KR20230010741A - 병원성 대장균의 증식을 억제하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

병원성 대장균에 의해 유발된 감염 또는 질환을 예방하거나 치료하기 위한 조성물은 병원성 대장균을 용해시키는 능력을 갖는 포도비리대 (Podoviridae) 박테리오파지 (Esc-COP-30) 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 병원성 대장균에 의해 유발된 감염 또는 질환을 예방하거나 치료하는 방법은 대상체에게 포도비리대 박테리오파지를 투여하는 단계; 및 병원성 대장균을 포도비리대 박테리오파지로 용해시키는 단계를 포함한다.

Description

병원성 대장균의 증식을 억제하기 위한 조성물 및 방법

본 출원은 2020년 6월 6일자로 제출된 미국 최종 특허출원 제 16/893,106호에 대한 우선권을 주장하고, 이는 모든 목적으로 본원에 완전하게 기재된 것과 같이 참고문헌으로 통합된다.

본 발명은 병원성 대장균의 증식을 억제하기 위한 조성물 및 방법, 보다 구체적으로 포도비리대 (Podoviridae) 박테리오파지를 포함하는 조성물 및 이를 사용하는 방법에 관한 것이다.

대장균 (Escherichia coli)는 에스케리키아 속의 그램 음성, 조건부 혐기성, 막대 모양의 대장균형 세균이다. 이것은 체세포 (O), 편모 (H) 또는 피막 (K) 항원을 포함하는지 여부에 따라 혈청학적으로 세분되고, 이러한 항원은 대장균의 병원성과 연관되는 것으로 알려져 있다. 병원성 대장균은 대장균에서 발현될 수 있는 적은 수의 병독 인자를 획득한 대장균을 말하며, 발병 특징 및 독소의 종류에 따라 5가지 유형의 병원성 대장균, 즉 장 출혈성 대장균, 장 독소생성 대장균, 장 침투성 대장균, 장 병원성 대장균 및 장 공격성 대장균이 있다.

병원성 대장균은 식중독, 급성 췌장염, 요로 감염, 패혈증 및 암과 같은 다양한 질환을 유발시킨다. 병원성 대장균 관련 암 중에, 결장직장암은 모든 암 사례의 대략 10% 및 모든 암 사망의 대략 8%를 차지하는 가장 보편적 암 중 하나이다. 또한, 결장직장암은 전세계적으로 매우 흔하며, 정상 점막의 샘암종으로 전환을 촉진하는 결장 상피세포 돌연변이의 축적을 통해 진행된다. 결장직장암 발생을 유도하는 주요 원인 중 하나로서, 결장 폴립은 결장 점막이 비정상적으로 성장하여 창자 내로 돌출되고 사마귀 모양의 돌기가 되는 병태를 말한다. 이것은 종종 암으로 진행될 수 있는 종양성 폴립, 및 암으로 진행되지 않을 비-종양성 폴립으로 구분된다. 다양한 유형의 폴립 중에, 샘종성 폴립은 시간 경과 시 암으로 진행될 가능성이 크다. 병원성 대장균에 의해 유발된 설사가 명확한 질환이더라도, 일부 병원성 대장균의 콜로니 형성은 샘종성 폴립 형성의 촉진에 의한 결장직장암의 발생 촉진과 관련된다.

일반적으로, 백신 및 항생제가 병원성 대장균의 감염성 질환의 예방 및 치료에 사용된다. 여기서, 항생제의 효능은 항생제-저항성 병원성 대장균의 증가로 인해 계속 감소되고 있으며, 현재 처방되고 있는 항생제가 아닌 더 효과적인 방법의 개발이 요구된다.

최근에, 세균성 감염 질환에 대한 대책으로서 박테리오파지의 사용이 상당히 주목을 받아왔다. 박테리오파지는 세균에 감염되는 매우 작은 미생물이고, 보통 간략히 "파지"로 불린다. 일단 박테리오파지가 세균 세포에 감염되면, 박테리오파지는 세균 세포 내에서 증식하게 된다. 증식 이후에, 박테리오파지의 자손은 세균의 세포벽을 파괴하고 숙주 세균으로부터 유출되어, 박테리오파지가 세균을 죽이는 능력이 있음을 시사한다. 박테리오파지가 세균을 감염시키는 방식은 이의 매우 높은 특이성을 특징으로 하고, 따라서 특이적 세균을 감염하는 박테리오파지 유형의 수는 제한된다. 즉, 특정 박테리오파지는 특이적 세균에만 감염할 수 있어, 특정 박테리오파지는 특이적 세균만을 죽일 수 있으며, 기타 다른 세균은 해칠 수 없음을 보여준다. 이러한 박테리오파지의 세균 특이성으로 인해, 박테리오파지는 표적 세균에 미치는 항균 효과만을 제공하고, 인간을 포함한 동물에서의 공생 세균을 침범하지는 않는다. 세균의 치료에 널리 사용되어 왔던 통상적인 항생제는 부수적으로 많은 종류의 세균에 영향을 미친다. 이것은 정상 세균총의 교란과 같은 문제점을 야기한다. 한편으로, 박테리오파지의 사용은 표적 세균을 선별적으로 살상하기 때문에, 정상 세균총을 교란하지는 않는다. 따라서, 박테리오파지는 안전하게 사용될 수 있으며, 이로써 임의의 다른 항생제와 비교하여 사용 시 부작용의 확률을 크게 감축시킨다.

박테리오파지는 세균을 살상하는 독특한 능력으로 인해, 이들이 발견된 이래로 세균성 감염에 대응하는 잠재적인 효과적 대책으로서 주목을 받아왔으며, 이와 관련된 연구도 많이 있다.

박테리오파지는 세균에 대해 매우 특이적인 경향이 있다. 이러한 특이성 때문에, 박테리오파지는 세균이 동일한 종에 속하더라도 특정 균주의 세균에서만 항균 효과를 발휘한다. 또한, 박테리오파지의 항균력도 표적 세균 균주의 유형에 의존적이라 할 수 있다. 따라서, 특이적 세균을 효과적으로 통제하는데 유용한 많은 종류의 박테리오파지를 수집하는 것이 필요하다. 그러므로, 병원성 대장균에 반응하는 효과적인 박테리오파지 사용 방법을 개발하기 위하여, 병원성 대장균에 대한 항균 작용을 나타내는 많은 종류의 박테리오파지를 확보하여야 한다. 더욱이, 생성된 박테리오파지는 항균력 및 항균 범위의 관점으로 다른 것보다 우수한지 여부에 관해 스크리닝되는 것이 필요하다.

따라서, 본 발명은 관련 기술분야에서 겪는 문제점을 명심하면서 이루어졌으며, 이러한 문제점을 해결하고자 한다.

일 구현예에서, 병원성 대장균에 의해 유발된 감염 또는 질환을 예방하거나 치료하기 위한 조성물은 병원성 대장균을 용해시키는 능력을 갖는 포도비리대 (Podoviridae) 박테리오파지 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.

또 다른 구현예에서, 포도비리대 박테리오파지는 서열번호 1에 기재된 서열 또는 서열번호 1과 적어도 90% 일치도로 적어도 80% 조회 범위를 갖는 서열을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 포도비리대 박테리오파지는 1× 10¹ pfu/mL 내지 1× 10³⁰ pfu/mL 또는 1× 10¹ pfu/g 내지 1× 10³⁰ pfu/g의 농도를 갖는다.

또 다른 구현예에서, 포도비리대 박테리오파지는 1× 10⁴ pfu/mL 내지 1× 10¹⁵ pfu/mL 또는 1× 10⁴ pfu/g 내지 1× 10¹⁵ pfu/g의 농도를 갖는다.

또 다른 구현예에서, 약제학적으로 허용가능한 담체는 락토스, 덱스트로스, 슈크로스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 칼슘 포스페이트, 알기네이트, 젤라틴, 칼슘 실리케이트, 미세결정 셀룰로우스, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로우스, 물, 시럽, 메틸셀룰로우스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 미네랄 오일이다.

또 다른 구현예에서, 조성물은 활택제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁화제 및 보존제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 추가로 포함한다.

또 다른 구현예에서, 병원성 대장균은 장 출혈성 대장균, 장 독소생성 대장균, 장 침투성 대장균, 장 병원성 대장균, 장 공격성 대장균 또는 발암성 대장균이다.

또 다른 구현예에서, 감염 또는 질환은 식중독, 장염, 설사, 요로 감염, 신생아 수막염, 용혈성 요독 증후군, 복막염, 유방염, 패혈증, 그램 음성 폐렴, 쉬겔라증, 이질 또는 암이다.

또 다른 구현예에서, 조성물은 유성 또는 수용성 매질 중 용액, 현탁액, 유화액, 추출액, 분말, 과립, 정제 또는 캡슐이다.

또 다른 구현예에서, 조성물은 병원성 대장균 또는 대장균이 아닌 세균 종을 용해시키는 능력을 갖는 제 2 박테리오파지를 추가로 포함한다.

또 다른 구현예에서, 포도비리대 박테리오파지는 대략 43 kDa, 48 kDa, 63 kDa, 75 kDa, 85 kDa 및 142 kDa 크기의 주요 구조 단백질을 갖는다.

또 다른 구현예에서, 포도비리대 박테리오파지는 10분 내지 25분의 잠복기, 및 740 내지 860 pfu/감염된 세포의 방출량을 갖는다.

또 다른 구현예에서, 잠복기는 15분 내지 20분이고, 방출량은 770 내지 830 pfu/감염된 세포이다.

일 구현예에서, 병원성 대장균에 의해 유발된 감염 또는 질환을 예방하거나 치료하는 방법은 대상체에게 포도비리대 박테리오파지를 투여하는 단계; 및 병원성 대장균을 포도비리대 박테리오파지로 용해시키는 단계를 포함한다.

또 다른 구현예에서, 포도비리대 박테리오파지는 서열번호 1에 기재된 서열을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 포도비리대 박테리오파지는 1× 10¹ pfu/mL 내지 1× 10³⁰ pfu/mL 또는 1× 10¹ pfu/g 내지 1× 10³⁰ pfu/g의 농도를 갖는다.

또 다른 구현예에서, 포도비리대 박테리오파지는 1× 10⁴ pfu/mL 내지 1× 10¹⁵ pfu/mL 또는 1× 10⁴ pfu/g 내지 1× 10¹⁵ pfu/g의 농도를 갖는다.

전술한 일반적 설명 및 다음의 상세한 설명은 모두 예시하고, 해석하는 것이며, 청구된 바와 같은 본 발명의 추가의 설명을 제공하고자 함으로 이해되어야 한다.

본 출원의 병원성 대장균의 증식을 억제하기 위한 조성물 및 방법은 항생제를 기반으로 한 통상적인 조성물 및 방법과 비교하여, 병원성 대장균에 대한 높은 특이성을 갖는다. 본 조성물은 다른 유용한 공생 세균에 영향을 주지 않고도 병원성 대장균을 예방하거나 치료하는데 사용될 수 있으며, 부작용은 더 적다. 일반적으로, 항생제가 사용될 때 공생 세균도 손상을 받아 이들의 사용으로 인한 다양한 부작용을 수반하게 된다. 한편, 박테리오파지에서 항균력 및 항균 범위 (숙주 범위)와 같은 항균 성질 각각은 동일한 세균 종에 대한 항균 활성을 나타내는 박테리오파지의 경우에도 상이하고, 보통 박테리오파지는 동일한 세균 종 내의 단지 일부 세균 균주에 대해 효과적이다. 따라서, 본 출원의 조성물 및 방법은 이의 산업적 응용에서 상이한 효과를 제공한다.

첨부된 도면은 본 발명의 추가 이해를 제공하기 위해 포함되고, 본 명세서에 통합되어 이의 일부를 구성하며, 본 발명의 구현예를 제시하고, 상세한 설명과 함께 본 발명의 원리를 설명하고 있다.
도 1은 박테리오파지 Esc-COP-30의 형태를 나타내는 전자현미경 사진이다.
도 2는 박테리오파지 Esc-COP-30의 주요 구조 단백질에 대한 분석 결과이다.
도 3은 박테리오파지 Esc-COP-30의 대장균을 살상하는 능력에 관한 실험 결과를 나타내는 사진이다. 투명한 영역은 표적 세균의 용해에 의해 형성된 플라크이다.
도 4는 박테리오파지 Esc-COP-30의 일 단계 성장 곡선이다.

본 발명의 구현예가 이제 자세하게 언급될 것이고, 이의 예시는 첨부된 도면에 제시되어 있다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 Esc-COP-30으로 명명된 포도비리대 박테리오파지를 제공하고, 이는 대장균을 특이적으로 살상하는 능력을 갖으며 서열번호 1에 기재된 서열을 포함하는 게놈을 갖는다. 일부 구현예에서, 포도비리대 박테리오파지는 적어도 90% 일치도로 적어도 80% 조회 범위, 적어도 90% 일치도로 적어도 85% 조회 범위, 적어도 90% 일치도로 적어도 90% 조회 범위, 적어도 90% 일치도로 적어도 95% 조회 범위, 적어도 90% 일치도로 적어도 96% 조회 범위, 적어도 90% 일치도로 적어도 97% 조회 범위, 적어도 90% 일치도로 적어도 98% 조회 범위, 적어도 90% 일치도로 적어도 99% 조회 범위, 또는 적어도 90% 일치도로 적어도 99.5% 조회 범위를 갖는 서열을 포함한다.

본 발명은 또한 이를 유효 성분으로서 포함하는 조성물을 사용하여 병원성 대장균에 의해 유발된 감염 또는 질환을 예방하거나 치료하는 방법을 제공한다.

박테리오파지 Esc-COP-30은 본 발명자에 의해 분리된 다음 2019년 11월 15일자로 한국생명공학연구원, 미생물 기탁기관에 기탁되었다 (수탁번호: KCTC 14032 BP).

포도비리대 박테리오파지의 주요 구조 단백질의 분자량은 대략 43 kDa, 48 kDa, 63 kDa, 75 kDa, 85 kDa 및 142 kDa이다.

박테리오파지 Esc-COP-30의 잠복기 및 방출량은 각각 10분 내지 25분 및 740 내지 860 pfu/감염된 세포, 바람직하게 각각 15분 내지 20분 및 770 내지 830 pfu/감염된 세포이나 이들에 한정되지는 않는다.

또한, 본 발명은 병원성 대장균에 의해 유발된 감염 또는 질환의 예방 또는 치료에 적용가능한 조성물로서, 유효 성분으로서 박테리오파지 Esc-COP-30을 포함하는, 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물에 포함된 박테리오파지 Esc-COP-30은 병원성 대장균을 효과적으로 살상하기 때문에, 병원성 대장균 감염의 예방 또는 병원성 대장균에 의해 유발된 질환의 치료에 효과적인 것으로 사료된다. 따라서, 본 발명의 조성물은 병원성 대장균에 의해 유발된 질환의 예방 및 치료에 사용될 수 있다.

본 발명에서 병원성 대장균에 의해 유발된 질환은 식중독, 장염, 설사, 요로 감염, 신생아 수막염, 용혈성 요독 증후군, 복막염, 유방염, 패혈증, 그램 음성 폐렴, 쉬겔라증, 이질 및 암을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 조성물에 포함된 약제학적으로 허용가능한 담체는 일반적으로 약제학적 제형물의 제조에 사용되는 것이고, 이의 예로는 락토스, 덱스트로스, 슈크로스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 칼슘 포스페이트, 알기네이트, 젤라틴, 칼슘 실리케이트, 미세결정 셀룰로우스, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로우스, 물, 시럽, 메틸셀룰로우스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 미네랄 오일이나 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 조성물은 상기 성분에 추가하여 활택제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁화제 및 보존제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물에서는, 박테리오파지 Esc-COP-30가 유효 성분으로서 포함된다. 박테리오파지 Esc-COP-30은 1× 10¹ pfu/mL 내지 1× 10³⁰ pfu/mL 또는 1× 10¹ pfu/g 내지 1× 10³⁰ pfu/g의 농도, 바람직하게 1× 10⁴ pfu/mL 내지 1× 10¹⁵ pfu/mL 또는 1× 10⁴ pfu/g 내지 1× 10¹⁵ pfu/g의 농도로 포함된다.

본 발명의 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 수행할 수 있는 방법에 따라, 단일 용량 또는 다중 용량 용기에서 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 사용하여 제형화될 수 있다. 다음으로, 제형물은 유성 또는 수용성 매질 중 용액, 현탁액 또는 유화액, 추출액, 분말, 과립, 정제 또는 캡슐의 형태일 수 있다. 분산화제 또는 안정화제가 추가적으로 포함될 수 있다.

상기 목적의 효능을 개선하기 위하여, 대장균이 아닌 세균 종에 대한 항균 활성을 갖는 박테리오파지가 본 발명의 조성물에 추가로 포함될 수 있다. 또한, 대장균에 대한 항균 활성을 갖는 다른 종류의 박테리오파지가 본 발명의 조성물에 추가로 포함할 수 있다. 박테리오파지의 항균력 및 항균 범위 (숙주 범위)와 같은 의 항균 성질 각각은 동일한 세균 종에 대한 항균 활성을 나타내는 박테리오파지의 경우에도 상이하기 때문에, 이러한 박테리오파지는 항균 효과를 극대화하도록 추가적으로 포함될 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "예방" 및 "예방하다"는 (i) 병원성 대장균 감염을 차단하는 것; 및 (ii) 병원성 대장균 감염에 의해 유발된 질환의 진행을 억제하는 것을 나타낸다.

본 명세서에서, 용어 "치료" 및 "치료하다"는 (i) 병원성 대장균에 의해 유발된 질환을 억압하고, (ii) 병원성 대장균에 의해 유발된 질환의 병리학적 병태를 경감시키는 모든 활동을 나타낸다.

본 명세서에서, 용어 "병원성 대장균"은 장 출혈성 대장균, 장 독소생성 대장균, 장 침투성 대장균, 장 병원성 대장균, 장 공격성 대장균 및 발암성 대장균을 나타내나 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서, 용어 "병원성 대장균에 의해 유발된 질환" 및 "병원성 대장균 감염"은 식중독, 장염, 설사, 요로 감염, 신생아 수막염, 용혈성 요독 증후군, 복막염, 유방염, 패혈증, 그램 음성 폐렴, 쉬겔라증, 이질 및 암을 나타내나 이에 한정되지는 않는다.

본 명세서에서, 용어 "잠복기"는 박테리오파지 입자가 감염된 숙주 세포 내에서 재생산되는데 걸리는 시간을 나타낸다.

본 명세서에서, 용어 "방출량"은 감염된 세균 당 생산된 박테리오파지의 수를 나타낸다.

본 명세서에서, 용어 "분리하다", "분리하는" 및 "분리된"은 다양한 실험적 기법을 적용하여 자연으로부터 박테리오파지를 분리하고, 표적 박테리오파지를 다른 것과 구별할 수 있는 특징을 유지시키는 활동을 말하고, 표적 박테리오파지가 산업적으로 응용가능하도록 생명공학 기법을 사용하여 표적 박테리오파지를 증식시키는 활동도 추가로 포함한다.

본 명세서에서, 용어 "조회 범위" 및 "일치도"는 NCBI (국립생명과학정보센터)에 의해 제공되는 온라인 검색 도구인 BLAST (기본 로칼 정렬 검색 도구)와 관련되어 있다.

본 명세서에서, 조회 범위는 조회 서열 (즉, 박테리오파지 ESC-COP-30의 게놈 서열)이 표적 서열 (즉, 이전에 보고된 박테리오파지의 게놈 서열)에 적용되는 정도를 설명하는 수이다. 데이터베이스의 표적 서열이 전체 조회 서열에 해당하는 경우라면, 조회 범위는 100%이다. 이것은 서로가 대비되는 서열의 길이 정도를 나타낸다.

본 명세서에서, 용어 "일치도" 또는 "서열 일치도"는 "조회 범위"에 대해 측정되었고, 조회 서열 (즉, 박테리오파지 ESC-COP-30의 게놈 서열)이 표적 서열 (즉, 이전에 보고된 박테리오파지의 게놈 서열)과 유사한 정도를 설명하는 수이다. 보다 구체적으로, 용어 "일치도" 또는 "서열 일치도"는 조회 서열 (즉, 박테리오파지 ESC-COP-30의 게놈 서열) 및 표적 서열 (즉, 이전에 보고된 박테리오파지의 게놈 서열)이 BLAST 정렬 분석에 의해 분석될 때, 표적 서열 (즉, 이전에 보고된 박테리오파지의 게놈 서열) 또는 조회 서열 (즉, 박테리오파지 ESC-COP-30의 게놈 서열)의 해당된 서열 부분에서 일치하는 뉴클레오티드의 백분율을 말한다. 일치도 백분율이 높아질수록 매칭이 더욱 유의해진다.

본 발명의 실제적인 현재 바람직한 구현예는 다음의 실시예에 나타낸 바와 같이 설명된다.

그러나, 당업자라면 본 발명을 고려하여, 본 발명의 사상 및 범주 내에서 변형 및 개선을 이룰 수 있는 것으로 이해할 것이다.

실시예 1: 대장균을 살상할 수 있는 박테리오파지의 분리

대장균을 살상할 수 있는 박테리오파지를 분리하기 위하여 시료는 환경적 또는 임상적 시료로부터 수집하였다. 본원에서, 박테리오파지의 분리에 사용된 대장균 균주는 이전에 분리되어 본 발명자에 의해 대장균 (Escherichia coli)으로서 확인되었다.

박테리오파지를 분리하기 위한 절차는 이하 본원에서 자세하게 기술된다. 수집된 시료는 대장균이 1/1,000 비율로 접종되어 있는 TSB (트립틱소이 배양액) 배양 배지 (카세인 소화물, 17 g/L; 대두 소화물, 3 g/L; 덱스트로스, 2.5 g/L; NaCl, 5 g/L; 디소듐 포스페이트, 2.5 g/L)에 첨가하고, 이어서 배양물을 37℃에서 3 내지 4시간 동안 진탕하였다. 배양의 완료 시, 원심분리를 8,000 rpm에서 30분 동안 수행하고, 상층액을 회수하였다. 회수된 상층액에 대장균을 1/1,000 비율로 접종하고, 이어서 배양물을 37℃에서 3 내지 4시간 동안 진탕하였다. 시료가 박테리오파지를 포함하였을 때, 상기 절차는 박테리오파지의 수 (역가)를 충분히 증가시키기 위하여 총 5회 반복하였다. 절차를 5회 반복한 이후에, 배양 용액은 8,000 rpm에서 20분 동안 원심분리를 시행하였다. 원심분리 이후에, 회수된 상층액은 0.45 μm 필터를 사용하여 여과하였다. 획득된 여과액은 대장균을 살상할 수 있는 박테리오파지가 여기에 포함되는지 여부를 조사하기 위한 전형적인 점적 검정법에 사용되었다.

점적 검정법은 다음과 같이 수행하였다: TSB 배양 배지에는 대장균을 1/1,000 비율로 접종하고, 이어서 배양물을 37℃에서 밤새 진탕하였다. 상기에서 준비된 2 mL (OD₆₀₀ 1.5)의 대장균의 배양 용액을 TSA (카제인 소화물, 15 g/L; 대두 소화물, 5 g/L; NaCl, 5 g/L; 한천, 15 g/L) 플레이트 위에 도말하였다. 플레이트를 클린 벤치 위에 약 30분 동안 두어 도말된 용액을 건조시켰다. 건조시킨 이후에, 10 μg의 준비된 여과액을 대장균이 도말된 플레이트 배양 배지 위에 점적한 다음 약 30분 동안 건조하도록 두었다. 건조시킨 이후에, 점적이 시행된 플레이트 배양 배지는 37℃에서 하루 동안 배양한 다음 여과액이 점적된 위치에서 투명한 영역의 형성에 대해 조사하였다. 투명한 영역이 생성된 여과액의 경우에, 대장균을 살상할 수 있는 박테리오파지가 여기에 포함된 것으로 판단하였다. 상기 검사를 통해, 대장균을 살상하는 능력을 갖는 박테리오파지를 포함한 여과액을 획득할 수 있었다.

순수한 박테리오파지는 상기에서 대장균을 살상할 수 있는 박테리오파지를 갖는 것으로 검증된 여과액로부터 분리되었다. 통상적인 플라크 검정법이 순수한 박테리오파지를 분리하는데 사용되었다. 자세하게, 플라크 검정 과정에서 형성된 플라크는 멸균된 팁을 사용하여 회수하였으며, 이는 다음으로 대장균의 배양 용액에 첨가하고 이어서 37℃에서 4 내지 5시간 동안 배양하였다. 배양한 이후에, 원심분리를 8,000 rpm에서 20분 동안 수행하여 상층액을 획득하였다. 대장균 배양 용액은 획득된 상층액에 1/50의 부피 비율로 첨가하고 이어서 37℃에서 4 내지 5시간 동안 배양하였다. 박테리오파지의 수를 증가시키기 위하여, 상기 절차는 적어도 5회 반복하였다. 다음으로, 최종 상층액을 획득하기 위하여 원심분리를 8,000 rpm에서 20분 동안 수행하였다. 플라크 검정법은 생성된 상층액을 사용하여 추가로 수행하였다. 일반적으로, 순수한 박테리오파지의 분리는 절차의 1회 반복을 통해서 완료되지 못하여, 상기 절차는 상기에서 형성된 결과적 플라크를 사용하여 반복하였다. 절차의 적어도 5회 반복 이후에, 순수한 박테리오파지를 포함하는 용액을 획득하였다. 순수한 박테리오파지를 분리하기 위한 절차는 일반적으로 생성된 플라크가 크기와 형태가 서로 유사하게 될 때까지 반복하였다. 또한, 순수한 박테리오파지의 최종 분리는 전가현미경을 사용하여 검증하였다. 전자현미경 관찰은 통상적인 방법에 따라 수행하였다. 간략하게, 순수한 박테리오파지를 포함하는 용액을 구리 그리드 상에 로딩하고, 이어서 2% 우라닐 아세테이트로 음성 염색하여 건조시켰다. 다음으로 이의 형태를 투과 전자현미경을 사용하여 관찰하였다. 분리된 순수한 박테리오파지의 전자현미경 사진은 도 1에 나타낸다. 형태학적 특징을 기초로 하여, 상기 분리된 신규한 박테리오파지는 포도비리대 (Podoviridae) 박테리오파지에 속하는 것으로 검증되었다.

상기에 검증된 순수한 박테리오파지를 포함하는 용액은 다음의 정제 공정을 시행하였다. 대장균 배양 용액을 순수한 박테리오파지를 포함하는 용액에 박테리오파지 용액의 총 부피를 기준으로 1/10의 부피 비율로 첨가하고, 이어서 4 내지 5시간 동안 추가로 배양하였다. 배양한 이후에, 원심분리를 8,000 rpm에서 20분 동안 수행하여 상층액을 획득하였다. 박테리오파지의 충분한 수를 포함하는 용액을 획득하기 위하여, 이러한 절차는 총 5회 반복하였다. 최종 원심분리로부터 획득된 상층액은 0.45 μm 필터를 사용하여 여과하고, 이어서 통상적인 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 침전 공정을 시행하였다. 구체적으로, 100 mL의 여과액에 PEG 및 NaCl을 10% PEG 8000 / 0.5 M NaCl에 되도록 첨가한 다음 4℃에 2 내지 3시간 동안 나두었다. 그런 다음, 원심분리를 8,000 rpm에서 30분 동안 수행하여 박테리오파지 침전물을 획득하였다. 생성된 박테리오파지 침전물은 5 mL의 완충액 (10 mM Tris-HCl, 10 mM MgSO₄, 0.1% 젤라틴, pH 8.0)에 현탁하였다. 생성된 물질은 박테리오파지 현탁액 또는 박테리오파지 용액으로 지칭하였다.

그 결과로, 상기에서 정제된 순수한 박테리오파지를 수집하여 박테리오파지 Esc-COP-30으로 명명한 다음 2019년 11월 15일자로 한국생명공학연구원, 미생물 기탁기관에 기탁하였다 (수탁번호: KCTC 14032 BP).

실시예 2: 박테리오파지 Esc-COP-30의 게놈의 분리 및 서열 분석

박테리오파지 Esc-COP-30의 게놈은 다음과 같이 분리하였다. 게놈은 실시예 1에서와 동일한 방법을 사용하여 획득된 박테리오파지 현탁액으로부터 분리하였다. 먼저 현탁액 내에 포함된 대장균의 DNA 및 RNA를 제거하기 위하여, 200 U의 DNase I 및 RNase A 각각을 10 mL의 박테리오파지 현탁액에 첨가한 다음 37℃에 30분 동안 나두었다. 30분 동안 방치한 다음, DNase I 및 RNase A 활성을 중단시키기 위하여, 500 μL의 0.5 M 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)을 이에 첨가한 다음 10분 동안 나두었다. 또한, 생성된 혼합물은 65℃에 10분 동안 추가로 방치한 다음 여기에 100 mL의 단백질 분해효소 K (20 mg/mL)를 첨가하여 박테리오파지의 외벽을 파손시키고, 이어서 37℃에 20분 동안 반응시켰다. 이후에, 500 μL의 10% 소듐 도데실 설페이트 (SDS)를 이에 첨가하고, 이어서 65℃에 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 동안 반응 이후에, 25 : 24 : 1의 성분 비율로 혼합된 페놀 : 클로로포름 : 이소아밀 알코올의 10 mL 용액을 반응 용액에 첨가하고, 이어서 잘 혼합하였다. 또한, 생성된 혼합물은 13,000 rpm에서 15분 동안 원심분리를 시행하여 층을 분리하였다. 분리된 층 중에, 상층을 선택하여 이에 이소프로필 알코올을 1.5의 부피 비율로 첨가하고, 이어서 게놈을 침전시키기 위하여 13,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하였다. 침전물을 수집한 이후에 70% 에탄올을 침전물에 첨가하고, 이어서 13,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 침전물을 세척하였다. 세척된 침전물을 회수하고, 진공건조시킨 다음 100 μL의 물에 용해하였다. 이러한 절차를 반복하여 박테리오파지 Esc-COP-30의 충분한 양의 게놈을 획득하였다.

상기에서 획득된 박테리오파지 Esc-COP-30의 게놈 서열에 관한 정보는 서울대학교 농생명과학공동기기원으로부터의 일루미나 Mi-Seq 장비를 사용하여 차세대 시퀸싱 분석을 수행하여 확보하였다. 최종적으로 박테리오파지 Esc-COP-30의 분석된 게놈은 40,403 bp의 크기를 갖으며, 전체 게놈의 서열은 서열번호 1로 표현되었다.

이전에 보고된 박테리오파지의 게놈 서열과 상기에서 획득된 박테리오파지 Esc-COP-30의 게놈 서열의 상동성 (유사도)은 BLAST 검색을 사용하여 조사하였다. 박테리오파지 Esc-COP-30의 게놈 서열은 시트로박터 (Citrobacter) 박테리오파지 SH3 (진뱅크 수탁번호 KU687349.1)의 서열과 비교적 높은 상동성을 갖는 것으로 밝혀졌다 (조회 범위: 71.5%, 일치도: 91.5%). 그러나, 박테리오파지 Esc-COP-30 게놈의 위상학은 원형인 반면, 시트로박터 박테리오파지 SH3는 선형의 게놈을 갖는다. 또한, 박테리오파지 Esc-COP-30 게놈 상의 개방형 해독틀 (ORF)의 수는 50개인 반면, 시트로박터 박테리오파지 SH3는 49개의 개방형 해독틀을 갖는다.

이러한 결과를 기초로 하여, 박테리오파지 Esc-COP-30가 통상적으로 보고되는 박테리오파지와는 상이한 신규한 박테리오파지가 틀림없는 것으로 판단한다. 추가로, 박테리오파지의 항균력 및 항균 범위가 전형적으로 박테리오파지의 유형에 의존하기 때문에, 박테리오파지 Esc-COP-30은 이전에 보고된 임의의 다른 박테리오파지의 활성과는 상이한 항균 활성을 제공할 수 있을 것으로 고려된다.

실시예 3: 박테리오파지 Esc-COP-30의 주요 구조 단백질의 분석

일차원 전기영동을 수행하여 박테리오파지 Esc-COP-30의 주요 구조 단백질을 분석하였다. 박테리오파지 Esc-COP-30의 외벽을 구성하는 단백질을 획득하기 위하여, 실시예 1에서 제조된 200 μL의 박테리오파지 현탁액을 800 μL의 아세톤과 혼합하고, 이를 격렬하게 볼텍싱하였다. 혼합물은 -20℃에 10분 동안 정치하였다. 원심분리를 4℃에서 13,000 rpm으로 20분 동안 수행하여 상층액을 제거하고, 이어서 공기로 건조시켰다. 침전물은 15 μL의 원심분리 시료 완충액 (5×)으로 재현탁시키고, 다음으로 이를 5분 동안 가열하였다. 제조된 시료는 일차원 전기영동에 의해 분석하였다. 그 결과로 도 2에 나타낸 바와 같이, 대략 43 kDa, 48 kDa, 63 kDa, 75 kDa, 85 kDa 및 142 kDa 크기의 주요 구조 단백질이 검증되었다.

실시예 4: 박테리오파지 Esc-COP-30의 병원성 대장균을 살상하는 능력의 조사

박테리오파지 Esc-COP-30의 병원성 대장균을 살상하는 능력을 조사하였다. 살상 능력을 조사하기 위하여, 투명한 영역의 형성은 실시예 1에 기술된 바와 동일한 방식으로 점적 검정법을 사용하여 관찰하였다. pks 게놈 영역의 양성 보인자인 pks 양성 대장균 균주로서 확인되었던 총 5가지 균주를 살상 능력의 조사를 위한 병원성 대장균으로서 사용하였다. 박테리오파지 Esc-COP-30은 실험적 표적으로서 5가지 병원성 대장균 균주 중에 총 3가지 균주를 용해시키고 살상하는 능력을 갖고 있었다. 이의 실험 결과는 표 1에 제시되고, 대표적인 결과는 도 3에 나타낸다.

한편으로, 박테리오파지 Esc-COP-30가 보데텔라 브론키셉티카 (Bordetella bronchiseptica), 엔테로코커스 페칼리스 (Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 페슘 (Enterococcus faecium), 스태필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae) 및 슈도모나스 에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa)를 살상하는 능력도 별도의 실험으로 조사하였다. 그 결과로는, 박테리오파지 Esc-COP-30가 이들 세균을 살상하는 능력을 갖지 않았다.

따라서, 박테리오파지 Esc-COP-30가 병원성 대장균을 살상하는 강력한 능력 및 병원성 대장균에 대한 넓은 항균 범위를 갖는 것으로 검증되었으며, 박테리오파지 Esc-COP-30가 병원성 대장균 감염을 예방하고 치료하기 위한 조성물의 유효 성분으로서 사용될 수 있음을 시사한다.

실시예 5: 박테리오파지 Esc-COP-30의 성장 특징

박테리오파지 Esc-COP-30의 성장 특징은 일 단계 성장 곡선의 분석에 의해 분석하였다. 박테리오파지 Esc-COP-30의 일 단계 성장 곡선의 분석은 다음과 같이 수행하였다: TSB (트립틱소이 배양액, 디프코사) 배양 배지에 대장균을 1/1,000 비율로 접종하고, 이어서 배양물을 대수증식기 (OD₆₀₀ = 0.3 내지 0.4)까지 진탕하였다. 배양의 완료 시, 원심분리를 8,000 rpm에서 5 분 동안 수행하여 세균 세포 펠렛을 회수하였다. 회수된 펠렛은 50 mL의 TSB에 현탁시켰다. 생성된 물질은 세균 현탁액으로서 지칭될 수 있다. 박테리오파지 Esc-COP-30은 0.1의 다중감염도 (MOI)로 세균 현탁액과 혼합하고, 실온에서 10분 동안 배양한 다음 12,000 rpm에서 30초 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거한 이후에 박테리오파지 감염된 세균 세포를 포함하는 펠렛은 50 mL의 TSB에 현탁시키고, 37℃에서 진탕하면서 배양하였다. 분취량을 5분 간격으로 60분 동안 채취하고, 분취량의 역가는 통상적인 플라크 검정법에 의해 즉시 결정하였다 (도 4).

박테리오파지 Esc-COP-30의 잠복기는 대략 15분 ± 5분이고, 평균 방출량은 약 800 ± 10 pfu/감염된 세포인 것으로 추정되었다.

실시예 6: 박테리오파지 Esc-COP-30을 사용한 병원성 대장균 감염의 예방에 관한 실험예

100 μL의 박테리오파지 Esc-COP-30 현탁액 (1× 10⁸ pfu/mL)을 9 mL의 TSB 배양 배지를 포함하는 튜브에 첨가하였다. 9 mL의 TSB 배양 배지를 포함하는 또 다른 튜브에, 동일한 양의 TSB 배양 배지만을 추가로 첨가하였다. 다음으로 병원성 대장균 (pks 양성 CCARM 1G937 균주) 배양 용액을 600 nm에서 흡광도가 약 0.5에 도달하도록 각 튜브에 첨가하였다. 병원성 대장균을 첨가한 이후에, 튜브를 37℃의 배양기로 이동시키고, 이어서 배양물을 진탕하면서 병원성 대장균의 성장을 관찰하였다. 표 2에 제시된 바와 같이, 병원성 대장균의 성장이 박테리오파지 Esc-COP-30 현탁액이 첨가된 튜브에서 억제되는 반면, 병원성 대장균의 성장이 박테리오파지 Esc-COP-30 현탁액이 첨가되지 않은 튜브에서 억제되지 않는 것으로 관찰되었다.

상기 결과는 본 발명의 박테리오파지 Esc-COP-30가 병원성 대장균의 성장을 억제할 뿐만 아니라 병원성 대장균을 살상하는 능력을 갖는 것을 가리킨다. 따라서, 박테리오파지 Esc-COP-30가 병원성 대장균 감염을 예방하기 위한 조성물의 유효 성분으로서 사용될 수 있는 것으로 판단한다.

실시예 7: 동물 모델에서 대장균의 감염에 미치는 박테리오파지 Esc-COP-30의 예방 효과

대장균에 의해 감염된 이유기 돼지에 미치는 박테리오파지 Esc-COP-30의 예방 효과를 조사하였다. 25일령의 이유기 돼지 4마리를 함께 그룹화하고, 총 2개 그룹의 돼지를 각 돼지 사육상자 (1.1 m × 1.0 m)에 사육하였다. 난방 시스템을 갖추고 주변 환경을 제어하였다. 돼지 사육상자의 온도 및 습도는 일정하게 조절하고, 바닥을 매일 청소하였다. 실험 1일째부터, 실험군 (박테리오파지가 첨가됨)의 돼지는 통상적인 사료 공급 절차에 따라 1× 10⁸ pfu/g의 박테리오파지 Esc-COP-30가 첨가된 사료를 사용하여 사육한 반면, 대조군 (박테리오파지가 첨가되지 않음)의 돼지는 통상적인 절차에 따라 박테리오파지 Esc-COP-30가 첨가되지 않은 동일한 사료를 사용하여 사육하였다. 실험 7일째부터, 모든 실험군의 사료는 1× 10⁸ pfu/g의 병원성 대장균으로 2일 동안 오염시킨 다음 병원성 대장균의 감염을 유발시키도록 실험군 및 대조군에게 각각 매일 2회 공급하였다. 투여된 병원성 대장균 현탁액은 다음과 같이 제조하였다: 병원성 대장균 (CCARM 1G941 균주)는 TSB 배양 배지를 사용하여 37℃에서 18시간 동안 배양하고, 이후에 세균을 분리하여 생리학적 식염수 (pH 7.2)를 사용하여 10⁹ cfu/mL로 조정하였다. 오염된 사료를 2일 동안 공급한 다음날 (실험 9일째)부터, 실험군 (박테리오파지가 첨가됨)의 돼지는 이전과 같은 통상적인 사료 공급 절차에 따라 병원성 대장균으로 오염되지 않은 1× 10⁸ pfu/g의 박테리오파지 Esc-COP-30가 첨가된 사료를 사용하여 다시 사육한 반면, 대조군 (박테리오파지가 첨가되지 않음)의 돼지는 통상적인 절차에 따라 박테리오파지가 첨가되지 않은 동일한 사료를 사용하여 사육하였다. 실험 9일째부터, 매일을 기준으로 모든 테스트 동물에서 설사 검사를 하였다. 설사의 정도는 설사 지표에 따라 측정하여 결정하였다. 설사 지표는 흔히 사용되는 대변 굳기 (FC) 점수 (정상: 0점, 연질 대변: 1점, 무른 설사: 2점, 심한 설사: 3점)를 사용하여 측정하였다. 결과는 표 3에 나타낸다.

상기 결과로부터, 본 발명의 박테리오파지 Esc-COP-30가 병원성 대장균의 감염을 억제하는데 매우 효과적일 수 있는 것으로 검증되었다.

실시예 8: 박테리오파지 Esc-COP-30을 사용한 병원성 대장균의 감염성 질환의 치료 예시

병원성 대장균에 의해 유발된 질환에 미치는 박테리오파지 Esc-COP-30의 치료 효과는 다음과 같이 평가하였다: 40마리의 8주령 마우스는 그룹 당 20마리 마우스의 총 2개의 그룹으로 구분하였으며, 이후 각각 5마리의 하위 그룹을 개별 실험 마우스 사육상자에서 별도로 사육하고, 실험을 7일 동안 수행하였다. 실험 2일째, 0.1 mL의 병원성 대장균 현탁액을 모든 마우스에게 복강내 주사를 통해 투여하였다. 투여된 병원성 대장균 현탁액은 다음과 같이 제조하였다: 병원성 대장균 (CCARM 1G931 균주)는 TSB 배양 배지를 사용하여 37℃에서 18시간 동안 배양하고, 이후에 세균을 분리하여 생리학적 식염수 (pH 7.2)를 사용하여 10⁹ cfu/mL로 조정하였다. 병원성 대장균의 투여 이후 2시간째, 10⁹ pfu의 박테리오파지 Esc-COP-30을 실험군 (박테리오파지 현탁액이 투여됨)의 마우스에게 복강내 주사를 통해 투여하였다. 대조군 (박테리오파지 현탁액이 투여되지 않음)의 마우스에게는 0.1 mL의 식염수를 복강내 주사를 통해 투여하였다. 대조군 및 실험군 모두에게 사료 및 음료수를 주어 동등하게 사육하였다. 병원성 대장균의 투여로부터 시작하여 테스트의 종료 시까지 마우스의 생존 여부를 관찰하였다. 결과는 하기 표 4에 나타낸다.

상기 결과로부터 자명한 바와 같이, 본 발명의 박테리오파지 Esc-COP-30가 병원성 대장균에 의해 유발된 질환의 치료에서 매우 효과적인 것으로 판단될 수 있다.

당업자라면 전술한 상세한 설명에 개시된 개념 및 구체적인 구현예가 본 발명과 동일한 목적을 수행하기 위한 다른 구현예를 변형하거나 설계하기 위한 근거로서 쉽게 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 당업자라면 이러한 동등한 구현예가 첨부된 청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 범주를 벗어나지 않음도 이해할 것이다.

당업자에게 본 발명에서 다양한 변형 및 변경이 본 발명의 사상 또는 범주를 벗어나지 않고도 이루어질 수 있음이 자명할 것이다. 따라서, 본 발명은 단 첨부된 청구범위 및 이들의 동등물의 범주 내에 속하면 본 발명의 변형 및 변경을 포괄하는 것으로 의도된다.

수탁번호

기탁기관의 명칭: KTCT

수탁번호: KCTC 14032 BP

기탁일: 20191115

SEQUENCE LISTING <110> iNtRON Biotechnology, Inc. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING THE PROLIFERATION OF PATHOGENIC ESCHERICHIA COLI <130> 200010056WO <150> US 16/893,106 <151> 2020-06-04 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 40403 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Podoviridae bacteriophage <400> 1 tctcacagtt caagaacctc aagtcccccc ataggccctc tttaagtccg accaaaggcc 60 ctacccctag accgaaggtc taaacctcaa gtcactagtc gtcgactagc agccattgac 120 ccgaagtctg acccgaagtc tggaccgata gggcctatat ctagtggttg ggacgatggg 180 ttgggactat atgttgtgtc cctgagtcgc tatctgtatc agcccaaagt catcacctac 240 agtctcacta cctacagtct cactacctac agtctcacta cctagttagc cttcagctaa 300 cctacagtca tcgaccatcg gtaaagccac tacctacagt caccgaccta cagttaatag 360 acacaatcta tagacttaag gtctaagaca tgttagtcaa agattatatc ctcttagtca 420 ctatggggcc gacgatagct taatcaatat tatttcaaat tacctattga ctataggtct 480 agactatggc taatagcttc cgtcaacacg acacggcaac aaccggatag tgaagacgcc 540 gggtcagacc ggataagtag tcagcctgta agacatacga 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caacgttcag gctccgactg gtgactctgg tctagctcgt gcgttaacca 28140 acttcgttga gtctgggact ggattataca agcagttcaa agacgaggag aagaccagag 28200 ctgatgagcg gtctaacgag attatccgta agttgacacc tcagcaaaga cgtgaggcta 28260 tccagaacgg gacactgcta tatcaggacg acccttacgc tatggaagca cttcgagtca 28320 agacgggccg taacgctgcc tttgcggtgg atgacgagat taacgttaag attcagaacg 28380 gtgagttccg tacacgtcag gacatggaag agtatcgcca ccagcgactt caggatgctg 28440 ctaagtccta tgctgaagag gcaggtatta accctaccga cgagttcttc cagcgtggat 28500 ttaacgataa catcactgac cgaaacatcg ctatctacgg gtctttcaat aagtatttca 28560 gcaagcagtc tgaagagaca gcaatgttga acactcgtat tgagctgaac tcgttcctta 28620 acgatgggga cctgatgcgt tcgcctgagt ctggaaagac cttcatggcc taccttcggg 28680 atggactgac gactgctgct ataccttcgg accagagagc acgagaggtc atcacccaga 28740 cggtccgtga cgcaatccag aagtcaggag gctcaaactt cctacagcaa gtccgtggcg 28800 agcgtatcac ccttaatggt gttgacgcta ccatcgaaga ggttgtagga cctgacgtct 28860 tcaatgctgc tatggttgag gcccaaggta ctgagtataa actggtggct aagtatcagg 28920 aagacttggc gttaggagtt cagtctgcga ttcttcagga cgacccaacc atcggtcttg 28980 cccagattca gaaactcaag gagcagaaca accagcttca acccggcgaa gaactcactc 29040 ctcagcgtca gatgcttatt aatgccgaag ccagcttact tgaagcggta aaacgtaagt 29100 ctgctgaaca ggcgaaggag aacactaagt taatccagac tcagaacaag caactggtca 29160 ttgaccaagt gtatcagcga cgtctggctg gggacaacgt gtccaccaac tatgaggacc 29220 ttccggtatc tgaagctaca ggagagttca agcgttcaga catgaacaac tatgcgtctg 29280 ccaagctaca gcagattgac cagatggaca tccctgaggc tgctaaagat gctcagaagg 29340 tggcattgtt aagagctgac actaacaacg gtcctttccg taatgccttc cagacgctta 29400 ctcaggacgc tgctggtgag tggcaagctg cggtcatccg tggacagtac gacccagaca 29460 agatgaaacg cttcgagtct cttcgtcgtg cctacactca ggacccttca agtttcgctg 29520 ctctgtatcc tgaccaagct cagctgttct ctacgttcga ccagatggac aagatgggtc 29580 ttgaccctca gacgatgatt gaagctgata agcaagctgc aagtcaaagc cgtgagatgc 29640 gcatggaatc agacaaggcg tggcaggagt tgaagaacga ctccaagaac acccagttgt 29700 ctcgcctccc aacgtctctg gattcaagtg ctcgtaaggt ctgggactca tggtactatc 29760 gtacaggtaa cgctgatgct gcaactcagc agactcaacg ctggctgaac gagaacaccg 29820 taacgttcca gtctgaaggt tctgacggta agtcaatcgg catggtatcc aagcaccagc 29880 ttatggtcgg ggataaccct gagtcgtggc aggtaggtcg agacattatc gacaccgccc 29940 gtaagcagct cattaaggcc aacccttggg tagtgaactc tcagttgtcc gttgttgaac 30000 agaacggctc tatcttcctc caagacgcta caggtaccat tcgtattcgc tacgataagg 30060 aacttgtagg taaactctac cgcgaacaac agcagaaggc acaagatgcc gcatatgctc 30120 aggcagaacg tgacgctaac aagcgagcgc gtatcgtcgg gactaaagct gctggtgata 30180 aacgtcgagc tgaccgagag gccaacatcg agaagcgcgg tgggatgtac aatgacgtct 30240 cactggaggg tatcgcaaac gtattaattg gtaaggagta acataatggc gacacgtgga 30300 gtaaggaatt caaaccccgg gaacctccgt aagtccaaag accagtggga aggtgctata 30360 ggtgatgatg gtgaatttgt tatcttcgac agccctgaat ccggggtccg agccttagca 30420 aaaaaccttc aaagctacgg tcgccaaggc tacgactcaa tcgagaagat tatcagccgc 30480 tgggcaccac ctaatgagaa cgacactcag tcatacatca actctgttgt ggctgctact 30540 ggcattccag cgacccagag tctcgacctg acgaaccctg acgtcctcgc ctctctgtct 30600 gaggctatcg gctaccacga gacaggctcc cggtacgacc ctgaagtcta tcagaaggga 30660 gtcgcacggg cactcaacgg tatcacccca aagaccccac cagtaagcgc taacgtattt 30720 gacgctctca cggagggctt gaaggctaaa cctaaagtag ctctgggcga gaaccttccg 30780 accgctgctg gtctaaacat tgagggtcaa gcacctgaag ctcccaacga atcgttcggt 30840 gagatgttct ataaggctac tggagagacc atgcaggagc gagaggatcg ctctacgtgg 30900 ttcggtttcg gtgctgctgc agaagctgaa gtgaagaact ctatggtcgg cgtggctatc 30960 cgagctggtc agactgagga ttcactggat gtcattggtg atgtgttcaa cccgaccaga 31020 tggaacaacc ataagtggtc gcgtgaggag ctggaccaga ttcgtaacgc tggggttctg 31080 cctcagtatt acggagtcat tactggtggc tctcctcaga acctgaccga gcttattaac 31140 ttggcgcttg agaaccagaa gttggaccaa gagaaggcca aggctgggac tggcgctcag 31200 ttagctgctg gtgttattgg tgctggcgtg gaccctctga catacgttcc tattgctgga 31260 caggttggta aaggcgctaa gctggtcaat aagatgttca ccgtggctgc tcaatctgga 31320 gcactggctg gtgtgtctga gatggcccgt acctcagtgg ctggtggtga tgctcatgtg 31380 gcggaagcta tccttggtgg tgctctcttc ggtggtggta tgactgctat cgctgatgga 31440 ctaggcagag ccttaggtcg caacactaat gagttcgctg gcccagctac acgtctggaa 31500 gctcgtgaga ccgctcgtaa cgttgatggt caggacctgt ctcgtctccc tattcaggaa 31560 ggtgagcaga cctttagtca tcaaggcgtt aagttcgctg acgttccgaa cgagtcgggt 31620 agtgtacgac ttgaagatgg ttcaatcctg attggtgaga accctctgaa ccctaagaca 31680 cgtcaggtct ttgatgaagt gattgagcct gaacgtgctg ctgctggtgt gaaccttggt 31740 gggctgactg agattggcct gaagcttctt cggtccgaga accctgagat tcgtggagtc 31800 gctgctgact tagtgcgttc accgactggt atgcagtcag gggcctcagg taaaatcggg 31860 accactgcgt cagacgtatt cgagagactt cgtgctgtgg accatcggtt ctacaacgac 31920 atcgacgatg cggttactga ggcgctcaag gacccatact tccagacagc attctggcga 31980 gactctggcg cattccgtca ggacatctac caacgtgtgt ctatggctat agaagatggt 32040 agcgggaacc tgaagtctga actgactccg ggagaactga aagtctacga cctgctgaag 32100 aaccagtttg acgccaagcg tgagatgatg gagaacccag cgatgtttgg tcgtccagac 32160 gctaagtcta tctttccggg tagtcgcttc aagggaacct acgtcccgca tgtgtatagc 32220 aaccagatga aggagctgta catcaaggag cttggaagtc cagaggcact acaggaggcc 32280 atcaagaagt catggttgac cagctatgcg tctcggcctg aagtcaagaa acgtgtggac 32340 gaggcactct tagaggctga ccctactctg actccagagg gacttgctgc tgcggtcgat 32400 aagtacgcca acgataaggc ttacggtatc tctcacaccg agcagttcga acgttcatcc 32460 gtaatggaag agaacatcaa cggtctggtg ggtcttgaga acaacagctt ccttgaggct 32520 cgtaacctgt tcgatagcga tatgtcaatc gttctgccta acggtcagac cttcagtgtc 32580 aacaacctgc gtgagtggga catggacaag attgtcccgg cctacaaccg tcgagttaat 32640 ggtgacattg ctatcatggc tggtacaggc aagaccacga aggacatgaa ggacttagtt 32700 gagaccatga tgaacaaggc tggtgatgat ggcaagttga aaggtgaggt ctcgacctta 32760 cgagacacct tgaagattct cactggtcgt gctagacgtg atggtgctga cgatgctgcc 32820 ttcgctacag tgatgcgcac aatgacagac ctatcgttct tcgctaagaa tgcctacatg 32880 ggtgttcaga acttaacgga gattggcggt atgctggctc gtggcaacgt tcgtgcaatg 32940 ctgcatggag tcccgatgtt ccgtgaccta gccttccgta acaagaaggt cggggcctca 33000 gagattaagg acctgcacaa tgttatcttc ggtaaagaac tggatgactc aatccgtccg 33060 tctaaacagg acgtcattga ccgtctgcga gcttacagtg acctcggtcg tggtacagct 33120 acagctcttg ggactgccaa gtattacact ggtgaacttg cagtacgctc tccgttcact 33180 aaagtcctga acggtacgac taactacctg cttgatgctg gacgtcaggg cttcttgtct 33240 gacatagtgg agcacagcct gaccggaagt aagcgtaagt ttgatgaccg ctggttgaag 33300 accgctggta tctccgctga ccagtggaag ggcattaagt ccctcatccg tgagtcagtg 33360 actcgtggtc cagacgggaa gtacaccatc aaggataaga aggcgttcag tcaggaccca 33420 agggctatgg acctctggcg catgggtgac accatcgctg atgagaccct cctccgtcct 33480 cacaagctga gcaacatgga tgcaaaggct tatggaccgc tggctaagac tgtcttgcag 33540 tttaagaact tcgtcatcaa gtctatcaac ggtcgtacaa tgcggaccta ctacaacgcc 33600 accaagaaca accgagctat tgacgctgcg ctgtccacgg tgatgtctat gggtctggct 33660 ggtatgtact acatggctca ggcgcacatc aaggcctacg ctatgcagga tggccgcgac 33720 cgtgagtacc tgaagcaggc gcttaaccct acgatgattg gctatgcggc tctgtcccgt 33780 agctcacact tgggtggccc actcggggtc gctaacattc taggtggcat cgctgggtat 33840 gaggacacta agcttctccg ttcgtctatc ctccctcgtt cacctacaga gaagcctgaa 33900 cgtgccatcc cgtatggtgc ggctacaagt gaccctgtga tgaatgtcgt cggtaacttc 33960 ttggagcagg ttccagcttt cggctatgct gctaacgttg gtgcttcggc ttacaacttg 34020 gctggctacc taaaggccga tactcgtgtc aacgagcgag actatatgac aggtatgtat 34080 aataccttcc gagaactagt cccgaacgac ccaattactc agaagctact gcttgggacc 34140 ttcgaggagc aaggcatcca catcaaagac taaactatca ctataggaaa cgggacacta 34200 acataggtcc ctcttatgtc aaactaaagg aggccaaatg tcaggcactt taactcagtt 34260 ccctacaggg agcactcagt ataaaattaa cttcgagtac ctagctcgtg cattcgtggt 34320 cgtgactttg gtcaactctt ctgataactc tcagaaccgt gtactgactg tgggcaatga 34380 ctacacgttc cttaacccta cgacaatcta tgtaactgct aaccaagccg gttatgacat 34440 tatacagatt caccgtgaga ctactacaga acttatcgtt gacttccgtg atggctcagt 34500 cctgactgct agtgatttaa ctaacgctga gcttcaggct gtccatatcg cagaagaggg 34560 taaggaccag actattgaac ggggtcgaca gtatgctgaa gctgctggaa aagaatatga 34620 gaacgctaag tctgagcgcg aagctattga ggacattgtt tcaacttctg gctgggactc 34680 taagttgcgt tctgatttag caggggctga tggatacaca ttagtgccta ctgttgcgcc 34740 taagaactca gtaacaagag tgcccattac gacgttccct tcgtataata attcagctat 34800 tgagcaagca atgtatgact cggtgcagac tctgggatat gcatacatcc ccggcctagg 34860 cgcggaatac actaagtata caatctcaaa cactatatca ccctcagtag atttaacagg 34920 tgcgcgcgtg attgtagacg atatggtttg gatagattca aactatgaca actactcatt 34980 ctttaaatcg ttaaactttg agggcaagtg taagtttact ttcagaaacg gattgtttgg 35040 gatgactggt ggtgaggttg aagccttacc taacgtcgga cgactaaatg aatctccagt 35100 atccatctcc cctatatcgt tcgatgatac gtatgtacgt attctacaga gtgacctaga 35160 tactttctcc accggggtta aaggagcttc taatgattac tcctgtgagt ttgcagttga 35220 agctggtaag tatgctggat tgtttaccgg aataaatatt ggtgagacga taacagggca 35280 tataggagca gcgcacggac aggaaaaagc tgaatcgaca ggtgtcttac tccgtggaga 35340 actaggatgg attctattcg acggatttag taatgggagt gagtggcgtt acagggttaa 35400 gaagaaaggc gaatcaatgg taaatggtgc gtcaatttcc gtacctgagt ctggaatgct 35460 taaatcgtac tctccgtcca atgctacagt tggtattagc cttacagcag cggacagatt 35520 caactttatt gtcaatgggg taagtttgac cccaacattc acatcactag taggatccat 35580 ttatgagata ggattcgtta gttcgaacca aactactatg atgcagagag taacaggcct 35640 gaatctctac acatcaaagc gaggagtctt tgggcatgct cctcttcaca tcttgatacg 35700 tggagattct accgcagaag gattcatctc tacttttgac aagtatctac cgggtcttct 35760 cgacggctcc atgggtacac gcagtttatc aattactaac aaggctattg ctggtgcgtt 35820 catgcgtcag cagcttgacg accttaaggc tgaaggcgct ggacaggcat atatggtaat 35880 catggttggt ggaactaatg aagggcaagc taactacagt cctgacgcgt tcggcgcaat 35940 ggttaaggag tttgctgatt ggtgcatttc taatggtaga gttcctgtct gggttgagcc 36000 gtggatgtgg tattcgaaga cattcgtagg aggtgcagga caagactcta gtaactacga 36060 gaatgctgca caattgcgag agtcaggtaa aagggctatg gcttcttatg gagacctcgg 36120 tatatgcgtt ccgacgacac acatactgcc agcacctatg cctgagtatg taacatctgg 36180 tgttgctcca ctattacgtg atgatattca ccaagatgag ttagggtata aactctatgc 36240 cgaagccatt gcgtccgcga tagtaggctg gtcgtccaag gtatcatcta ggccacgtcc 36300 agcatggagc gaatggtctc gcaatacagc ttcaataacg tacccatcca tagtaaccac 36360 taatagtatt aacgtatcta tggacatcac tggcttctca aatggacagg ttgtacttaa 36420 cctaccacga gggtgccgtc cagtggttac tacggtagcg actgttacac acactactga 36480 taacatcaac tatgctgctg gtttcgctct aatagctcct aatggcgacg tgactgtgca 36540 ggggcttaag tcgacagaag gtcgcataac tattgtagca aattggtaaa taactggagg 36600 ccttatgatt gagttagact tcaagaatga agttcttaag gcctccccta tcgttgggac 36660 cgctgcggct gatggtgcca gtcggttctt ctttggactc acactgaacg aatggttcta 36720 cgttgcagct attgcgtaca ccgttgtcca gattggtgtg ctggtctaca aaacgattaa 36780 agggggagga aagtcatgac acaaatggac ttagagaagt tcctgttaat gctagataca 36840 gagcgtgccc gtctcatgct gcaagacctg cgggatgaca ctaagcgttc acctcagctc 36900 tacaacgcca ttgagaagct actagctcgt cacaactttg tgttaagcaa ggtgtctgtg 36960 gacgagaaga cgctggctga tatggaggcc ctgaacgcag agtacgataa ggtgctttca 37020 gctactgagg ataatgacac cgggtatggt gttcaataag tgttagactc aaggtcatcg 37080 tcaggtggcc tttatgatta acactaagga ggttacatga aagattcata cataagtggc 37140 ggttactgga aggttactcg taacggtaag gttcatggag ttcatagatt actatgggag 37200 gaagcctacg gtactatccc 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tcccgactcg ctgtcagatt gacatggcga agaaactatc ggctggggac 38100 aacaggcgtt tcatcctaca ggcgttccgt ggtatcggga agtccttcat tacgtgtgcc 38160 ttcgtggtct ggaagctatg gaacaaccca gacttgaagt tcatgattgt gtcggcctca 38220 aaggaacgag ccgatgcgaa ctccatattc atcaagcgaa tcatcgacct catgcctcag 38280 cttcaggaac tcaaacctaa gcagggacag agggacgcgg ttatcagctt cgacgttggg 38340 ccagccaagc cggaccactc accttcggtt aagtccgttg gtatcactgg tcagctgact 38400 ggtagtcgtg ctgacatcct gattgccgat gacgtggagg ttccaaacaa ctctgcgact 38460 caggctgcac gagaccgtct gtcagagctt gtgaaagagt tcgacgctat cctgaagccg 38520 ggaggtacaa tcatctatct gggtactcct cagaacgaga tgaccctgta tcgtgagctt 38580 gaaggccgtg ggtataccac tactatctgg cctgctcgtt atcctcgtga taagaaggac 38640 tggcagtctt acggcgaccg tctggctcct atgcttcagg cagaactgga agaggaccct 38700 gagtccttct actggcgtcc gaccgatgaa gtacgattcg atgatacgga cctgaaggaa 38760 cgtgagctgt cctatggtaa agctggcttc gctctacagt tcatgcttaa cccgaacctg 38820 agtgatgctg agaagtaccc tctgaagctc cgtgacctta tcgtagccga cttggaccca 38880 gcgtccagcc caatggtcta ccaatggctg ccaaaccctc agaacaagcg tgaggacgtt 38940 cctaacgttg gactcatggg tgactcatac cacacgtatc agactgtagg ttctgccttc 39000 agttcgtaca cccagaagat tctggtcatt gaccctagtg gtcgtggtaa ggatgaaact 39060 ggttatgcgg tactgtacca gctcaacgga tacatcttcg ctatggaagt tggtggtatg 39120 cgaggtggct atgaagactc tacgctggaa gccttggcta agattggtcg taagtggaag 39180 gtcaacgaat acgtcattga gggtaacttc ggtgatggta tgtaccttga gctattcaag 39240 cctgtagcgg cacgtatcca ccctgcggct gtaactgaag tgaagagtaa gggtcagaaa 39300 gaactacgca tctgtgacgt tctggagcct atcatggggt ctcacaggct tatcgttaac 39360 gctgctgcta tcgtccaaga ctaccagtca gcctctgata aggatggtgt gcgtaaccct 39420 atctactctc tcttctacca gatgacccgt atatctcgtg aacgtggagc cttggcacac 39480 gatgaccgac ttgatgcgct ggctatcggt gtacagttct tcgttgagtc tatggctaag 39540 gatgccaaca aaggcgaacg tgaagtcact gaggagtggc tggaggaaca gatggaggac 39600 ccacggaaag gcttcgagtc catccacact gagttctggg acaatggggt ccgggtaact 39660 catgatacgg acgacgagct gggactaggg tcatacgtta cgttccacta gctgaatgaa 39720 taactatggg tgaaagctgc atgaatacgc ggttagtaac ctatagttac taccagtcta 39780 acctactgtt ttataagaag tttggactta actatcacta taggaaagac caatggttac 39840 ttatagtatt actgtagtga atatacatat gcagacttta tgcaagacct taggaggcag 39900 actccgagtt cttacctaag gcttgcaccg atggaaggag gtgatattaa tcataatccc 39960 tccaatacag atagtcaccg accatagata caggaggtat gtagcatatg gcaaagacca 40020 aagctgtact taaagctctg gcgaccaatc gagctacata caggtttctt gctgctgttc 40080 tacttgctgc tggcgttact gctggaagta agtgggtcgg gtgggtcgag actctcgtat 40140 gttctctggt ctctcagtgt aattaacgca atcatggtaa cgattcatga gtggaagacc 40200 taaggtcagt tcatagctga cgctactcta ctgaccttag ctactgtagt caaggacttt 40260 aggtaacacc ttaagagaag ctcacttagg gtcatcctac ttactggtct accctagtgt 40320 cgcctgacct acggtccttg acctacagtg gctgtggcct acagtaggga cgatgagttt 40380 tggaccaaaa gtttgagacc aca 40403

Claims (17)

1. 병원성 대장균 (Escherichia coli)에 의해 유발된 감염 또는 질환을 예방하거나 치료하기 위한 조성물로서,
   상기 병원성 대장균을 용해시키는 능력을 갖는 포도비리대 (Podoviridae) 박테리오파지; 및
   약제학적으로 허용가능한 담체
   를 포함하는, 조성물.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 포도비리대 박테리오파지는 서열번호 1에 기재된 서열, 또는 서열번호 1과 적어도 90% 일치도로 적어도 80% 조회 범위를 갖는 서열을 포함하는, 조성물.
3. 제 1항에 있어서,
   상기 포도비리대 박테리오파지는 1× 10¹ pfu/mL 내지 1× 10³⁰ pfu/mL 또는 1× 10¹ pfu/g 내지 1 × 10³⁰ pfu/g의 농도를 갖는, 조성물.
4. 제 3항에 있어서,
   상기 포도비리대 박테리오파지는 1× 10⁴ pfu/mL 내지 1× 10¹⁵ pfu/mL 또는 1× 10⁴ pfu/g 내지 1× 10¹⁵ pfu/g의 농도를 갖는, 조성물.
5. 제 1항에 있어서,
   상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 락토스, 덱스트로스, 슈크로스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 칼슘 포스페이트, 알기네이트, 젤라틴, 칼슘 실리케이트, 미세결정 셀룰로우스, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로우스, 물, 시럽, 메틸셀룰로우스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 미네랄 오일인, 조성물.
6. 제 1항에 있어서,
   활택제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁화제 및 보존제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 추가로 포함하는, 조성물.
7. 제 1항에 있어서,
   상기 병원성 대장균은 장 출혈성 대장균, 장 독소생성 대장균, 장 침투성 대장균, 장 병원성 대장균, 장 공격성 대장균 또는 발암성 대장균인, 조성물.
8. 제 1항에 있어서,
   상기 감염 또는 질환은 식중독, 장염, 설사, 요로 감염, 신생아 수막염, 용혈성 요독 증후군, 복막염, 유방염, 패혈증, 그램 음성 폐렴, 쉬겔라증, 이질 또는 암인, 조성물.
9. 제 1항에 있어서,
   상기 조성물은 유성 또는 수용성 매질 중 용액, 현탁액, 유화액, 추출액, 분말, 과립, 정제 또는 캡슐인, 조성물.
10. 제 1항에 있어서,
    상기 포도비리대 박테리오파지는 대략 43 kDa, 48 kDa, 63 kDa, 75 kDa, 85 kDa 및 142 kDa 크기의 주요 구조 단백질을 갖는, 조성물.
11. 제 1항에 있어서,
    상기 포도비리대 박테리오파지는 10분 내지 25분의 잠복기, 및 740 내지 860 pfu/감염된 세포의 방출량을 갖는, 조성물.
12. 제 1항에 있어서,
    상기 잠복기는 15분 내지 20분이고, 상기 방출량은 770 내지 830 pfu/감염된 세포인, 조성물.
13. 제 1항에 있어서,
    병원성 대장균 또는 대장균이 아닌 세균 종을 용해시키는 능력을 갖는 제 2 박테리오파지를 추가로 포함하는, 조성물.
14. 병원성 대장균에 의해 유발된 감염 또는 질환을 예방하거나 치료하는 방법으로서,
    대상체에게 포도비리대 박테리오파지를 투여하는 단계; 및
    상기 병원성 대장균을 상기 포도비리대 박테리오파지로 용해시키는 단계
    를 포함하는, 방법.
15. 제 14항에 있어서,
    상기 포도비리대 박테리오파지는 서열번호 1에 기재된 서열을 포함하는, 방법.
16. 제 14항에 있어서,
    상기 포도비리대 박테리오파지는 1× 10¹ pfu/mL 내지 1× 10³⁰ pfu/mL 또는 1× 10¹ pfu/g 내지 1× 10³⁰ pfu/g의 농도를 갖는, 방법.
17. 제 16항에 있어서,
    상기 포도비리대 박테리오파지는 1× 10⁴ pfu/mL 내지 1× 10¹⁵ pfu/mL 또는 1× 10⁴ pfu/g 내지 1× 10¹⁵ pfu/g의 농도를 갖는, 방법.

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