KR20230005256A - 순환 종양 세포 검출용 세포사멸 키트 및 이의 검출 방법 - Google Patents

순환 종양 세포 검출용 세포사멸 키트 및 이의 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생물학적 검출 기술 분야에 속하며, 보다 상세하게는 순환 종양 세포 검출용 세포사멸 키트 및 이의 검출 방법에 관한 것이다. 상기 키트에는 1% Triton X-100 200μL, TRITC 표지 스테렙트아비딘 100μL, 디옥시리보뉴클레아제 I 200μL, 디옥시리보뉴클레아제 I 완충액 200μL, 평형 완충액 1mL, TdT 효소 80μL, 비오틴-11-dUTP 20μL, 표지 완충액 1.0mL, 세균성 지질다당류 완충액 50μL가 함유된다. 본 발명에서 제공하는 키트는 원스텝 염색만을 통해 사멸 세포를 검출할 수 있으며, 동시에 본 발명은 세포 사멸 순환 종양 세포의 검출에 특히 적용되며, 민감도, 특이도, 검출 효과가 우수하다.

Description

순환 종양 세포 검출용 세포사멸 키트 및 이의 검출 방법
본 발명은 생물학적 검출 기술 분야에 속하며, 보다 상세하게는 순환 종양 세포 검출용 세포사멸 키트 및 이의 검출 방법에 관한 것이다.
순환 종양 세포(Circulating tumor cell, CTCs)는 고형 종양에서 탈락되어 말초 혈액 순환계로 유입된 종양 세포로, 1989년 발견된 이래 현재 말초 혈액 순환 종양 세포를 검출하기 위한 많은 방법들이 있다. 최근 연구에 따르면, 이의 검출은 종양 환자, 특히 말기 종양 환자의 예후를 평가하고 적절한 개별 치료를 선택하는 데 중요한 임상적 의미가 있음이 밝혀졌다. CTC 검출은 최소 침습, 실시간 검출 등의 특성을 가지고 있기 때문에 종양의 "액상 생검"이라고 불린다.
세포사멸 키트는 세포사멸 과정에서 세포막 표면에 나타나는 포스파티딜세린(phosphatidylserine)을 검출하기 위해 사용하는 검출용 키트이다. 세포 사멸의 초기 단계에서 세포는 포스파티딜세린을 세포막 외측으로 외부화하고 포스파티딜세린이 세포 표면에 노출된 후 혈액 응고 및 염증 반응을 촉진한다. 녹색 형광 프로브인 FITC 표지 Annexin V를 사용하여, 세포사멸의 중요한 특징인 포스파티딜세린의 외부화를 간단하고 직접적으로 검출할 수 있다. 순환 종양 세포는 자체 특성으로 인해 일련의 항-세포사멸 메커니즘을 진화시켜 세포의 사멸을 억제하므로, 이의 세포사멸 세포를 기존의 세포사멸 키트로 검출하면 위양성이 발생하기 쉽다.
종래 기술에서 세포사멸을 표적으로 하는 순환 종양 세포 검출용 키트가 없는 점을 고려하며, 본 발명은 순환 종양 세포 검출용 세포사멸 키트를 제공한다.
본 발명은 상기 키트를 이용한 검출 방법을 더 제공한다.
본 발명은 상술한 목적을 구현하기 위해 하기의 기술적 해결책을 채택한다.
본 발명은 순환 종양 세포 검출용 세포사멸 키트를 제공한다. 상기 키트에는 1% Triton X-100 200μL, TRITC 표지 스테렙트아비딘(streptavidin) 100μL, 디옥시리보뉴클레아제(deoxyribonuclease) I 200μL, 디옥시리보뉴클레아제 I 완충액 200μL, 평형 완충액 1mL, TdT 효소 80μL, 비오틴-11-dUTP 20μL, 표지 완충액 1.0mL, 세균성 지질다당류 완충액 50μL가 함유된다.
또한, 상기 디옥시리보뉴클레아제 I의 농도는 50U/μL이고 상기 세균성 지질다당류 완충액의 농도는 30U/μL이다.
본 발명은 상술한 세포사멸 키트를 이용해 순환 종양 세포를 검출하는 방법을 더 제공한다. 여기에는 하기 단계가 포함된다.
(1) 순환 종양 세포를 함유하는 샘플을 파클리탁셀(paclitaxel)로 처리하고, 매회 5분 동안 PBS로 2회 세척한 다음, 100μL 1% Triton X-100 용액에 첨가하여 5분 동안 처리한다.
(2) 20μL 디옥시리보뉴클레아제 I 및 60μL 디옥시리보뉴클레아제 I 완충액을 샘플에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 처리한 다음 PBS에 담그고 매회 5분씩 3회 헹군다.
(3) 그 후 샘플에 50μL TdT 효소 반응액을 첨가하고 따뜻한 박스에 넣고 37℃에서 차광시킨 채 60분 동안 반응시키고, 반응된 샘플을 PBS에 담그고 매회 5분 동안 3회 헹군다. 해당 기간 동안 차광에 유의한다.
(4) 각 샘플에 세균성 지질다당류 완충액 50μL을 점적하고 10분간 정치시킨 후, 다시 50μL TRITC 표지 스테렙트아비딘 표지액을 점적하여 습한 박스에 넣고 37℃에서 차광시킨 채 30분 동안 반응시킨다. 반응된 샘플을 PBS에 담그고 매회 5분 동안 3회 헹군다.
(5) 세포핵을 DAPI 염색액으로 재염색하고 실온에서 차광시킨 채 10분 동안 반응시킨 후 DAPI 염색액을 씻어내고 봉입제를 첨가한 후 형광 현미경으로 검출을 수행한다.
더 나아가, 상기 TdT 효소 반응액의 구체적인 구성 과정은 다음과 같다. 즉, 1.0μL의 비오틴-11-dUTP와 4.0μL의 TdT 효소를 45μL의 평형 완충액에 첨가하고 고르게 교반하면 된다.
더 나아가, 상기 TRITC 표지 스테렙트아비딘 표지액의 구체적인 구성 과정은 다음과 같다. 즉, 5μL TRITC 표지 스테렙트아비딘과 45μL 표지 완충액을 고르게 혼합하면 된다.
더 나아가, 상기 봉입제는 트리에틸렌디아민(triethylenediamine), 글리세롤 및 PBS를 부피비 2:4:5로 구성한다.
본 발명의 보관 조건은 차광시킨 채 -20℃에서 보관하는 것이다.
본 발명의 유익한 효과는 다음과 같다. 본 발명에서 제공하는 키트는 원스텝 염색만을 통해 사멸 세포를 검출할 수 있으며, 동시에 본 발명은 세포 사멸 순환 종양 세포의 검출에 특히 적용되며, 민감도, 특이도, 검출 효과가 우수하다.
도 1은 실시예 1에서 검출하여 획득한 염색 세포 이미지이다.
이하에서는 구체적인 실시예를 통해 본 발명의 기술적 해결책을 더욱 상세하게 해석 및 설명한다.
본 발명의 키트의 구체적인 성분은 표 1과 같다.
표 1
Figure pct00001
실시예 1
상기 키트를 이용한 구체적인 검출 방법은 하기와 같다.
(1) 순환 종양 세포를 함유하는 샘플을 파클리탁셀(paclitaxel)로 처리하고, 매회 5분 동안 PBS로 2회 세척한 다음, 100μL 1% Triton X-100 용액에 첨가하여 5분 동안 처리한다.
(2) 20μL 디옥시리보뉴클레아제 I 및 60μL 디옥시리보뉴클레아제 I 완충액을 샘플에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 처리한 다음 PBS에 담그고 매회 5분씩 3회 헹군다.
(3) 그 후 샘플에 50μL TdT 효소 반응액을 첨가하고 따뜻한 박스에 넣고 37℃에서 차광시킨 채 60분 동안 반응시키고 반응된 샘플을 PBS에 담그고 매회 5분 동안 3회 헹군다. 해당 기간 동안 차광에 유의한다.
상기 TdT 효소 반응액의 구체적인 구성 과정은 다음과 같다. 즉, 1.0μL의 비오틴-11-dUTP와 4.0μL의 TdT 효소를 45μL의 평형 완충액에 첨가하고 고르게 교반하면 된다.
(4) 각 샘플에 세균성 지질다당류 완충액 50μL을 점적하고 10분간 정치시킨 후, 다시 50μL TRITC 표지 스테렙트아비딘 표지액을 점적하여 습한 박스에 넣고 37℃에서 차광시킨 채 30분 동안 반응시킨다. 반응된 샘플을 PBS에 담그고 매회 5분 동안 3회 헹군다.
상기 TRITC 표지 스테렙트아비딘 표지액의 구체적인 구성 과정은 다음과 같다. 즉, 5μL TRITC 표지 스테렙트아비딘과 45μL 표지 완충액을 고르게 혼합하면 된다.
(5) 세포핵을 DAPI 염색액으로 재염색하고 실온에서 차광시킨 채 10분 동안 반응시킨 후 DAPI 염색액을 씻어내고 봉입제를 첨가한 후 형광 현미경으로 검출을 수행한다. 상기 봉입제는 트리에틸렌디아민, 글리세롤 및 PBS를 부피비 2:4:5로 구성한다.
도 1은 형광현미경으로 염색한 이미지이다. 이미지에서 알 수 있듯이, 세포사멸된 CTC는 이의 세포핵이나 세포질 내에 짙고 조밀하게 염색된 형광을 볼 수 있으며, 핵형태학적 변화가 뚜렷하고 세포사멸체를 형성하며 3개 또는 3개 이상의 DNA 형광 조각이 있다.
비교예 1
(1) 순환 종양 세포를 함유하는 샘플을 파클리탁셀(paclitaxel)로 처리하고, 매회 5분 동안 PBS로 2회 세척한 다음, 100μL 1% Triton X-100 용액에 첨가하여 5분 동안 처리한다.
(2) 20μL 디옥시리보뉴클레아제 I 및 60μL 디옥시리보뉴클레아제 I 완충액을 샘플에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 처리한 다음 PBS에 담그고 매회 5분씩 3회 헹군다.
(3) 그 후 샘플에 50μL TdT 효소 반응액을 첨가하고 따뜻한 박스에 넣고 37℃에서 차광시킨 채 60분 동안 반응시키고 반응된 샘플을 PBS에 담그고 매회 5분 동안 3회 헹군다. 해당 기간 동안 차광에 유의한다.
상기 TdT 효소 반응액의 구체적인 구성 과정은 다음과 같다. 즉, 1.0μL의 비오틴-11-dUTP와 4.0μL의 TdT 효소를 45μL의 평형 완충액에 첨가하고 고르게 교반하면 된다.
(4) 각 샘플에 50μL의 TRITC 표지 스테렙트아비딘 표지액을 점적하고 습한 박스에 넣은 후 37℃에서 차광시킨 채 30분 동안 반응시킨다. 반응된 샘플은 PBS에 담그고 매회 5분씩 3회 헹군다.
상기 TRITC 표지 스테렙트아비딘 표지액의 구체적인 구성 과정은 다음과 같다. 즉, 5μL TRITC 표지 스테렙트아비딘과 45μL 표지 완충액을 고르게 혼합하면 된다.
(5) 세포핵을 DAPI 염색액으로 재염색하고 실온에서 차광시킨 채 10분 동안 반응시킨 후 DAPI 염색액을 씻어내고 봉입제를 첨가한 후 형광 현미경으로 검출을 수행한다.
상기 방법으로 검출된 사멸 세포는 위양성률이 높으며 일부는 사멸 CTC 세포가 아닌 괴사 세포이다.
비교예 2
상기 키트를 이용한 구체적인 검출 방법은 하기와 같다.
(1) 순환 종양 세포를 함유하는 샘플을 파클리탁셀(paclitaxel)로 처리하고, 매회 5분 동안 PBS로 2회 세척한 다음, 100μL 1% Triton X-100 용액에 첨가하여 5분 동안 처리한다.
(2) 20μL 디옥시리보뉴클레아제 I 및 60μL 디옥시리보뉴클레아제 I 완충액을 샘플에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 처리한 다음 PBS에 담그고 매회 5분씩 3회 헹군다.
(3) 그 후 샘플에 50μL TdT 효소 반응액을 첨가하고 따뜻한 박스에 넣고 37℃에서 차광시킨 채 60분 동안 반응시키고 반응된 샘플을 PBS에 담그고 매회 5분 동안 3회 헹군다. 해당 기간 동안 차광에 유의한다.
상기 TdT 효소 반응액의 구체적인 구성 과정은 다음과 같다. 즉, 1.0μL의 비오틴-11-dUTP와 4.0μL의 TdT 효소를 45μL의 평형 완충액에 첨가하고 고르게 교반하면 된다.
(4) 각 샘플에 세균성 지질다당류 완충액 50μL을 점적하고 10분간 정치시킨 후, 다시 50μL TRITC 표지 스테렙트아비딘 표지액을 점적하여 습한 박스에 넣고 37℃ 암실에서 30분간 반응시킨다. 반응된 샘플을 PBS에 담그고 매회 5분 동안 3회 헹군다.
상기 TRITC 표지 스테렙트아비딘 표지액의 구체적인 구성 과정은 다음과 같다. 즉, 5μL TRITC 표지 스테렙트아비딘과 45μL 표지 완충액을 고르게 혼합하면 된다.
(5) 세포핵을 DAPI 염색액으로 재염색하고 실온에서 차광시킨 채 10분 동안 반응시킨 후 DAPI 염색액을 씻어내고 봉입제를 첨가한 후 형광 현미경으로 검출을 수행한다. 상기 봉입제는 글리세롤 및 PBS를 부피비 6:5로 구성한다.
상기 비교예에서 실시예 1 및 비교예 1에 비해 형광물질의 소광 시간이 현저히 짧으며, 본 발명에서 제공하는 봉입제는 소광 시간을 상당히 늦출 수 있다.

Claims (6)

  1. 순환 종양 세포 검출용 세포사멸 키트에 있어서,
    상기 키트에는 1% Triton X-100 200μL, TRITC 표지 스테렙트아비딘(streptavidin) 100μL, 디옥시리보뉴클레아제(deoxyribonuclease) I 200μL, 디옥시리보뉴클레아제 I 완충액 200μL, 평형 완충액 1mL, TdT 효소 80μL, 비오틴-11-dUTP 20μL, 표지 완충액 1.0mL, 세균성 지질다당류 완충액 50μL가 함유되는 것을 특징으로 하는 순환 종양 세포 검출용 세포사멸 키트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 디옥시리보뉴클레아제 I의 농도는 50U/μL이고; 상기 세균성 지질다당류 완충액의 농도는 30U/μL인 것을 특징으로 하는 순환 종양 세포 검출용 세포사멸 키트.
  3. 제1항 또는 제2항의 상기 검출용 세포사멸 키트를 이용해 순환 종양 세포를 검출하는 방법에 있어서,
    이하의 단계,
    (1) 순환 종양 세포를 함유하는 샘플을 파클리탁셀(paclitaxel)로 처리하고, 매회 5분 동안 PBS로 2회 세척한 다음, 100μL 1% Triton X-100 용액에 첨가하여 5분 동안 처리하는 단계;
    (2) 20μL 디옥시리보뉴클레아제 I 및 60μL 디옥시리보뉴클레아제 I 완충액을 샘플에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 처리한 다음 PBS에 담그고 매회 5분씩 3회 헹구는 단계;
    (3) 그 후 샘플에 50μL TdT 효소 반응액을 첨가하고 따뜻한 박스에 넣고 37℃에서 차광시킨 채 60분 동안 반응시키고, 반응된 샘플을 PBS에 담그고 매회 5분 동안 3회 헹구고, 해당 기간 동안 차광에 유의해야하는 단계;
    (4) 각 샘플에 세균성 지질다당류 완충액 50μL을 점적하고 10분간 정치시킨 후, 다시 50μL TRITC 표지 스테렙트아비딘 표지액을 점적하여 습한 박스에 넣고 37℃에서 차광시킨 채 30분 동안 반응시키고, 반응된 샘플을 PBS에 담그고 매회 5분 동안 3회 헹구는 단계; 및
    (5) 세포핵을 DAPI 염색액으로 재염색하고 실온에서 차광시킨 채 10분 동안 반응시킨 후 DAPI 염색액을 씻어내고 봉입제를 첨가한 후 형광 현미경으로 검출을 수행하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 검출용 세포사멸 키트를 이용해 순환 종양 세포를 검출하는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 TdT 효소 반응액의 구체적인 구성 과정은, 즉, 1.0μL의 비오틴-11-dUTP와 4.0μL의 TdT 효소를 45μL의 평형 완충액에 첨가하고 고르게 교반하면 되는 것을 특징으로 하는 검출용 세포사멸 키트를 이용해 순환 종양 세포를 검출하는 방법.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 TRITC 표지 스테렙트아비딘 표지액의 구체적인 구성 과정은, 즉, 5μL TRITC 표지 스테렙트아비딘과 45μL 표지 완충액을 고르게 혼합하면 되는 것을 특징으로 하는 검출용 세포사멸 키트를 이용해 순환 종양 세포를 검출하는 방법.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 봉입제는 트리에틸렌디아민(triethylenediamine), 글리세롤 및 PBS를 부피비 2:4:5로 구성하는 것을 특징으로 하는 검출용 세포사멸 키트를 이용해 순환 종양 세포를 검출하는 방법.
KR1020227040824A 2020-04-22 2021-04-16 순환 종양 세포 검출용 세포사멸 키트 및 이의 검출 방법 KR20230005256A (ko)

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