CN116018153A - 用于抑制致病性大肠杆菌增殖的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

一种用于预防或治疗由致病性大肠杆菌引起的感染或疾病的组合物，包括具有裂解致病性大肠杆菌的能力的短尾噬菌体科噬菌体（Esc‑COP‑30）和药学上可接受的载体。一种用于预防或治疗由致病性大肠杆菌引起的感染或疾病的方法，包括向受试者给药短尾噬菌体科噬菌体以及用短尾噬菌体科噬菌体裂解致病性大肠杆菌。

Description

用于抑制致病性大肠杆菌增殖的组合物和方法

本申请要求于2020年6月6日提交的美国非临时专利申请号 16/893,106的优先权，该申请出于所有目的以引用方式并入，如同在本文中完整阐述一样。

技术领域

本发明涉及用于抑制致病性大肠杆菌(Escherichia coli)增殖的组合物和方法，更具体地说，涉及含短尾噬菌体科噬菌体(Podoviridae bacteriophage)的组合物及其使用方法。

背景技术

大肠杆菌是一种革兰氏阴性、兼性厌氧、杆状大肠杆菌属大肠菌型细菌。在血清学上，根据其是否含有体细胞(O)、鞭毛(H)或荚膜(K) 抗原进行细分，已知这些抗原与大肠杆菌的致病性相关。致病性大肠杆菌是指获得了少量的能够在大肠杆菌中表达的毒力因子的大肠杆菌，根据其发病特征和毒素种类，有五种致病性大肠杆菌，即肠出血性大肠杆菌、产肠毒素大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌和肠聚集性大肠杆菌。

致病性大肠杆菌可引起多种疾病，如食物中毒、急性胰腺炎、尿路感染、败血症和癌症。在致病性大肠杆菌相关的癌症中，结直肠癌是最常见的癌症之一，约占所有癌症病例的10％和所有癌症死亡的8％。此外，结直肠癌在全球非常常见，并通过促使正常粘膜向腺癌的转变的结肠上皮细胞突变的累积而发展。作为导致结直肠癌发生的主要原因之一，结肠息肉是指结肠粘膜异常生长并成为突出到肠内的疣状肿块的情况。它通常分为可能发展成癌症的肿瘤性息肉和不太可能发展成癌症的非肿瘤性息肉。在各种类型的息肉中，腺瘤性息肉随着时间的推移更有可能发展为癌症。虽然致病性大肠杆菌引起的腹泻是一种值得注意的疾病，但一些致病性大肠杆菌的定殖与促使腺瘤性息肉的形成而促使结直肠癌的发展有关。

通常，疫苗和抗生素被用于致病性大肠杆菌的传染性疾病的预防和治疗。在这里，由于抗生素耐药性致病性大肠杆菌的增加，抗生素的有效性一直在不断下降，需要研发除目前处方抗生素以外的有效方法。

最近，使用噬菌体作为防治细菌性传染性疾病的对策引起了广泛关注。噬菌体是感染细菌的非常小的微生物，通常简称为“噬菌体”。一旦噬菌体感染细菌细胞，噬菌体就会在细菌细胞内增殖。增殖后，噬菌体的后代破坏细菌细胞壁并从宿主细菌中逃脱，表明噬菌体具有杀灭细菌的能力。噬菌体感染细菌的方式的特点是其非常高的特异性，因此感染特定细菌的噬菌体类型的数量是有限的。也就是说，某种噬菌体只能感染特定的细菌，这表明某种噬菌体仅能杀灭特定的细菌而不能伤害其他细菌。由于噬菌体的这种细菌特异性，噬菌体仅对目标细菌具有抗菌作用，但不影响包括人类在内的动物中的共生细菌。广泛用于细菌治疗的传统抗生素附带地也会影响多种细菌。这会导致诸如正常菌群紊乱的问题。另一方面，噬菌体的使用不会干扰正常菌群，因为目标细菌被选择性地杀灭。因此，可以安全地使用噬菌体，与任何其他抗生素相比，这大大降低了使用中发生不良反应的可能性。

由于噬菌体具有杀灭细菌的独特的能力，自发现以来，噬菌体作为一种防治细菌感染的潜在的有效对策引起了人们的关注，并进行了大量相关研究。

噬菌体往往对细菌具有高度特异性。由于这种特异性，噬菌体通常仅对某些细菌菌株具有抗菌作用，即使这些细菌属于同一菌种。此外，噬菌体的抗菌强度可能取决于目标菌株的类型。因此，有必要收集多种有用的噬菌体，以便有效控制特定细菌。因此，为了研发针对致病性大肠杆菌的有效噬菌体利用方法，必须获得对致病性大肠杆菌具有抗菌作用的多种噬菌体。此外，需要筛选产生的噬菌体，以确定它们在抗菌强度和抗菌谱方面是否优于其他噬菌体。

发明内容

因此，本发明考虑到相关技术中遇到的问题并且旨在解决这些问题。

在一个实施方式中，用于预防或治疗由致病性大肠杆菌引起的感染或疾病的组合物包括：具有裂解致病性大肠杆菌的能力的短尾噬菌体科噬菌体以及药学上可接受的载体。

在另一个实施方式中，短尾噬菌体科噬菌体包括如SEQ ID NO:1所述的序列或与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性下具有至少80％查询覆盖度的序列。

在另一个实施方式中，短尾噬菌体科噬菌体的浓度为1×10¹pfu/ml 至1×10³⁰pfu/ml或1×10¹pfu/g至1×10³⁰pfu/g。

在另一个实施方式中，短尾噬菌体科噬菌体的浓度为1×10⁴pfu/ml 至1×10¹⁵pfu/ml或1×10⁴pfu/g至1×10¹⁵pfu/g。

在另一个实施方式中，药学上可接受的载体是乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、甲基羟基苯甲酸酯(methylhydroxybenzoate)、丙基羟基苯甲酸酯 (propylhydroxybenzoate)、滑石粉、硬脂酸镁或矿物油。

在另一个实施方式中，组合物还包括选自由润滑剂、润湿剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂和防腐剂组成的组的一个或多个。

在另一个实施方式中，致病性大肠杆菌是肠出血性大肠杆菌、产肠毒素大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠聚集性大肠杆菌或致癌性大肠杆菌。

在另一个实施方式中，感染或疾病是食物中毒、胃肠炎、腹泻、尿路感染、新生儿脑膜炎、溶血性尿毒症综合征、腹膜炎、乳腺炎、败血症、革兰氏阴性肺炎、志贺氏菌病、痢疾或癌症。

在另一个实施方式中，组合物是溶液、悬浮液、油乳剂、水溶性介质、提取物、粉末、颗粒、片剂或胶囊。

在另一个实施方式中，组合物进一步包括具有裂解致病性大肠杆菌或非大肠杆菌细菌种的能力的第二噬菌体。

在另一个实施方式中，短尾噬菌体科噬菌体具有约43kDa，48kDa， 63kDa，75kDa，85kDa和142kDa大小的主要结构蛋白。

在另一个实施方式中，短尾噬菌体科噬菌体具有10-25分钟的潜伏期和740-860PFU/感染细胞的裂解量。

在另一个实施方式中，潜伏期为15-20分钟，裂解量为770-830PFU/ 感染细胞。

在一个实施方式中，用于预防或治疗由致病性大肠杆菌引起的感染或疾病的方法包括向受试者给药短尾噬菌体科噬菌体；以及用短尾噬菌体科噬菌体裂解致病性大肠杆菌。

在另一个实施方式中，短尾噬菌体科噬菌体包括如SEQ ID NO:1所述的序列。

在另一个实施方式中，短尾噬菌体科噬菌体的浓度为1×10¹pfu/ml 至1×10³⁰pfu/ml或1×10¹pfu/g至1×10³⁰pfu/g。

在另一个实施方式中，短尾噬菌体科噬菌体的浓度为1×10⁴pfu/ml 至1×10¹⁵pfu/ml或1×10⁴pfu/g至1×10¹⁵pfu/g。

应当理解，上述一般描述和以下详细描述都是示例性和解释性的，旨在提供对所要求保护的本发明的进一步解释。

发明的有益效果

与基于抗生素的传统组合物和方法相比，本申请的用于抑制致病性大肠杆菌增殖的组合物和方法对致病性大肠杆菌具有高特异性。该组合物可用于预防或治疗致病性大肠杆菌感染，而不影响其他有用的共生菌，并且具有较小的副作用。一般来说，当使用抗生素时，共生菌也受到损害，因此由于其使用而产生各种副作用。同时，在噬菌体对相同细菌菌种表现出抗菌活性的情况下，噬菌体的每种抗菌特性(例如抗菌强度和抗菌谱(宿主范围))是不同的，并且噬菌体通常仅对相同细菌菌种中的某些细菌菌株有效。因此，本申请的组合物和方法在其工业应用中提供了不同的效果。

附图说明

附图是为了提供对本发明的进一步理解，被纳入本说明书并构成本说明书的一部分，附图说明了本发明的实施方式，并与描述一起用于解释本发明的原理。

在附图中：

图1是示出噬菌体Esc-COP-30的形态的电子显微照片。

图2是噬菌体Esc-COP-30的主要结构蛋白的分析结果。

图3是示出噬菌体Esc-COP-30杀灭大肠杆菌能力的实验结果的照片。透明区是由目标细菌裂解形成的斑块。

图4是噬菌体Esc-COP-30的一步生长曲线。

具体实施方式

现在将详细参考本发明的实施方式，其示例在附图中示出。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种名为Esc-COP-30的短尾噬菌体科噬菌体，其具有特异性杀灭大肠杆菌的能力，并具有包含如SEQ ID NO:1所述序列的基因组。在某个实施方式中，短尾噬菌体科噬菌体包括具有以下特征的序列：具有与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性下的至少80％查询覆盖度，具有与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性下的至少85％查询覆盖度，具有与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性下的至少90％查询覆盖度，具有与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性下的至少 95％查询覆盖度，具有与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性下的至少96％查询覆盖度，具有与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性下的至少97％查询覆盖度，具有与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性下的至少98％查询覆盖度，具有与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性下的至少99％查询覆盖度，或具有与SEQ IDNO:1具有至少90％同一性下的至少99.5％查询覆盖度。

本发明还提供了使用包含其作为活性成分的组合物用于预防和治疗由致病性大肠杆菌引起的感染或疾病的方法。

噬菌体Esc-COP-30由本申请的发明人分离，然后于2019年11月 15日保藏在韩国生命工学研究院(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)的韩国典型培养物保藏中心(Korea Collection for Type Cultures)(保藏号：KCTC14032BP)。

短尾噬菌体科噬菌体的主要结构蛋白的分子量约为43kDa，48kDa, 63kDa，75kDa，85kDa和142kDa。

噬菌体Esc-COP-30的潜伏期和裂解量分别为10-25分钟和740-860 PFU/感染细胞，优选分别为15-20分钟和770-830PFU/感染细胞，但不限于此。

此外，本发明提供了一种可用于预防或治疗由致病性大肠杆菌引起的感染或疾病的组合物，其包括噬菌体Esc-COP-30作为活性成分。

因为包含在本发明组合物中的噬菌体Esc-COP-30能有效杀灭致病性大肠杆菌，所以认为其在预防致病性大肠杆菌感染或治疗由致病性大肠杆菌引起的疾病方面有效。因此，本发明的组合物能够被用于预防和治疗由致病性大肠杆菌引起的疾病。

本发明中由致病性大肠杆菌引起的疾病包括食物中毒、胃肠炎、腹泻、尿路感染、新生儿脑膜炎、溶血性尿毒症综合征、腹膜炎、乳腺炎、败血症、革兰氏阴性肺炎、志贺氏菌病、痢疾和癌症，但不限于此。

本发明组合物中包含的药学上可接受的载体是通常用于制备药物制剂的载体，其示例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、甲基羟基苯甲酸酯(methylhydroxybenzoate)、丙基羟基苯甲酸酯(propylhydroxybenzoate)、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油，但不限于此。除了上述成分之外，本发明的组合物还可以包括润滑剂、润湿剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂和防腐剂。

在本发明的组合物中，包括噬菌体Esc-COP-30作为活性成分。包括的噬菌体Esc-COP-30的浓度为1×10¹pfu/ml至1×10³⁰pfu/ml或1×10¹ pfu/g至1×10³⁰pfu/g，优选浓度为1×10⁴pfu/ml至1×10¹⁵pfu/ml或1×10⁴ pfu/g至1×10¹⁵pfu/g。

本发明的组合物可以根据本发明所属领域的普通技术人员使用单位剂量或多剂量容器形式的药学上可接受的载体和/或赋形剂来容易地进行的方法进行配置。然后，制剂可以是溶液、悬浮液或油乳剂或水溶性介质、提取物、粉末、颗粒、片剂或胶囊的形式。可以另外包括分散剂或稳定剂。

为了提高上述目的的有效性，可在本发明组合物中进一步包括对非大肠杆菌细菌菌种具有抗菌活性的噬菌体。此外，在本发明的组合物中还可以包括对大肠杆菌具有抗菌活性的其他种类的噬菌体。可以附加地包括这些噬菌体，以使抗菌效果最大化，因为噬菌体的每种抗菌性质(例如抗菌强度和抗菌谱(宿主范围))在噬菌体对相同细菌菌种表现出抗菌活性的情况下是不同的。

在本说明书中，术语“预防(prevention)”和“预防(prevent)”表示(i)阻断致病性大肠杆菌感染；和(ii)抑制由致病性大肠杆菌感染引起的疾病的进展。

在本说明书中，术语“治疗(treatment)”和“治疗(treat)”表示所有以下活动：(i)抑制由致病性大肠杆菌引起的疾病；和(ii)减轻由致病性大肠杆菌引起的疾病的病理状况。

在本说明书中，术语“致病性大肠杆菌”表示肠出血性大肠杆菌、产肠毒素大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌，肠致病性大肠菌、肠聚集性大肠杆菌和致癌性大肠杆菌，但不限于此。

在本说明书中，术语“由致病性大肠杆菌引起的疾病”和“致病性大肠菌感染”表示食物中毒、胃肠炎、腹泻、尿路感染、新生儿脑膜炎、溶血性尿毒症综合征、腹膜炎、乳腺炎、败血症、革兰氏阴性肺炎、志贺氏菌病、痢疾和癌症，但不限于此。

在本说明书中，术语“潜伏期”表示噬菌体微粒在受感染的宿主细胞内繁殖所需的时间。

在本说明书中，术语“裂解量”表示每个被感染的细菌产生的噬菌体的数量。

在本说明书中，术语“分离(isolate)”、“分离(isolating)”和“分离(isolated)”表示通过应用各种实验技术从自然界中分离噬菌体的行为，以及确保能够区分目标噬菌体和其他噬菌体的特性的行为，并且还包括使用生物工程技术增殖目标噬菌体从而使得目标噬菌体可工业应用的行为。

在本说明书中，术语“查询覆盖度”和“同一性”与BLAST(基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool))有关，BLAST 是NCBI(美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information))提供的在线搜索工具。

在本说明书中，查询覆盖度是描述多少查询序列(即，噬菌体Esc-COP-30的基因组序列)被目标序列(即，先前报告的噬菌体的基因组序列)覆盖的数字。如果数据库中的目标序列涵盖整个查询序列，则查询覆盖度是100％。这表明序列相对于彼此有多长。

在本说明书中，针对“查询覆盖度”测量了术语“同一性”或“序列同一性”，并且“同一性”或“序列同一性”是描述查询序列(即噬菌体Esc-COP-30的基因组序列)与目标序列(即，先前报告的噬菌体的基因组序列)相似程度的数字。更具体地，当查询序列(即噬菌体Esc-COP-30的基因组序列)和目标序列(即，先前报告的噬菌体的基因组序列)通过BLAST比对分析来分析时，术语“同一性”或“序列同一性”是指目标序列(即，先前报告的噬菌体的基因组序列)或查询序列 (即噬菌体Esc-COP-30的基因组序列)的跨越序列部分中相同核苷酸的百分比。同一性百分比越高，匹配越显著。

如以下示例所示，本发明的实际的和当前优选的实施方式是说明性的。

然而，应当理解，本领域技术人员在考虑本公开内容的基础上，可以在本发明的精神和范围内进行修改和改进。

实施例1：能够杀灭大肠杆菌的噬菌体的分离

从环境或临床样本中收集样本，以分离能够杀灭大肠杆菌的噬菌体。这里，用于噬菌体分离的大肠杆菌菌株已经由本申请的发明人预先分离并鉴定为大肠杆菌。

下文详细描述了分离噬菌体的步骤。将收集的样本添加到以1/1000 的比例接种大肠杆菌的TSB(胰酶大豆肉汤)培养基(酪蛋白消化物 17g/L；大豆消化物3g/L；葡萄糖2.5g/L；氯化钠5g/L；磷酸氢二钾2.5g/L)，然后在37℃振荡培养3-4小时。培养完成后，以8,000rpm离心20分钟，回收上清液。回收的上清液以1/1000的比例接种大肠杆菌，然后在37℃振荡培养3-4小时。当样本含有噬菌体时，为了充分增加噬菌体的数量(滴度)，将上述步骤重复总共5次。重复该步骤5次后，将培养液以8,000rpm离心20分钟。离心后，使用0.45μm过滤器过滤回收的上清液。将获得的滤液用于典型的斑点试验，以检查其中是否包含能够杀灭大肠杆菌的噬菌体。

斑点试验如下进行：以1/1000的比例将大肠杆菌接种到TSB培养基，然后在37℃下振荡培养过夜。将2ml(OD₆₀₀为1.5)的上述制备的大肠杆菌培养液涂抹在TSA(酪蛋白消化物15g/L；大豆消化物5g/L，氯化钠5g/L；琼脂15g/L)平板上。将平板放置在清洁的工作台上约30分钟以干燥涂抹的溶液。干燥后，将10μl制备好的滤液点在其上涂有大肠杆菌的平板培养基上，然后放置干燥约30分钟。干燥后，将被点滴的平板培养基在37℃培养一天，然后检查在滴有滤液的位置透明区的形成。在滤液产生透明区的情况下，则判断其中包括能够杀灭大肠杆菌的噬菌体。通过上述检查，可以获得含有具有杀灭大肠杆菌能力的噬菌体的滤液。

从上述确认的滤液中分离出纯噬菌体，以得到能够杀灭大肠杆菌的噬菌体。传统的噬菌斑测定用于分离纯噬菌体。详细地说，使用灭菌的尖端回收在噬菌斑测定过程中形成的斑块，然后将其添加到大肠杆菌的培养溶液中，然后在37℃培养4-5小时。培养后，以8,000rpm离心20 分钟以获得上清液。将大肠杆菌培养液以1/50的体积比添加到获得的上清液中，然后在37℃培养4-5小时。为了增加噬菌体的数量，重复上述步骤至少5次。然后，以8,000rpm离心20分钟，以获得最终上清液。使用得到的上清液进一步进行噬菌斑测定。一般来说，纯噬菌体的分离不是通过步骤的单次迭代完成的，因此使用上述得到的斑块重复上述步骤。在至少5次重复该步骤后，获得含有纯噬菌体的溶液。通常重复分离纯噬菌体的步骤，直到生成的斑块在大小和形态上变得彼此相似。此外，使用电子显微镜确认纯噬菌体的最终分离。重复上述步骤，直到使用电子显微镜确认分离出纯噬菌体。根据常规方法操作电子显微镜。简言之，将含有纯噬菌体的溶液加载到铜网格上，然后用2％醋酸铀酰进行负染色并干燥。然后使用透射式电子显微镜观察其形态。分离的纯噬菌体的电子显微照片如图1所示。根据形态学特征，确认上述分离的新噬菌体属于短尾噬菌体科噬菌体。

对含有上述确认的纯噬菌体的溶液进行以下纯化过程。以噬菌体溶液的总体积计，以1/50的体积比将大肠杆菌培养液添加到含有纯噬菌体的溶液中，然后进一步培养4-5小时。培养后，以8,000rpm离心20分钟以获得上清液。重复该步骤总共5次，以获得含有足够数量的噬菌体的溶液。将最终离心得到的上清液使用0.45μm过滤器过滤，然后采用常规聚乙二醇(PEG)沉淀工艺。具体地，将PEG和NaCl添加到100ml 滤液中，直到达到10％ PEG8000/0.5M NaCl，然后在4℃下放置2-3小时。此后，以8,000rpm离心30分钟以获得噬菌体沉淀。将所得噬菌体沉淀悬浮于5ml缓冲液中(10mM Tris-HCl、10mM MgSO₄、0.1％明胶、 pH8.0)。所得材料称为噬菌体悬浮液或噬菌体溶液。

因此，收集上述纯化的纯噬菌体，命名为噬菌体Esc-COP-30，然后于2019年11月15日保藏在韩国生命工学研究院(Korea Research Institute of Bioscience andBiotechnology)的韩国典型培养物保藏中心(Korea Collection for Type Culture)(保藏号：KCTC 14032BP)。

实施例2：噬菌体Esc-COP-30基因组的分离和序列分析

噬菌体Esc-COP-30的基因组如下进行分离。从使用与实施例1相同的方法从获得的噬菌体悬浮液中分离基因组。首先，为了去除悬浮液中包含的大肠杆菌的DNA和RNA，将200U的脱氧核糖核酸酶I(DNase I) 和核糖核酸酶A(RNase A)分别添加到10ml噬菌体悬浮溶液中，然后在37℃放置30分钟。静置30分钟后，为了停止脱氧核糖核酸酶I(DNase I)和核糖核酸酶A(RNase A)的活性，向其中加入500μl的0.5M乙二胺四乙酸(EDTA)，然后静置10分钟。此外，将所得混合物进一步在65℃放置10分钟，然后向其中加入100μl蛋白酶K(20mg/ml)以破坏噬菌体的外壁，随后在37℃反应20分钟。之后，向其中加入500μl 10％十二烷基硫酸钠(SDS)，然后在65℃反应1小时。反应1小时后，向反应溶液中加入10ml以25:24:1的组分比混合的苯酚∶氯仿∶异戊醇溶液，然后彻底混合。此外，将所得混合物以13,000rpm离心15分钟以分离成多层。在分离的层中，选择上层，并以1.5的体积比向其中加入异丙醇，随后以13,000rpm离心10分钟以沉淀基因组。收集沉淀物后，向沉淀物中加入70％乙醇，然后以13,000rpm离心10分钟以洗涤沉淀物。回收洗涤的沉淀物，真空干燥，然后溶于100μl水中。重复该过程以获得足够量的噬菌体Esc-COP-30的基因组。

通过使用来自首尔国立大学环境管理国家仪器中心(National InstrumentationCenter for Environmental Management,Seoul National University)的Illumina Mi-Seq设备进行下一代测序分析，获得了上述获得的噬菌体Esc-COP-30基因组序列信息。最终分析的噬菌体Esc-COP-30 的基因组大小为40,403bp，全基因组序列由SEQ ID NO:1表达。

使用BLAST调查对上述获得的噬菌体Esc-COP-30基因组序列与先前报道的噬菌体基因组序列的同源性(相似性)进行了研究，发现噬菌体Esc-COP-30的基因组序列与柠檬酸杆菌噬菌体SH3(基因库登录号 KU687349.1)的序列具有相对高的同源性(查询覆盖度：71.5％，序列同一性：91.5％)。然而，噬菌体Esc-COP-30基因组的拓扑为圆形，而柠檬酸杆菌噬菌体SH3具有线性基因组。另外，噬菌体Esc-COP-30基因组上的开放阅读框(openreading frame)(ORF)数量为50，而柠檬酸杆菌噬菌体SH3具有49个开放阅读框。

根据这一结果，可以得出结论，噬菌体Esc-COP-30一定是一种不同于传统报道的噬菌体的新型噬菌体。此外，由于噬菌体的抗菌强度和抗菌谱通常取决于噬菌体的类型，因此认为噬菌体Esc-COP-30可以提供不同于先前报道的任何其他噬菌体的抗菌活性。

实施例3：噬菌体Esc-COP-30的主要结构蛋白的分析

进行一维电泳以分析噬菌体Esc-COP-30的主要结构蛋白。为了获得构成噬菌体Esc-COP-30外壁的蛋白质，将200μl的实施例1中制备的噬菌体悬浮液与800μl丙酮混合，并剧烈旋转。混合物在-20℃下静置10 分钟。以13,000rpm在4℃离心20分钟以除去上清液，然后空气干燥。将沉淀物重新悬浮在50μl电泳样本缓冲液(5×)中，然后将其煮沸5分钟。通过一维电泳分析制备的样本。因此，如图2所示，确认了大小约为43kDa、48kDa、63kDa和75kDa，85kDa和142kDa的主要结构蛋白。

实施例4：噬菌体Esc-COP-30杀灭致病性大肠杆菌能力的研究

研究了噬菌体Esc-COP-30杀灭致病性大肠杆菌的能力。为了研究杀灭能力，以与实施例1中所述相同的方式使用斑点试验观察透明区的形成。将总共5株已鉴定为pks阳性的大肠杆菌菌株(其为pks基因组岛的阳性载体)用作致病性大肠杆菌以研究杀灭能力。噬菌体Esc-COP-30具有裂解和杀灭作为实验目标的5株致病性大肠杆菌中总共3株的能力。其实验结果示于表1中，代表性结果示于图3中。

[表1]噬菌体Esc-COP-30的抗菌活性测试

同时，也在单独的实验中研究了噬菌体Esc-COP-30对支气管败血症博代氏杆菌(Bordetella bronchiseptica)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)、肺炎双球菌(Streptococcus pneumoniae)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的杀灭能力。结果，噬菌体 Esc-COP-30不具有杀灭这些细菌的能力。

因此，证实噬菌体Esc-COP-30具有较强的杀灭致病性大肠杆菌的能力和针对致病性大肠杆菌的广谱抗菌谱，这表明噬菌体Esc-COP-30可以用作用于预防和治疗致病性大肠杆菌感染的组合物的活性成分。

实施例5：噬菌体Esc-COP-30的生长特性

噬菌体Esc-COP-30的生长特性通过一步生长曲线分析进行分析。噬菌体Esc-COP-30的一步生长曲线分析如下进行：将50ml TSB(胰酶大豆肉汤，Difco)培养基以1/1000的比例接种大肠杆菌，然后振荡培养直至指数期(OD₆₀₀＝0.3～0.4)。培养完成后，以8,000rpm离心5分钟，回收细菌细胞沉淀物。将回收的沉淀物悬浮在50ml TSB中。所得材料可称为细菌悬浮液。将噬菌体Esc-COP-30与细菌悬浮液以0.1的感染复数 (MOI)混合，并在室温下培养10分钟，然后以12,000rpm离心30秒。除去上清液后，将含有噬菌体感染的细菌细胞的沉淀物悬浮于50ml TSB 中，并在37℃振荡培养。在60分钟内以5分钟间隔取等分试样，并立即通过常规噬菌斑测定法测定等分试样中的滴度(图4)。

噬菌体Esc-COP-30的潜伏期估计约为15±5分钟，平均裂解量约为 800±30pfu/感染细胞。

实施例6：关于使用噬菌体Esc-COP-30预防致病性大肠杆菌感染的实验实施例

将100μl噬菌体Esc-COP-30悬浮液(1×10⁸pfu/ml)加入含有9ml TSB 培养基的试管中。在含有9ml TSB培养基的另一试管中，仅进一步添加相同量的TSB培养基。然后将致病性大肠杆菌(pks阳性菌株CCARM 1G937)培养液添加到每个试管中，使得在600nm处的吸光度达到约0.5。添加致病性大肠杆菌后，将试管转移到37℃的培养箱中，然后进行振荡培养，在此期间观察致病性大肠杆菌的生长。如表2所示，观察到在添加了噬菌体Esc-COP-30悬浮液的试管中抑制了致病性大肠杆菌的生长，而在未添加噬菌体悬浮液的试管中没有抑制致病性大肠杆菌的生长。

[表2]噬菌体Esc-COP-30的细菌生长抑制试验

上述结果表明，本发明的噬菌体Esc-COP-30不仅抑制致病性大肠杆菌的生长，而且具有杀灭致病性大肠杆菌的能力。因此，得出结论，噬菌体Esc-COP-30可用作用于预防致病性大肠杆菌感染的组合物的活性成分。

实施例7：噬菌体Esc-COP-30对动物模型中大肠杆菌感染的预防作用

研究了噬菌体Esc-COP-30对受大肠杆菌影响的断奶仔猪的预防作用。将4头25日龄断奶仔猪组在一起；每个猪圈(1.1m×1.0m)共饲养 2组猪。提供加热系统，并控制周围环境。始终控制猪圈的温度和湿度，每天清洁地板。从实验的第1天开始，按照常规饲料供应步骤向实验组的猪(添加噬菌体)喂食添加了1×10⁸pfu/g的噬菌体Esc-COP-30的饲料，同时按照常规步骤向对照组的猪(不添加噬菌体)喂食不添加噬菌体Esc-COP-30的相同的饲料。从实验第7天开始，两组的饲料均被1× 10⁸cfu/g致病性大肠杆菌污染2天，然后分别为实验组和对照组每天提供两次，以引起致病性大肠杆菌感染。给药的致病性大肠杆菌悬浮液制备如下：使用TSB培养基在37℃培养致病性大肠杆菌(菌株CCARM 1G941)18小时，之后分离细菌并使用生理盐水(pH 7.2)将细菌调节至 10⁹CFU/ml。从提供受污染饲料2天后的第二天(实验的第9天)开始，实验组(添加噬菌体)的猪按照之前的常规饲料供应步骤再次喂食添加了1×10⁸pfu/g噬菌体Esc-COP-30且不污染致病性大肠杆菌的饲料，而对照组(不添加噬菌体)的猪按照常规步骤喂食不添加噬菌体的相同饲料。从实验第9天开始，每天检查所有试验动物的腹泻情况。通过根据腹泻指数进行测量来确定腹泻程度。腹泻指数采用常用的粪便稠度(FC) 评分来测量(正常：0，软便：1，轻度腹泻(loose diarrhea)：2，严重腹泻：3)。结果如表3所示。

[表3]粪便稠度评分

从上述结果可以证实，本发明的噬菌体Esc-COP-30可以非常有效地抑制致病性大肠杆菌的感染。

实施例8：使用噬菌体Esc-COP-30治疗致病性大肠杆菌的传染性疾病的实施例

噬菌体Esc-COP-30对致病性大肠杆菌引起的疾病的治疗效果评估如下：将40只8周龄小鼠分为两组，每组20只小鼠，然后将每组5只小鼠的亚组分别饲养在单独的实验鼠笼中，实验进行7天。在实验的第二天，通过腹腔注射向所有小鼠给药0.1ml致病性大肠杆菌悬浮液。给药的致病性大肠杆菌悬浮液制备如下：使用TSB培养基在37℃培养致病性大肠杆菌(菌株CCARM 1G941)18小时，之后分离细菌并使用生理盐水(pH 7.2)将细菌调节至10⁹CFU/ml。在给药致病性大肠杆菌后2 小时，通过腹腔注射给实验组小鼠(用噬菌体悬浮液给药)给药10⁹pfu 的噬菌体Esc-COP-30。通过腹腔内注射给对照组小鼠(不给药噬菌体悬浮液)给药0.1ml盐水。对照组和实验组均同等喂食饲料和饮用水。从给药致病性大肠杆菌开始直到试验结束，每天观察小鼠是否存活。结果如下表4所示。

[表4]存活率

从上述结果可以明显地得出结论，本发明的噬菌体Esc-COP-30在治疗致病性大肠杆菌引起的疾病方面非常有效。

本领域技术人员将认识到，上述描述中公开的概念和具体实施方式可以容易地用作改进或设计其他实施方式以实现本发明的相同目的的基础。本领域技术人员还将理解，这样的等效实施方式不脱离所附权利要求中所述的本发明的精神和范围。

本领域技术人员将清楚，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可以对本发明进行各种改进和变化。因此，本发明旨在覆盖本发明的改进和变化，只要它们在所附权利要求及其等价物的范围内。

保藏号

保藏机构名称：KCTC

保藏号：KCTC 14032BP

保藏日期：20191115。

序列表

<110> 尹特荣生物科技株式会社

<120> 用于抑制致病性大肠杆菌增殖的组合物和方法

<130> 200010056WO

<150> US 16/893,106

<151> 2020-06-04

<160> 1

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 40403

<212> DNA

<213> 未知的

<220>

<223> 短尾噬菌体科噬菌体(Podoviridae bacteriophage)

<400> 1

tctcacagtt caagaacctc aagtcccccc ataggccctc tttaagtccg accaaaggcc 60

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cgacgaccag tggcaactct atcaggtgct gcgcgattgc tcctcacggt ctccgtatgt 1200

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acgctatcat ctgcgaggcg tgctacaaga ctgaagactc aagcgcaggc atagcaggtc 1920

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gctttaagaa agacgactca ggcgctgcgt atgcggcctt ctgccgagag aatgagggca 2100

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gcttgataat cactgaccca gtgtcttgga ccgcaagcga ccatcaagac gagatgcaag 2520

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gattatttct cacaacatat agaggtgaac tatgaacatc tggtactggg tgtgcttatc 2640

tccggtcatc ttcctgatag ctttcggtct tctggatgca atcaagcgag ggtctttcta 2700

atggcttggg cacttctggt catcggctac gggttaatcc tcgcagtcct cacgaaagac 2760

atcgtgaaag cacgtaaagt ctaccgcttc cagtatgtat cactgggccg ctggactgta 2820

agacaaccaa acgggcgctt tctgcgcaac ctcgcaaacg tctgggacat cgcaacctta 2880

gggagtaaac tgtaatgaac aagtcatacg ggattaatct ggtgcactct atggacgcag 2940

aaatgaacat gttaagccta ctggctaccg ggtatcgtca cggaaagtca agtcacacca 3000

cacgtcaaca gcaggagcgc gaccgtgtac ttcaggcacg actacgggct gagggccata 3060

agtccgaact gatgtgtctg gcgtatggtg gactaccaat cactgacgat ggtaaacttc 3120

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ataggactca aggtctaaga ctccaagtga aagaccaaag agactttaaa gtgaaagact 3300

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ccttgagcgc cagactgagc gcggggaact ggcagacaat caggtcgcca agcctctcat 3540

gcagactctg gtccctaaga ttgcgcaagc cgtcaaggag tggcatgaag gtccagacgg 3600

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aggtcgcaca cttgaggacg aaatccgctt cggtcgcatc cgtgacaagg agaaggagca 3840

cttcaagaag gcgatagctg agaacctgaa caagcgagcc ggggtatcct acaagaaagc 3900

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ggctgcggtc cagcgctacg aagacgtgta catgcctgaa gtttacgagg cggtgaacat 4320

cattcagcag actccttgga aggtaaacaa gaaggtgctg gaagtggtga acatggtcga 4380

gaagctgaat aacacgccta tcgctgacat ccctcagatg gagccgctga agcctgaaga 4440

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tctggcggta ggcaagccaa tcggtgcgga cggcttcaaa tggctgaagg tacacggtgc 4740

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gcacttcagt gctatgctcc gtgaccacgt tggtggacat gcagtcaacc tgacgccaag 5040

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tccgaagaaa ggtaaactga atatcgaaga catcttgtct tcagactttg cattcgctta 6000

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aacaaggtag tgaccgtaac caaggtggct ggcaagggtc tggtcaaggt tactatggtc 6120

ccgactggaa cggctaaggc caagggtatc agccagaagg agctgattca ggtaatccag 6180

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accctaaata aacactactg gagatttaac catatgtatc agaatactat caacttcgag 6420

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ccaaccctca ccgcgctgta gattactctg agtcaggagt taagaaggcg ctggctgctg 6900

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gagagggtga gacctattgg ctgagccgtg agtctaaacc tcttccagcc ttggagtgga 7020

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ggactgcgtg aagcggggac gtcactcgaa accgccagta ttcaaaggag aagctaatca 10140

caagactaag ctgaccgagg aagacgtagc gtttatcctg aagtccaagc tgaggcctat 10200

agaacttgct aagatgtttg gcgttactca gcaagctatt aattggagac gcaagaatgg 10260

caagaacgat tagccgaggg catcaagtag gaatatatag gtctggacta gaagcaaaga 10320

accaagagtg gctggagaag aacggagtta aggctgagta cgagatgtat agcatcaagt 10380

acacaatacc agaatccctt cacagttatt gtccagactt tgtactgccc aacggaatca 10440

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cacgcagcct aacggaatgt ggggggcgtg ggtttcagaa ggatatcttg aggaaatctt 10920

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cagcacggat gctaaccgtt tccaacgtca tctgaaccta gtagctgtag agctggtggt 11160

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acattcgtaa cggtaacaaa tggaggcacg tttaatggct accaaggtac aattcaagcc 11640

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aacgggtaca aagacgccaa cgctgcactt caggccaagg acttcaaggc catcaccgat 13140

gctatctgga acgctaaacc tttcgtcccg gctggtgtgg tatcagcatc aagtctgaag 13200

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atgtggctct acaaaggagt ccactgagtt caggaagaca aatgggtggt gcatatcctg 14400

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attgtggtgt tatcattaac gctggaactc aggctactga gaaatatggt gttgccccta 14880

tgactgggct gacaggtgga ttcaaagagt acatagaccg catagaatct attatggcat 14940

ccactgacgg tatgctggtt ctgcacaatg gtgtgaacta tgatatacca gccttgaaaa 15000

tactgaagaa gaaatacttt ggtaagaacc taaatgtgaa taagggtcga attattgata 15060

ccttggtgct gggccgcttg atgtatccca acattaagtt ctcagacatg ggagcagtga 15120

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agccgaagaa caaagctcaa cgcttaggtc ttgaaccttg tgaacgcgat acgagagaca 15720

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tcaacccatg cggtgcagta accggacgtg cgacccatag ttcaccaaac atggctcagg 16080

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agcttcgttg tctggggaac cgagcagcac cgtttgatgg tggagcctat gcgaagactg 16260

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ctgagaagac gggagctatc agtctcctca agcagcaggg ctacagcgat gcgttcattg 18660

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cttggcacag accgactccc ggtctggacc tttcaatagt cgctattcgt cgtgactcgc 19260

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ccaagtgcgt tagcatgaac aaggagatta accgtgggta aatcaatcag taaggctttc 19440

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cagccgtaac tgactggcag gttgttgtgt ttcctattaa ctaccaaagg agaatgactc 21420

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gaccgatggt gctcagcctg agttcatcga actgggtgat gcaccaaaag agctgaccga 21720

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agaagctggc aaggtcactg ctgacgaaat taccgctatc aaggctgaat acgccaagga 21840

cggtaagctg tctgacgcat cctacgctaa gttgcaggaa gcaggttata ccaagcgttt 21900

cgtagattcg tttgtccgtg gtcaggaagc tctggctgaa cagtatgctg ctggtgtggt 21960

tcgctatgct ggtggtgctg aacagtttaa tcgcatcctg tcacaccttg agtccaacga 22020

cccgtcaact cgtgaggcac tggaagctgc tatcgttcgt aaggacattg cgactaccaa 22080

agctctgctg aatctggctg gcaagactct gggtaaagct gtgggtgtta aacctcagcg 22140

taccatcacc actcaggcta aacctgtggt cgcacctaag gctcctcaga ccgaagcatt 22200

cagctctaag gctgacatga ttaaggctat gagtgacccg cgatacctgc gtgacgctaa 22260

gtacacgatg gaagttcgcg ctaaggtagc tgcatcaagc ctgtagttga ctaaactatc 22320

actataggga gaccaagaga ctctgaaagg aagagactca atgtttccct attacttcag 22380

tccatacgga ttgggcgtac agtaagtaat aaactttatc tttcaattga ataggagaat 22440

tatcatatgg caaacgttcc gggtcagaaa attggtacag accaaggtaa aggcaaatcc 22500

agttccgacg ctctggcgtt gttcctgaag gtatttgctg gtgaagtcct gaccgcattc 22560

actcgccgct ctgtaactgc cgacaagcat attgtccgta ccattcagaa cggtaagtct 22620

gctcagttcc cggtcatggg tcgcacctct ggtgtgtatc tggctccggg tgagcgactg 22680

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gagtattcca accagctcgg cgaatctctg gctattgctg ctgatggtgc ggtactggct 22860

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gaagcaatca tcggtcaatt gacaattgct cgtgcgaagt tgacctccaa ctacgttcct 23040

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gtaatgggct tcgttgtggt tgaggttcct cacctgacgc agggtggtgc tggcgaaact 23220

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actggtgatg ttaaagttgc tctggacaac gttgtgggcc tgttctctca ccgttctgct 23340

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tgactgctgg tgctaccagt tactacagca acatgggagg atacctttat gacctgtcca 24000

ctcagtccac gaccttcact ggtccaatta cagttgaact ggtagagatg aaaccgttcg 24060

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accagcaggt gatggagtac gagatggaca ctggtcgcta caacatgatg tctgacatag 24240

ggagggacta atggcctacc attacctgaa gattgaccct gagttctttg agcctgttat 24300

ctcaggacta aagactgctg agctgagact caacgacagg gactataagg ttggcgactg 24360

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agcctgacat cctcaggttc caagaccaag ggtcacttca ggtaaacgct tggtcatctg 24600

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ttagccaccc cggttatgac atgaagcatc gcgctctgat taacatacgt ggtggacaat 24960

atgggcgcac ccttaccgtc tcaattaatg gtggaccagc tgtatcccat gtccttccga 25020

atggtagtaa tgctgagact gaccctccaa aggtagatgc ccagaacata ggcttcgagc 25080

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ttgagattat tcctcctgat ggtaccaaca ttagcagcgt ggagacagcg gatggttatt 25200

ctaaccagtt aatcaacgca gtgttggaca ccgtacagag tgtgagtaag ttaccactag 25260

ccgcacctga cggctacatt atccgaatcc aaggcgagac gaacagttct gctgacgaat 25320

acttcgtaag gtacgatgcc tctcgtaaga cttggcggga gactgtggag ccgggagtgg 25380

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ttgactttac gtctctggat tgggcaggac gtggcgcagg caatgatgat actaacccta 25500

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ggggcatctg ggactttggc gagtacggag actgtaaggt tctggcaact gcttgtatcg 26160

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tacagcttcg cagggcatgg attaactatc aggatacagg cgctatgata ctgaaggtta 26640

agactccagc gcgtgagttt gagaacactc tcaacggcta taagctgggc cagcagacca 26700

tcgggtctgt gagcattggg tccgggcagt ttaggttccc tatgaacggc gacgccaccc 26760

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gggaggcttc atacgcgcgt aaagcgaagt ctatctaact tactgattgg cctatagatt 26880

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ctttatgtat attcgtaaag ctacggaacc ggatgtccac tactttatgt ggcatctttc 27000

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gtcaaggaga gagcagggat taccgaaagt tacaaccgcg actatgcggc tatcttcggg 27780

aaccgtatcg ccaacattga gaacaccaag tctgctatcc gcggtcaagg taaaatcatc 27840

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ctctggctaa tcggactatg ggtcgtggca gagcgcctgg taaaactatc gccgtcaact 28080

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gtgagttccg tacacgtcag gacatggaag agtatcgcca ccagcgactt caggatgctg 28440

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tcaatgctgc tatggttgag gcccaaggta ctgagtataa actggtggct aagtatcagg 28920

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cccagattca gaaactcaag gagcagaaca accagcttca acccggcgaa gaactcactc 29040

ctcagcgtca gatgcttatt aatgccgaag ccagcttact tgaagcggta aaacgtaagt 29100

ctgctgaaca ggcgaaggag aacactaagt taatccagac tcagaacaag caactggtca 29160

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ttccggtatc tgaagctaca ggagagttca agcgttcaga catgaacaac tatgcgtctg 29280

ccaagctaca gcagattgac cagatggaca tccctgaggc tgctaaagat gctcagaagg 29340

tggcattgtt aagagctgac actaacaacg gtcctttccg taatgccttc cagacgctta 29400

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agatgaaacg cttcgagtct cttcgtcgtg cctacactca ggacccttca agtttcgctg 29520

ctctgtatcc tgaccaagct cagctgttct ctacgttcga ccagatggac aagatgggtc 29580

ttgaccctca gacgatgatt gaagctgata agcaagctgc aagtcaaagc cgtgagatgc 29640

gcatggaatc agacaaggcg tggcaggagt tgaagaacga ctccaagaac acccagttgt 29700

ctcgcctccc aacgtctctg gattcaagtg ctcgtaaggt ctgggactca tggtactatc 29760

gtacaggtaa cgctgatgct gcaactcagc agactcaacg ctggctgaac gagaacaccg 29820

taacgttcca gtctgaaggt tctgacggta agtcaatcgg catggtatcc aagcaccagc 29880

ttatggtcgg ggataaccct gagtcgtggc aggtaggtcg agacattatc gacaccgccc 29940

gtaagcagct cattaaggcc aacccttggg tagtgaactc tcagttgtcc gttgttgaac 30000

agaacggctc tatcttcctc caagacgcta caggtaccat tcgtattcgc tacgataagg 30060

aacttgtagg taaactctac cgcgaacaac agcagaaggc acaagatgcc gcatatgctc 30120

aggcagaacg tgacgctaac aagcgagcgc gtatcgtcgg gactaaagct gctggtgata 30180

aacgtcgagc tgaccgagag gccaacatcg agaagcgcgg tgggatgtac aatgacgtct 30240

cactggaggg tatcgcaaac gtattaattg gtaaggagta acataatggc gacacgtgga 30300

gtaaggaatt caaaccccgg gaacctccgt aagtccaaag accagtggga aggtgctata 30360

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tgggcaccac ctaatgagaa cgacactcag tcatacatca actctgttgt ggctgctact 30540

ggcattccag cgacccagag tctcgacctg acgaaccctg acgtcctcgc ctctctgtct 30600

gaggctatcg gctaccacga gacaggctcc cggtacgacc ctgaagtcta tcagaaggga 30660

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gacgctctca cggagggctt gaaggctaaa cctaaagtag ctctgggcga gaaccttccg 30780

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gagatgttct ataaggctac tggagagacc atgcaggagc gagaggatcg ctctacgtgg 30900

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cgagctggtc agactgagga ttcactggat gtcattggtg atgtgttcaa cccgaccaga 31020

tggaacaacc ataagtggtc gcgtgaggag ctggaccaga ttcgtaacgc tggggttctg 31080

cctcagtatt acggagtcat tactggtggc tctcctcaga acctgaccga gcttattaac 31140

ttggcgcttg agaaccagaa gttggaccaa gagaaggcca aggctgggac tggcgctcag 31200

ttagctgctg gtgttattgg tgctggcgtg gaccctctga catacgttcc tattgctgga 31260

caggttggta aaggcgctaa gctggtcaat aagatgttca ccgtggctgc tcaatctgga 31320

gcactggctg gtgtgtctga gatggcccgt acctcagtgg ctggtggtga tgctcatgtg 31380

gcggaagcta tccttggtgg tgctctcttc ggtggtggta tgactgctat cgctgatgga 31440

ctaggcagag ccttaggtcg caacactaat gagttcgctg gcccagctac acgtctggaa 31500

gctcgtgaga ccgctcgtaa cgttgatggt caggacctgt ctcgtctccc tattcaggaa 31560

ggtgagcaga cctttagtca tcaaggcgtt aagttcgctg acgttccgaa cgagtcgggt 31620

agtgtacgac ttgaagatgg ttcaatcctg attggtgaga accctctgaa ccctaagaca 31680

cgtcaggtct ttgatgaagt gattgagcct gaacgtgctg ctgctggtgt gaaccttggt 31740

gggctgactg agattggcct gaagcttctt cggtccgaga accctgagat tcgtggagtc 31800

gctgctgact tagtgcgttc accgactggt atgcagtcag gggcctcagg taaaatcggg 31860

accactgcgt cagacgtatt cgagagactt cgtgctgtgg accatcggtt ctacaacgac 31920

atcgacgatg cggttactga ggcgctcaag gacccatact tccagacagc attctggcga 31980

gactctggcg cattccgtca ggacatctac caacgtgtgt ctatggctat agaagatggt 32040

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aaccagtttg acgccaagcg tgagatgatg gagaacccag cgatgtttgg tcgtccagac 32160

gctaagtcta tctttccggg tagtcgcttc aagggaacct acgtcccgca tgtgtatagc 32220

aaccagatga aggagctgta catcaaggag cttggaagtc cagaggcact acaggaggcc 32280

atcaagaagt catggttgac cagctatgcg tctcggcctg aagtcaagaa acgtgtggac 32340

gaggcactct tagaggctga ccctactctg actccagagg gacttgctgc tgcggtcgat 32400

aagtacgcca acgataaggc ttacggtatc tctcacaccg agcagttcga acgttcatcc 32460

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ggtgacattg ctatcatggc tggtacaggc aagaccacga aggacatgaa ggacttagtt 32700

gagaccatga tgaacaaggc tggtgatgat ggcaagttga aaggtgaggt ctcgacctta 32760

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ttcgctacag tgatgcgcac aatgacagac ctatcgttct tcgctaagaa tgcctacatg 32880

ggtgttcaga acttaacgga gattggcggt atgctggctc gtggcaacgt tcgtgcaatg 32940

ctgcatggag tcccgatgtt ccgtgaccta gccttccgta acaagaaggt cggggcctca 33000

gagattaagg acctgcacaa tgttatcttc ggtaaagaac tggatgactc aatccgtccg 33060

tctaaacagg acgtcattga ccgtctgcga gcttacagtg acctcggtcg tggtacagct 33120

acagctcttg ggactgccaa gtattacact ggtgaacttg cagtacgctc tccgttcact 33180

aaagtcctga acggtacgac taactacctg cttgatgctg gacgtcaggg cttcttgtct 33240

gacatagtgg agcacagcct gaccggaagt aagcgtaagt ttgatgaccg ctggttgaag 33300

accgctggta tctccgctga ccagtggaag ggcattaagt ccctcatccg tgagtcagtg 33360

actcgtggtc cagacgggaa gtacaccatc aaggataaga aggcgttcag tcaggaccca 33420

agggctatgg acctctggcg catgggtgac accatcgctg atgagaccct cctccgtcct 33480

cacaagctga gcaacatgga tgcaaaggct tatggaccgc tggctaagac tgtcttgcag 33540

tttaagaact tcgtcatcaa gtctatcaac ggtcgtacaa tgcggaccta ctacaacgcc 33600

accaagaaca accgagctat tgacgctgcg ctgtccacgg tgatgtctat gggtctggct 33660

ggtatgtact acatggctca ggcgcacatc aaggcctacg ctatgcagga tggccgcgac 33720

cgtgagtacc tgaagcaggc gcttaaccct acgatgattg gctatgcggc tctgtcccgt 33780

agctcacact tgggtggccc actcggggtc gctaacattc taggtggcat cgctgggtat 33840

gaggacacta agcttctccg ttcgtctatc ctccctcgtt cacctacaga gaagcctgaa 33900

cgtgccatcc cgtatggtgc ggctacaagt gaccctgtga tgaatgtcgt cggtaacttc 33960

ttggagcagg ttccagcttt cggctatgct gctaacgttg gtgcttcggc ttacaacttg 34020

gctggctacc taaaggccga tactcgtgtc aacgagcgag actatatgac aggtatgtat 34080

aataccttcc gagaactagt cccgaacgac ccaattactc agaagctact gcttgggacc 34140

ttcgaggagc aaggcatcca catcaaagac taaactatca ctataggaaa cgggacacta 34200

acataggtcc ctcttatgtc aaactaaagg aggccaaatg tcaggcactt taactcagtt 34260

ccctacaggg agcactcagt ataaaattaa cttcgagtac ctagctcgtg cattcgtggt 34320

cgtgactttg gtcaactctt ctgataactc tcagaaccgt gtactgactg tgggcaatga 34380

ctacacgttc cttaacccta cgacaatcta tgtaactgct aaccaagccg gttatgacat 34440

tatacagatt caccgtgaga ctactacaga acttatcgtt gacttccgtg atggctcagt 34500

cctgactgct agtgatttaa ctaacgctga gcttcaggct gtccatatcg cagaagaggg 34560

taaggaccag actattgaac ggggtcgaca gtatgctgaa gctgctggaa aagaatatga 34620

gaacgctaag tctgagcgcg aagctattga ggacattgtt tcaacttctg gctgggactc 34680

taagttgcgt tctgatttag caggggctga tggatacaca ttagtgccta ctgttgcgcc 34740

taagaactca gtaacaagag tgcccattac gacgttccct tcgtataata attcagctat 34800

tgagcaagca atgtatgact cggtgcagac tctgggatat gcatacatcc ccggcctagg 34860

cgcggaatac actaagtata caatctcaaa cactatatca ccctcagtag atttaacagg 34920

tgcgcgcgtg attgtagacg atatggtttg gatagattca aactatgaca actactcatt 34980

ctttaaatcg ttaaactttg agggcaagtg taagtttact ttcagaaacg gattgtttgg 35040

gatgactggt ggtgaggttg aagccttacc taacgtcgga cgactaaatg aatctccagt 35100

atccatctcc cctatatcgt tcgatgatac gtatgtacgt attctacaga gtgacctaga 35160

tactttctcc accggggtta aaggagcttc taatgattac tcctgtgagt ttgcagttga 35220

agctggtaag tatgctggat tgtttaccgg aataaatatt ggtgagacga taacagggca 35280

tataggagca gcgcacggac aggaaaaagc tgaatcgaca ggtgtcttac tccgtggaga 35340

actaggatgg attctattcg acggatttag taatgggagt gagtggcgtt acagggttaa 35400

gaagaaaggc gaatcaatgg taaatggtgc gtcaatttcc gtacctgagt ctggaatgct 35460

taaatcgtac tctccgtcca atgctacagt tggtattagc cttacagcag cggacagatt 35520

caactttatt gtcaatgggg taagtttgac cccaacattc acatcactag taggatccat 35580

ttatgagata ggattcgtta gttcgaacca aactactatg atgcagagag taacaggcct 35640

gaatctctac acatcaaagc gaggagtctt tgggcatgct cctcttcaca tcttgatacg 35700

tggagattct accgcagaag gattcatctc tacttttgac aagtatctac cgggtcttct 35760

cgacggctcc atgggtacac gcagtttatc aattactaac aaggctattg ctggtgcgtt 35820

catgcgtcag cagcttgacg accttaaggc tgaaggcgct ggacaggcat atatggtaat 35880

catggttggt ggaactaatg aagggcaagc taactacagt cctgacgcgt tcggcgcaat 35940

ggttaaggag tttgctgatt ggtgcatttc taatggtaga gttcctgtct gggttgagcc 36000

gtggatgtgg tattcgaaga cattcgtagg aggtgcagga caagactcta gtaactacga 36060

gaatgctgca caattgcgag agtcaggtaa aagggctatg gcttcttatg gagacctcgg 36120

tatatgcgtt ccgacgacac acatactgcc agcacctatg cctgagtatg taacatctgg 36180

tgttgctcca ctattacgtg atgatattca ccaagatgag ttagggtata aactctatgc 36240

cgaagccatt gcgtccgcga tagtaggctg gtcgtccaag gtatcatcta ggccacgtcc 36300

agcatggagc gaatggtctc gcaatacagc ttcaataacg tacccatcca tagtaaccac 36360

taatagtatt aacgtatcta tggacatcac tggcttctca aatggacagg ttgtacttaa 36420

cctaccacga gggtgccgtc cagtggttac tacggtagcg actgttacac acactactga 36480

taacatcaac tatgctgctg gtttcgctct aatagctcct aatggcgacg tgactgtgca 36540

ggggcttaag tcgacagaag gtcgcataac tattgtagca aattggtaaa taactggagg 36600

ccttatgatt gagttagact tcaagaatga agttcttaag gcctccccta tcgttgggac 36660

cgctgcggct gatggtgcca gtcggttctt ctttggactc acactgaacg aatggttcta 36720

cgttgcagct attgcgtaca ccgttgtcca gattggtgtg ctggtctaca aaacgattaa 36780

agggggagga aagtcatgac acaaatggac ttagagaagt tcctgttaat gctagataca 36840

gagcgtgccc gtctcatgct gcaagacctg cgggatgaca ctaagcgttc acctcagctc 36900

tacaacgcca ttgagaagct actagctcgt cacaactttg tgttaagcaa ggtgtctgtg 36960

gacgagaaga cgctggctga tatggaggcc ctgaacgcag agtacgataa ggtgctttca 37020

gctactgagg ataatgacac cgggtatggt gttcaataag tgttagactc aaggtcatcg 37080

tcaggtggcc tttatgatta acactaagga ggttacatga aagattcata cataagtggc 37140

ggttactgga aggttactcg taacggtaag gttcatggag ttcatagatt actatgggag 37200

gaagcctacg gtactatccc agatggttac gtcatagacc acattgatag gaatcctatg 37260

aataacgaac tgtcaaacct taggtgcata cctaaaggcg caaacaaggc taacacggta 37320

tcctctaggg aactacctaa aggcgtatac tctaggtttg ctaaacgtca aggtgtaact 37380

gtgtactatg gtgacattag gatgggaggt aagaaagaaa ctcatgcgcc tactaagaat 37440

ctgaaggaag tcgtggaatg ggctaagtca actcatagca gaatgctaaa ggagacatat 37500

ggtatttcaa atgtttaaga gagtggctcc gtggttactt gcagcagtga tgtttgctgg 37560

tggctaccac accgctaaca ataagtggga ggctaaggtc aatgcagaat acacctcgaa 37620

tcttaaggca tcggaggata caaggcttgc tgtccaagct gaagtcaaca aagtgtcaaa 37680

gcggtttcag gacgaaatgt cctcgctgga aggcagcact gataggatta ttgctgacct 37740

tcagtctgac aataagcggc tgcgcatccg agtcaaacct acgagtggag ccacgcaaag 37800

tgacggtcga tgcgtcattg atggttacgc cgaacttgac gaacgagatg ctaaacgtct 37860

tatcgccatc ggagtgaaag gagacaaatg gattaaggca cttcaggaca ctgtgagagc 37920

cttacagcaa gataaggagg ggacgcattg agtaaagact tagtggcgcg tcaggcgcta 37980

atgactgccc gtatgaaggc agacttcgtg ttcttcctgt tcgtcctgtg gaaagctctg 38040

tcactaccag tcccgactcg ctgtcagatt gacatggcga agaaactatc ggctggggac 38100

aacaggcgtt tcatcctaca ggcgttccgt ggtatcggga agtccttcat tacgtgtgcc 38160

ttcgtggtct ggaagctatg gaacaaccca gacttgaagt tcatgattgt gtcggcctca 38220

aaggaacgag ccgatgcgaa ctccatattc atcaagcgaa tcatcgacct catgcctcag 38280

cttcaggaac tcaaacctaa gcagggacag agggacgcgg ttatcagctt cgacgttggg 38340

ccagccaagc cggaccactc accttcggtt aagtccgttg gtatcactgg tcagctgact 38400

ggtagtcgtg ctgacatcct gattgccgat gacgtggagg ttccaaacaa ctctgcgact 38460

caggctgcac gagaccgtct gtcagagctt gtgaaagagt tcgacgctat cctgaagccg 38520

ggaggtacaa tcatctatct gggtactcct cagaacgaga tgaccctgta tcgtgagctt 38580

gaaggccgtg ggtataccac tactatctgg cctgctcgtt atcctcgtga taagaaggac 38640

tggcagtctt acggcgaccg tctggctcct atgcttcagg cagaactgga agaggaccct 38700

gagtccttct actggcgtcc gaccgatgaa gtacgattcg atgatacgga cctgaaggaa 38760

cgtgagctgt cctatggtaa agctggcttc gctctacagt tcatgcttaa cccgaacctg 38820

agtgatgctg agaagtaccc tctgaagctc cgtgacctta tcgtagccga cttggaccca 38880

gcgtccagcc caatggtcta ccaatggctg ccaaaccctc agaacaagcg tgaggacgtt 38940

cctaacgttg gactcatggg tgactcatac cacacgtatc agactgtagg ttctgccttc 39000

agttcgtaca cccagaagat tctggtcatt gaccctagtg gtcgtggtaa ggatgaaact 39060

ggttatgcgg tactgtacca gctcaacgga tacatcttcg ctatggaagt tggtggtatg 39120

cgaggtggct atgaagactc tacgctggaa gccttggcta agattggtcg taagtggaag 39180

gtcaacgaat acgtcattga gggtaacttc ggtgatggta tgtaccttga gctattcaag 39240

cctgtagcgg cacgtatcca ccctgcggct gtaactgaag tgaagagtaa gggtcagaaa 39300

gaactacgca tctgtgacgt tctggagcct atcatggggt ctcacaggct tatcgttaac 39360

gctgctgcta tcgtccaaga ctaccagtca gcctctgata aggatggtgt gcgtaaccct 39420

atctactctc tcttctacca gatgacccgt atatctcgtg aacgtggagc cttggcacac 39480

gatgaccgac ttgatgcgct ggctatcggt gtacagttct tcgttgagtc tatggctaag 39540

gatgccaaca aaggcgaacg tgaagtcact gaggagtggc tggaggaaca gatggaggac 39600

ccacggaaag gcttcgagtc catccacact gagttctggg acaatggggt ccgggtaact 39660

catgatacgg acgacgagct gggactaggg tcatacgtta cgttccacta gctgaatgaa 39720

taactatggg tgaaagctgc atgaatacgc ggttagtaac ctatagttac taccagtcta 39780

acctactgtt ttataagaag tttggactta actatcacta taggaaagac caatggttac 39840

ttatagtatt actgtagtga atatacatat gcagacttta tgcaagacct taggaggcag 39900

actccgagtt cttacctaag gcttgcaccg atggaaggag gtgatattaa tcataatccc 39960

tccaatacag atagtcaccg accatagata caggaggtat gtagcatatg gcaaagacca 40020

aagctgtact taaagctctg gcgaccaatc gagctacata caggtttctt gctgctgttc 40080

tacttgctgc tggcgttact gctggaagta agtgggtcgg gtgggtcgag actctcgtat 40140

gttctctggt ctctcagtgt aattaacgca atcatggtaa cgattcatga gtggaagacc 40200

taaggtcagt tcatagctga cgctactcta ctgaccttag ctactgtagt caaggacttt 40260

aggtaacacc ttaagagaag ctcacttagg gtcatcctac ttactggtct accctagtgt 40320

cgcctgacct acggtccttg acctacagtg gctgtggcct acagtaggga cgatgagttt 40380

tggaccaaaa gtttgagacc aca 40403

Claims (17)

1. 一种用于预防或治疗由致病性大肠杆菌引起的感染或疾病的组合物，包括：

具有裂解致病性大肠杆菌的能力的短尾噬菌体科噬菌体，和

药学上可接受的载体。

2. 根据权利要求1所述的组合物，其中短尾噬菌体科噬菌体包括如SEQ ID NO:1所述的序列或具有与SEQ ID NO:1至少90%同一性下的至少80%查询覆盖度的序列。

3. 根据权利要求1所述的组合物，其中短尾噬菌体科噬菌体的浓度为1×10¹ pfu/ml至1×10³⁰ pfu/ml或1×10¹ pfu/g至1×10³⁰pfu/g。

4. 根据权利要求3所述的组合物，其中短尾噬菌体科噬菌体的浓度为1×10⁴ pfu/ml至1×10¹⁵pfu/ml或1×10⁴pfu/g至1×10¹⁵pfu/g。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中药学上可接受的载体是乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、甲基羟基苯甲酸酯、丙基羟基苯甲酸酯、滑石粉、硬脂酸镁或矿物油。

6.根据权利要求1所述的组合物，还包括：

选自由润滑剂、润湿剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂和防腐剂组成的组的一个或多个。

7.根据权利要求1所述的组合物，其中致病性大肠杆菌是肠出血性大肠杆菌、产肠毒素大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠聚集性大肠杆菌或致癌性大肠杆菌。

8.根据权利要求1所述的组合物，其中感染或疾病是食物中毒、胃肠炎、腹泻、尿路感染、新生儿脑膜炎、溶血性尿毒症综合征、腹膜炎、乳腺炎、败血症、革兰氏阴性肺炎、志贺氏菌病、痢疾或癌症。

9.根据权利要求1所述的组合物，其中组合物是溶液、悬浮液、油乳剂、水溶性介质、提取物、粉末、颗粒、片剂或胶囊。

10. 根据权利要求1所述的组合物，其中短尾噬菌体科噬菌体具有约43 kDa，48 kDa，63 kDa，75 kDa，85 kDa和142 kDa大小的主要结构蛋白。

11. 根据权利要求1所述的组合物，其中短尾噬菌体科噬菌体具有10-25分钟的潜伏期，裂解量为740-860 PFU/感染细胞。

12. 根据权利要求1所述的组合物，其中潜伏期为15-20分钟，裂解量为770-830 PFU/感染细胞。

13.根据权利要求1所述的组合物，进一步包括：

具有裂解致病性大肠杆菌或非大肠杆菌细菌菌种的能力的第二噬菌体。

14. 一种用于预防或治疗由致病性大肠杆菌引起的感染或疾病的方法，包括：

向受试者给药短尾噬菌体科噬菌体；以及

用短尾噬菌体科噬菌体裂解致病性大肠杆菌。

15. 根据权利要求14所述的方法，其中短尾噬菌体科噬菌体包括如SEQ ID NO:1所述的序列。

16. 根据权利要求14所述的方法，其中短尾噬菌体科噬菌体的浓度为1×10¹ pfu/ml至1×10³⁰ pfu/ml或1×10¹ pfu/g至1×10³⁰ pfu/g。

17. 根据权利要求16所述的方法，其中短尾噬菌体科噬菌体的浓度为1×10⁴ pfu/ml至1×10¹⁵ pfu/ml或1×10⁴ pfu/g至1×10¹⁵ pfu/g。

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