CN116033928A - 使用反应性气体解除病毒的方法 - Google Patents

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Abstract

对被病毒污染或者疑似被病毒污染的表面进行消毒的方法，其包括：通过用电介质阻挡放电(DBD)系统在20kV‑150kV的电压下由工作气体形成高电压冷等离子体(HVCP)而产生反应性气体；将反应性气体从HVCP运输至少1米远；之后使表面与反应性气体接触。

Description

使用反应性气体解除病毒的方法
背景技术
生物净化和杀菌具有广泛的应用，包括医疗设备和器械杀菌、食品生产和保存、以及消费品的制备。目前使用化学品、热、高能电子束、以及X-射线或γ-射线辐照系统来杀菌。由于成本、效率、不动性、电力需求、有毒废弃物、人身危害以及杀菌或净化所需要的时间，这些系统各自具有取舍。
等离子体已经被用于净化和杀菌。作为区别于气体、液体和固体的第四种物质状态的等离子体可通过放电、例如放电通过气体而产生。虽然所有的等离子体含有电子、离子和中性物种，但是取决于用于制备等离子体的气体的组成以及用于产生等离子体的装置的电学和结构配置，它们将具有不同的性质。
一种类型的等离子体是高电压冷等离子体(HVCP)，其可使用(电)介质阻挡放电(DBD)系统制备。HVCP可通过用DBD系统，使用优选地30kV-500kV、典型地频率为50或60Hz的电压将气体非平衡击穿而制备。尚未研究HVCP以及其它类型的等离子体例如热等离子体或RF等离子体。因此，目前没有理论解释这些等离子体的性质，也没有理论解释在此类等离子体中产生的受激发和反应性物种。在过去十年，已经进行了HVCP的实验考察以研究该等离子体。
已经研究了将材料直接暴露于HVCP。特别相关的是将生物产品和污染物暴露于HVCP的研究，其中将生物产品密封在包装内并且在该包装内产生HVCP。在此类研究中，将所包装的食品例如农产品(produce)和其它材料在短时期内杀菌。包装内的产品与等离子体直接接触。由于包装被密封，等离子体中产生的反应性气体一直至它们衰变回它们的初始状态都保持与产品接触，未被稀释或分散，并且所包装的产品被保护而免于再污染，从而明显地延长产品例如水果和蔬菜的保质期。参见，例如，美国专利公布No.2013/0189156和2014/0044595，两者均是Keener等人的。
臭氧气体已经被公认为消毒剂，并且臭氧已经被用于处理表面以除去气味、例如烟雾气味。臭氧能够杀死病毒。例如，臭氧处理是许多水和废水处理设施的组成部分(Wolf,C.等人，“Proxies to monitor the inactivation of viruses by ozone in surfacewater and wastewater effluent”,Water Research,第166卷(2019))。臭氧还已经被处理产品例如水果(Brie,A.等人，“Inactivation of murine norovirus and hepatitis Avirus on fresh raspberries by gaseous ozone treatment”,Food Microbiol.,第70卷，第1-6页(2018))。这些处理使水和产品对于消费来说是安全的。
最近各种病毒性疾病的出现加上有限的有效疗法已经产生了对于开发可应对这些病毒性疾病的强效消毒方法和疗法的需求。尽管通过疫苗接种而在控制环境和人类病毒病原体方面取得了进展，但是需要新方法对这些新兴公共卫生威胁进行消毒。此类技术应适合于解除食品、空气、表面和水传播的病毒，从而防止它们在群体中感染和传播。
一些病毒可通过接触、大的呼吸道飞沫(droplet)和小的颗粒飞沫核(气溶胶)、和甚至从被污染表面而传播。实验研究已经表明，流感病毒可在小颗粒气溶胶中保持感染性，并且可跨越房间传播(Cowling BJ等人,“Aerosol transmission is an important modeof influenza A virus spread.”Nat Commun.,4,1935(2013))。冠状病毒和轮状病毒可通过与被污染表面的接触而传播。麻疹类似地是触染性的。
用于解除可存在于表面上的病毒的当前技术包括喷洒液体消毒剂以解除可存在的任何病毒。负责喷洒消毒剂的人员必须穿防护服，以保护他们自己不被感染或污染。
臭氧已经被用作病毒净化剂(Hudson JB等人,“Development of a PracticalMethod for Using Ozone Gas as a Virus Decontaminating Agent”Ozone:Science&Engineering,31,216(2009))。使用20-25ppm臭氧气体进行各种表面的处理以除去病毒。一些净化是在环境条件下实现的，但是当将臭氧气体加湿至大于90％相对湿度时，实现了大得多的效果。描述包含如下的原型装置：8个电晕放电单元、一个循环风扇、和一个用于在处理之后将臭氧转化回氧气的催化转化器。
发明内容
在第一方面中，本发明为一种对疑似被病毒污染的表面进行消毒的方法，其包括通过用电介质阻挡放电(DBD)系统在20kV-150kV的电压下由工作气体形成高电压冷等离子体(HVCP)而产生反应性气体；将反应性气体从HVCP运输至少1米远；之后使表面与反应性气体接触以对表面进行消毒。被病毒感染的宿主已经接触了所述表面。
在第二方面中，本发明为一种对被病毒污染的表面进行消毒的方法，其包括通过用电介质阻挡放电(DBD)系统在20kV-150kV的电压下由工作气体形成高电压冷等离子体(HVCP)而产生反应性气体；将反应性气体从HVCP运输至少1米远；之后使表面与反应性气体接触以对表面进行消毒。被病毒感染的宿主已经接触了所述表面。
定义
本文中描述的所有电势均以伏(V)和千伏(kV)均方根(RMS)表示，并且电力来源于交流电。气体组成百分比(％)为体积百分比。
冷等离子体指的是如下等离子体：其具有比用于制备所述等离子体的气体(即，工作气体)的温度高至多40℃的温度，更优选地比用于制备所述等离子体的气体的温度高至多20℃的温度。
高电压冷等离子体(HVCP)意指使用电介质阻挡放电(DBD)系统、使用具有至多500kV、具有至多至5000Hz的频率的电压制备，由具有10-50000托例如760托的压力(大气压)的气体制备的冷等离子体。HVCP不是热等离子体，不是微波等离子体并且不是射频(RF)等离子体。HVCP等离子体是在非平衡击穿条件下生成的。
反应性气体意指通过HVCP产生的气体，包括激发态并且化学反应性的物种，但是不包括在0.2秒或更短内耗散的那些物种。随着激发态物种耗散并且反应性气体内的反应发生，反应性气体的组成将随时间推移而变化。反应性气体是可被从正产生HVCP的DBD系统移出的气体。如果反应性物种或激发态物种可使用光谱学检测到，则其被认为存在于反应性气体中。
电介质阻挡放电(DBD)、或DBD系统意指具有至少两个被电介质阻挡物隔开的电极的系统，并且可具有更多电极，其中在各电极之间存在电介质阻挡物以防止通过放电而在所述气体中生成的电荷到达电极。DBD系统中的相邻电极之间的最短距离优选为至多30cm(或12英寸)、且优选为至少0.5cm(或0.25英寸)。优选地，DBD系统配置成在产生HVCP的条件下操作。DBD系统的实例示于图1A、1B、1C、1D、1E和1F中；优选地，电极被直接在电极之间的间隙或增压室(plenum)间隔开，如图1A、1B、1C和1F中所示。
工作气体和工作气体混合物指的是用于形成等离子体的气体。
包装意指具有至多6加仑(或22.7升)的容积的容器。
密封的或基本上密封的意指，包装或容器内部的气体如果不受干扰的话，保持在内部并且未从包装或容器流出或扩散出达至少24小时。
术语“消毒”意指病毒已经被毁灭和/或存在的任何病毒无法再引起疾病。
“宿主”意指病毒在其中引起疾病的人类、动物、或植物，或者在细菌中，病毒引起细菌的溶菌。
短语“被病毒污染的表面”意指在表面上存在病毒。
短语“疑似污染的表面”意指被病毒感染的宿主已经接触该表面。
短语“与表面接触”包括物理接触，以及将表面暴露于大的呼吸道飞沫、小的颗粒飞沫核(气溶胶)、或者其它的病毒脱落。
为了确定处理对于对表面进行消毒的效力，可使用以下协议。所述协议可被称作“MS2噬菌体菌斑鉴定测试”。通过提供MS2噬菌体样品作为其它病毒的替代物，并且将样品处理以测量由该处理导致的MS2噬菌体减少量，该协议可用于验证处理对于减少病毒量的效力。协议包括将经处理的MS2噬菌体样品与用作对照的未经处理的MS2噬菌体样品比较。首先，将含有MS2噬菌体的溶液点在若干无菌滤纸的表面上。在实验处理之前，允许滤纸干燥并且将其在清洁容器中在4℃下放置。然后，将经处理的滤纸用反应性气体(或其它消毒处理)处理。将未经处理的滤纸存储并且不暴露于任何处理以充当对照。在处理之后，将经处理的滤纸置于无菌塑料容器中并且在冷冻冷却器中运输至实验室以使用SM缓冲液提取(对于具体的SM缓冲液配方，参见下表7)。为了提取，将经处理和未经处理的纸无菌地切成0.5cm宽的条，将所述条堆叠并且随后切割置于50ml无菌管中。将SM缓冲液(5mL)添加到各管中并且进行噬菌体的提取达10分钟的时期。在刚添加所述缓冲液之后并且在该10分钟期间每隔2分钟，将各样品轻轻地脉冲涡旋15秒。之后，将管在4℃下以5000rpm离心。然后将含有残余噬菌体的上清液通过0.22μM尼龙注射器式过滤器过滤到15ml无菌管中。将该上清液添加至宿主大肠杆菌培养物。进行经处理和未经处理的滤纸提取物的若干次稀释并且使用TSB顶部琼脂和底部琼脂板通过菌斑鉴定而测定所回收噬菌体的浓度。可能需要进行更多次稀释来获得产生合适数量菌斑的噬菌体浓度。将0.15ml的3小时细菌培养物在TSB中1:5稀释并且添加至通过水浴保持为42-45℃的3ml的熔融的顶部/软琼脂，之后添加15μl的经稀释的MS2噬菌体提取物。然后将混合物轻轻地涡旋，倾倒在底部琼脂板上，并且允许其凝固。然后将所述板上下倒置地在37℃培育箱中培育过夜。第二天，对所述板上的所形成菌斑(清亮区域)进行计数并且将结果制成表格。大肠杆菌培养是通过如下开始的：将10ml的TSB肉汤用100μl大肠杆菌悬浮液接种，并且使该细菌培养物在37℃培育箱中生长过夜。第二天，使用该过夜培养物开始另一新鲜的大肠杆菌培养。将1ml的该过夜培养物添加至9ml的新鲜TSB培养基(过夜培养物1:10稀释)并且以相同条件生长3小时。然后将该新鲜培养物在TSB培养基中1:5稀释并且用作细菌宿主。
2-log10减少意指，处理后表面上存在的活性病毒的量为处理前存在的活性病毒的量的1/100，如通过MS2菌斑鉴定测试而测定的；该测试不要求在处理之前实际存在感兴趣的病毒，但是却是所述处理的病毒杀死能力的量度。类似地，X-log10减少，其中X为3、4、5、或6，意指处理后表面上存在的活性病毒的量分别为处理前存在的病毒的量的1/1000、1/10,000、1/100,000和1/1,000,000。
附图说明
提供附图以帮助说明本申请的产品、装置(器械)和方法，但是其它变型和配置是可能的。附图不是按比例绘制的，为了清楚增大或减小了一些部分的尺寸。
图1A、1B、1C、1D、1E和1F为各种各样的DBD系统的示意图。
图2为用于将产品或表面用反应性气体连续处理的反应性气体处理系统的示意图。
图3为用于将产品或表面用反应性气体间歇处理的反应性气体处理系统的示意图。
图4为使用封闭空间来处理设备和/或表面的反应性气体处理系统的示意图。
图5为显示相对于大肠杆菌对照，对于各种数据集而言，MS2噬菌体对大肠杆菌生长率的影响的图。
图6为显示相对于大肠杆菌对照，对于各种数据集而言，MS2噬菌体对大肠杆菌生长率的影响的图。
图7为显示相对于大肠杆菌对照，对于各种数据集而言，MS2噬菌体对大肠杆菌生长率的影响的图。
图8为在暴露于阴性对照、阳性对照和经RGS处理的寨卡病毒的滤纸提取物之后宿主细胞计数的图。
图9为暴露于来自未经处理(阳性对照，T＝0)和经RGS处理的寨卡病毒的滤纸提取物的Vero细胞各自三个孔的一组显微照片图像。照片上的点状物为由于寨卡病毒的细胞病变效应而改变的Vero细胞。
图10为显示使用RGS情况下细菌噬菌体SBA 1781的减活的图。
图11为显示与未经处理的(T＝0)MS2噬菌体相比，在暴露于RGS 1小时之后MS2噬菌体的减活的图。
图12为显示与未经处理的(T＝0)MS2噬菌体相比，在暴露于RGS 3小时之后MS2噬菌体的减活的图。
图13为显示萎缩芽孢杆菌(B.atrophaeus)孢子随着暴露时间的减少量的图。
图14为显示对于高流量系统(橙色)和标准流量系统(蓝色)而言，萎缩芽孢杆菌孢子随着暴露时间的减少量的图。
图15为显示对于高流量系统(橙色)和标准流量系统(蓝色)而言，孢子随着暴露时间的log减少量的图。
图16为显示对于高流量系统(橙色)和标准流量系统(蓝色)而言，随着暴露时间的萎缩芽孢杆菌孢子的种群的图。
图17为显示对于空气减少(橙色)和反应性气体物种减少(蓝色)而言，肠沙门氏菌(S.enterica)细胞随着暴露时间的减少量的图。
图18为显示对于空气减少(橙色)和反应性气体物种减少(蓝色)而言，肠沙门氏菌细胞随着暴露时间的减少量的图。
图19为显示对于各种初始种群而言，大肠杆菌种群的log减少量的图。
图20为显示对于各种初始种群而言，作为初始种群对最终种群的比率的大肠杆菌种群减少量的图。
图21为显示提高大肠杆菌种群密度的减少量的图。
图22为显示提高大肠杆菌种群密度的log减少量的图。
图23为显示对于具有过氧化物效应的四个种群而言，在实验条件的可计数范围内，总反应性气体物种减少量和残余过氧化物减少量的图。
具体实施方式
本发明利用HVCP所产生的反应性气体。反应性气体即使在从其中产生等离子体的DBD系统运输显著距离例如3-30米(或者10-100英尺)时也能够对表面进行消毒。而且，反应性气体能够解除病毒。这是相当令人惊讶的，因为不同于在包装内产生的HVCP，产品未直接暴露于HVCP，反应性气体与产品的接触时间是有限的，例如1秒、1分钟、30分钟、或1小时。优选地，等离子体未接触该表面。而且，由于反应性气体是从其中产生HVCP的DBD系统运输出去的，因此其通过扩散到周围气体中以及与周围气体和/或工作气体混合而被稀释。由于反应性气体是从DBD系统运输出去的，因此可处理更大的表面。此外，也可进行大规模消毒例如交通工具或房间的消毒。此外，预期反应性气体的效力大于由单独的臭氧内容物所预期的效力。
环境保护署(EPA)以及疾病控制和预防中心(CDC)认识到，可以将病毒针对它们对消毒剂的耐受性而排名(EPA,“Guidance to Registrants:Process for Making ClaimsAgainst EmergingViral Pathogens Not on EPA-Registered Disinfectant Labels”,2016年8月19日公布)。使用该方法，病毒被划分成三个亚组：小型非包膜病毒、大型非包膜病毒和包膜病毒。根据该等级体系，如果消毒剂能够杀死小型非包膜病毒，其应该能够杀死任何大型非包膜病毒和任何包膜病毒。类似地，能够杀死大型非包膜病毒的消毒剂能够杀死任何包膜病毒。本申请的反应性气体杀死MS2噬菌体病毒，如实施例1和4所示。MS2噬菌体是小型非包膜病毒。由于杀死该病毒是最具挑战性的，因此预期反应性气体也杀死来自其它亚组的任何病毒。该预期被寨卡病毒和肠沙门氏菌噬菌体的杀死所证实，如实施例2和3中分别所示的。类似地，冠状病毒被归类为包膜病毒，因此如果在用反应性气体处理之前存在冠状病毒，预期反应性气体杀死冠状病毒和对表面进行消毒。
当反应性气体接触表面时，如果存在病毒，其对表面进行消毒。就病毒活性而言减少量可至少为2-log10减少量、3-log10减少量、4-log10减少量、5-log10减少量、或6-log10减少量。可使用MS2噬菌体菌斑鉴定测试来测定消毒的效力。该测试不要求在处理之前实际存在感兴趣的病毒，但是却是所述处理的病毒杀死能力的量度。病毒量的检测也可使用经典分析测试技术例如ELISA或显微测定来进行。可增加与反应性气体接触的持续时间来进一步减少活性病毒的量。还可重复表面与反应性气体的接触以进一步降低病毒的活性。
病毒可为DNA病毒或RNA病毒。所述DNA或RNA病毒可进一步分类为单链的(ss)、双链的(ds)、线性的和/或环状的。整个病毒基因组可占据一个核酸分子(单分基因组)或数个核酸链段(多分基因组)。不同类型的基因组需要不同的复制策略。
病毒可通过通常病毒名或者由病毒引起的疾病来识别。病毒也可通过病毒所源自的或者病毒是其中所特有的(endemic)生物来识别。理解，本文中所识别的通常病毒名可指的是具有类似特性或者和与通常病毒名相关联的病毒在遗传上相关的各种病毒毒株。
病毒可为DNA病毒，例如来自如下的DNA病毒科的病毒：非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)(例如非洲猪瘟病毒(ASF))；腺病毒科(Adenoviridae)(例如腺病毒和犬感染性肝炎病毒)；乳多空病毒科(Papovaviridae)(例如乳头状瘤病毒、多瘤病毒科(polyomaviridae)、和猿猴空泡病毒)；细小病毒科(Parvoviridae)(例如细小病毒B19和犬细小病毒)；疱疹病毒科(Herpesviridae)(例如单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒(也称作水痘病毒)、巨细胞病毒、和爱泼斯坦-巴尔病毒)；痘病毒科(Poxviridae)(例如天花病毒、牛痘病毒、绵羊痘病毒、口疮病毒、猴痘病毒、和痘苗病毒)；指环病毒科(Anelloviridae)(例如细环病毒)；或嗜盐菌多形病毒科(Pleolipoviridae)(例如HHPV1、HRPV1、HGPV1、和His2V)。
病毒可为RNA病毒，例如来自如下的RNA病毒科的病毒：呼肠孤病毒科(Reoviridae)(例如呼肠孤病毒和轮状病毒(也称作轮样病毒))；微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)(例如肠病毒、鼻病毒、肝病毒、心脏病毒、口蹄疫病毒、脊髓灰质炎病毒、副肠孤病毒、马鼻炎病毒、嵴病毒、捷申病毒、和柯萨奇病毒)；杯状病毒科(Caliciviridae)(例如诺瓦克病毒)；披膜病毒科(Togaviridae)(例如风疹病毒和甲病毒)；沙粒病毒科(Arenaviridae)(例如淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒)；黄病毒科(Flaviviridae)(例如登革病毒、丙型肝炎病毒、黄热病病毒、和寨卡病毒)；正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如流感病毒、感染性鲑鱼贫血病毒、和索戈托病毒)；副粘病毒科(Paramyxoviridae)(例如麻疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞病毒、牛瘟病毒、和犬瘟热病毒)；布尼亚病毒科(Bunyaviridae)(例如加利福尼亚脑炎病毒和汉坦病毒)；弹状病毒科(Rhabdoviridae)(例如狂犬病病毒)；丝状病毒科(Filoviridae)(例如埃博拉病毒和马尔堡病毒)；冠状病毒科(Coronaviridae)(例如冠状病毒)；星状病毒科(Astroviridae)(例如星状病毒)；博尔纳病毒科(Bornaviridae)(例如博尔纳病毒)；动脉炎病毒科(Arteriviridae)(例如动脉炎病毒和马动脉炎病毒)；或肝炎病毒科(Hepeviridae)(例如戊型肝炎病毒)。
轮状病毒的实例包括A、B、C、D、E、F、G、H、I或J轮状病毒。冠状病毒的实例包括中东呼吸综合征冠状病毒(MERS)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS)、和COVID-19病毒，以及引起感冒的冠状病毒。引起COVID-19的病毒也称作严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)。动脉炎病毒的一个实例为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)。
流感病毒的实例包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、和丙型流感病毒。流感病毒变体有时根据毒株为其中所特有的或者其所适应的物种(宿主)命名。例如，流感病毒可称作鸟流感(也称作禽流感)、猪流感、人流感、马流感、和犬流感。甲型流感病毒物种可进一步通过两组蛋白的组合而分类：血凝素或“H”蛋白和神经氨酸酶或“N”蛋白("Influenza Type AViruses".Centers for Disease Control and Prevention。https://www.cdc.gov/flu/avianflu/influenza-a-virus-subtypes.htm。2017年4月19日最后审核，2020年3月12日访问)。甲型流感病毒的不同血清型的实例包括H1N1、H1N2、H2N2、H3N1、H3N2、H3N8、H5N1、H5N2、H5N3、H5N8、H5N9、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N7、H7N9、H9N2、H10N7。
病毒可为来自如下的病毒科的逆转录病毒：逆转录病毒科(Retroviridae)(例如人类免疫缺陷病毒(HIV))；花椰菜花叶病毒科(Caulimoviridae)(例如花椰菜花叶病毒、和可可肿枝病毒)；或嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)(例如乙型肝炎病毒)。
病毒可存在于产品或表面上，或者可存在于空气中。反应性气体可解除以气溶胶飞沫或更大飞沫存在于空气中的病毒。反应性气体可接触人造结构体的内表面。人造结构体可为交通工具例如飞机、火车、或汽车。人造结构体可为房间或过道。房间可为医院中的房间或游轮舱室。房间可为宾馆中的一间房间或多间房间。房间可为办公室或会议场所。房间可为剧院或运动场。
图1A、1B、1C、1D、1E和1F为可用于产生HVCP的各种各样的DBD系统的示意图，所述HVCP产生反应性气体。DBD系统包括生成交流电的接地的高(电)压源10、第一电极20、第二电极30、和中间电介质40。在第一和第二电极之间还可存在一个或多个另外的中间电介质60。在一些配置中电介质可包围第一和/或第二电极。在一些配置中，与电压波形一道使用的在电极上的电荷积聚可用于估计DBD系统的功率消耗，并且可通过测定跨越常规电容器或其它传感器70所显现的电压而测量。优选地，存在增压室50，其限定在电极之间的其中产生HVCP和反应性气体的空间，如图1A、1B、1C和1F中所示。然而，即使在DBD系统中不存在明显的增压室(例如图1D和1E中所示)时在电介质附近也可产生HVCP和反应性气体。在一些配置中，可使用多个电极例如3-21个电极、11-15、4-8个电极、或者5-7个电极，并且在每对相邻电极之间具有一个或多个中间电介质，并且任选地形成多个增压室，例如图1F中所示的(其中可使用框架80来保持各电极-电介质组件(例如40、20、和40)以限定各增压室(50))；此类布置允许在维持电极之间的合适距离并且保持系统紧凑的同时产生更大量的HVCP并且因此产生反应性气体。DBD系统的该配置导致限制了在电极之间形成的任何丝状放电的电流以防止形成高电流电弧。在一种优选布置中，第一电极被完全围封在电介质中，并且第二电极接地。
电极可由任何导电材料例如金属形成。电介质可由任何绝缘材料(电介质材料)例如陶瓷、玻璃、有机材料、或塑料(包括各种组成的多层体)形成。电介质的或电介质的不同层的厚度应被选择成限制可在电极之间形成的任何丝状放电的电流。用于电介质层的材料的选择可对反应性气体组成具有影响。
当电极平行时相邻电极之间的距离，或者当电极不平行时相邻电极之间的最短距离优选为至多30cm(或12英寸)，和优选为至少0.5cm(或0.25英寸)，例如1-10cm、或2.5-6cm(或1-2英寸)，包括2、3、4、5、6、7、8和9cm。该高电压源产生如下的电压：其为至多500kV、更优选地20kV-150kV，包括30、40、50、60、70、80、90、95、100、110、120、130和140kV；具有至多5000Hz、更优选地10-100Hz例如50-60Hz的频率。也可使用时变(即，脉冲化的)DC电源。虽然该频率主要是为了方便而选择的(例如，50或60Hz的AC电源可得自市政电网)，但是选择电压以保证HVCP的产生。
电极系统和/或电介质阻挡放电系统的结构可为美国专利申请No.16/442,380中描述的系统。
工作气体和工作气体混合物的不同选择将影响通过HVCP产生的反应性气体中存在的物种。可用于制备HVCP的气体的实例包括氧气(O2)；氮气(N2)；水蒸气(H2O)；惰性和稀有气体例如氦(He)、氖(Ne)、氩(Ar)、氪(Kr)、氙(Xe)和六氟化硫(SF6)；氢气(H2)；二氧化碳(CO2)和一氧化碳(CO)；卤素和拟卤素例如氟(F2)、氯(Cl2)、溴(Br2)、和氰((CN)2)；酸性气体例如硫化氢(H2S)、氟化氢(HF)、氯化氢(HCl)、和硫化羰(COS)；氨(NH3)；肼(H4N2)；三氟化氮(NF3)；二氧化氯(ClO2)；烃例如甲烷(CH4)、乙烷(C2H6)和乙炔(H2C2)；醇例如甲醇(CH3OH)和乙醇(C2H5OH)；及其混合物。优选的气体包括空气和MA65(65％O2、30％CO2、和5％N2的混合物)。提高该气体中的水蒸气的量可用于减少反应性气体中存在的臭氧。提高稀有气体例如氦的量可用于降低产生HVCP所需要的电压。用于制备HVCP的气体的压力被方便地选择成环境压力或大气压力，但是可使用其它压力例如10-50000托、更优选地100-1000托例如760托(大气压)。
反应性气体含有各种各样的反应性和激发态的物种，并且反应性气体总是含有至少一种(和典型地超过一种)不存在于工作气体中的反应性和/或激发态的物种。当工作气体含有氧(例如，O2、CO2、和/或H2O)时，可形成臭氧；然而，反应性气体的性质和反应是通过臭氧的单独存在解释不了的，并且除了任何臭氧(其可存在或者可不存在于反应性气体中)之外，反应性气体还总是含有其它反应性和激发态的物种。除了臭氧之外，可存在于反应性气体中的其它反应性和激发态的物种还包括：单线态氧(1O2)和其它激发态的分子物种(被振动激发的分子和被电子激发的原子和/或分子两者，例如O2、H2、N2、CO、CO2、H2O、He、Ne、Ar、Kr、和Xe)、羟基自由基(HO·)、氮的氧化物(例如N2O、NO、NO2、NO3、N2O3、N2O4和N2O5)、过氧化氢(H2O2)、氢过氧基(HO2)、HNOx物种(例如HNO4、HNO3和HNO)、原子自由基(例如O、F、Cl、N和H)、和分子自由基(例如烃自由基，其还可含有如下的一种或多种：氧、氮、氟和氯)。优选地，除了臭氧和NO2(或N2O4)(其可存在或可不存在)之外，反应性气体还具有至少一种另外的反应性和/或激发态的物种。不同于HVCP，反应性气体不是等离子体并且不含有自由电子。优选地，反应性气体含有至少2种不同的以上列出的反应性和/或激发态的物种、更优选地至少3种不同的以上列出的反应性和/或激发态的物种、甚至更优选地至少4种不同的以上列出的反应性和/或激发态的物种、和最更优选地至少5种不同的以上列出的反应性和/或激发态的物种，包括2-10或3-8或4-6种不同的以上列出的反应性和/或激发态的物种。
也可将反应性气体捕获和存储在容器中用于后续使用。优选地，所存储的反应性气体在其产生之后24小时内、更优选地12小时内、最更优选地6、甚至更优选地3小时内被用于处理产品或表面。
也可通过冷却至极低温，例如使用液氮作为冷却剂、或者使用液氦作为冷却剂来捕获和存储反应性气体。当在这样低的温度下捕获和存储时，反应性气体可被存储达延长的时间，例如1天-6星期、并且可能更长。可使用用于存储其它液化或凝固的气体的容器例如玻璃或金属容器。
反应性气体处理系统包括DBD系统或所存储的反应性气体，和处理腔室。反应性气体处理系统还包括用于将反应性气体从DBD系统(其产生HVCP，HVCP进而产生反应性气体)或从已经存储有反应性气体的容器移出并且进入到处理腔室中或遍及处理腔室的装置、机构、或配置；这可为DBD系统和处理腔室之间的流体连接。优选地，处理腔室未被密封；此类未被密封的腔室将包括具有气体出口的处理腔室。优选地，处理腔室具有至少28升(或1立方英尺)的容积，更优选地至少1立方米、和甚至更优选地至少8立方米的容积。处理腔室的实例包括房间、仓室、谷物干燥器、筒仓、储罐和运输集装箱。
可使用反应性气体系统来进行通过如下处理产品和/或表面的方法：(从所存储的反应性气体，或者通过使用DBD系统生成HVCP)供应反应性气体，并且将反应性气体分布到处理腔室中或者遍及处理腔室分布。用于移动反应性气体的装置、机构、或配置的实例包括对流、气体路径或气体管线、风扇，以及将流动或被加压的工作气体供应至DBD系统。优选地，被反应性气体处理的产品或表面未因该处理方法而被加热了(即，其温度未升高了)超过40℃、更优选地不超过20℃、甚至更优选地不超过10℃、和最更优选地不超过5℃，例如未加热产品或表面。用反应性气体处理是非热处理方法。优选地，产品或表面在该方法期间未暴露于HVCP所产生的辐射(例如UV光)。任选地，可使用空气、工作气体、或另外的气体(例如稀有气体或氮气)将反应性气体从处理腔室逐出，或者可将处理腔室抽真空。该方法可任选地重复1、2、3或更多次，以对产品或表面提供多次处理。任选地，产品在用反应性气体处理之后可被密封到容器中和/或被制冷。优选地，待处理产品在处理期间未被围封在密封或基本上密封的容器中，例如容器具有至多10加仑、或至多6加仑的容积。优选地，HVCP不是在密封容器内产生的，例如容器具有至多10加仑、或至多6加仑的容积。
通过扩散或气体输送(转移)，将通过HVCP产生的反应性气体从HVCP的产生场所运输走(以避免产品或表面直接暴露于HVCP)。优选地，等离子体和待处理产品或表面之间的距离至少为5cm，例如至少10cm、至少50cm、和至少1米(或3.28英尺)、更优选地至少3米、例如3-300米(包括5、10、20、30、40和50米)的距离。在大多数配置中，允许反应性气体在其与待处理产品或表面接触的同时流动，虽然也可产生反应性气体并且将其转移至处理产品或表面的场所，并且将所述气体限制于该处理位置达一段时期。用于将反应性气体输送至用于与产品或表面接触的位置的流速的实例包括10-3000米/分钟、30-2500米/分钟、和1000-2000米/分钟，例如50、100、200、300、400、500、750、和1500米/分钟。允许反应性气体与产品或表面接触至少1秒，例如至少2秒、至少10秒、至少30秒、至少1分钟、至少10分钟、至少30分钟、至少35分钟、至少1小时、至少6小时、或至少12小时。接触时间的实例包括1秒-12小时、10秒-1小时、1分钟-35分钟，包括5秒、15秒、2分钟、5分钟、20分钟、35分钟、40分钟、2小时、3小时、4小时和5小时。
图2为用于将产品或表面用反应性气体连续处理的反应性气体处理系统200的示意图。该系统包括用于生成HVCP以产生反应性气体210的DBD系统206。反应性气体沿着气体路径208流入到处理腔室216中，然后从气体出口222流出。在将待处理或者具有待处理表面的产品214进料到处理腔室中和传送机218上时，可将其存储在料斗212中，传送机218使产品移动通过处理腔室并且进入到接收仓室220中以将产品在其已经与反应性气体接触之后存放。还示出了：气体源202例如气体储罐，其提供HVCP由其形成的工作气体；和气体管线204，其向DBD系统供应工作气体。在反应性气体流动通过该系统时，可其将用另外的工作气体稀释。反应性气体从DBD系统向处理腔室的运输是通过DBD系统(由于工作气体的引入而处于较高压力)和处理腔室(由于气体出口而处于较低压力下)之间的压力差。任选地，气体出口可通过第二气体管线连接回DBD系统，从而允许工作气体和任何剩余反应性气体的再循环。任选地，DBD系统可位于处理腔室内，从而避免对气体路径的需要。在一种变型中，工作气体可为空气，并且反应性气体的运输可由位于气体路径中(将反应性气体吹送到处理腔室中)或者DBD系统的背后(将空气吹送通过DBD系统)的风扇引起。任选地，传送机可在筛网上运输产品以保证反应性气体与产品的所有表面进行接触。此外，可将产品在多个传送机上移动通过处理腔室，其中在产品从第一传送机移动至第二传送机时使产品转身，从而保证反应性气体与产品的所有表面接触。在另一变型中，通过使用所存储的反应性气体作为气体源并且将反应性气体直接运输到处理腔室中，可消除DBD系统。可使用各种各样的不同传送机，例如渗透性的带式传送机、螺杆、隧道式干燥器、谷物干燥器、流化床干燥器或滚筒式干燥器。
图3为用于将产品或表面用反应性气体间歇处理的反应性气体处理系统300的示意图。该系统包括用于生成HVCP以产生反应性气体的DBD系统306。反应性气体沿着气体路径308和312流入到处理腔室302中，然后通过气体路径316、通过任选的产品回收阱318、沿着气体路径320流出和通过气体出口324流出。反应性气体和工作气体的一些或全部可通过任选的气体路径304被再循环回DBD系统。反应性气体和工作气体由风扇310和322推动通过该系统。待处理或者具有待处理表面的产品314存在于处理腔室中；如所示的，将反应性气体通过处理腔室的底部进料进入以由反应性气体和产品产生流化床以保证产品的所有表面的处理。产品回收阱可用于捕获离开处理腔室并且进入到气体路径中的任何产品并且将其返回至处理腔室。在所示的系统中处理腔室可为筒仓；其它处理腔室包括流化床、机械流化床、和仓室。在反应性气体流动通过该系统时，可将其用另外的工作气体稀释。如所示的，工作气体可为空气，但是任选地，气体路径304可连接至用于将工作气体供应至DBD系统的气体源。在另一变型中，DBD系统可被消除并且用所存储的反应性气体代替。
产品的实例包括新鲜食品(例如水果、蔬菜、谷物、豆类、种子、肉、乳产品、蛋、和香味料或调味品)、海鲜(鱼和贝类、及其部分)、预制食品、冷冻食品、包装前的加工食品(水、饮料、婴儿食品、液体蛋、果汁、面粉、油、营养产品、维生素、保健品和烘焙食品)、包装产品(用于包装外部的处理)、动物饲料、罐头、瓶子、塑料容器、食品容器、炊具和用具；药丸、胶囊、单位剂型和粉末；使用前和使用后两种情况下的医疗器械和医疗设备；实验室玻璃和塑料器具；陶瓷产品；金属产品；以及皮革和木产品。
如果通过用反应性气体处理，未完成消毒，则可进行相继的处理。例如，可进行1-10次处理，或者可进行2-9次处理，包括3、4、5、6、7或8次处理。类似地，也可延长处理的时间。
图4为使用封闭空间例如房间、运输集装箱、拖车或冷藏卡车来处理设备和/或表面的反应性气体处理系统的示意图。在处理腔室400(其在此为封闭空间)内的为用于生成HVCP以产生反应性气体408的DBD系统406。使用风扇410来使反应性气体遍及封闭空间分布。还示出了待处理产品或表面，其包括待用反应性气体处理的封闭空间的壁或内表面、任选的设备414例如医疗设备(例如，手术器械、面罩、辅助呼吸设备和生命体征监测器)、和/或任选的表面412例如手术台。任选地，可使用支撑物402来将DBD系统安装至封闭空间的顶部或侧面，或者可将DBD系统放置在封闭空间的地板上。任选地，工作气体供应可由连接至气体供应(未示出)的气体管线404供应。替代地，封闭空间可用工作气体填充。在另一配置中，DBD系统可用所存储的反应性气体代替。
实施例
以下实施例为显示反应性气体的效果和性质的测试系统，其中使用HVCP来产生反应性气体。在典型的系统中，规模将增加以实现商业上显著量产品的处理。所有HVCP是使用60Hz的功率产生的。
实施例1：反应性气体对病毒活性和灭活的影响：使用MS2细菌噬菌体模型来筛选反应性气体作为抗病毒剂的效力
该实施例描述了针对关于杀死病毒的效力，将运输21英尺(640cm)的反应性气体使用在MS2细菌噬菌体上。MS2细菌噬菌体为感染大肠埃希氏菌(大肠杆菌)和肠杆菌科的其它细菌成员的RNA病毒。由于大多数人类病毒病原体为RNA病毒，因此选择MS2细菌噬菌体(一种非人类病原体)作为用于病毒灭活的模型系统。MS2细菌噬菌体是用于人类病毒的常用模型(Kuzmanovic,D.A.等人,“Bacteriophage MS2:Molecular Weight and SpatialDistribution of the Protein and RNA Components by Small-Angle NeutronScattering and Virus Counting”,Structure,第11期,1339-1348(2003))。
生长宿主细菌培养物：
该研究中使用的MS2细菌噬菌体宿主为大肠埃希氏菌(大肠杆菌，菌株K-12，ATCC15597)。在其原始小瓶中的大肠杆菌(ATCC 15597购自American Type CultureCollection(ATCC)(Manassas,VA)并且通过添加1ml新鲜肉汤培养基(在去离子水中1％胰蛋白胨、0.1％酵母提取物、和0.8％NaCl)而重建。将重建的培养物(100μl)从小瓶取出并且用于在培养瓶中接种30ml相同的肉汤培养基并且在热培育箱中在37℃下生长过夜。然后将所得大肠杆菌培养物用于MS2细菌噬菌体的增殖和筛选试验。
MS2细菌噬菌体增殖
将细菌噬菌体MS2(ATCC 15597-B1)根据ATCC程序在不使用软/顶部琼脂覆盖物的情况下在其细菌宿主细胞大肠杆菌(菌株K-12，ATCC 15597)中增殖。如上所述将宿主细菌培养细胞在肉汤中在37℃下生长过夜。随后，将1.0ml宿主细菌细胞悬浮液添加至琼脂板的表面并且轻轻地倾斜以保证整个表面被宿主细菌细胞覆盖。然后从琼脂板吸出过量的液体并且允许板干燥。将MS2噬菌体悬浮液在肉汤中不同稀释的溶液点在琼脂板的表面上并且在37℃下培育过夜。在过夜生长之后，将5ml的SM缓冲液添加至各琼脂板并且在定期轻轻摇动的情况下在4℃下存储3小时。收集SM缓冲悬浮液并且将其转移到50ml聚丙烯管中并且将新鲜SM缓冲液(5ml/板)添加到各板中，之后在4℃下在定期悬浮的情况下进一步培育15分钟。收集缓冲液并且将其与在所述50ml管中的之前的缓冲液合并在一起并且将板丢弃。将合并的SM缓冲液-MS2噬菌体悬浮液在4℃下以5000x g离心15分钟，以使细胞碎片和琼脂碎块沉降，并且收集上清液。使所得上清液通过0.22μM Millipore过滤器以除去宿主细菌细胞，并且将含有所回收MS2噬菌体的滤液在4℃下存储供实验使用。
MS2噬菌体的反应性气体减活
为了用反应性气体使MS2病毒减活，将1ml过滤的MS2噬菌体上清液点在购自General Electric Company(GE Healthcare Life Sciences,Pittsburgh,PA)的圆形Whatman滤纸(直径90mm)上。然后将滤纸通过蒸发而干燥，然后暴露于使用DBD系统在76kV的电压下产生的运输21英尺(640cm)的反应性气体30-90分钟。产生等离子体的装置的电极间隙为1.5英寸。在反应性气体处理之后，将纸切割而置于15ml无菌管中并且从切割的滤纸碎块通过用5ml/管的SM缓冲液提取而回收MS2病毒。通过使用透明96孔平底板(购自Midwest Scientific(MidSci),St.Louis,MO)和宿主细菌培养物(大肠杆菌)的高通量筛选而测定纸提取物中的病毒活性。简单来说，将生长过夜的大肠杆菌培养物在营养肉汤中稀释至1000个细胞/ml悬浮液的细胞密度；并且等分到96孔板中(275μl/孔)。这之后立即添加25μl的MS2噬菌体纸提取物。然后将接种的96孔板在37℃下培育过夜并且过夜监测大肠杆菌生长动力学达24小时。在24小时结束时，取660nm处的光密度(OD)读数并且将其用于计算因反应性气体减活的MS2病毒引起的细菌生长逆转。阴性(单独的培养基肉汤)和阳性(单独的细菌培养物)对照也在相同的板中运行并且进而被用于计算因MS2噬菌体引起的细菌生长抑制。将反应性气体未处理的和处理的MS2噬菌体两者与阳性对照孔比较并且对于所有经等离子体处理的病毒计算大肠杆菌的生长百分比。
通过如下测定由从对照滤纸提取物(反应性气体未处理)和反应性气体暴露的MS2噬菌体纸提取物回收的MS2噬菌体引起的细菌生长抑制百分比：将它们分别的细菌生长与阳性对照孔(没有MS2噬菌体暴露的孔)的细菌生长比较。该研究的结果描绘于下。
结果：
此处呈现的表格数据来自在不同日期进行的两个独立实验。如由这些结果所展现的，在所研究的所有暴露时间内，将MS2噬菌体暴露于反应性气体使病毒显著地减活并且逆转其对其细菌宿主大肠杆菌的溶菌活性。如图5、6和7的图中所示，未经处理的MS2噬菌体使细菌生长减少50％。将病毒暴露于反应性气体30、60和90分钟分别以与将病毒暴露于反应性气体的持续时间成比例的线性方式逆转了该生长抑制。这表明，MS2噬菌体被反应性气体显著地减少或减活，从而允许其宿主细菌大肠杆菌正常生长(而不被病毒所溶菌)。在实验1(a)中，数据是在24小时终点处获得的。
1(a).实验1
处理 大肠杆菌对照 T＝0MS2 T＝30MS2 T＝60MS2 T＝90MS2
0.691 0.463 0.44 0.734 0.765
0.708 0.338 0.326 0.735 0.775
0.717 0.383 0.755 0.728 0.778
0.722 0.402 0.754 0.407 0.697
平均OD 660 0.705 0.397 0.569 0.651 0.754
大肠杆菌生长率(％) 100 56 81 92 107
汇总：
Figure BDA0003971684040000181
来自MS2-阴性、MS2-阳性、和MS2-RGS处理的大肠杆菌(宿主细胞)计数。实验1结果。
处理 ％活宿主细胞 ％宿主细胞死亡率 MS2噬菌体的％RGS减活(标准化的)
阴性对照 100 0 0
阳性对照 56 44* 100**
经RGS处理，T＝30 81 19* 56.81**
经RGS处理，T＝60 92 8* 81.81**
经RGS处理，T＝90 107 -7* 100**
*相对于阴性对照宿主细胞计数标准化。
**相对于阳性宿主细胞死亡率标准化。
2(a).实验2
反应性气体处理 大肠杆菌对照 T＝0MS2 T＝30MS2 T＝60MS2 T＝90MS2
0.708 0.409 0.693 0.433 0.723
0.717 0.239 0.676 0.419 0.729
0.722 0.332 0.723 0.778 0.72
0.715 0.723 0.743 0.739
平均OD660 0.716 0.327 0.704 0.593 0.728
大肠杆菌生长率(％) 100 46 98 83 102
汇总：
MS2反应性气体处理 大肠杆菌对照 T＝0MS2 T＝30MS2 T＝60MS2 T＝90MS2
大肠杆菌生长(％) 100 46 98 83 102
来自MS2-阴性、MS2-阳性、和MS2-RGS处理的大肠杆菌(宿主细胞)计数。实验2结果。
处理 ％活宿主细胞 ％宿主细胞死亡率 MS2噬菌体的％RGS减活(标准化的)
阴性对照 100 0 0
阳性对照 46 54* 100**
经RGS处理，T＝30 98 2* 96.30**
经RGS处理，T＝60 83 17* 68.52**
经RGS处理，T＝90 102 -2* 100**
*相对于阴性对照宿主细胞计数标准化。
**相对于阳性宿主细胞死亡率标准化。
实施例1的宿主细菌和MS2噬菌体的培养基和试剂。
大肠杆菌培养基制备：
(I)琼脂板
成分 1升 500mL
1.胰蛋白胨 10.0g 5.0g
2.酵母提取物 1.0g 0.5g
3.NaCl 8.0g 4.0g
4.琼脂 15.0g 7.5g
对于1升培养基体积添加950ml去离子水或者对于500ml培养基体积添加475ml去离子水。将培养基在121℃下高压灭菌，并且在无菌情况下，将溶液B添加至在高压灭菌并且冷却之后的培养基(即，对于1升体积添加50ml或者对于500ml体积添加25ml)。将培养基在凝固之前倾倒到100mm培养皿中(10ml/培养皿)。将该琼脂板在4℃下存储并且根据需要使用。
(II)溶液B：50ml或500ml
根据ATCC推荐制备溶液B：
Figure BDA0003971684040000191
将所得溶液通过经由0.22μM过滤而杀菌。
(III)营养肉汤
成分 1升 500ml
胰蛋白胨 10.0g 5.0g
酵母提取物 1.0g 0.5g
NaCl 8.0g 4.0g
在称取肉汤成分之后，如在琼脂板培养基中那样；对于1升培养基添加950ml去离子水或者对于500ml培养基添加475ml去离子水。将肉汤在121℃下高压灭菌并且在高压灭菌和冷却之后，在无菌情况下添加溶液B(对于1升体积添加50ml或者对于500ml肉汤添加25ml)。将肉汤培养基等分到无菌玻璃烧瓶中并且在室温下存储供将来使用。
(IV)顶部琼脂营养物
成分 1升 500ml
胰蛋白胨 10.0g 5.0g
酵母提取物 1.0g 0.5g
NaCl 8.0g 4.0g
琼脂 5.0g 2.5g
以与板琼脂培养基相同的方式制备软/顶部琼脂。称取一半的琼脂量到顶部琼脂培养基中(通常琼脂板培养基含有15g琼脂(1.5％w/v)和顶部琼脂5-7.5g琼脂(0.5-0.75％w/v)。在高压灭菌、冷却和添加溶液B之后，将该软培养基等分到无菌玻璃管中(4ml/管)并且在室温下存储以便将来需要时使用。
(V)MS2噬菌体悬浮液缓冲液(SM缓冲液)：SM缓冲液(1升)
5.8g NaCl(100mM)
2g MgSO4·7H2O(8mM)
50ml 1M Tris-Cl(pH 7.5)(50mM)
5ml 2％明胶
实施例2：使用寨卡病毒(ZIKV)评价反应性气体(RGS)作为抗病毒剂的效力
该实施例描述了针对关于杀死病毒的效力，将运输21英尺(640cm)的反应性气体用在寨卡病毒上。在该研究中，致力于测定RGS在减活寨卡病毒感染性方面的效力。该病毒是造成导致出生缺陷例如小头畸形的全球新兴病原体之一。像大多数新类别的病毒一样，寨卡病毒尚没有批准的疗法或疫苗并且对其活性具有抑制效果的任何抗病毒剂将是防止其感染的有用工具。在该初步研究中，我们测试了RGS是否适合作为用于将寨卡病毒减活的抗病毒剂。
材料和方法
宿主细胞、寨卡病毒、和试剂
用于寨卡病毒增殖和感染的Vero细胞(ATCC CCL-81)购自American TypeCulture Collection(ATCC,Manassas,VA)。寨卡病毒(ATCC VR-1843PQ，菌株PRVABC59)也购自ATCC。将细胞在高葡萄糖Dulbecco改良Eagles培养基(DMEM，得自ATCC)中生长并且补充10％热灭活的胎牛血清(FBS)、4mM L-谷氨酰胺、100μg/ml链霉素、100单位/ml盘尼西林、1mM丙酮酸钠和非必需氨基酸。将细胞在5％CO2加湿培育箱中在37℃下培养和维持。所有组织培养等级试剂和化学品得自ATCC或Millipore-Sigma(St.Louis,MO)和Thermo FisherScientific(Waltham,MA)。
寨卡病毒的增殖
将该研究中使用的寨卡病毒(菌株PR VABC59)通过如下增殖：将70％融合Vero细胞在T75组织培养瓶中在没有FBS的3ml DMEM培养基中接种2小时，感染倍数分别为0.01和0.025。然后添加20ml的具有10％FBS的新鲜DMEM培养基并且细胞在5％CO2加湿腔室中在37℃下培育。通过以光显微镜法观察而监测细胞病变效应(CPE)，其用作被寨卡病毒杀死的宿主细胞的量度。当Vero细胞由于CPE而显示70％或更多细胞死亡或脱离时，收获病毒。取出废培养基并且以3000rpm离心5分钟。使所得上清液通过0.22μM Millipore过滤器以除去宿主细胞残留物和任何污染性细菌。将含有寨卡病毒的滤液等分并且在-20℃下存储以用于将来的实验。
寨卡病毒的RGS减活
寨卡病毒(ZIKV PRVABC 59)的RGS减活根据既定协议(Muller等人，2016)进行。简而言之，将Whatman圆盘滤纸(90mm直径)用600μl寨卡病毒废培养基接种并且立即暴露于RGS。用于对照实验的滤纸仅用在用于病毒增殖的Dulbecco改良Eagles培养基(DMEM)中的宿主细胞接种(阴性对照)。将两组经接种的滤纸在80kV下用RGS处理(测试)45和90分钟(表4)，之后用无菌的磷酸盐缓冲的盐水(PBS，1X)进行病毒提取。未用RGS处理的一组经接种的滤纸充当阳性对照并且将其立即处理用于病毒提取。该实验一式两份进行。因此，有两组阴性对照滤纸(仅DMEM)、未经处理的两组寨卡接种的滤纸(阳性对照；T＝0分钟)、用RGS处理45分钟的两组寨卡接种的滤纸(测试，T＝45分钟)和用RGS处理90分钟的两组寨卡接种的滤纸(测试，T＝90分钟)。
从未经处理的(阳性对照)和经RGS处理的(测试)滤纸提取寨卡病毒
将未经处理的(T＝0)和经RGS处理的滤纸(T＝45和T＝90分钟)单独地用PBS(1X)提取。将暴露之前和之后的滤纸切割成小的碎块并且转移到50ml无菌锥形管中来提取。病毒的提取根据标准既定协议(Butot等人，2007)进行。简而言之，将10ml无菌PBS添加到含有所切割滤纸的各50ml锥形管中并且剧烈涡旋。将管在室温(RT)下在每隔3分钟间歇涡旋的情况下培育15分钟。然后将管以5000rpm离心5分钟以沉淀滤纸碎片，并且所得上清液通过0.22微米过滤器过滤。将滤液在4℃下存储，用于使用3-[4.5-二甲基-2-噻唑基]-2-5-二苯基-2H-四唑溴化物(MTT)细胞毒性生物鉴定进行寨卡病毒活性分析。
MTT生物鉴定或(3-[4.5-二甲基-2-噻唑基]-2-5-二苯基-2H-四唑溴化物细胞毒性生物鉴定
MTT鉴定是用于评价细胞代谢活性的比色鉴定。在限定的条件下，NAD(P)H依赖性细胞氧化还原酶可反映存在的存活细胞的数量。这些酶能够将四唑盐染料MTT 3-(4,5-二甲基噻唑-2基)-2,5-二苯基四唑溴化物还原为具有紫色颜色的其不溶性甲臜(formazan)。
将未经处理和经RGS处理的寨卡病毒滤液涂敷(plate)于在最终体积为200μl的DMEM中含有接种密度为6x103细胞/孔的Vero细胞的96孔组织培养板中。将培养物在具有恒定5％CO2的加湿腔室中在37℃下培育，直至具有T＝0滤液的孔显示出70％细胞死亡(CPE)。然后向各孔添加20μl无菌MTT(在PBS中5mg/ml)溶液并且将所述板在37℃下进一步培育3小时。通过将废DMEM培养基倒出而将其丢弃并且将板吸干。然后通过添加100μl的二甲基亚砜(DMSO)和乙醇的1:2混合物，将来自附着的Vero细胞的所得甲臜晶体溶解。通过如下测定所得甲臜晶体溶液的吸收：读取它在490nm处的光密度(OD)，其被相对于它的650nm读数校正(来自Molecular Device Instruments的Spectra Max 340PC板读取器)。由对于阴性寨卡病毒对照(没有病毒的孔)的和使用寨卡病毒(滤纸滤液)情况下的MTT溶液吸收读数，对于T＝45和T＝90分钟RGS处理，计算宿主细胞生长。结果汇总于下。
结果和讨论
针对寨卡病毒研究的结果
将阴性对照孔(没有病毒的Vero细胞)的细胞活力与暴露于寨卡病毒的滤纸提取物的来自时间点T＝0、45和90分钟的细胞的细胞活力进行比较。如所观察到的，未经处理的病毒提取物(T＝0)引起大约50％细胞死亡(毒性)，这是由于由活性病毒感染Vero细胞所产生的细胞病变效应(CPE)引起的(表4)。而来自经RGS处理的寨卡滤纸的病毒提取物由于因RGS处理使寨卡病毒减活而引起更少的Vero细胞死亡。与阴性对照(无寨卡)、阳性对照(未用RGS处理的寨卡)和两个经RGS处理的寨卡对应的宿主细胞计数示于图8和表1中。与阳性对照(未用RGS处理的寨卡病毒)相比，45分钟和90分钟RGS处理使寨卡显著减活(表4)。
宿主细胞的百分比死亡率对于T＝90处理(9.45％)而言与T＝45处理(20.14％)相比低得多(表1)。这意味着，如所预期的那样，对于90分钟处理而言，与45分钟处理相比，更多寨卡被减活。将宿主细胞死亡率相对于阴性对照中的宿主细胞死亡率进行的标准化表明，由45分钟和90分钟的RGS处理，寨卡病毒分别减活56.34％和79.51％(表1)。如所预期的那样，与来自两个经RGS处理的寨卡病毒(T＝45和T＝90)的滤纸提取物相比，暴露于阳性对照寨卡病毒提取物(T＝0)的Vero细胞显示出最大的Vero细胞死亡。
表1.来自寨卡-阴性、寨卡-阳性、和寨卡-RGS处理的宿主细胞计数
处理 ％活宿主细胞 ％宿主细胞死亡率 寨卡病毒的％RGS减活(标准化的)
阴性对照 100 0 0
阳性对照 53.87 46.13* 100**
经RGS处理，T＝45 79.86 20.14* 56.34**
经RGS处理，T＝90 90.55 9.45* 79.51**
*相对于阴性对照宿主细胞计数标准化。
**相对于阳性宿主细胞死亡率标准化。
图9显示暴露于阳性对照(T＝0)和经RGS处理的寨卡病毒滤纸提取物的Vero细胞(一式三份)的孔的显微照片图像。图8中显示的细胞死亡结果与显微图像(图9)匹配。
结论
该研究的结果证明，RGS处理使寨卡病毒显著减活。90分钟RGS处理使寨卡病毒减少大约80％。因此，RGS处理可使表面、空间、食品、饲料、医疗设备等上的病原性病毒有效地减活。RGS技术对于环境、医疗和食品传播的病毒而言是有效的抗病毒处理。
实施例3：使用反应性气体(RGS)将肠沙门氏菌(Newport)细菌噬菌体减活：使用SBA 1781细菌噬菌体模型来测定RGS作为抗病毒剂的效力
在该研究中，使用肠沙门氏菌噬菌体(SBA 1781噬菌体病毒)来评价RGS在使病毒减活方面的效力。
材料和方法
宿主细菌：肠沙门氏菌(Newport菌株，ATCC 6962)，购自American Type CultureCollection(ATCC),Manassas，VA.细菌噬菌体，SBA 1781:ATCC名称PTA-5282也购自ATCC。
生长肠沙门氏菌培养物(宿主细菌)
肠沙门氏菌(ATCC 6962)是细菌噬菌体SBA 1781的天然细菌宿主。通过添加1ml新鲜肉汤培养基(在蒸馏H2O中1％胰蛋白胨、0.1％酵母提取物、和0.8％NaCl)，将购自ATCC的肠沙门氏菌细菌(在小瓶中)重建。将重建的细菌培养物(100μl)从小瓶取出并且用于在具有松盖的培养玻璃管中接种10ml相同的肉汤培养基。将接种的肉汤在温度受控的培育箱中在37℃下生长过夜(18-20小时)。然后将所得肠沙门氏菌过夜培养物用于细菌噬菌体SBA1781的增殖。
SBA 1781细菌噬菌体增殖
使用ATCC推荐的程序，将细菌噬菌体SBA 1781在其天然宿主细胞肠沙门氏菌培养物中增殖。简而言之，将宿主细菌培养细胞在如上所述的肉汤中在37℃下生长过夜。之后，将1.0ml细菌培养细胞悬浮液添加至琼脂板的表面并且轻轻地倾斜以保证整个表面被宿主细菌细胞覆盖。然后从琼脂板吸出过量的液体并且允许板阴干(moist dry)。将沙门氏菌噬菌体(SBA 1781)在肉汤中不同稀释的悬浮液点在琼脂板的表面上并且在37℃下培育过夜。第二天，通过添加5ml新鲜肉汤培养基/板而收获细菌噬菌体并且将其在定期轻轻摇动的情况下在4℃下培育1小时。收集来自各板的提取物(悬浮液)并且将其转移至50ml无菌聚丙烯管，并且向各板添加另外的5ml新鲜培养基以在定期轻轻摇动的情况下在4℃下进行第二次提取(20分钟)。将来自各板的两个提取物合并到50ml锥形管中并且将板丢弃。将合并的悬浮液在4℃下以5000x g离心15分钟，以使细胞和琼脂碎片沉淀。然后收集上清液并且使其通过0.22μM Millipore过滤器以除去宿主细菌细胞。将含有所回收细菌噬菌体的所得滤液在4℃下存储以供将来实验使用。
RGS减活SBA 1781细菌噬菌体
为了将沙门氏菌细菌噬菌体用RGS减活，将1ml过滤的噬菌体上清液点在购自General Electric Company(GE Healthcare Life Sciences,Pittsburgh,PA)的圆形Whatman滤纸(直径90mm)上。然后将滤纸风干并且将一组滤纸指定为阳性对照[未用RGS处理或未处理(T＝0)]并且处理而用于噬菌体提取。将剩余滤纸分为三组并且将各组在80kV下用RGS在使用RGS分别达30、60和90分钟的情况下处理。在RGS处理之后，将各组滤纸单独地切割成小碎块并且置于无菌50ml管中。将来自滤纸的细菌噬菌体用5ml/管的无菌PBS(1X)提取。使用接种有宿主细胞(肠沙门氏菌)的过夜细菌培养物的透明96孔平底板(购自Midwest Scientific(MidSci),St.Louis,MO)，通过高通量筛选，测定所回收的滤纸提取物中的病毒活性。将新鲜的所生长肠沙门氏菌培养物在营养肉汤中稀释至1000个细胞/ml悬浮液的细胞密度；并且涂铺在96孔板中(170μl/孔)。这之后立即添加30μl的不同稀释的细菌噬菌体提取物(悬浮液)至200μl/孔的最终体积。将接种的96孔板在37℃下培育以过夜培养生长(18-20小时)。然后使用Spectra-Vmax PC340板读取器(Molecular Devise)在660nm处读取过夜培养物光密度(OD)。使用获得的吸光度读数来计算细菌生长，作为由于SBA1781病毒噬菌体被RGS减活所引起的生长逆转的度量。阴性(单独的培养基肉汤)和阳性(单独的细菌培养物)对照也在相同的板中运行；并且进而用于评价因细菌噬菌体而引起的细菌生长抑制。将未经处理的(阳性对照)和经RGS处理的噬菌体两者与阴性对照孔(没有噬菌体的孔)比较并且对于所有处理组，计算肠沙门氏菌的生长百分比(活力)。
通过比较在经RGS处理的和未经处理的(阳性对照)细菌噬菌体的提取物中观察到的细菌(肠沙门氏菌)生长差异(％活力)，测定RGS在将SBA 1781灭活方面的效力。
结果和讨论
肠沙门氏菌噬菌体(SBA 1781)的RGS处理显著降低了其对其目标宿主细胞(肠沙门氏菌)的感染性，从而允许宿主细胞生长(表2)。未经处理的SBA1781噬菌体(阳性对照)能够感染其细菌宿主细胞并且引起溶菌/死亡，从而导致63％死亡率或替代地37％活力(存活率)(表2和图10)。将噬菌体暴露于RGS达30、60和90分钟显著地逆转了宿主细胞的生长抑制，如通过分别观察到的86％、87％和89％的活力所展现的(表2)。将噬菌体暴露于RGS达30、60和90分钟显著地逆转了宿主细胞的生长抑制，如通过分别观察到的86％、87％和89％的活力所展现的(表2)。
表2.使用肠沙门氏菌宿主细胞活力测定细菌噬菌体的RGS减活
Figure BDA0003971684040000251
表3.来自噬菌体-阴性、噬菌体-阳性、和三个噬菌体-RGS处理的宿主细胞计数
处理 ％活宿主细胞 ％宿主细胞死亡率 寨卡病毒的％RGS减活(标准化的)
阴性对照 100 0 0
阳性对照 37 63* 100**
经RGS处理，T＝30 86 14* 77.78**
经RGS处理，T＝60 87 13* 79.37**
经RGS处理，T＝90 89 11* 82.54**
*相对于阴性对照宿主细胞计数标准化。
**相对于阳性宿主细胞死亡率标准化。
对于经RGS处理的噬菌体而言，与阳性对照相比，宿主细胞的百分比死亡率低得多(表3)。这意味着，通过RGS处理，更多的噬菌体被减活。将宿主细胞死亡率相对于阴性对照中的宿主细胞死亡率进行的标准化表明，由30分钟、60分钟和90分钟的RGS处理，噬菌体分别减活77.78％、79.37％和82.54％(表3)。如所预期的那样，与来自三个经RGS处理的细菌噬菌体(T＝30、T＝60和T＝90)的滤纸提取物相比，暴露于阳性对照噬菌体提取物(T＝0)的宿主细胞显示出最大的宿主细胞死亡。
结论
由该研究获得的初步结果清楚地展现了RGS对肠沙门氏菌噬菌体SBA1781活性的抑制效果。通过比较在未经处理的对照(阳性对照)和经RGS处理的肠沙门氏菌培养物中细菌噬菌体的细菌培养生长，评价RGS作为抗病毒剂的功效。如数据所展现的，该技术是用于防止不同组病毒的传播的工具。
实施例4：使用RGS对MS2细菌噬菌体病毒进行消毒：规模放大的中试发生器系统
使用RGS中试发生器对点在90mm Whatman 5滤纸的表面上并且从该表面回收的作为单链RNA病毒的MS2细菌噬菌体进行消毒。MS2细菌噬菌体是对大肠埃希氏菌(大肠杆菌)和肠杆菌科的其它细菌成员进行感染和溶菌的RNA病毒。由于大多数人类病毒病原体为RNA病毒，因此选择MS2细菌噬菌体(非人类病原体)作为用于测定RGS处理对病毒消毒和灭活的效力的最优模型。
该中试系统是从1kW原型技术系统放大而来的工业加固的8kW发电系统。该改进的中试系统版本具有显著更大的处理腔室容量并且能够经由在10个1.5英寸电极间隙之间的电介质阻挡放电(DBD)而产生更大量反应性气体物种(RGS)。对于该研究，该系统以590立方英尺/分钟(cfm)和84kV的电压操作，其导致形成30±2ppm的臭氧，如在其中处理样品的容器的中心所测量的。使气体穿过该等离子体发生器，并且然后通过气动传送系统，然后通过4”PVC柔性管子运输大约250ft而至充当处理腔室的20ft标准运输集装箱。进料到该发生系统中的空气的相对湿度(RH)和环境温度分别为50％和70°F。由该研究获得的初步结果和数据显示MS2病毒颗粒减少了2-log10，表明RGS作为用于对病毒消毒的工具的适用性。
材料
宿主细菌：大肠埃希氏菌(大肠杆菌，菌株K-12，ATCC 15597)购自American TypeCulture Collection(ATCC),Manassas,VA。MS2噬菌体:ATCC15597-B1也购自ATCC。一般实验室耗材、试剂和用品包括：TSB培养基肉汤、琼脂板、顶部琼脂、移液器、血清学管和吸管、SM噬菌体缓冲液、注射器、0.22μM尼龙注射器式过滤器、黑色塑料SNAP 
Figure BDA0003971684040000271
容器、镊子、止血器、剪刀等。
培养基包括：TSB肉汤、底部琼脂板(100mm板)和顶部琼脂(3ml/管)。底部琼脂包括：在TSB肉汤中的1.5％琼脂(15g/升或7.5g/500ml)。顶部琼脂包括：在TSB肉汤中的0.7％琼脂(7.5g/升或3.75g/500ml)
表4：SM缓冲液
成分 1升 500ml
NaCl 5.8g 2.9g
<![CDATA[MgSO<sub>4</sub>.7H<sub>2</sub>O]]> 2.0g 1.0g
1M Tris HCl,pH 7.4 50ml 25ml
2％明胶(w/v) 5ml 2.5ml
SM缓冲溶液在使用之前用高压灭菌周期进行杀菌。
方法
生长宿主细菌培养物用于MS2增殖
该研究中使用的MS2细菌噬菌体宿主细菌为大肠埃希氏菌(大肠杆菌，菌株K-12,ATCC 15597)。在其原始小瓶中的大肠杆菌(ATCC 15597)购自ATCC并且通过添加1ml新鲜肉汤培养基(在去离子(DI)水1％胰蛋白胨、0.1％酵母提取物、和0.8％NaCl)而重建。将重建的培养物(100μl)从小瓶取出并且用于在玻璃培养管中接种10ml相同的肉汤培养基，将所述培养管在热培育箱中在37℃下生长过夜。然后将所得大肠杆菌培养物用于待处理MS2细菌噬菌体的增殖和随后对从未经处理的/经处理的样品回收的病毒进行滴定菌斑鉴定。
MS2细菌噬菌体增殖
将细菌噬菌体MS2(ATCC 15597-B1)根据ATCC程序在不使用软/顶部琼脂覆盖物的情况下在其细菌宿主细胞大肠杆菌(菌株K-12，ATCC 15597)中增殖。如上所述将宿主细菌培养细胞在肉汤中在37℃下生长过夜。随后，将1.0ml宿主细菌细胞悬浮液添加至各琼脂板的表面并且轻轻地倾斜以保证整个表面被宿主细菌细胞覆盖。然后从琼脂板吸出过量的液体并且允许板干燥。将MS2噬菌体悬浮液在肉汤中不同稀释的溶液点在琼脂板的表面上并且在37℃下培育过夜。
过夜生长之后，将显示出宿主细菌被MS2噬菌体显著溶菌的板使用细菌噬菌体稳定化用缓冲液(SM)处理以进行噬菌体病毒提取。将SM稳定化用缓冲液(5ml)添加至各琼脂板并且在定期轻轻摇动的情况下在4℃下存储3小时。收集SM缓冲悬浮液并且将其转移到50ml聚丙烯管中。将第二等分的新鲜SM缓冲液(5ml/板)添加到各板中，之后在定期轻轻摇动的情况下在4℃下进一步培育15分钟。收集缓冲液并且将其与在该50ml管中的之前除去的缓冲液合并到一起，之后丢弃板。将合并的SM缓冲液-MS2噬菌体悬浮液在4℃下以5000xg离心15分钟以使细胞碎片和琼脂碎块沉降，之后收集不含颗粒物的含病毒的上清液。使所得上清液通过0.22μM尼龙注射器式过滤器以除去宿主细菌细胞，并且将含有所回收MS2噬菌体的滤液在4℃下存储以供实验使用。
用RGS处理MS2病毒以及残留病毒的提取
将从板获得并且含有增殖的病毒颗粒的MS2细菌噬菌体上清液(1ml)点在数个无菌90mm Whatman 5滤纸的表面上。然后允许滤纸在通风橱中干燥并且将其置于清洁容器中以在4℃下存储直至实验处理。在处理之前立即将含病毒的滤纸从冰箱取出并且在填充有冰袋的冷却器中运输至处理容器。将滤纸无菌地从它们地存储容器移出并且用已经用棉线缠绕的长尾夹夹住并且悬挂在8’x8’x20’(长度x宽度x深度)钢容器中的不同位置中的磁钩上。该容器具有一个双开门。右边的门完全打开并且不碍事，并且将附着至2x4框架的1/2英寸厚胶合舱壁板插入到容器中代替打开的门。在胶合板的右上角中切割出标称的4”孔并且将4”金属导管通过该孔插入到容器中，该导管在容器的中点(其在此处被支撑)处终止。将10英尺长的脊形导管连接至4”PVC柔性管子。左边的门被打开了(1.5英寸)，以给气体一个出口来逃逸。
在每次处理滤纸样品之后，将等离子体发生器关闭，但是让鼓风机再开10分钟以将残余反应性气体从容器清除。然后将样品移入到单独的无菌塑料容器中并且在冷冻的冷却器中携带至实验室用于使用SM缓冲液来提取残余病毒。为了提取，将经RGS处理的和未经处理的纸无菌地切割成0.5cm宽的条，将所述条堆叠并且随后切割而置于50ml无菌管中。将SM缓冲液(5mL)添加至各管并且进行提取达10分钟期间。在刚添加缓冲液后和在该10分钟期间每隔2分钟间隔时，将各样品轻轻地脉冲涡旋15秒。之后，将所述管在4℃下以5000rpm离心。然后将含有残余病毒的上清液通过0.22μM尼龙注射器式过滤器过滤到15ml无菌管中用于使用MS2菌斑鉴定来测定病毒浓度。
MS2细菌噬菌体的涂敷和滴定
通过在与以上描述的相同培养基中将10ml的TSB肉汤用100μl大肠杆菌悬浮液接种而开始大肠杆菌培养物并且将其在37℃培育箱中生长过夜。第二天，将过夜培养物用于开始另一新鲜大肠杆菌培养物。将1ml过夜培养物添加至9ml新鲜TSB培养基(过夜培养物1:10稀释)并且以相同条件生长3小时。然后将该新鲜培养物在TSB培养基中1:5稀释并且在MS2菌斑鉴定中用作细菌宿主。进行未经处理和经处理的滤纸提取物的数次稀释并且通过使用TSB顶部琼脂和底部琼脂板的菌斑鉴定，测定所回收的MS2病毒的浓度。
简而言之，将0.15ml的3小时细菌培养物在TSB中1:5稀释并且添加至3ml的通过水浴维持在42-45℃下的熔融的顶部/软琼脂，之后添加15μl稀释的MS2噬菌体提取物。然后将混合物轻轻地涡旋，倾倒在底部琼脂板上，并且允许凝固。然后将所述板在37℃培育箱中上下倒置地培育过夜。第二天，对板上的所形成菌斑(清亮区域)进行计数并且结果制成表格，如以下所示。
结果
实验1：MS2细菌噬菌体上清液的灭活
滤纸#13A为未经处理的对照样品(T＝0)，而滤纸#9(放置在样品容器的气体入口点前面)在84kV下用RGS以590立方英尺/分钟(CFM)处理1小时。
表5:实验1结果：MS2菌斑形成单位/ml(PFU/ml)
Figure BDA0003971684040000291
上表第五列中的MS2浓度/ml值是通过如下获得的：将菌斑计数除以0.015ml(添加至含有0.15ml的3小时大肠杆菌1:5稀释液的15ml小瓶、和3ml顶部琼脂的MS2提取物的体积)，然后考虑MS2稀释因子。
实验2：MS2细菌噬菌体上清液的灭活
滤纸#9为未经处理的对照样品(T＝0)。将滤纸#1(放置在样品容器的气体入口点前面)和滤纸#3(放置于样品容器的左后角中)在84kV下用RGS以590CFM处理3小时。
表6:实验2结果：MS2菌斑形成单位/ml(PFU/ml)
Figure BDA0003971684040000301
上表第五列中的MS2浓度(PFU/ml)值是通过如下获得的：将菌斑计数除以0.015ml(添加至含有0.15ml的3小时大肠杆菌1:5稀释液的15ml小瓶、和3ml顶部琼脂的MS2提取物的体积)，然后考虑MS2稀释因子。
以上呈现的表格数据来自在不同日期进行的两个独立实验。由这两个初步研究所获得的结果展现了，RGS处理对MS2细菌噬菌体病毒消毒。如结果所展现的，将MS2噬菌体暴露于RGS使病毒载量对于1小时处理而言减少大约2-log10和对于3小时处理而言减少大约3-log10(表5和6)。
在实验1中，将一张未经处理的纸(样品13A)与在处理容器中悬挂在气体入口正前方的一张经处理的纸(样品9)比较。实验1指示存活的病毒减少了98.8％，从6.00x1011PFU/mL减少至7.47x109PFU/ml。在实验2中，将一张未经处理的纸(样品9)与两张经处理的纸比较。将第一张经处理的纸(样品1)在处理容器中悬挂在气体入口的正前方，而将第二章经处理的纸(样品3)悬挂在距离气体入口大约14英尺的左后角落中。样品3的位置具有重要意义，因为其有可能看到比样品1明显更少的湍流空气流动，但是仅具有略微更差的病毒减少百分比。实验2指示，分别地对于样品1和样品3而言，存活的病毒减少了99.9％和99.8％，从2.67x1010PFU/mL减少至2.53x107和6.40x107PFU/mL。
在该基于细菌细胞的菌斑鉴定中将宿主大肠杆菌细胞用提取的MS2细菌噬菌体病毒涂敷提供了一种用于量化病毒恢复和减少量的相对容易的方法。活性MS2噬菌体感染其宿主细胞并且将它们溶菌(杀死)，从而导致形成菌斑，其通过板上的清亮区域表征。由于各清亮区域(菌斑)代表单个病毒颗粒，因此菌斑定量允许测定对照和实验样品两者中的病毒滴度。如在图11和12中所示的结果中所观察到的，各T＝0未处理样品的提取物与T＝1小时和T＝3小时处理样品相比显示出更多的菌斑。这些结果表明，将MS2病毒暴露于RGS使它们的PFU与相应的未经处理的样品提取物相比减少最高达3-log10。
结论
由该研究获得的结果清楚地展现了通过RGS处理而使MS2细菌噬菌体活力降低。两独立实验已经表明，在中试规模下，RGS使表面上的RNA病毒减活。
实施例5：在60kV下产生的反应性气体在标准流量下对萎缩芽孢杆菌孢子在60、120和180分钟时的影响
萎缩芽孢杆菌孢子被认为是最难以杀死的微生物之一。以下实验展现了反应性气体杀死包括病毒在内的任何微生物的能力。另外的实验显示细菌的杀死，其也显示反应性气体杀死病毒的能力，因为病毒和细菌的组成是类似的。
将接种有萎缩芽孢杆菌孢子的纸条(Mesa Labs,Inc.Lakewood,CO)暴露于反应性气体(RGS)达60、120和180分钟。RGS是在60kV下以改进的单向阀方向产生的。产生的臭氧的量与在固定电压下产生的RGS的总量成比例，并且容易用可用设备进行定量，因此使用臭氧来跟踪RGS浓度的变化。
在开始等离子体生成之后，RGS被积聚，直至臭氧的量为350ppm。此时，排气阀上的密封被略微打开以允许少量体积的气体逃逸并且被环境空气(有可能通过等离子体发生器外壳中的门缝吸入)代替。这导致流速从25增加至28立方英尺/分钟(cfm)并且臭氧下降而稳定在250ppm处并且具有较小的波动。通过如下移出样品：将去往样品接触器的阀门关闭，同时允许RGS的生成继续，从而在系统中循环。在短暂的样品移出(1-2分钟持续时间)期间臭氧达到峰值，接近350ppm，但是在恢复向样品接触器流动之后快速稳定至250ppm。
Mesa Labs估计，每个条含有1.8x106个孢子。通过由Mesa Labs推荐的程序处理的实验对照测得了1.0x106个孢子/条的平均值。在所有时间点处，在标准48小时后测得的最终计数为0个菌落形成单位(cfu)。将板保留用于观察。在第三天，已经暴露于RGS达60分钟的样品具有适度的孢子种群。暴露更长持续时间的样品没有变化。最终结果在图13和下表7中。
表7
Figure BDA0003971684040000321
实施例6：在60kV下产生的反应性气体在标准流量和高流量下对萎缩芽孢杆菌孢子在15、30、45和60分钟时的影响
将接种有萎缩芽孢杆菌孢子的纸条(Mesa Labs,Inc.Lakewood,CO)暴露于反应性气体(RGS)达15、30、45和60分钟。RGS是在与实施例5相同的条件下生成的。两组纸条接受相同的处理条件和时间，但是在流动系统内的不同位置中。将一组即“标准流量”用长尾夹悬吊，该长尾夹钩挂在从放置在样品接触器的顶部(最宽)部分中的线架悬吊的S-钩环上。将第二组即“高流量”放置在样品接触器流出90°钢弯头的汇合处之间。结果汇总于图14和下表8中。
表8
Figure BDA0003971684040000322
实施例5和6的数据汇编(compilation)
来自实施例5和6的被汇编在图15和16、以及表9和10中的数据点显示了在高流量和标准流量两种条件下调查的所有时间点的减少曲线。在单独的和汇编的汇总之间在数据点中可看到轻微的不同。将任何重叠的时间点重复物取平均。数据集被显示为log-减少量和种群变化，其仅是代表相同趋势的反函数。
标准流量条件导致种群逐渐减少，达到在60分钟内减少大约2.5log。暴露120和180分钟导致E+06种群的完全减少。在这些实验条件下，1-2小时暴露能够有效地消除与通常遇到的污染水平相当的孢子种群水平。
与标准流量相比，高流量条件导致更高的减少率。高流量条件能够在大约一半时间内减少相同的种群。当将高流量在30分钟时的最终种群(N＝1.72E+04)与标准流量在60分钟时的最终种群(N＝1.82E+04)相比时，证明了这一点。高流量条件在暴露45分钟后消除了整个孢子种群，而标准流量条件直到1和2小时之间的某处才达到完全消除。通过外推，预期E+06种群通过在标准流量下的RGS暴露而引起的完全减少在约90分钟时发生。
标准流量计算为80.2英尺/分钟的速度，而高流量计算为2281英尺/分钟的速度。在这两个实施例中，温度为25-40℃，并且露点为5.3-6.7℃，从而给出39.3-40.8的相对湿度。请注意：“E+”是科学E表示法，其中表述“mE+n”表示m×10n的值。
表9
Figure BDA0003971684040000331
表10
Figure BDA0003971684040000332
实施例7：在80kV下产生的反应性气体对于滤纸上的肠沙门氏菌的影响
将10张10mm Whatman滤纸用2.27E+6肠沙门氏菌细胞接种并且暴露于反应性气体(RGS)达3个点的时间期间。各样品包括同时用在80kV下生成的RGS处理0、5、15或30分钟的一批10张滤纸。将三组滤纸用仅空气处理相应的时间点用于对比。所有对照和实验样品在置于处理腔室中之前立即接种，并且在处理之后立即放置于提取缓冲液中。对于RGS和空气处理两者而言的减少值，表示为随时间推移的种群变化的log[Log10(N0/N)]，示于图17和下表11中。
表11
时间 RGS减少量 空气减少量
0 0.00 0
5 7.36 1.29
15 7.36 1.89
30 7.36 1.89
实施例8：在80kV下产生的反应性气体对滤纸上的大肠杆菌的影响
实施例8在与实施例7类似的条件下进行。将10张10mm Whatman滤纸用8.08E+6大肠杆菌细胞接种并且暴露于反应性气体物种(RGS)达3个点的时间期间。各样品包括同时用在80kV下生成的RGS处理0、1、5或15分钟的一批10张滤纸。将三组滤纸用仅空气处理相应的时间点用于对比。所有对照和实验样品在置于处理腔室中之前立即接种，并且在处理之后立即放置于提取缓冲液中。对于RGS和空气处理两者而言的减少值，表示为随时间推移的种群变化的log[Log10(N0/N)]，示于图18和下表12中。
表12
时间 RGS减少量 空气减少量
0 0.00 0
1 3.47 1.59
5 4.78 1.80
15 5.05 1.88
实施例9：在80kV下产生的反应性气体对胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)上的大肠埃希氏菌的影响
将大肠杆菌接种体制备为在625nm处的O.D.为0.550。该密度估计为1.8E+9个细胞并且实验确认为6.95E+9个细胞。由该接种体产生一系列7个1:10系列稀释液，从而得到从E+9细胞降至E+2细胞的一系列细胞悬浮液。将初始种群水平为E+8、E+7和E+6细胞的三个组接种到TSA上并且用反应性气体(RGS)处理15、30和45分钟。所有对照和实验样品在置于处理腔室中之前立即接种，并且在处理之后立即放置于提取缓冲液中。以log减少量和作为初始种群对最终种群的比率两者报道的结果示于图19和20中。E+2或更低的细胞计数检测极限阻碍了精确地区分处理30和45分钟的E+6样品、以及处理30和45分钟的E+7样品。
实施例10：在80kV下产生的反应性气体对在胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)上的大肠埃希氏菌的影响
将培养24小时的大肠杆菌细胞浓缩至1.5E+10的起始密度并且按照一系列7个1:10稀释液进行稀释。将一组8个TSA板用0.1mL的各种群稀释液接种，从而导致具有开始于1.51E+9直到1.51E+2的细胞种群的一系列板，之后进行25分钟反应性气体(RGS)暴露。将第二组板在以与第一系列板相同的方式处理之后进行25分钟RGS暴露并且用细胞接种。预接种组的减少值指示由于所有伴随的实验因素而引起的总减少量。后接种板的减少值指示由于在琼脂生长培养基内形成过氧化物自由基和酸化而引起的净减少量(注：大多数琼脂为≥95％水)。结果既显示为初始(No)对最终(N)种群曲线(图21)，也显示为log减少量的大小(图22)。在图21中，“*”表示细胞太多而无法计数，并且细胞的数量是通过稀释方案估计的。在图21中，“**”表示N＝0，并且对于log值而言，使用值1来获得真实值。
图23比较了对于具有过氧化物效应的四个种群，在实验条件的可计数范围内，总减少量、和因残余过氧化物引起的减少量。(请注意：“E+”为科学E表示法，其中表述“mE+n”表示m×10n的值。)
实施例11(预言)
期望验证被病毒污染的表面已经通过用反应性气体处理而被消毒。为了确定表面是被消毒的，从在用反应性气体处理之前的表面取得第一个病毒样品。将该病毒样品存储在冷的无菌容器中，直至准备好对其进行测试。然后使表面与反应性气体接触。通过用电介质阻挡放电(DBD)系统在20kV-150kV的电压下由工作气体形成高电压冷等离子体(HVCP)而产生反应性气体并且将反应性气体从HVCP运输至少1米远。在表面已经被处理之后，从表面取得第二个病毒样品。对第一个病毒样品和第二个病毒样品进行菌斑鉴定测试。对各样品的菌斑的数量进行计数。比较各样品的菌斑形成单位/体积(PFU/mL)。通过比较经处理和未经处理的纸的PFU/mL，测定病毒的log10减少量。如果经处理的纸的病毒浓度为1.0x107PFU/mL并且未经处理的纸的病毒浓度为1.0x109PFU/mL，则该处理已经实现了2-log10减少量。如果第二个样品中的PFU/mL的数值太高，可给予反应性气体的第二次给予。
替代地，为了确定反应性气体是否将被病毒污染的表面消毒，可使用多张滤纸来提供均一的病毒样品。两张滤纸可吸有含有病毒、优选地MS2噬菌体的溶液。可将一张滤纸(经RGS处理的)置于具有待处理表面的腔室中。使包括滤纸的腔室中的表面与反应性气体接触。反应性气体是通过用电介质阻挡放电(DBD)系统在20kV-150kV的电压下由工作气体形成高电压冷等离子体(HVCP)而产生的并且将反应性气体从HVCP运输至少1米远。将另一张滤纸(未经处理的)存储在冷的无菌容器中，直至准备好对其进行测试。在已经进行反应性气体处理之后，对经RGS处理的和未经处理的滤纸进行菌斑鉴定测试。
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Claims (29)

1.一种对疑似被病毒污染的表面进行消毒的方法，包括：
通过用电介质阻挡放电(DBD)系统在20kV-150kV的电压下由工作气体形成高电压冷等离子体(HVCP)而产生反应性气体；
将所述反应性气体从HVCP运输至少1米远；之后
使所述表面与所述反应性气体接触以将所述表面消毒，
其中被所述病毒感染的宿主已经接触所述表面。
2.一种对被病毒污染的表面进行消毒的方法，包括：
通过用DBD系统在20kV-150kV的电压下由工作气体形成高电压冷等离子体(HVCP)而产生反应性气体；
将所述反应性气体从HVCP运输至少1米远；
之后使所述表面与所述反应性气体接触以对所述表面进行消毒，
其中被所述病毒感染的宿主已经接触所述表面。
3.一种对被病毒污染的表面进行消毒的方法，包括：
(I)通过用DBD系统在20kV-150kV的电压下由工作气体形成高电压冷等离子体(HVCP)而产生反应性气体；
(II)将所述反应性气体从HVCP运输至少1米远；
(III)之后使所述表面与所述反应性气体接触以对所述表面进行消毒，
(IV)在所述接触之后从所述表面获得病毒样品，和
(V)测定在暴露于所述反应性气体之后剩余病毒的量，
其中，如果未通过所述接触对所述表面进行消毒，重复(I)、(II)和(III)，直至所述表面被消毒。
4.前述权利要求任一项的方法，其中所述表面为人造结构体的内表面。
5.前述权利要求任一项的方法，其中所述宿主为人类或动物。
6.前述权利要求任一项的方法，其中所述宿主为植物。
7.前述权利要求任一项的方法，其中所述人造结构体包括房间或过道。
8.前述权利要求任一项的方法，其中所述人造结构体包括交通工具。
9.前述权利要求任一项的方法，其中所述接触在具有至少8立方米的容积的房间中进行。
10.前述权利要求任一项的方法，其中所述房间为医院房间。
11.前述权利要求任一项的方法，其中所述房间为游轮舱室。
12.前述权利要求任一项的方法，其中所述表面为医疗器械的表面。
13.前述权利要求任一项的方法，其中所述接触达1秒-24小时。
14.前述权利要求任一项的方法，其中所述接触达30分钟-2小时。
15.前述权利要求任一项的方法，其中所述接触达至少90分钟。
16.前述权利要求任一项的方法，其中所述反应性气体包括除了臭氧之外的至少一种反应性或激发态的物种。
17.前述权利要求任一项的方法，其中所述病毒为RNA病毒。
18.前述权利要求任一项的方法，其中所述病毒选自：轮状病毒、鼻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、汉坦病毒、诺如病毒、麻疹病毒、埃博拉病毒、流感病毒、禽病毒、寨卡病毒、中东呼吸综合征(MERS)冠状病毒、严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒和严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)。
19.前述权利要求任一项的方法，其中所述病毒为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)。
20.前述权利要求任一项的方法，其中所述工作气体包括MA65。
21.前述权利要求任一项的方法，其中所述病毒为DNA病毒。
22.前述权利要求任一项的方法，其中所述病毒为非洲猪瘟病毒。
23.前述权利要求任一项的方法，其中与所述表面的所述接触足以产生通过MS2噬菌体鉴定测试的至少2-log10减少量。
24.前述权利要求任一项的方法，其中与所述表面的所述接触足以产生通过MS2噬菌体鉴定测试的至少3-log10减少量。
25.前述权利要求任一项的方法，其中与所述表面的所述接触足以产生通过MS2噬菌体鉴定测试的至少4-log10减少量。
26.前述权利要求任一项的方法，其中与所述表面的所述接触足以产生通过MS2噬菌体鉴定测试的至少5-log10减少量。
27.前述权利要求任一项的方法，其中与所述表面的所述接触足以产生通过MS2噬菌体鉴定测试的至少6-log10减少量。
28.前述权利要求任一项的方法，其中所述测定使用MS2噬菌体菌斑鉴定测试。
29.前述权利要求任一项的方法，其中所述测定使用酶联免疫吸附鉴定(ELISA)测试来测定所述病毒的量。
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