NL9100550A - Werkwijze en kit voor het detecteren van apoptose. - Google Patents

Description

Titel: Werkwijze en kit voor het detecteren van apoptose

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze en een kit voor het detecteren van apoptose in zoogdiercellen. De uitvinding betreft meer in het bijzonder een nieuwe techniek voor de detectie van apoptose in individuele cellen.

Andere aanduidingen voor apoptose zijn: interfase dood en geprogrammeerde celdood. Het belang van de detectie van apoptose in cellen werd onder andere erkend door Kerr et al. (Apoptosis: A basic biological phenomenom with wide-ranging implications in tissue kinetics, 1972, British Journal of Cancer 26: 239-257). Apoptose is een belangrijk fenomeen in embryogenese, cel differentiatie en tumor regressie. Apoptose is een algemene vorm van negatieve celselectie die geïnduceerd kan worden door factoren in de omgeving van de cel. Tot deze factoren behoren onder andere: cytokines (o.a. Tumor Necrose Factor, TNF), T-lymfocyten, specifieke glucocorticosteroiden en straling. De belangrijkste karakteristieken van apoptose zijn: afbraak van het chromatine in DNA fragmenten ter grootte van nucleosomen (+ 160 baseparen lang), segmentatie van de kern, condensatie van het cytoplasma en bladderen van de celmembraan. Sellins en Cohen (Gene induction by γ-irradiation leads to DNA fragmentation in lymphocytes, 1987, The Journal of Immunology 139, 3199-3206) hebben aangetoond dat apoptose een actief proces is, waarbij RNA- en eiwitsynthese plaats vindt voordat het proces dat tot apoptose leidt kan beginnen.

Wanneer één van deze twee stilgelegd wordt, treedt er geen apoptose op.

Het is van groot belang dat apoptose in verband met medische behandelingen waarbij apoptose geïnduceerd wordt, optreedt of een relevant bijverschijnsel is, kan worden gedetecteerd. Er zijn behandelingsstrategieën van kanker in ontwikkeling die erop gericht zijn specifiek apoptose te induceren in tumoren. Evaluaties van deze behandelingswijzen vereisen een goede, objectieve methode voor de detectie van apoptose in zowel tumorweefsel als in het gezonde weefsel. Ook vormt Interfase Dood, een specifieke vorm van apoptose die onder andere geïnduceerd kan worden met straling, een belangrijk fenomeen waarvoor een goede kwantificering wenselijk is.

Er zijn verschillende methoden voor de detectie van apoptose bekend. Deze kunnen als volgt worden onderverdeeld: - Isolatie van DNA fragmenten van oligonucleosoom-grootte uit apoptotische cellen. Voor deze methode is echter een relatief groot aantal cellen nodig en bovendien geeft deze methode geen exacte informatie over het percentage cellen in apoptose.

- Morfologische evaluatie. De morfologische eigenschappen van cellen in apoptose zijn duidelijk onderscheidbaar van andere cellen. Tijdens apoptose treden zowel een inkrimping van het cytoplasma als een segmentering van de nucleus op. Voor dit type van analyse is echter een patholoog of getrainde analist nodig. Het is bovendien niet eenvoudig om dit proces te automatiseren. Ook is een goede morfologische evaluatie in hoofdzaak beperkt tot de latere stadia van apoptose.

- Methoden welke berusten op de verschillende permeabiliteit voor bepaalde fluorescerende kleurstoffen van levende en dode cellen. In een later stadium van apoptose wordt de celmembraan permeabel. De cellen worden daardoor toegankelijk voor kleurstoffen. Gekleurde cellen kunnen worden geteld met behulp van een microscoop of een flow cytometer. Deze methode is wel eenvoudig, maar niet echt specifiek voor apoptose en vereist een vrij lange tijd (+ 6 tot 24 uur) tussen de inductie van apoptose en de detectie.

De uitvinding verschaft nu een nieuwe werkwijze voor het detecteren van apoptose in zoogdiercellen, waarbij men de te onderzoeken cellen incubeert in een voor in situ nick translatie geschikt medium, waarbij ten minste één van de in het medium aanwezige deoxynucleotiden zodanig is gemodificeerd dat het gedetecteerd kan worden, en men de cellen, nadat het nick translatie medium is verwijderd, onderzoekt op de aanwezigheid van DNA dat gemodificeerd deoxynucleotide bevat.

Tevens verschaft de uitvinding een kit ten behoeve van de detectie van apoptose in zoogdiercellen, omvattende (a) componenten waaruit een voor in situ nick translatie geschikt medium kan worden samengesteld, waaronder ten minste één zodanig gemodificeerd deoxynucleotide dat het gedetecteerd kan worden, en (b) middelen waarmee de cellen, na verwijdering van het nick translatie medium, kunnen worden onderzocht op de aanwezigheid van DNA dat gemodificeerd deoxynucleotide bevat.

Volgens de uitvinding wordt apoptose gedetecteerd door breuken in het DNA in apoptotische cellen te labelen en aldus waarneembaar te maken. Het labelen van de DNA breuken kan worden gerealiseerd met behulp van enzymen die specifiek deoxynucleotiden (hierin gemakshalve ook wel aangeduid als nucleotiden) inbouwen in DNA vanaf een breuk in de DNA helix. Dit geschiedt volgens de op zichzelf bekende nick translatie methode. Deze wordt in de moleculaire biologie gebruikt voor het labelen van DNA voor hybridisatie toepassingen (zie: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pag. 10.7-10.10).

Aangezien de uitvinding een labelings-methode betreft van individuele cellen, is het mogelijk deze snel te meten met behulp van cytometrische technieken. Cytometrie wordt veel gebruikt voor de studie van zoogdiercellen. De twee relevante technieken zijn: - Flow cytometrie. Het principe van flow cytometrie is dat men deeltjes die in een vloeistofstroom gesuspendeerd zijn door een laserbundel laat passeren. Het laserlicht wordt bij deze passage verstrooid en voor elke individuele cel wordt de fluorescentie die hierbij ontstaat gemeten. Aldus kan van in de orde van grootte van enkele duizenden cellen per seconde informatie worden verkregen over grootte van de cel, structuur en chemische samenstelling (zie:M.R. Melamed, et al.: Flow Cytometry and Sorting, 1979, pp. 1-9 en 11-37, John Wiley & Sons, New York).

- Beeld cytometrie. Hierbij wordt het microscoopbeeld van (een aantal) cellen door een computer verwerkt en geanalyseerd met behulp van patroonherkenningstechnieken. Aldus kunnen op een snelle wijze cellen worden geïdentificeerd en karakteristieken van deze cellen worden gemeten.

Het gebruikte label kan echter ook op andere wijzen worden gedetecteerd, bijv. direct of na toepassing van een geschikte kleuringstechniek zichtbaar worden gemaakt onder een microscoop, of in het geval van een radioactief label met behulp van autoradiografie worden waargenomen.

De methode volgens de uitvinding is gebaseerd op het labelen van DNA breuken die kenmerkend zijn voor cellen in apoptose. Tijdens de apoptotische DNA fragmentatie wordt het chromatine van de cellen door endonucleases in fragmenten van oligo-nucleosoom grootte geknipt. Endonucleases knippen in het DNA tussen twee nucleosomen. De breuken die tijdens deze DNA fragmentatie zijn ontstaan, zijn het target voor de in situ nick translatie.

De uitvinding maakt het mogelijk om specifiek breuken in het DNA van cellen in apoptose te labelen. Het ontstaan van DNA breuken is een vroege karakteristiek van apoptose zodat volgens de uitvinding ook cellen kunnen worden gedetecteerd die zich in het beginstadium van apoptose bevinden. De cellen kunnen duidelijk en objectief worden onderscheiden van cellen die niet in apoptose zijn. Omdat het een in situ methode betreft, is het mogelijk om het percentage cellen in apoptose nauwkeurig te bepalen. Ook kan apoptose volgens de uitvinding binnen een subpopulatie van alle cellen onderzocht worden. Een duidelijk onderscheid gebaseerd op labelingstechniek maakt het mogelijk een snelle screening te doen met behulp van flow- en beeld-cytometrie.

Nucleotiden kunnen op verschillende wijzen zodanig zijn gemodificeerd dat ze van een detecteerbaar label kunnen worden voorzien: - Gemodificeerde nucleotiden die door een antilichaam kunnen worden herkend, bijvoorbeeld Bromo-deoxyuridine (Brdü) en Iodo-deoxyuridine (IdU). Dit zijn thymidine analoga die kunnen worden gedetecteerd met antilichamen die specifiek binden aan Brdü en IdU. Deze antilichamen kunnen geconjugeerd zijn aan bijv. een fluorescerende groep of aan een enzym dat optische detectie mogelijk maakt. Het is ook mogelijk deze antilichamen met behulp van een tweede laag van fluorescerend gelabelde antilichamen te detecteren.

- Afgeleiden van nucleotiden die een groep bevatten die specifiek aan andere moleculen kan binden, bijvoorbeeld een biotine-groep of een digoxigenine-groep, gebonden aan dUTP of dATP. De DNA nucleotiden kunnen via een zgn. spacer-arm gekoppeld worden aan biotine. Biotine kan worden gedetecteerd met behulp van avidine of streptavidine. Biotine en (strept)avidine hebben een zeer hoge affiniteit voor elkaar.

(Strept)avidine kan weer eenvoudig gekoppeld zijn aan een fluorescerende stof, een andere kleurstof of een enzym. Men kan bijv. gebruik maken van commerciëel verkrijgbare conjugaten van streptavidine en avidine met FITC en Cascade

Blue. Het hapteen digoxigenine kan gedetecteerd worden met behulp van antilichamen.

- Radioactief gelabelde nucleotiden, bijvoorbeeld met tritium gelabelde nucleotiden.

- Nucleotiden die direct gekoppeld zijn aan een fluorescerende groep of molecuul, zoals fluoresceine, coumarine, rhodamine en hun derivaten.

Inbouw kan worden uitgevoerd met alle enzymen die nucleotiden vanaf een enkel- of dubbelstrengs breuk in het DNA kunnen inbouwen, zoals £. coli DNA polymerase I, terminal deoxynucleotidyl-transferase en Klenow polymerase. Als label kunnen alle fluorescerende stoffen worden gebruikt die aan een eiwitmolecuul gekoppeld kunnen worden. Voor een eventuele tegenkleuring van het DNA dient bij voorkeur een kleurstof te worden gekozen met een emissiespectrum dat goed te scheiden is van de kleurstof waarmee de DNA-breuken gelabeld zijn. Men kan zeer geschikt FITC, Bodipy en Cascade Blue® gebruiken als kleurstoffen voor de te labelen DNA breuken, terwijl dan DAPI, Hoechst 33258 en Propidium Jodide kunnen worden gebruikt voor de tegenkleuring van het DNA.

De uitvinding zal aan de hand van een voorbeeld en de figuren 1-2 nader worden toegelicht.

Voorbeeld

De in situ nick translatie procedure werd uitgevoerd in zgn. 'nick translatie buffer'. Deze bestond uit 5 mM MgCl2, 10 mM β-mercapto-ethanol, 50 mM Tris-pH 7.8 en 10 μg/ml Bovine Serum Albumin (BSA). Gebruikt werden 200.000 cellen in 12.5 μΐ buffer. Aan deze buffer werden toegevoegd: 1 unit polymerase (E. coli). 0.2 nmol biotin-16-dUTP, 0.2 nmol ongelabeld dATP, dCTP en dGTP. Dit mengsel werd 90 minuten geïncubeerd op 15°C. Hierna werden de cellen gewassen en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd in een kleurbuffer. Deze kleur-buffer bestond uit 2.5 μg/ml van een avidine-FITC conjugaat, DCS kwaliteit in 4*SSC, 0.1% Triton-X-100 en 5% Nonfat Dry Milk. Hierna werden de cellen gewassen met Hepes gebufferde Hank's Salt Solution (HH) met 0.1% Triton-X-100 en met 1 μg/ml van de fluorescerende DNA kleurstof DAPI, 30 minuten op 4°C in HH, tegengekleurd.

Figytret

Fig. 1 laat de detectie van apoptose na bestraling zien aan de hand van dotplots van flow-cytometrie data. De metingen van 2 000 individuele cellen zijn weergegeven. Individuele cellen zijn weergegeven als stippen in een twee-dimensionale ruimte. Twee bivariate verdelingen zijn weergegeven van de DAPI fluorescentie (x-as) tegen de FITC fluorescentie (y-as). De DAPI fluorescentie is een maat voor de DNA inhoud. De FITC fluorescentie is een maat voor de hoeveelheid ingebouwd biotine-ll-dUTP, en daarmee een indicator voor apoptose. Cellen met een hoge FITC fluorescentie zijn in apoptose. De cellen in fig. 1 zijn muize-thymocyten, geïsoleerd uit BCBA muizen. Ze werden bestraald en daarna zes uur geïncubeerd bij 37°C. Hierna werden de cellen gefixeerd met formaldehyde, gevolgd door ethanol fixatie. Hierna werd de in situ nick translatie uitgevoerd. De stippen in het vierkant met de pijl zijn de cellen in apoptose. Deze cellen hebben een verhoogde FITC fluorescentie.

Fig. 2 laat de toename van apoptose in DA-1 cellen zien als functie van de stralingsdosis. DA-1 cellen werden gekweekt met medium dat verrijkt was met IL-3. Monsters van 1.106 cellen werden bestraald en geïncubeerd met en zonder IL-3. Na zes uur werden de monsters gefixeerd. De in situ nick translatie procedure werd uitgevoerd en de cellen werden gemeten. Het wordt duidelijk uit deze figuur dat de in situ nick translatie een gevoelige techniek is. Al vanaf 0.25 Gy wordt een verhoogd aantal cellen in apoptose gemeten. Ook laat deze figuur zien dat het effect van groeifactoren op apoptose met deze methode kan worden bestudeerd: IL-3 voorkomt vrijwel volledig deze door straling geïnduceerde apoptose.

Claims (23)

1. Werkwijze voor het detecteren van apoptose in zoogdiercellen, waarbij men de te onderzoeken cellen incubeert in een voor in situ nick translatie geschikt medium, waarbij ten minste één van de in het medium aanwezige deoxynucleotiden zodanig is gemodificeerd dat het gedetecteerd kan worden, en men de cellen, nadat het nick translatie medium is verwijderd, onderzoekt op de aanwezigheid van DNA dat gemodificeerd deoxynucleotide bevat.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij men een nick translatie medium gebruikt waarin ten minste één van de deoxynucleotiden een detecteerbaar label draagt.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, waarbij men als het detecteerbare label een fluorescerende groep of molecuul, of een radioactief element toepast.

4. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij men een nick translatie medium gebruikt waarin ten minste één van de deoxynucleotiden zodanig gemodificeerd is dat het gedetecteerd kan worden met behulp van een stof, die specifiek aan het gemodificeerde deoxynucleotide kan binden en van een detecteerbaar label is voorzien.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, waarbij men een nick translatie medium gebruikt waarin ten minste één van de deoxynucleotiden zodanig gemodificeerd is dat het gedetecteerd kan worden met behulp van een antilichaam, dat specifiek aan het gemodificeerde deoxynucleotide kan binden en van een detecteerbaar label is voorzien.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, waarbij men een nick translatie medium gebruikt dat een gemodificeerd deoxynucleotide gekozen uit de groep bestaande uit bromo-deoxyuridine (BrdU) en iodo-deoxyuridine (IdU) bevat, welk gemodificeerd deoxynucleotide gedetecteerd kan worden met behulp van een antilichaam, dat specifiek aan het gemodificeerde deoxynucleotide kan binden en van een detecteerbaar label is voorzien.

7. Werkwijze volgens conclusie 5, waarbij men een nick translatie medium gebruikt waarin ten minste één van de deoxy-nucleotiden gemodificeerd is met een hapteen dat gedetecteerd kan worden met behulp van een antilichaam, dat specifiek aan het gehapteniseerde deoxynucleotide kan binden en van een detecteerbaar label is voorzien.

8. Werkwijze volgens conclusie 7, waarbij men een nick translatie medium gebruikt waarin ten minste één van de deoxy-nucleotiden gemodificeerd is met digoxigenine dat gedetecteerd kan worden met behulp van een antilichaam, dat specifiek aan digoxigenine kan binden en een detecteerbaar label draagt.

9. Werkwijze volgens conclusie 4, waarbij men een nick translatie medium gebruikt waarin ten minste één van de deoxy-nucleotiden gemodificeerd is met biotine dat gedetecteerd kan worden met behulp van (strept)avidine dat een detecteerbaar label draagt.

10. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij men een nick translatie medium gebruikt waarin ten minste één van de deoxynucleotiden zodanig gemodificeerd is dat het gedetecteerd kan worden met behulp van een eerste antilichaam dat specifiek aan het gemodificeerde deoxynucleotide kan binden, en een tweede antilichaam dat specifiek aan het eerste antilichaam kan binden en van een detecteerbaar label is voorzien.

11. Werkwijze volgens een van de conclusies 4-10, waarbij men als het detecteerbare label een fluorescerende stof, een kleurstof, of een detecteerbaar enzym toepast.

12. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-11, waarbij men de cellen met behulp van flow cytometrie of beeld cytometrie onderzoekt op de aanwezigheid van DNA dat gemodificeerd deoxynucleotide bevat.

13. Kit ten behoeve van de detectie van apoptose in zoogdiercellen, omvattende (a) componenten waaruit een voor in situ nick translatie geschikt medium kan worden samengesteld, waaronder ten minste één zodanig gemodificeerd deoxynucleotide dat het gedetecteerd kan worden, en (b) middelen waarmee de cellen, na verwijdering van het nick translatie medium, kunnen worden onderzocht op de aanwezigheid van DNA dat gemodificeerd deoxynucleotide bevat.

14. Kit volgens conclusie 13, omvattende ten minste één deoxynucleotide dat een detecteerbaar label draagt.

15. Kit volgens conclusie 14, waarbij het detecteerbare label een radioactief element of een fluorescerende groep of molecuul is.

16. Kit volgens conclusie 13, omvattende ten minste één gemodificeerd deoxynucleotide, alsmede een stof die specifiek aan het gemodificeerde deoxynucleotide kan binden en van een detecteerbaar label is voorzien.

17. Kit volgens conclusie 16, omvattende ten minste één gemodificeerd deoxynucleotide, alsmede een antilichaam dat specifiek aan het gemodificeerde deoxynucleotide kan binden en van een detecteerbaar label is voorzien.

18. Kit volgens conclusie 17, omvattende een gemodificeerd deoxynucleotide, gekozen uit de groep bestaande uit bromo-deoxyuridine (BrdU) en iodo-deoxyuridine (IdU), alsmede een antilichaam dat specifiek aan het gemodificeerde deoxynucleotide kan binden en van een detecteerbaar label is voorzien.

19. Kit volgens conclusie 17, omvattende ten minste één met een hapteen gemodificeerd deoxynucleotide, alsmede een antilichaam dat specifiek aan het gehapteniseerde deoxynucleotide kan binden en van een detecteerbaar label is voorzien.

20. Kit volgens conclusie 19, omvattende ten minste één met digoxigenine gemodificeerd deoxynucleotide, alsmede een antilichaam dat specifiek aan digoxigenine kan binden en een detecteerbaar label draagt.

21. Kit volgens conclusie 16, omvattende ten minste één met biotine gemodificeerd deoxynucleotide, alsmede (strept)avidine dat een detecteerbaar label draagt.

22. Kit volgens conclusie 13, omvattende ten minste één gemodificeerd deoxynucleotide, een eerste antilichaam dat specifiek aan het gemodificeerde deoxynucleotide kan binden, alsmede een tweede antilichaam dat specifiek aan het eerste antilichaam kan binden en van een detecteerbaar label is voorzien.

23. Kit volgens een van de conclusies 16-22, waarbij het detecteerbare label een fluorescerende stof, een kleurstof, of een detecteerbaar enzym is.