ASFVは、MGF 360 10Lの機能性バージョンを含む。適切には、MGF 360 10Lの機能性バージョンは、配列番号62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73又は74の配列を含む。適切には、MGF 360 10Lの機能性バージョンは、配列番号62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73又は74と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含む。適切には、MGF 360 10Lの機能性バージョンは、配列番号62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73又は74の配列からなる。

MGF 360 11L遺伝子配列

一実施形態では、本発明の弱毒化ASFVは、MGF 360 11Lの機能性バージョンを含む。適切には、MGF 360 11Lの機能性バージョンは、配列番号75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86又は87の配列を含む。適切には、MGF 360 11Lの機能性バージョンは、配列番号75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86又は87と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含む。適切には、MGF 360 11Lの機能性バージョンは、配列番号75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86又は87の配列からなる。

MGF 360 12L遺伝子配列

一実施形態では、本発明の弱毒化ASFVは、MGF 360 12Lの機能性バージョンを含む。適切には、MGF 360 12Lの機能性バージョンは、配列番号88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99の配列を含む。適切には、MGF 360 12Lの機能性バージョンは、配列番号88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含む。適切には、MGF 360 12Lの機能性バージョンは、配列番号88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99の配列からなる。

MGF 360 13L遺伝子配列

一実施形態では、本発明の弱毒化ASFVは、MGF 360 13Lの機能性バージョンを含む。適切には、MGF 360 13Lの機能性バージョンは、配列番号100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110又は111の配列を含む。適切には、MGF 360 13Lの機能性バージョンは、配列番号100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110又は111と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含む。適切には、MGF 360 13Lの機能性バージョンは、配列番号100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110又は111の配列からなる。

MGF 360 14L遺伝子配列

一実施形態では、本発明の弱毒化ASFVは、MGF 360 14Lの機能性バージョンを含む。適切には、MGF 360 14Lの機能性バージョンは、配列番号112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122又は123の配列を含む。適切には、MGF 360 14Lの機能性バージョンは、配列番号112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122又は123と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含む。適切には、MGF 360 14Lの機能性バージョンは、配列番号112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122又は123の配列からなる。

MGF 360 21R遺伝子配列

一実施形態では、本発明の弱毒化ASFVは、MGF 360 21Rの機能性バージョンを含む。適切には、MGF 360 21Rの機能性バージョンは、配列番号124、125、126、127、128、129、130、131、132又は133の配列を含む。適切には、MGF 360 21Rの機能性バージョンは、配列番号124、125、126、127、128、129、130、131、132又は133と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含む。適切には、MGF 360 21Rの機能性バージョンは、配列番号124、125、126、127、128、129、130、131、132又は133の配列からなる。

MGF 505 1R遺伝子配列

一実施形態では、本発明の弱毒化ASFVは、MGF 505 1Rの機能性バージョンを含む。適切には、MGF 505 1Rの機能性バージョンは、配列番号134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145又は146の配列を含む。適切には、MGF 505 1Rの機能性バージョンは、配列番号134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145又は146と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含む。適切には、MGF 505 1Rの機能性バージョンは、配列番号134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145又は146の配列からなる。

MGF 505 2R遺伝子配列

一実施形態では、本発明の弱毒化ASFVは、MGF 505 2Rの機能性バージョンを含む。適切には、MGF 505 2Rの機能性バージョンは、配列番号147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157又は158の配列を含む。適切には、MGF 505 2Rの機能性バージョンは、配列番号147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157又は158と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含む。適切には、MGF 505 2Rの機能性バージョンは、配列番号147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157又は158の配列からなる。

MGF 505 6R遺伝子配列

一実施形態では、本発明の弱毒化ASFVは、MGF 505 6Rの機能性バージョンを含む。 適切には、MGF 505 6Rの機能性バージョンは、配列番号257、258、259、260、261、262、263、264又は265の配列を含む。適切には、MGF 505 2Rの機能性バージョンは、配列番号257、258、259、260、261、262、263、264又は265と、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性を有する配列を含む。適切には、MGF 505 6Rの機能性バージョンは、配列番号257、258、259、260、261、262、263、264又は265の配列からなる。

一実施形態では、本発明は、Benin 97/1株由来の以下の配列のうちの1つ以上、例えば全てを含むASFVを提供する:
配列番号55(MGF 360 6L)、配列番号68(MGF 360 10L)、配列番号78(MGF 360 11L)、配列番号96(MGF 360 12L)、配列番号108(MGF 360 13L)及び配列番号120(MGF 360 14L)、並びに
配列番号141(MGF 505 1R)及び配列番号151(MGF 505 2R)。

一実施形態では、本発明は、China/2018/AnhuiXCGQ株由来の以下の配列のうちの1つ以上、例えば全てを含むASFVを提供する:
配列番号52(MGF 360 6L)、配列番号63(MGF 360 10L)、配列番号76(MGF 360 11L)、配列番号89(MGF 360 12L)、配列番号101(MGF 360 13L)、配列番号113(MGF 360 14L)及び配列番号125(MGF 360 21R)、並びに
配列番号135(MGF 505 1R)及び配列番号148(MGF 505 2R)。

一実施形態では、本発明は、Georgia 2007/1株由来の以下の配列のうちの1つ以上、例えば全てを含むASFVを提供する:
配列番号51(MGF 360 6L)、配列番号62(MGF 360 10L)、配列番号75(MGF 360 11L)、配列番号88(MGF 360 12L)、配列番号100(MGF 360 13L)、配列番号112(MGF 360 14L)及び配列番号124(MGF 360 21R)、並びに
配列番号134(MGF 505 1R)及び配列番号147(MGF 505 2R)。

一実施形態では、本発明は、Ken05/Tk1株由来の以下の配列のうちの1つ以上、例えば全てを含むASFVを提供する:
配列番号35(MGF 110 6L)、配列番号44(MGF 110 8L)、並びに
配列番号58(MGF 360 6L)、配列番号65(MGF 360 10L)、配列番号86(MGF 360 11L)及び配列番号130(MGF 360 21R)、並びに
配列番号145(MGF 505 1R)及び配列番号156(MGF 505 2R)。

一実施形態では、本発明は、Ken06.Bus株由来の以下の配列のうちの1つ以上、例えば全てを含むASFVを提供する:
配列番号36(MGF 110 6L)、並びに
配列番号61(MGF 360 6L)、配列番号64(MGF 360 10L)、配列番号87(MGF 360 11L)、配列番号99(MGF 360 12L)、配列番号111(MGF 360 13L)、配列番号123(MGF 360 14L)及び配列番号132(MGF 360 21R)、並びに
配列番号144(MGF 505 1R)及び配列番号158(MGF 505 2R)。

一実施形態では、本発明は、Kenya 1950株由来の以下の配列のうちの1つ以上、例えば全てを含むASFVを提供する:
配列番号37(MGF 110 6L)、配列番号45(MGF 110 8L)、並びに
配列番号60(MGF 360 6L)、配列番号66(MGF 360 10L)、配列番号85(MGF 360 11L)、配列番号98(MGF 360 12L)、配列番号110(MGF 360 13L)、配列番号122(MGF 360 14L)及び配列番号131(MGF 360 21R)、並びに
配列番号143(MGF 505 1R)及び配列番号157(MGF 505 2R).

一実施形態では、本発明は、L60株由来の以下の配列のうちの1つ以上、例えば全てを含むASFVを提供する:
配列番号54(MGF 360 6L)、配列番号67(MGF 360 10L)、配列番号77(MGF 360 11L)、配列番号95(MGF 360 12L)、配列番号107(MGF 360 13L)及び配列番号119(MGF 360 14L)、並びに
配列番号140(MGF 505 1R)及び配列番号150(MGF 505 2R)。

一実施形態では、本発明は、Malawi Lil-20/1 (1983)株由来の以下の配列のうちの1つ以上、例えば全てを含むASFVを提供する:
配列番号38(MGF 110 6L)、配列番号46(MGF 110 8L)、並びに
配列番号59(MGF 360 6L)、配列番号74(MGF 360 10L)、配列番号84(MGF 360 11L)、配列番号97(MGF 360 12L)、配列番号109(MGF 360 13L)、配列番号121(MGF 360 14L)及び配列番号133(MGF 360 21R)、並びに
配列番号146(MGF 505 1R)及び配列番号155(MGF 505 2R).

一実施形態では、本発明は、Mkuzi 1979株由来の以下の配列のうちの1つ以上、例えば全てを含むASFVを提供する:
配列番号39(MGF 110 6L)、配列番号47(MGF 110 8L)、並びに
配列番号57(MGF 360 6L)、配列番号69(MGF 360 10L)、配列番号79(MGF 360 11L)、配列番号94(MGF 360 12L)、配列番号106(MGF 360 13L)、配列番号118(MGF 360 14L)及び配列番号128(MGF 360 21R)、並びに
配列番号138(MGF 505 1R)及び配列番号149(MGF 505 2R)。

一実施形態では、本発明は、Pretorisuskop/96/4株由来の以下の配列のうちの1つ以上、例えば全てを含むASFVを提供する:
配列番号40(MGF 110 6L)、配列番号48(MGF 110 8L)、並びに
配列番号56(MGF 360 6L)、配列番号70(MGF 360 10L)、配列番号81(MGF 360 11L)、配列番号93(MGF 360 12L)、配列番号105(MGF 360 13L)、配列番号117(MGF 360 14L)及び配列番号127(MGF 360 21R)、並びに
配列番号142(MGF 505 1R)及び配列番号153(MGF 505 2R)。

一実施形態では、本発明は、Tengani 62株由来の以下の配列のうちの1つ以上、例えば全てを含むASFVを提供する:
配列番号41(MGF 110 6L)、並びに
配列番号71(MGF 360 10L)、配列番号82(MGF 360 11L)、配列番号90(MGF 360 12L)、配列番号102(MGF 360 13L)、配列番号114(MGF 360 14L)及び配列番号126(MGF 360 21R)、並びに
配列番号136(MGF 505 1R)及び配列番号152(MGF 505 2R).

一実施形態では、本発明は、Warmbaths株由来の以下の配列のうちの1つ以上、例えば全てを含むASFVを提供する:
配列番号42(MGF 110 6L)、配列番号49(MGF 110 8L)、並びに
配列番号53(MGF 360 6L)、配列番号73(MGF 360 10L)、配列番号80(MGF 360 11L)、配列番号92(MGF 360 12L)、配列番号104(MGF 360 13L)、配列番号116(MGF 360 14L)及び配列番号129(MGF 360 21R)、並びに
配列番号137(MGF 505 1R)及び配列番号154(MGF 505 2R)。

一実施形態では、本発明は、Warthog株由来の以下の配列のうちの1つ以上、例えば全てを含むASFVを提供する:
配列番号43(MGF 110 6L)、配列番号50(MGF 110 8L)、並びに
配列番号72(MGF 360 10L)、配列番号83(MGF 360 11L)、配列番号91(MGF 360 12L)、配列番号103(MGF 360 13L)、配列番号115(MGF 360 14L)、並びに
配列番号139(MGF 505 1R)。

それらの遺伝子の翻訳生成物(すなわちタンパク質配列)を下に示す:
Benin 97/1 MGF遺伝子のタンパク質配列

MGF 110 5Lタンパク質配列

MGF 110 12Lタンパク質配列

MGF 360 12Lタンパク質配列

MGF 360 13Lタンパク質配列

MGF 360 14Lタンパク質配列

MGF 505 1Rタンパク質配列

DP148R
DP148R遺伝子は、ASFVゲノムの右端近く、Benin 97/1ゲノムの位置177915～178679に位置する。DP148R遺伝子はMGF 360 18Rと呼ばれることもある。DP148Rは、感染後の早い時期に発現する。DP148Rタンパク質のアミノ酸配列には、他のタンパク質との有意な類似性はない。二次構造は主にらせん状であると予測されるが、シグナルペプチド又は膜貫通ドメインについては明らかにされていない。

DP148RはI型インターフェロンを阻害する。DP148Rはまた、NF-κB転写因子の活性化も阻害する(図7を参照のこと)。DP148Rは、NF-κBのp65サブユニットの核移行を阻害する(図8を参照のこと)。NF-κBは、ウイルス感染に対する宿主の自然免疫系応答の一部としてインターフェロン及び炎症誘発性サイトカインの発現を制御する。DP148RによるNF-κBの阻害は、ASFVに感染した細胞によって産生されるI型インターフェロン(IFN)並びに炎症誘発性サイトカイン及びケモカインの量の低下をもたらし、ASFVが宿主の自然免疫応答を回避することが可能となり、その結果、ウイルスの複製の助力となり且つ適応応答の発達を破壊すると考えられる。

様々なASFV株由来のDP148R遺伝子のゲノムにおける遺伝子(すなわちヌクレオチド)配列及び位置を下に提示する。

様々なASFV株由来のDP148Rタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号11～19及び301～305として以下に示す：

血球吸着
血球吸着とは、ASFVに感染した細胞がその表面に赤血球(erythrocytes)(赤血球(red blood cells))を吸着する現象である。ASFVによって誘導される血球吸着の程度は、本明細書に記載のような血球吸着(HAD)アッセイ(例えば、実施例1及び3を参照のこと)を使用して測定することができる。例えば、細胞(例えば、Vero細胞又はブタ骨髄細胞)にタンパク質をトランスフェクトさせるか又はASFVを感染させ、次いで赤血球を添加し、イメージングによって血球吸着の程度を検出することができる。このようにして、様々なタンパク質及びウイルスを、血球吸着に及ぼすそれらの影響について試験することができる。

EP402R及びEP153Rは、ASFV感染細胞の血球吸着を媒介する際に関与する。

一実施形態では本発明は、EP153R遺伝子及びEP402R遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されていない相当するASFウイルスと比較して、ASFウイルスが血球吸着を誘導する能力は減少している、弱毒化ASFウイルスを提供する。一実施形態では本発明は、EP153R遺伝子及びEP402R遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されている弱毒化アフリカ豚熱(ASF)ウイルスであって、
以下の遺伝子:
多重遺伝子族(MGF) 110 3L、6L、7L、8L、10L、11L及び12L、
MGF 360 5L、6L、7L、10L、11L、12L、13L、14L、20R、21R及び22R、並びに
MGF 505 1R、2R及び6R
のうちの1つ以上の機能性バージョンを含み、
且つEP153R遺伝子及び/又はEP402R遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されていない相当するASFウイルスと比較して、ASFウイルスが血球吸着を誘導する能力は減少している、
弱毒化ASFウイルスを提供する。

本発明はまた、
EP153R遺伝子及びEP402R遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されている弱毒化ASFウイルスであって、
以下の遺伝子:
多重遺伝子族(MGF) 110 11L及び12L、
MGF 360 6L、10L、11L、12L、13L及び14L、並びに
MGF 505 1R及び2R
のうちの1つ以上の機能性バージョンを含み、
且つEP153R遺伝子及び/又はEP402R遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されていない相当するASFウイルスと比較して、ASFウイルスが血球吸着を誘導する能力は減少している、
弱毒化ASFウイルスも提供する。

本発明はまた、
EP153R遺伝子及びEP402R遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されている弱毒化ASFウイルスであって、
以下の遺伝子:
多重遺伝子族(MGF) 110 5L、6L、8L及び12L、
MGF 360 6L、10L、11L、12L、13L、14L及び21R、並びに
MGF 505 1R及び2R
のうちの1つ以上の機能性バージョンを含み、
且つEP153R遺伝子及び/又はEP402R遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されていない相当するASFウイルスと比較して、ASFウイルスが血球吸着を誘導する能力は減少している、
弱毒化ASFウイルスも提供する。

別の態様では本発明は、本発明のEP402Rタンパク質及び/又は本発明のポリヌクレオチドを含まない相当するASFウイルスと比較して、ASFウイルスが血球吸着を誘導する能力は減少している、本発明のEP402Rタンパク質及び/又は本発明のポリヌクレオチドを含むASFウイルスを提供する。

本発明の弱毒化ASFウイルスの一実施形態では、EP153R遺伝子及び/又はEP402R遺伝子が血球吸着を媒介する能力を破壊することができる。一実施形態では、EP153R遺伝子が血球吸着を媒介する能力を破壊することができる。一実施形態では、EP402R遺伝子が血球吸着を媒介する能力を破壊することができる。

血球吸着を減少させる又は血球吸着を媒介する能力を破壊するとは、野生型ASFVに感染した細胞よりも、或いは、本発明のASFウイルスであって、EP153R遺伝子及びEP402R遺伝子の発現及び/又は活性は破壊されていない、又は本発明のEP402Rタンパク質及び/又は本発明のポリヌクレオチドを含まない、本発明のASFウイルスに相当するか又は本質的に相当するASFウイルスに感染した細胞よりも、本発明のASFVに感染した細胞では細胞の表面に吸着する赤血球が少ないことを意味する。血球吸着を減少させる又は血球吸着を媒介する能力を破壊するとはまた、突然変異型の非機能性EP153Rタンパク質若しくはEP402Rタンパク質を発現するようにトランスフェクトした細胞では、野生型のEP153Rタンパク質若しくはEP402Rタンパク質をトランスフェクトした細胞よりも、細胞の表面に吸着する赤血球が少ないことを意味する。感染した/トランスフェクトした細胞の表面に吸着した赤血球の数を、少なくとも50、60、70、80又は90%低下させ得る。一実施形態では、血球吸着が消失する、すなわち、本発明の弱毒化ASFVに感染した細胞の表面に、又は突然変異型の非機能性EP153Rタンパク質若しくはEP402Rタンパク質をトランスフェクトした細胞の表面に、赤血球はまったく吸着しない。

遺伝子発現及び活性
一実施形態では本発明のASFウイルスは、EP153R遺伝子及びEP402R遺伝子の破壊された発現及び/又は活性を有する。別の実施形態では本発明のASFウイルスは、EP153R、EP402R及びK145Rの各遺伝子の破壊された発現及び/又は活性を有する。これらの遺伝子は、本明細書において「破壊された遺伝子」と呼ぶことがある。

一実施形態では、本発明は、EP153R遺伝子及びEP402R遺伝子の発現が破壊されているASFVを提供する。一実施形態では、本発明は、EP153R、EP402R及びK145Rの各遺伝子の発現が破壊されているASFVを提供する。適切には、EP153R遺伝子の発現が破壊されている。適切にはEP402R遺伝子の発現が破壊されている。適切には、K145R遺伝子の発現が破壊されている。一実施形態では本発明は、EP153R遺伝子及びEP402R遺伝子の活性が破壊されているASFVを提供する。

遺伝子に関する「発現」という用語は、ASFウイルスが遺伝子の産物、例えばRNA及び/又はタンパク質を産生する能力を指す。遺伝子の発現の破壊とは、遺伝子産物の産生が低下することを意味する。遺伝子の発現を、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%及び/又は少なくとも95%低下させ得る。遺伝子の発現を、遺伝子産物、例えばRNA及び/又はタンパク質の産生が完全に消失する(すなわち、遺伝子産物がまったく産生されない)程度まで低下させ得る。遺伝子発現の破壊によって、遺伝子が破壊されていない場合の遺伝子の発現と比べて、遺伝子の発現が低下する。例えば、突然変異遺伝子は、遺伝子の野生型バージョンと比較して低下した発現を示し得る。

発現が破壊されている遺伝子は、完全には転写及び翻訳されないことがある。遺伝子の転写を、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%及び/又は少なくとも95%低下させ得る。遺伝子の転写は消失することがある(すなわち、遺伝子は転写されないことがある)。遺伝子の翻訳を、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%及び/又は少なくとも95%低下させ得る。遺伝子の翻訳は消失することがある。遺伝子は転写されるが翻訳されないことがある。遺伝子は転写及び翻訳され得るが、タンパク質が迅速に分解されてその機能を実行することできないことがある。遺伝子は転写及び翻訳され得るが、タンパク質が非機能性の場合がある。

遺伝子発現は、当技術分野で知られる技術によって測定することができる。例えば、遺伝子から転写されたmRNAの量を、例えば、定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)を使用することによって定量化することができる。代替的に又は付加的に、タンパク質の量を、例えばウェスタンブロッティング又は質量分析法を使用することによって、定量化することができる。

遺伝子に関する「活性」という用語は、当該遺伝子がその機能を実行する能力を指す。異なる遺伝子は異なる活性、すなわちそれらが果たす異なる機能を有する。所与の遺伝子は多重の活性を有していてもよく、遺伝子活性の破壊は、それらの活性のうちの1つ以上の破壊を意味する。遺伝子のうちの1つ以上の活性を破壊してもよいが、一方、1つ以上の他の活性は破壊されない。遺伝子活性の破壊によって、遺伝子が破壊されていない場合の遺伝子の活性と比べて、遺伝子の活性は低下する。例えば、突然変異遺伝子は、当該遺伝子の野生型バージョンと比較して低下した活性を示し得る。遺伝子活性を、遺伝子活性が完全に消失する程度まで低下させ得る。

本発明によるASFVは、破壊された遺伝子の非機能性バージョンを含んでもよい。

遺伝子産物量の低下は、遺伝子がその活性のうちの1つ以上を効果的に実行することができないことを意味するため、遺伝子の発現の破壊によってその遺伝子の活性も破壊され得る。

一実施形態では、本発明のASFウイルスは、EP153R及びEP402Rの遺伝子の発現及び/又は活性を破壊する突然変異を含む。

遺伝子の発現及び/又は活性は、遺伝子のmRNAへの転写を破壊することによって、すなわち、遺伝子転写を低下させること、例えば遺伝子転写を完全に消失させることによって破壊され得る。遺伝子の発現及び/又は活性は、mRNAのタンパク質への翻訳を破壊することによって破壊され得る。一実施形態では、弱毒化ASFウイルスは、遺伝子の転写及び/又は翻訳を低下させる突然変異を含む。一実施形態では、弱毒化ASFウイルスは、遺伝子が転写及び/又は翻訳されないこと(すなわち、転写及び/又は翻訳の完全な消失)をもたらす、突然変異を含む。

遺伝子の発現及び/又は活性は、遺伝子に関連する非コード配列、例えばプロモーターを突然変異させることによって破壊され得る。一実施形態では、弱毒化ASFウイルスは、1つ以上の破壊された遺伝子のプロモーターに突然変異を含む。

遺伝子発現及び/又は活性を、1つ以上の破壊された遺伝子のコード配列を突然変異させることによって破壊してもよい。

遺伝子の機能性バージョン
本発明の弱毒化ASFVは、以下の遺伝子:
多重遺伝子族(MGF) 110 3L、6L、7L、8L、10L、11L及び12L、
MGF 360 5L、6L、7L、10L、11L、12L、13L、14L、20R、21R及び22R、並びに
MGF 505 1R、2R及び6R
のうちの1つ以上の機能性バージョンを含む。

一部の実施形態では、本発明の弱毒化ASFVは、以下の遺伝子: MGF 110 3L、6L、7L、8L、10L、11L及び12L; MGF 360 5L、6L、7L、10L、11L、12L、13L、14L、20R、21R及び22R;並びにMGF 505 1R、2R及び6Rのうちの1つ以上の機能性バージョンを含むことができる。適切には、弱毒化ASFVは、以下の遺伝子: MGF 110 3L、6L、7L、8L、10L、11L及び12L; MGF 360 5L、6L、7L、10L、11L、12L、13L、14L、20R、21R及び22R;並びにMGF 505 1R、2R及び6Rのうちの、2つ以上、例えば3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、9つ以上、10以上、11以上、12以上、13以上、14以上、15以上、16以上、17以上、18以上、19以上、20以上、21又は22の機能性バージョンを含む。一実施形態では、弱毒化ASFVは、以下の遺伝子: MGF 110 3L、6L、7L、8L、10L、11L及び12L; MGF 360 5L、6L、7L、10L、11L、12L、13L、14L、20R、21R及び22R;並びにMGF 505 1R、2R及び6Rのうちの全ての機能性バージョンを含む。適切には、本発明の弱毒化ASFウイルスは、EP153R及びEP402R以外のすべてのASFウイルス遺伝子の機能性バージョンを含む。 適切には、本発明の弱毒化ASFウイルスは、EP153R、EP402Ｒ及びK145R以外のすべてのASFウイルス遺伝子の機能性バージョンを含む。

遺伝子の「機能性バージョン」という表現は、その発現及び活性が破壊されていない遺伝子を指す。遺伝子の機能性バージョンは、遺伝子発現又は遺伝子活性が破壊されるような様式で突然変異していなくてもよい。遺伝子の機能性バージョンは、なんら突然変異を含まなくてもよい。遺伝子の機能性バージョンのコード配列は、完全であり且つ非分断であってよい。遺伝子の機能性バージョンは、完全に転写され且つ翻訳されていてもよい。遺伝子の機能性バージョンは、完全なコード配列を含んでもよい。

遺伝子の機能性バージョンは、野生型ASFV分離株の遺伝子に相当し得る。遺伝子の機能性バージョンは、病原性ASFV株の遺伝子に相当し得る。遺伝子の機能性バージョンの配列は、野生型ASFV分離株又は病原性ASFV株の遺伝子の配列と同一とし得る。遺伝子の機能性バージョンの配列は、本発明の弱毒化ASFVが由来する野生型ASFV分離株の遺伝子の配列と同一とし得る。遺伝子の機能性バージョンは、野生型ASFV分離株の遺伝子の天然の変異体とし得る。

遺伝子の機能性バージョンは突然変異を含んでもよい。しかし、突然変異によって遺伝子の発現又は活性が損なわれてはならない。換言すれば、突然変異は遺伝子の機能に影響を与えてはならない。遺伝子の機能性バージョンは、1つ以上の同義的な突然変異(すなわち、当該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を変更しない突然変異)を含んでもよい。遺伝子の機能性バージョンは1つ以上のサイレント突然変異を含んでもよく、これは同義であっても非同義であってもよい。遺伝子の機能性バージョンは、遺伝子の発現又は活性を破壊しない欠失を含んでもよい。遺伝子の機能性バージョンは、遺伝子の発現又は活性を破壊しない1つ以上の一塩基多型(SNP)を含んでもよい。

突然変異
遺伝子発現及び/又は活性は、ASFVゲノムを突然変異させることによって、すなわちASFVゲノムのヌクレオチド配列を変化させることによって破壊される。「突然変異」とは、公知のASFV遺伝子型に対するASFVゲノムのヌクレオチド配列の変化を意味する。突然変異には、1つ以上のヌクレオチドを異なるヌクレオチドへ変化させること(すなわち置換)、ヌクレオチドを付加すること(すなわち挿入)、ヌクレオチドを排除すること(すなわち欠失)及び/又はこれらの組合せが含まれる。一実施形態では本発明のASFウイルスは、EP153R遺伝子及びEP402R遺伝子の発現及び/又は活性を破壊する1つ以上の突然変異を含む。一実施形態では、本発明のASFウイルスは、K145R遺伝子の発現を破壊する1つ以上の突然変異を含む。

遺伝子発現及び/又は活性を破壊する突然変異は、ASFVゲノムの非コード配列及び/又はASFVゲノムのコード配列にあり得る。本発明の弱毒化ASFウイルスは、EP153R遺伝子の発現及び/若しくは活性を破壊する、非コード領域中に1つ以上の突然変異、並びに/又はEP402R遺伝子の発現及び/若しくは活性を破壊する、非コード領域中に1つ以上の突然変異を含み得る。本発明のASFウイルスは、K145R遺伝子の発現及び/又は活性を破壊する、非コード領域中に1つ以上の突然変異を含み得る。

本発明のASFウイルスは、EP153R遺伝子の発現及び/若しくは活性を破壊する、EP153R遺伝子のコード領域中に1つ以上の突然変異、並びに/又はEP402R遺伝子の発現及び/若しくは活性を破壊する、EP402R遺伝子のコード領域中に1つ以上の突然変異を含み得る。本発明の弱毒化ASFウイルスは、K145R遺伝子の発現を破壊する、K145R遺伝子のコード領域中に1つ以上の突然変異を含み得る。

欠失
本発明のASFVでは、遺伝子の発現及び/又は活性が欠失によって破壊されてもよい。換言すれば、遺伝子の発現及び/又は活性が、欠失である突然変異によって破壊されてもよい。本発明のASFVは、欠失によって遺伝子の機能性バージョンを欠くように作製してもよい。換言すれば、ASFVが遺伝子の機能性バージョンを欠くことをもたらす突然変異は、欠失であってもよい。

「欠失」とは、ASFVゲノムヌクレオチド配列の一部の除去を意味する。欠失は連続的であることもあり、又は配列の複数のセクションの欠失を含むこともある。欠失によって、本明細書に記載の方法のいずれかで遺伝子発現及び/又は活性を破壊してもよい。欠失によって、本明細書に記載の方法のいずれかで、ASFVが遺伝子の機能性バージョンを欠くことをもたらしてもよい。

欠失によって、生成される遺伝子産物が変化し得る。欠失によって、遺伝子が転写及び/又は翻訳されないことが生じ得る。欠失によって、遺伝子のmRNAへの転写を破壊してもよい。例えば、遺伝子のプロモーターを欠失すると、転写が破壊されることになる。欠失によって、mRNAのタンパク質への翻訳を破壊してもよい。例えば、開始コドンを欠失すると、翻訳が破壊されることになる。遺伝子の発現及び/又は活性を、遺伝子に関連する非コード配列、例えばプロモーターを欠失させることによって破壊してもよい。

遺伝子発現及び/又は活性を、遺伝子のコード配列を欠失させることによって破壊してもよい。ASFVを、遺伝子のコード配列を欠失させることによって、遺伝子の機能性バージョンを欠くように作製してもよい。「遺伝子の欠失」(例えば「部分的に欠失している」又は「完全に欠失している」)という表現は、遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されているような十分な量のコード配列の欠失を指す。

コード配列の欠失は部分的であってもよい(すなわち、コード配列の一部が欠失している)。欠失によって、例えば、遺伝子のコード配列の少なくとも50、60、70、80又は90%を除去することができる。遺伝子発現及び/又は活性を破壊するのに欠失させる必要があるコード配列の量は、極めて小さくてもよい。例えば、遺伝子の部分的欠失は、遺伝子の発現及び/又は活性を破壊するのに十分である場合、単に開始コドン(ATG)を欠失させることを意味することがある。その一方で、欠失は完全である場合があるが、その場合、遺伝子のコード配列の100%が欠失している(すなわち、野生型分離株の相当するゲノムと比較した場合、コード配列の全てが非存在である)。換言すれば、「完全に欠失している」とは、その遺伝子のコード配列の全てが欠失したことを意味する。

遺伝子の部分的及び完全な欠失は、当技術分野で既知の技法、例えばCre-LoxP及びFlp-FRTのシステムを介した条件付きターゲティングを使用して、又は操作されたヌクレアーゼ、例えば、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)及びCRISPR-CasシステムのCasを使用する二本鎖切断(DSB)並びに修復を誘導することによって、行うことができる。DSB修復を利用して、DSBのいずれかの側に隣接する配列と相同である配列内に所望の突然変異ヌクレオチド配列を含むベクターを供給することにより、所望の突然変異を導入することができる。これにより、所望の突然変異がDSBの部位に挿入される。ヌクレアーゼ、例えば上のものを操作して、ゲノム内の特定の部位にDSBを誘導することができる。例えば、既知のタンパク質単位を組み合わせることによってキメラメガヌクレアーゼを容易に生成することができ、その結果、目的の遺伝子又はゲノム領域内の標的認識配列を認識することができる。ZFNは、特定の配列を標的とするように設計することもでき、その結果、例えばジンクフィンガーユニットを既知の特異性と組み合わせてDNAの特定の領域に結合することができる。TALENは、ヌクレアーゼドメインをDNA結合TALE(転写活性化因子様エフェクター)ドメインに融合させることによって設計された人工制限酵素である。TALEドメインは、単一塩基を認識するアミノ酸反復のタンデムアレイであり、DNAの特定の領域を標的とするように設計することができる。CRISPR-Casシステムは、Cas(CRISPR-関連タンパク質)ヌクレアーゼ及び、CRISPR(クラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の反復)RNA配列から構成されるが、この配列によって、Casタンパク質がCRISPR配列に相補的なDNAの特定の鎖を認識及び切断するように誘導する。そのため、一本鎖ガイドRNA(sgRNA)を、DNAの特定の領域に結合し、Casを誘導してDSBを導入するように設計することできる。したがって、遺伝子のヌクレオチド(例えば、DNA又はcDNA)配列が知られていることを条件として、既知のヌクレアーゼ系を利用して、遺伝子に部分的又は完全な欠失を導入することができる。

コード配列の欠失は、連続的であってもよく、又は、コード配列の複数のセクションの欠失を含んでもよい。欠失は、欠失が遺伝子の発現及び/又は活性を破壊するように、すなわち、タンパク質などの機能的な遺伝子産物が遺伝子からもはや産生されないように、十分な量のコード配列を除去すべきである。

分断
遺伝子の発現及び/又は活性を、遺伝子の分断によって破壊してもよい。換言すれば、遺伝子の発現及び/又は活性を破壊する突然変異は、遺伝子を分断する突然変異であってもよい。

本発明の弱毒化ASFVの一実施形態では、EP153R、EP402R及びK145Rの遺伝子をそれぞれ分断してもよい。EP153R遺伝子を分断してもよい。EP402R遺伝子を分断してもよい。K145R遺伝子を分断してもよい。

「分断」とは、機能性遺伝子産物、例えばタンパク質がもはや産生されないように、突然変異が遺伝子のコード配列を変更することを意味する。「分断」という用語は、遺伝子を分断する突然変異を指して本明細書で使用することができる。遺伝子の発現及び/又は活性を破壊する、すなわち、機能性遺伝子産物、例えばタンパク質が遺伝子からもはや産生されないような様式で、突然変異によってコード配列が分断されることが求められる。

分断は、遺伝子のコード配列内の欠失（すなわち、1つ以上のヌクレオチドの除去）を包含し得るが、遺伝子のコード配列内の置換（すなわち、1つ以上のヌクレオチドの置換）及び挿入（すなわち、1つ以上のヌクレオチドの付加）も包含し得る。

分断によって、遺伝子産物の産生を完全に消失させてもよい。例えば、遺伝子産物がタンパク質である場合、分断によってmRNAがナンセンスとなり、その結果、mRNAが分解されること及びタンパク質が翻訳されないことが引き起こされ、それによってタンパク質産生が消失し得る。分断は、産生される遺伝子産物を変更することがある。分断は、遺伝子が転写及び/又は翻訳されないことの原因となり得る。

分断は、点突然変異(すなわち、単一ヌクレオチドの置換、挿入又は欠失)であってもよい。分断は欠失であってもよい。分断は1つ以上のヌクレオチドの挿入であってもよい。遺伝子は、遺伝子の分断につながる多重の突然変異を含んでもよい。

分断は、ヌクレオチドの挿入又は欠失により生じるフレームシフト突然変異であってもよい。フレームシフトは、フレームシフトの下流のコドンが異なるアミノ酸として読み取られることの原因となる。産生されたタンパク質は非機能性となり得る。

分断は、開始コドンの突然変異であってもよい。開始コドンは通常ATGである。開始コドンの突然変異(例えば、1つ、2つ又は3つのヌクレオチドの点突然変異)は、そのコドンで翻訳が開始しないことになることを意味する。翻訳は、更に下流の後続の開始コドンで開始することがある。後続の開始コドンがフレーム中にある場合、N末端が切断されているバージョンのタンパク質が生成され、したがってこれは非機能性となり得る。後続の開始コドンがフレーム中にない場合、まったく異なるタンパク質又はナンセンスタンパク質が生成され、これは非機能性となり得る。後続の開始コドンがない場合、翻訳は完全に消失し、タンパク質は生成されない。

分断は終止コドン(TAG、TAA又はTGA)の突然変異であってもよい。終止コドンの突然変異(ノンストップ突然変異とも呼ばれる)によって、翻訳されるべきではない配列へのmRNAの継続的翻訳が引き起こされる。結果的に生じるタンパク質は、その過剰な長さに起因して非機能性となり得る。

アミノ酸の変化
本発明の弱毒化ASFウイルスの実施形態では、EP402R遺伝子は、EP402Rタンパク質のリガンド結合ドメイン中の1つ以上のアミノ酸を変化させる1つ以上の突然変異を含み得る。EP402Rにおけるアミノ酸の変化は、本明細書に別途記載される。

ASFウイルスにおける突然変異の組合せ
本明細書に記載の遺伝子発現及び/又は活性を破壊する突然変異を、本発明のASFVにおいて組み合わせてもよい。換言すれば、本発明のASFVにおけるEP153R遺伝子及びEP402R遺伝子のそれぞれを、他の遺伝子のいずれかと同じタイプの突然変異によって、又は他の遺伝子のいずれかと異なるタイプの突然変異によって破壊してもよい。更に、K145R遺伝子を、他の遺伝子のいずれかと同じタイプの突然変異によって、又は他の遺伝子のいずれかと異なるタイプの突然変異によって破壊してもよい。

例えば、本発明のASFVでは、EP153Rを完全な欠失によって破壊してもよく、EP402Rをそのリガンド結合ドメイン中のアミノ酸変化によって破壊してもよく、K145Rをプロモーター配列の突然変異によって破壊してもよい。代替の例としてEP153Rを分断によって破壊してもよく、EP402Rを完全な欠失によって破壊してもよく、K145Rを部分的な欠失によって破壊してもよい。

一実施形態では本発明は、
EP153R遺伝子が完全に欠失し、且つ
EP402R遺伝子が、Georgia 2007/1 EP402Rタンパク質(配列番号24)のQ96に相当する、EP402Rタンパク質中の位置でアミノ酸をRに変化させる突然変異を含む、
ASFVを提供する。

一実施形態では本発明は、
EP153R遺伝子及びK145R遺伝子がそれぞれ完全に欠失し、且つ
EP402R遺伝子が、Georgia 2007/1 EP402Rタンパク質(配列番号24)のQ96に相当する、EP402Rタンパク質中の位置でアミノ酸をRに変化させる突然変異を含む、
ASFVを提供する。

一実施形態では本発明は、
EP153R遺伝子が完全に欠失し、且つ
EP402R遺伝子が、Georgia 2007/1 EP402Rタンパク質(配列番号24)のW99に同等のEP402Rタンパク質中の位置でアミノ酸をDに変化させる突然変異を含む、
ASFVを提供する。

一実施形態では本発明は、
EP153R遺伝子及びK145R遺伝子がそれぞれ完全に欠失し、且つ
EP402R遺伝子が、Georgia 2007/1 EP402Rタンパク質(配列番号24)のW99に同等のEP402Rタンパク質中の位置でアミノ酸をDに変化させる突然変異を含む、
ASFVを提供する。

一実施形態では本発明は、EP153R遺伝子及びK145R遺伝子がそれぞれ完全に欠失し、配列番号33の配列を含むEP402Rタンパク質を含む、ASFVを提供する。

一実施形態では本発明は、EP153R遺伝子、EP402R遺伝子及びK145R遺伝子がそれぞれ完全に欠失しているASFVを提供する。

一実施形態では本発明は、
EP153R遺伝子及びK145R遺伝子がそれぞれ完全に欠失していること、及び
EP402R遺伝子が、EP402Rタンパク質のQ96をRに変化させる突然変異を含むことを除いて、
ASFVゲノムがGeorgia 2007/1株のゲノムと同一である、
ASFVを提供する。

一実施形態では本発明は、ASFVであって、EP153R遺伝子及びK145R遺伝子がそれぞれ完全に欠失しており、且つ配列番号33の配列を含むEP402Rタンパク質を含み、ここで、ASFVのゲノムはGeorgia 2007/1株のゲノムに相当する、ASFVを提供する。

医療用途、ワクチン及び医薬組成物
本発明は、対象において疾患の治療及び/又は予防に使用するための本発明のASFウイルスを提供する。本発明はまた、対象において疾患を治療及び/又は予防するための医薬の製造のための、本発明のASFウイルスの使用も提供する。適切には疾患はアフリカ豚熱である。

本発明はまた、本発明の弱毒化ASFウイルスを含むワクチンを提供する。

本明細書で使用される「ワクチン」という用語は、対象に投与された場合に防御免疫応答を誘導又は刺激する調剤を指す。一部の実施形態では、本発明のワクチンは、部分防御免疫応答を誘導する。一部の実施形態では、ワクチンは、ASF症状の重症度及び/又は持続期間を軽減するが、ASF症状を完全には消失させない。ワクチンは、生物体を特定の疾患、本件ではASFに対して免疫性にすることができる。したがって、本発明のワクチンは、その後に行うASFウイルスチャレンジに対して防御的である免疫応答を対象において誘導する。本発明の弱毒化ASFVを含むワクチンは、複数のASFウイルス遺伝子型に対する交差防御免疫応答を誘導し得る。一実施形態では、単一遺伝子型の本発明の弱毒化ASFVを含むワクチンは、複数のASFウイルス遺伝子型に対する交差防御免疫応答を誘導できてもよい。

ワクチンは、複数の弱毒化ASFウイルスを含んでもよい。複数の弱毒化ASFウイルスは、複数の様々な分離株、例えば、病原性が高い又は不明の様々な分離株に相当し得る。そのようなワクチンは、複数のASFウイルス遺伝子型に対する交差防御免疫応答を誘導できてもよい。

ワクチンは、アフリカ豚熱を予防する上で有用であり得る。したがって、本発明は、対象においてアフリカ豚熱の治療及び/又は予防に使用するための本発明のワクチンを提供する。

本発明はまた、本発明の1つ以上の弱毒化ASFウイルスを含む医薬組成物も提供する。医薬組成物は、アフリカ豚熱を治療するために使用され得る。

ワクチン又は医薬組成物は、本発明のうちの1つ以上の弱毒化ASFウイルス並びに、場合により1つ以上のアジュバント、賦形剤、担体及び希釈剤を含んでもよい。医薬賦形剤、担体又は希釈剤の選択は、意図する投与経路及び標準的な薬務に関連して選択することができる。医薬組成物は、担体、賦形剤又は希釈剤として(又はそれらに加えて)、適切な任意の結合剤、滑沢剤、懸濁化剤、コーティング剤、可溶化剤及び他の担体剤を含んでもよい。医薬組成物は通常、製造及び貯蔵の条件下で無菌且つ安定であることが求められる。非経口投与用の製剤には、限定するものではないが、懸濁剤、液剤、油性又は水性ビヒクル中のエマルジョン、ペースト剤、埋込型徐放性又は生分解性製剤が含まれる。無菌の注射用製剤は、非毒性で非経口的に許容される希釈剤又は溶媒を使用して調製してもよい。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される分散剤、湿潤剤、懸濁剤、等張剤、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、担体、賦形剤、塩、又は用いられる投薬量及び濃度で対象にとって無毒である安定剤を含んでもよい。好ましくは、そのような組成物は、例を挙げると非経口(例えば、皮下、皮内又は静脈内注射)又は髄腔内投与ための、投与の所与の方法及び/又は部位に適合する、疾患の治療に使用するための薬学的に許容される担体又は賦形剤を更に含むことができる。

ワクチン又は医薬組成物は、1つ以上の本発明の弱毒化ASFウイルスを有効量で含み得る。

一実施形態では、本発明は、対象に投与された場合に、病原性ASFウイルスによるその後に行うチャレンジに対して防御的である免疫応答を誘導する、本発明の弱毒化ASFウイルスを提供する。一実施形態では、本発明は、対象に投与された場合に、ワクチンの弱毒化ASFウイルスとは異なる遺伝子型の病原性ASFウイルスによるその後に行うチャレンジに対して防御的である免疫応答を誘導する、本発明の弱毒化ASFウイルスを提供する。一実施形態では、本発明は、対象に投与された場合に、任意の遺伝子型の病原性ASFウイルスによるその後に行うチャレンジに対して防御的である免疫応答を誘導する、本発明の弱毒化ASFウイルスを提供する。したがって、本発明は、アフリカ豚熱の治療及び/又は予防に使用するための弱毒化ASFウイルスを含むワクチンを提供し、この場合、アフリカ豚熱は、ワクチンのASFウイルスとは異なる遺伝子型のASFウイルスによって引き起こされる。一実施形態では、本発明は、アフリカ豚熱の治療及び/又は予防に使用するための弱毒化ASFウイルスを含むワクチンを提供し、この場合、アフリカ豚熱は任意の遺伝子型のASFウイルスによって引き起こされる。一実施形態では、ワクチンのASFウイルスは、遺伝子型II、例えばGeorgia 2007/1株に相当し、ワクチンは、I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X及び/又はXIVの遺伝子型による感染に対し防御的である。一実施形態では、ワクチンのASFウイルスは、遺伝子型II、例えばGeorgia 2007/1株に相当し、ワクチンは、I、IX、X、XIV、及び/又はVIIIの各遺伝子型による感染に対し防御的である。一実施形態では、ワクチンのASFウイルスは、遺伝子型II、例えばGeorgia 2007/1株に相当し、ワクチンは、I、IX及び/又はXの遺伝子型による感染に対し防御的である。

予防/治療の方法
本発明はまた、本発明の弱毒化ウイルス、ワクチン又は医薬組成物の有効量を対象に投与することによって、対象においてASFを予防及び/又は治療する方法も提供する。

「予防する」という用語は、ASFの感染を防ぐこと、遅延させること、妨害すること又は妨げることを指すことを意図している。ワクチンは、例えば、感染性ASFVが細胞に侵入する可能性を予防又は低減し得る。ワクチンは、ASF症状の重症度及び/又は持続期間を軽減し得る。ワクチンは、ASF症状を完全に消失させ得る。

「治療する」という用語は、現存のASF感染の少なくとも1つの症状を軽減又は緩和することを指すことを意図している。

対象は、ASF感染に感受性のある任意の動物とし得る。ASF感受性動物には、家畜のブタ、イボイノシシ、カワイノシシ及びダニが含まれる。

本発明に従ってワクチン接種される対象は、家畜のブタとし得る。

適切には、本明細書で定義される防御免疫は、ワクチン接種された母親などのワクチン接種された対象から初乳を与えられた子ブタに付与され得る。

投与
本発明のワクチンを、簡便な任意の経路によって、例えば筋肉内注射によって投与することができる。他の適切な投与経路には、鼻腔内、経口、皮下、経皮及び膣(例えば、人工授精中)が含まれる。一実施形態では、経口投与は、ワクチンを動物飼料又は飲料水に添加することを含む。別の実施形態では、ワクチンを、野生動物用の餌、例えばイノシシ、野生のブタ、カワイノシシ又はイボイノシシに適した餌に添加してもよい。

ブタの免疫の用量は、ブタ1匹当たり約10³～約10⁶ HAD₅₀又はTCID₅₀としてもよい。ブタの免疫の用量は、ブタ1匹当たり約10³から約10⁶ TCID₅₀としてもよい。ブタの免疫の用量は、ブタ1匹当たり10⁴ HAD₅₀又はTCID₅₀未満としてもよい。例えば、用量は、10²～10³の間のHAD₅₀又はTCID₅₀としてもよい。用量は、ブタ1匹当たり約10² HAD₅₀又はTCID₅₀とし得る。用量は、獣医の健全な判断の範囲内で獣医が決定してよい。

ワクチンはプライムブーストレジーム（prime-boost regime）に従って投与してもよい。例えば、第1の接種の後、しばらく(例えば、約7、14、21又は28日)の後、対象は第2のブースト投与を受けることができる。通常、ブースト投与はプライミング投与よりも高用量である。ブースト用量は、ブタ1匹当たり約10³～約10⁶ HAD₅₀又はTCID₅₀とし得る。ブースト用量は、ブタ1匹当たり約10³～約10⁶ TCID₅₀とし得る。

ウイルスの調製方法
本発明はまた、本発明のASFウイルスを生成する方法であって、EP402Rタンパク質のリガンド結合ドメイン中の1つ以上のアミノ酸を変化させることを含み、ここで、アミノ酸変化がEP402Rタンパク質のリガンド結合を破壊している、方法も提供する。

本発明はまた、ASFウイルスが血球吸着を誘導する能力を減少させる方法であって、EP402Rタンパク質のリガンド結合ドメイン中の1つ以上のアミノ酸変化を変化させることを含み、ここで、アミノ酸変化がEP402Rタンパク質のリガンド結合を破壊している、方法も提供する。

EP402Rのリガンド結合ドメインにおけるアミノ酸変化は、本明細書に記載のアミノ酸変化のいずれであってもよい。そのようなアミノ酸変化は、本明細書に記載のようにASFVゲノムを突然変異させることによってなし得る。

一実施形態では、方法は、Georgia 2007/1 EP402Rタンパク質(配列番号24)のQ96及び/又はW99に相当する位置で、EP402Rタンパク質中の1つ以上のアミノ酸を変化させることを含む。

本発明はまた、EP153R遺伝子及びEP402R遺伝子の発現及び/又は活性を破壊することを含む、ASFウイルスを弱毒化する方法も提供する。適切には、方法は、EP153R遺伝子及び/又はEP402R遺伝子が血球吸着を媒介する能力を破壊することを含む。

遺伝子発現及び/又は活性の破壊は、本明細書に記載の方法のいずれかでASFVゲノムに突然変異を起こさせることによって達成することができる。

一実施形態では、方法は、ASFウイルスにDIVA突然変異を導入することを更に含む。適切には、DIVA突然変異はK145R遺伝子の発現を破壊する。適切には、K145Rは少なくとも部分的に欠失している、好ましくは完全に欠失している。適切には、K145R遺伝子は分断されている。適切には、DIVA突然変異はB125R遺伝子の発現を破壊する。適切には、B125Rは少なくとも部分的に欠失している、好ましくは完全に欠失している。適切には、B125R遺伝子は分断されている。

ASFVを生成及び/又は弱毒化する方法の一実施形態では、EP153R遺伝子は、少なくとも部分的に欠失している、好ましくは完全に欠失している。一実施形態ではEP153R遺伝子は分断されている。

ASFVを生成及び/又は弱毒化する方法の一実施形態では、EP402R遺伝子は、少なくとも部分的に欠失している、好ましくは完全に欠失している。一実施形態ではEP402R遺伝子は分断されている。適切には、方法は、1つ以上の突然変異を含まない相当するASFウイルスと比較して、EP402Rタンパク質の表面発現を減少させる1つ以上の突然変異をEP402R遺伝子に導入することを含む。適切には、方法は、EP402Rタンパク質によるリガンド結合を破壊する1つ以上の突然変異をEP402R遺伝子に導入することを含む。適切には、方法は、EP402Rタンパク質のリガンド結合ドメイン中の1つ以上のアミノ酸を変化させる1つ以上の突然変異をEP402R遺伝子に導入することを含む。適切には、1つ以上のアミノ酸は異なるアミノ酸に変化している。適切には、アミノ酸を異なるアミノ酸に変化させることは、EP402R上の結合表面を変化させることによって、EP402Rとそのリガンドとの間の相互作用を直接阻害する。

一実施形態では、方法は、Georgia 2007/1 EP402Rタンパク質(配列番号24)のQ96及び/又はW99に相当する位置で、EP402Rタンパク質中のアミノ酸を変化させることを含む。適切には、Georgia 2007/1 EP402Rタンパク質(配列番号24)のQ96に相当する位置のEP402Rタンパク質のアミノ酸はRに若しくはRの保存的置換であるアミノ酸に変化し、及び/又はGeorgia 2007/1 EP402Rタンパク質(配列番号24)のW99に相当する位置のアミノ酸はDに若しくはDの保存的置換であるアミノ酸に変化している。適切には、Q96に相当する位置のアミノ酸はH、K若しくはRに変化し、及び/又はW99に相当する位置のアミノ酸はD、E、N若しくはQに変化している。適切には、Q96に相当する位置のアミノ酸はRに変化し、及び/又はW99に相当する位置のアミノ酸はDに変化している。

一実施形態では本発明は、EP153R遺伝子及びK145R遺伝子のそれぞれを完全に欠失させること、Georgia 2007/1 EP402Rタンパク質(配列番号24)のQ96に相当する位置で、アミノ酸をRに変化させること、並びに/又はGeorgia 2007/1 EP402Rタンパク質(配列番号24)のW99に相当する位置で、アミノ酸をDに変化させることを含む、ASFウイルスを弱毒化する方法を提供する。一実施形態では本発明は、EP153R遺伝子及びK145R遺伝子のそれぞれを完全に欠失させること、並びにGeorgia 2007/1 EP402Rタンパク質(配列番号24)のQ96に相当する位置で、アミノ酸をRに変化させることを含む、ASFウイルスを弱毒化する方法を提供する。

一実施形態では本発明のASFウイルスを生成及び/又は弱毒化する方法は、任意の遺伝子型のASFウイルス(すなわち、遺伝子型I～XXIVのいずれかのASFウイルス)に適用することができる。換言すれば、任意の遺伝子型のASFウイルスが、本発明の方法の改変の対象であり得る。任意の遺伝子型のASFウイルスを方法において使用することができる。一実施形態では本発明のASFウイルスを生成及び/又は弱毒化する方法は、遺伝子型IIのASFウイルスに適用することができる。一実施形態では本発明のASFウイルスを生成及び/又は弱毒化する方法は、Georgia 2007/1株のASFウイルスに適用することができる。

一実施形態では本発明は、EP153R遺伝子及びK145R遺伝子のそれぞれを完全に欠失させること、Georgia 2007/1 EP402Rタンパク質(配列番号24)のQ96をRに変化させること、並びに/又はGeorgia 2007/1 EP402Rタンパク質(配列番号24)のW99をDに変化させることを含む、Georgia 2007/1株のASFウイルスを弱毒化する方法を提供する。一実施形態では本発明は、EP153R遺伝子及びK145R遺伝子のそれぞれを完全に欠失させること、及びGeorgia 2007/1 EP402Rタンパク質(配列番号24)のQ96をRに変化させることを含む、Georgia 2007/1株のASFウイルスを弱毒化する方法を提供する。

ウイルス遺伝子の突然変異の方法は当技術分野で知られている。特に、ウイルス遺伝子の欠失の方法は当技術分野で知られている。例えば、相同組換えを使用することができるが、この場合、関連する遺伝子を欠いている状態でトランスファーベクターを創り出し、これを使用してウイルス感染細胞にトランスフェクトする。配列の新規の部分を発現する組換えウイルスを次いで選択してもよい。例えばATG開始コドンの欠失により、遺伝子発現を分断するために、同様の手順を使用することができる。

一部の実施形態では、ASFウイルスを弱毒化する方法は、以下の遺伝子: MGF 110 3L、6L、7L、8L、10L、11L及び12L; MGF 360 5L、6L、7L、10L、11L、12L、13L、14L、20R、21R及び22R;並びにMGF 505 1R、2R及び6Rのうちの1つ以上の機能を保持することを含み得る。適切には、以下の遺伝子のうちの2つ以上、例えば3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上、9つ以上、10以上、11以上、12以上、13以上、14以上、15以上、16以上、17以上、18以上、19以上、20以上、21又は22の機能が保持される:MGF 110 3L、6L、7L、8L、10L、11L及び12L; MGF 360 5L、6L、7L、10L、11L、12L、13L、14L、20R、21R及び22R;並びにMGF 505 1R、2R及び6R。一実施形態では、ASFウイルスを弱毒化する方法は、以下の遺伝子:MGF 110 3L、6L、7L、8L、10L、11L及び12L; MGF 360 5L、6L、7L、10L、11L、12L、13L、14L、20R、21R及び22R;並びにMGF 505 1R、2R及び6Rの全ての機能を保持することを含み得る。

遺伝子の「機能を保持する」とは、弱毒化プロセスの間、遺伝子の発現及び活性が影響を受けないことを意味する。結果として得られる弱毒化ウイルスは、遺伝子の機能性バージョンを発現するはずである。適切には、機能が保持されることになる遺伝子は、弱毒化の方法によって変更されない。適切には、機能が保持されることになる遺伝子の配列は、弱毒化の方法によって変更されない。

本開示は、本明細書において開示される例示の方法及び材料によって限定されるものではなく、本開示の実施形態を実践又は試験するにあたって、本明細書に記載のものと類似する又は等価である任意の方法及び材料を使用することができる。数値範囲は、範囲を定義する数値を包括する。別途記載のない限り、それぞれ、任意の核酸配列は左から右に5'から3'方向で記載されており、アミノ酸配列は左から右にアミノからカルボキシの方向で記載されている。

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「a」、「an」及び「the」は、文脈が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。

本明細書において使用される「含む(comprising)」、「含む(comprises)」及び「で構成される(comprised of)」という用語は、「含む(including)」、「含む(includes)」又は「含有する(containing)」、「含有する(contains)」と同義であり、包含的又はオープンエンドであり、さらなる記載されていないメンバー、要素又は方法のステップを除外するものではない。「含む(comprising)」、「含む(comprises)」及び「で構成される(comprised of)」という用語はまた、「からなる(consisting of)」という用語を含む。

本明細書で論議される刊行物は、本出願の出願日前の刊行物の開示のためにのみ提供されるものである。本明細書には、そのような刊行物が、本明細書に添付の特許請求の範囲に対して先行技術を構成すると認めたものと解釈されるべき記載はない。

更なる態様
本発明はまた、以下の番号付きパラグラフ(パラ)で定義される更なる態様も提供する。
1. EP153R遺伝子及びK145R遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されている弱毒化アフリカ豚熱(ASF)ウイルス。
2. EP402Rの発現及び/又は活性が破壊されていない、パラ1に記載の弱毒化ASFウイルス。
3. 以下の遺伝子:
多重遺伝子族(MGF) 110 3L、6L、7L、8L、10L、11L及び12L、
MGF 360 5L、6L、7L、10L、11L、12L、13L、14L、20R、21R及び22R、並びに
MGF 505 1R、2R及び6R
のうちの1つ以上の機能性バージョンを含む、パラ1又は2に記載の弱毒化ASFウイルス。
4. K145R遺伝子は少なくとも部分的に欠失している、好ましくは完全に欠失している、いずれかの先行パラに記載の弱毒化ASFウイルス。
5. K145R遺伝子は分断されている、パラ4に記載の弱毒化ASFウイルス。
6. EP153R遺伝子は少なくとも部分的に欠失している、好ましくは完全に欠失している、いずれかの先行パラに記載の弱毒化ASFウイルス。
7. EP153R遺伝子は分断されている、いずれかの先行パラに記載の弱毒化ASFウイルス。
8. EP153R及びK145R以外の全てのASFウイルス遺伝子の機能性バージョンを含む、いずれかの先行パラに記載の弱毒化ASFウイルス。
9. 弱毒化ASFウイルスのゲノムは遺伝子型IIに相当するか又は本質的に相当する、いずれかの先行パラに記載の弱毒化ASFウイルス。
10. 弱毒化ASFウイルスのゲノムはGeorgia 2007/1株のゲノムに相当するか又は本質的に相当する、パラ9に記載の弱毒化ASFウイルス。
11. 対象において疾患の治療及び/又は予防に使用するためのパラ1から10のいずれかに記載のASFウイルス。
12. 対象において疾患を治療及び/又は予防するための医薬の製造のための、パラ1から10のいずれかに記載のASFウイルスの使用。
13. パラ1から10のいずれかに記載のASFウイルスを含む医薬組成物。
14. 対象において疾患の治療及び/又は予防に使用するためのパラ13に記載の医薬組成物。
15. 疾患はアフリカ豚熱である、パラ11に記載の使用のためのASFウイルス、パラ12に記載のASFウイルスの使用、又はパラ14に記載の使用のための医薬組成物。
16. パラ1から10のいずれかに記載のASFウイルスを含むワクチン。
17. 対象においてアフリカ豚熱の治療及び/又は予防に使用するためのパラ16に記載のワクチン。
18. アフリカ豚熱は、ワクチンのASFウイルスとは異なる遺伝子型のASFウイルスによって引き起こされる、パラ17に記載の使用のためのワクチン。
19. パラ13に記載の医薬組成物又はパラ16に記載のワクチンの有効量を対象に投与するステップを含む、対象においてアフリカ豚熱を治療及び/又は予防する方法。
20. 対象は家畜のブタである、パラ11に記載の使用のためのASFウイルス、パラ12に記載のASFウイルスの使用、パラ14に記載の使用のための医薬組成物、パラ17に記載の使用のためのワクチン、又はパラ19に記載の方法。
21. ワクチンはプライムブーストレジームに従って投与される、パラ17、18若しくは20のいずれかに記載の使用のためのワクチン、又は請求項19若しくは20に記載の方法。
22. EP153R遺伝子及びEP402R遺伝子の発現及び/又は活性を破壊することを含む、ASFウイルスを弱毒化する方法。
23. K145R遺伝子は少なくとも部分的に欠失している、好ましくは完全に欠失している、パラ22に記載の方法。
24. K145R遺伝子は分断されている、パラ23に記載の方法。
25. EP153R遺伝子は少なくとも部分的に欠失している、好ましくは完全に欠失している、パラ22から24のいずれかに記載の方法。
26 .EP153R遺伝子は分断されている、パラ22から25のいずれかに記載の方法。

ここで、本発明を実施例によって更に説明するが、実施例は当業者の本発明の実施を補助することを意味するものであって、本発明の範囲をいかようにも制限することを意図するものではない。

[実施例]
[実施例1]
HADを減少させるEP402R/CD2v突然変異型の特定
突然変異を、アフリカ豚熱ウイルス(ASFV)Benin分離株EP402Rタンパク質(CD2v)で行い、血球吸着(HAD)に及ぼすそれらの影響について試験した。

CD2vの細胞外N末端IgG様、リガンド結合ドメインのモデルを生成し、これを使用してCD2vのそのリガンドへの結合に関与する機能性アミノ酸残基を予測した。これらの残基を個別に突然変異させて、一連の突然変異型CD2vタンパク質を生成した。

Vero細胞に、T7RNAポリメラーゼを発現する改変ワクシニアウイルスAnkaraを感染させ、C末端HAエピトープタグを備える野生型又は突然変異型CD2v完全長タンパク質を発現するプラスミド(pcDNA3)をトランスフェクトした。ブタ赤血球を添加し、表面への赤血球の付着について細胞を観察した。野生型又は突然変異型CD2vタンパク質の発現を、透過処理細胞を使用する共焦点顕微鏡と、HAタグを認識する抗体及び二次抗体を使用するウェスタンブロッティングの両方によって確認した。野生型又は突然変異型CD2vの細胞表面発現はまた、野生型CD2v遺伝子を含有する弱毒化ASFVで免疫したブタからの血清と、それに続く二次抗体で非透過処理細胞を染色することによっても確認した(図1)。

Benin CD2vの残基E99又はY102の突然変異によって、HADが抑制された。図2に、HADアッセイからの例示的画像を示す。図2Aに、野生型Benin CD2vを発現するプラスミドをトランスフェクトした細胞を示す。赤血球のHADが3個の細胞の周囲に見られる。図2Bに、Y102残基がDに突然変異したCD2vを発現する細胞を示す。1つの細胞の周囲に部分的なHADが見られる。図2Cに、残基E99がRに突然変異したCD2vを発現する細胞を示す。HADは見られない。

Benin CD2vの残基E99は、種々の遺伝子型の様々なASFV分離株由来のCD2vリガンド結合ドメインのアミノ酸配列のアラインメントによって示されるように、ASFVにおいて強く保存されている(図3)。他の分離株(図3で黄色で強調表示)の相当する残基は、同一(E)であるか又は同じ電荷(Q)を有するか、いずれかである。

Georgia CD2vのBenin CD2vE99に相当する残基Q96をRに突然変異させ、突然変異タンパク質がHADを誘導する能力について、上記のHADアッセイを使用して試験した(Vero細胞のプラスミドから発現した野生型及び変異型CD2vタンパク質)。Georgia CD2vにおけるQ96の突然変異によって、HADが抑制された。図4に、ブタ赤血球によるVero細胞のHADアッセイからの例示的画像を示す。図4Aに、野生型Benin CD2vを発現するプラスミドをトランスフェクトしたVero細胞を示す。赤血球のHADが4個の細胞の周囲に見られる。図4Bに、野生型Georgia CD2vを発現するVero細胞を示す。HADが2個の細胞の周囲に見られる。図4Cに、残基Q96がRに突然変異したGeorgia CD2vを発現するVero細胞を示す。HADは見られない。図4Dに、非トランスフェクトVero細胞を示す。HADは見られない。

同じアッセイを使用して、以下の突然変異がBeninのHADに影響すると判定した: N16R、I 19R、W21D、Y 76D、E99R、Y102D。加えて、E99R + N108Rの組合せによって、BeninのHADに影響すると判定した。

以下の突然変異がGeorgiaのHADに影響すると判定した: S15R、W19D、Q96R、N104R及びK108D。加えて、S15R + W19D及びQ96R + N104Rの組合せが、GeorgiaのHADに影響すると判定した。

以下の突然変異が、N10遺伝子型IXのHADに影響すると判定した: W20D、R125D、Q112R + N121R。

[実施例2]
DIVAマーカーのスクリーニング
遺伝子がワクチン接種動物からの感染動物の区別(DIVA)のマーカーとして機能するためには、遺伝子から発現されるタンパク質は免疫原性である必要がある。換言すれば、DIVAタンパク質を発現するウイルスに感染した対象は、DIVAタンパク質を特異的に結合する抗体を必然的に産生する。このようにして、DIVAワクチン(DIVAマーカー遺伝子を欠くウイルス)をワクチン接種した動物を、野生型ウイルス(DIVAマーカー遺伝子を発現する)に感染した動物と区別することができる。何故なら、ワクチン接種動物の血清はDIVAマーカータンパク質に対する抗体を含まないことになり、一方、感染動物の血清は、DIVAマーカータンパク質に対する抗体を含むことになるからである。

DIVAマーカーとして機能する可能性のあるASFV遺伝子の選択を、細胞中で各遺伝子を発現させることによって、及び産生されたタンパク質が以前にASFVに感染していたブタから採取した血清によって検出することが可能かどうかを試験することによって、スクリーニングした。血清による検出は、感染ブタにおいてASFVによって発現されたタンパク質が感染ブタにおいて抗体応答を誘導していたことを示し得る。したがって、そのようなタンパク質をDIVAマーカーの候補とした。

特に、HA又はV5エピトープタグに融合された個々のASFV遺伝子(既知の必須遺伝子を除いて)をコードする71のプラスミドを、Vero細胞にトランスフェクトした。細胞を固定し、透過処理し、ASFVの様々な株に感染させたブタからの抗血清で染色し、これに続いて、蛍光標識二次抗体で染色した。共焦点顕微鏡を使用して、発現遺伝子が血清によって検出可能かどうかを評価した。並行して、細胞を、ASFV遺伝子に融合されたHA又はV5タグに対する抗体及び異なる蛍光標識二次抗体で染色して、タンパク質の発現を確認した。

細胞を染色するのに使用したブタ血清は、以下のASFV株で免疫した免疫研究のブタからのものとした: BeninΔDP148R(5匹のブタ)、BeninΔMGF(6匹のブタ)、OURT88/3(5匹のブタ)及びGeorgiaΔMGF(4匹のブタ)。各ブタについて、免疫前の血清試料(対照として)及び免疫後、チャレンジ前の血清試料を使用した。

遺伝子の一次スクリーニングを、BeninΔDP148Rで免疫したブタからの血清を使用して実施した(0日目からの免疫前血清、免疫後38日目からの免疫後血清)。ASFVのCP204L、B646L及びE183Lの遺伝子を陽性対照として使用し、免疫後の血清を使用して検出した。免疫前の血清ではなんらの遺伝子も検出されなかった。

下の表7に示すように、BeninΔDP148R免疫後血清を使用することで、6つのASFV遺伝子が検出された(++は強い検出を指示し、+は弱い検出を指示し、-は検出されないことを指示する)。

次いで、一次スクリーニングで検出した6つのASFV遺伝子を、他の3つの免疫研究からのブタ血清で試験した。

下の表8に、BeninΔMGFウイルスで免疫した6匹のブタからの免疫後血清を使用したASFV遺伝子の検出を示す(15日目にブースト、免疫後38日目に採取の免疫後血清;免疫前血清は陰性であった)。

下の表9に、OURT88/3ウイルスで免疫した5匹のブタからの免疫後血清を使用したASFV遺伝子の検出を示す(免疫後20日目に採取の免疫後血清;免疫前血清はブタ2を除いて陰性であった)。

下の表10に、GeorgiaΔMGFウイルスで免疫した4匹のブタからの免疫後血清を使用したASFV遺伝子の検出を示す(免疫後34日目に採取した免疫後血清;-3日目に採取した免疫前血清は陰性であった)。2匹のブタ(A)を10³ GeorgiaΔMGFで免疫した。2匹のブタ(B)を10⁴ GeorgiaΔMGFで免疫した。

K145Rタンパク質は血清の65%で検出され、B125Rは血清の75%で検出された。B125R、B175L、E184L、H339R、K145R、及びM448Rの遺伝子のそれぞれを個別に欠失させた。B175L、E184L、H339R、又はM448Rの遺伝子を欠失させることはできなかったが、これは、それらの遺伝子はウイルス複製にとって必須であることを示唆する。したがって、スクリーニングにより、K145R遺伝子及びB125R遺伝子を最も有望な可能性のあるDIVAマーカーとして特定した。

図5に、細胞中で発現したK145R及びB125Rを示す。Vero細胞に、インフレームで融合させたHAエピトープタグを備えるK145R又はB125Rを発現するプラスミドをトランスフェクトした。発現タンパク質を、HAに対する抗体を使用して透過処理細胞において検出し、共焦点顕微鏡を使用して画像化した。緑色の染色は発現タンパク質を示し、青色のDAPI染色はDNAを検出する。図5AにK145Rを示し、図5BにB125Rを示す。

図6に、Vero細胞で発現し、ASFVで免疫したブタからの抗血清によって検出したK145R(図6A)及びB125R(図6B)のスクリーニングプロセスの例を示す。細胞を固定し、透過処理し、発現タンパク質を検出するために抗HA(赤色)で染色し、弱毒化遺伝子型I Benin97/1遺伝子欠失ASFV株(緑色)で免疫したブタからの血清で染色した。免疫前及び免疫後38日目に採取した血清で染色した細胞の画像を示す。DNAは青色に染色されている。

[実施例3]
非HAD ASFV GeorgiaΔK145RΔEP153RCD2vQ96Rの生成
上の実施例に記載の発見に基づいて、K145R遺伝子及びEP153R遺伝子が欠失し、EP402R/CD2vタンパク質がQ96Rアミノ酸置換を含むように突然変異された、ASFVを生成した。Georgia 2007/1株(ASFV遺伝子型IIの株)を使用した。したがって、上記ASFVをGeorgiaΔK145RΔEP153RCD2vQ96Rとする。

GeorgiaΔK145RΔEP153RCD2vQ96RがHADを誘導する能力について試験した。ブタ骨髄細胞にGeorgiaΔK145RΔEP153RCD2vQ96R又は対照として野生型Georgia 2007/1を感染させ、ブタ赤血球を添加し、表面への赤血球の付着について細胞を観察した。HADが、感染後1日目で野生型Georgia 2007/1に感染した細胞で観察された(図7A -感染細胞の周囲に赤血球が蓄積)、一方、HADは、感染後1日目でGeorgiaΔK145RΔEP153RCD2vQ96Rに感染した細胞で観察されなかった(図7B)。

[実施例4]
Georgia ΔK145RΔEP153RCD2vQ96Rは弱毒化されており且つチャレンジに対する防御を誘導する
ワクチン接種実験プロトコル
7週齢の体重17～19kgの範囲の6匹の大ヨークシャー種(Large White)/ランドレース種ブタの群(K群)を、GeorgiaΔK145RΔEP153RCD2vQ96Rで1ml中に10⁴ TCID₅₀で筋肉内経路によって免疫し、同じ用量で同じ経路によって21日後にブーストした。更に18日後、K群の免疫ブタ及び3匹の非免疫ブタの対照群(M群)を、病原性遺伝子型II ASFウイルスGeorgia 2007/1で1ml中に10³ TCID₅₀で筋肉内経路によってチャレンジした。更に20日後、ブタを終了させた。本実験プロトコルを図8に表す。

体温及び臨床スコア
ブタの体温(図9)及び臨床スコア(図10)について、標準スコアリングシステム(Kingら、2011)を使用して毎日記録した。臨床スコアには体温及びその他の徴候、例えば食欲不振又は嗜眠が含まれる。

非免疫ブタの対照M群は、チャレンジ後4日目から、体温の上昇(図9A)並びに食べない及び嗜眠を含めて急性ASFVの典型的なその他の臨床的徴候を発生し、チャレンジ後6日目に重症度が中等度のエンドポイントで安楽死させた(図10A)。

免疫K群のブタの内2匹は、免疫後11日目に始まって2日間、40.6を超える体温の一時的な上昇を有した(図9B)。K群のこれらのブタ及び他の全てのブタは、ブースト後又はチャレンジ後に他の臨床的徴候をまったく示さなかった(図10B)。

上記の研究は、K145Rの欠失は直接的な最小弱毒化効果を有していたことを示す。

ウイルス血症のデータを図15に示す。

死後の肉眼的病変のスコアリング
剖検では、標準化スコアリングシステムに従って、様々な臓器及び腔の肉眼的病変をスコア化した。図11において、スコアをy軸に示し、ブタの番号をx軸に示す。K群からのブタ(GeorgiaΔK145RΔEP153RCD2vQ96Rで免疫)はほとんど病変を示さなかったが、この病変とは主にわずかに拡大した腎臓又は顎下のリンパ節であった。対照的に、M群の対照非免疫ブタは、拡大した出血性リンパ節及び拡大した脾臓を始めとした急性ASFVの典型的な病変を有していた。

免疫ブタの抗体応答
免疫前の様々な日に並びに免疫、ブースト及びチャレンジ後の様々な日にK群のブタから採取した血清を、市販の競合ELISAアッセイを使用して、主要なASFVカプシドタンパク質VP72/B646Lに対する抗体のレベルについて試験した。図12において、ブロッキングの%をy軸に示し、免疫後の日数をx軸に示す。個々のブタのデータは、異なる色で示されている。灰色の線は、陽性血清の検出用に製造業者によって指示されたカットオフ値を示す。結果は、免疫後14日目までに全てのブタについて値は陽性であり、レベルが実験の間維持されたプラトーに達したことを示す。

細胞性免疫応答
GeorgiaΔK145RΔEP153RCD2vQ96Rによる免疫前、ブースト前及びGeorgia 2007/1ウイルスによるチャレンジ前に、K群のブタから末梢血単核細胞(PBMC)を採取した。PBMCをASFVで刺激し、ASFVに対する細胞性免疫応答の指標としてインターフェロンガンマ産生細胞の数を測定した(図13)。

PBMCを、モック刺激(青色バー)又はASFV遺伝子型I Benin97/1感染性ウイルス(赤色バー)若しくはASFV遺伝子型II Georgia 2007/1ウイルス(緑色バー)で刺激した。インターフェロンガンマ産生細胞の数を測定し、y軸に10⁶個細胞あたりで示す。ブタの番号をx軸に示す。結果は、予想通り、免疫前にIFNガンマ産生細胞が非常に低いか又は検出不能であることを示す(図13A)。ブースト前の21日目までに、IFNガンマ産生細胞の数は、刺激に使用したASFVウイルスに応じて、約100～750個の細胞の間の範囲で増加した(図13B)。ASFV刺激に続くIFNガンマ産生細胞の数は、チャレンジ前の39日目で良好なレベルに維持されていた(図13C)。IFNガンマ産生を、遺伝子型Iと遺伝子型IIの分離株の両方によって刺激することで、交差遺伝子型の細胞応答が誘導されたことが示唆された。予想通り、モック刺激は検出可能な応答を引き起こさなかった。

図14に、経時的にGeorgia 2007/1分離株で刺激した後の別々のブタのIFNガンマ産生細胞の数を示す。

上の本明細書において言及した全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の記載の方法及びシステムに関する各種の改変及び変更は、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく当業者にとって明白であろう。本発明を特定の好ましい実施形態に関連付けて説明してきたが、特許請求している発明は、そのような特定の実施形態に不当に制限されるべきものではないことを理解されたい。実際、ウイルス学、分子生物学又は関連分野の当業者であれば明白である、本発明を実施するための記載されている様式の各種改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。

Claims (82)

1. EP153R遺伝子及びEP402R遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されている弱毒化アフリカ豚熱(ASF)ウイルスであって、
   以下の遺伝子:
   多重遺伝子族(MGF) 110 3L、6L、7L、8L、10L、11L及び12L、
   MGF 360 5L、6L、7L、10L、11L、12L、13L、14L、20R、21R及び22R、並びに
   MGF 505 1R、2R及び6R
   のうちの1つ以上の機能性バージョンを含む、弱毒化ASFウイルス。
2. ワクチン接種動物から感染動物を区別する(DIVA)突然変異を更に含む、請求項1に記載の弱毒化ASFウイルス。
3. EP153R遺伝子及びEP402R遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されており、DIVA突然変異を含む、弱毒化ASFウイルス。
4. DIVA突然変異はK145R遺伝子の発現を破壊する、請求項2又は3に記載の弱毒化ASFウイルス。
5. K145R遺伝子は少なくとも部分的に欠失している、好ましくは完全に欠失している、請求項4に記載の弱毒化ASFウイルス。
6. K145R遺伝子は分断されている、請求項4に記載の弱毒化ASFウイルス。
7. EP153R遺伝子は少なくとも部分的に欠失している、好ましくは完全に欠失している、請求項1から6のいずれか一項に記載の弱毒化ASFウイルス。
8. EP153R遺伝子は分断されている、請求項1から6のいずれか一項に記載の弱毒化ASFウイルス。
9. EP153R遺伝子及び/又はEP402R遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されていない相当するASFウイルスと比較して、ASFウイルスが血球吸着を誘導する能力は減少している、請求項1から8のいずれか一項に記載の弱毒化ASFウイルス。
10. EP402R遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されていない相当するASFウイルスと比較して、EP402Rタンパク質の表面発現は減少している、請求項1から9のいずれか一項に記載の弱毒化ASFウイルス。
11. EP402R遺伝子は、EP402Rタンパク質によるリガンド結合を破壊する1つ以上の突然変異を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の弱毒化ASFウイルス。
12. EP402R遺伝子は、EP402Rタンパク質のリガンド結合ドメイン中の1つ以上のアミノ酸を変化させる1つ以上の突然変異を含む、請求項10又は11に記載の弱毒化ASFウイルス。
13. 1つ以上のアミノ酸は異なるアミノ酸に変化している、請求項12に記載の弱毒化ASFウイルス。
14. 異なるアミノ酸への変化が、EP402R上の結合表面を変化させることによって、EP402Rとそのリガンドとの間の相互作用を直接阻害する、請求項13に記載の弱毒化ASFウイルス。
15. 1つ以上の突然変異は、Georgia 2007/1 EP402Rタンパク質(配列番号24)のQ96及び/又はW99に相当する、EP402Rタンパク質中の位置でアミノ酸を変化させる、請求項11から14のいずれか一項に記載の弱毒化ASFウイルス。
16. Q96に相当する位置のアミノ酸はRに若しくはRの保存的置換であるアミノ酸に変化し、及び/又はW99に同等の位置のアミノ酸はDに若しくはDの保存的置換であるアミノ酸に変化している、請求項15に記載の弱毒化ASFウイルス。
17. Q96に相当する位置のアミノ酸はH、K若しくはRに変化し、及び/又はW99に相当する位置のアミノ酸はD、E、N若しくはQに変化している、請求項16に記載の弱毒化ASFウイルス。
18. Q96に相当する位置のアミノ酸はRに変化し、及び/又はW99に相当する位置のアミノ酸はDに変化している、請求項17に記載の弱毒化ASFウイルス。
19. EP402R遺伝子は少なくとも部分的に欠失している、好ましくは完全に欠失している、請求項1から12のいずれか一項に記載の弱毒化ASFウイルス。
20. EP402R遺伝子は分断されている、請求項1から12のいずれか一項に記載の弱毒化ASFウイルス。
21. EP153R及びEP402R以外の全てのASFウイルス遺伝子の機能性バージョンを含む、請求項1又は請求項7から20のいずれか一項に記載の弱毒化ASFウイルス。
22. EP153R、EP402R及びK145R以外の全てのASFウイルス遺伝子の機能性バージョンを含む、請求項1から20のいずれか一項に記載の弱毒化ASFウイルス。
23. 弱毒化ASFウイルスのゲノムは遺伝子型IIに相当するか又は本質的に相当する、請求項1から22のいずれか一項に記載の弱毒化ASFウイルス。
24. 弱毒化ASFウイルスのゲノムはGeorgia 2007/1株のゲノムに相当するか又は本質的に相当する、請求項23に記載の弱毒化ASFウイルス。
25. アミノ酸変化がEP402Rタンパク質のリガンド結合を破壊している、リガンド結合ドメイン中に1つ以上のアミノ酸変化を含むEP402Rタンパク質。
26. Georgia 2007/1 EP402Rタンパク質(配列番号24)のQ96及び/又はW99に相当する位置に1つ以上のアミノ酸変化を含むEP402Rタンパク質。
27. Q96に相当する位置のアミノ酸はRに若しくはRの保存的置換であるアミノ酸に変化し、及び/又はW99に相当する位置のアミノ酸はDに若しくはDの保存的置換であるアミノ酸に変化している、請求項26に記載のEP402Rタンパク質。
28. Q96に相当する位置のアミノ酸はH、K若しくはRに変化し、及び/又はW99に相当する位置のアミノ酸はD、E、N若しくはQに変化している、請求項27に記載のEP402Rタンパク質。
29. Q96に相当する位置のアミノ酸はRに変化し、及び/又はW99に相当する位置のアミノ酸はDに変化している、請求項28に記載のEP402Rタンパク質。
30. 配列番号21から30又は配列番号242から246のいずれかと少なくとも70%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項25から29のいずれか一項に記載のEP402Rタンパク質。
31. 配列番号31、32、33又は379のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項30に記載のEP402Rタンパク質。
32. 請求項25から31のいずれか一項に記載のEP402Rタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
33. 配列番号229から241のいずれかと少なくとも70%の同一性を有する配列を含む、請求項32に記載のポリヌクレオチド。
34. 請求項32又は33に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
35. 請求項25から31のいずれか一項に記載のEP402Rタンパク質を含むASFウイルス。
36. 請求項32又は33に記載のポリヌクレオチドを含むASFウイルス。
37. 請求項25から31のいずれか一項に記載のEP402Rタンパク質又は請求項32若しくは33に記載のポリヌクレオチドを含まない相当するASFウイルスと比較して、ASFウイルスが血球吸着を誘導する能力は減少している、請求項35又は36に記載のASFウイルス。
38. 弱毒化されている、請求項35から37のいずれか一項に記載のASFウイルス。
39. DIVA突然変異を更に含む、請求項35から38のいずれか一項に記載のASFウイルス。
40. DIVA突然変異はK145R遺伝子の発現を破壊する、請求項39に記載のASFウイルス。
41. K145R遺伝子は少なくとも部分的に欠失している、好ましくは完全に欠失している、請求項40に記載のASFウイルス。
42. K145R遺伝子は分断されている、請求項40に記載のASFウイルス。
43. EP153R遺伝子の発現及び/又は活性が破壊されている、請求項35から42のいずれか一項に記載のASFウイルス。
44. EP153R遺伝子は少なくとも部分的に欠失している、好ましくは完全に欠失している、請求項43に記載のASFウイルス。
45. EP153R遺伝子は分断されている、請求項43記載のASFウイルス。
46. ASFウイルスゲノムは遺伝子型IIに相当するか又は本質的に相当する、請求項35から45のいずれか一項に記載のASFウイルス。
47. ASFウイルスゲノムはGeorgia 2007/1株のゲノムに相当するか又は本質的に相当する、請求項46に記載のASFウイルス。
48. 対象において疾患の治療及び/又は予防に使用するための、請求項1から24のいずれか一項又は請求項35から47のいずれか一項に記載のASFウイルス。
49. 対象において疾患を治療及び/又は予防するための医薬の製造のための、請求項1から24のいずれか一項又は請求項35から47のいずれか一項に記載のASFウイルスの使用。
50. 請求項1から24のいずれか一項又は請求項35から47のいずれか一項に記載のASFウイルスを含む医薬組成物。
51. 対象において疾患の治療及び/又は予防に使用するための、請求項50に記載の医薬組成物。
52. 疾患はアフリカ豚熱である、請求項48に記載の使用のためのASFウイルス、請求項49に記載のASFウイルスの使用、又は請求項51に記載の使用のための医薬組成物。
53. 請求項1から24のいずれか一項又は請求項35から47のいずれか一項に記載のASFウイルスを含むワクチン。
54. 対象においてアフリカ豚熱の治療及び/又は予防に使用するための、請求項53に記載のワクチン。
55. アフリカ豚熱は、ワクチンのASFウイルスとは異なる遺伝子型のASFウイルスによって引き起こされる、請求項54に記載の使用のためのワクチン。
56. 請求項50に記載の医薬組成物又は請求項53に記載のワクチンの有効量を対象に投与するステップを含む、対象においてアフリカ豚熱を治療及び/又は予防する方法。
57. 対象は家畜のブタである、請求項48又は52に記載の使用のためのASFウイルス、請求項49又は52に記載のASFウイルスの使用、請求項51又は52に記載の使用のための医薬組成物、請求項54又は55に記載の使用のためのワクチン、又は請求項56に記載の方法。
58. ワクチンはプライムブーストレジームに従って投与される、請求項54、55若しくは57のいずれか一項に記載の使用のためのワクチン、又は請求項56若しくは57に記載の方法。
59. 請求項35から47のいずれか一項に記載のASFウイルスを生成する方法であって、
    EP402Rタンパク質のリガンド結合ドメイン中の1つ以上のアミノ酸を変化させることを含み、ここで、
    アミノ酸変化がEP402Rタンパク質のリガンド結合を破壊している、
    方法。
60. 請求項35から47のいずれか一項に記載のASFウイルスを生成する方法であって、
    Georgia 2007/1 EP402Rタンパク質(配列番号24)のQ96及び/又はW99に相当する位置で、EP402Rタンパク質中の1つ以上のアミノ酸を変化させることを含む、
    方法。
61. ASFウイルスが血球吸着を誘導する能力を減少させる方法であって、
    EP402Rタンパク質のリガンド結合ドメイン中の1つ以上のアミノ酸変化を変化させることを含み、ここで、
    アミノ酸変化がEP402Rタンパク質のリガンド結合を破壊している、
    方法。
62. ASFウイルスが血球吸着を誘導する能力を減少させる方法であって、
    Georgia 2007/1 EP402Rタンパク質(配列番号24)のQ96及び/又はW99に相当する位置で、EP402Rタンパク質中のアミノ酸を変化させることを含む、
    方法。
63. EP153R遺伝子の発現及び/又は活性を破壊することを更に含む、請求項59から62のいずれか一項に記載の方法。
64. EP153R遺伝子及びEP402R遺伝子の発現及び/又は活性を破壊することを含む、ASFウイルスを弱毒化する方法。
65. EP153R遺伝子及び/又はEP402R遺伝子が血球吸着を媒介する能力を破壊することを含む、請求項64に記載の方法。
66. DIVA突然変異をASFウイルスに導入することを更に含む、請求項59から65のいずれか一項に記載の方法。
67. DIVA突然変異はK145R遺伝子の発現を破壊する、請求項66に記載の方法。
68. K145R遺伝子は少なくとも部分的に欠失している、好ましくは完全に欠失している、請求項67に記載の方法。
69. K145R遺伝子は分断されている、請求項67に記載の方法。
70. EP153R遺伝子は少なくとも部分的に欠失している、好ましくは完全に欠失している、請求項63から69のいずれか一項に記載の方法。
71. EP153R遺伝子は分断されている、請求項63から69のいずれか一項に記載の方法。
72. EP402R遺伝子は少なくとも部分的に欠失している、好ましくは完全に欠失している、請求項64から71のいずれか一項に記載の方法。
73. EP402R遺伝子は分断されている、請求項64から71のいずれか一項に記載の方法。
74. 1つ以上の突然変異を含まない相当するASFウイルスと比較して、減少したEP402Rタンパク質の表面発現を減少させる1つ以上の突然変異をEP402R遺伝子に導入することを含む、請求項64から73のいずれか一項に記載の方法。
75. EP402Rタンパク質によるリガンド結合を破壊する1つ以上の突然変異をEP402R遺伝子に導入することを含む、請求項64から74のいずれか一項に記載の方法。
76. EP402Rタンパク質のリガンド結合ドメイン中の1つ以上のアミノ酸を変化させる1つ以上の突然変異をEP402R遺伝子に導入することを含む、請求項74又は75に記載の方法。
77. 1つ以上のアミノ酸は異なるアミノ酸に変化している、請求項76に記載の方法。
78. 異なるアミノ酸への変化が、EP402R上の結合表面を変化させることによって、EP402Rとそのリガンドとの間の相互作用を直接阻害する、請求項77に記載の方法。
79. Georgia 2007/1 EP402Rタンパク質(配列番号24)のQ96及び/又はW99に相当する位置で、EP402Rタンパク質中のアミノ酸を変化させることを含む、請求項75から78のいずれか一項に記載の方法。
80. Georgia 2007/1 EP402Rタンパク質(配列番号24)のQ96に相当する位置のEP402Rタンパク質中のアミノ酸はRに若しくはRの保存的置換であるアミノ酸に変化し、及び/又はGeorgia 2007/1 EP402Rタンパク質(配列番号24)のW99に相当する位置のアミノ酸はDに若しくはDの保存的置換であるアミノ酸に変化している、請求項59から79のいずれか一項に記載の方法。
81. Q96に相当する位置のアミノ酸はH、K若しくはRに変化し、及び/又はW99に相当する位置のアミノ酸はD、E、N若しくはQに変化している、請求項80に記載の方法。
82. Q96に相当する位置のアミノ酸はRに変化し、及び/又はW99に相当する位置のアミノ酸はDに変化している、請求項81に記載の方法。

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