KR20220161992A - 차조기 추출물을 포함하는 항산화, 항균, 항염, 또는 항주름용 조성물 - Google Patents

차조기 추출물을 포함하는 항산화, 항균, 항염, 또는 항주름용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 차조기 추출물을 포함하는 항산화, 항균, 항염, 또는 항주름 조성물에 관한 것으로, 상기 차조기 추출물은 DPPH 자유라디칼 소거 활성, LPS로 유도된 마우스 대식세포의 NO 생성 억제 활성, 항균 활성, 콜라게네이즈 활성 억제 활성을 나타내므로, 항산화, 항염, 항균, 및 항주름을 위한 화장료, 식품, 및 의약외품 조성물로서 효과적으로 사용할 수 있다. 또한, 상기 차조기 추출물은 상기한 효과로 인하여 알코올이 함유된 세정제 및 핸드크림에서 알코올을 대체하여 사용할 수 있으므로 항균 및 피부 보호용 세정제 및 핸드크림으로도 유용하다.

Description

차조기 추출물을 포함하는 항산화, 항균, 항염, 또는 항주름용 조성물 {Composition having antioxidant, antibacterial, anti-inflammatory, or anti-wrinkle activity comprising Perilla frutescens extracts}
본 발명은 차조기 추출물을 포함하는 항산화, 항균, 항염, 또는 항주름 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 알코올이 함유된 세정제 및 핸드크림에서 알코올을 대체하여 차조기 추출물이 함유된 항균 및 피부 보호용 세정제 및 핸드크림에 관한 것이다.
최근 피부는 환경오염, 자동차 배기가스 등의 각종 공해물질을 비롯하여 화장품 원료로 많이 사용되고 있는 레티놀, 락트산 등에 의해 자극을 받아 노화, 아토피 또는 여드름과 같은 피부염증, 주름 등의 피부질환의 발생이 증가하고 있다. 구체적으로, 각종 공해물질로 인해 호르몬 불균형 현상이 심화되어 피부의 섬유아세포의 합성 능력을 감소시키거나 면역작용능력이 감소되고, 주름개선 및 재생에 효과적인 레티놀과 락트산은 자외선에 의해 분해되어 실제적인 효능이 떨어져 자외선에 의한 피부손상을 초래하게 된다.
이러한 피부손상, 노화 등의 피부질환의 주요 원인은 체내 염증반응에 의해 이루어지며, 체내 염증반응에서 활성자유종(reactive radical species)의 일종인 일산화질소(NO)는 대식세포와 같은 면역세포에 의해 생성되어 각종 생리 및 병리적 과정에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 일산화질소는 매우 불안정한 화합물로서 지질다당류(lipopolysaccaride, LPS)와 같은 염증유발물질에 의한 일산화질소(NO) 생성 효소인 iNOS(inducible nitric oxide synthase)의 활성화를 통해 생성된다. COX(cyclooxygenase)는 PGHS(prostaglandin H synthase)라고도 불리우며, 세포막 인지질(membrane phospholipid)을 프로스타글라딘류(prostalandins, thromboxanes)로 변환시키는데 작용하는 중요한 조절효소로써 현재 COX-1과 COX-2가 알려져 있다. COX-1은 조직 내에서 기본적으로 존재하며 일정한 작용을 꾸준히 나타내는 반면에, COX-2는 동물이나 인간의 염증반응 부위에서 발현되는데 다양한 자극에 의해 단기간 내에 급격히 발현되는 것으로 알려져 있다. 대표적 염증유발효소인 COX-2의 발현 증가가 일산화질소(NO)의 생성에도 영향을 미치는 것으로 알려져 있다(대우, 대한화장품학회지 (2006)58:173-180).
상기와 같은 피부손상 및 노화를 개선 또는 방지하기 위하여 종래에는 활성 산소의 발생을 억제하여 세포의 노화를 예방하는 벤지다민, 인토메타신, 이부프로펜 등과 같은 비스테로이드 계통의 항산화제 또는 덱사메타손, 하이드로코티존 등과 같은 스테로이드 계통의 항산화제를 사용하여 피부주름, 피부염증질환 등을 개선하였다. 그러나 상기 화학물질들은 과도하게 사용되는 경우 부작용이 발생하고 안정성 및 안전성에 문제가 있기 때문에, 천연물로부터 유래하여 부작용이 적어 안전하면서도 피부질환 개선 효과가 우수한 조성물의 개발이 필요하다.
한편, 최근 알코올이 함유된 손 세정제를 세균 및 바이러스 사멸의 목적으로 많이 사용하고 있다. 그러나 알코올이 함유된 손 세정제를 지속적으로 사용할 경우 알코올에 의한 미생물 사멸 효과는 얻을 수는 있지만 알코올이 기화하면서 피부의 수분도 함께 증발하여 피부가 거칠어지고 갈라짐이 발생하는 문제가 있다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 알코올이 함유된 손 세정제를 사용한 후 피부에 수분 및 영양을 공급해 주기 위한 핸드크림을 사용하는 경우가 있으나, 핸드크림의 사용 시 미생물에 의한 오염이 재발생하는 문제가 있어 주의를 요하고 있다.
이에 본 발명자들은 상기한 문제를 해결하기 위하여 천연물로부터 다양한 효능을 가지고 있는 물질을 찾고자 노력을 하여왔으며, 그 결과 차조기 추출물이 항산화, 항균, 항염, 및 항주름 효과를 나타내고 있을 뿐만 아니라 알코올을 대체하여 손 세정제 및 핸드크림에 사용하는 경우 알코올 대체 효과가 매우 우수함을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
대한민국 등록특허 제10-0378151호(2003.03.29. 공고) 대한민국 등록특허 제10-1233857호(2013.02.15. 공고) 대한민국 공개특허 제10-2020-0027860호(2020.03.13. 공개) 대한민국 공개특허 제10-2021-0061979호(2021.05.28. 공개)
본 발명의 하나의 목적은 차조기 추출물을 포함하는 항산화, 항균, 항염, 또는 항주름 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 화장료, 식품, 또는 의약외품 조성물로 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 알코올을 함유한 세정제 또는 핸드크림에서 상기 알코올을 차조기 추출물로 대체하여 포함된 세정제 또는 핸드크림을 제공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 차조기 추출물을 포함하는 항산화, 항균, 항염, 또는 항주름 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 차조기(Perilla frutescens)는 통화식물목 꿀풀과의 한해살이풀로, 한방에서는 잎을 소엽, 종자를 자소자(紫蘇子)라고 하여 발한ㅇ진해ㅇ건위ㅇ이뇨ㅇ진정 및 진통제로 사용하여 온 식물이다.
본 발명의 차조기 추출물은 상기한 차조기의 전초, 잎, 뿌리, 줄기, 꽃 등을 통상의 방법에 의하여 추출하거나 이로부터 분리된 항산화, 항균, 항염, 및 항주름 활성을 가지는 물질을 말한다. 또한, 상기 추출물은 통상의 방법에 의하여 차조기 추출물로부터 추출한 추출액뿐만 아니라 이의 건조 분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 말한다.
본 발명에서 차조기 추출물은 물 또는 유기 용매를 사용하여 추출할 수 있는데, 추출한 액은 액체 형태로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다. 상기 유기용매는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매이며, 추출물의 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 추출하는 유기용매에 따라 추출물의 유효성분의 추출정도와 손실정도가 차이가 날 수 있으므로, 알맞은 유기용매를 선택하여 사용한다. 추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출, 초임계 유체 추출 등이 있다.
본 발명에 있어서, 차조기 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함한다.
본 발명의 조성물은 차조기 추출물을 조성물의 총 중량을 기준으로 0.001 내지 20%, 바람직하게는 0.001 내지 10중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 5중량%로 포함한다. 상기 차조기 추출물의 함량이 0.001중량% 미만일 경우 항산화, 항균, 항염, 및 항주름 효능이 미약하고, 차조기 추출물의 함량이 20중량%를 조과하는 경우에는 함량의 증가에 따른 효과의 증가가 매우 미약하다는 문제점이 있다.
하나의 구체적 예로서, 상기 차조기 추출물은 농도 의존적으로 DPPH 자유라디칼 소거활성을 나타내었으며, LPS로 유도된 마우스 대식세포의 NO 생성을 농도 의존적으로 억제하였으며, 대장균 및 포도상구균의 미생물에 대한 항균 활성을 나타내었으며, 콜라게네이즈 활성을 농도 의존적으로 억제함을 확인할 수 있었다.
또한, 상기 차조기 추출물은 인체 자극 실험에서 인체에 자극을 주지 않아 인체에 무해한 성분이다.
하나의 구체적 양태로서, 본 발명은 차조기 추출물을 포함하는 항산화용, 항균용, 염증의 예방 또는 개선용, 또는 주름의 예방 또는 개선용 화장료 조성물로 제공된다.
본 발명의 상기 화장료 조성물은 유효성분으로서 차조기 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 첨가되는 성분, 예컨대 항염증제, 항산화제, 안정화제, 가용화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 추가로 첨가할 수 있다.
본 발명의 상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양젤 또는 마사지 크림의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트 검, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 토스, 탈크, 실리카, 알루미늄히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 가용화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 검등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
다른 하나의 구체적 양태로서, 본 발명은 차조기 추출물을 포함하는 항산화용, 항균용, 염증의 예방 또는 개선용, 또는 주름의 예방 또는 개선용 식품 조성물로 제공된다.
본 발명의 상기 식품 조성물은 유효성분으로서 차조기 추출물 이외에 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 AC 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 차조기 추출물을 포함하는 항산화용, 항균용, 염증의 예방 또는 치료용, 또는 주름의 예방 또는 치료용 의약외품 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 의약외품 조성물은 유효성분으로서 차조기 추출물 이외에 필요에 따라 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제는 본 발명의 효과를 해하지 않는 한 제한되지 않으며, 예를 들어 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 윤활제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.
상기 "약학적으로 허용가능한 담체"는 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 유효성분의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체, 부형제 또는 희석제를 의미할 수 있으며, 구체적으로, 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)일 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 의약외품으로서 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 구체적으로, 비경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 또한 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 의약외품 조성물은 소독 청결제, 샤워폼, 연고액, 물티슈, 코팅제 등을 예시할 수 있으나 이에 제한되는 것이 아니며, 의약외품의 제제화 방법, 용량, 이용 방법, 구성 성분 등은 기술분야에 공지된 통상의 기술로부터 적절히 선택될 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 차조기 추출물을 포함하는 유효성분으로 포함하는 의약외품 조성물을 인간을 포함한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 항산화용, 항균용, 염증의 예방 또는 치료용, 또는 주름의 예방 또는 치료 방법에 사용될 수 있다. 상기 개체는 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물을 제한 없이 포함할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 알코올을 함유한 세정제 또는 핸드크림에서 상기 알코올을 차조기 추출물로 대체하여 포함된 항균 및 피부 보호용 세정제 또는 핸드크림을 제공한다.
본 발명의 상기 알코올을 함유한 세정제는 인간을 포함한 개체의 살균을 목적으로 하는 세정제로서 알코올에 의한 세균 및 바이러스 등의 미생물 살균 효과를 가진다.
본 발명의 상기 알코올을 함유한 핸드크림은 인간의 손의 살균을 목적으로 하는 핸드크림으로서 알코올에 의한 세균 및 바이러스 등의 미생물 살균 효과를 가진다.
상기 알코올을 함유한 세정제 및 핸드크림은 미생물의 살균 목적을 위하여 알코올을 하유하고 있지만 알코올을 함유한 세정제 및 핸드크림이 도포된 인간을 포함한 개체의 도포 부위에서 알코올의 급속한 기화로 인하여 피부의 수분 감소, 피부의 갈라짐 및 피부의 거칠기가 증가하는 문제가 있다.
이와 달리 본 발명의 상기 알코올을 대체하여 차조기 추출물이 포함된 세정제 및 핸드크림은 차조기 추출물의 미생물 살균 효과로 인하여 인간을 포함한 개체의 도포 부위의 살균 효과를 얻을 수 있을 뿐만 아니라 알코올과 같은 급속한 기화가 없기 때문에 피부의 수분 감소, 피부의 갈라짐 및 피부의 거칠기 증가가 발생하지 않는 효과가 있다. 더욱이 상기 차조기 추출물은 상술한 바와 같이 천연 식물로부터 유래하고 인체 피부에 자극을 주지 않아 인체에 무해하며, 항산화, 항염, 및 항주름 효과가 우수한 성분이므로 인간의 포함한 개체의 도포 부위의 피부에 상기한 효과를 부여하는 효과도 있다.
상기 인간을 포함한 개체는 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물을 제한 없이 포함한다.
상기 "알코올을 차조기 추출물로 대체하여 포함된"에서 "대체"는 세정제 및 핸드크림에 함유된 알콜올 함량의 100 내지 60%, 바람직하게는 95 내지 65%, 보다 바람직하게는 90 내지 70%를 차조기 추출물이 포함되는 것을 말한다. 예를 들어, 알코올을 함유한 세정제의 알코올 함량이 전체 조성물의 60중량%인 경우 이의 100 내지 60%인 60중량% 내지 36중량%를 차조기 추출물이 함유되는 것을 의미한다.
하나의 구체적 예로서, 알코올 함량이 5중량%인 핸드크림과 상기 알코올 함량의 80%를 차조기 추출물로 대체한 핸드크림(즉, 차조기 추출물 함량이 4중량%이고 알코올 함량이 1중량%임)을 만 26~53세 이하의 건강한 성인 남여를 2그룹으로 나누어 사용하였을 때, 알코올만이 함유된 핸드크림이 도포된 손은 피부의 거칠기 등이 증가하였으나 알코올이 차조기 추출물로 대체된 핸드크림이 도포된 손은 피부의 거칠기 등의 변화가 없을 뿐만 아니라 미생물 살균 효과도 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
상기 항균은 미생물을 사멸하거나 미생물의 활성을 억제 또는 제거하는 의미로 사용될 수 있으며, 상기 피부 보호는 피부의 거칠기 및 갈라짐을 예방하고 피부에 항산화, 항주름, 또는 항염 효과를 부여하여 피부의 기능 감소를 억제 또는 제거하는 것이다.
본 발명의 차조기 추출물이 함유된 세정제 및 핸드크림은 미생물의 살균 효과 이외에도 종래 알코올로 인한 문제를 해결할 수 있을 뿐만 아니라 피부의 염증 예방 및 개선, 피부의 주름 예방 및 개선, 피부의 항산화 효과 등을 제공할 수 있다.
본 발명의 차조기 추출물은 DPPH 자유라디칼 소거 활성, LPS로 유도된 마우스 대식세포의 NO 생성 억제 활성, 미생물에 대한 항균 활성, 콜라게네이즈 활성 억제 활성을 나타내므로, 항산화, 항염, 항균, 및 항주름을 위한 화장료, 식품, 및 의약외품 조성물로서 효과적으로 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 차조기 추출물은 상기한 효과로 인하여 알코올이 함유된 세정제 및 핸드크림에서 알코올을 대체하여 사용할 수 있으므로 항균 및 피부 보호용 세정제 및 핸드크림으로도 유용하다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 차조기 추출물의 콜라게나제 활성 억제 정도를 나타낸 그림이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 차조기 추출물의 LPS로 유도된 대식세포의 NO 생성율을 나타낸 그림이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 차조기 추출물이 함유된 핸드크림의 대장균에 대한 항균 활성 효과를 나타낸 그림이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 차조기 추출물이 함유된 핸드크림의 황색포도상구균에 대한 항균 활성 효과를 나타낸 그림이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 차조기 추출물이 함유된 핸드크림의 폐렴균에 대한 항균 활성 효과를 나타낸 그림이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
제조예 1: 차조기 추출물의 제조
차조기 전초를 세척한 후에 건조 및 분쇄하고, 분쇄된 차조기 100 중량부를 38 내지 42℃의 결정화조에 넣고 400bar의 압력에서 50℃의 CO2를 유량 60mL/min의 속도로 120분간 추출한 후, 보조 용매인 주정을 이용하여 50mL/min의 속도로 60분간 잔류 성분을 추출하여 차조기 추출물을 준비하였으며, 이를 정제수나 주정 등의 용매를 이용하여 20배 희석 및 여과하여 하기 실험을 수행하였다.
실시예 1: 차조기 추출물의 항산화 효과
차조기 추출물에 대한 항산화 효과 중 하나인 활성산소에 포함된 자유라디칼 소거효과를 평가하기 위해 DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl)을 이용한 자유라디칼 소거활성 시험을 실시하였다.
구체적으로, 상기 제조예 1에서 제조한 차조기 추출물을 에탄올을 이용하여 0.01 %, 0.05 %, 0.1 %, 1 % 농도로 조제한 용액을 96 well plate에 100μL 분주하고 0.2mM DPPH (Ethanol) 100μL를 넣었다. 실온에서 30분간 차광상태로 반응시킨 후 517nm 파장에서 흡광도를 측정하고 다음의 [계산식 1]을 이용한 DPPH 자유라디칼 소거활성을 측정하였다. 양성 대조물로는 아스코르빈산(ascorbic acid)을 사용하였다. 이에 대한 결과를 표 1에 나타내었다.
[계산식 1]
DPPH free radical scavenger activity (%) = 1 ?? A/B x 100
(A: 시험물질의 흡광도, B: 공시료의 흡광도)
Group N 농도(%) OD517 DPPH 자유라디칼 소거활성 (%)
Mean ± S.D. Mean ± S.D.
G1
(TS)		 3 0 0.725 ± 0.010 -
3 0.01 0.619 ± 0.005 14.58* ± 0.56
3 0.05 0.153 ± 0.012 78.95* ± 1.56
3 0.1 0.040 ± 0.005 94.51* ± 0.70
3 1 0.029 ± 0.077 95.99* ± 10.65
G2
(PC)		 3 0 0.691 ± 0.019 -
3 0.0005 0.551 ± 0.022 20.31* ± 0.99
3 0.001 0.396 ± 0.007 42.73* ± 0.86
3 0.0015 0.229 ± 0.010 66.84* ± 0.51
3 0.002 0.069 ± 0.011 90.01* ± 1.28
TS : 시험물질, PC : 양성대조군
- : 측정안됨, N : 웰(well) 수, S.D. : 표준편차
* : 대조군과 대비하여 현저한 차이가 있음(p<0.05)
상기 표 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 차조기 추출물은 0.01 %, 0.05 %, 0.1 %, 및 1 % 농도에서 각각 14.58 %, 78.95 %, 94.51 % 및 95.99 %의 DPPH 자유라디칼 소거활성을 농도 의존적으로 나타내었다.
실시예 2: 차조기 추출물의 항주름 효과
차조기 추출물의 항주름 효과를 시험하기 위하여 섬유아세포(fibroblast)를 배양한 후 시료의 세포 내 콜라게나제 양을 공시험액과 비교하여 콜라게나제 활성 억제 정도를 평가하였으며, 이는 식품의약품안전처 "피부의 주름개선에 도움을 주는 기능성화장품 유효성평가 가이드라인"에 준하여 실시하였다.
실험에 사용한 인간 유래 섬유아세포인 CCD-986SK 세포는 ATCC CRL-1947TM 으로부터 공급받아 사용하였으며 차조기 추출물의 MMP-1 발현에 미치는 영향을 확인하기 위해 Human MMP-1 ELISA kit(Sigma-aldrich)를 사용하였다.
구체적으로, CCD-986SK 세포를 플레이트에 분주하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양 후, 배지를 버리고 인산완충생리식염수(PBS, phophate buffered saline)로 세척한 다음 PBS 2mL을 넣고 자외선 (UVB, 312nm) 10mJ을 조사하였다. 무혈청 배지를 이용하여 시험물질인 차조기 추출물 31.3 μg/mL, 62.5 μg/mL, 125 μg/mL 및 양성대조군 Adenosine 100 μg/mL를 제조하여 자외선 조사한 CCD-986SK 세포에 시험물질 및 양성대조물질이 포함된 무혈청 배지로 교체하여 37℃, 5% CO2 배양기에 24시간 추가 배양하였다. 세포배양액을 회수하여 BCA protein assay reagent kit (Thermo scientific PIERCE, USA)를 이용 BSA 표준 곡선에 따라 단백질 함량을 측정하였고, Humman MMP-1 ELISA Kit (SIGMA)에 따라 콜라게나제 표준 곡선을 이용 콜라게나제 함량을 측정하였다. 세포내 콜라게나제 함량은 단백질 함량에 대한 콜라게나제 함량으로 환산하였으며, 다음 [계산식 2]에 따라 산출하였다. 그 결과를 표 2 및 도 1에 나타내었다.
[계산식 2]
Figure pat00001
Group Substance Dose Humman MMP-1 Conc. (pg/mL) Protein Conc. (μg/mL) Humman MMP-1 Conc. (pg/mL)
G1 - - Mean 1605.949 834.857 100.00
S.D. 48.862 11.242 2.67
N 3 3 3
G2 Adenosine 100 μg/mL Mean 914.737 815.933 58.23
S.D. 117.434 9.576 6.92
N 3 3 3
G3 차조기 추출물 31.3 μg/mL Mean 1297.768 744.568 90.63
S.D. 36.093 25.708 0.87
N 3 3 3
G4 62.5 μg/mL Mean 1076.145 770.593 72.63
S.D. 34.580 16.282 3.04
N 3 3 3
G5 125 μg/mL Mean 955.361 772.906 64.33
S.D. 28.655 43.780 2.02
N 3 3 3
N: Number of well
S.D.: Standard deviation
Conc.: Concentration
상기 표 2 및 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 차조기 추출물은 31.3 μg/mL, 62.5 μg/mL, 125 μg/mL 농도에서 각각 90.63±0.87%, 72.63±3.04%, 64.33±2.02%으로 세포 내 콜라게나제 활성 억제가 관찰되었으며, 차조기 추출물 125 μg/mL 처리한 농도군에서 최대 64.33ㅁ2.02%의 세포 내 콜라게나제 활성을 억제하였음을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 차조기 추출물의 항염 효과
차조기 추출물의 마우스 대식세포 RAW264.7에서의 염증억제 유효성을 평가하기 위하여 NO assay를 통한 nitrate 생성억제 확인 시험으로 식품의약품안전처 "건강기능식품 기능성 평가 가이드[민원인 안내서](면역기능 개선에 도움편)"을 참고하여 시험을 실시하였다.
구체적으로, 마우스 대식세포인 RAW264.7 세포를 24well pate에 2×105 mL/well 개로 분주하고 배양기에서 24 시간 배양하였다. 이후 차조기 추출물을 125 ㎍/mL, 250 ㎍/mL, 500 ㎍/mL을 포함한 무혈청 배지로 교체하여 2시간 추가 배양 후 Lipopolysaccharides (LPS) 1 ㎍/mL를 처리하고 24시간 배양을 통해 염증을 인위적으로 유발 시켰다. 배양이 끝난 후 모든 군의 세포 배양액을 수거하여, Nitrate Assay Kit (Sigma-aldrich, USA)를 이용하여 질산염 발현을 확인하였으며, 질산염 발현 정도는 Microplate reader (Epoch)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정함으로써 질산염(nitrate) 발현을 확인하였다. 유발대조군은 LPS 1 ㎍/mL만을 처리하였다. 그 결과를 표 3 및 도 2에 나타내었다.
시료 NO 생성율 (%)
Control 59.0
유발 대조군 100.0
차조기 추출물 125 μg/mL 83.0
차조기 추출물 250 μg/mL 79.5
차조기 추출물 500 μg/mL 61.2
상기 표 3 및 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 차조기를 125 ㎍/mL, 250 ㎍/mL 및 500 ㎍/mL의 농도로 처리한 세포주에 LPS로 염증자극을 유발하여 nitrate 발현을 확인한 결과, 유발대조군(2.148 ± 0.390 nmole)과 비교하여 차조기 추출물 125 ㎍/mL (1.784 ± 0.042 nmole, 유발대조군 대비 83.0 %), 250 ㎍/mL (1.708 ± 0.039 nmole, 유발대조군 대비 79.5 %) 및 500 ㎍/mL (1.315 ± 0.008 nmole, 유발대조군 대비 61.2%)로 통계적으로 유의한 감소 결과가 관찰되어 차조기 추출물은 염증 억제에 효과적임을 확인할 수 있었다.
제조예 2: 차조기 추출물이 함유된 핸드크림 제조
상기 제조예 1의 차조기 추출물이 함유된 하기 표 4와 같은 성분을 혼합하여 핸드크림을 제조하였다.
성분 함량(중량%)
정제수 75
글리세린 6
세테아릴알코올 5
차조기 추출물 4
에탄올 1
식물성 오일류
(해바라기씨 오일, 마카다미아씨 오일, 스위트아몬드 오일)		 6
시어버터 2
트로메타인 0.5
잔탄검 0.5
실시예 4: 차조기 추출물이 함유된 핸드크림의 항균 효과
상기 제조예 2의 차조기 추출물이 함유된 핸드크림의 항균 활성을 평가하기 위해 한국건설생활환경에 의뢰하여 수행하였으며, KCL-FIR-1002:2018의 시험방법에 따라 실시하였다.
구체적으로, 시험을 위한 시험대상 균주 3종을 이용하여 0.2g/mL의 항균 활성 시험용 샘플에 균주를 접종하고 24시간 후 시험체에 존재하는 균의 농도를 확인하여 세균 감소율을 시험하였다. 시험대상 균주는 대장균의 경우 Eschericia coli ATCC 25922, 황색포도상구균의 경우 Staphylococcus aureus ATCC 6538, 폐렴균의 경우 Klebsiella pneumoniae ATCC 4352를 사용하였다. 각 접종균은 대장균 2.8 × 104 CFU/mL, 황색포도상구균 2.0 × 104 CFU/mL, 폐렴균 1.5 × 104 CFU/mL의 농도로 각각 주입하였다. 주입 후 24시간 지낸 후 각 군에서 형성된 집락(colony)수를 계수하고, 시험제품을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 시험제품 처리군의 감소율(%)을 다음 [계산식 3]을 이용하여 계산하였다. 이에 대한 결과를 하기 표 5 및 도 3 내지 5에 나타내었다.
[계산식 3]
Figure pat00002
시험항목 시료 초기균수(CFU/mL) 결과값(CFU/mL) 감소율 (%)
대장균 대조군 2.8 × 104 8.3 × 105 -
제조예 2 2.8 × 104 <10 99.9
황색포도상구균 대조군 2.0 × 104 7.7 × 106 -
제조예 2 2.0 × 104 <10 99.9
폐렴균 대조군 1.5 × 104 7.2 × 105 -
제조예 2 1.5 × 104 <10 99.9
노출시간 : 24시간
ND : Not Detected
상기 표 4 및 도 3 내지 도 5에서 볼 수 있는 바와 같이, 차조기 추출물의 핸드크림은 대장균(Escherichia coli), 포도상구균(Staphylococcus aureus)과 폐렴균(Klebsiella pneumoniae)의 3종의 균주에 대해 99.9%의 항균 활성을 보임을 확인할 수 있었다.
비교예 1: 알코올이 함유된 핸드크림 제조
상기 표 4의 핸드크림 조성에 있어서 차조기 추출물을 제외하고 에탄올을 5 중량%로 하여 동일하게 핸드크림을 제조하였다.
실시예 5: 핸드크림의 항균 및 피부 변화 등 확인
만 26~53세 이하의 성인 남, 여로서 피부질환을 포함하는 급, 만성 신체질환이 없는 건강한 사람 32명을 2그룹으로 나눈 후 시험 1시간 전부터 수세하지 않은 상태에서 1일 2회(오전 10시 및 오후 4시)에 1그룹은 제조예 1의 핸드크림 3ml를, 다른 1그룹은 비교예 1의 핸드크림 3ml를 손바닥과 손등에 충분히 문지렀다. 이러한 실험을 7일 동안 수행하였으며, 1일 1회의 경우는 제조예 1 및 비교예 1의 핸드크림 사용 전과 사용 후 2분 경과 시점에 면봉으로 손바닥의 동일 지점으로부터 채취한 후 표준한천배지(PCA)에서 배양하여 미생물의 살균 여부를 확인하였다. 또한, 7일차 마지막 세정 후 각 시험자로부터 피부의 이상 반응 여부, 피부의 거칠기 및 갈라짐에 대한 설문을 조사하였다.
그 결과, 제조예 1 및 비교예 1의 핸드크림 사용 전에는 미생물이 검출되었으나 사용 후에는 모두 미생물이 검출되지 않아 제조예 1 및 비교예 1의 핸드크림 모두 미생물의 살균 효과가 우수한 것임을 확인할 수 있었다.
또한, 제조예 1 및 비교예 1의 핸드크림을 사용한 시험자 모두 특별한 피부의 이상 반응은 나타나지 않았다.
다만, 비교예 1의 핸드크림을 사용한 시험자는 피부의 거칠기 및 갈람짐이 있다는 시험자가 8명으로 조사되었으나, 제조예 1의 핸드크림을 사용한 시험자는 피부의 거칠기 및 갈람짐이 있다는 시험자가 0명으로 조사되었다.
따라서 본 발명에 따른 제조예 1의 핸드크림은 미생물의 살균 효과뿐만 아니라 피부를 보호하는 효과도 우수함을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 인체피부 자극실험
상기 제조예 2의 본 발명에 따른 차조기 추출물이 함유된 핸드크림의 인체피부 자극실험을 수행하였다.
구체적으로, 만 26~53세 이하의 성인 남여로서 피부질환을 포함하는 급, 만성 신체질환이 없는 건강한 사람 32명을 대상으로 식품의약품안전처 고시 제2019-47호 기능성화장품의 심사에 관한 규정 중 안전성에 관한 제출 자료에 해당하는 인체피부 일차자극시험을 실시하였다.
시험부위를 정제수로 세척 및 5분간 자연건조 후 시험제품을 20μL 적하시킨 IQ chamber를 측정부위인 등 부위에 고정하여 24시간 동안 폐쇄첩포하였다. 24시간 후 IQ chamber를 제거하고 첩포제거 30분, 24시간 후에 각 시험부위의 피부반응도를 International Contact Dermatitis Research Group(ICDRG)의 판정기준에 따라 판정하였다.
아래의 공식을 이용하여 각 시험부위에 대한 평균 피부 반응도를 계산하여 산출된 피부반응도를 기준으로 피부자극도를 판정하였다.
[계산식 4]
Figure pat00003
그 결과, 시험자 모두 피부자극지수가 0.00으로 나타나 무자극 범주로 판정되었으며, 특별한 피부의 이상 반응은 나타나지 않았는바, 피부에 안전한 조성물임을 확인할 수 있었다.

Claims (7)

  1. 차조기 추출물을 포함하는 항산화용, 항균용, 염증의 예방 또는 개선용, 또는 주름의 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
  2. 차조기 추출물을 포함하는 항산화용, 항균용, 염증의 예방 또는 개선용, 또는 주름의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  3. 차조기 추출물을 포함하는 항산화용, 항균용, 염증의 예방 또는 치료용, 또는 주름의 예방 또는 치료용 의약외품 조성물.
  4. 알코올을 함유한 세정제에서 상기 알코올을 차조기 추출물로 대체하여 포함된 항균 및 피부 보호용 세정제.
  5. 제4항에 있어서, 상기 대체는 세정제에 함유된 알콜올 함량의 100 내지 60%를 차조기 추출물로 함유하는 것인 항균 및 피부 보호용 세정제.
  6. 알코올을 함유한 핸드크림에서 상기 알코올을 차조기 추출물로 대체하여 포함된 항균 및 피부 보호용 핸드크림.
  7. 제6항에 있어서, 상기 대체는 핸드크림에 함유된 알콜올 함량의 100 내지 60%를 차조기 추출물로 함유하는 것인 항균 및 피부 보호용 핸드크림.
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