KR20220162673A

KR20220162673A - Cyp2e1 유전자를 이용한 톨루엔 정화능이 증진된 형질전환 산호수 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20220162673A
Application number: KR1020220158632A
Authority: KR
Inventors: 이수영; 박부희; 박필만; 안혜련; 김란선
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2019-12-13
Filing date: 2022-11-23
Publication date: 2022-12-08
Also published as: KR20210075384A; KR102582262B1

Abstract

본 발명은 CYP2E1 유전자를 이용한 톨루엔 정화능이 증진된 형질전환 산호수 및 이의 용도에 관한 것으로, CYP2E1 유전자가 형질전환된 산호수는 일반적인 산호수 대비 톨루엔 저감률이 현저히 우수하므로, 대기 중 톨루엔 정화에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

CYP2E1 유전자를 이용한 톨루엔 정화능이 증진된 형질전환 산호수 및 이의 용도{Transgenic Ardisia pusilla with Increased Toluene Purification using CYP2E1 Gene and Use thereof}

본 발명은 CYP2E1 유전자를 이용한 톨루엔 정화능이 증진된 형질전환 산호수 및 이의 용도에 관한 것이다.

점차 환경오염이 심해지면서, 인구가 밀집하고 있는 도심지에서의 미세먼지 증가와 매연과 같은 각종 유해 물질들이 점차 증가하고 있는 추세이다. 최근 가정 또는 사무실 등을 비롯한 실내에서 생활하는 시간이 많아지고 있으나, 환기부족 및 실내 오염물질 발생원 증가 등의 문제로 실내 공기 오염이 심화되면서, 실내 공기의 적정관리에 대한 요구가 높아지고 있다. 실외의 경우 자연 바람이나 대기순환으로 오염물질이 희석되는 반면, 실내의 경우에는 밀폐된 공간 내에서 환기 및 청소가 부족하여 오염물질이 지속적으로 순환 적체되면서 오염 농도가 증가하고 있는 실정이다.

이와 같은 오염물질에 대한 노출의 증가는 각종 질병과 아토피, 천식과 같은 질병을 유발하므로 최근에는 많은 가정 및 직장에서 공기 청정기를 이용하여 이러한 오염물질을 제거하고자 하고 있다. 다만, 이러한 공기 청정기는 미세먼지 등 미세 입자의 정화에는 큰 효과를 나타내지만, 톨루엔 등 독성 화학 물질의 정화에는 큰 효과가 없는 것으로 알려져 있다. 또한, 일반적인 공기 청정기는 물리 필터를 이용하므로 주기적인 필터 청소 및 교체를 수반해야 하는데, 필터의 교체 시기를 놓칠 경우 공기 청정기를 사용하지 않은 경우 보다 악화된 공기를 사용자에게 공급할 수 있다는 문제가 있다.

따라서, 공공장소뿐만 아니라 일반 가정에서도 공기정화 식물을 배치하여 실내 오염물질을 정화하고자 하고 있다. 다만, 소수의 공기정화 식물만으로는 충분한 오염물질의 정화가 어렵고, 공간적 제약으로 인하여 생활 공간에 다수의 공기정화 식물을 기르는 데에는 한계가 있다.

이에, 본 발명자들은 공기정화 능력이 증진된 형질전환 식물체를 개발하기 위한 연구를 수행하여 본 발명을 완성하였다.

대한민국 특허등록 제10-1152617호

본 발명의 하나의 목적은 CYP2E1(Cytochrome P450 2E1) 유전자를 포함하는 공기 정화 능력이 증진된 산호수(Ardisia pusilla)를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 CYP2E1 유전자를 포함하는 공기 정화 능력이 증진된 산호수의 원괴체유사체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, CYP2E1 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 산호수 세포를 형질전환하는 단계; 및 형질전환된 산호수 세포로부터 형질전환 산호수를 재분화하는 단계를 포함하는 공기 정화 능력이 증진된 형질전환 산호수의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, CYP2E1 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 산호수 세포를 형질전환시켜 CYP2E1 유전자를 발현하는 단계를 포함하는 산호수의 공기 정화 능력을 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 공기 정화 능력이 증진된 산호수를 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양상은 CYP2E1(Cytochrome P450 2E1) 유전자를 포함하는 공기 정화 능력이 증진된 산호수(Ardisia pusilla)를 제공한다.

본 발명의 공기 정화 능력이 증진된 산호수는 CYP2E1 유전자로 형질전환되어 공기중의 유해물질의 정화 능력이 증진된 것으로, 특히 톨루엔 저감률이 현저히 우수하므로, 대기 중 톨루엔 정화에 유용하게 활용될 수 있다.

본 발명의 CYP2E1 유전자가 도입된 형질전환 산호수는 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 원괴체유사체 유도, 재분화 신초 유도 및 생장을 통해 재분화 식물체를 획득할 수 있으며, 기내 마디배양 및 분주를 통해 증식시킬 수 있다. 또한 기내식물체를 발근 및 토양 순화 후 온실로 옮겨 꺾꽂이, 접붙이기 등과 같은 무성번식방법에 의해 생산될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, '원괴체유사체(protocorm like body, PLB)'는 미분화된 배와 배유 때문에 자체 발아 능력이 없는 난과 식물의 종자가 자연 상태에서 균과의 공생으로 발아하여 형성되는 구상체 조직인 원괴체(protocorm)와 유사한 형태의 조직으로 난과식물의 경우 생장점조직을 배양하였을 때 형성된다.

본 발명에서 사용되는 용어, '기내 도입'은 시험관 등의 용기에 인공 배지를 주입하여 환경이 조절된 상태로 식물체의 일부를 치상하여 배양하는 것을 말하고, '기내배양 개체'는 기내 도입된 식물체 일부를 배양하여 얻은 식물체를 말한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 CYP2E1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 공기 정화는 톨루엔(toluene) 정화일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따른 CYP2E1 유전자가 도입된 형질전환 산호수 CYP2E1-2-2계통은 톨루엔 처리 5시간 후 톨루엔 저감 능력이 일반적인 산호수 대비 1.86 내지 6.09배 우수하므로, 대기 중 톨루엔 정화에 유용하게 활용될 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 CYP2E1 유전자를 포함하는 공기 정화 능력이 증진된 산호수의 원괴체유사체를 제공한다.

본 발명의 CYP2E1 유전자를 포함하는 공기 정화 능력이 증진된 산호수의 원괴체유사체는 당업계에 공지된 식물체(마디절편)로부터 생산하기 위한 방법을 통하여 획득될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양상은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, CYP2E1 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 산호수 세포를 형질전환하는 단계; 및 형질전환된 산호수 세포로부터 형질전환 산호수를 재분화하는 단계를 포함하는 공기 정화 능력이 증진된 형질전환 산호수의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, '재조합 벡터'는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, '형질전환'은 목적 단백질을 코딩하는 염기서2열을 포함하는 벡터를 식물체 내에 도입하여 식물체 내에서 상기 염기서열이 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 말한다. 형질전환된 염기서열은 식물체 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 식물체의 염색체 내에 삽입되어 위치할 수 있고, 또는 염색체 외에 위치할 수 있으며, 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열은 목적 단백질을 코딩하는 DNA 및/또는 RNA를 포함할 수 있다. 상기 염기서열은 예를 들어, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 식물체에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 염기서열에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터, 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및/또는 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 염기서열은 상기 벡터로 형질전환된 아그로박테리움에 의하여 식물체에 도입될 수 있고, 또는 상기 염기서열은 그 자체의 형태로 식물체에 도입되어 식물체에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 목적 단백질을 코딩하는 염기서열은 구체적으로 CYP2E1 유전자이고, 구체적으로, 서열번호 1로 이루어진 염기서열일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 제한 없이 사용될 수 있으며, 당업계에 공지된 임의의 벡터가 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 벡터는 식물 형질전환용 벡터이므로, 당업계에 알려진 다양한 식물체-기능적 프로모터가 사용될 수 있으며, 예를 들어, 칼리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 35S 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 슈가케인 바실리폼 바이러스 프로모터, 코메리나 옐로우 모틀 바이러스 프로모터, 리불로스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제의 소단위(ssRUBISCO)로부터의 빛-유도성 프로모터, 쌀 사이토졸릭 트리오세포스페이트 이소머라아제(TPI) 프로모터, 아라비돕시스(Arabidopsis)로부터의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제(APRT) 프로모터, 옥수수의 유비키틴 프로모터, 쌀 액틴 1 유전자 프로모터, 알파-아밀라제 3D 프로모터(alpha-amylase, 3D promoter), 글로부린 프로모터, 글루테린 A 또는 B 프로모터, 플로라민 프로모터, 만노핀 신타아제 및 옥토핀신타아제 프로모터가 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 벡터는 선발 표지 유전자로써 항생제 저항성 유전자, 제초제 저항성 유전자, 대사관련 유전자, 발광 유전자, GFP(green fluorescence protein) 유전자, GUS(β유전자, GAL(β-galactosidase) 유전자 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 Ⅱ(NPT Ⅱ) 유전자, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자, 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 유전자 또는 다이하이드로폴레이트 환원효소 유전자 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

CYP2E1 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 산호수 세포를 형질전환시키는 방법은 목적 단백질을 코딩하는 염기서열을 식물체 내로 도입하는 어떤 방법도 제한 없이 사용될 수 있으며, 당업계에 공지된 적합한 표준 기술을 선택하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 아그로박테리움 속(Agrobacterium sp.) 미생물을 이용한 형질전환, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG (Polyethylenglyco l)에 의한 침전법이 사용될 수 있고, 바람직하게는, 아그로박테리움-매개 형질전환법이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 공기 정화는 톨루엔 정화일 수 있다.

본 발명의 또 다른 양상은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, CYP2E1 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 산호수 세포를 형질전환시켜 CYP2E1 유전자를 발현하는 단계를 포함하는 산호수의 공기 정화 능력을 증진시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 산호수의 공기 정화 능력을 증진시키는 방법에 있어서, 전술한 내용과 중복되는 부분은 전술한 의미와 동일한 의미로 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양상은 상기 방법에 의해 제조된 공기 정화 능력이 증진된 산호수를 제공한다.

CYP2E1 유전자를 이용한 톨루엔 정화능이 증진된 형질전환 산호수 및 이의 용도에 따르면, CYP2E1 유전자가 형질전환된 산호수는 일반적인 산호수 대비 톨루엔 저감률이 현저히 우수하므로, 대기 중 톨루엔 정화에 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 CYP2E1 삽입 pCM2300PMN 벡터 map을 나타낸 그림이다.
도 2는 경정배양 후 (A) 170일 및 (B) 250일이 경과된 산호수 신초를 나타낸 사진이다.
도 3은 CYP2E1 유전자가 도입된 산호수 모주의 증식을 나타낸 사진이다.
도 4는 CYP2E1 유전자가 도입된 산호수 줄기 단편 유래 재분화 선발배지 교체 및 식물체 재분화 경과를 나타낸 사진이다.
도 5는 CYP2E1 유전자가 도입된 형질전환 산호수의 증식을 나타낸 사진이다.
도 6은 (A) CYP2E1 유전자 및 (B) NPTII 유전자의 도입이 확인된 형질전환 산호수의 게놈 DNA PCR 결과이다.
도 7은 (A) 순화 후, 온실에서 (B) 증식되고 있는 형질전환 산호수를 나타낸 사진이다.
도 8은 (A) EcoRI 절단 후 전체 DNA 및 (B) CYP2E1 유전자 copy 수를 나타낸 형질전환 산호수의 서던 블롯 분석 결과이다.
도 9는 형질전환 산호수의 CYP2E1 유전자 도입 copy 수를 나타낸 그래프이다.
도 10은 (A) CYP2E1 mRNA 및 (B) 전체 RNA를 나타낸 형질전환 산호수의 노던 블롯 분석 결과이다. NC는 비형질전환 산호수로부터 추출한 전체 RNA이고, 1 내지 25는 CYP2E1 유전자가 도입된 형질전환 산호수로부터 추출된 전체 RNA이다.
도 11은 형질전환 산호수로부터 CYP2E1 단백질 발현이 확인된 (A) SDS-PAGE 분석 결과 및 (B) 웨스턴 블롯 분석 결과이다. M은 사전 염색된(pre-stained) 단백질 마커(Bio-Rad)이고, PC는 대장균에서 유도된 재조합 rabbit CYP2E1 단백질이고, NC는 비형질전환 산호수의 전체 잎 단백질이고, 1 내지 12는 각각 형질전환 산호수 라인들(CYP2E1-2-1, CYP2E1-2-2, CYP2E1-3-3, CYP2E1-3-4, CYP2E1-6-1, CYP2E1-6-2, CYP2E1-6-5, CYP2E1-20-3, CYP2E1-24-3, CYP2E1-35-1, CYP2E1-54-1, CYP2E1-54-2)의 잎 단백질이다.
도 12는 (A) CYP2E1에 의한 아닐린(aniline)의 4-아미노페놀(aminophenol)로의 전환, (B) OD630nm에서 4-아미노페놀의 표준곡선, 및 (C) 형질전환 산호수의 CYP2E1 효소 활성을 나타낸 그림 및 그래프이다.
도 13은 제한효소를 이용한 유전자 삽입 개수 및 CYP2E1 유전자 도입 산호수의 게놈 내 주변 염기 서열을 나타낸 CYP2E1 유전자 삽입 형질전환 산호수의 인접 DNA 시퀀싱 결과이다.
도 14는 형질전환 산호수의 엽면적당 톨루엔 저감 능력 검정 결과를 나타낸 그래프이다.

이하 본 발명을 하나 이상의 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. CYP2E1 유전자 클로닝 및 식물 형질전환 발현 벡터 내 삽입

pCambia2300 운반체에 항시 발현 프로모터인 P35S 프로모터(0.8kb)와 노팔린 신타아제 터미네이터(0.2kb)를 삽입시킨 pCambia2300-PMN 운반체를 제작하였고, 표 1의 CYP2E1(Cytochrome P450 2E1) 유전자(Genbank No. M15061) 전체 서열(full length, 1,995bp)을 합성하였다. 서브클로닝을 위해 CYP2E1 유전자를 XbaI과 KpnI제한 효소로 절단하여 pCambia2300-PMN에 삽입시켜 최종적으로 pCambia2300-CYP2E1을 제작하였다(도 1). 이때 DH5α(Invitrogen) 컴피턴트 세포(competent cell)를 사용하여 형질전환하였다. 구축된 식물발현운반체인 pCambia2300-CYP2E1는 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 균주 GV3101에 형질전환하여 산호수로 도입하는데 사용하였다.

CYP2E1 gene

ATGGCTGTTCTGGGCATCACCGTCGCCCTGCTGGGGTGGATGGTCATCCTCCTGTTCATATCCGTCTGGAAGCAGATCCACAGCAGCTGGAACCTGCCCCCAGGACCTTTCCCACTGCCCATCATCGGGAATCTTCTCCAGTTGGATTTGAAGGATATTCCCAAGTCCTTTGGCAGGCTGGCAGAGCGCTTTGGGCCGGTGTTCACTGTGTACCTGGGCTCCAGGCGTGTTGTGGTTCTGCACGGCTACAAGGCGGTGAGGGAGATGCTGTTGAACCACAAGAACGAGTTCTCTGGGCGTGGCGAGATCCCTGCTTTCCGGGAGTTTAAGGACAAGGGGATCATTTTCAACAATGGACCCACCTGGAAGGACACTCGGCGGTTCTCCCTGACCACCCTCCGGGACTATGGGATGGGGAAACAGGGCAACGAGGACCGGATCCAGAAGGAGGCCCACTTCCTGCTGGAGGAGCTCAGGAAGACCCAGGGCCAGCCCTTCGACCCCACCTTTGTCATCGGCTGCACACCCTTCAACGTCATCGCCAAAATCCTCTTCAATGACCGCTTTGACTATAAGGACAAGCAGGCTCTGAGGCTGATGAGTTTGTTCAACGAGAACTTCTACCTGCTCAGTACTCCTTGGCTGCAGGTTTACAATAATTTTTCAAACTATCTACAGTACATGCCTGGAAGTCACAGGAAAGTAATAAAAAATGTGTCTGAAATAAAAGAGTACACACTCGCAAGAGTGAAGGAGCACCACAAGTCGCTGGACCCCAGCTGCCCCCGGGACTTCATTGACAGCCTGCTCATAGAAATGGAGAAGGACAAACACAGCACGGAGCCCCTGTACACGCTGGAAAACATTGCTGTGACTGTGGCGGACATGTTCTTTGCGGGCACGGAGACCACCAGCACCACGCTGCGATATGGGCTCCTGATCCTGCTGAAGCACCCCGAGATCGAAGAGAAACTTCATGAAGAAATCGACAGGGTGATTGGGCCGAGCCGAATGCCTTCTGTCAGGGACAGGGTGCAGATGCCCTACATGGACGCTGTGGTACATGAGATTCAGCGATTCATCGATCTCGTGCCCTCCAATCTGCCGCACGAAGCCACACGGGACACCACCTTCCAAGGATACGTCATCCCCAAGGGCACTGTTGTAATCCCGACTCTGGACTCCCTTTTGTATGACAAGCAAGAATTCCCTGATCCCGAGAAGTTCAAACCAGAGCACTTTCTGAATGAGGAGGGGAAGTTCAAGTATAGCGACTACTTCAAGCCGTTTTCCGCAGGAAAACGCGTGTGTGTTGGAGAAGGCCTGGCTCGCATGGAGTTGTTTCTGCTCCTGTCTGCCATTCTGCAGCATTTTAACCTCAAGCCTCTCGTTGACCCAGAGGACATTGACCTTCGCAATATTACGGTGGGCTTTGGCCGTGTCCCACCACGCTACAAACTCTGTGTCATTCCCCGCTCGTAA

서열번호 1

실시예 2. CYP2E1 유전자 도입 산호수 재분화 식물체 획득

2-1. CYP2E1 유전자 도입을 위한 산호수 재료 준비

실내 공기 정화능력이 증진된 산호수를 개발하기 위하여, 자생 실내 식물로서 상업적으로 이용되고 있는 산호수를 국립원예특작과학원 도시농업과로부터 분양 받아 2015년 1월 15일에 신초 50개를 소독한 후 경정(3mm 내외)을 2% 수크로오스(sucrose, Duchefa)가 첨가된 1/2 MS(Duchefa) 고체배지[pH5.7, 0.7% agar(Duchefa)]로 채운 시험관에 배양하였다.

신초 소독은 다음과 같은 방법으로 수행하였다: 신초를 10분정도 흐르는 물에 담가 둔 후, 70% 에탄올(EtOH)로 30초 동안 표면 살균하고, 멸균수로 헹구었다. 이후, 진공펌프를 이용해 압력을 낮춰 시료 표면 공기를 빼내어 1% NaOCl액이 잘 침투되도록 10분간 소독하였고, 무균대안으로 옮겨 멸균수로 3회 헹군후 5분간 멸균수에 담가 둔 후 멸균 필터페이퍼가 깔린 샤알레에서 멸균수를 제거하였다. 그 다음, 4주 간격으로 곁가지를 동일한 배지로 옮기는 계대배양을 통해 증식하여 톨루엔 정화 유전자 도입 식물체를 획득하기 위한 재료로 사용하였다(도 2 및 도 3). 경정배양 및 이후 계대배양은 25℃±2℃로 유지되는 배양실에서 배양하였다.

2-2. CYP2E1 유전자가 도입된 산호수 재분화 식물체 획득

2016년 3월, 실시예 2-1에서 준비한 산호수 줄기를 절단한 단편(절편체, 1mm 내외 두께) 332개를 전배양 배지[1/2 MS components + TDZ(MBcell) 0.5㎎·L^-1 + IBA(Duchefa) 0.5㎎·L^-1 + 수크오로스 30g·L^-1 + plant agar 7g·L^-1, pH5.7]에 1 내지 4일간 전배양한 후, 실시예 1에서 제작한 아그로박테리움 균주와 2 내지 4일간 공동배양[배지조성: 전배양 배지 + 아세토시린곤(acetosyringone, aldrich) 50μM, pH5.2]을 통해 산호수 줄기단편으로 CYP2E1 유전자의 도입을 시도하였다. 아그로박테리움 균주는 LB액체배지에서 배양(O.D₆₀₀ = 0.6 내지 0.8) 후 액체배지(MS components + 수크로오스 30g·L^-1, pH5.2)에 희석하여 사용하였다. 공동배양 후, 절편체를 MS 액체배지(pH5.7)로 세척하고, 영양배지(전배양배지 + 세포탁심(cefotaxim) 200㎎·L^-1)에서 7일간 배양하였다. 이후 선발배지[영양배지 + 가나마이신(Sigma) 5㎎·L^-1]에서 배지교체를 통하여(도 4) 2016년 말 재분화 신초를 획득하였다. 그 후, 재분화 신초를 생장 선발배지(1/2 MS + 수크로오스 30g·L^-1 + 세포탁심 100㎎·L^-1 + 가나마이신 5㎎·L^-1+ plant agar 7g·L^-1, pH5.7)로 옮겨 식물체로 생장 및 증식 시켰으며, 332개 중 121개의 절편체로부터 재분화 신초를 획득하였다.

실시예 3. CYP2E1 유전자 도입 확인, 및 산호수 식물체의 순화 및 증식

3-1. CYP2E1 유전자 도입 산호수의 기내 증식 및 PCR 분석에 따른 CYP2E1 유전자 도입 확인

실시예 2-2에서 획득한 산호수 재분화 신초를 신초생장 선발배지에서 생장시켜, 65개 산호수 절편체로부터 산호수 재분화 유식물체 178개체를 획득하였다. 그 후, CYP2E1 유전자가 도입되었는지 분석하기 위하여 산호수 재분화 유식물체를 기내 증식하였다(도 5).

기내 증식한 산호수 재분화 유식물체에 목표 유전자인 CYP2E1이 도입되었는지 확인하기 위하여 PCR(Polymerase Chain Reaction) 분석을 수행하였다.

구체적으로, 가나마이신(kanamycin)이 첨가된 배지에서 일차 선발되어 형질전환체로 예상되는 산호수 178개체로부터 DNeasy Mini Plant Kit(Qiagen, USA)를 이용하여 게놈(genomic) DNA를 추출하였으며, NanoVue(GE healthcare, UK)를 이용하여 추출된 게놈 DNA를 정량하였다. PCR 반응은 200 내지 500ng의 DNA, 0.2mM dNTP, 표 2의 프라이머 및 0.2U Taq polymerase 등을 혼합한 시약 20㎕를 95℃에서 1분 동안 denaturation, 58℃에서 1분 동안 primer annealing, 72℃에서 1분 동안 primer extension하는 과정을 30회 증폭한 후, loading star(DYNEBIO, Korea)를 혼합한 1% 아가로스 젤(agarose gel)상에서 전기영동하여 UV 하에서 유전자 도입여부를 확인하였다.

프라이머	프라이머 염기서열(5'→3')	서열번호	비고
Os-CYP2E1 F1	TCTAGAATGGCTGTTCTGGGCAT	서열번호 2	목표 유전자 특이적 프라이머
Oc-CYP2E1 R1	TTGGTACCTTACGAGCGGGGAAT	서열번호 3	목표 유전자 특이적 프라이머
NPTII F	GAGGCTATTCGGCTATGACTG	서열번호 4	선별 유전자 특이적 프라이머
NPTII R1	ATCGGGAGCGGCGATACCGTA	서열번호 5	선별 유전자 특이적 프라이머

그 결과, 산호수 178개체 중 50개체에서 목표 및 선발 유전자가 도입된 것으로 확인되었으며, 형질전환율은 28.0%인 것으로 확인되었다(도 6).

3-2. CYP2E1 유전자가 도입된 산호수 식물체의 순화 및 증식

CYP2E1 유전자가 도입된 산호수에 대한 효소 활성 분석 및 톨루엔 가스 정화 분석을 수행하여 위하여, 실시예 3-1에서 형질전환된 것으로 확인된 50계통의 산호수 형질전환체를 순화 후, 더운 여름 차광막을 이용하여 온실에서 반 음지 식물로 재배하였다(도 7).

실시예 4. CYP2E1 유전자가 도입된 산호수 식물체의 분자생물학적 분석

4-1. CYP2E1 유전자 도입 copy수 확인

CYP2E1 유전자 도입 copy수를 확인하기 위하여 서던 블롯(Southern blot) 분석을 수행하였다.

구체적으로, 형질전환 산호수의 게놈 DNA안에 삽입된 CYP2E1 유전자의 copy수를 확인하기 위하여, 온실에서 증식된 실시예 3-2의 형질전환 산호수 중 25계통의 잎으로부터 DNA를 추출하여 농도를 확인하였다. 40㎍의 DNA를 100units의 EcoRI으로 처리하고, 0.5X TBE 용액에 담긴 0.9% 아가로스 젤에 로딩한 후, 30V로 17시간 러닝(running)하였다. 아가로스 젤에 전개된 DNA는 Hybond-N+ membrane(Amersham Life Science, UK)에 capillary transfer 방법으로 블롯팅하였다. 멤브레인을 UV 2,000J로 가교 결합(cross-linking)한 후, 혼성화 용기(hybridization bottle)에 넣고 10㎖의 혼성화 버퍼(hybridization buffer, 1mM EDTA, 250 mM Na₂HPO₄·7H₂O, 1% casein hydrolysate, 7% SDS, 85% H3PO4, pH 7.4)를 첨가하여 3시간 동안 65℃에서 사전 혼성화(pre-hybridization)하였다. CYP2E1 유전자가 삽입되어 있는 pCAMBIA2300 벡터의 PCR 산물을 용리(elution)한 후, 30ng DNA로 Redyprime II Random Prime Labeling System(Amersham Life Science, UK)을 사용하여 [α-32P]dCTP로 표지한 프로브(probe)를 첨가하고, 65℃에서 18시간 동안 혼성화하였다. 용기에서 혼성화 버퍼를 제거한 후, 2X SSC, 0.1% SDS로 65℃에서 30분간, 2X SSC, 1% SDS으로 65 ℃에서 30분간, 100㎖의 0.2X SSC, 0.1% SDS으로 65℃에서 30분간 멤브레인을 세척한 다음, 표지인식을 위하여 BSA-1800II Bio-Imaging analyzer(FUJIFILM, Japan)을 사용하였다.

그 결과, 25 계통의 형질전환 산호수 식물체에 CYP2E1 유전자가 1 내지 3 copy 삽입된 것으로 확인되었다(도 8 및 도 9).

4-2. CYP2E1 유전자의 발현 분석

형질전환 산호수 식물체에서 CYP2E1 유전자의 발현을 분석하기 위하여 노던 블롯(Northern blot) 분석을 수행하였다.

구체적으로, 실시예 4-1에서 CYP2E1 유전자의 삽입이 확인된 형질전환 산호수 25계통의 식물체의 잎으로부터 전체 RNA를 Fruit-mate for RNA prep과 RNAiso(Takara, Japan)를 사용하여 추출하였다. RNA를 분리하기 위하여, 형질전환 산호수 잎 2g을 액체질소를 이용하여 막자사발에서 분쇄한 후, 이를 2.0㎖ 튜브에 옮기고, 1㎖ Fruite mate를 첨가하여 섞어준 다음, 15,000rpm으로 5분간 원심 분리하여 상층액을 새로운 튜브로 옮기고, 1㎖ RNAiso를 첨가하여 강하게 섞어준 후 5분간 실온에 두었다. 여기에 클로로포름(chloroform) 200㎕를 첨가한 후, 다시 한 번 강하게 섞어주고, 이를 10분간 실온에서 반응시켰다. 반응이 끝난 EP 튜브를 15,000rpm으로 15분간 원심 분리하여 상층액 600㎕를 새로운 Ep 튜브에 옮기고, 300㎕ High-salt Solution(Takara)을 넣고 간단히 섞어준 후, 동량의 이소프로판올(isopropanol)을 첨가하여 실온에서 10분간 반응시켰다. 이후 4℃에서 15,000 rpm으로 8분간 원심 분리한 후 상층액을 버리고, 펠렛을 DEPC로 처리된 70% 에탄올(ethanol) 1㎖을 이용하여 세척 및 건조시킨 후, RNA 펠렛을 DEPC 처리된 50㎕의 물에 녹였다. 녹말을 제거하기 위하여 65℃에서 5분간 건조시킨 후, 원심 분리하여 상층액을 새 EP 튜브에 옮겼다. RNA는 NanoVue(GE healthcare)를 이용하여 정량한 후, 총 RNA 20㎍을 포름알데히드(formaldehyde) 아가로스 젤에서 전기영동한 다음, capillary transfer 방법(Lehrach, H. et al., 1977)에 의해 Hybond-N+ membrane (Amersham Pharmacia Biotech)으로 이동시켰다. 이후 과정은 실시예 4-1의 서던 블롯 분석 방법과 동일하게 수행하였다.

그 결과, 25계통 중 12계통에서 안정적으로 mRNA가 발현됨을 확인하였으며(도 10), 삽입된 CYP2E1 유전자 copy수와 비례해서 mRNA 발현이 증가하지는 않은 것으로 확인되었다. 한편, 일부 형질전환 계통들에서는 유전자가 도입되었으나, mRNA 발현은 확인되지 않았다.

4-3. CYP2E1 단백질 발현 분석

형질전환 산호수 식물체에서 CYP2E1 단백질의 발현을 분석하기 위하여 SDS-PAGE(odium dodecyl sulfate polyacryl amide gel electrophoresis) 및 웨스턴 블롯(Western blot blot) 분석을 수행하였다.

구체적으로, 실시예 4-2에서 CYP2E1 유전자에 대한 mRNA의 안정적 발현이 확인된 12계통의 형질전환 산호수 잎으로부터 전체 단백질을 추출한 후, Bradford's method를 사용하여 정량하였다. 형질전환 산호수 잎 단백질은 50mM Tris(pH7.4), 1mM EDTA, 1% PVP(40,000), 0.001% PMSF, 5% 메르캅토에탄올(mercaptoethanol) 및 0.05% Tween-20의 버퍼를 이용하여 추출하였다. 20㎍의 전체 단백질은 Laemmli(1970)의 방법에 기초하여 환원 조건(reducing condition)에서 12%의 폴리 아크릴아마이드 젤(poly arcrylamide gel)을 이용하여 SDS-PAGE를 수행하여 분리되었으며, 분리된 단백질들은 Coomassie brilliant blue에 의하여 염색되고 가시화되었다.

한편, 웨스턴 블롯 분석을 수행하기 위하여 아크릴아마이드 젤에서 분리된 단백질들은 Hybond-C membrane(Amersham)에 20V로 40분 동안 일렉트로블로팅(electroblotting) 시킨 후, TBST 버퍼(100mM Tris pH7.5, 0.9% NaCl, 0.1% Tween 20)에 10% 탈지유(skim milk)로 약 16시간 정도 블로킹(blocking)하였다. 멤브레인을 TBST 버퍼로 3회 세척한 후, rabbit anti-CYP2E1 polyclonal antibody(MyBiosource, CA, USA)를 1차 항체로 4시간 반응시키고, anti-rabbit IgG(H+L) alkaline phosphatase conjugated(Sigma)를 2차 항체로 사용하여 5% 탈지유가 포함된 TBST 버퍼에 1:7,000으로 희석하여 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. TBST 버퍼로 3회, TMN 버퍼(100mM Tris pH9.5, 100mM NaCl, 5mM MgCl₂)로 1회 세척 한 후, BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate) 및 NBT(nitro blue tetrazolium)으로 TMN 버퍼에서 발색하였다.

그 결과, 12계통에서 소포체로 가는 신호 펩티드(signal peptide)가 절단된 후, 성숙한 형태(mature form)의 53kDa에서 단백질이 확인되어(도 11) CYP2E1 단백질이 발현되는 것으로 확인되었다.

4-4. CYP2E1 단백질 효소 활성 확인

형질전환 산호수 식물체에서 CYP2E1 단백질의 효소 활성을 분석하기 위하여 아닐린 하이드록시레이즈 활성(aniline hydroxylase activity)을 평가하였다.

구체적으로, 실시예 4-3에서 CYP2E1 단백질 발현이 확인된 형질전환 산호수 식물체의 잎을 채취하고, 액체 질소를 이용하여 곱게 간 후, 버퍼(50mM Tris-HCl buffer(pH7.4) 중 1mM EDTA, 1% PVP, 0.001% PMSF(pH 8.0))를 이용하여 전체 잎 단백질을 추출하였다. 5% 메르캅토에탄올을 첨가하고, 15,000g 원심분리기를 이용하여 30분 동안 4℃에서 원심분리 한 후, 상층액을 새로운 Ep 튜브로 옮긴 다음, 10분 동안 4℃에서 15,000g로 원심분리하여 상층액을 수거하였다. Bradford's method(Bradford 1976)를 사용하여 단백질을 정량한 후, 10㎍의 전체 잎 단백질을 CYP2E1 활성 분석을 위하여 사용하였다.

효소활성 반응 분석에 사용하기 위하여 5mM 아닐린, 5 mM MgCl₂, 5mM 이소구연산염(isocitrate), 100mM Tris-HCl 조성을 갖는 효소활성 버퍼를 준비하였으며, 샘플과 반응 전에 0.5mM NADPH를 첨가하여 사용하였다. 효소활성 반응은 10㎍의 전체 잎 단백질에 100㎕의 NADPH 존재 하에서 준비한 효소활성 버퍼를 넣고, 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 10% 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid)을 이용하여 반응하고 남아있는 물질들을 침전시켰다. 5분 동안 아이스에서 반응시킨 후, 10분 동안 4℃에서 15,000g으로 원심분리하여 상층액을 수거하고, 100㎕ 샘플과 100㎕ 2.5N NaOH 용액을 첨가하여 58℃의 수조에서 20동안 반응시켜 p-아미노페놀을 발색시켰다. 아닐린 하이드록시레이즈 활성은 기질로 사용한 아닐린이 CYP2E1 효소에 의해 하이드록실레이션 됨으로써 형성되는 p-아미노페놀을 630nm에서 측정하여 평가하였다.

그 결과, 대조군과 비교하여 형질전환 산호수 CYP2E1-2-2에서 2.02% 활성이 증가하였으며, CYP2E1-3-3과 CYP2E1-6-2를 제외하고 대조구와 비교하여 CYP2E1 활성이 증가한 것으로 확인되었다(도 12).

4-5. 도입 유전자 주변 염기서열 분석

형질전환 산호수 식물체에서 도입 유전자 주변 염기서열 분석을 위하여 인접 DNA 시퀀싱(Flanking DNA sequencing)을 수행하였다.

구체적으로, 형질전환 산호수 식물체 CYP2E1-27-5 및 CYP2E1-54-4 계통의 게놈 DNA를 추출한 후, 그린진 바이오에 의뢰하여 도입 유전자 주변 염기서열을 분석하였다. 그 후, CYP2E1 유전자가 도입된 산호수 식물체의 게놈내 염기서열을 NCBI Blast를 이용하여 전체 게놈 서열이 밝혀진 식물체들과 유사 서열을 비교하였다.

그 결과, 다른 식물체와의 서열 유사성은 확인되지 않아, CYP2E1 유전자가 산호수의 고유한 유전자 내로 삽입된 것으로 확인되었다. 또한, 형질전환 산호수 CYP2E1-27-5와 CYP2E1-54-4 계통은 각각 단일 copy로 산호수 게놈 내에 삽입된 것으로 확인되었다(도 13).

실시예 5. 형질전환 산호수 식물체의 톨루엔 정화 능력 검정

비형질전환 산호수와 실시예 4-4에서 아닐린 하이드록시레이즈 활성이 증가한 것으로 확인된 CYP2E1-2-2 산호수 식물체를 온도 23±2℃, 광도 약 1500Lux의 국립원예특작과학원 도시농업과 환경 조절실에서 약 1주일간 광 순화 후 챔버(0.02㎥)에 투입하여 3시간 간격으로 3번 톨루엔을 챔버에 0.5ppm 농도로 주입하여 전처리하였다. 톨루엔 정화 능력 검정을 위하여 톨루엔과 공기를 1:6 비율로 테들러 백에 기체로 만들어 챔버 내 톨루엔이 초기농도가 0.5ppm이 되도록 챔버 안으로 주입하였다. 한 챔버 당 3시간 간격으로 12시간동안 GC/MS측정을 수행하였으며, 동일한 조건으로 3반복 수행하였다.

그 결과, 실시예 4-4에서 효소 활성이 가장 우수한 것으로 확인된 CYP2E1 유전자 도입 산호수 CYP2E1-2-2 계통 2개체를 대상으로 톨루엔 제거능력을 동일한 방법으로 검정한 결과, 대조군 대비 형질전환 산호수 식물체에서 처리 5시간 후 톨루엔 저감 능력이 1.86 내지 6.09배 향상되는 것으로 확인되었다(표 3 및 도 14).

측정시간(min)	일반산호수 (㎍/m³)	형질전환 산호수 (CYP2E1-2-2-(1)) (㎍/m³)	형질전환 산호수 (CYP2E1-2-2-(2)) (㎍/m³)
0	0.0±0.0	0.0±0.0	0.0±0.0
60	136.3±30.6	286.3±31.8	831.0±64.6
120	187.3±34.1	354.8±37.8	976.0±66.0
180	206.2±31.2	384.6±33.9	1060.4±47.8
240	169.2±38.7	332.3±22.1	902.9±47.4
300	156.9±28.4	314.6±5.0	841.3±14.9

이제까지 본 발명에 대하여 그 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Transgenic Ardisia pusilla with Increased Toluene Purification using CYP2E1 Gene and Use thereof <130> RDA-P190093 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1482 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cytochrome P450 2E1 <400> 1 atggctgttc tgggcatcac cgtcgccctg ctggggtgga tggtcatcct cctgttcata 60 tccgtctgga agcagatcca cagcagctgg aacctgcccc caggaccttt cccactgccc 120 atcatcggga atcttctcca gttggatttg aaggatattc ccaagtcctt tggcaggctg 180 gcagagcgct ttgggccggt gttcactgtg tacctgggct ccaggcgtgt tgtggttctg 240 cacggctaca aggcggtgag ggagatgctg ttgaaccaca agaacgagtt ctctgggcgt 300 ggcgagatcc ctgctttccg ggagtttaag gacaagggga tcattttcaa caatggaccc 360 acctggaagg acactcggcg gttctccctg accaccctcc gggactatgg gatggggaaa 420 cagggcaacg aggaccggat ccagaaggag gcccacttcc tgctggagga gctcaggaag 480 acccagggcc agcccttcga ccccaccttt gtcatcggct gcacaccctt caacgtcatc 540 gccaaaatcc tcttcaatga ccgctttgac tataaggaca agcaggctct gaggctgatg 600 agtttgttca acgagaactt ctacctgctc agtactcctt ggctgcaggt ttacaataat 660 ttttcaaact atctacagta catgcctgga agtcacagga aagtaataaa aaatgtgtct 720 gaaataaaag agtacacact cgcaagagtg aaggagcacc acaagtcgct ggaccccagc 780 tgcccccggg acttcattga cagcctgctc atagaaatgg agaaggacaa acacagcacg 840 gagcccctgt acacgctgga aaacattgct gtgactgtgg cggacatgtt ctttgcgggc 900 acggagacca ccagcaccac gctgcgatat gggctcctga tcctgctgaa gcaccccgag 960 atcgaagaga aacttcatga agaaatcgac agggtgattg ggccgagccg aatgccttct 1020 gtcagggaca gggtgcagat gccctacatg gacgctgtgg tacatgagat tcagcgattc 1080 atcgatctcg tgccctccaa tctgccgcac gaagccacac gggacaccac cttccaagga 1140 tacgtcatcc ccaagggcac tgttgtaatc ccgactctgg actccctttt gtatgacaag 1200 caagaattcc ctgatcccga gaagttcaaa ccagagcact ttctgaatga ggaggggaag 1260 ttcaagtata gcgactactt caagccgttt tccgcaggaa aacgcgtgtg tgttggagaa 1320 ggcctggctc gcatggagtt gtttctgctc ctgtctgcca ttctgcagca ttttaacctc 1380 aagcctctcg ttgacccaga ggacattgac cttcgcaata ttacggtggg ctttggccgt 1440 gtcccaccac gctacaaact ctgtgtcatt ccccgctcgt aa 1482 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Os-CYP2E1 F1 <400> 2 tctagaatgg ctgttctggg cat 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oc-CYP2E1 R1 <400> 3 ttggtacctt acgagcgggg aat 23 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NPTII F <400> 4 gaggctattc ggctatgact g 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NPTII R1 <400> 5 atcgggagcg gcgataccgt a 21

Claims

서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CYP2E1(Cytochrome P450 2E1) 유전자가 인위적으로 도입된 형질전환 산호수로서,
CYP2E1 유전자가 인위적으로 도입되지 않은 산호수에 비해, CYP2E1 유전자가 과발현되거나 CYP2E1 단백질의 활성이 증가된 것이며,
톨루엔(toluene) 정화 능력이 증진된 산호수(Ardisia pusilla).
제 1 항에 따른 산호수의 원괴체유사체(protocorm like body).
서열번호 1의 염기서열로 이루어진, CYP2E1 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 산호수 세포를 상기 CYP2E1(Cytochrome P450 2E1) 유전자를 1 내지 3 카피 포함하도록 형질전환하는 단계; 및
형질전환된 산호수 세포로부터 형질전환 산호수를 재분화하는 단계
를 포함하는 톨루엔 정화 능력이 증진된, 제1항의 형질전환 산호수의 제조 방법.