KR20220164023A - 반응성 가스를 사용하여 바이러스를 무력화시키는 방법 - Google Patents
반응성 가스를 사용하여 바이러스를 무력화시키는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
바이러스로 오염되거나, 바이러스로 오염된 것으로 의심되는 표면을 소독하는 방법으로서, 20 kV 내지 150 kV의 전압에서 유전체 장벽 방전 (DBD) 시스템을 사용하여 작동 가스로부터 고전압 저온 플라즈마 (HVCP)를 형성함으로써 반응성 가스를 생성하는 단계; 상기 반응성 가스를 HVCP에서 적어도 1미터 떨어진 곳으로 이송하는 단계; 이후, 상기 표면을 반응성 가스와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법이 제공된다.
Description
본 발명은 반응성 가스를 사용하여 바이러스를 무력화시키는 방법에 관한 것이다.
생물학적 오염 제거 및 살균은 의료 장비 및 장치 살균, 식품 생산 및 보존, 및 소비재의 제조를 비롯하여 광범위하게 적용된다. 화학물질, 열, 고에너지 전자빔 및 X선 또는 감마선 조사 시스템이 현재 살균을 위해 사용되고 있다. 이러한 시스템들은 각각 비용, 효율성, 부동성, 전력 요구량, 독성 폐기물, 인체 유해성, 및 살균 또는 오염 제거에 필요한 시간에 기인하여 취사선택된다.
플라즈마는 오염 제거 및 살균에 이용되어 왔다. 기체, 액체 및 고체와 구별되는 4번째 상태 물질인 플라즈마는 전기 방전, 예컨대 가스를 통한 전기 방전을 통해 제조될 수 있다. 모든 플라즈마들은 전자, 이온 및 중성 화학종을 포함하지만, 플라즈마를 생성하는데 사용되는 장치의 전기적 및 구조적 구성 뿐만 아니라 플라즈마를 제조하는데 사용되는 가스의 조성에 따라 달라지는 다양한 특성들을 가질 것이다.
플라즈마 중 하나의 유형은 유전체 장벽 방전 (DBD, dielectric barrier discharge) 시스템을 이용하여 제조될 수 있는 고전압 저온 플라즈마 (HVCP)이다. HVCP는 바람직하게 전압이 30 kV 내지 500 kV이고, 일반적으로 주파수가 50 또는 60 Hz인 DBD 시스템을 이용하여, 가스의 비평형 파괴를 통해 제조될 수 있다. HVCP는 열 플라즈마 또는 RF 플라즈마와 같은 다른 유형들의 플라즈마와 마찬가지로 연구되어 있지 않다. 따라서, 이러한 플라즈마의 특성들이나 이러한 플라즈마에서 생성되는 여기된 다양한 반응성 화학종들을 설명하는 이론은 현재 존재하지 않는다. 지난 10년간 이 플라즈마를 연구하기 위해 HVCP에 대한 실험적 검사가 수행되어 왔다.
HVCP에 대한 물질들의 직접적 노출이 연구되었다. 특히 생물학적 제품과 오염물을 HVCP에 노출시키는 연구들이 특히 관련성이 있는데, 이 연구에서는 생물학적 제품들을 패키지 안에 밀봉하여 HVCP를 해당 패키지 내부에서 생성시킨다. 이러한 연구들에서, 농산물 및 기타 재료들과 같은 패키지 식품들은 단시간에 살균되었다. 패키지 안의 제품은 플라즈마와 직접 접촉하게 된다. 패키지가 밀봉되어 있기 때문에, 이들 패키지가 분해되어 발생기 상태로 돌아갈때까지 해당 제품과 접촉한 상태를 유지하여 플라즈마에서 생성된 반응성 가스는 희석되거나 분산되지 않으며, 패키지된 제품은 재오염으로부터 보호되어, 과일과 야채와 같은 해당 제품의 유통 기한을 획기적으로 연장시킨다. 예컨대, 미국 특허 공보 2013/0189156호와 2014/0044595호 (모두 Keener et al.)를 참조한다.
오존 가스는 소독제로 인식되어 있으며, 오존은 담배 냄새와 같은 냄새를 제거하기 위해 표면을 처리하는데 사용되어 왔다. 오존은 바이러스를 죽일 수 있다. 예를 들어, 오존 처리는 다량의 물과 폐수 처리 시설들의 필수적인 부분이다 (Wolf, C., et al., "Proxies to monitor the inactivation of viruses by ozone in surface water and wastewater effluent", Water Research, Volume 166 (2019)). 또한, 오존은 과일과 같은 식품을 처리하는데 사용되어 왔다 (Brie, A., et al., "Inactivation of murine norovirus and hepatitis A virus on fresh raspberries by gaseous ozone treatment", Food Microbiol., vol. 70, pg. 1-6 (2018)). 이러한 처리를 통해서 물과 제품들을 안전하게 소비할 수 있다.
최근, 다양한 바이러스성 질병들이 출현하여 이에 대한 효과적인 치료법이 부족한 현실이, 이러한 바이러스성 질병들을 해결할 수 있는 강력한 살균 방법 및 치료법의 개발에 대한 수요를 창출하게 되었다. 백신접종을 통해 환경 및 인간 바이러스 병원체들을 제어하는데 진전이 있었음에도 불구하고, 이러한 공중 보건을 위협하는 것들을 소독하기 위해서는 새로운 접근 방식이 필요하다. 이러한 기술들은 음식, 공기, 표면 및 수인성 바이러스를 무력화시켜 이들의 감염을 예방하고 지역사회에서의 확산을 방지하는데 적절해야 한다.
어떤 바이러스들은 접촉, 큰 호흡기 비말 및 작은 입자 비말 핵 (에어로졸)을 통해, 심지어는 오염된 표면으로부터도 확산될 수 있다. 실험 연구에 따르면, 인플루엔자 바이러스는 작은 입자의 에어로졸에서 감염성을 유지할 수 있으며, 방 전체로 이동할 수도 있다 (Cowling BJ, et al., "Aerosol transmission is an important mode of influenza A virus spread." Nat Commun., 4, 1935 (2013)). 코로나 바이러스와 로타바이러스는 오염된 표면과의 접촉을 통해 퍼질 수 있다. 이와 마찬가지로 홍역도 전염성이 있다.
표면에 존재할 수 있는 바이러스들을 무력화하기 위한 현재의 기술로는, 존재할 수 있는 임의의 바이러스를 무력화하기 위해 액체 소독제를 분사하는 것을 포함한다. 소독제를 살포하는 담당자라면 감염이나 오염으로부터 자신을 보호하기 위해 보호복을 착용해야 한다.
오존은 바이러스 오염 제거제로 사용되어 왔다 (Hudson JB, et al., "Development of a Practical Method for Using Ozone Gas as a Virus Decontaminating Agent" Ozone: Science & Engineering, 31, 216 (2009)). 바이러스 제거를 위한 다양한 표면 처리는 20 내지 25 ppm의 오존 가스를 사용하여 수행되었다. 주위 조건 하에 어느 정도는 오염이 제거되었지만, 오존 가스가 90% 이상의 상대 습도로 가습되었던 경우에 훨씬 더 큰 효과가 있었다. 8개의 코로나 방전 장치, 순환 팬, 및 처리 후 오존을 다시 산소로 전환시키는 촉매 변환기를 포함하는 프로토타입 장치를 설명한다.
제1 양태에서, 본 발명은 바이러스로 오염된 것으로 의심되는 표면을 소독 (disinfect)하는 방법으로서, 20 kV 내지 150 kV의 전압에서 유전체 장벽 방전 (DBD) 시스템을 사용하여 작동 가스 (working gas)로부터 고전압 저온 플라즈마 (HVCP)를 형성함으로써 반응성 가스를 생성하는 단계; 상기 반응성 가스를 HVCP에서 적어도 1미터 떨어진 곳으로 이송하는 단계; 이후, 상기 표면을 반응성 가스와 접촉시켜 상기 표면을 소독하는 단계를 포함하는, 방법이다. 바이러스에 감염된 숙주는 상기 표면에 접촉하였다.
제2 양태에서, 본 발명은 바이러스로 오염된 표면을 소독하는 방법으로서, 20 kV 내지 150 kV의 전압에서 유전체 장벽 방전 (DBD) 시스템을 사용하여 작동 가스로부터 고전압 저온 플라즈마 (HVCP)를 형성함으로써 반응성 가스를 생성하는 단계; 상기 반응성 가스를 HVCP에서 적어도 1미터 떨어진 곳으로 이송하는 단계; 이후, 상기 표면을 반응성 가스와 접촉시켜 상기 표면을 소독하는 단계를 포함하는, 방법이다. 바이러스에 감염된 숙주는 상기 표면에 접촉하였다.
정의
본원에 설명된 모든 전위는 볼트 (V) 및 킬로볼트 (kV) 제곱 평균 제곱근 (RMS)로 나타내며, 전력은 교류로 유도된다. 퍼센트(%) 가스 조성은 부피 퍼센트이다.
저온 플라즈마 (cold plasma)란, 플라즈마를 제조하는데 사용되는 가스 (즉, 작동 가스)의 온도보다 최대 40℃ 높은 온도, 보다 바람직하게 플라즈마를 제조하는데 사용되는 가스의 온도보다 최대 20℃ 높은 온도를 갖는 플라즈마를 가리킨다.
고전압 저온 플라즈마 (HVCP, High-voltage cold plasma)는 10 내지 50000 Torr의 압력, 예컨대 760 Torr (대기압)의 가스로부터 제조되는, 최대 5000 Hz의 주파수, 최대 500 kV의 전압을 이용하는, 유전체 장벽 방전 (DBD) 시스템을 이용하여 제조되는 저온 플라즈마를 의미한다. HVCP는 열 플라즈마가 아니고, 마이크로파 플라즈마도 아니며, 무선 주파수 (RF) 플라즈마도 아니다. HVCP 플라즈마는 비평형 파괴 조건 하에 생성된다.
반응성 가스는 여기된 화학 반응종들을 비롯한, HVCP에 의해 생성된 가스를 의미하나, 0.2초 이하로 소멸되는 종들은 포함하지 않는다. 반응성 가스의 조성은, 여기된 화학종들이 소멸되고 반응성 가스 내의 화학 반응들이 일어나면서 시간이 경과함에 따라 변화될 것이다. 반응성 가스는 HVCP를 생성하는 DBD 시스템으로부터 멀리 이동할 수 있는 가스이다. 반응성 화학종 또는 여기된 화학종들은, 분광법을 사용하여 검출될 수 있는 경우라면 해당 반응성 기체에 존재하는 것으로 간주한다.
유전체 장벽 방전 (DBD), 즉 DBD 시스템은 유전체 장벽에 의해 분리된 적어도 2개의 전극을 갖는 시스템을 의미하며, 방전에 의해 가스에서 생성되는 전하가 전극에 도달하는 것을 방지하도록 각 전극들 사이에 유전체 배리어가 존재하는 경우에는 더 많은 전극을 가질 수도 있다. DBD 시스템에서 인접한 전극들 간의 최단 거리는 바람직하게는 최대 30 cm (또는 12 인치)이고, 바람직하게는 적어도 0.5 cm (또는 0.25 인치)이다. 바람직하게는, DBD 시스템은 HVCP를 생성하는 조건 하에 작동하도록 구성되어 있다. DBD 시스템의 예를 도 1a, 1b, 1c, 1d, 1e 및 1f에 도시하며; 바람직하게는, 전극은 도 1a, 1b, 1c 및 1f에 도시되는 전극들 간에 직접 갭 또는 플리넘 (plenum)으로 이격된다.
작동 가스와 작동 가스 혼합물은 플라즈마를 형성하는데 사용되는 가스를 가리킨다.
패키지는 최대 6갤런 (즉 22.7리터) 부피의 용기를 의미한다.
"밀봉된" 또는 "실질적으로 밀봉된"이라는 말은, 건드리지 않고 놔두면 패키지 또는 용기 내의 가스가 적어도 24시간 동안 해당 패키지 또는 용기 내에 유지되어서, 외부로 흘러 확산되지 않는다는 것을 의미한다.
"소독하다"라는 용어는 바이러스가 파괴되었고/되었거나 존재하는 임의의 바이러스가 더 이상 질병을 일으킬 수 없음을 의미한다.
"숙주"는 바이러스가 질병을 유발하거나, 또는 박테리아에서 바이러스가 해당 박테리아의 용해를 일으키는 인간, 동물 또는 식물을 의미한다.
"바이러스로 오염된 표면"이라는 말은 표면에 바이러스가 존재한다는 것을 의미한다.
"오염된 것으로 의심되는 표면"이라는 말은 바이러스에 감염된 숙주가 해당 표면에 접촉한 것을 의미한다.
"표면에 접촉된"이라는 말에는 물리적 접촉 뿐만 아니라, 표면을 큰 호흡기 비말, 작은 입자 비말 핵 (에어로졸) 또는 기타 바이러스의 쉐딩 (shedding)에 노출시키는 것도 포함된다.
표면 소독 처리의 효과를 측정하기 위해, 하기의 프로토콜을 사용할 수 있다. 본 프로토콜은 "MS2 파지 플라크 분석 시험"으로 지칭할 수 있다. 본 프로토콜은 MS2 파지 샘플을 다른 바이러스에 대한 대용물로 제공하고, 상기 샘플들을 처리하여 해당 처리로 인한 MS2 파지 감소량을 측정함으로써, 바이러스의 양을 감소시키기 위한 치료의 효과를 검증하는데 사용할 수 있다. 본 프로토콜은 상기 처리된 MS2 파지 샘플을 대조군으로 사용하기 위해 미처리된 MS2 파지 샘플과 비교하는 것을 포함한다. 먼저, MS2 파지를 함유하는 용액을 수개의 멸균 여과지의 표면 상에 점을 찍는다. 상기 여과지를 건조시켜 실험 처리 전에 4℃의 깨끗한 용기에 둔다. 그런 다음, 상기 처리된 여과지들을 반응성 가스 (또는 다른 소독 처리제)로 처리한다. 미처리된 여과지들은 보관하여 대조군으로 사용하기 위해서 어떠한 처리에도 노출시키지 않는다. 처리 후, 처리된 여과지들을 멸균 플라스틱 용기에 넣고 SM 완충액 (구체적인 SM 완충액 제형에 대해서는 하기 표 7 참조)을 사용하는 추출을 위해 차가운 냉각기 중에서 실험실로 이송한다. 추출을 위해, 처리된 여과지와 미처리된 여과지를 무균 상태에서 0.5 cm 너비의 스트립으로 썰어서 쌓은 후에 50 ml의 멸균 튜브 내로 잘라 넣는다. SM 완충액 (5 mL)을 각 튜브에 첨가하고, 10분 동안 파지의 추출을 수행한다. 완충액을 추가한 직후, 10분간 각각 2분 간격으로 각 샘플들을 15초 동안 약하게 펄스 볼텍싱한다. 그 후, 상기 튜브들을 4℃에서 5000 rpm으로 원심분리한다. 다음으로, 잔류 파지를 함유하는 상청액을 0.22 μM의 나일론 주사기 필터를 통해 15 ml의 멸균 튜브로 여과시킨다. 이 상청액은 숙주인 이. 콜라이 (E. coli) 배양물에 추가될 것이다. 처리된 여과지 추출물과 미처리된 여과지 추출물을 여러 번 희석하고, TSB 탑 아가 (top agar) 및 바텀 아가 (bottom agar) 플레이트를 사용하는 플라크 분석에 의해 회수된 파지의 농도를 측정한다. 적절한 수의 플라크를 생성하는 파지 농도를 얻기 위해서는 희석을 더 많이 수행해야 할 수도 있다. 0.15 ml의 3시간 박테리아 배양액을 TSB 중에 1:5로 희석하고, 수조에서 42-45℃로 유지된 3 ml의 용융된 탑/소프트 아가에 첨가한 후, 15 ㎕의 희석된 MS2 파지 추출물을 첨가한다. 그런 다음, 상기 혼합물을 가볍게 볼텍싱하여, 바텀 아가 플레이트에 붓고, 응고되도록 놔둔다. 이후, 상기 플레이트들을 37℃ 항온배양기 중에서 뒤집어서 밤새 항온배양한다. 다음 날, 플레이트들에 형성된 플라크들 (투명한 부분들)을 계수하여 그 결과를 표로 작성한다. 이. 콜라이 배양은 10 ml의 TSB 액체 배지에 100 ㎕의 이. 콜라이 현탁액을 접종하고 37℃ 항온배양기 중에서 박테리아 배양물을 밤새 성장시킴으로써 시작된다. 다음날, 상기 밤샌 배양물을 사용하여 또 다른 신선한 이. 콜라이 배양을 시작한다. 1 ml의 상기 밤샌 배양물을 9 ml의 신선한 TSB 배지 (밤샌 배양물의 1:10 희석물)에 첨가하여 동일한 조건에서 3시간 동안 성장시킨다. 이후, 상기 신선한 배양물은 TSB 배지 중에서 1:5로 희석하여 박테리아 숙주로 사용한다.
2-log10 감소라는 것은, MS2 플라크 분석 시험으로 측정시, 처리 후 표면에 존재하는 활성 바이러스의 양이 처리 전에 존재하였던 활성 바이러스 양의 1/100임을 의미하는데; 상기 시험은 관심대상 바이러스가 처리 전에 실제로 존재하는 것이 필요치 않으며, 오히려 해당 처리의 바이러스 사멸 능력을 측정하는 것이다. 이와 유사하게, X-log10감소 (여기서, X는 3, 4, 5 또는 6임)라는 것은, 처리 후 표면에 존재하는 활성 바이러스의 양이 각각 처리 전에 존재하였던 바이러스 양의 1/1000, 1/10,000, 1/100,000 및 1/1,000,000임을 의미한다.
하기의 도면들은 본 출원의 제품, 장치 및 방법을 예시하는데 도움을 주기 위해 제공하지만, 다른 변형과 구성들도 가능하다. 본 도면들은 축척에 맞게 그려진 것은 아니며, 명확하게 보이기 위해서 일부 부품들의 크기를 크게하거나 작게하기도 하였다.
도 1a, 1b, 1c, 1d, 1e 및 1f는 다양한 DBD 시스템의 개략도이다.
도 2는 반응성 가스로 제품 또는 표면의 연속 처리를 위한 반응성 가스 처리 시스템의 개략도이다.
도 3은 반응성 가스로 제품 또는 표면의 뱃치 처리를 위한 반응성 가스 처리 시스템의 개략도이다.
도 4는 밀폐 공간을 갖는 장기 및/또는 표면의 처리를 위한 반응성 가스 처리 시스템의 개략도이다.
도 5는 이. 콜라이 대조군과 비교한, 다양한 데이터 세트들의 이. 콜라이 증식률에 대한 MS2 파지의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 6은 이. 콜라이 대조군과 비교한, 다양한 데이터 세트들의 이. 콜라이 증식률에 대한 MS2 파지의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 7은 이. 콜라이 대조군과 비교한, 다양한 데이터 세트들의 이. 콜라이 증식률에 대한 MS2 파지의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 8은 음성 대조군, 양성 대조군 및 RGS 처리된 지카 (Zika) 바이러스의 여과지 추출물에 노출시킨 후의 숙주 세포수를 나타낸 그래프이다.
도 9는 미처리 (양성 대조군, T=0) 및 RGS 처리된 지카 바이러스의 여과지 추출물에 노출된 Vero 세포들의 각 3개 웰의 현미경 사진 이미지 세트이다. 해당 사진의 점들은 지카 바이러스의 세포변성 효과로 인해 변형된 Vero 세포들이다.
도 10은 RGS를 이용한 박테리오파지 SBA 1781의 비활성화를 나타내는 그래프이다.
도 11은 미처리 (T=0) MS2 파지와 비교한, RGS에 1시간 노출 후 MS2 파지의 비활성화를 보여주는 그래프이다.
도 12는 미처리 (T=0) MS2 파지와 비교한, RGS에 3시간 노출 후 MS2 파지의 비활성화를 보여주는 그래프이다.
도 13은 노출 시간 동안 B. 아트로파에우스 (atrophaeus) 포자가 감소한 것을 나타내는 그래프이다.
도 14는 고유량 시스템 (오렌지색)과 표준 유량 시스템 (청색)의 경우에 노출 시간 동안 B. 아트로파에우스 포자가 감소한 것을 나타내는 그래프이다.
도 15는 고유량 시스템 (오렌지색)과 표준 유량 시스템 (청색)의 경우에 노출 시간 동안 B. 아트로파에우스 포자의 로그 감소를 나타내는 그래프이다.
도 16은 고유량 시스템 (오렌지색)과 표준 유량 시스템 (청색)의 경우에 노출 시간 동안 B. 아트로파에우스 포자의 계체군을 나타내는 그래프이다.
도 17은 공기 감소 (오렌지색)와 반응성 가스종 감소 (청색)의 경우에 노출 시간 동안 S. 엔테리카 (enterica) 세포의 감소를 나타내는 그래프이다.
도 18은 공기 감소 (오렌지색)와 반응성 가스종 감소 (청색)의 경우에 노출 시간 동안 S. 엔테리카 세포의 감소를 나타내는 그래프이다.
도 19는 다양한 초기 개체군들에 대한이. 콜라이 개체군의 로그 감소를 보여주는 그래프이다.
도 20은 최종 개체군에 대한 초기 개체군의 비율로서 다양한 초기 개체군들에 대한이. 콜라이 개체군의 감소를 나타내는 그래프이다.
도 21은 이. 콜라이 개체군 밀도 증가의 감소를 나타내는 그래프이다.
도 22는 이. 콜라이 개체군 밀도 증가의 로그 감소를 나타내는 그래프이다.
도 23은 셀 수 있는 실험 조건 범위 내에 과산화물 효과를 갖는 4개의 개체군의 경우에 있어서, 총 반응성 가스종 감소 및 잔류 과산화물에 의한 감소를 나타내는 그래프이다.
도 1a, 1b, 1c, 1d, 1e 및 1f는 다양한 DBD 시스템의 개략도이다.
도 2는 반응성 가스로 제품 또는 표면의 연속 처리를 위한 반응성 가스 처리 시스템의 개략도이다.
도 3은 반응성 가스로 제품 또는 표면의 뱃치 처리를 위한 반응성 가스 처리 시스템의 개략도이다.
도 4는 밀폐 공간을 갖는 장기 및/또는 표면의 처리를 위한 반응성 가스 처리 시스템의 개략도이다.
도 5는 이. 콜라이 대조군과 비교한, 다양한 데이터 세트들의 이. 콜라이 증식률에 대한 MS2 파지의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 6은 이. 콜라이 대조군과 비교한, 다양한 데이터 세트들의 이. 콜라이 증식률에 대한 MS2 파지의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 7은 이. 콜라이 대조군과 비교한, 다양한 데이터 세트들의 이. 콜라이 증식률에 대한 MS2 파지의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 8은 음성 대조군, 양성 대조군 및 RGS 처리된 지카 (Zika) 바이러스의 여과지 추출물에 노출시킨 후의 숙주 세포수를 나타낸 그래프이다.
도 9는 미처리 (양성 대조군, T=0) 및 RGS 처리된 지카 바이러스의 여과지 추출물에 노출된 Vero 세포들의 각 3개 웰의 현미경 사진 이미지 세트이다. 해당 사진의 점들은 지카 바이러스의 세포변성 효과로 인해 변형된 Vero 세포들이다.
도 10은 RGS를 이용한 박테리오파지 SBA 1781의 비활성화를 나타내는 그래프이다.
도 11은 미처리 (T=0) MS2 파지와 비교한, RGS에 1시간 노출 후 MS2 파지의 비활성화를 보여주는 그래프이다.
도 12는 미처리 (T=0) MS2 파지와 비교한, RGS에 3시간 노출 후 MS2 파지의 비활성화를 보여주는 그래프이다.
도 13은 노출 시간 동안 B. 아트로파에우스 (atrophaeus) 포자가 감소한 것을 나타내는 그래프이다.
도 14는 고유량 시스템 (오렌지색)과 표준 유량 시스템 (청색)의 경우에 노출 시간 동안 B. 아트로파에우스 포자가 감소한 것을 나타내는 그래프이다.
도 15는 고유량 시스템 (오렌지색)과 표준 유량 시스템 (청색)의 경우에 노출 시간 동안 B. 아트로파에우스 포자의 로그 감소를 나타내는 그래프이다.
도 16은 고유량 시스템 (오렌지색)과 표준 유량 시스템 (청색)의 경우에 노출 시간 동안 B. 아트로파에우스 포자의 계체군을 나타내는 그래프이다.
도 17은 공기 감소 (오렌지색)와 반응성 가스종 감소 (청색)의 경우에 노출 시간 동안 S. 엔테리카 (enterica) 세포의 감소를 나타내는 그래프이다.
도 18은 공기 감소 (오렌지색)와 반응성 가스종 감소 (청색)의 경우에 노출 시간 동안 S. 엔테리카 세포의 감소를 나타내는 그래프이다.
도 19는 다양한 초기 개체군들에 대한이. 콜라이 개체군의 로그 감소를 보여주는 그래프이다.
도 20은 최종 개체군에 대한 초기 개체군의 비율로서 다양한 초기 개체군들에 대한이. 콜라이 개체군의 감소를 나타내는 그래프이다.
도 21은 이. 콜라이 개체군 밀도 증가의 감소를 나타내는 그래프이다.
도 22는 이. 콜라이 개체군 밀도 증가의 로그 감소를 나타내는 그래프이다.
도 23은 셀 수 있는 실험 조건 범위 내에 과산화물 효과를 갖는 4개의 개체군의 경우에 있어서, 총 반응성 가스종 감소 및 잔류 과산화물에 의한 감소를 나타내는 그래프이다.
본 발명은 HVCP에 의해 생성된 반응성 가스를 사용한다. 반응성 가스는, 플라즈마가 생성되는 DBD 시스템으로부터 심지어 상당한 거리, 예컨대 3 내지 30 미터 (또는 10 내지 100 피트)로 이동되는 경우에도 표면을 소독할 수 있다. 또한, 반응성 가스는 바이러스를 무력화시킬 수 있다. 이러한 사실은 매우 놀라운 것인데, 그 이유는 패키지 내에 생성되는 HVCP와는 달리, 해당 제품은 HVCP에 직접 노출되지 않고, 해당 제품과 반응성 가스의 접촉 시간이, 예컨대 1초, 1분, 30분, 또는 1시간으로 제한되어 있기 때문이다. 바람직하게는, 플라즈마는 표면과 접촉하지 않는다. 또한, 반응성 가스는, HVCP가 생성되는 DBD 시스템으로부터 멀리 이동하기 때문에, 주변 가스로의 확산에 의해서, 그리고 주변 가스 및/또는 작동 가스와 혼합에 의해서도 희석된다. 반응성 가스는 DBD 시스템에서 멀리 이동하기 때문에, 더 큰 표면이 처리될 수 있다. 또한, 차량이나 방의 소독과 같은 대규모 소독도 수행될 수 있다. 또한, 반응성 가스의 효과는 오존 함량만으로 예상할 수 있는 것보다 더 클 것으로 기대된다.
미국 환경 보호청 (EPA)과 질병 통제 예방 센터 (CDC)는 바이러스들을 소독제에 대한 내성과 관련하여 순위를 매길 수 있음에 대해 공인하고 있다 (EPA, "Guidance to Registrants: Process for Making Claims Against Emerging Viral Pathogens Not on EPA-Registered Disinfectant Labels", published on August 19, 2016). 이러한 접근 방식에 의하면, 바이러스들은 3가지 하위군: 작은 비외피 (non-enveloped) 바이러스, 큰 비외피 바이러스 및 외피 바이러스로 세분된다. 계층 구조에 따르면, 소독제가 작은 비외피 바이러스를 사멸시킬 수 있는 경우라면, 이는 큰 비외피 바이러스와 모든 외피 바이러스를 사멸시킬 수 있어야 한다. 이와 유사하게, 큰 비외피 바이러스를 사멸시킬 수 있는 소독제는 모든 외피 바이러스를 죽일 수 있다. 본 출원의 반응성 가스는 실시예 1과 4에 나타낸 바와 같이 MS2 파지 바이러스를 사멸시킨다. MS2 파지는 작은 비외피 바이러스이다. 이 바이러스를 사멸시키는 것이 가장 어렵기 때문에, 반응성 가스는 다른 하위군의 임의의 바이러스도 사멸시킬 것으로 기대된다. 이러한 기대는 실시예 2와 3에 각각 보여진 바와 같이, 지카 바이러스 및 살모넬라 엔테리카 (Salmonella enterica) 박테리오파지의 사멸에 의해 입증된다. 마찬가지로, 코로나바이러스는 외피 바이러스로 분류되므로, 반응성 가스로 처리하기 전에 코로나바이러스가 존재했다면, 반응성 가스는 코로나바이러스를 사멸시켜 표면을 소독할 것으로 예상된다.
반응성 가스가 표면에 접촉하는 경우, 바이러스가 있다면 해당 표면을 소독하게 된다. 감소는 바이러스 활성에 있어서 적어도 2-log10 감소, 3-log10 감소, 4-log10 감소, 5-log10 감소, 또는 6-log10 감소일 수 있다. MS2 파지 플라크 분석 시험은 소독의 효과를 측정하는데 사용할 수 있다. 상기 시험은 관심대상 바이러스가 처리 전에 실제로 존재해야 하는 것이 필요하지 않으며, 해당 처리의 바이러스 사멸 능력을 측정하는 것이다. 바이러스 양의 검출은 ELISA 또는 현미경 측정과 같은 고전적인 분석 시험 기술을 사용하여 수행될 수도 있다. 활성 바이러스의 양을 더 감소시키기 위해 반응성 가스와의 접촉 시간을 증가시킬 수도 있다. 표면을 반응성 가스와 접촉시키는 것도 바이러스의 활동을 더 감소시키기 위해 반복할 수 있다.
바이러스는 DNA 바이러스 또는 RNA 바이러스일 수 있다. DNA 또는 RNA 바이러스는 단일 가닥 (ss), 이중 가닥 (ds), 선형 및/또는 원형으로 더 분류될 수 있다. 전체 바이러스 게놈은 1개의 핵산 분자 (단분자 게놈) 또는 수개의 핵산 세그먼트 (다분자 게놈)를 사용할 수 있다. 다른 유형의 게놈은 다른 복제 전략이 필요하다.
바이러스는 일반적인 바이러스 명칭 또는 바이러스에 의해 유발되는 질병으로 식별될 수 있다. 또한, 바이러스는 해당 바이러스가 유래한 바이러스 또는 해당 바이러스가 특유한 유기체에 의해 식별될 수도 있다. 본원에서 확인된 일반적인 바이러스 명칭들은, 유사한 특성을 갖거나 일반적인 바이러스 해당 명칭과 관련된 바이러스들과 유전적으로 연관된 다양한 바이러스 균주들을 지칭할 수 있다.
바이러스는 DNA 바이러스, 예컨대 하기 계열의 DNA 바이러스 유래의 바이러스일 수 있다: 아스파르바이러스과 (Asfarviridae) (예: 아프리카 돼지 열병 바이러스 (ASF)); 아데노바이러스과 (예: 아데노바이러스 및 전염성 개 간염 바이러스); 파포바바이러스과 (예: 유두종바이러스, 폴리오마바이러스과 및 유인원 액포형성 바이러스); 파르보바이러스과 (예: 파르보바이러스 B19 및 개 파르보바이러스); 헤르페스바이러스과 (단순포진 바이러스, 수두-대상포진 바이러스 (수두 바이러스라고도 함), 거대세포바이러스, 및 엡스타인-바 바이러스); 폭스바이러스과 (예: 천연두 바이러스, 소두 바이러스, 양두 바이러스, orf 바이러스, 원숭이 수두 바이러스 및 백시니아 바이러스); 아넬로바이러스과 (Anelloviridae) (예: 토크 테노 (Torque teno) 바이러스); 또는 플레올리포바이러스과 (Pleolipoviridae) (예: HHPV1, HRPV1, HGPV1 및 His2V).
바이러스는 RNA 바이러스, 예컨대 하기 계열의 RNA 바이러스 유래의 바이러스일 수 있다: 레오바이러스과 (Reoviridae) (예: 레오바이러스 및 로타바이러스 (로토바이러스라고도 함)); 피코르나바이러스과(예: 엔테로바이러스, 라이노바이러스, 헤파토바이러스, 카디오바이러스, 아프토바이러스, 폴리오바이러스, 파레코바이러스, 에르보바이러스, 코부바이러스, 테스코바이러스 및 콕사키); 칼리시바이러스과 (Caliciviridae) (예: 노워크 바이러스); 토가바이러스과 (Togaviridae) (예: 풍진 바이러스 및 알파바이러스); 아레나바이러스과 (예: 림프구성 맥락수막염 바이러스); 플라비바이러스과 (예: 뎅기 바이러스, C형 간염 바이러스, 황열병 바이러스 및 지카 바이러스); 오르쏘믹소바이러스과 (Orthomyxoviridae) (예: 인플루엔자 바이러스, 이사바이러스 및 토고토바이러스); 파라믹소바이러스과 (예: 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 우역 (Rinderpest) 바이러스 및 개 디스템퍼 (distemper) 바이러스); 부니아바이러스과 (Bunyaviridae) (예: 캘리포니아 뇌염 바이러스 및 한타바이러스); 랍도바이러스과 (예: 광견병 바이러스); 필로바이러스과 (예: 에볼라 바이러스 및 마르부르크 바이러스); 코로나바이러스과 (예: 코로나바이러스); 아스트로바이러스과 (예: 아스트로바이러스); 보르나바이러스과 (예: 보르나병 바이러스); 아르테리바이러스과 (Arteriviridae) (예: 아르테바이러스 및 말 동맥염 바이러스); 또는 헤페바이러스과 (Hepeviridae) (예: E형 간염 바이러스).
로타바이러스의 예로는 A, B, C, D, E, F, G, H, I 또는 J형 로타바이러스를 포함한다. 코로나바이러스의 예로는 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스 (MERS), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 (SARS) 및 COVID-19 바이러스 뿐만 아니라 감기를 유발하는 코로나바이러스를 포함한다. COVID-19를 유발하는 바이러스는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2)로도 알려져 있다. 아르테리바이러스의 예로는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV)를 들 수 있다.
인플루엔자 바이러스의 예로는 A형 인플루엔자 바이러스, B형 인플루엔자 바이러스 및 C형 인플루엔자 바이러스를 포함한다. 인플루엔자 바이러스 변이체는 흔히 해당 균주가 고유한 종 (숙주)이냐 또는 순응한 종 (숙주)이냐에 따라 명명된다. 예를 들어, 인플루엔자 바이러스는 조류 독감 (bird flu 또는 avian flu로도 알려짐), 돼지 독감, 인간 독감, 말 독감 및 개 독감으로 공지될 수 있다. A형 인플루엔자 바이러스 종은 헤마글루티닌, 즉 "H" 단백질 및 뉴라미니다제, 즉 "N" 단백질의 두 단백질 그룹의 조합에 의해 추가로 세분될 수 있다 ("Influenza Type A Viruses". Centers for Disease Control and Prevention. https://www.cdc.gov/flu/avianflu/influenza-a-virus-subtypes.htm. 2017년 4월 19일 마지막 검토, 2020년 3월 12일 방문). A형 인플루엔자 바이러스의 다른 혈청형의 예로는 H1N1, H1N2, H2N2, H3N1, H3N2, H3N8, H5N1, H5N2, H5N3, H5N8, H5N9, H7N1, H7N2, H7N3, H7N4, H7N7, H7N9, H9N2, H10N7을 포함한다.
바이러스는 레트로바이러스과 (예: 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)); 카울리모바이러스과 (Caulimoviridae) (예: 카울리모바이러스 및 카카오 가지팽창 바이러스); 또는 헤파드나바이러스과 (Hepadnaviridae) (예: B형 간염 바이러스)의 바이러스 계열의 역전사 바이러스일 수 있다.
바이러스는 제품이나 표면에 존재할 수 있거나, 또는 공기 중에 존재할 수도 있다. 반응성 가스는 에어로졸 액적 또는 더 큰 액적으로 공기 중에 존재하는 바이러스를 무력화시킬 수 있다. 반응성 가스는 인공 구조물의 내부 표면과 접촉할 수 있다. 인공 구조물은 비행기, 기차 또는 자동차와 같은 운송수단일 수 있다. 인공 구조물은 방이나 통로일 수 있다. 방은 병원이나 크루즈 선실의 방일 수 있다. 방은 호텔의 방(들)일 수 있다. 방은 사무실이나 회의 공간일 수 있다. 방은 극장이나 스포츠 경기장일 수 있다.
도 1a, 1b, 1c, 1d, 1e 및 1f는 반응성 가스를 생성하는 HVCP를 생성하는데 사용될 수 있는 다양한 DBD 시스템의 개략도이다. DBD 시스템은 교류를 발생시키는 접지를 갖는 고전압원(10), 제1 전극(20), 제2 전극(30) 및 개재 유전체(intervening dielectric)(40)를 포함한다. 하나 이상의 추가적인 개재 유전체(60)들이 제1 전극과 제2 전극 사이에 존재할 수도 있다. 일부 구성에서, 유전체는 제1 및/또는 제2 전극을 둘러쌀 수 있다. 일부 구성에서, 전압 파형과 관련하여 사용되는, 전극 상의 전하 축적은, DBD 시스템의 전력 소모를 추산하는데 사용될 수 있으며, 종래의 커패시터 또는 다른 센서(70)에 걸쳐 발생되는 전압을 측정함으로써 측정될 수 있다. 바람직하게는, 도 1a, 1b, 1c 및 1f에 도시된 바와 같이, HVCP와 반응성 가스가 생성되는 전극들 사이의 공간인 플리넘(50)이 존재한다. 그러나, HVCP와 반응성 가스는, 도 1d와 1e에 도시된 바와 같이, DBD 시스템에 깨끗한 플리넘이 존재하지 않는 경우라도 유전체 부근에서 제조될 수 있다. 일부 구성에서, 인접한 전극의 각각의 쌍 사이에 하나 이상의 개재 유전체를 가지며, 임의로 다수의 플리넘을 형성할 수 있는 다수의 전극, 예컨대 3 내지 21개의 전극, 11 내지 15개, 4 내지 8개의 전극, 또는 5 내지 7개의 전극들은, 도 1f (여기서, 프레임(80)은 각 플리넘(50)을 정의하도록 각각의 전극-유전체 어셈블리 (예컨대 40, 20 및 40)를 홀딩하는데 사용될 수 있음)에 도시된 바와 같이, 이용될 수 있고; 이러한 배열은 전극들 간에 적절한 거리를 유지하고 시스템을 컴팩트하게 유지하면서도, 다량의 HVCP를 생성하고, 그에 따라 반응성 가스도 생성할 수 있게 해준다. DBD 시스템의 구성은 고전류 아크의 형성을 방지하기 위해 전극들 사이에 형성되는 임의의 필라멘트 방전 (filamentary discharge)의 전류를 제한하는 결과를 가져온다. 바람직한 배열에서, 제1 전극은 유전체로 완전히 둘러싸이고, 제2 전극은 접지된다.
전극은 금속과 같은 임의의 전도성 재료로 형성될 수 있다. 유전체는 다양한 조성의 다수층을 포함하는 세라믹, 유리, 유기 재료 또는 플라스틱과 같은 임의의 절연 재료 (유전체 재료)로 형성될 수 있다. 유전체의 두께, 또는 유전체의 서로 다른 층들은 전극들 사이에 형성될 수 있는 임의의 필라멘트 방전의 전류를 제한하도록 선택되어야 한다. 유전체 층의 재료 선택은 반응성 가스 조성에 영향을 미칠 수 있다.
전극들이 평행한 경우에 인접한 전극들 사이의 거리, 또는 전극들이 평행하지 않은 경우에 인접한 전극들 사이의 최단 거리는, 바람직하게는 최대 30 cm (또는 12 인치), 바람직하게 적어도 0.5 cm (또는 0.25 인치), 예컨대 1 내지 10 cm, 또는 2.5 내지 6 cm (또는 1 내지 2 인치), 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9 cm이다. 고전압원은 최대 500 kV, 보다 바람직하게는 20 kV 내지 150 kV, 예컨대 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 100, 110, 120, 130 및 140 kV의 전압을 생성하고, 최대 5000 Hz, 보다 바람직하게 10 내지 100 Hz, 예컨대 50 내지 60 Hz의 주파수를 가진다. 시변 (즉, 펄스된) DC 전력도 사용할 수 있다. 주파수는 주로 편의를 위해 (예를 들어, 도시 전력망에서 50 Hz 또는 60 Hz AC 전원을 사용할 수 있음) 선택되지만, 전압은 HVCP 생산을 담보하기 위해 선택된다.
전극 시스템 및/또는 유전체 장벽 방전 시스템의 구조는 미국 특허 출원 16/442,380호에 설명된 시스템일 수 있다.
작동 가스 및 작동 가스 혼합물에 대한 서로 다른 선택은 HVCP에 의해 생성된 반응성 가스에 존재하는 화학종들에 영향을 미칠 것이다. HVCP를 제조하기 위해 이용될 수 있는 가스의 예로는, 산소 (O2); 질소 (N2); 수증기 (H2O); 헬륨 (He), 네온 (Ne), 아르곤 (Ar), 크립톤 (Kr), 제논 (Xe) 및 육플루오르화 황 (SF6)과 같은 불활성 및 비활성 가스; 수소 (H2); 이산화탄소 (CO2) 및 일산화탄소 (CO); 불소 (F2), 염소 (Cl2), 브롬 (Br2), 및 시아노겐 ((CN)2)과 같은 할로겐 및 유사할로겐; 황화수소 (H2S), 불화수소 (HF), 염화수소 (HCl), 및 황화카르보닐 (COS)과 같은 산성 가스; 암모니아 (NH3); 히드라진 (H4N2); 삼불화질소 (NF3); 이산화염소 (ClO2); 메탄 (CH4), 에탄 (C2H6) 및 아세틸렌 (H2C2)과 같은 탄화수소; 메탄올 (CH3OH) 및 에탄올 (C2H5OH)과 같은 알콜류; 및 이들의 혼합물을 포함한다. 바람직한 가스는 공기 및 MA65 (65% O2, 30% CO2 및 5% N2의 혼합물)를 포함한다. 가스 중 수증기의 양을 증가시키는 것을 이용하여 반응성 가스에 존재하는 오존을 감소시킬 수 있다. 헬륨과 같은 비활성 가스의 양을 증가시켜 HVCP를 생성하는데 필요한 전압을 감소시킬 수도 있다. HVCP를 제조하는데 사용되는 가스의 압력은 주위 압력 또는 대기압으로서 적절히 선택되지만, 10 내지 50000 Torr, 보다 바람직하게는 100 내지 1000 Torr, 예컨대 760 Torr (대기압)와 같은 다른 압력들도 사용될 수 있다.
반응성 가스는 다양한 반응성 및 여기 화학종들을 포함하고, 반응성 가스는 항상 해당 작동 가스에 존재하지 않는 적어도 하나 (일반적으로 하나 이상)의 반응성 및/또는 여기 화학종을 함유한다. 작동 가스가 산소 (예컨대, O2, CO2 및/또는 H2O)를 함유하는 경우, 오존을 형성할 수 있지만; 반응성 가스의 특성 및 반응은 오존의 존재만으로는 설명되지 않으며, 반응성 가스는 (반응성 가스에 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있는) 임의의 오존 이외에 다른 반응성 및 여기 화학종을 항상 함유하고 있다. 오존 이외에, 반응성 가스에 존재할 수 있는 다른 반응성 및 여기 화학종으로는, 일중항 산소 (1O2) 및 다른 여기 분자 화학종 (진동 여기된 분자와 전자 여기된 원자 및/또는 분자들 모두, 예컨대 O2, H2, N2, CO, CO2, H2O, He, Ne, Ar, Kr 및 Xe), 하이드록실 라디칼 (HOㆍ), 질소 산화물 (예컨대, N2O, NO, NO2, NO3, N2O3, N2O4 및 N2O5), 과산화수소 (H2O2), 하이드로퍼옥실 (HO2), HNOx 종 (예컨대, HNO4, HNO3 및 HNO), 원자 라디칼 (예컨대, O, F, Cl, N 및 H), 및 분자 라디칼 (예컨대, 산소, 질소, 불소 및 염소 중 하나 이상을 함유할 수도 있는 탄화수소 라디칼)을 포함한다. 바람직하게는, 반응성 가스는 (존재하거나 존재하지 않을 수 있는) 오존 및 NO2 (또는 N2O4) 이외에 적어도 하나의 추가의 반응성 및/또는 여기 화학종을 함유한다. HVCP와는 달리, 반응성 가스는 플라즈마가 아니라서 자유 전자를 포함하지 않는다. 바람직하게는, 반응성 가스는 상기 열거한 2-10 또는 3-8 또는 4-6개의 서로 다른 반응성 및/또는 여기 화학종을 비롯하여, 상기 열거한 적어도 2개의 서로 다른 반응성 및/또는 여기 화학종, 보다 바람직하게는 상기 열거한 적어도 3개의 서로 다른 반응성 및/또는 여기 화학종, 보다 더 바람직하게는 상기 열거한 적어도 4개의 서로 다른 반응성 및/또는 여기 화학종, 가장 바람직하게는 상기 열거한 적어도 5개의 서로 다른 반응성 및/또는 여기 화학종을 함유한다.
또한, 차후에 사용하기 위해 용기에 반응성 가스를 포획하여 보관할 수도 있다. 바람직하게는, 상기 보관된 반응성 가스는 생성된 후 24시간 내에, 보다 바람직하게는 12시간 내에, 가장 바람직하게는 6시간 내에, 보다 더 바람직하게는 3시간 내에 제품 또는 표면을 처리하는데 사용된다.
또한, 반응성 가스를 포획하여, 예컨대 냉각수로서 액체 질소를 사용하거나, 또는 냉각수로서 액체 헬륨을 사용하여, 매우 낮은 온도까지 냉각시켜 보관할 수도 있다. 이러한 저온에서 포획 및 보관하는 경우, 반응성 가스는 연장된 기간 동안, 예를 들어 1일 내지 6주, 그보다 더 오랜 기간 보관할 수도 있다. 다른 액화 또는 고체화 가스를 저장하는데 사용되는 용기, 예컨대 유리 또는 금속 용기를 사용할 수 있다.
반응성 가스 처리 시스템은 DBD 시스템 또는 저장된 반응성 가스 및 처리 챔버를 포함한다. 또한, 반응성 가스 처리 시스템은, 반응성 가스를 (HVCP를 생산하고, 결과적으로 반응성 가스를 생산하는) DBD 시스템으로부터, 또는 반응성 가스를 저장한 용기로부터 처리 챔버 내로 또는 처리 챔버 도처로 이동시키기 위한 장치, 메커니즘 또는 구성을 포함하는데; 이는 DBD 시스템과 치료 챔버 간의 유체 연결일 수 있다. 바람직하게는, 처리 챔버는 밀봉되지 않으며; 이러한 밀봉되지 않은 챔버는 가스 배출구가 있는 처리 챔버를 포함한다. 바람직하게는, 처리 챔버는 적어도 28 리터 (또는 1 세제곱 피트)의 부피, 보다 바람직하게는 적어도 1 세제곱 미터, 보다 더 바람직하게는 적어도 8 세제곱 미터의 부피를 갖는다. 처리 챔버의 예로는 방, 통 (bin), 곡물 건조기, 사일로, 탱크 및 선적 컨테이너를 포함한다.
반응성 가스 시스템은 (저장된 반응성 가스로부터, 또는 DBD 시스템을 이용하여 HVCP를 발생시킴으로써) 반응성 가스를 공급하여 제품 및/또는 표면을 처리하고, 처리 챔버 내로 또는 처리 챔버 도처로 상기 반응성 가스를 분배하는 방법을 수행하는데 사용될 수 있다. 반응성 가스를 이동시키는 장치, 메커니즘 또는 구성의 예로는 대류, 가스 통로 또는 가스 라인, 팬, 및 유동하거나 가압된 작동 가스를 DBD 시스템에 공급하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 반응성 가스에 의해 처리된 제품 또는 표면은, 해당 제품 또는 표면을 가열하지 않는 것과 같이, 40℃ 초과로, 보다 바람직하게는 20℃ 이하로, 보다 더 바람직하게는 10℃ 이하로, 가장 바람직하게는 5℃ 이하로, 상기 처리 방법에 의해 가열되지 않는다 (즉, 제품 또는 표면의 온도가 증가되지 않는다). 반응성 가스를 이용한 처리는 비열 처리 방식이다. 바람직하게는, 제품 또는 표면은 상기 방법 동안 HVCP에 의해 생성된 방사선 (예컨대, UV 광)에 노출되지 않는다. 선택적으로, 공기, 작동 가스, 또는 다른 가스 (예: 비활성 가스 또는 질소)를 사용하여 반응성 가스를 처리 챔버 밖으로 플러싱하거나, 또는 처리 챔버를 진공처리할 수도 있다. 이 방법은 선택적으로 1, 2, 3회 또는 그 이상 반복하여, 제품 또는 표면에 다수회의 처리를 제공할 수도 있다. 선택적으로, 제품은 반응성 가스로 처리된 후 용기에 밀봉되거나 냉장처리될 수도 있다. 바람직하게는, 처리될 제품은, 처리하는 동안 밀봉되거나 실질적으로 밀봉된 용기, 예컨대 최대 10 갤런 또는 최대 6 갤런의 부피를 갖는 용기에 담기지 않는다. 바람직하게는, HVCP는 밀봉된 용기, 예컨대 최대 10 갤런 또는 최대 6 갤런의 부피를 갖는 용기 내부에서 생성되지 않는다.
HVCP에 의해 생성된 반응성 가스는 (HVCP에 대한 제품 또는 표면의 직접적 노출을 피하기 위해) 확산 또는 가스 전달에 의해 HVCP 제조 현장으로부터 멀리 이동된다. 바람직하게는, 플라즈마와 처리될 제품 또는 표면 사이의 거리는, 적어도 5 cm, 예컨대 적어도 10 cm, 적어도 50 cm, 및 적어도 1 미터 (또는 3.28 피트)이고, 보다 바람직하게는 적어도 3 미터, 예를 들어 3 내지 300 미터, 예컨대 5, 10, 20, 30, 40 및 50 미터의 거리이다. 대부분의 구성에서, 반응성 가스는 처리할 제품 또는 표면과 접촉하는 동안에 흐르도록 하지만, 반응성 가스를 생성하고, 이를 해당 제품 또는 표면을 처리하기 위해 현장으로 이동시키며, 일정 기간 동안 처리 위치에 해당 가스를 가두어 두는 것도 가능하다. 반응성 가스를 제품 또는 표면과의 접촉 위치로 이송하기 위한 유속의 예로는 10 내지 3000 미터/분, 30 내지 2500 미터/분, 및 1000 내지 2000 미터/분, 예컨대 50, 100, 200, 300, 400, 500, 750 및 1500 미터/분을 포함한다. 반응성 가스를 제품 또는 표면에 적어도 1초, 예컨대 적어도 2초, 적어도 10초, 적어도 30초, 적어도 1분, 적어도 10분, 적어도 30분, 적어도 35분, 적어도 1시간, 적어도 6시간 또는 적어도 12시간 동안 접촉시킨다. 접촉 시간의 예로는 1초 내지 12시간, 10초 내지 1시간, 1분 내지 35분, 예컨대 5초, 15초, 2분, 5분, 20분, 35분, 40분, 2시간, 3시간, 4시간 및 5시간을 포함한다.
도 2는 반응성 가스로 제품 또는 표면을 연속적으로 처리하기 위한 반응성 가스 처리 시스템(200)의 개략도이다. 상기 시스템은 반응성 가스(210)를 제조하기 위해 HVCP를 발생시키기 위한 DBD 시스템(206)을 포함한다. 반응성 가스는 가스 통로(208)를 따라 처리 챔버(216)로 흐른 후, 가스 배출구(222) 밖으로 나간다. 처리될 제품(214), 또는 처리될 표면을 갖는 제품(214)은, 반응성 가스와 접촉된 후에 해당 제품을 보유하기 위한 수납통(220)으로 처리 챔버를 통해 제품을 이동시키는 컨베이어(218) 상에 처리 챔버 내로 공급될 때, 호퍼 (hopper)(212)에 저장될 수도 있다. 또한, HVCP가 형성되는 작동 가스를 제공하는 가스 공급원(202), 예컨대 가스 탱크, 및 작동 가스를 DBD 시스템에 공급하는 가스 라인(204)도 도시되어 있다. 반응성 가스는 시스템을 통해 흐를 때 추가의 작동 가스로 희석될 수도 있다. DBD 시스템으로부터 처리 챔버로의 반응 가스 수송은, (작동 가스의 도입으로 인한 고압의) DBD 시스템과 (가스 배출구로 인한 저압의) 처리 챔버 간의 압력차를 이용한다. 선택적으로, 가스 배출구는 제2 가스 라인에 의해 DBD 시스템에 다시 연결되어, 작업 가스 및 임의의 잔류 반응성 가스를 재활용시킬 수 있다. 선택적으로, DBD 시스템은 처리 챔버 내에 위치하여, 가스 통로의 필요성을 회피할 수 있다. 변형 예에서, 작동 가스는 공기일 수 있고, 반응성 가스의 수송은 가스 통로에 위치한 팬 (반응성 가스를 처리 챔버 내로 불어넣음) 또는 DBD 시스템의 후면에 위치한 팬 (DBD 시스템을 통해 공기를 불어넣음)에 의해 유도될 수 있다. 선택적으로, 컨베이어는 반응성 가스가 제품의 모든 표면 상에 접촉하도록 하기 위해 스크린 상에 해당 제품을 운송할 수 있다. 또한, 제품은 처리 챔버를 통해 복수의 컨베이어 상에서 이동될 수 있고, 이때 상기 제품은 제1 컨베이어에서 제2 컨베이어로 이동할 때 방향을 바꾸기도 하여, 이는 반응성 가스가 제품의 모든 표면들과 접촉하도록 해준다. 또 다른 변형 예에서, 저장된 반응성 가스를 가스 공급원으로 사용하고, 상기 반응성 가스를 처리 챔버로 직접 이동시킴으로써, DBD 시스템을 제거할 수도 있다. 다양한 서로 다른 컨베이어, 예컨대 투과성 벨트 컨베이어, 스크류, 터널 건조기, 곡물 건조기, 유동층 건조기 또는 원통형 건조기를 사용할 수 있다.
도 3은 반응성 가스로 제품 또는 표면을 뱃치 처리하기 위한 반응성 가스 처리 시스템(300)의 개략도이다. 상기 시스템은 반응성 가스를 제조하기 위해 HVCP를 발생시키기 위한 DBD 시스템(306)을 포함한다. 반응성 가스는 가스 통로(308 및 312)를 따라 처리 챔버(302)로 흐른 후, 가스 통로(316)를 통해, 선택적 제품 회수 트랩(318)을 통해, 가스 통로(320)를 따라 나가, 가스 배출구(324)를 통해 밖으로 흘러 나간다. 반응성 가스 및 작동 가스의 일부 또는 전부는 선택적 가스 통로 (304)를 통해 DBD 시스템으로 다시 재순환될 수도 있다. 반응성 가스 및 작동 가스는 팬(310 및 322)에 의해서 시스템을 통해 나아갈 수 있다. 처리될 제품(314) 또는 처리될 표면을 갖는 제품(314)은 처리 챔버 내에 존재하고; 도시된 바와 같이, 제품의 표면 전부의 처리가 가능하도록 제품 및 반응성 가스로부터 유동층을 형성하기 위해 처리 챔버의 하부를 통해 반응성 가스를 공급한다. 제품 회수 트랩을 사용하여, 처리 챔버를 빠져나와 가스 통로로 들어가는 임의의 제품을 포획하여 이를 다시 처리 챔버로 되돌릴 수도 있다. 처리 챔버는 도시된 시스템 내의 사일로일 수 있고; 다른 처리 챔버들로는 유동층, 기계적 유동층 및 통을 포함한다. 반응성 가스는 시스템을 통해 흐를 때 추가의 작동 가스로 희석될 수도 있다. 도시된 바와 같이, 작동 가스는 공기일 수 있지만, 선택적으로 가스 통로(304)는 작동 가스를 DBD 시스템에 공급하기 위한 가스 공급원에 연결될 수도 있다. 또 다른 변형 예에서, DBD 시스템을 제거하고 저장된 반응성 가스로 대체할 수도 있다.
제품의 예로는 신선한 식품 (예컨대, 과일, 채소, 곡식, 콩, 씨앗, 고기, 유제품, 달걀 및 향료 또는 조미료), 해산물 (생선 및 어패류, 및 그 부속물), 제조 식품, 냉동 식품, 포장 전 가공 식품 (물, 음료, 이유식, 액상란, 과일 쥬스, 밀가루, 오일, 영양 제품, 비타민, 영양보조제 및 구운 음식), (포장 외부의 처리를 위한) 포장 제품, 동물 먹이, 캔, 병, 플라스틱 용기, 식품 용기, 취사도구 및 가정용품; 알약, 캡슐, 단위 제형 및 분말; 의료 장치 및 의료 기기 (사용 전과 후 모두); 실험실 안경 및 플라스틱제 기구; 세라믹 제품, 금속 제품 및 가죽 및 목재 제품을 포함한다.
반응성 가스 처리로 소독이 되지 않을 경우에는 연속적인 처리를 수행할 수도 있다. 예를 들어, 1 내지 10회 처리를 수행할 수 있거나, 또는 2 내지 9회의 처리, 예컨대 3, 4, 5, 6, 7 또는 8회 처리를 수행할 수 있다. 이와 마찬가지로, 치료 기간도 연장될 수 있다.
도 4는 방, 선적 컨테이너, 트레일러 또는 냉장 트럭과 같이, 밀폐 공간이 있는 장비 및/또는 표면을 처리하기 위한 반응성 가스 처리 시스템의 개략도이다. 여기서 밀폐된 공간인 처리 챔버(400) 내에는, 반응성 가스(408)를 제조하기 위해 HVCP를 생성하기 위한 DBD 시스템(406)이 있다. 팬(410)은 밀폐 공간 전체에 반응성 가스를 분배하는데 사용된다. 또한, 반응성 가스로 처리될, 수술대와 같은 선택적 표면(412) 및/또는 의료 장비 (예컨대, 수술 장비, 마스크, 인공 호흡기 및 활력 징후 모니터)와 같은 선택적 장비(414), 밀폐 공간의 내부 표면 또는 벽을 포함하는, 처리될 제품 또는 표면도 도시되어 있다. 선택적으로, 지지대(402)를 사용하여 DBD 시스템을 밀폐 공간의 상부 또는 측면에 장착하거나, 또는 DBD 시스템을 밀폐 공간의 바닥에 배치할 수도 있다. 선택적으로, 작동 가스 공급은 가스 공급에 연결된 가스 라인(404)에 의해 공급될 수 있다 (도시하지 않음). 다르게는, 상기 밀폐 공간을 작동 가스로 채울 수도 있다. 또 다른 구성에서, DBD 시스템은 저장된 반응성 가스로 대체될 수도 있다.
실시예
하기의 실시예들은, HVCP가 반응성 가스를 제조하는데 사용되었던 경우, 해당 반응성 가스의 효과와 특성들을 보여주는 시험 시스템이다. 통상적인 시스템에서, 상당량의 시판 제품을 처리하기 위해서는 규모가 커질 것이다. 모든 HVCP는 60 Hz 전력을 사용하여 생산하였다.
실시예 1: 바이러스 활성 및 비활성화에 대한 반응성 가스의 영향: 항바이러스제로서의 반응성 가스 효과를 스크리닝하기 위한 MS2 박테리오파지 모델의 사용
본 실시예는 바이러스를 사멸시키는 효과를 위해 MS2 박테리오파지에서 21 피트 (640 cm) 이동시킨 반응성 가스를 사용하는 것에 대하여 설명한다. MS2 박테리오파지는 에쉐리키아 콜라이 (이. 콜라이) 및 엔테로박테리아과의 다른 박테리아 구성원을 감염시키는 RNA 바이러스이다. 대부분의 인간 바이러스 병원체들은 RNA 바이러스이기 때문에, MS2 박테리오파지 (인간이 아닌 병원체)를 바이러스 비활성화를 위한 모델 시스템으로 선택하였다. MS2 박테리오파지는 인간 바이러스에 일반적으로 사용되는 모델이다 (Kuzmanovic, D.A., et al., "Bacteriophage MS2: Molecular Weight and Spatial Distribution of the Protein and RNA Components by Small-Angle Neutron Scattering and Virus Counting", Structure, Vol. 11, 1339-1348 (2003)).
숙주 박테리아 배양물의 증식:
본 연구에 사용된 MS2 박테리오파지 숙주 박테리아는 에쉐리키아 콜라이 (이. 콜라이, 균주 K-12, ATCC 15597)이었다. 원래 바이알에 들어 있는 이. 콜라이 (ATCC 15597)는 미국 세포 균주 은행 (ATCC) (미국 버지니아주 마나싸스 소재)에서 구입하여, 1 ml의 신선한 액체 배지 (탈이온수 중 1% 트립톤, 0.1% 효모 추출물 및 0.8% NaCl)를 첨가하여 재구성하였다. 상기 재구성한 배양액 (100 ㎕)을 바이알에서 꺼내, 이를 사용하여 30 ml의 동일한 액체 배지를 배양 플라스크에 접종하고 이를 37℃로 열 항온배양기 중에서 밤새 성장시켰다. 다음으로, 생성된 이. 콜라이 배양물을 MS2 박테리오파지의 증식 및 스크리닝 분석에 사용하였다.
MS2 박테리오파지 증식
박테리오파지 MS2 (ATCC 15597-B1)는 소프트/탑-아가 오버레이를 사용하지 않고 ATCC 절차에 따라 박테리아 숙주 세포인 이. 콜라이 (균주 K-12, ATCC 15597)에서 증식시켰다. 숙주 박테리아 배양 세포를 상술한 바와 같이 37℃의 액체 배지 중에서 밤새 성장시켰다. 그 후, 1.0 ml의 숙주 박테리아 세포 현탁액을 아가 플레이트의 표면에 첨가하고, 가볍게 기울여 전체 표면이 숙주 박테리아 세포로 덮힐 수 있도록 하였다. 다음으로, 초과량의 액체를 아가 플레이트로부터 흡인한 후 플레이트를 건조시켰다. 액체 배지 중 MS2 파지 현탁액의 다양한 희석액을 아가 플레이트의 표면에 스폿팅하여 37℃로 밤새 항온배양하였다. 밤새 증식시킨 후, 5 ml의 SM 완충액을 각각의 아가 플레이트에 첨가하고 주기적으로 부드럽게 흔들면서 4℃에서 3시간 동안 보관하였다. SM 완충 현탁액을 수집하여 50 ml의 폴리프로필렌 튜브로 옮기고, 새로운 SM 완충액 (플레이트당 5 ml)을 각 플레이트에 첨가한 후, 주기적으로 부드럽게 흔들면서 4℃에서 15분간 추가로 항온배양하였다. 완충액을 수집하여 이전 완충액과 함께 50 ml 튜브에 모은 뒤에 플레이트들을 버렸다. 상기 모은 SM 완충액-MS2 파지 현탁액을 4℃에서 15분간 5000×g로 원심분리하여, 세포 잔해물과 및 아가 조각들을 침전시키고, 상청액을 수집하였다. 생성된 상청액을 0.22 μM Millipore 필터에 통과시켜 숙주 박테리아 세포들을 제거하고, 회수된 MS2 파지가 포함된 여과액을 실험에서 사용하기 위해 4℃에서 보관하였다.
MS2 파지의 반응성 가스 비활성화
반응성 가스로 MS2 바이러스를 비활성화시키기 위해, 1 ml의 여과된 MS2 파지 상청액을 General Electric Company (GE Healthcare Life Sciences, 팬실베니아주 피츠버그 소재)에서 구입한 원형 와트만 (Whatman) 여과지 (직경 90 mm)에 스폿팅하였다. 그 다음, 상기 여과지를 증발 건조시킨 후, 76 kV의 전압에서 DBD 시스템을 사용하여 생성된, 21 피트 (640 cm) 이동시킨 반응성 가스에 30-90분간 노출시켰다. 플라즈마를 생성하는 장치의 전극 갭은 1.5 인치였다. 반응성 가스 처리 후, 여과지를 15 ml의 멸균 튜브 내로 잘게 썰어 넣고, 튜브당 5 ml의 SM 완충액을 사용한 추출을 통해 슬라이스 여과지 조각들로부터 MS2 바이러스를 회수하였다. 여과지 추출물의 바이러스 활성은, 투명한 96-웰 평탄 바닥 플레이트 (Midwest Scientific (MidSci)으로부터 구입, 미주리주 세인트 루이스 소재)와 숙주 박테리아 배양물 (이. 콜라이)을 사용하여 고속대용량 스크리닝으로 측정하였다. 간략히 설명하면, 밤새 증식시킨 이. 콜라이 배양물을 영양 액체 배지중에서 현탁액 1 ml당 1000개의 세포의 세포 밀도로 희석한 후; 96-웰 플레이트에 분취하였다 (275 ㎕/웰). 그 직후에, MS2 파지 여과지 추출물 25 ㎕를 첨가하였다. 이후, 접종된 96-웰 플레이트를 37℃에서 밤새 항온배양하고, 이. 콜라이 증식 역학을 24시간 동안 밤새 모니터링하였다. 24시간이 끝나갈 즈음, 660 nm에서 광학 밀도 (OD) 판독치를 취하여 반응성 가스로 비활성화된 MS2 바이러스에 의한 박테리아 성장 역전을 계산하는데 사용하였다. 음성 (액체 배지 단독) 및 양성 (박테리아 배양물 단독) 대조군들도 동일한 플레이트에서 실행하여, MS2 파지에 의한 박테리아 성장 억제를 계산하는데 번갈아 사용하였다. 반응성 가스로 처리되지 않은 MS2 파지와 반응성 가스로 처리된 MS2 파지를 모두 양성 대조군 웰과 비교하여, 플라즈마 처리된 모든 바이러스들에 대해서 이. 콜라이 증식율을 계산하였다.
(반응성 가스 미처리된) 대조군 여과지 추출물 및 반응성 가스에 노출된 MS2 파지 여과지 추출물로부터 회수된 MS2 파지에 의한 박테리아 증식 억제율은, 이들의 각 박테리아 성장을 양성 대조군 웰 (MS2 파지 노출이 없는 웰)의 박테리아 성장과 비교하여 측정하였다. 본 연구의 결과를 아래에 설명한다.
결과:
여기에 제시된 표 형식의 데이터는 서로 다른 날짜에 수행된 2개의 독립적인 실험으로부터 나온 것이다. 이러한 결과에 의해 입증되는 바와 같이, MS2 파지가 반응성 가스에 노출되면, 연구된 모든 노출 시간에서 바이러스가 현저히 비활성화되고 박테리아 숙주인 이. 콜라이에 대한 용균 활성도 역전되었다. 도 5, 6 및 7의 그래프에 도시된 바와 같이, 미처리된 MS2 파지는 박테리아 성장을 50%까지 감소시켰다. 반응성 가스에 바이러스를 각각 30분, 60분 및 90분간 노출시키면, 해당 바이러스가 반응성 가스에 노출되는 시간에 비례하여 선형 형태로 이러한 성장 억제가 역전되었다. 이는 MS2 파지가 반응성 가스에 의해 현저하게 감소되거나 비활성화되어서, 숙주 박테리아인 이. 콜라이가 정상적으로 성장할 수 있게 해주었음을 시사하는 것이다 (바이러스에 의해 용균되지 않음). 실험 1(a)에서, 데이터는 24시간 종료 시점에서 얻었다.
1(a). 실험 1
MS2-음성, MS2-양성 및 MS2-RGS 처리에서의 이. 콜라이 (숙주 세포) 수. 실험 1 결과.
2(a). 실험 2
MS2-음성, MS2-양성 및 MS2-RGS 처리에서의 이. 콜라이 (숙주 세포) 수. 실험 2 결과.
실시예 1의 숙주 박테리아 및 MS2 파지를 위한 배지와 시약
에쉐리키아 배지 제조:
(I) 아가 플레이트
부피가 1 리터인 배지의 경우 950 ml의 탈이온수를 첨가하거나, 부피가 500 ml인 배지의 경우 475 ml의 탈이온수를 첨가하였다. 배지를 121℃에서 가압멸균하고 무균상태로 하고, 가압멸균후 용액 B를 배지에 첨가하고 냉각시켰다 (즉, 1리터 부피의 경우 50 ml, 또는 500 ml 부피의 경우 25 ml). 배지를 고형화하기 전에 100 mm 페트리 디쉬에 부었다 (플레이트당 10 ml). 아가 플레이트들은 4℃에서 보관하여 필요에 따라 사용하였다.
(II) 용액 B: 50 ml 또는 500 ml
용액 B는 ATCC 권고 사항에 따라 제조하였다:
생성된 용액을 0.22 μM 필터를 통해 여과시켜 멸균하였다.
(III) 영양 액체 배지
아가 플레이트 배지에서와 같이, 액체 배지 성분들의 무게를 잰 후; 1 리터 또는 500 ml의 배지의 경우 950 ml 또는 475 ml의 탈이온수를 첨가하였다. 상기 액체 배지를 121℃에서 가압멸균하고, 가압멸균 및 냉각 후에 무균 상태로 용액 B를 첨가하였다 (1 리터 부피의 액체 배지 경우 50 ml, 또는 500 ml 액체 배지의 경우 25 ml). 액체 배지를 멸균 유리 플라스크에 분취하여 차후 사용을 위해 실온에서 보관하였다.
(IV) 탑 아가 영양분
소프트/탑 아가는 플레이트 아가 배지와 동일한 방식으로 제조하였다. 아가 양의 절반을 탑 아가 배지 (통상적으로 아가 플레이트 배지에는 15 g의 아가 (1.5% w/v) 및 탑 아가 5 내지 7.5 g의 아가 (0.5 내지 0.75% w/v)가 포함됨)에 무게를 두었다. 가압멸균, 냉각 및 용액 B 첨가 후에, 소프트 배지를 멸균 유리 튜브에 분취하여 (튜브당 4 ml) 필요에 따라 차후 사용을 위해 실온에 보관하였다.
(V) MS2 파지 현탁 완충액 (SM 완충액): SM 완충액 (1 리터)
실시예 2: 지카 바이러스 (ZIKV)를 이용한 항바이러스제로서의 반응성 가스 (RGS)의 효과 평가.
본 실시예는 바이러스를 사멸시키는 효과를 위해 지카 바이러스에서 21 피트 (640 cm) 이동시킨 반응성 가스를 사용하는 것에 대하여 설명한다. 본 연구에서는, 지카 바이러스 감염력을 비활성화시키는데 있어서 RGS의 효과를 알아보기 위해 노력하였다. 이 바이러스는 소두증과 같은 선천적 기형을 일으키는 원인이 되는 새로운 글로벌 병원체들 중 하나이다. 대부분의 새로운 부류의 바이러스들과 마찬가지로, 지카 바이러스도 승인된 치료법이나 백신이 없어서, 바이러스 활성에 대한 억제 효과가 있는 항바이러스제가 그 감염을 예방하는 유용한 도구가 될 것이다. 본 예비적 연구에서, 우리는 RGS가 지카 바이러스 비활성화를 위한 항바이러스제로 적절한지의 여부를 시험하였다.
재료 및 방법
숙주 세포, 지카 바이러스 및 시약들
지카 바이러스 증식 및 감염에 사용된 Vero 세포 (ATCC CCL-81)는 미국 세포 균주 은행 (ATCC, 버니지아주 마나싸스 소재)에서 구입하였다. 지카 바이러스 (ATCC VR-1843 PQ, 균주 PRVABC59)도 ATCC에서 구입하였다. 세포들을 높은 글루코스 함량의 둘베코의 변형된 이글 배지 (DMEM, ATCC에서 입수) 중에서 성장시키고, 10% 열-불활성화된 소태아혈청 (FBS), 4 mM의 L-글루타민, 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신, 100 단위/ml (페니실린), 1 mM의 피루브산나트륨 및 비필수 아미노산을 보충하였다. 세포들을 배양하여 5% CO2 가습 항온배양기에서 37℃로 유지하였다. 모든 조직 배양 등급 시약들과 화학 물질들은 ATCC 또는 Millipore-Sigma (미주리주 세인트 루이스 소재) 및 Thermo Fisher Scientific (매사추세츠주 월섬 소재)에서 입수하였다.
지카 바이러스의 증식
본 연구에 사용된 지카 바이러스 (균주 PR VABC59)는, FBS가 없는 3 ml의 DMEM 배지 중에서 T75 조직 배양 플라스크의 70% 전면배양시킨 Vero 세포를 각각 0.01 및 0.025의 감염 다중도로 2시간 동안 접종함으로써 증식시켰다. 그런 다음, 10% FBS가 포함된 새로운 DMEM 배지를 20 ml 첨가하고 세포들을 5% CO2 가습 챔버에서 37℃로 항온배양하였다. 지카 바이러스에 의해 사멸된 숙주 세포에 대한 척도로 사용되는 세포변성 효과 (CPE)를 광학 현미경 관찰에 의해 모니터링하였다. Vero 세포들이 CPE로 인해 70% 이상의 세포 사멸 또는 박리를 보이는 경우에 바이러스를 수확하였다. 사용한 배지를 제거하고 3000 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 생성된 상청액을 0.22 μM Millipore 필터에 통과시켜 숙주 세포 잔류물과 임의의 오염성 박테리아를 제거하였다. 지카 바이러스를 함유하고 있는 여과액을 분취하여 차후 실험을 위해 -20℃로 보관하였다.
지카 바이러스의 RGS 비활성화
지카 바이러스 (ZIKV PRVABC 59)의 RGS 비활성화는 확립된 프로토콜(Muller et al, 2016)에 따라 수행하였다. 간락히 설명하면, 와트만 원판 여과지 (직경 90mm)에 600 ㎕의 지카 바이러스 사용 배지를 접종하고 즉시 RGS에 노출시켰다. 대조군 실험을 위한 여과지는 바이러스 증식에 사용된 둘베코의 변형된 이글 배지 (DMEM) 중의 숙주 세포로만 접종하였다 (음성 대조군). 접종시킨 두 세트의 여과지를 80 kV에서 45분과 90분간 RGS로 처리(시험)한 후 (표 4), 멸균 인산염 완충 식염수 (PBS, 1X)로 바이러스를 추출하였다. RGS를 처리하지 않은, 접종된 여과지 한 세트를 양성 대조군으로 사용하고 즉시 바이러스 추출을 위한 처리를 하였다. 실험은 2회 수행하였다. 그래서, 음성 대조군 여과지 2세트 (DMEM만 해당), 미처리된 지카 접종 여과지 2세트 (양성 대조군; T=0분), RGS로 45분간 처리한 지카 접종 여과지 2세트 (시험, T=45분) 및 RGS로 90분간 처리한 지카 접종 여과지 2세트 (시험, T=90분)를 준비하였다.
미처리 (양성 대조군) 및 RGS 처리 (시험) 여과지로부터 지카 바이러스의 추출
미처리 (T=0) 및 RGS로 처리된 여과지 (T=45 및 T=90분)를 PBS (1X)로 개별적으로 추출하였다. 노출 전후의 여과지들을 작은 조각으로 절단하여 추출을 위한 50 ml의 멸균 원뿔형 튜브로 옮겼다. 바이러스 추출은 확립된 표준 프로토콜 (Butot et al, 2007)에 따라 수행하였다. 간략히 설명하면, 10 ml의 멸균 PBS를 절단된 여과지들을 포함하는 각 50 ml의 원뿔형 튜브에 첨가하여 강하게 볼텍싱시켰다. 튜브들을 매 3분마다 간헐적으로 볼텍싱하면서 실온 (RT)에서 15분간 항온배양하였다. 그런 다음, 튜브들을 5000 rpm으로 5분간 원심분리하여 여과지 부스러기들을 펠렛화하고, 생성된 상청액을 0.22 마이크론 필터를 통해 여과하였다. 3-[4,5-디메틸-2-티아오졸릴]-2-5-디페닐-2H-테트라졸륨 브로마이드 (MTT) 세포독성 생물분석을 사용하는 지카 바이러스 활성 분석을 위해 상기 여과액을 4℃에서 보관하였다.
MTT 생물분석 또는 (3-[4,5-디메틸-2-티아졸릴]-2-5-디페닐-2H-테트라졸륨 브로마이드 세포독성 생물분석
MTT 분석은 세포 대사 활성을 평가하기 위한 비색 검정이다. NAD(P)H 의존성 세포 산화환원 효소는, 정의된 조건 하에, 존재하는 생존 세포수를 반영할 수 있다. 이러한 효소들은 테트라졸륨 염료인 MTT 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드를 보라색인 불용성 포르마잔으로 환원시킬 수 있다.
미처리 및 RGS로 처리된 지카 바이러스 여과액을, 200 ㎕의 DMEM의 최종 부피 중에서 Vero 세포를 포함하는 96-웰 조직 배양 플레이트에 웰당 6×103 개 세포의 분주 밀도로 플레이팅하였다. T=0 여과액을 갖는 웰이 70% 세포 사멸 (CPE)을 보일 때까지, 배양물들을 일정한 5% CO2가 있는 가습 챔버 중에서 37℃로 항온배양하였다. 그런 다음, 20 ㎕의 멸균 MTT (PBS 중 5 mg/ml) 용액을 각 웰에 첨가하고, 플레이트들을 37℃로 3시간 동안 추가로 항온배양하였다. 사용된 DMEM 배지를 쏟아 버리고 플레이트를 건조시켜 얼룩이 남게 하였다. 이후, 부착된 Vero 세포들로부터 생성된 포르마잔 결정을 디메틸 설폭사이드 (DMSO)와 에탄올의 1:2 혼합물 100 ㎕를 첨가하여 용해시켰다. 생성된 포르마잔 결정 용액의 흡수는 490 nm에서 그의 광학 밀도 (OD)를 판독하여 측정하였고, 그의 650 nm 판독치로 보정하였다 (Molecular Device Instruments의 Spectra Max 340 PC 플레이트 판독기). 음성 지카 바이러스 대조군 (바이러스가 없는 웰)과 지카 바이러스가 있는 (여과지 여과액)에 대한 MTT 용액 흡수 판독치들로부터, T=45 및 T=90분간의 RGS 처리의 경우의 숙주 세포 성장을 산출하였다. 그 결과를 하기에 요약하였다.
결과 및 논의
지카 바이러스 연구 결과
음성 대조군 웰 (바이러스가 없는 Vero 세포)의 세포 생존력을 T=0, 45 및 90분 시점에서 지카 바이러스의 여과지 추출물에 노출된 세포들의 생존력과 비교하였다. 관찰된 바와 같이, 미처리 바이러스 추출물 (T=0)은, Vero 세포를 감염시키는 활성 바이러스에서 기인하는 세포변성 효과 (CPE) 때문에, 약 50%의 세포 사멸 (독성)을 유도하였다 (표 4). RGS로 처리된 지카 여과지의 바이러스 추출물은 RGS 처리로 인한 지카 바이러스의 비활성화 때문에 Vero 세포 사멸을 덜 유도하였다. 음성 대조군 (지카 없음), 양성 대조군 (RGS로 처리되지 않은 지카) 및 RGS 처리된 2개의 지카에 해당하는 숙주 세포수를 도 8과 표 1에 나타내었다. 양성 대조군 (RGS로 처리되지 않은 지카 바이러스)과 비교하였을 때, 45분 및 90분의 RGS 처리는 지카를 현저히 비활성화시켰다 (표 4).
숙주 세포의 사망률은 T=45 처리 (20.14%)에 비해, T=90 처리 (9.45%)에서 훨씬 덜하다 (표 1). 이것은 예상한 대로 45분간의 처리에 비해서 90분간의 처리의 경우에 더 많은 지카가 비활성화된다는 것을 의미하는 것이다. 음성 대조군에서의 숙주 세포 사망률에 대한 숙주 세포 사망률의 정규화는, 45분 및 90분간의 RGS 처리에서 각각 56.34%와 79.51%의 지카 바이러스 비활성화를 시사하고 있다 (표 1). 예상대로, 양성 대조군 지카 바이러스 추출물 (T=0)에 노출된 Vero 세포들은 RGS로 처리된 두 지카 바이러스 (T=45 및 T=90)의 여과지 추출물에 비해서 최대의 Vero 세포 사멸을 나타냈다.
도 9는 양성 대조군 (T=0)과 RGS로 처리된 지카 바이러스 여과지 추출물에 노출된 Vero 세포들의 웰의 현미경 사진 이미지를 나타낸 것이다 (3회). 도 8에 나타낸 세포 사멸 결과들은 이 현미경 이미지들과 일치한다 (도 9).
결론
본 연구의 결과는 RGS 처리가 지카 바이러스를 현저히 비활성화한다는 것을 입증한다. 90분간의 RGS 처리는 지카 바이러스를 약 80% 감소시킨다. 따라서, RGS 처리는 표면, 공간, 식품, 사료, 의료 장비 등의 병원성 바이러스를 효과적으로 비활성화시킬 수 있다. RGS 기술은 환경, 의료 및 식품 매개형 바이러스에 대한 효과적인 항바이러스 치료제이다.
실시예 3: 반응성 가스 (RGS)를 사용한 살모넬라 엔테리카 (Newport) 박테리오파지 비활성화: 항바이러스제로서 RGS의 효과를 알아보기 위한 SBA 1781 박테리오파지 모델의 사용
본 연구에서는, 살모넬라 엔테리카 박테리오파지 (SBA 1781 파지 바이러스)를 사용하여 바이러스를 비활성화하는 RGS의 효과를 평가하였다.
재료 및 방법
숙주 박테리아: 살모넬라 엔테리카 (Newport 균주, ATCC 6962), 버지니아주 마나싸스 소재의 ATCC (미국 세포 균주 은행)에서 구입함. 박테리오파지, SBA 1781: ATCC 명칭 PTA-5282도 ATCC에서 구입하였다.
살모넬라 엔테리카 배양물 (숙주 박테리아)의 성장
살모넬라 엔테리카 (ATCC 6962)는 박테리오파지, SBA 1781의 천연 박테리아 숙주이다. ATCC에서 구입한 (바이알 중의) 살모넬라 엔테리카 박테리아는 1 ml의 신선한 액체 배지 (증류한 H2O 중 1% 트립톤, 0.1% 효모 추출물 및 0.8% NaCl)를 첨가하여 재구성하였다. 상기 재구성한 박테리아 배양액 (100 ㎕)을 바이알에서 꺼내어 헐거운 캡을 갖는 배양 유리 튜브 중에서 10 ml의 동일한 액체 배지를 접종하는데 사용하였다. 상기 접종된 액체 배지를 온도 조절형 항온배양기 중에서 37℃로 밤새(18-20시간) 성장시켰다. 그 후, 상기 생성된살모넬라 엔테리카 24시간 배양물을 박테리오파지, SBA 1781의 증식에 사용하였다.
SBA 1781 박테리오파지 증식
박테리오파지 SBA 1781은 ATCC 권고 절차를 사용하여 천연 숙주 세포인 살모넬라 엔테리카 배양물 중에서 증식시켰다. 간략히 설명하면, 숙주 박테리아 배양 세포를 상술한 바와 같이 37℃의 액체 배지 중에서 밤새 성장시켰다. 그 후, 1.0 ml의 박테리아 세포 현탁액을 아가 플레이트의 표면에 첨가하고, 가볍게 기울여 전체 표면이 숙주 박테리아 세포로 덮힐 수 있도록 하였다. 다음으로, 초과량의 액체를 아가 플레이트로부터 흡인한 뒤 플레이트를 습윤 건조시켰다. 액체 배지 중 살모넬라 파지 (SBA 1781)의 다양한 희석액의 현탁액을 아가 플레이트의 표면에 스폿팅하여 37℃로 밤새 항온배양하였다. 다음 날, 박테리오파지를 플레이트당 5 ml의 신선한 액체 배지를 첨가하여 수확하고, 주기적으로 부드럽게 흔들면서 4℃에서 1시간 동안 항온배양하였다. 각 플레이트의 추출물 (현탁액)을 수집하여 50 ml의 멸균 폴리프로필렌 튜브로 옮기고, 주기적으로 부드럽게 흔들면서 4℃에서 2차 추출 (20분)을 위해 추가로 5 ml의 새로운 배지를 각 플레이트에 첨가하였다. 각 플레이트의 두 추출물을 50 ml의 원뿔형 튜브에 모으고 플레이트들을 버렸다. 상기 모은 현탁액을 4℃에서 15분간 5000×g로 원심분리하여 세포 및 아가 잔해물을 펠렛화하였다. 그런 다음, 상청액을 수집하고 0.22 μM Millipore 필터를 통과시켜서 숙주 박테리아 세포들을 제거하였다. 상기 회수된 박테리오파지를 포함하여 생성된 여과액은 차후 실험에 사용하기 위해 4℃로 보관하였다.
SBA 1781 박테리오파지의 RGS 비활성화
RGS로 살모넬라 박테리오파지를 비활성화시키기 위해, 1 ml의 여과된 파지 상청액을 General Electric Company (GE Healthcare Life Sciences, 팬실베니아주 피츠버그 소재)에서 구입한 원형 와트만 여과지 (직경 90 mm)에 스폿팅하였다. 다음으로, 여과지들을 통풍 건조시키고, 양성 대조군 [RGS로 처리하지 않거나 미처리 (T=0)]으로 한 세트의 여과지를 지정한 후, 파지 추출을 위해 처리하였다. 나머지 여과지들을 3세트로 하여, 각 세트를 각각 80 kV에서 30분, 60분 및 90분간 RGS로 처리하였다. RGS 처리 후, 각 세트의 여과지들을 개별적으로 작은 조각으로 썰어서 멸균된 50 ml의 튜브에 넣었다. 여과지들의 박테리오파지를 튜브당 5 ml의 멸균 PBS (1X)로 추출하였다. 여과지 추출물의 바이러스 활성은, 숙주 세포 (살모넬라 엔테리카)의 24시간 박테리아 배양물이 분주된, 투명한 96-웰 평탄 바닥 플레이트 (Midwest Scientific (MidSci)으로부터 구입, 미주리주 세인트 루이스 소재)를 사용하여 고속대용량 스크리닝으로 측정하였다. 새로 성장시킨 살모넬라 엔테리카 배양물을 영양 액체 배지 중에서 1000개의 세포/ml (현탁액)의 세포 밀도로 희석하고; 96-웰 플레이트 (170 ㎕/웰)에 플레이팅한다. 이후, 즉시 웰당 최종 부피 200 ㎕로 다양한 희석액의 박테리오파지 추출물 (현탁액) 30 ㎕를 첨가하였다. 상기 접종된 96-웰 플레이트를 밤새 배양물 성장 (18-20시간)을 위해 37℃로 항온배양하였다. 다음으로, 24시간 배양 광학 밀도 (OD)를 Spectra-Vmax PC340 플레이트 판독기 (Molecular Devise)를 사용하여 660 nm에서 판독하였다. 수득한 흡광도 판독치를, RGS에 의한 SBA 1781 바이러스 파지의 비활성화로 인한 성장 역전에 대한 척도로서, 박테리아 성장을 계산하는데 사용하였다. 음성 (액체 배지 단독) 및 양성 (박테리아 배양물 단독) 대조군들도 동일한 플레이트에서 실행하여, 박테리오파지에 의한 박테리아 성장 억제를 평가하는데 번갈아 사용하였다. 미처리 (양성 대조군) 및 RGS로 처리된 파지를 모두 음성 대조군 웰 (파지가 없는 웰)과 비교하고, 모든 처리 그룹에 대해 살모넬라 엔테리카의 성장 백분율 (생존율)을 계산하였다.
SBA 1781을 비활성화시키는 RGS의 효과는 RGS 처리 및 미처리 (양성 대조군) 박테리오파지의 추출물에서 관찰된 박테리아 (살모넬라 엔테리카) 성장율 차이 (% 생존율)를 비교하여 측정하였다.
결과 및 논의
살모넬라 엔테리카 박테리오파지 (SBA 1781)의 RGS 처리는 그의 표적 숙주 세포 (살모넬라 엔테리카)에 대한 감염력을 현저히 감소시켜 숙주 세포가 성장할 수 있게 해주었다 (표 2). 미처리된 SBA 1781 파지 (양성 대조군)는 그의 박테리아 숙주 세포를 감염시키고 용균/사멸을 야기하여 63%의 사망률 또는 다르게는 37%의 생존력 (생존율)을 유도할 수 있었다 (표 2 및 도 10). 30분, 60분 및 90분간 파지를 RGS에 노출시켰더니, 관찰된 생존율이 각각 86%, 87% 및 89%로 나타난 바와 같이 (표 2), 숙주 세포의 성장 억제가 크게 역전되었다. 30분, 60분 및 90분간 파지를 RGS에 노출시켰더니, 관찰된 생존율이 각각 86%, 87% 및 89%로 나타난 바와 같이 (표 2), 숙주 세포의 성장 억제가 크게 역전되었다.
숙주 세포의 사망률은 RGS로 처리된 파지의 경우에 양성 대조군에 비해 훨씬 낮다 (표 3). 이는 RGS 처리에 의해 더 많은 파지들 비활성화된다는 것을 의미한다. 음성 대조군에서의 숙주 세포 사망률에 대한 숙주 세포 사망률의 정규화는, 30분, 60분 및 90분간의 RGS 처리에서 각각 77.78%, 79.37% 및 82.54%의 파지 비활성화를 시사하고 있다 (표 3). 예상대로, 양성 대조군 파지 추출물 (T=0)에 노출된 숙주 세포들은 RGS로 처리된 3개의 박테리오파지 (T=30, T=60 및 T=90)의 여과지 추출물에 비해 최대 숙주 세포 사멸을 나타냈다.
결론
본 연구에서 얻은 예비적 결과는 살모넬라 엔테리카 박테리오파지 SBA 1781 활성에 대한 RGS의 억제 효과를 명확하게 입증하고 있다. 항바이러스제로서 RGS의 효능은 미처리 대조군 (양성 대조군) 및 RGS 처리된 살모넬라 엔테리카 배양물에서 박테리오파지의 박테리아 배양 성장을 비교하여 평가하였다. 데이터에서 입증되듯이, 이 기술은 다양한 바이러스 그룹들의 확산을 방지하는 수단이다.
실시예 4: RGS를 사용한 MS2 박테리오파지 바이러스의 소독: 확장된 파일럿 발생기 시스템
RGS 파일럿 발생기는 90 mm의 와트만 5 여과지의 표면에서 스폿팅되고 회수된 단일 가닥 RNA 바이러스인 MS2 박테리오파지를 소독하는데 사용하였다. MS2 박테리오파지는 에쉐리키아 콜라이 (이. 콜라이) 및 엔테로박테리아과의 다른 박테리아 구성원을 감염 및 용균시키는 RNA 바이러스이다. 대부분의 인간 바이러스 병원체들은 RNA 바이러스이므로, 바이러스 소독 및 비활성화에 대한 RGS 처리의 효과를 측정하기 위한 최적의 모델로서 MS2 박테리오파지 (인간이 아닌 병원체)를 선택하였다.
본 파일럿 시스템은 1 kW 프로토타입 기술 시스템에서 확장된 산업적으로 강화시킨 8 kW 발전 시스템이다. 개선된 파일럿 시스템 형태는 10개의 1.5인치 전극 갭들 간의 유전체 장벽 방전 (DBD)을 통해서 더 많은 양의 반응성 가스 화학종 (RGS)을 발생시킬 수 있는 기능으로 훨씬 더 많은 처리 챔버 용량을 갖는다. 본 연구를 위해, 상기 시스템을 분당 590 세제곱 피트 (cfm) 및 84 kV의 전압에서 작동시켰으며, 이로써 샘플들이 처리되는 용기의 중앙부에서 측정시 30 ± 2 ppm의 오존이 형성되었다. 가스를 플라즈마 발생기를 통과시킨 후 공압 이송 시스템을 통해 약 250 피트를 운반시킨 다음, 4인치의 PVC 유연성 튜브를 통해 처리 챔버 역할을 하는 20 피트의 표준 운송 용기로 운송하였다. 발생 시스템에 공급되는 공기의 상대 습도 (RH)와 주위 온도는 각각 50%와 70℉였다. 본 연구에서 얻은 예비 결과와 데이터를 통해, MS2 바이러스 입자들이 2-log10 감소한 것을 알 수 있었는데, 이는 바이러스 소독 수단으로서 RGS를 이용할 수 있음을 의미한다.
재료
숙주 박테리아: 에쉐리키아 콜라이 (이. 콜라이, 균주 K-12, ATCC 15597)를 미국 버지니아주 마나싸스 소재의 미국 세포 균주 은행 (ATCC)에서 구입하였다. MS2 파지: ATCC 15597-B1도 ATCC에서 구입하였다. 일반적인 실험실 소모품, 시약 및 보급품에는 하기가 포함된다: TSB 액체 배지, 아가 플레이트, 탑 아가, 피펫터, 혈청 튜브 및 피펫, SM 파지 완충액, 주사기, 0.22 μM의 나일론 주사기 필터, 검은색 플라스틱 SNAP PAK® 용기, 핀셋, 지혈기, 가위 등
배지에는 하기가 포함된다: TSB 액체 배지, 바텀 아가 플레이트 (100 mm 플레이트) 및 탑 아가 (3 ml/튜브). 바텀 아가에는 다음이 포함된다: TSB 액체 배지 중 1.5% 아가 (리터당 15 g 또는 500 ml당 7.5 g). 탑 아가에는 다음이 포함된다: TSB 액체 배지 중 0.7% 아가 (리터당 7.5 g 또는 500 ml당 3.75 g)
SM 완충 용액은 사용 전에 가압멸균 주기를 사용하여 멸균시켰다.
방법
MS2 증식을 위한 숙주 박테리아 배양물 성장시키기
본 연구에 사용된 MS2 박테리오파지 숙주 박테리아는 에쉐리키아 콜라이 (이. 콜라이, 균주 K-12, ATCC 15597)이었다. 원래 바이알에 들어 있는 이. 콜라이 (ATCC 15597)는 ATCC에서 구입하여, 1 ml의 신선한 액체 배지 (탈이온수 중 1% 트립톤, 0.1% 효모 추출물 및 0.8% NaCl)를 첨가하여 재구성하였다. 상기 재구성한 배양액 (100 ㎕)을 바이알에서 꺼내, 이를 사용하여 10 ml의 동일한 액체 배지를 유리 배양 튜브에 접종하고 이를 37℃로 열 항온배양기 중에서 밤새 성장시켰다. 이후, 생성된 이. 콜라이 배양물을, 처리를 위한 MS2 박테리오파지의 증식 및 미처리/처리된 샘플들로부터 회수된 바이러스들에 대한 후속 적정 플라크 분석에 사용하였다.
MS2 박테리오파지 증식
박테리오파지 MS2 (ATCC 15597-B1)는 소프트/탑-아가 오버레이를 사용하지 않고 ATCC 절차에 따라서 그의 박테리아 숙주 세포인 이. 콜라이 (균주 K-12, ATCC 15597)에서 증식시켰다. 숙주 박테리아 배양 세포를 상술한 바와 같이 37℃의 액체 배지 중에서 밤새 성장시켰다. 이어서, 1.0 ml의 숙주 박테리아 세포 현탁액을 각 아가 플레이트의 표면에 첨가하고, 숙주 박테리아 세포로 전체 표면을 덮도록 살짝 기울여주었다. 다음으로, 초과량의 액체를 아가 플레이트로부터 흡인한 후 플레이트를 건조시켰다. 액체 배지 중 MS2 파지 현탁액의 다양한 희석액을 아가 플레이트의 표면에 스폿팅하여 37℃로 밤새 항온배양하였다.
밤새 성장시킨 후, MS2 파지에 의한 상당량의 숙주 박테리아 용균을 나타내는 플레이트들을 박테리오파지 안정화 완충액 (SM)을 사용하는 파지 바이러스 추출 처리하였다. SM 안정화 완충액 (5 ml)을 각 아가 플레이트에 첨가하고, 주기적으로 부드럽게 흔들면서 4℃에서 3시간 동안 보관하였다. SM 완충 현탁액을 수집하여 50 ml의 폴리프로필렌 튜브로 옮겼다. 신선한 SM 완충액의 제2 분취량 (플레이트당 5 ml)을 각 플레이트에 첨가한 다음, 주기적으로 부드럽게 흔들면서 4℃에서 15분간 추가로 항온배양하였다. 완충액을 수집하여 이전에 제거한 완충액과 함께 50 ml 튜브에 모은 뒤에 플레이트들을 버렸다. 상기 모은 SM 완충액-MS2 파지 현탁액을 4℃에서 15분간 5000×g로 원심분리하여, 세포 잔해물과 및 아가 조각들을 침전시킨 후, 미립자가 없는 바이러스가 포함된 상청액을 수집하였다. 생성된 상청액을 0.22 μM 나일론 주사기 필터에 통과시켜 숙주 박테리아 세포들을 제거하고, 회수된 MS2 파지가 포함된 여과액을 실험에서 사용하기 위해 4℃에서 보관하였다.
RGS를 이용한 MS2 바이러스 처리 및 잔류 바이러스 추출
플레이트에서 얻어서 증식된 바이러스 입자들을 포함하는 MS2 박테리오파지 상청액 (1 ml)을 수개의 멸균된 90 mm 와트만 5 여과지들의 표면에 스폿팅하였다. 그런 다음, 상기 여과지들을 흄 후드에서 건조시키고 실험 처리시까지 4℃ 보관을 위한 깨끗한 용기에 넣었다. 처리 직전에, 바이러스가 포함된 여과지들을 냉장고에서 제거하여 아이스팩이 채워진 냉각기에 담아 처리 용기로 옮겼다. 여과지들을 이들의 저장 용기로부터 무균 상태로 제거하고, 8'×8'×20' (길이×너비×깊이) 강철 용기 중의 다양한 위치에서 무명실로 엮은 바인더 클립으로 고정하여 자성 후크에 매달았다. 용기에는 이중문이 있었다. 우측 문은 완전히 개방하여 이동에 제한이 없게 하였으며, 개방된 문을 대신하여 2×4 프레임에 부착된 1/2인치 두께의 합판 격벽 패널을 용기에 삽입하였다. 상기 합판 패널의 상단 우측 모서리에 공칭 4인치 구멍을 뚫고, 4인치 금속 덕트 (상기 덕트는 그것이 지지된 용기의 중간 지점에서 끝남)를 해당 구멍을 통해 용기에 삽입하였다. 10 피트 길이의 고랑진 (ridged) 덕트를 4인치 PVC 유연성 튜브에 연결하였다. 좌측 문은 살짝 개방하여 (1.5인치) 가스가 배출구를 빠져나갈 수 있도록 하였다.
여과지 샘플들을 각각 처리한 후, 플라즈마 발생기는 꺼두었지만, 용기에서 잔류 반응성 가스를 퍼징하기 위해 송풍기는 추가로 10분간 더 그대로 놔두었다. 그런 다음, 샘플들을 제거하여 각각 멸균 플라스틱 용기들에 넣고, 차가운 냉각기 중에 담아 SM 완충액을 사용하는 잔류 바이러스 추출을 위해 실험실로 가져갔다. 추출을 위해, RGS로 처리된 여과지와 미처리된 여과지를 무균 상태에서 0.5 cm 너비의 스트립으로 썰어서 쌓은 후에 50 ml의 멸균 튜브 내로 잘라 넣었다. SM 완충액 (5 mL)을 각 튜브에 첨가하고, 10분 동안 추출을 수행하였다. 완충액을 추가한 직후, 10분간 각각 2분 간격으로 각 샘플들을 15초 동안 약하게 펄스 볼텍싱하였다. 그 후, 상기 튜브들을 4℃에서 5000 rpm으로 원심분리하였다. 잔류 바이러스를 함유하는 상청액을 0.22 μM 나일론 주사기 필터를 통해 15 ml의 멸균 튜브로 여과하여 MS2 플라크 분석을 사용하여 바이러스 농도를 측정하였다.
MS2 박테리오파지의 플레이팅과 적정
이. 콜라이 배양은 10 ml의 TSB 액체 배지에 상술한 동일한 배지 중의 100 ㎕의 이. 콜라이 현탁액을 접종하고 37℃ 항온배양기 중에서 밤새 성장시킴으로써 시작하였다. 다음날, 상기 밤샌 배양물을 사용하여 또 다른 신선한 이. 콜라이 배양을 시작하였다. 1 ml의 상기 밤샌 배양물을 9 ml의 신선한 TSB 배지 (밤샌 배양물의 1:10 희석물)에 첨가하여 동일한 조건에서 3시간 동안 성장시켰다. 그런 다음, 이 신선한 배양물을 TSB 배지 중에서 1:5로 희석하고 MS2 플라크 분석에서 박테리아 숙주로 사용하였다. 처리된 여과지 추출물과 미처리된 여과지 추출물을 여러 번 희석하고, TSB 탑 아가 및 바텀 아가 플레이트를 사용하는 플라크 분석에 의해 회수된 MS2 바니러스의 농도를 측정하였다.
간략히 설명하면, 0.15 ml의 3시간 박테리아 배양액을 TSB 중에 1:5로 희석하고, 수조에서 42-45℃로 유지된 3 ml의 용융된 탑/소프트 아가에 첨가한 후, 15 ㎕의 희석된 MS2 파지 추출물을 첨가하였다. 그런 다음, 상기 혼합물을 가볍게 볼텍싱하여, 바텀 아가 플레이트에 붓고, 응고되도록 놔두었다. 이후, 상기 플레이트들을 37℃ 항온배양기 중에서 뒤집어서 밤새 항온배양하였다. 다음 날, 플레이트들에 형성된 플라크들 (투명한 부분들)을 계수하여 그 결과를 하기에 나타낸 바와 같이 표로 작성하였다.
결과
실험 1: MS2 박테리오파지 상청액의 비활성화
여과지 #13A는 미처리 대조군 샘플 (T=0)이었고, 여과지 #9 (샘플 용기에 대한 가스 진입점 앞에 배치됨)는 분당 590 세제곱 피트 (CFM)로 84 kV에서 1시간 동안 RGS로 처리하였다.
상기 표의 제5열에 있는 ml당 MS2 농도값은 플라크수를 0.015 ml (3시간 이. 콜라이의 1:5 희석액 0.15 ml 및 3 ml의 탑 아가를 함유하는 15 ml의 바이알에 첨가된 MS2 추출물의 부피)로 나누어 얻은 후 MS2 희석 인자를 고려한 것이다.
실험 2: MS2 박테리오파지 상청액의 비활성화
여과지 #9는 미처리 대조군 샘플 (T=0)이었다. 여과지 #1 (샘플 용기의 가스 진입점 앞에 배치됨) 및 여과지 #3 (샘플 용기의 후면 좌측 모서리에 배치됨)을 590 CFM으로 84 kV에서 3시간 동안 RGS로 처리하였다.
상기 표의 제5열에 있는 ml당 MS2 농도 (PFU/ml) 값은 플라크수를 0.015 ml (3시간 이. 콜라이의 1:5 희석액 0.15 ml 및 3 ml의 탑 아가를 함유하는 15 ml의 바이알에 첨가된 MS2 추출물의 부피)로 나누어 얻은 후 MS2 희석 인자를 고려한 것이다.
상기 제시된 표 형식의 데이터는 서로 다른 날짜에 수행된 2개의 독립적인 실험으로부터 나온 것이다. 상기 2가지 예비적 연구에서 얻은 결과는 RGS 처리가 MS2 박테리오파지 바이러스를 소독한다는 것을 입증하는 것이다. 결과에서 알 수 있듯이, MS2 파지가 RGS에 노출되면 1시간 처리의 경우 바이러스 부하량이 약 2-log10, 3시간 처리의 경우 3-log10이 감소하였다 (표 5 및 6).
실험 1에서는, 미처리 여과지 (샘플 13A) 1개와 가스 주입구 바로 앞에 처리 용기에 매달아 놓았던 처리된 여과지 (샘플 9) 1개와 비교하였다. 실험 1은 6.00×1011 PFU/mL에서 7.47×109 PFU/mL로 98.8%의 생존가능한 바이러스 감소를 나타냈다. 실험 2에서는, 미처리 여과지 (샘플 9) 1개와 처리된 여과지 2개와 비교하였다. 첫번째 처리된 여과지 (샘플 1)는 가스 주입구 바로 앞의 처리 용기에 걸어두었고, 두번째 처리된 여과지 (샘플 3)는 가스 주입구에서 약 14피트 떨어진 후면 좌측 모서리에 걸어두었다. 샘플 3의 위치는, 샘플 1보다 와류가 훨씬 적게 보였지만 바이러스 감소율이 약간 더 낮았기 때문에 의미가 있다. 실험 2는 샘플 1과 샘플 3에 대해 2.67×1010 PFU/mL에서 2.53×107 및 6.40×107 PFU/mL로 각각 99.9% 및 99.8%의 생존가능한 바이러스 감소를 나타냈다.
이 박테리아 세포 기반 플라크 분석에서 추출된 MS2-박테리오파지 바이러스로 숙주 이. 콜라이 세포를 플레이팅하면, 비교적 용이한 바이러스 회수 및 감소의 정량화 방법을 제공할 수 있다. 활성 MS2 파지는 그 숙주 세포를 감염시켜서 용균 (사멸)함으로써, 플레이트 상에 투명한 부위가 특징인 플라크들을 형성시킨다. 각 투명 부위들 (플라크)은 단일 바이러스 입자를 나타내기 때문에, 플라크 정량을 통해 대조군 및 실험 샘플 모두에서 바이러스 역가를 측정할 수 있다. 도 11과 도 12에 도시된 결과에서 관찰된 바와 같이, T=0 미처리 샘플의 추출물은 각각 T=1시간 및 T=3시간 처리 샘플에 비해 플라크가 더 많이 나타났다. 이러한 결과는 MS2 바이러스를 RGS에 노출시키면 상응하는 미처리 샘플 추출물과 비해 그의 PFU가 최대 3-log10까지 감소함을 나타내고 있다.
결론
본 연구에서 얻은 결과는 RGS 처리에 의한 MS2 박테리오파지 생존율의 감소를 명확히 입증하고 있다. 두 독립적인 실험에 따르면, RGS는 파일럿 규모에서 표면의 RNA 바이러스를 비활성화시킨다.
실시예 5: 표준 유량으로 60, 120 및 180분에 60 kV에서 생성된 반응성 가스의 바실러스 아트로파에우스 포자에 대한 효과
B. 아트로파에우스 포자는 사멸시키기 가장 어려운 미생물들 중 하나로 간주된다. 하기의 실험은 바이러스를 포함한 임의의 모든 미생물들을 사멸시키는 반응성 가스의 능력을 입증한다. 추가의 실험들에서 박테리아가 사멸되었으며, 이 역시 반응성 가스가 바이러스를 사멸시키는 능력을 보여주고 있는데, 이는 바이러스와 박테리아의 조성이 유사하기 때문이다.
B. 아트로파에우스 포자를 접종한 종이 스트립 (Mesa Labs, Inc. Lakewood, CO)을 60, 120 및 180분 동안 반응성 가스 (RGS)에 노출시켰다. RGS는 변형된 원-패스 밸브 방향으로 60 kV에서 생성하였다. 생성된 오존의 양은 고정 전압에서 생성된 RGS의 총량에 비례하고, 이는 시판 장비로 쉽게 정량화되므로, 오존을 사용하여 RGS의 농도 변화를 추적한다.
플라즈마 생성이 시작된 후, 오존의 양이 350 ppm이 될 때까지 RGS를 축적하였다. 이 시점에, 배기 밸브의 밀봉을 살짝 열어 소량의 가스를 빠져나가게 하고, 플라즈마 발생기 하우징의 문 이음새를 통해 흡입된 주위 공기로 대체하도록 하였다. 그 결과, 분당 25 내지 28 세제곱 피트 (cfm)의 유량이 증가하였고, 약간의 변동은 있지만 250 ppm에서 안정화되는 오존 감소가 있었다. 샘플 접촉기로 가는 밸브들 닫아 샘플들을 제거하면서, RGS 생성은 시스템을 통해 계속 순환하도록 하였다. 오존은 단시간의 샘플 제거 (1 내지 2분 지속) 동안 350 ppm 부근에서 피크에 이르렀지만, 샘플 접촉기로의 흐름을 재개한 후에는 250 ppm으로 빠르게 안정화되었다.
Mesa Labs는 각 스트립에 1.8×106 개의 포자들이 포함되어 있다고 추산한다. Mesa Labs에서 권장하는 절차에 따라 처리된 실험 대조군은 스트립당 평균 1.0×106 개의 포자가 있는 것으로 측정되었다. 모든 시점에서, 측정된 최종 개수는 표준 48시간 후에 0 콜로니 형성 단위 (cfu)였다. 플레이트들을 관찰을 위해 유지하였다. 3일째 되던 날, 60분간 RGS에 노출시킨 샘플들의 포자 개체군의 수는 보통이었다. 더 긴 시간 동안 노출시킨 샘플들은 변화가 없었다. 최종 결과는 도 13과 하기 표 7에 나타내었다.
실시예 6: 표준 유량 및 고유량으로 15, 30, 45 및 60분에 60 kV에서 생성된 반응성 가스의 바실러스 아트로파에우스 포자에 대한 효과
B. 아트로파에우스 포자를 접종한 종이 스트립 (Mesa Labs, Inc. Lakewood, CO)을 15, 30, 45 및 60분 동안 반응성 가스 (RGS)에 노출시켰다. 실시예 5와 동일한 조건 하에 RGS를 생성하였다. 두 세트의 종이 스트립은 동일한 처리 조건과 시간으로 하였으나, 유량 시스템 내에서는 서로 다른 위치에 두었다. 제1세트인 "표준 유량"은 샘플 접촉기의 상단 (가장 넓은) 부분에 배치된 와이어 선반에 매단 S-카라비너에 고리 모양의 바인더 클립으로 매달았다. 제2세트인 "고유량"은 샘플 접촉기의 유출형 90°강철 엘보 (steel elbow)의 접합부 사이에 배치하였다. 결과를 도 14와 하기 표 8에 요약하였다.
실시예 5 및 6의 데이터 편집
도 15와 16, 및 표 9와 10에 편집한 실시예 5 및 6의 데이터포인트들은, 고유량 및 표준 유량 조건에서 연구된 모든 시점들에 대한 감소 곡선을 보여주는 것이다. 각 요약본과 편집 요약본 간의 데이터포인트에는 약간의 차이가 나타날 수 있다. 임의의 중복하는 시점의 반복실험들은 평균을 냈다. 데이터 세트는 로그 감소와 개체군에서의 변화로 나타내는데, 이들은 동일한 추세를 나타내는 단순 역함수이다.
표준 유량 조건은 점진적인 개체군 감소를 가져와, 60분 안에 대략 2.5 로그 감소에 도달하였다. 120분과 180분간의 노출 결과, E+06 개체군이 완전히 감소하였다. 이러한 실험 조건 하에, 1~2시간 노출은 통상적으로 접하게 되는 오염 수준에 상당하는 포자 개체군 수준을 효과적으로 제거할 수 있었다.
고유량 조건은 표준 유량보다 더 높은 감소율을 보였다. 고유량 조건은 대략 절반의 시간 안에 동일한 개체군을 감소시킬 수 있었다. 이러한 사실은 30분의 고유량 (N = 1.72E+04)과 60분의 표준 유량 (N = 1.82E+04)의 최종 개체군 비교시에 입증된다. 고유량 조건은 45분간의 노출 후에 전체 포자 개체군을 제거하였던 반면, 표준 유량 조건은 어디든지 간에 1~2시간 사이에는 완전히 제거되지 않았다. 외삽법에 의하면, E+06 개체군의 표준 유량 하에서 RGS 노출에 의한 완전한 감소는 약 90분이 될 때 나타날 것으로 예상된다.
표준 유량은 80.2 피트/분의 속도로 계산하였고, 고유량은 2281 피트/분의 속도로 계산하였다. 두 예에서 모두, 온도는 25 내지 40℃ (이슬점은 5.3 내지 6.7℃)이었고, 상대 습도는 39.3 내지 40.8이었다. 참고: "E+"는 과학적 E 표기법으로, "mE+n"이라고 하면 m×10n의 값을 의미한다.
실시예 7: 80 kV에서 생성된 반응성 가스가 여과지 상의 살모넬라 엔테리카에 미치는 효과
10개의 10 mm 와트만 여과지에 2.27E+6개의 S. 엔테리카 세포를 접종하고 3-포인트 시간 동안에 반응성 가스 (RGS)에 노출시켰다. 각 샘플에는 80 kV에서 생성된 RGS를 사용하여 0, 5, 15 또는 30분간 동시에 처리한 10개의 여과지의 뱃치가 포함되었다. 3세트의 여과지들은 비교를 위해 각 시점에서 공기만으로 처리하였다. 모든 대조군 및 실험 샘플들은 처리 챔버 내로 배치하기 직전에 접종하였고, 처리 후에 즉시 추출 완충액에 넣었다. 시간 경과에 따른 개체군 변화의 로그 [Log10(N0/N)]로 나타내는 RGS 및 공기 처리 모두의 경우에 대한 감소값들을 도 17과 하기 표 11에 나타내었다.
실시예 8: 80 kV에서 생성된 반응성 가스가 여과지 상의 에쉐리키아 콜라이에 미치는 효과
실시예 8은 실시예 7과 유사한 조건 하에 수행하였다. 10개의 10 mm 와트만 여과지에 8.08E+6개의 이. 콜라이 세포를 접종하고 3-포인트 시간 동안에 반응성 가스 화학종 (RGS)에 노출시켰다. 각 샘플에는 80 kV에서 생성된 RGS를 사용하여 0, 1, 5 또는 15분간 동시에 처리한 10개의 여과지의 뱃치가 포함되었다. 3세트의 여과지들은 비교를 위해 각 시점에서 공기만으로 처리하였다. 모든 대조군 및 실험 샘플들은 처리 챔버 내로 배치하기 직전에 접종하였고, 처리 후에 즉시 추출 완충액에 넣었다. 시간 경과에 따른 개체군 변화의 로그 [Log10(N0/N)]로 나타내는 RGS 및 공기 처리 모두의 경우에 대한 감소값들을 도 18과 하기 표 12에 나타내었다.
실시예 9: 80 kV에서 생성된 반응성 가스가 트립톤 소야 아가 (Tryptone Soya Agar, TSA) 상의 에쉐리키아 콜라이에 미치는 효과
이. 콜라이 접종물을 625 nm에서 0.550의 O.D.로 제조하였다. 상기 밀도는 1.8E+9개의 세포들로 추산되며 실험적으로는 6.95E+9개의 세포로 확인되었다. 상기 접종물로부터 7개의 다수의 1:10 연속 희석액을 만들어, E+9개의 세포에서 E+2개의 세포까지 다수의 세포 현탁액을 생성하였다. E+8, E+7 및 E+6개의 세포들의 3세트의 초기 개체군 수준을 TSA에 접종하고 반응성 가스 (RGS)로 15분, 30분 및 45분간 처리하였다. 모든 대조군 및 실험 샘플들은 처리 챔버 내로 배치하기 직전에 접종하였고, 처리 후에 즉시 추출 완충액에 넣었다. 로그 감소와 최종 개체군에 대한 초기 개체군의 비율로 기록한 결과를 도 19와 20에 나타내었다. E+2개 이하의 세포수 검출 한계로 인해서, 30분과 45분간 처리된 E+6 샘플들과 30분과 45분간 처리된 E+7 샘플들은 정확하게 구별하지 못하였다.
실시예 10: 80 kV에서 생성된 반응성 가스가 트립톤 소야 아가 (TSA) 상의 에쉐리키아 콜라이에 미치는 효과
24시간 동안 배양시킨 이. 콜라이 세포를 1.5E+10의 출발 밀도로 농축하고, 7개의 다수의 1:10 희석액으로 희석하였다. 8개의 TSA 플레이트의 한 세트에 0.1 mL의 각 개체군 희석액을 접종하여 1.51E+9개에서 시작해 1.51E+2개까지의 세포 개체군이 있는 다수의 플레이트를 만들고, 이들을 25분간 반응성 가스 (RGS)에 노출시켰다. 두 번째 세트의 플레이트들을 25분간 RGS에 노출시키고, 첫번째 다수의 플레이트들과 동일한 방식으로 처리 후의 세포들로 접종하였다. 사전에 접종한 세트의 감소값은 수반되는 모든 실험 요인들으로 인한 총감소를 의미한다. 접종 후 플레이트들의 감소값은 아가 성장 배지 (참고: 대부분의 아가는 ≥95%의 물임) 내의 과산화물 라디칼의 형성과 산성화로 인한 순감소를 의미한다. 그 결과를 초기 (No) 개체군 대 최종 (N) 개체군 곡선 (도 21) 뿐만 아니라 로그 감소의 크기 (도 22)로도 나타내었다. 도 21에서, "*"는 세포들이 너무 많아서 셀 수 없음을 의미하며, 세포수는 희석 방식으로 추산한다. 도 21에서, "**"는 N=0을 의미하며, 로그값에 대한 실수를 얻기 위해 1의 값을 사용하였다.
도 23은 셀 수 있는 실험 조건 범위 내에 과산화물 효과를 갖는 4개의 개체군의 경우에 있어서, 총 감소 및 잔류 과산화물에 의한 감소를 비교한 것이다. (참고: "E+"는 과학적 E 표기법으로, "mE+n"이라고 하면, m×10n의 값을 의미한다.)
실시예 11 (예측 실시예)
바이러스로 오염된 표면이 반응성 가스 처리로 소독되었는지를 확인하는 것이 바람직하다. 표면이 소독되었는지를 확인하기 위해, 반응성 가스로 처리하기 전에 표면에서 첫번째 바이러스 샘플을 채취한다. 이 바이러스 샘플을 시험 준비가 될 때까지 차가운 멸균 용기에 보관한다. 그런 다음, 표면을 반응성 가스와 접촉시킨다. 반응성 가스는 20 kV 내지 150 kV의 전압에서 유전체 장벽 방전 (DBD) 시스템을 사용하여 작동 가스로부터 고전압 저온 플라즈마 (HVCP)를 형성함으로써 생성하고, 상기 반응성 가스를 HVCP에서 적어도 1 m 떨어진 곳으로 이송시킨다. 표면을 처리한 후, 표면에서 두번째 바이러스 샘플을 채취한다. 첫번째 바이러스 샘플과 두번째 바이러스 샘플에 대해 플라크 분석 시험을 수행한다. 각 샘플에 대한 플라크들의 수를 계산될 것이다. 각 바이러스 샘플에 대한 부피당 플라크 형성 단위 (PFU/mL)를 비교할 것이다. 처리 및 미처리 여과지의 PFU/mL를 비교함으로써, 바이러스의 log10 감소를 측정한다. 처리된 여과지의 바이러스 농도가 1.0×107 PFU/mL이고, 미처리된 여과지의 바이러스 농도가 1.0×109 PFU/mL인 경우라면, 해당 처리는 2-log10 감소를 달성한 것이다. 두 번째 시료의 PFU/mL 수가 너무 많은 경우에는, 반응성 가스를 재차 투여할 수도 있다.
다르게는, 반응성 가스가 바이러스로 오염된 표면을 소독하는지의 여부를 확인하기 위해, 여과지의 조각들을 사용하여 균일한 바이러스 샘플들을 제공할 수도 있다. 두 조각의 여과지를 바이러스, 바람직하게는 MS2 파지를 포함하는 용액으로 블롯팅할 수 있다. (RGS 처리된) 여과지 한 조각을 처리할 표면이 있는 챔버 중에 넣을 수도 있다. 여과지를 포함하고 있는 챔버 내의 표면들은 반응성 가스와 접촉시킨다. 반응성 가스는 20 kV 내지 150 kV의 전압에서 유전체 장벽 방전 (DBD) 시스템을 사용하여 작동 가스로부터 고전압 저온 플라즈마 (HVCP)를 형성함으로써 생성하고, 상기 반응성 가스를 HVCP에서 적어도 1 m 떨어진 곳으로 이송시킨다. (미처리된) 다른 여과지 조각은 시험 준비가 될 때까지 차가운 멸균 용기에 보관한다. 반응성 가스 처리를 수행한 후, RGS로 처리된 여과지와 미처리된 여과지에 대해 플라크 분석 시험을 수행한다.
참고문헌:
Claims (29)
- 바이러스로 오염된 것으로 의심되는 표면을 소독 (disinfect)하는 방법으로서,
20 kV 내지 150 kV의 전압에서 유전체 장벽 방전 (DBD, dielectric barrier discharge) 시스템을 사용하여 작동 가스 (working gas)로부터 고전압 저온 플라즈마 (HVCP)를 형성함으로써 반응성 가스를 생성하는 단계;
상기 반응성 가스를 HVCP에서 적어도 1미터 떨어진 곳으로 이송하는 단계; 이후
상기 표면을 반응성 가스와 접촉시켜 상기 표면을 소독하는 단계를 포함하며,
여기서, 상기 바이러스에 감염된 숙주가 표면에 접촉했었던 것인, 방법. - 바이러스로 오염된 표면을 소독하는 방법으로서,
20 kV 내지 150 kV의 전압에서 DBD 시스템을 사용하여 작동 가스로부터 고전압 저온 플라즈마 (HVCP)를 형성함으로써 반응성 가스를 생성하는 단계;
상기 반응성 가스를 HVCP에서 적어도 1미터 떨어진 곳으로 이송하는 단계; 이후
상기 표면을 반응성 가스와 접촉시켜 상기 표면을 소독하는 단계를 포함하며,
여기서, 상기 바이러스에 감염된 숙주가 표면에 접촉했었던 것인, 방법. - 바이러스로 오염된 표면을 소독하는 방법으로서,
(I) 20 kV 내지 150 kV의 전압에서 DBD 시스템을 사용하여 작동 가스로부터 고전압 저온 플라즈마 (HVCP)를 형성함으로써 반응성 가스를 생성하는 단계;
(II) 상기 반응성 가스를 HVCP로부터 적어도 1미터 떨어진 곳으로 이송하는 단계;
(III) 이후, 상기 표면을 반응성 가스와 접촉시켜 상기 표면을 소독하는 단계;
(IV) 상기 접촉 후 상기 표면으로부터 바이러스 샘플을 얻는 단계, 및
(V) 반응성 가스에 노출된 후 잔류 바이러스의 양을 측정하는 단계를 포함하며,
여기서, 상기 접촉에 의해 표면이 소독되지 않는 경우라면, 해당 표면이 소독될 때까지 (I), (II) 및 (III)을 반복하는 것인, 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표면이 인공 구조물의 내부 표면인 것인, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주가 인간 또는 동물인 것인, 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주가 식물인 것인, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인공 구조물이 방 또는 통로를 포함하는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인공 구조물이 운송 수단 (vehicle)을 포함하는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉이 적어도 8 세제곱 미터의 부피를 갖는 방에서 수행되는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방이 병실인 것인, 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방이 크루즈선 선실인 것인, 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표면이 의료 장치의 표면인 것인, 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉이 1초 내지 24시간 동안 지속되는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉이 30분 내지 2시간 동안 지속되는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉이 적어도 90분 동안 지속되는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응성 가스가 오존 이외의 적어도 하나의 반응성 또는 여기 화학종을 포함하는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스가 RNA 바이러스인 것인, 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스가 로토바이러스, 라이노바이러스, 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV), 한타바이러스, 노로바이러스, 홍역 바이러스, 에볼라 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 조류 바이러스, 지카 바이러스, 중동 호흡기 증후군 (MERS) 코로나바이러스, 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS) 코로나바이러스 및 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스가 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2)인 것인, 방법.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작동 가스가 MA65를 포함하는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스가 DNA 바이러스인 것인, 방법.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스가 아프리카 돼지 열병 바이러스인 것인, 방법.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표면 접촉이 MS2 파지 분석 시험에 의해 적어도 2-log10 감소를 유도하기에 충분한 것인, 방법.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표면 접촉이 MS2 파지 분석 시험에 의해 적어도 3-log10 감소를 유도하기에 충분한 것인, 방법.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표면 접촉이 MS2 파지 분석 시험에 의해 적어도 4-log10 감소를 유도하기에 충분한 것인, 방법.
- 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표면 접촉이 MS2 파지 분석 시험에 의해 적어도 5-log10 감소를 유도하기에 충분한 것인, 방법.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표면 접촉이 MS2 파지 분석 시험에 의해 적어도 6-log10 감소를 유도하기에 충분한 것인, 방법.
- 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 측정이 MS2 파지 플라크 분석 시험을 이용하는 것인, 방법.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 측정이 효소-결합 면역흡착 분석 (ELISA) 시험을 사용하여 바이러스의 양을 측정하는 것인, 방법.
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