NL9100550A - METHOD AND KIT FOR DETECTING APOPTOSE. - Google Patents
METHOD AND KIT FOR DETECTING APOPTOSE. Download PDFInfo
- Publication number
- NL9100550A NL9100550A NL9100550A NL9100550A NL9100550A NL 9100550 A NL9100550 A NL 9100550A NL 9100550 A NL9100550 A NL 9100550A NL 9100550 A NL9100550 A NL 9100550A NL 9100550 A NL9100550 A NL 9100550A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- modified
- deoxynucleotide
- antibody
- detectable
- nick translation
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6841—In situ hybridisation
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Titel: Werkwijze en kit voor het detecteren van apoptoseTitle: Method and kit for detecting apoptosis
De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze en een kit voor het detecteren van apoptose in zoogdiercellen. De uitvinding betreft meer in het bijzonder een nieuwe techniek voor de detectie van apoptose in individuele cellen.The invention relates to a method and a kit for detecting apoptosis in mammalian cells. More particularly, the invention relates to a new technique for the detection of apoptosis in individual cells.
Andere aanduidingen voor apoptose zijn: interfase dood en geprogrammeerde celdood. Het belang van de detectie van apoptose in cellen werd onder andere erkend door Kerr et al. (Apoptosis: A basic biological phenomenom with wide-ranging implications in tissue kinetics, 1972, British Journal of Cancer 26: 239-257). Apoptose is een belangrijk fenomeen in embryogenese, cel differentiatie en tumor regressie. Apoptose is een algemene vorm van negatieve celselectie die geïnduceerd kan worden door factoren in de omgeving van de cel. Tot deze factoren behoren onder andere: cytokines (o.a. Tumor Necrose Factor, TNF), T-lymfocyten, specifieke glucocorticosteroiden en straling. De belangrijkste karakteristieken van apoptose zijn: afbraak van het chromatine in DNA fragmenten ter grootte van nucleosomen (+ 160 baseparen lang), segmentatie van de kern, condensatie van het cytoplasma en bladderen van de celmembraan. Sellins en Cohen (Gene induction by γ-irradiation leads to DNA fragmentation in lymphocytes, 1987, The Journal of Immunology 139, 3199-3206) hebben aangetoond dat apoptose een actief proces is, waarbij RNA- en eiwitsynthese plaats vindt voordat het proces dat tot apoptose leidt kan beginnen.Other indications for apoptosis are interphase death and programmed cell death. The importance of the detection of apoptosis in cells has been recognized, inter alia, by Kerr et al. (Apoptosis: A basic biological phenomenom with wide-ranging implications in tissue kinetics, 1972, British Journal of Cancer 26: 239-257). Apoptosis is an important phenomenon in embryogenesis, cell differentiation and tumor regression. Apoptosis is a generalized form of negative cell selection that can be induced by factors in the environment of the cell. These factors include: cytokines (including Tumor Necrosis Factor, TNF), T lymphocytes, specific glucocorticosteroids and radiation. The main characteristics of apoptosis are: degradation of the chromatin in DNA fragments the size of nucleosomes (+ 160 base pairs long), segmentation of the nucleus, condensation of the cytoplasm and peeling of the cell membrane. Sellins and Cohen (Gene induction by γ-irradiation leads to DNA fragmentation in lymphocytes, 1987, The Journal of Immunology 139, 3199-3206) have shown that apoptosis is an active process, involving RNA and protein synthesis before the process apoptosis can begin.
Wanneer één van deze twee stilgelegd wordt, treedt er geen apoptose op.When either of these is shut down, apoptosis does not occur.
Het is van groot belang dat apoptose in verband met medische behandelingen waarbij apoptose geïnduceerd wordt, optreedt of een relevant bijverschijnsel is, kan worden gedetecteerd. Er zijn behandelingsstrategieën van kanker in ontwikkeling die erop gericht zijn specifiek apoptose te induceren in tumoren. Evaluaties van deze behandelingswijzen vereisen een goede, objectieve methode voor de detectie van apoptose in zowel tumorweefsel als in het gezonde weefsel. Ook vormt Interfase Dood, een specifieke vorm van apoptose die onder andere geïnduceerd kan worden met straling, een belangrijk fenomeen waarvoor een goede kwantificering wenselijk is.It is of great importance that apoptosis related to medical treatments where apoptosis is induced, occurs or is a relevant side effect can be detected. Cancer treatment strategies are being developed that specifically aim to induce apoptosis in tumors. Evaluations of these treatments require a good, objective method for the detection of apoptosis in both tumor and healthy tissue. Interphase Death, a specific form of apoptosis that can be induced with radiation, is also an important phenomenon for which good quantification is desirable.
Er zijn verschillende methoden voor de detectie van apoptose bekend. Deze kunnen als volgt worden onderverdeeld: - Isolatie van DNA fragmenten van oligonucleosoom-grootte uit apoptotische cellen. Voor deze methode is echter een relatief groot aantal cellen nodig en bovendien geeft deze methode geen exacte informatie over het percentage cellen in apoptose.Several methods of detection of apoptosis are known. These can be subdivided as follows: Isolation of oligonucleosome size DNA fragments from apoptotic cells. However, this method requires a relatively large number of cells and, moreover, this method does not provide exact information about the percentage of cells in apoptosis.
- Morfologische evaluatie. De morfologische eigenschappen van cellen in apoptose zijn duidelijk onderscheidbaar van andere cellen. Tijdens apoptose treden zowel een inkrimping van het cytoplasma als een segmentering van de nucleus op. Voor dit type van analyse is echter een patholoog of getrainde analist nodig. Het is bovendien niet eenvoudig om dit proces te automatiseren. Ook is een goede morfologische evaluatie in hoofdzaak beperkt tot de latere stadia van apoptose.- Morphological evaluation. The morphological properties of cells in apoptosis are clearly distinguishable from other cells. During apoptosis, both a shrinkage of the cytoplasm and a segmentation of the nucleus occur. However, this type of analysis requires a pathologist or trained analyst. Moreover, it is not easy to automate this process. Also, a good morphological evaluation is mainly limited to the later stages of apoptosis.
- Methoden welke berusten op de verschillende permeabiliteit voor bepaalde fluorescerende kleurstoffen van levende en dode cellen. In een later stadium van apoptose wordt de celmembraan permeabel. De cellen worden daardoor toegankelijk voor kleurstoffen. Gekleurde cellen kunnen worden geteld met behulp van een microscoop of een flow cytometer. Deze methode is wel eenvoudig, maar niet echt specifiek voor apoptose en vereist een vrij lange tijd (+ 6 tot 24 uur) tussen de inductie van apoptose en de detectie.- Methods based on the different permeability to certain fluorescent dyes of living and dead cells. At a later stage of apoptosis, the cell membrane becomes permeable. The cells thereby become accessible to dyes. Stained cells can be counted using a microscope or a flow cytometer. This method is simple, but not really specific for apoptosis and requires quite a long time (+ 6 to 24 hours) between the induction of apoptosis and the detection.
De uitvinding verschaft nu een nieuwe werkwijze voor het detecteren van apoptose in zoogdiercellen, waarbij men de te onderzoeken cellen incubeert in een voor in situ nick translatie geschikt medium, waarbij ten minste één van de in het medium aanwezige deoxynucleotiden zodanig is gemodificeerd dat het gedetecteerd kan worden, en men de cellen, nadat het nick translatie medium is verwijderd, onderzoekt op de aanwezigheid van DNA dat gemodificeerd deoxynucleotide bevat.The invention now provides a new method for detecting apoptosis in mammalian cells, wherein the cells to be examined are incubated in a medium suitable for in situ nick translation, wherein at least one of the deoxynucleotides present in the medium is modified such that it can be detected. cells, and after the nick translation medium is removed, the cells are examined for the presence of DNA containing modified deoxynucleotide.
Tevens verschaft de uitvinding een kit ten behoeve van de detectie van apoptose in zoogdiercellen, omvattende (a) componenten waaruit een voor in situ nick translatie geschikt medium kan worden samengesteld, waaronder ten minste één zodanig gemodificeerd deoxynucleotide dat het gedetecteerd kan worden, en (b) middelen waarmee de cellen, na verwijdering van het nick translatie medium, kunnen worden onderzocht op de aanwezigheid van DNA dat gemodificeerd deoxynucleotide bevat.The invention also provides a kit for the detection of apoptosis in mammalian cells, comprising (a) components from which a medium suitable for in situ nick translation can be composed, including at least one deoxynucleotide modified such that it can be detected, and (b ) means by which the cells, after removal of the nick translation medium, can be examined for the presence of DNA containing modified deoxynucleotide.
Volgens de uitvinding wordt apoptose gedetecteerd door breuken in het DNA in apoptotische cellen te labelen en aldus waarneembaar te maken. Het labelen van de DNA breuken kan worden gerealiseerd met behulp van enzymen die specifiek deoxynucleotiden (hierin gemakshalve ook wel aangeduid als nucleotiden) inbouwen in DNA vanaf een breuk in de DNA helix. Dit geschiedt volgens de op zichzelf bekende nick translatie methode. Deze wordt in de moleculaire biologie gebruikt voor het labelen van DNA voor hybridisatie toepassingen (zie: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pag. 10.7-10.10).According to the invention, apoptosis is detected by labeling breaks in the DNA in apoptotic cells and thus making them detectable. Labeling of the DNA breaks can be accomplished using enzymes that specifically incorporate deoxynucleotides (hereinafter conveniently referred to as nucleotides herein) into DNA from a break in the DNA helix. This is done according to the known nick translation method. It is used in molecular biology to label DNA for hybridization applications (see: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pp. 10.7-10.10).
Aangezien de uitvinding een labelings-methode betreft van individuele cellen, is het mogelijk deze snel te meten met behulp van cytometrische technieken. Cytometrie wordt veel gebruikt voor de studie van zoogdiercellen. De twee relevante technieken zijn: - Flow cytometrie. Het principe van flow cytometrie is dat men deeltjes die in een vloeistofstroom gesuspendeerd zijn door een laserbundel laat passeren. Het laserlicht wordt bij deze passage verstrooid en voor elke individuele cel wordt de fluorescentie die hierbij ontstaat gemeten. Aldus kan van in de orde van grootte van enkele duizenden cellen per seconde informatie worden verkregen over grootte van de cel, structuur en chemische samenstelling (zie:M.R. Melamed, et al.: Flow Cytometry and Sorting, 1979, pp. 1-9 en 11-37, John Wiley & Sons, New York).Since the invention concerns a labeling method of individual cells, it is possible to measure them quickly using cytometric techniques. Cytometry is widely used for the study of mammalian cells. The two relevant techniques are: - Flow cytometry. The principle of flow cytometry is that particles suspended in a liquid stream are allowed to pass through a laser beam. The laser light is scattered during this passage and the fluorescence that is generated for each individual cell is measured. Thus, on the order of several thousand cells per second, information can be obtained about cell size, structure and chemical composition (see: MR Melamed, et al .: Flow Cytometry and Sorting, 1979, pp. 1-9 and 11-37, John Wiley & Sons, New York).
- Beeld cytometrie. Hierbij wordt het microscoopbeeld van (een aantal) cellen door een computer verwerkt en geanalyseerd met behulp van patroonherkenningstechnieken. Aldus kunnen op een snelle wijze cellen worden geïdentificeerd en karakteristieken van deze cellen worden gemeten.- Image cytometry. The microscope image of (a number of) cells is processed by a computer and analyzed using pattern recognition techniques. Thus cells can be quickly identified and characteristics of these cells measured.
Het gebruikte label kan echter ook op andere wijzen worden gedetecteerd, bijv. direct of na toepassing van een geschikte kleuringstechniek zichtbaar worden gemaakt onder een microscoop, of in het geval van een radioactief label met behulp van autoradiografie worden waargenomen.However, the label used can also be detected in other ways, e.g., be visualized directly under a microscope or after application of an appropriate staining technique, or in the case of a radioactive label by autoradiography.
De methode volgens de uitvinding is gebaseerd op het labelen van DNA breuken die kenmerkend zijn voor cellen in apoptose. Tijdens de apoptotische DNA fragmentatie wordt het chromatine van de cellen door endonucleases in fragmenten van oligo-nucleosoom grootte geknipt. Endonucleases knippen in het DNA tussen twee nucleosomen. De breuken die tijdens deze DNA fragmentatie zijn ontstaan, zijn het target voor de in situ nick translatie.The method of the invention is based on the labeling of DNA breaks that are characteristic of cells in apoptosis. During apoptotic DNA fragmentation, the chromatin of the cells is cut into oligo-nucleosome size fragments by endonucleases. Endonucleases cut the DNA between two nucleosomes. The breaks that occur during this DNA fragmentation are the target for the in situ nick translation.
De uitvinding maakt het mogelijk om specifiek breuken in het DNA van cellen in apoptose te labelen. Het ontstaan van DNA breuken is een vroege karakteristiek van apoptose zodat volgens de uitvinding ook cellen kunnen worden gedetecteerd die zich in het beginstadium van apoptose bevinden. De cellen kunnen duidelijk en objectief worden onderscheiden van cellen die niet in apoptose zijn. Omdat het een in situ methode betreft, is het mogelijk om het percentage cellen in apoptose nauwkeurig te bepalen. Ook kan apoptose volgens de uitvinding binnen een subpopulatie van alle cellen onderzocht worden. Een duidelijk onderscheid gebaseerd op labelingstechniek maakt het mogelijk een snelle screening te doen met behulp van flow- en beeld-cytometrie.The invention makes it possible to specifically label breaks in the DNA of cells in apoptosis. The emergence of DNA breaks is an early characteristic of apoptosis, so that according to the invention cells can also be detected that are in the initial stage of apoptosis. The cells can be clearly and objectively distinguished from cells that are not in apoptosis. Because it is an in situ method, it is possible to accurately determine the percentage of cells in apoptosis. Apoptosis according to the invention can also be investigated within a subpopulation of all cells. A clear distinction based on labeling technique allows rapid screening using flow and image cytometry.
Nucleotiden kunnen op verschillende wijzen zodanig zijn gemodificeerd dat ze van een detecteerbaar label kunnen worden voorzien: - Gemodificeerde nucleotiden die door een antilichaam kunnen worden herkend, bijvoorbeeld Bromo-deoxyuridine (Brdü) en Iodo-deoxyuridine (IdU). Dit zijn thymidine analoga die kunnen worden gedetecteerd met antilichamen die specifiek binden aan Brdü en IdU. Deze antilichamen kunnen geconjugeerd zijn aan bijv. een fluorescerende groep of aan een enzym dat optische detectie mogelijk maakt. Het is ook mogelijk deze antilichamen met behulp van een tweede laag van fluorescerend gelabelde antilichamen te detecteren.Nucleotides can be modified in several ways to be labeled with a detectable: Modified nucleotides that can be recognized by an antibody, for example Bromo-deoxyuridine (Brdü) and Iodo-deoxyuridine (IdU). These are thymidine analogues that can be detected with antibodies that specifically bind to Brdü and IdU. These antibodies can be conjugated to, for example, a fluorescent group or to an enzyme that allows optical detection. It is also possible to detect these antibodies using a second layer of fluorescently labeled antibodies.
- Afgeleiden van nucleotiden die een groep bevatten die specifiek aan andere moleculen kan binden, bijvoorbeeld een biotine-groep of een digoxigenine-groep, gebonden aan dUTP of dATP. De DNA nucleotiden kunnen via een zgn. spacer-arm gekoppeld worden aan biotine. Biotine kan worden gedetecteerd met behulp van avidine of streptavidine. Biotine en (strept)avidine hebben een zeer hoge affiniteit voor elkaar.- Derivatives of nucleotides containing a group that can bind specifically to other molecules, for example a biotin group or a digoxigenin group, bound to dUTP or dATP. The DNA nucleotides can be linked to biotin via a so-called spacer arm. Biotin can be detected using avidin or streptavidin. Biotin and (strept) avidin have a very high affinity for each other.
(Strept)avidine kan weer eenvoudig gekoppeld zijn aan een fluorescerende stof, een andere kleurstof of een enzym. Men kan bijv. gebruik maken van commerciëel verkrijgbare conjugaten van streptavidine en avidine met FITC en Cascade(Strept) avidin can again easily be linked to a fluorescent substance, another dye or an enzyme. For example, one can use commercially available streptavidin and avidin conjugates with FITC and Cascade
Blue. Het hapteen digoxigenine kan gedetecteerd worden met behulp van antilichamen.Blue. The hapten digoxigenin can be detected using antibodies.
- Radioactief gelabelde nucleotiden, bijvoorbeeld met tritium gelabelde nucleotiden.- Radiolabeled nucleotides, for example tritium labeled nucleotides.
- Nucleotiden die direct gekoppeld zijn aan een fluorescerende groep of molecuul, zoals fluoresceine, coumarine, rhodamine en hun derivaten.- Nucleotides directly linked to a fluorescent group or molecule, such as fluorescein, coumarin, rhodamine and their derivatives.
Inbouw kan worden uitgevoerd met alle enzymen die nucleotiden vanaf een enkel- of dubbelstrengs breuk in het DNA kunnen inbouwen, zoals £. coli DNA polymerase I, terminal deoxynucleotidyl-transferase en Klenow polymerase. Als label kunnen alle fluorescerende stoffen worden gebruikt die aan een eiwitmolecuul gekoppeld kunnen worden. Voor een eventuele tegenkleuring van het DNA dient bij voorkeur een kleurstof te worden gekozen met een emissiespectrum dat goed te scheiden is van de kleurstof waarmee de DNA-breuken gelabeld zijn. Men kan zeer geschikt FITC, Bodipy en Cascade Blue® gebruiken als kleurstoffen voor de te labelen DNA breuken, terwijl dan DAPI, Hoechst 33258 en Propidium Jodide kunnen worden gebruikt voor de tegenkleuring van het DNA.Incorporation can be performed with any enzyme capable of incorporating nucleotides into the DNA from a single or double stranded break, such as β. coli DNA polymerase I, terminal deoxynucleotidyl transferase and Klenow polymerase. All fluorescent substances that can be coupled to a protein molecule can be used as a label. For a possible counterstaining of the DNA, it is preferable to choose a dye with an emission spectrum that is easy to separate from the dye with which the DNA breaks are labeled. Very suitably FITC, Bodipy and Cascade Blue® can be used as dyes for the DNA breaks to be labeled, while DAPI, Hoechst 33258 and Propidium Iodide can be used for counterstaining the DNA.
De uitvinding zal aan de hand van een voorbeeld en de figuren 1-2 nader worden toegelicht.The invention will be explained in more detail with reference to an example and figures 1-2.
VoorbeeldExample
De in situ nick translatie procedure werd uitgevoerd in zgn. 'nick translatie buffer'. Deze bestond uit 5 mM MgCl2, 10 mM β-mercapto-ethanol, 50 mM Tris-pH 7.8 en 10 μg/ml Bovine Serum Albumin (BSA). Gebruikt werden 200.000 cellen in 12.5 μΐ buffer. Aan deze buffer werden toegevoegd: 1 unit polymerase (E. coli). 0.2 nmol biotin-16-dUTP, 0.2 nmol ongelabeld dATP, dCTP en dGTP. Dit mengsel werd 90 minuten geïncubeerd op 15°C. Hierna werden de cellen gewassen en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd in een kleurbuffer. Deze kleur-buffer bestond uit 2.5 μg/ml van een avidine-FITC conjugaat, DCS kwaliteit in 4*SSC, 0.1% Triton-X-100 en 5% Nonfat Dry Milk. Hierna werden de cellen gewassen met Hepes gebufferde Hank's Salt Solution (HH) met 0.1% Triton-X-100 en met 1 μg/ml van de fluorescerende DNA kleurstof DAPI, 30 minuten op 4°C in HH, tegengekleurd.The in situ nick translation procedure was performed in so-called 'nick translation buffer'. This consisted of 5 mM MgCl2, 10 mM β-mercaptoethanol, 50 mM Tris-pH 7.8 and 10 μg / ml Bovine Serum Albumin (BSA). 200,000 cells were used in 12.5 μΐ buffer. To this buffer were added: 1 unit of polymerase (E. coli). 0.2 nmol biotin-16-dUTP, 0.2 nmol unlabelled dATP, dCTP and dGTP. This mixture was incubated at 15 ° C for 90 minutes. The cells were then washed and incubated in a color buffer for 30 minutes at room temperature. This color buffer consisted of 2.5 μg / ml of an avidin-FITC conjugate, DCS grade in 4 * SSC, 0.1% Triton-X-100 and 5% Nonfat Dry Milk. After this, the cells were washed with Hepes buffered Hank's Salt Solution (HH) with 0.1% Triton-X-100 and counterstained with 1 μg / ml of the fluorescent DNA dye DAPI, at 4 ° C in HH for 30 minutes.
FigytretFigytret
Fig. 1 laat de detectie van apoptose na bestraling zien aan de hand van dotplots van flow-cytometrie data. De metingen van 2 000 individuele cellen zijn weergegeven. Individuele cellen zijn weergegeven als stippen in een twee-dimensionale ruimte. Twee bivariate verdelingen zijn weergegeven van de DAPI fluorescentie (x-as) tegen de FITC fluorescentie (y-as). De DAPI fluorescentie is een maat voor de DNA inhoud. De FITC fluorescentie is een maat voor de hoeveelheid ingebouwd biotine-ll-dUTP, en daarmee een indicator voor apoptose. Cellen met een hoge FITC fluorescentie zijn in apoptose. De cellen in fig. 1 zijn muize-thymocyten, geïsoleerd uit BCBA muizen. Ze werden bestraald en daarna zes uur geïncubeerd bij 37°C. Hierna werden de cellen gefixeerd met formaldehyde, gevolgd door ethanol fixatie. Hierna werd de in situ nick translatie uitgevoerd. De stippen in het vierkant met de pijl zijn de cellen in apoptose. Deze cellen hebben een verhoogde FITC fluorescentie.Fig. 1 shows detection of apoptosis after irradiation using dot plots from flow cytometry data. The measurements of 2,000 individual cells are shown. Individual cells are shown as dots in a two-dimensional space. Two bivariate distributions of the DAPI fluorescence (x axis) against the FITC fluorescence (y axis) are shown. The DAPI fluorescence is a measure of the DNA content. The FITC fluorescence is a measure of the amount of built-in biotin-ll-dUTP, and thus an indicator of apoptosis. Cells with high FITC fluorescence are in apoptosis. The cells in Figure 1 are mouse thymocytes isolated from BCBA mice. They were irradiated and then incubated at 37 ° C for six hours. After this, the cells were fixed with formaldehyde followed by ethanol fixation. After this, the in situ nick translation was performed. The dots in the square with the arrow are the cells in apoptosis. These cells have an increased FITC fluorescence.
Fig. 2 laat de toename van apoptose in DA-1 cellen zien als functie van de stralingsdosis. DA-1 cellen werden gekweekt met medium dat verrijkt was met IL-3. Monsters van 1.106 cellen werden bestraald en geïncubeerd met en zonder IL-3. Na zes uur werden de monsters gefixeerd. De in situ nick translatie procedure werd uitgevoerd en de cellen werden gemeten. Het wordt duidelijk uit deze figuur dat de in situ nick translatie een gevoelige techniek is. Al vanaf 0.25 Gy wordt een verhoogd aantal cellen in apoptose gemeten. Ook laat deze figuur zien dat het effect van groeifactoren op apoptose met deze methode kan worden bestudeerd: IL-3 voorkomt vrijwel volledig deze door straling geïnduceerde apoptose.Fig. 2 shows the increase in apoptosis in DA-1 cells as a function of the radiation dose. DA-1 cells were cultured with medium enriched with IL-3. Samples from 1,106 cells were irradiated and incubated with and without IL-3. After six hours, the samples were fixed. The in situ nick translation procedure was performed and the cells were measured. It is clear from this figure that the in situ nick translation is a sensitive technique. An increased number of cells in apoptosis is measured from as little as 0.25 Gy. This figure also shows that the effect of growth factors on apoptosis can be studied with this method: IL-3 almost completely prevents this radiation-induced apoptosis.
Claims (23)
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL9100550A NL9100550A (en) | 1991-03-27 | 1991-03-27 | METHOD AND KIT FOR DETECTING APOPTOSE. |
| AU15701/92A AU1570192A (en) | 1991-03-27 | 1992-03-26 | Method and kit for detecting apoptosis |
| PCT/NL1992/000059 WO1992017610A1 (en) | 1991-03-27 | 1992-03-26 | Method and kit for detecting apoptosis |
| EP92908721A EP0581801A1 (en) | 1991-03-27 | 1992-03-26 | Method and kit for detecting apoptosis |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL9100550 | 1991-03-27 | ||
| NL9100550A NL9100550A (en) | 1991-03-27 | 1991-03-27 | METHOD AND KIT FOR DETECTING APOPTOSE. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL9100550A true NL9100550A (en) | 1992-10-16 |
Family
ID=19859070
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL9100550A NL9100550A (en) | 1991-03-27 | 1991-03-27 | METHOD AND KIT FOR DETECTING APOPTOSE. |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0581801A1 (en) |
| AU (1) | AU1570192A (en) |
| NL (1) | NL9100550A (en) |
| WO (1) | WO1992017610A1 (en) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4319506A1 (en) * | 1993-06-12 | 1994-12-15 | Boehringer Mannheim Gmbh | Method for the detection of metabolically labeled DNA |
| FR2731711B1 (en) * | 1995-03-15 | 1997-06-06 | Rech Investissements Sfri Soc | METHOD FOR QUALITATIVE AND QUANTITATIVE DETECTION OF DNA DAMAGE |
| CA2230753A1 (en) * | 1995-08-30 | 1997-03-06 | New York Medical College | Methods for labeling dna ends with halogenated nucleotides and detecting same with antibodies |
| DE19544333C2 (en) * | 1995-11-28 | 1998-12-10 | Deutsches Krebsforsch | Procedure for assessing the activity of drugs |
| US5858694A (en) * | 1997-05-30 | 1999-01-12 | Cell Pathways, Inc. | Method for identifying compounds for inhibition of cancerous lesions |
| CN111579538B (en) * | 2020-04-22 | 2022-12-30 | 山东第一医科大学(山东省医学科学院) | Method for detecting circulating tumor cells by using apoptosis kit |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2588383B1 (en) * | 1985-10-04 | 1988-01-08 | Inst Nat Sante Rech Med | NOVEL PROCESS FOR RECOVERING AND DETERMINING MICROQUANTITES OF DEOXYRIBONUCLEIC ACID IN AN ACELLULAR BIOLOGICAL LIQUID |
-
1991
- 1991-03-27 NL NL9100550A patent/NL9100550A/en not_active Application Discontinuation
-
1992
- 1992-03-26 EP EP92908721A patent/EP0581801A1/en not_active Ceased
- 1992-03-26 WO PCT/NL1992/000059 patent/WO1992017610A1/en not_active Application Discontinuation
- 1992-03-26 AU AU15701/92A patent/AU1570192A/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1992017610A1 (en) | 1992-10-15 |
| AU1570192A (en) | 1992-11-02 |
| EP0581801A1 (en) | 1994-02-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Darzynkiewicz et al. | Assays of cell viability: discrimination of cells dying by apoptosis | |
| US9790541B2 (en) | Methods and compositions for labeling nucleic acids | |
| Darzynkiewicz et al. | Flow cytometry | |
| AU646635B2 (en) | In-situ hybridization in suspension for detection or separation of cells | |
| US4770992A (en) | Detection of specific DNA sequences by flow cytometry | |
| Darzynkiewicz et al. | Recognition of cells in mitosis by flow cytofluormetry. | |
| Boeck | Current status of flow cytometry in cell and molecular biology | |
| Traganos et al. | Cytofluorometric studies on conformation of nucleic acids in situ. I. Restriction of acridine orange binding by chromatin proteins. | |
| NL9100550A (en) | METHOD AND KIT FOR DETECTING APOPTOSE. | |
| US20140017673A1 (en) | Method for enumerating eukaryotic cell micronuclei with an emphasis on simultaneously acquiring cytotoxicity and mode of action information | |
| Traganos et al. | Nucleic acid content and cell cycle distribution of five human bladder cell lines analysed by flow cytofluorometry | |
| Darzynkiewicz | Acid-induced denaturation of DNA in situ as a probe of chromatin structure | |
| Darzynkiewicz | Cytochemical probes of cycling and quiescent cells applicable to flow cytometry | |
| US20050079516A1 (en) | Chromosome stability assay | |
| Thiessen et al. | Microspectrophotometric cell analysis | |
| Crissman et al. | Multivariate cell analysis: Techniques for correlated measurements of DNA and other cellular constituents | |
| Darzynkiewicz et al. | In situ detection of DNA strand breaks in analysis of apoptosis by flow-and laser-scanning cytometry | |
| Walker et al. | Labeling DNA damage with terminal transferase: applicability, specificity, and limitations | |
| Darzynkiewicz et al. | Detection of DNA strand breakage in the analysis of apoptosis and cell proliferation by flow and laser scanning cytometry | |
| Darzynkiewicz et al. | Analysis of cell death by flow and laser-scanning cytometry | |
| OLINS et al. | Inhibition of DNA synthesis in the macronuclear replication band of Euplotes eurystomus | |
| Zelenin | Acridine Orange as a Probe | |
| Darzynkiewicz et al. | Assays of cell viability: discrimination of cells dying by apoptosis | |
| Traganos | Difficulties and Pitfalls In Analysis | |
| PINKEL et al. | JGJ BAUMAN |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A1B | A search report has been drawn up | ||
| BV | The patent application has lapsed |