KR20220140580A - 새로운 키토산 유도체 합성 방법 및 이의 용도 - Google Patents

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KR20220140580A
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노보치졸 에스에이
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Abstract

본 발명은 신규 가교 키토산, 이의 제제, 조성물 및 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 적어도 하나의 생물활성제에 대한 활성제 및 전달 시스템으로서 유용한 나노입자 및 이의 조성물에 관한 것이다.

Description

새로운 키토산 유도체 합성 방법 및 이의 용도
본 발명은 특히 화학, 생물학, 의학 및 재료 과학 분야에서 키토산, 특히 키토산으로부터의 나노입자의 제조, 이의 제제, 조성물 및 용도에 관한 것이다.
바이오폴리머는 생체적합성, 생분해성, 투여 시 무독성으로 인해 다양한 약물 및 기타 활성 물질의 운반체로서 유망한 물질이다. 적절한 화학적 변형으로 이러한 폴리머는 활성 물질이 저분자량 화합물(소분자) 또는 고분자량 화합물(거대분자)일 수 있는 약물 전달 시스템에 더 나은 재료를 제공할 수 있다. 나노구조의 약물 운반체는 핵산 및 단백질과 같은 고분자 화합물의 전달을 가능하게 한다 (Advances in Polymer Science. Chitosan for Biomaterials I. Volume Editors: R. Jayakumar, M. Prabaharan, R.A.A. Muzzarelli. Springer Heidelberg Dordrecht London New York 2011 DOI 10.1007/978-3-642-23114-8).
키토산은 나노 입자 생성을 위한 가장 유망한 생체 고분자 후보 중 하나이다. 한편으로는 점막 접착성, 생체 적합성 및 낮은 독성, 생분해 능력 및 복합체 형성과 같은 매력적인 고유 특성을 가지고 있고, 다른 한편으로는, 구조의 높은 규칙성과 그 내부에 하이드록실 및 아미노기의 존재는 중합체의 선택적 변형에 대한 좋은 전망을 제시한다.
따라서 이러한 키토산의 특성은 약물 전달 솔루션 개발에 대한 관심을 끌었다(Bhattarai et al., 2010, Advanced Drug Delivery Reviews, 62 83-99. doi: 10.1016 / j.addr.2009.07.019).
키토산은 우수한 담체로서 몇 가지 유리한 특성을 나타내지만, 생리학적 조건에서 낮은 용해도로 인해 변형되지 않은 키토산의 사용이 제한된다. 이러한 한계를 극복하기 위해 키토산의 다양한 화학적 변형이 개발되었다(Kritchenkov et al., 2017, Russ. Chem. Rev., 86, 231-239. http://dx.doi.org/10.1070/RCR4636; Chuanet al., 2019, Adv. Colloid Interface Sci., 268, 25-38.; Jiang, H.-L.; Xing et al., 2018, Curr. Org. Chem., 22, 668-689. DOI: 10.2174/1385272821666170926163544; Layek, B.; Singh, J. 8―Chitosan for DNA and gene therapy. In Chitosan Based Biomaterials Volume 2; Jennings, J.A., Bumgardner, J.D., Eds.; Woodhead Publishing: Cambridge, UK, 2017; pp. 209-244).
키토산의 구조는 다양한 방식으로 변형될 수 있는 가능성을 제공한다. 소수성을 증가시키기 위해 키토산 아미드는 지방산, 스테롤 유도체, 유로칸산, 이미다졸 단편을 포함하는 카르복실산 유도체 등으로 쉽게 만들 수 있다. 대안적으로, 2차 키토산 아민은 적절한 쉬프 염기를 통한 알킬화 또는 환원성 아민화에 의해 다양한 구조의 알킬 치환체, 피리딘 유도체, 스페르미딘 등을 사용하여 형성될 수 있다. 친수성을 증가시키기 위해 키토산 아미드는 황 함유 아미노산, 락토비온산, 티오글리콜산 등을 포함한 아미노산으로 생성될 수 있다. 추가적으로, 키토산의 2차 아민은 다양한 당, 폴리에틸렌이민 및 그 유도체를 사용하여 얻을 수 있다. 페길화(pegylation)에 의한 폴리에틸렌 글리콜 유도체의 합성이 특히 인기가 있다. 이러한 방법에 따라 생산된 키토산 유도체는 특히 핵산과 같은 고분자 전해질과 함께 나노입자를 형성하는 능력이 향상되고 약리학적 특성이 변경될 수 있다(Mao et al., 2010, Advanced Drug Delivery Reviews, 62, 12-27 doi:10.1016/j.addr.2009.08.004).
키토산 나노 입자는 이러한 가교를 촉매하기 위한 다른 시약을 사용하여 공유 결합의 형성을 포함하는 화학적 가교를 통해 본질적으로 비가역적인 방식으로 형성될 수 있다(Bhattarai et al., 2010, supra). 역사적으로 글루타르알데하이드와 포름알데하이드는 이 가교에 사용된 최초이자 가장 인기 있는 제제였지만 오늘날에는 이러한 독성 화합물의 흔적을 모두 제거하는 어려움과 이러한 알데하이드를 방출하는 나노입자의 느린 가수분해로 인해 인기를 잃어가고 있다. 제니핀(Genepine)은 최근 많은 주목을 받고 있지만 이 시약은 매우 고가이며 중합되기 쉽다. 디에틸 스퀘어레이트(DES), 에틸렌글리콜 디글리시딜에테르(EGDE) 및 차단된 디이소시아네이트는 다소 천천히 반응하며 그 후 반응은 주로 상승된 온도에서 일어나서 부반응에 기여할 수 있다. 광 활성화 가교 시약: 작용성 아지드, 작용성 아크릴레이트 및 효소 활성화제 - 플로레트산 및 활성화 퀴논도 존재한다. 예를 들어, Baoqiand et al., 2015 in Acta Biomaterialia, 22, 1742-7061 or Journal of Nanotechnology in engineering and medicine, 6, 041001-6 은 키토산을 메타크릴산 무수물과 반응시켜 겔 또는 폼 형태의 폴리아크릴아미드 화합물을 생성한 후 용액에서 키토산의 광개시 라디칼 중합을 사용하여 가교 키토산을 제조하는 방법을 제공한다. 키토산의 카르복시메틸 유도체는 El-sherbiny et al., 2009, European Polymer Journal 45, 1, 199-210 에 설명되어 있는 바, 제1 단계에서는 키토산의 1차 알코올기를 알칼리성 매질에서 모노클로로아세트산과 반응시켜 카르복실기를 키토산에 도입하고 제2 단계에서는 아크릴로일글리신 중합체를 광유도 중합을 통해 첨가하여 내부 가교 없이 키토산을 생성한다. US 5,770,712는 미반응 1차 아민 기를 갖는 키토산 물질을 2개 이상의 에폭사이드 기를 갖는 과량의 다작용성 에폭사이드 화합물과 조합함으로써 가교 키토산을 제조하는 방법을 기재하고 있다. 키토산의 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르과의 가교 반응은 생리학적 pH (7 이상)에서 난용성인 키토산의 아미노-에탄올 가교 유도체를 생성한다.
알데히드기를 함유하는 키토산과 쉬프 염기의 형성, 말단 설프히드릴기를 갖는 시약에 의해 미리 작용기화된 키토산과의 이황화 가교 형성 및 약염기 존재 하에서 기능성 아크릴레이트로 미리 처리된 키토산과 함께 마이클(Michael)을 추가하는 것을 통해 사전-유도체화된 키토산의 가교에 사용하는 것도 가능하다.
이 모든 방법은 키토산이 용액에 있을 때 나노입자의 형성을 포함한다. 일부 경우에는 모든 화학 반응이 액체 상태에서 완료될 때까지 진행되고, 다른 경우에는 분무 건조 또는 동결건조 동안이나 이후와 같은 나중 단계에서 완료된다. 중요한 것은 모든 경우에 공정이 시작되고 핵심 단계는 용해된 상태의 키토산에서 발생한다는 것이다(Jayakumar et al., 2011, supra). 용해될 키토산의 필요성은 나노입자의 합성에 상당한 제약을 준다. 이것은 키토산이 산의 존재하에서 염의 형태인 경우에만 수용성이라는 사실에 기인한다. 이 형태에서는 2% 키토산 이상의 용액에 대해 농도가 증가함에 따라 점도가 비정상적으로 증가하며, 이는 가능한 합성 구현 및 반응 장치의 높은 처리량 가능성에 상당한 제한을 가한다. 특히, 점성 용액을 혼합할 때에 벽 효과 (wall-effects)는 반응 용기의 시약 농도에 상당한 이질성을 이질성을 가져오고 결과적으로 나노 입자의 특성에 이질성을 줄 수 있다. 또 다른 난제는 높은 친핵성 아미노기가 가교에 가장 자주 사용되지만 용액에서는 키토산을 용해된 상태로 유지하기 위해 온화되어야 한다는 것이다.
따라서 효율적이고 비용 효율적인 방식으로 키토산 나노입자를 형성하기 위한 새로운 합성 경로를 개발할 필요가 있다.
본 발명은 키토산으로부터 나노입자를 제조하는 새로운 방법의 예상치 못한 발견에 관한 것으로, 키토산 출발 물질을 용해할 필요를 피하고 따라서 염의 형성이나 희석된 산성 수용액의 사용에 의존하거나 용액 중에 키토산을 분산시킬 필요를 피하고 따라서 유화, 분쇄 또는 중합체의 완전성에 기계적 영향을 미칠 수 있는 기타 절차에 의존할 필요를 피하는 이점을 제공한다. 특히, 본 발명은 특히 2개의 화학적 단계를 통해 키토산 분자의 상이한 부분 사이에 새로운 화학내 결합이 형성되는 새로운 가교 키토산 방법에 관한 것이다. 특정 측면에 따르면, 키토산의 용해의 부재는 보다 효율적인 합성 전환율 (예를 들어, 용해된 키토산을 사용한 가교 방법에 비해 약 200배 크기)을 유도한다.
생성된 생성물은 제조 방법의 두 번째 단계가 끝날 때 자발적으로 나노 입자를 형성하며, 이러한 나노 입자는 광범위한 적용에 적합하다. 더욱 유리하게는, 생성된 가교 키토산 생성물은 표준 선형 또는 분지형 키토산의 생물학적 활성과 유사한 생물학적 활성을 갖지만, 예상외로 광범위한 생물학적 관련 pH 또는 미생물 조건 및 물리화학적 특성 측면에서 안정성 측면에서 몇 가지 특정 이점을 나타내므로 보다 쉽게 사용할 수 있다.
본 발명의 일 측면은 본 발명에 따른 가교 키토산의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 새로운 가교 키토산, 특히 나노입자를 자발적으로 형성하는 새로운 가교 키토산에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명에 따른 적어도 하나의 가교 키토산 및 적어도 하나의 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명에 따른 적어도 하나의 가교 키토산 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명에 따른 하나의 가교된 키토산을 포함하는 나노입자에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명에 따른 적어도 하나의 가교 키토산을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명에 따른 적어도 하나의 가교 키토산 또는 본 발명에 따른 이의 조성물을 포함하는 연조직 충전제에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명에 따른 적어도 하나의 가교 키토산을 포함하는 상처 드레싱에 관한 것이다.
또 다른 특정 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 적어도 하나의 가교 키토산 또는 이의 조성물을 포함하는 재건 조직이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명에 따른 적어도 하나의 가교 키토산을 포함하는 농업용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명에 따른 적어도 하나의 가교 키토산 또는 이의 나노입자를 포함하는 조성물(예를 들어, 연조직 충전제, 상처 드레싱 또는 재건 조직)의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 생체내(in vivo) 약물 전달, 시험관내(in vitro) 세포 또는 생물학적 조직 배양 및 조직 공학 적용에 사용하기 위한 본 발명에 따른 가교 키토산에 관한 것이다.
또 다른 특정 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 적어도 하나의 가교 키토산 또는 이의 조성물을 포함하는 세포 또는 생물학적 조직 배양 배지가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면은 의학적 장애 및, 특히 심장 부정맥, 특히 심방세동 및 고혈압과 같은 심혈관 질환, 류마티스 관절염, 골관절염, 척추관절염과 같은 관절 병리 및 관절 질환, 및 연골, 뼈, 인대 또는 활액낭 손상으로 이어지는 외상성 사고, 안구 건조 증후군, 포도막염, 녹내장, 각막 병변 등의 눈 병리 및 부상, 루푸스 및 다발성 근염과 같은 결합 조직 장애, 피부/점막 장애 또는 상처, 흉터, 건선, 여드름, 습진, 주사비와 같은 부상, 물리적 또는 화학적 성질의 화상, 특히 외과적 상처 및 일광 화상, 궤양, 치질, 치주 및 치과 질환, 우발적 손상 또는 뇌 및 중추 신경계 수술 후와 같은 경막 손상, 악성 및 양성 신생물, 특히 암종, 육종, 림프종 및 흑색종, 수술 후 누공 및 감염, 종양 또는 혈관 기형과 같은 합병증의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 가교 키토산에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 의학적 장애 및 특히 심장 부정맥, 특히 심방세동 및 고혈압과 같은 심혈관 질환, 류마티스 관절염, 골관절염, 척추관절염과 같은 관절 병리 및 관절 질환, 및 연골, 뼈, 인대 또는 활액낭 손상으로 이어지는 외상성 사고, 안구 건조 증후군, 포도막염, 녹내장, 각막 병변 등의 눈 병리 및 부상, 루푸스 및 다발성 근염과 같은 결합 조직 장애, 상처, 흉터, 건선, 여드름, 습진, 주사비와 같은 피부/점막 장애 또는 부상, 물리적 또는 화학적 성질의 화상, 특히 외과적 상처 및 일광 화상, 궤양, 치질, 치주 및 치과 질환, 우발적 손상 또는 뇌 및 중추 신경계 수술 후와 같은 경막 손상, 악성 및 양성 신생물, 특히 암종, 육종, 림프종 및 흑색종, 수술 후 누공 및 감염, 종양 또는 혈관 기형과 같은 합병증의 예방 및/또는 치료를 위한 제약 제제의 제조를 위한 본 발명에 따른 가교 키토산의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 세포 또는 생물학적 배양 배지 또는 재건 조직의 제조를 위한 본 발명에 따른 가교 키토산의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 생물활성제용 약물 전달 시스템의 제조 방법에 관한 것이다.
또 다른 특정 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 방법으로부터 수득가능한 가교 키토산을 확인하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면은 의학적 장애 및, 특히 심장 부정맥, 특히 심방세동 및 고혈압과 같은 심혈관 질환, 류마티스 관절염, 골관절염, 척추관절염과 같은 관절 병리 및 관절 질환, 및 연골, 뼈, 인대 또는 활액낭 손상으로 이어지는 외상성 사고, 안구 건조 증후군, 포도막염, 녹내장, 각막 병변 등의 눈 병리 및 부상, 루푸스 및 다발성 근염과 같은 결합 조직 장애, 상처, 흉터, 건선, 여드름, 습진, 주사비와 같은 피부/점막 장애 또는 부상, 물리적 또는 화학적 성질의 화상, 특히 외과적 상처 및 일광 화상, 궤양, 치질, 치주 및 치과 질환, 우발적 손상 또는 뇌 및 중추 신경계 수술 후와 같은 경막 손상, 악성 및 양성 신생물, 특히 암종, 육종, 림프종 및 흑색종, 수술 후 누공 및 감염, 종양 또는 혈관 기형과 같은 합병증의 예방, 치료 또는 개선하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 발명에 따른 적어도 하나의 가교 키토산 또는 이의 약제학적 제형의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 적어도 하나의 가교된 키토산 또는 이의 조성물, 예를 들어, 동결건조된 형태의 키토산을 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 물질, 예를 들어, 생물활성제, 약물 물질, 단백질, 항체, 당류, 핵산, 또는 이들의 조합의 캡슐화를 위한 나노입자의 제조, 또는 본 발명의 적어도 하나의 가교 키토산 또는 이의 조성물을 포함하는 예방 또는 치료용 물질의 제조를 위한 키트에 관한 것이다.
생성된 생성물은 제조 방법의 두 번째 단계가 끝날 때 자발적으로 나노 입자를 형성하며, 이러한 나노 입자는 광범위한 적용에 적합하다. 더욱 유리하게는, 생성된 가교 키토산 생성물은 표준 선형 또는 분지형 키토산의 생물학적 활성과 유사한 생물학적 활성을 갖지만, 예상외로 광범위한 생물학적 관련 pH 또는 미생물 조건 및 물리화학적 특성 측면에서 안정성 측면에서 몇 가지 특정 이점을 나타내므로 보다 쉽게 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 가교 키토산 나노입자의 특성을 나타낸다(실시예 2i). A: 실시예 3에 기재된 바와 같이 염색된 키토산(3.2% 가교된 501 kDa 키토산)의 현미경 사진에 의한 것; B: 비교 선형 키토산(B1) 및 상응하는 본 발명의 가교 키토산 나노입자(B2), 고배율(B3) 및 저배율(B4)에서 본 발명의 가교 키토산 나노입자의 건조 필름의 원자력 현미경.
도 2는 실시예 4에 기재된 형광 현미경에 의해 측정된 쥐 백혈구에서의 본 발명의 가교 키토산 나노입자(실시예 2i)의 내재화를 나타낸다. A: 백혈구 경계; B: 핵 DNA(Hoechst 33258, 강렬한 청색 형광); C: 세포내이입된 FITC-표지된 가교 키토산(녹색 형광); D: 혼합된 파란색/녹색 형광(파란색: 세포질의 배경 비특이적 및/또는 비핵성 DNA, 녹색: 세포내이입된 FITC 표지된 가교 키토산).
도 3은 실시예 4에 기재된 바와 같이 FITC-FAM 형광에 의해 각막 표면에 남아 있는 표준 키토산(A)과 비교하여 쥐 각막에서 본 발명의 가교 키토산 나노입자(실시예 2i)(B)의 내재화를 나타낸다. A: 각막; B: 키토산(밝은 녹색 형광).
도 4는 비교예의 비가교 표준 키토산(A1: 양이온에 대한 총 이온 전류) 및 (A2: 관심 이온 영역(낮은 m/z 비율)); 및 실시예 3에 기재된 바와 같이 본 발명의 가교 키토산 (B1: 양이온 및 B2(관심 이온 영역(낮은 m/z 비율))에 대한 총 이온 전류)의 질량 분석 분석을 나타낸다.
도 5는 5V(A) 및 15V(B)의 충돌 에너지에서 m/z = 180 화합물 및 5V(C) 및 15V(D)의 충돌 에너지에서 m/z =252 화합물의 충돌 연구 결과 스펙트럼 및 실시예 3에 기재된 바와 같은 난 리소자임(E)의 가수분해로부터 생성된 스펙트럼을 나타낸다.
도 6 은 대조군과 비교한 실시예 6에 기술된 바와 같이 발아 챔버(A) 에서 봄 밀 종자의 발아 과정(1일 후 치근 (radicle) 출현 측정, 3일 후 발아 에너지 측정; 7일 후 발아능력 측정) 및 토양 기재(B)(종자는 파종 7일 전에 처리함)에서 봄 밀 묘목의 기공 부분의 성장 증가(대조군에 대한 % 증가율)에 대한 본 발명의 가교 키토산 처리(물 중 0.1% w/w 또는 0.05% w/w)의 효과를 나타낸다. 1일 후 측정, 발아 에너지는 3일 후 측정, 발아 능력은 7일 후) 및 토양 기재(B)(종자는 파종 7일 전에 처리함)에 대해 측정하였다.
본 명세서에 사용된 용어 "가교도(degree of crosslink)"는 키토산 상에 초기에 존재하는 작용기의 총량에 대한 가교 또는 그래프팅 결합으로 전환된 작용기의 양을 의미하며, 백분율로 표시된다.
단독으로 또는 다른 용어와 조합하여 사용될 때 용어 "알킬"은 1 내지 50개의 탄소 원자를 갖는 1가 알킬기를 지칭하는 C1-C50 알킬의 직쇄 또는 분지쇄를 포함한다. 이 용어는 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, s-부틸, i-부틸, t-부틸, n-펜틸, 1-에틸프로필, 2-메틸부틸, 3-메틸부틸, 2,2-디메틸프로필, n-헥실, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 4-메틸펜틸, n-헵틸, 2-메틸헥실, 3-메틸헥실, 4-메틸헥실, 5-메틸헥실, n-헵틸, n-옥틸, n-노닐, n- 데실, 테트라히드로게라닐, n-도데실, n-트리데실, n-테트라데실, n-펜타데실, n-헥사데실, n-옥타데실, n-노나데실 및 n-에이코사닐 등과 같은 작용기로 예시된다. 바람직하게는, 이들은 C1-C9 알킬, 보다 바람직하게는 C1-C6 알킬, 특히 바람직하게는 C1-C4 알킬을 포함하며, 이는 유추에 의해 각각 1 내지 9개의 탄소 원자를 갖는 1가 알킬기, 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 1가 알킬기 및 탄소수 1 내지 4의 1가 알킬기를 지칭한다. 특히, 이들은 C1-C6 알킬을 포함한다.
단독으로 또는 다른 용어와 조합하여 사용되는 경우 용어 "알케닐"은 직쇄 또는 분지형 C2-C50 알케닐을 포함한다. 임의의 사용 가능한 위치에서 사용 가능한 수의 이중 결합을 가질 수 있으며 이중 결합의 배열은 (E) 또는 (Z) 배열일 수 있다. 이 용어는 비닐, 알릴, 이소프로페닐, 1-프로페닐, 2-메틸-1-프로페닐, 1-부테닐, 2-부테닐, 3-부테닐, 2-에틸-1-부테닐, 3-메틸- 2-부테닐, 1-펜테닐, 2-펜테닐, 3-펜테닐, 4-펜테닐, 4-메틸-3-펜테닐, 1-헥세닐, 2-헥세닐, 3-헥세닐, 4-헥세닐, 5-헥세닐, 1- 헵테닐, 1-옥테닐, 게라닐, 1-데세닐, 1-테트라데세닐, 1-옥타데세닐, 9-옥타데세닐, 1-에이코세닐 및 3,7,11,15-테트라메틸-1-헥사데세닐 등과 같은 작용기로 예시된다. 바람직하게는, 이들은 C2-C8 알케닐, 보다 바람직하게는 C2-C6 알케닐을 포함한다. 그 중에서도 비닐 또는 에테닐(-CH=CH2), n-2-프로페닐(알릴, -CH2CH=CH2), 이소프로페닐, 1-프로페닐, 2-메틸-1-프로페닐, 1-부테닐, 2-부테닐 및 3-메틸-2-부테닐 등이 특히 바람직하다.
단독으로 또는 다른 용어와 조합하여 사용될 때 용어 "알키닐"은 직쇄 또는 분지형 C2-C50 알키닐을 포함한다. 사용 가능한 위치에서 사용 가능한 수의 삼중 결합을 가질 수 있다. 이 용어는 2-50개의 탄소수를 가질 수 있는 알키닐기와 선택적으로 이중 결합을 가질 수 있는 에티닐(-C
Figure pct00001
CH), 1-프로피닐, 2-프로피닐(프로파길: -CH2C
Figure pct00002
CH), 2-부티닐, 2-펜텐-4-이닐 등과 같은 기로 예시된다. 특히, 이들은C2-C8 알키닐, 보다 바람직하게는 C2-C6 알키닐 등을 포함한다. 바람직하게는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖고 적어도 1 또는 2개의 알키닐 불포화 부위를 갖는 기를 지칭하는 C2-C6 알키닐을 포함한다.
용어 "아릴"은 단일 고리(예: 페닐) 또는 다중 축합 고리(예: 인데닐, 나프틸)를 갖는 6 내지 14개의 탄소 원자의 불포화 방향족 탄소환식 기를 지칭한다. 아릴은 페닐, 나프틸, 안트릴, 페난트레닐 등을 포함한다.
용어 "C1-C6 알킬 아릴"은 메틸 페닐, 에틸 페닐 등을 포함하는, C1-C6 알킬 치환기를 갖는 아릴기를 지칭한다.
용어 "아릴 C1-C6 알킬"은 3-페닐프로파닐, 벤질 등을 포함하는, 아릴 치환기를 갖는 C1-C6 알킬기를 지칭한다.
용어 "헤테로아릴"은 모노사이클릭 헤테로방향족, 또는 바이사이클릭 또는 트리사이클릭 융합-고리 헤테로방향족기를 지칭한다. 헤테로방향족기의 특정 예는 임의로 치환된 피리딜, 피롤릴, 피리미디닐, 푸릴, 티에닐, 이미다졸릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 피라졸릴, 1,2,3-트리아졸릴, 1,2,4-트리아졸릴, 1,2,3-옥사디아졸릴, 1,2,4-옥사디아-졸릴, 2,5-옥사디아졸릴, 1,3,4-옥사디아졸릴, 1,3,4-트리아지닐, 1,2,3-트리아지닐, 벤조푸릴, [2,3-디히드로]벤조푸릴, 이소벤조푸릴, 벤조티에닐, 벤조트리아졸릴, 이소벤조티에닐, 인돌릴, 이소인돌릴, 3H-인돌릴, 벤즈이미다졸릴, 이미다조[1,2-a]피리딜, 벤조티아졸릴, 벤족사졸릴, 퀴놀리지닐, 퀴나졸리닐, 프탈라지닐, 퀴녹살리닐, 신도놀리닐, 나프티리디닐, 피리도[3,4-b]피리딜, 피리도[3,2-b]피리딜, 피리도[4,3-b]피리딜, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, 테트라졸릴, 5,6,7,8-테트라하이드로퀴놀릴, 5,6,7,8-테트라하이드로이소퀴놀릴, 푸리닐, 프테리디닐, 카바졸릴, 크산테닐 또는 벤조퀴놀릴을 포함한다.
용어 "C3-C8-사이클로알킬"은 단일 고리(예: 사이클로헥실) 또는 다중 축합 고리(예: 노르보르닐)를 갖는 3 내지 8개의 탄소 원자의 포화 탄소환식 기를 지칭한다. C3-C8-사이클로알킬은 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 노르보르닐 등을 포함한다.
용어 "헤테로사이클로알킬"은 상기 정의에 따른 C3-C8-사이클로알킬기를 나타내고, 여기서 3개 이하의 탄소 원자가 O, S, NR로 이루어진 군으로부터 선택된 헤테로원자로 대체되고, R은 수소 또는 메틸로 정의된다. 헤테로사이클로알킬은 아제티디닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 모르폴리닐, 테트라히드로푸라닐 등을 포함한다.
개별 치환체의 정의에 의해 달리 제한되지 않는 한, 용어 "치환된 (substituted)"은 "C1-C6 알킬," "C2-C6 알케닐," "C2-C6 알키닐," "C3-C8-사이클로알킬," "헤테로사이클로알킬," "C1-C6 알킬 아릴," "C1-C6 알킬 헤테로아릴," "아릴 C1-C6 알킬," "헤테로아릴 C1-C6 알킬," "C1-C6 알킬 사이클로알킬," "C1-C6 알킬 헤테로사이클로알킬," "아미노", "아미노설포닐", "암모늄", "아실 아미노", "아미노 카보닐", "아릴", "헤테로아릴", "설피닐", "설포닐, " "알콕시", "알콕시 카보닐", "카바메이트", "설파닐", "할로겐", 트리할로메틸, 시아노, 히드록시, 머캅토, 니트로 등의 1 내지 5개의 치환기로 치환된 기를 지칭한다.
용어 "약제학적으로 허용되는(pharmaceutically acceptable)"은 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않고 특히 독성이 없는 물질로 구성된 담체를 지칭한다.
"담체"라는 용어는 활성제 이외의 약제학적 제형에 존재하는 임의의 성분을 말하며, 따라서 희석제, 결합제, 윤활제, 붕해제, 충전제, 착색제, 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 방부제 등을 포함한다.
"생물활성제(bioactive agent)"라는 용어는 본 발명의 그래프트 중합체 조성물에 혼입될 생물학적 활성을 갖는 임의의 제제를 설명하는 데 사용된다. 천연, 합성, 반합성 또는 이의 유도체일 수 있으며 소수성, 친수성, 가용성 및 불용성 화합물을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 이는 동물 및 인간, 특히 인간과 같은 포유동물에서 알려진 임의의 치료 영역에서 질환(conditions)의 치료 및/또는 예방 및/또는 진단에 유용한 임의의 생물활성제일 수 있으며, 상기 질환에는 심방세동과 같은 심장 부정맥, 고혈압, 염증성 질환 장애 또는 질환, 특히 관절 병리 및 관절 질환(류마티스성 관절염, 골관절염 및 척추관절염 등), 안구 병리(예: 안구 건조 증후군, 포도막염, 녹내장, 각막 병변), 결합 조직 장애(예: 루푸스 또는 다발근염), 피부 장애 또는 부상(예: 상처, 흉터, 건선, 여드름, 습진, 주사비, 물리적 또는 화학적 성질의 화상, 일광화상), 치주 및 치과 질환, 치질, 궤양, 유전자 치료가 가능한 질병, 세포 치료가 가능한 질병, 뇌경막 성형술 및 경막 복구 및 중추신경계 수술, 신경성형술, 통증, 수술 후 누공 및 감염, 외상성 질환, 양성 및 악성 신생물 및 감염을 포함하는, 자가면역 및 비-자가면역 염증성 질환을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 상기 생물활성제는 거대분자 화합물 또는 펩타이드, 단백질, 올리고 및 폴리뉴클레오타이드, 항감염제, 항생제, 항균제, 항바이러스제, 항균제, 항진균제, 성장인자, 효소, 항원, 항종양제, 항염증제, 마취제, 항종양제, 진통제, 항응고제, 지혈제, 세포 및 항체 등의 소분자 화합물에서 선택될 수 있다.
"염증성 질환 또는 질병(inflammatory disorder or disease)"이라는 용어는 염증성 장 질환, 알레르기, 천식, 자가면역 질환, 간염, 기타 기관 염증 및 관련 질병 등의 주요 또는 중요한 질병 기전으로서 염증 및 방출 또는 전염증성 사이토카인을 주요 또는 중대한 질환 기전으로 포함하는 모든 질환을 의미한다.
"피부 장애(skin disorders)" 또는 "피부 질환(skin diseases)"이라는 용어는 피부 표면은 노화 관련 조직 손상(예: 주름), 상처 및 흉터(예: 여드름 또는 풍진 흉터)와 같이 표면에 반드시 상처가 없어도 심한 함몰을 나타내는 피부 손상을 포함한다. 이러한 장애는 상처, 흉터, 건선, 여드름, 습진 및 주사비를 추가로 포함한다. "상처 (wounds)"라는 용어에는 예를 들어 외상이나 수술 후 손상된 조직이 포함된다.
포유동물의 상처는 예를 들어 찰과상 열상, 타박상, 뇌진탕, 자상, 피부 베인 상처, 외과적 상처, 총상, 열상, 화학적 상처, 일광 화상, 물린 상처 및 쏘인 상처 및 전기 상처를 포함한다. 여기에는 궤양 및 기타 염증성 피부 질환과 같은 만성 피부 질환이 포함된다.
"눈 병리 또는 장애(eye pathologies or disorders)"라는 용어는 눈, 특히 각막에 영향을 미치는 장애 또는 손상이다. 이러한 장애에는 각막 찰과상, 각막 긁힘, 각막 알칼리 화상, 연령 관련 황반 변성, 돌출된 눈, 백내장, 거대 세포 바이러스 망막염, 색맹, 사시, 당뇨병성 황반 부종, 눈 부종 및 눈 깜박임, 녹내장, 원추 각막, 게으른 눈, 낮은 시력, 안구 고혈압, 망막 박리, 눈꺼풀 경련, 포도막염, 건성 각결막염(KCS) 및 안구 건조증이 포함된다.
"관절 또는 관절 병리(articular or joint pathologies)"라는 용어는 골관절염, 관절염 통증, 류마티스 관절염, 감염 및 염증 통증, 연골로 이어지는 외상성 사고, 고관절의 외상성 사고, 뼈, 인대 또는 활액낭 손상을 포함한다.
"재건 조직(reconstruction tissue)"이라는 용어는 생물학적 조직(내인성 또는 외인성) 또는 표피, 신경, 연골 또는 뼈 조직과 같은 신체의 손상된 조직을 복구하기 위한 것 뿐만 아니라, Takebe et al., 2019, Science, 364, 6444, 956-959, DOI: 10.1126/science.aaw756 에 기재된 바와 같은 생물학적 시험용 오르가노이드의 구성에 유용한 합성 또는 반합성 물질을 말한다.
본원에 사용된 "치료(treatment)" 및 "치료하는(treating)" 등은 일반적으로 원하는 약리학적 및/또는 물리적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 의미한다. 상기 효과는 질병, 이의 증상 또는 질환을 예방하거나 부분적으로 예방한다는 점에서 예방적일 수 있고/있거나 질병, 질환, 증상 또는 질병에 기인한 부작용의 부분적 또는 완전한 치유의 관점에서 치료적일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "치료"는 포유동물, 특히 인간의 질병의 모든 치료를 포함하며, (a) 질병에 걸리기 쉬울 수 있지만 아직 질병에 걸린 것으로 진단되지 않은 대상체에서 질병이 발생하는 것을 예방하는 것; (b) 질병을 억제하는 것, 즉 질병의 발달을 저지하는 것; 또는 질병을 경감시키는 것, 즉 질병의 퇴행 및/또는 손상의 개선 또는 치료와 같은 이의 증상 또는 질환을 유발하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "대상체"는 포유동물을 지칭한다. 예를 들어, 본 발명에 의해 고려되는 포유동물은 인간, 영장류 및 가축, 예컨대 소, 양, 돼지, 말, 특히 경주마, 실험실 설치류 등을 포함한다.
본 발명에 따른 치료의 용어 "효능(efficacy)"은 본 발명에 따른 용도에 대한 반응으로 질병 경과의 변화에 기초하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 치료의 효능은 임상 징후 또는 증상의 소실 또는 감소 또는 사이토카인, 성장 인자 또는 기타 신호 분자 및 이들의 수용체, 세포 표면 마커, 세포 수 및 유전자 발현 프로필 등과 같은 질병 바이오마커의 보다 유리한 측정에 의해 측정될 수 있다.
본 발명에 따른 키토산의 제조 방법 및 이의 특성화
특정 측면에 따르면, 하기 단계들:
a) 키토산을 제공하고 상기 키토산이 용매에서 팽윤되도록 방치하는 단계;
b) 상기 키토산의 아미노기를 화학식 (I)의 아크릴 화합물로 아실화하는 단계로서:
Figure pct00003
여기서, R1은 할로겐, 또는 제거시 3-히드록시벤조트리아졸 에스테르, 무수물(혼합 무수물 포함), N-히드록시숙신이미드, 펜타클로로페놀, 2-니트로-4-술포페놀 에스테르 및 기타 유사한 이탈기와 같은 아미노기의 아실화를 보장하는 기타 이탈기이고; R2, R3 및 R4는 독립적으로 H로부터 선택되며, 선택적으로 치환된 알킬(예: C1-C6 알킬), 선택적으로 치환된 알케닐(예: C2-C6 알케닐), 선택적으로 치환된 알키닐(예: C3-C6 알키닐), 선택적으로 치환된 사이클로알킬(예: C3-C8-사이클로알킬), 선택적으로 치환된 사이클로알케닐(예: C4-C8 사이클로알케닐), 선택적으로 치환된 사이클로알키닐(예: C5-C8 사이클로알키닐), 선택적으로 치환된 헤테로사이클로알킬이고; 선택적으로 치환된 아릴(예: 선택적으로 치환된 페닐), 선택적으로 치환된 헤테로아릴 및 선택적으로 치환된 아릴 C1-C6 알킬, 특히 벤질이며; 여기서 "치환된(substituted)이라는 용어는 할로겐, -COOR', -NR'R'', =O, -OR', -COR', -CONR'R'', -SR', -SO3R', -SO2NR'R '', -SOR', -SO2R', -NO2 또는 -CN으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 5개의 치환기로 치환된 기를 지칭하며; 또는 R1 및 R2 또는 R1 및 R3, 또는 R1 및 R4는 함께 4-24원 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬(예: 8-24원 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬과 같은, 6-24원 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬)을 형성하는 단계;
c) 염기의 존재 하에 단계 b)의 아실화 생성물을 반응시키는 단계(Aza-Michael 반응);
d) (예를 들어, 염 불순물 및/또는 비양성자성 용매로부터) 단계 c)에서 얻은 가교 키토산을 정제하는 단계를 포함하는 가교 키토산의 제조 방법이 제공된다.
특정 구현예에 따르면, 단계 a) 및/또는 단계 b)에서 사용되는 용매는 양성자성 용매(예: 알코올 또는 물)이다.
특정 구현예에 따르면, 공정을 수행하기 위해 단계 a) 및/또는 단계 b)에서 양성자성 용매(예: 알코올 또는 물)가 사용되는 경우 형성되는 유리 아크릴산은 단계 c)를 수행하기 전에 반응 혼합물로부터 씻어낸다.
또 다른 특정 구현예에 따르면, 용매는 특히 단계 a) 및/또는 단계 b) 및/또는 단계 c)에서 비양성자성 용매이다.
특정 구현예에 따르면, 비양성자성 용매가 단계 c) 하에 사용되는 경우, 후속 아실화의 추가적인 단계 f)가 수행되지 않는다.
특정 구현예에 따르면, 단계 a)는 실온에서 수행된다.
특정 구현예에 따르면, 단계 b)의 아실화 생성물의 R3 또는 R4 뿐 아니라 R2 기는 글루코사민 골격의 1차 아미노기와 반응하여 글루코사민 사이에 가교를 형성할 것이다. 반응하는 기들은 특정 아크릴 화합물에 따라 다르다. 예를 들어, 아크릴산 및 메타크릴산의 경우 글루코사민 골격의 1차 아미노기와 반응하는 기는 R3 또는 R4 기이다. 그러나 R3 및 R4 기가 할로겐 원자로 대체되면 R2 기는 글루코사민 골격의 1차 아미노기와 반응한다.
추가적인 특정 구현예에 따르면, 이 가교는 나노 입자의 형성으로 이어진다
특정 측면에 따르면, 본 발명의 방법은 다음과 같이 반응식 1에 따라 도식화될 수 있다:
반응식 1
Figure pct00004
여기서 키토산(A)(m은 1과 12,500 사이의 정수이고, n은 1과 12,500 사이의 정수이다)은 먼저 실온의 비양성자성 용매에서 팽윤된 상태로 제공되고, 그 다음 상기 키토산의 아미노기가 아크릴 화합물(I)로 아실화되고 생성된 아실화 생성물(B1)은 염기 존재 하에 반응하여 가교 키토산(B2)이 생성되고, 이는 그 다음에 정제에 의해 분리하여 본 발명에 따른 정제된 가교 키토산을 유도한다.
특정 구현예에 따르면, 키토산은 양성자성 용매에서 팽윤된 상태, 용해된 상태에서도 제공될 수 있지만 이 경우 아실화제의 가수분해의 부반응이 발생할 수 있으므로 반응 부하를 계산할 때 이를 고려해야 한다. 부가적으로, 이 경우, 단계 c)에서 아자-마이클(aza-Michael) 반응 단계 전에 아실화제의 가수분해 생성물을 제거하기 위해 단계 b)에서 얻은 아실화 키토산을 세척할 필요가 있을 것이다.
특정 구현예에 따르면, 키토산은 물 없이 제공되고 아실화 단계는 물 없이 수행된다. 물의 부존재는 유리하게 더 높은 수율을 유도하고 부산물의 형성을 방지한다.
특히 유리한 측면에 따르면, 아실화 단계는 물의 부재 하에 수행된다. 이 경우 반응 매질 또는 초임계 유체(supercritical fluid)로 비양성자성 용매를 사용할 수 있다.
특정 구현예에 따르면, 비양성자성 용매는 예를 들어 DMF 및 DMSO로부터 선택된 것과 같은 극성 비양성자성 용매이다. 특정 실시예에서, 비양성자성 용매는 반응 매질에 아실화제를 제공하는 데 사용되는 이산화탄소, 산화질소(I), 프레온(클로로(브로모)(플루오로)탄화수소)과 같은 초임계 용매일 수 있고, 예를 들어 압력을 임계값 아래로 낮춤으로써 반응 매질로부터 초임계 용매를 제거한 후에 아실화 반응이 수행된다.
추가적인 특정 유리한 측면에 따르면, 아실화 단계는 무수 비양성자성 매질에서 수행된다.
특정 측면에 따르면, 극성 비양성자성 용매 추가의 특히 유리한 측면에 따르면, 아실화 단계는 무수 비양성자성 매질에서 수행된다.
또 다른 특정 측면에 따르면, 디클로로메탄, 디클로로에탄, 클로로포름 및 기타 클로로(플루오로)탄화수소도 극성 비양성자성 용매로 사용될 수 있으나, 아자-마이클 반응 단계 c)를 수행할 때 이러한 용매는 염기 제공 직전에 증류 제거되어야 한다. 이러한 증류는 60°C를 초과하지 않는 온도에서 수행하는 것이 바람직하며, 이는 대부분의 언급된 용매에 대해 대기압에서 실행 가능하다. 고비점 용매를 사용한 경우에는 감압하에서 증류해야 한다.
또 다른 특정 측면에 따르면, 에테르 및 에스테르, 케톤은 또한 무수 조건 하에 반응 단계 a) 내지 단계 c)를 위한 용매로서 사용될 수 있지만 이러한 용매에서의 반응은 더 느리게 진행될 것이다. 예를 들어, 디에틸 에테르, 디이소프로필 에테르, 메틸 tert-부틸 에테르, 메틸 아세테이트, 에틸 아세테이트, 프로필 아세테이트, 부틸 아세테이트, 아세톤, 메틸 에틸 케톤 및 디에틸 케톤이 사용될 수 있다.
본 발명의 특정 측면에 따르면, 아실화 단계 b)는 아크릴로일 클로라이드에 의한 글루코사민의 아실화와 관련하여 기재된 임의의 방법(Zhang et al., 2017, Biomacromolecules, 1, 3, 778 - 786; Bu et al., 2017, Advances, 7, 76, 48166 - 48175) 또는 i) 카르보디이미드; ii) 아지드; iii) 혼합 무수물; iv) 활성화된 에스테르를 사용하는 방법 및 v) 아래에 설명된 기타 방법 등과 같은 아미노기의 아실화에 유용한 것으로 기술된 방법들에 의해 수행될 수 있다.
중간체 에놀 에스테르의 형성과 함께 카르보디이미드를 사용하는 알려진 아실화 방법은 단계 b)에서 사용할 수 있다(WO 2019/60740; Hao-Bin et al., 2018, Carbohydrate Polymers, 196, 359 - 367). N,N'-디사이클로 헥실카르보디이미드 (DCC)가 축합제로 사용될 수 있는 경우, 1-에틸-(3-(3-디메틸아미노)프로필)-카르보디이미드 하이드로클로라이드 및 N-사이클로헥실-N'-(2- 모르폴리노에틸)카르보디이미드 메틸 p-톨루엔술포네이트(CAS 등록 번호: 2491-17-0)가 바람직할 것이다.
단계 b) 하에서 아지드를 사용하는 알려진 아실화 방법을 사용할 수 있다(Honzl et al., 1961, Coll. Czech. Chem. Commun., 26, N. 9, 2333-2344).
혼합 무수물을 사용하는 알려진 아실화 방법은 단계 b) 하에서 사용될 수 있다(Wieland et al., 1951, Ann. Chem., 572, N3, 190-194; Belleau et al., 1968, J. Amer. Chem. Soc., 90, N 6, 1651-1652; Gorecka et al., 1978, Synthesis, N 6, 474-476; Diago-Meseguer et al., 1980, Synthesis, N 7, 547-551; Leplawy etal., 1960, Tetrahedron, 11, N 1, 39-51). 내부 무수물 예를 들어 말레산 무수물의 사용은 또한 아실화를 위해 가능하다(Liwschitz et al. 1957, Journal of the Chemical Society, 4399; Kang, et al., 2014, Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 2, 10, 2364-2367; US 2016/200730; Sanchez et al., 2010, Anna European Journal of Organic Chemistry, 13, 2600 - 2606).
활성 아미드의 형성을 통한 활성 에스테르를 사용하는 알려진 아실화 방법은 카르보닐디이미다졸 방법(Paul et al., 1960, J. Amer. Chem. Soc., 82, N 17., 4596-4600), 시아노메틸에스테르법(Schwyzer et al., 1955, Helv. Chim. Acta, 38, N 1, 80-83), 티오페닐에스테르법(Wieland et al., 1951, supra), 치환된 페닐 에스테르법(Gross et al., 1983, Mayenhofer, editors. Moscow: Mir., P. 421), 카르보디이미드법과 함께 헤테로방향족 화합물을 이용한 에스테르법(Jakubke et al., 1966, A. Chem. Ber., 99, N 8, 2419-2429; Taschner et al., 1965, Ann. Chem., 690, 177-181), 카르보디이미드 방법과 함께 히드록실아민 유도체를 가진 에스테르법(Losse et al., 1964, Ann. Chem., 678, 185-190; Nefkens et al., 1961, Amer. Chem. Soc., 83, N 5, 1263; Anderson et al., 1963, Ibid, 85, N 19, 3039; Kφnig et al., 1970, Chem. Ber., 103, N 3, 788-798), 에스테르 교환법(interesterification methods)(에스테르법의 변형) (Sakakibara, 1965, Bull. Chem. Soc. Jap., 38, N 1, 1979-1984; Fujino et al., 1968, Ch. Chem. Pharm. Bull., 16, N 5, 929-932; Gudkov et al., 1978, 48, 9, 2146; Devadas et al., 1979, Ind. J. Chem., B16, N 11, 1026-1027) 등과 같이 단계 b)에서 사용될 수 있다.
알려진 다른 아실화 방법은 케테니민법(Stevens et al., 1958, J. Amer. Soc., 80, N 15, 4069-4071); 아세틸렌 유도체 방법(Arens, 1955, Rec. Trav. Chim., 74, N 6, 759-770; Gais 1978, Aktivierungsmittel fur Peptidsynthesen J. Angew. Chem. Int. Ed,90(8), 625-626 https://doi.org/10.1002/ange.19780900808 ); 시안아미드 유도체를 이용하는 방법(Losse et al., 1960, Ann. Chem., 636, 144-149); 이속사졸륨염(iIsoxazolium salt)을 이용한 합성(Woodwart et al., 1961, J. Amer. Chem. Soc., 83, N 4, 1010-1012); 이미도일 할라이드를 이용한 합성(Bergmann et al., 1936, J. Biol. Chem., 115, N 3, 93-611) 등의 단계 b)에서 사용할 수 있다.
특정 구현예에 따르면, 화학식 (I)의 아크릴 화합물은 산, 산 할로겐화물, 활성 에스테르(예: 3-히드록시벤조트리아졸 에스테르, N-히드록시숙신이미드, 펜타클로로페놀, 2-니트로-4-술포페놀 에스테르 및 기타 유사한 이탈기를 갖는 에스테르), 무수물 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
특정 구현예에 따르면, 화학식 (I)의 아크릴 화합물은 하기 군으로부터 선택된다:
Figure pct00005
(안젤산, CAS 등록 번호: 565-63-9);
Figure pct00006
(2-이소-프로필 아크릴산 CAS 등록 번호: 4465-04-7);
Figure pct00007
(2-메틸렌도데칸산, CAS 등록 번호: 52756-21-5);
Figure pct00008
(4S,6S)-4,6- 디메틸-2-메틸렌도코산산;
Figure pct00009
((Z)-3- 사이클로헥실프로펜산, CAS 등록 번호: 673456-32-1);
Figure pct00010
((E)-3-[4-(2,6-디옥소-1,3-디프로필-2,3,6,7-테트라하이드로-1H-푸린-8-일)-비사이클로[2.2.2]옥트-1-일]-아크릴산, CAS 등록 번호: 340021-16-1);
Figure pct00011
((2E)-3-((E)-4-{[2-(4-클로로페녹시)-2- 메틸프로파노일]아미노}-1-아다만틸)아크릴산;
Figure pct00012
(3-(2-카복시-4-페닐-3-스티릴-사이클로부틸)-아크릴산, CAS 등록 번호: 34271-87-9);
Figure pct00013
(3-메틸-2-아크릴사에우레-(1)-사이클로프로판-카본사이우레-(1)-카본사에우레-(1)-아에틸에스터, CAS 등록 번호: 91971-88-9);
Figure pct00014
(3t,4t- 디카르복시-사이클로부탄-1,2c-디-(트랜스-아크릴산), CAS 등록 번호: 55011-62-6);
Figure pct00015
코로나디엔;
Figure pct00016
(CAS 등록 번호: 1247-53-6);
Figure pct00017
((E)-3-(2t- 에톡시카르보닐-6ξ-메톡시-사이클로헥산-1r-일)- 아크릴산, CAS 등록 번호: 2960-11-4); 시나몬산(cinnamic acid); 4-메틸시나몬산; p-니트로시나몬산; 카페인산;
Figure pct00018
(3-(푸르-2-일)크로톤산; 3-(2-푸릴)아크릴산, CAS 등록 번호: 539-47-9);
Figure pct00019
((Z)- 유로칸산 CAS 등록 번호: 7699-35-6);
Figure pct00020
(3-(4-피리디닐)-2- 프로펜산; 3-(피리딘-4-yl)아크릴산, CAS 등록 번호: 5337-79-1); 아르구티노사이드 A-I;
Figure pct00021
((Z)-2-클로로-부트-2-에노산, CAS 등록 번호: 53993-41-2);
Figure pct00022
((2Z)-2,3-디클로로프롭-2-에노산, CAS 등록 번호: 3533-68-4);
Figure pct00023
시스 N-tert-부틸옥시카르보닐 탈수소 β-알라닌, CAS 등록 번호: 151292-68-1);
Figure pct00024
(2-히드록시-3-메르캅토-아크릴산, CAS 등록 번호: 6228-60-0;
Figure pct00025
히드록시(메트)아크릴산;
Figure pct00026
(디히드록시-아크릴산, CAS 등록 번호: 2702-94-5);
Figure pct00027
(리액시스 ID 2721331);
Figure pct00028
(CAS 등록 번호: 64361-31-5);
Figure pct00029
3-(2-카복시메틸렌-사이클로펜틸)-아크릴산;
Figure pct00030
(CAS 등록 번호: 78727-62-5);
Figure pct00031
(플루오로 부트 에노산, CAS 등록 번호: 2365-87-9);
Figure pct00032
((E)-2,3-비스(페녹시카르보닐아미노)부트-2-엔디오산);
Figure pct00033
((Z)-2,3-비스(페녹시카르보닐아미노)부트-2-엔디오산);
Figure pct00034
(2E,4E)-2,4-헥사디엔디오산(뮤콘산), 말레산; 푸마르산;
Figure pct00035
(말레일아세토아세트산, CAS 등록 번호: 5698-52-2); (E)-4 말레일아세토아세트산-2-에노산, 글루탐산의 아크릴 유도체;
Figure pct00036
Figure pct00037
(2- 메틸렌-9(Z)-옥타덱에노산, CAS 등록 번호: 33780-98-2);
Figure pct00038
(2-메틸렌-5-헥스에노산 (2-메틸렌 헥스-5-에노산), CAS 등록 번호: 73505-05-2);
Figure pct00039
((E)-6,9-디메틸-2-메틸리덴운데카-5,9-디에노산, CAS 등록 번호: 1580541-76-9);
Figure pct00040
(2-(시스-7,8-헥사데세닐)-아크릴산);
Figure pct00041
((E)-2-메틸렌옥타-4,7-디에노산);
Figure pct00042
(2-메틸렌-7- 옥티노익산, CAS 등록 번호: 127559-93-7); 및
Figure pct00043
(2-메틸렌-5- 데시노산, CAS 등록 번호: 150254-20-9); 및 아실 할라이드(R1= 할로겐), 특히 아크릴로일 클로라이드; (
Figure pct00044
) 또는 메타크릴로일 클로라이드.
추가적인 특정 구현예에 따르면, 아크릴 화합물은 아실 할라이드(R1= 할로겐), 특히 아크릴로일 클로라이드 (
Figure pct00045
) 또는 메타크릴로일 클로라이드이다.
특정 측면에 따르면, 아실화 단계 b)에서 사용된 아크릴 화합물이 산 할로겐화물인 경우, 반응 시스템에서 물의 존재를 피하는 것이 중요하다. 왜냐하면 산 할로겐화물의 바람직하지 않은 부수적인 과정이 일어나서, 아크릴산이 되고, 이는 키토산의 아미노기에 대한 자유 아크릴산의 마이클 부가 반응 시 카르복실기에 의한 나노입자의 기능화로 이어지기 때문이다.
특정 측면에 따르면, 아실화 단계 b) 하에 사용된 아크릴 화합물은 산 클로라이드(예: 아실 클로라이드)이다. 일 측면에 따르면, 산 클로라이드의 사용은 과량의 염기 존재 하에 다음 반응 단계를 방해하지 않고 투석 동안 염의 형태로 쉽게 제거되는 염화수소의 형성을 유리하게 초래한다.
아민과 카르복실산 할로겐화물의 아실화는 1당량의 산을 생성하고, 이는 미반응 아민과 염을 형성하고 본 발명의 방법의 수율을 감소시킨다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 따라서, 산 할로겐화물이 아실화 단계 b) 하에서 사용되는 경우, 이 산을 중화하기 위해 등량의 염기, 바람직하게는 비친핵성 염기를 첨가한다.
특정 측면에 따르면, 아실화 단계 b) 하에서 사용된 아크릴 화합물이 산 무수물인 경우, 본 발명의 방법은 단계 c)를 수행하기 전에 반응 시스템에서 물의 존재를 피하기 위해 반응 매질을 세척하고 형성된 산을 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
특히, 형성된 산은 필터를 통해 용매를 사용하여, 또는 용매에 대한 투석에 의해 또는 용매에 아실화 생성물을 현탁시키고 상청액을 버리고 원심분리함으로써 아실화 생성물로부터 세척될 수 있다.
또 다른 특정 측면에 따르면, 유리산으로의 아실화를 위해 축합제(예: DCC)를 사용할 때 반응의 완전성을 주의 깊게 제어할 필요가 있고 예방책으로 세척 단계를 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들어, DCC와 같은 축합제가 축합제로 사용되는 경우, 아실화 반응 동안 디사이클로헥실우레아와 같은 부산물이 형성되며, 이는 다음 단계를 수행하기 전에 반응 물질에서 제거해야 하므로 본 발명의 나노입자로 이어지는 형성된 가교에 관여하지 않는다.
또 다른 특정 구현예에 따르면, 단계 c) 하에서 염기는 단계 b)에서 형성된 할로겐화수소를 중화시키는 알칼리성 매질을 형성하기에 충분한 몰 과량으로 사용된다. 전형적으로, 염기의 몰 과량은 10% 이상의 몰 과량(예: 약 20 내지 40%의 몰 과량)이며, 이는 단계 b)의 아실화 생성물의 아미노 기와 관련하여 1-3 이상의 몰 과량에 해당한다.
또 다른 특정 구현예에 따르면, 단계 c) 하에서 수득된 가교 키토산은 염 불순물 및/또는 잔류 비양성자성을 제거하는 표준 기술에 의해, 예를 들어 투석 또는 물 또는 염화메틸렌, 메탄올, 에탄올, 아세톤 등의 용매를 사용한 세척 단계에 의해 단계 d) 하에서 정제될 수 있고, 이어서 원심분리 또는 가교 키토산의 형성된 나노 입자가 불용성인 이산화탄소 사용 등과 같은 초임계 용매 사용이 수행되거나 증발에 의해 비양성자성 용매를 제거한 다음에 가교 키토산 생성물로부터 부산물을 용매로 필터, 예를 들어 40 νm 이하의 기공을 갖는 필터를 통해 세척하는 단계가 수행된다. 보다 특정한 구현예에 따르면, 폴리프로필렌 또는 PTFE와 같은 미세 다공성의 소수성 필터 요소가 유리하게 사용될 수 있는데, 그 이유는 이들의 소수성이 이들을 통한 친수성 키토산 나노입자의 침투에 대한 추가적인 장애물을 생성하기 때문이다.
또 다른 특정 구현예에 따르면, 단계 d) 하에, 예를 들어 선택적인 추가 건조 단계 e) 하에 수득된 정제 가교 키토산이 건조될 수 있다.
특정 측면에 따르면, 마이클 부가 반응을 위한 단계 c) 하에 사용된 염기는 본질적으로 순수한 비친핵성 염기이며, 특히 본질적으로 2차 아민이 존재하지 않는다.
특정 측면에 따르면, 마이클 부가 단계 c)는 물과 같은 양성자성 용매에서 수행된다. 이 경우, 예를 들어 아실화 단계에서 형성된 카르복실기의 양과 형성된 아미노기의 양을 측정하여 비누화 (saponification) 정도를 제어할 필요가 있다. 카르복실기에 대한 정확한 방법은 농도가 일반적으로 1-2배 더 낮고 아미노기 수의 차이가 실험 오차 범위 내에 있을 수 있기 때문에 NMR, IR 분광법 또는 in Glazunov et al., 1999, 25(3), 216-219; Brugnerotto et al., 2001, Polymer, 42, 3569-3580 or Kubota, et al., 2000, Carbohydrate Research, 324, 268-274 에 기재된 것과 같은 산-염기 적정이 될 수 있다. 그러나, 이 단계의 양성자성 용매는 비누화된 가교 키토산 나노입자의 획득을 단계 c)의 끝에서 원하는 경우나 카르복시 기능으로 나노입자를 포화시킨 다음 과량의 가교를 달성하기 위해 아래에 설명된 바와 같이 아실화 단계를 반복할 것을 계획하는 경우 유리할 수 있다. 실제로, 나노입자가 카르복시 기능으로 포화되면 비누화 단계가 수행된다. 다음으로 아실화 및 아자-마이클 단계를 반복한 후 비누화한다. 양성자성 용매에서 아자-마이클 단계 시 자발적 비누화가 발생하면 이는 불리한 일이 아니다. 왜냐하면, 비누화는 아무튼 나중에 수행되고 아자-마이클 반응 중에 부분적으로 발생한다는 사실이 문제가 되지 않기 때문이다.
또 다른 특정 측면에 따르면, 마이클 첨가 단계 c)는 반응 매질로서 비양성자성 용매를 사용하거나 용매로서 염기를 사용함으로써 달성될 수 있는 물의 부재 하에 수행된다.
또 다른 특정 구현예에 따르면, 마이클 부가 반응 단계는 아실화 단계 동안 형성된 각각의 아미드 결합에 대해 마이클 부가 반응 후에 1당량의 2차 아민이 형성되도록 알칼리 매질에서 수행되어, 모든 아미노기의 가교 결합, 아미노기의 적어도 절반은 염 형성에 이용 가능한 상태로 남는다. 이는 Glazunov et al., 1999, 25(3), 216-219; Brugnerotto et al., 2001, Polymer, 42, 3569-3580 or Kubota, et al., 2000, Carbohydrate Research, 324, 268-274 에 기재된 바와 같이 산-염기 적정, IR 및 NMR 분광법으로 확인할 수 있다. 특정 측면에 따르면, 키토산 거대분자 내부의 분자내 첨가 반응은 통계적 및 입체적 요인으로 인해 분자간 반응보다 현저히 바람직하여 높은 가교 수율을 유도한다.
마이클 부가 반응 단계 c)후에 생성된 나노 입자는 아미드기를 2차 아민으로 변환하고 나노 입자의 가능한 이온화 정도를 증가시키기 위해 환원(예: 복합 금속 수소화물, 디보란, 시아노보로하이드라이드 및 기타 수소화붕소 유도체와 반응하여)될 수 있다. 나노 입자의 가능한 이온화 정도는 아미노기의 수에 따라 다르다. 아미노기가 많을수록 염이 형성되고 각각 이온화가 일어날 기회가 커진다. 이온화 정도는 산-염기 적정, IR 및 NMR 분광법으로 평가할 수 있다.
추가적인 측면에 따르면, 단계 c) 또는 단계 d)에서 수득된 가교 키토산 생성물 또는 단계 e)에서 수득된 상응하는 건조 생성물은 더 넓은 범위, 예를 들어 생리학적 약알칼리성 조건(예: pH 약 7.2-7.3)에서 가교 키토산 나노입자의 용해도를 증가시키기 위해 양성자성 용매 중에서 알칼리 조건(예: 과량의 수성 염기의 존재 하에) 하에 비누화 단계 f)를 거칠 수 있다. 단계 c) 또는 단계 d)에서 사용된 용매가 비누화를 허용하지 않는 경우(예: DMF와 같이), 비누화를 허용하는 용매에서 또는 건조된 가교 키토산을 용매로서의 에테르와 같이 단계 e) 후에 비누화를 허용하는 용매에서 재현탁함으로써 정제 단계 d) 후에 비누화를 수행해야 한다.
예를 들어, 이러한 추가적인 단계 f) 하에 수성 염기가 단계 b) 하에 사용된 아실화제의 양과 비교하여, 예를 들어, 이러한 아실화제의 몰량의 약 10배 또는 100배와 같이, 몰 과량으로 단계 c) 또는 단계 d) 하에 수득된 생성물에 첨가된다. 하기 반응식 2로 도식화된 바와 같이, 가교 키토산(B2)의 아미드기는 상응하는 염의 형성에 이용가능한 생성물(B3)에서 상응하는 카르복실기로 가수분해된다.
반응식 2
Figure pct00046
이는 교차 결합된 키토산에 있는 아미노기의 절반을 1차 아민으로 재생하고 나머지 절반은 2차 아민이 되어 현재 프로피온산(또는 치환된 프로피온산)으로 알킬화되게 한다. 예를 들어, 가교 키토산의 비누화는 1시간 동안 섭씨 50도에서 수산화나트륨 수용액 1몰을 첨가하여 수행할 수 있다. 그 다음, 수득된 생성물(B3) 은 하기 반응식 3a 및 반응식 3b 에 도식화된 바와 같이, 아실화 단계 b)를 다시 거칠 수 있고, 이 경우에 아실화는 동일한 조건에서 발생하며, 여기서 1차(반응식 3a) 및 2차(b, c 또는 f 단계에서 얻은 아미노기의 드노보 아실화, 반응식 3b) 아미노기 모두의 아실화가 가능하다. 그 다음, 얻어진 생성물(B4)을 단계 c)에서 마이클 부가 반응을 다시 수행하여 모든 아미노기의 가교를 달성하고 본질적으로 완전히 가교된 키토산(B5)을 얻는다.
반응식 3a
Figure pct00047
반응식 3b
Figure pct00048
이 경우, 얻어진 생성물에서 내부 염이 카르복실기로 형성되는데, 이는 첫 번째 합성 단계 c)의 말기에 존재하는 아미노기의 초기 함량의 절반이 될 것이다. 특정 측면에 따르면, 이러한 생성물은 본질적으로 동일한 수의 카르복실기, 총 2차 및 3차 아미노기, 아미드 작용기(초기 아세틸아미노글리코시드 단편 제외)를 함유할 것이다. 즉, 다시 말해서 이러한 생성물은 완전한 내부 염을 포함할 것이며, 모든 카르복실기는 아미노기에 의해 균형을 이룬다.
어떠한 이론에도 구속되지 않고, 아미노기가 단계 a) 하에 제공된 초기 키토산에 존재한다면, 이들의 완전한 유도가 단계 b) 하에 달성되면, X 아미노기는 아실화제에 의해 아실화되는 것으로 간주될 수 있다. 따라서 X 아미노기는 단계 c)에서 키토산에 접목된 아실 단편과 아자-마이클 반응을 하게 된다. 비누화 단계 f)를 거친 단계 c) 생성물에 존재하는 단계 b)에서 형성된 아미드 기의 비누화 후, X 1차 아미노기가 재생되고, X 카르복실기가 아실화에 사용된 아크릴산으로부터 입수가능하고, 단계 c)에서 생성된 X 2차 아미노기는 여전히 남는다. 따라서, 아실화에 의한 반복적인 철저한 유도(exhaustive derivation)로, X 재생된 1차 아미노기는 추가로 아실화될 수 있고(단계 c)에서 얻은 2차 아미노기)는 아마도 아실화될 수도 있겠지만, 이 과정은 가능성이 적다. 그런 다음, 단계 c)를 반복하면 단계 c)에서 앞서 얻은 2차 아미노기가 아자-마이클 반응에 진입하여 X 3차 아미노기를 형성한다.
또한, 다시 두 번째 비누화를 수행하면 비누화되지 않은 X개의 1차 아미노기와 X개의 3차 아미노기가 남아 X개의 카르복실기가 생성된다. 따라서 카르복실기의 총 수는 2X, 1차 아미노기 X, 3차 아미노기 X가 될 것이며 중합체는 전기적으로 중성이 되어 내부 염을 형성할 것이다.
세 번째로 철저한 유도가 수행되면 X/2 아실화제만 필요하다. 왜냐하면 X 아미노기만이 이러한 반응에 들어갈 수 있고 이러한 모든 아미노기는 1차 아미노기이기 때문이다. 따라서 세 번째 유도 시퀀스(단계 b) 내지 단계 c)) 및 비누화 (단계 f)) 후에 2.5X 카르복실기, 1.5X 3차 아미노기, 0.5X 1차 아미노기만 얻어지고 중합체는 0.5 X 과량의 카르복실기로 음이온성(anionic)이 된다. 따라서 이 반응 시퀀스를 반복하면 매번 0.25, 0.125, 0.0625, 0.03175 등의 증분으로 카르복실기의 수가 증가해야 한다. 카르복실기의 존재는 적외선 또는 산-염기 및 질량 분석에 의해 쉽게 확인할 수 있다.
특정 구현예에 따르면, 선택적인 비누화 단계 f) 하에 사용되는 알칼리의 양은 비누화될 제1 반응 단계 c)/d) 또는 단계 e)에서 수득된 아미드기와 동일한 몰량이고 최대 10배 몰 과량이다.
특정 구현예에 따르면, 단계 b) 내지 단계 c) (또는 d)/e))의 적어도 하나의 시퀀스는 아실화 단계 b) 내지 단계 c)의 새로운 시퀀스에 다시 적용되기 전에 마이클 첨가의 종료로서 비누화 단계 f)와 함께 수행된다.
추가적인 특정 구현예에 따르면, 단계 a) 내지 단계 f)의 약 2 내지 6개의 반응 시퀀스가 수행된다.
또 다른 특정 구현예에 따르면, 단계 a) 내지 단계 f)의 반응 시퀀스가 1회 또는 2회 반복된다.
특정 구현예에 따르면, 단계 a) 내지 단계 f)의 각 시퀀스 후에, 가교된 키토산의 용해도는 더 넓은 범위의 pH에서 얻어지고 천연 키토산의 특성은 예를 들어 점액성 및 세포로의 침투 측면에서 변형될 수 있다. 따라서, 이러한 특성은 수행되는 반응 순서의 수에 따라 유리하게 조정될 수 있고, 수득된 가교 키토산 나노입자는 관심 화합물의 전달에 유용할 수 있다.
특정 구현예에 따르면, 양이온성(예: 아르기닌, 오르니틴 또는 라이신이 풍부한 서열과 같은 양이온성 펩타이드(cationic peptides) 또는 전하 측면에서 중성 물질은 본 발명에 따른 가교 키토산에 의해 전달될 수 있다.
또 다른 특정 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 가교 키토산은 분해(예: 단백질 분해에 의한) 또는 바람직하지 않은 물질(예: 항체 또는 기타 거대분자)의 결합 또는 해당 화합물의 가용성 물질의 느린 방출을 보장한다.
또 다른 특정 구현예에 따르면, 생물학적 활성 물질은 제1 아실화 단계 b) 또는 제1 마이클 첨가 단계 c) 후에 형성된 나노입자 내에 통합될 수 있다. 추가적인 특정 구현예에 따르면, 생물학적 활성 물질은 공유 결합되거나 염 형태로 흡착 또는 고정되거나 본 발명의 가교 키토산 나노입자 내에 캡슐화될 수 있다.
비누화 단계가 수행되는 경우 생물학적 활성제의 공유 가교는 파괴되지만 생물학적 활성제와의 이온 결합은 형성된 가교 키토산의 염 내에서 형성될 수 있다.
대안적으로, 나노입자는 방사선 불투과성 나노입자를 생성하기 위해 무거운 원소들의 클러스터와 같은 이러한 단계의 시퀀스가 적용될 때 단계 a) 내지 단계 f)에서 사용되는 시약에 내성인 생물학적 활성 물질로 함침될 수 있다.
더 대안적으로, 다기능성, 불안정성, 생물학적 활성 물질은 바람직하게는 합성 후에 본 발명의 가교 키토산 나노입자 내로 확산에 의해, 또는 클릭 화학, 효소, 단백질, 핵산 및 항체의 고정화 방법을 사용하여 도입된다.
특정 측면에 따르면, 본 발명의 키토산 나노입자 내 생물학적 활성 물질의 통합은 단계 b) 또는 단계 c)로부터 생성된 생성물을 원하는 생물학적 활성 물질로 함침시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 비양성자성 용매에서 생물학적 활성 물질의 용액은 마이클 첨가 단계 c)를 수행하기 전에 단계 b)에서 생성된 생성물에 첨가될 수 있다. 대안적으로, 단계 b)로부터 생성된 아세틸화 키토산 생성물은 추가 합성 조건에 적합한 용매에 용해될 수 있다.
함침은 본 발명의 가교 키토산을 용해하지 않고 수행될 수 있다.
생물학적 활성제로 본 발명의 가교된 키토산의 함침의 관점에서, 생물학적 활성제/물질은 극성 비양성자성 용매 또는 임의의 다른 물질에 용해될 수 있다. 양성자성 용매를 사용하는 경우에는 아자-마이클 반응 전에 이를 제거하고 함침된 생성물을 건조시키는 것이 바람직하다. 함침을 위해서는, Weidner 2018, The Journal of Supercritical Fluids, 134, 220-227 https://doi.org/10.1016/j.supflu.2017.12.024 ; Duarte et al., 2007, The Journal of Supercritical Fluids, 42 (3), 373-377 https://doi.org/10.1016/j.supflu.2007.01.007 에 기재된 바와 같이 매우 높은 수준의 고품질 함침을 제공하는 초임계 유체를 사용할 수 있다. 상기 제제(agent)의 함침이 쿨롱의 방법에 의해 가속화될 수 있는 경우 Boccaccini et al., 2010, J. R. Soc. Interface, 7, S581-S613 https://doi.org/10.1098/rsif.2010.0156.focus; Pishbin et al., 2013, Acta Biomaterialia, 9(7), 7469-7479 에 기재된 전기영동법 또는 Zhao et al., 2012, PLoS One, 7(10): e46765. doi: 10.1371/journal.pone.0046765 에 기재된 "유전자 총(gene gun)" 방법을 사용하는 것도 가능하다. 예를 들어, 항생제와 같은 생물학적 활성 물질의 수용액은 단계 b) 이후에 아실화된 키토산의 수용액과 혼합될 수 있고 물의 공비 증류, 분무 건조, 동결건조 및 기타 건조 방법으로 증발되어 건조 상태의 생물학적 활성 물질이 함침된 아실화 키토산을 얻을 수 있다. 그 다음, 건조된 물질은 키토산의 아미노기를 탈이온화하기 위해 과량의 비친핵성 염기에 적용되고 생성된 혼합물은 이후 마이클 부가 반응 단계 c)에 거친다.
추가적인 측면에 따르면, 단계 a) 하에 제공된 키토산은 약 5 내지 약 2,000 kDalton, 특히 약 150 내지 2,000 kDalton 범위의 평균 분자량을 갖는다.
또 다른 추가적인 측면에 따르면, a) 단계 하에 제공된 키토산은 거대분자당 약 100%(글루코사민에서와 같이) 내지 약 2개의 탈아세틸화된 단편까지 탈아세틸화 정도를 가지며, 이는 예를 들어 분자 질량이 300 kDa인 키토산(키틴)에 대해 약 0.14%이다.
본 발명의 방법에서 출발 물질로 사용될 수 있는 적합한 키토산은 천연(동물 또는 진균), 특히 게 및 새우의 껍데기, 곤충의 외골격, 고등 진균, 단세포 버섯의 배양물을 비롯한 다양한 기원의 것일 수 있다. 화학적 또는 효소적으로 합성된 키토산도 사용될 수 있다.
추가적인 측면에 따르면, 단계 a)에서 제공된 키토산은 바람직하게는 비양성자성 용매에서 약 5분 내지 약 1일 동안 팽윤되도록 방치된다.
또 다른 추가적인 측면에 따르면, 탈아세틸화 단계 b)는 약 -70℃(반응 시작) 내지 약 +150℃(반응 완료), 바람직하게는 약 +2℃(반응 시작) 내지 약 +55℃(반응 완료)의 온도에서 수행된다. 반응 시간은 약 0.5시간 내지 10일, 바람직하게는 약 +20℃ 내지 +30℃에서 약 2.5시간이고, 바람직하게는 혼합 수단으로서 초음파 작용 하에 있다.
또 다른 추가적인 측면에 따르면, 마이클 첨가 단계 c)는 약 -70℃(반응 시작) 내지 약 +150℃(반응 완료), 바람직하게는 약 +20℃(반응 시작) 내지 약 +55℃(반응 완료)의 온도에서 수행된다. 반응 시간은 약 0.5 시간 내지 10일, 바람직하게는 약 +20℃에서 약 15-18 시간, 약 +55℃에서 약 6 시간이고, 바람직하게는 혼합 수단으로서 초음파 작용 하에 있다.
또 다른 추가적인 측면에 따르면, 가교 키토산의 건조 단계는 단계 e) 하에서 동결 건조에 의해 수행된다.
또 다른 추가적인 측면에 따르면, 선택적인 추가 비누화 단계 f)는 약 0℃(반응 시작) 내지 약 +140℃(반응 완료), 바람직하게는 약 +20℃(반응 시작) 내지 약 +55℃까지(반응 완료)에서 수행된다. 반응 시간은 +55℃에서 약 0.5시간 내지 10일, 바람직하게는 약 2 내지 6 시간이며, 바람직하게는 혼합 수단으로서 초음파 작용이 구비된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 나노입자는 본 발명의 방법의 단계 b) 및 단계 c) 하에 수득된 물질에 의해 자발적으로 형성된다. 이러한 입자는 시간이 지남에 따라 매우 안정적입니다. 예를 들어, 실온에서 2% 용액은 건조 상태에서 최소 1년 및 최소 몇 년 동안 안정적이다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 생물활성제가 단계 b), c), d) 또는 단계 e) 하에 첨가되는 본 발명의 방법을 수행하는 단계를 포함하는 생물활성제용 약물 전달 시스템의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 하기 단계를 포함하는 생물활성제용 약물 전달 시스템의 제조 방법이 제공된다:
- 습식 또는 건식 상태의 본 발명의 가교 키토산을 제공하는 단계;
- 전달될 생물활성제를 제공하는 단계;
- 상기 생물활성제를 용매에 용해 또는 초임계 유체에 용해시키는 단계;
- 가교 키토산에 생물활성제 용액을 함침시키거나 전기영동 또는 전기장에 의한 가속에 의해 나노입자에 직접 도입함으로써 본 발명의 상기 가교 키토산의 나노입자를 로딩하는 단계;
- 이렇게 얻은 조성물 또는 생물활성제가 담지된 나노입자를 수집하는 단계 (예: 약물).
또 다른 특정 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 방법으로부터 수득가능한 가교 키토산을 확인하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 하기 단계:
- 용매 단계 (예: 메틸렌 클로라이드 또는 클로로포름)에서 특징화되는 키토산을 제공하는 단계;
- 약 0℃ 내지 약 20℃, 예컨대 약 30분 동안 격렬한 교반 하에 본 명세서에 기재된 바와 같은 상기 키토산(예: 아세틸 클로라이드 또는 아세트산 무수물로서)을 아실화하는 단계;
- 반응 매질을 염기(예: 비친핵성 염기로서 디이소프로필에틸아민)로 중화시키는 단계;
- 용매를 증발시키고 얻어진 중화된 생성물을 세척하는 단계;
- 상기 생성물을 환류산 가수분해(예: 바람직하게는 약 1 내지 3 시간, 예컨대 약 2시간 동안 28% 염산 사용)하는 단계;
- 반응 혼합물을 증발시키고 가수분해된 생성물을 아세트산과 같은 약산에 재현탁시키는 단계;
- 화학식 (IIIa) 또는 화학식 (IIIb)에 따른 생성물로부터 선택된 생성물의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하되,
Figure pct00049
(IIIa);
Figure pct00050
(IIIb);
상기 화학식에서, R2 내지 R4는 본원에서 정의된 바와 같고, R2' 내지 R4'는 본원에서 각각 R2 내지 R4로 정의된 바와 같고, 여기서 화학식 (IIIa) 및/또는 (IIIb)의 생성물의 존재는 본 발명에 따른 방법에 의하여 수득된 가교 키토산을 나타낸다.
또 다른 특정 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 가교 키토산을 확인하는 방법에서 화학식 (IIIa)에 따른 생성물의 존재 또는 부재는 예를 들어 질량 분광법 전자분무 분석에 의해 수행될 수 있으며, 여기서, 예를 들어, m/z = 252.077인 피크는 화학식 (IIIa), 특히 화학식 (II)에 따른 화합물의 존재를 나타낸다.
Figure pct00051
(II).
본 발명에 따른 방법으로부터 수득된 가교 키토산을 확인하는 방법은 예를 들어 Baoqiand et al., 2015, supra 또는 El-sherbiny et al., 2009, supra 에 기술된 방법 등과 같은 기타 방법에 의한 가교 키토산을 구별할 수 있기 때문에 매우 유용하다.
본 발명에 따른 키토산 및 이의 나노입자
본 발명에 따른 가교 키토산은 본 발명의 방법에 따라 쉽게 입수가능한 출발 물질로부터 제조될 수 있다. 전형적이거나 바람직한 실험 조건(즉, 반응 온도, 시간, 시약의 몰, 용매 등)이 주어진 경우, 달리 언급되지 않는 한 다른 실험 조건도 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 최적의 반응 조건은 사용된 특정 반응물 또는 용매에 따라 달라질 수 있지만, 이러한 조건은 일상적인 최적화 절차를 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다.
특정 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 수득된 가교 키토산 및 이의 나노입자가 제공된다.
다른 특정 구현예에 따르면, 출발 키토산보다 낮은 점도를 특징으로 하는 가교 키토산이 제공된다. 예를 들어, 90% 탈아세틸화도, 3.2% 가교결합 및 0.25% 키토산 농도의 경우, 본 발명에 따른 나노입자의 용액은, 예를 들어, 본 발명의 키토산 나노입자에 대해 25℃에서 2.4 cSt 및 37℃에서 1.82 cSt 대 상응하는 출발 키토산에 대해 25℃에서 7.5 cSt 및 37℃에서 5.4 cSt로서, 출발 키토산보다 점성이 3배 덜하다.
특정 구현예에 따르면, 본 발명의 가교 키토산의 약제학적으로 허용되는 염은 아세테이트, 락테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 말로네이트, 푸마레이트, 말레에이트, 말산의 염, 뿐만 아니라 다른 카르복실산, 히드록시카르복실산, 이 염산염 이외에, 인산염, 황산염 및 기타 무기산을 포함한다.
본 발명의 가교된 키토산의 분자량은 출발 물질의 선택에 의해 조정될 수 있고 이의 선택은 본 발명의 나노입자 및 이의 제형의 의도된 기능에 의존할 것으로 이해된다. 예를 들어, 원하는 나노입자 조성물 분해 속도, 임의로 혼입된 생물활성제의 원하는 방출 속도, 치료될 치료 조건은 출발 물질로서 키토산의 분자량 선택에 영향을 미칠 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 가교 키토산의 분자량은 약 2 kDa 내지 2 MDa로 구성된다.
추가적인 일 구현예에서, 윤활/충전제 조성물에 사용하기 위한 본 발명의 가교 키토산의 분자량은 약 2 kDa 내지 2, 바람직하게는 약 30 kDa 내지 1,000 kDa에서 선택될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 약물 전달 시스템에서 또는 약물 전달 시스템으로서 사용하기 위한 본 발명의 가교 키토산의 분자량은 약 2 kDa 내지 2 MDa, 바람직하게는 약 30 kDa 내지 1,000 kDa에서 선택될 수 있다.
조성물
본 발명은 조성물로서의 약제 또는 치료제, 또는 이를 포함하는 의료 장치 및 의학적 장애 및 특히 심장 부정맥, 특히 심방세동 및 고혈압과 같은 심혈관 질환, 류마티스 관절염, 골관절염, 척추관절염과 같은 관절 병리 및 관절 질환, 및 연골, 뼈, 인대 또는 활액낭 손상으로 이어지는 외상성 사고, 안구 건조 증후군, 포도막염, 녹내장, 각막 병변 등과 같은 눈 병리 및 부상, 루푸스 및 다발성 근염과 같은 결합 조직 장애, 상처, 흉터, 건선, 여드름, 습진, 주사비와 같은 피부/점막 장애 또는 부상, 물리적 또는 화학적 성질의 화상, 특히 수술 상처 및 일광 화상, 궤양, 치질, 치주 및 치과 질환, 우발적 손상 또는 뇌 및 중추 신경계 수술 후와 같은 경막 손상, 악성 및 양성 신생물, 암종, 육종, 림프종 및 흑색종, 수술 후 합병증 등 누공 및 감염, 종양 또는 혈관 기형, 누공과 같은 수술 후 합병증 감염 및 종양 또는 혈관 기형을 앓고 있는 대상체, 바람직하게는 포유동물 환자, 가장 바람직하게는 인간 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 인간, 수의학적 또는 농업적 용도에 유용한 본 발명의 적어도 하나의 가교 키토산 조성물 또는 이의 조성물을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 농업용 조성물은 식물 성장 촉진제로서 유용하다.
특정 구현예에 따르면, 본 발명의 가교 키토산은 자기 조립 구조, 분자 기계, 전달 메커니즘, 전자 제품, 복합 재료 및 윤활제의 제조에 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 적어도 하나의 가교 키토산 또는 이의 조성물을 포함하는 약제학적 제형을 제공한다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 비경구 제제이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 관절내, 동맥내, 정맥내, 활액내, 피내, 피하, 점막하, 간질, 두개내, 안구내, 종양내, 위, 장, 항문, 복강 내 및 근육 내 제형 등과 같은 주사 가능한 제형이다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 경구 제제이다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 국소 제제이다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 안과용 제제이다.
대안적으로 본 발명은 상기 기재된 것과 동일한 용도로 다른 포유동물, 즉 인간에서 사용될 수 있는 조성물을 제공한다.
본 발명은 미용, 재건 수술(예: 조직 재건), 세포 또는 생물학적 조직 배양(예: 줄기 세포 배양), 재료 과학(예: 임플란트 코팅과 같은 표면 코팅, 윤활제 조성물, 응집제 조성물), 진단(예: 이미징 조성물) 응용에 유용한 조성물 또는 의료 장치를 추가로 제공한다. 이러한 조성물은 각각 화장용으로 허용되는 담체 또는 세포 또는 생물학적 조직 배양 영양소를 추가로 포함한다.
본 발명에 따른 조성물은 본 발명의 적어도 하나의 가교 키토산 또는 이의 나노입자를 포함하는 연조직 충전제 조성물, 예를 들어 진피 및 피하 충전제를 포함한다. 키토산계 연조직 충전제 조성물의 제조는 예를 들어 Grant et al., 2018, Tissue Eng Part A., 24(13-14):1091-1098. doi: 10.1089/ten.TEA.2017.0385. Epub 2018 Mar 20에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
특정 구현예에서, 약 5 내지 100 nm 범위의 평균 크기를 갖는 본 발명의 가교 키토산의 나노입자가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명에 따른 적어도 하나의 가교 키토산을 포함하는 상처 드레싱에 관한 것이다.
추가의 특정 측면에 따르면, 본 발명은 히드로콜로이드, 히드로겔, 알기네이트, 콜라겐, 셀룰로스, 폼 또는 천을 포함하는 투과성 매트릭스를 포함하는 상처 드레싱에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 명반(alum), 안정화제, 항균제, 완충제, 착색제, 향미제, 보조제(adjuvants) 등과 같은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 추가 성분(들)을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 통상적으로 사용되는 보조제, 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 제약 조성물의 형태로 배치될 수 있고 정제 또는 충전된 캡슐과 같은 고체, 또는 용액, 현탁액, 연고, 에멀젼, 엘릭시르와 같은 액체 또는 이와 같이 충전된 캡슐, 필름 또는 겔로서 모두 경구용으로 사용될 수 있다. 상기 조성물은 또한 사용 전에 물 또는 다른 적합한 비히클로 재구성하기 위한 건조 생성물로 제형화될 수 있다.
수성 또는 유성 현탁액, 용액, 에멀젼, 시럽 및 엘릭시르를 포함하지만 이에 제한되지 않는 액체 제제로서의 본 발명의 조성물이 제공된다.
이러한 액체 제제는 현탁제, 유화제, 비수성 비히클 및 방부제를 포함하지만 이에 국한되지 않는 첨가제를 함유할 수 있다. 현탁제는 소르비톨 시럽, 메틸 셀룰로스, 포도당/설탕 시럽, 젤라틴, 히드록시에틸 셀룰로스, 카르복시메틸 셀룰로스, 알루미늄 스테아레이트 겔 및 수소화된 식용 지방을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 유화제는 레시틴, 소르비탄 모노올레에이트 및 아카시아를 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 방부제는 메틸 또는 프로필 p-히드록시벤조에이트 및 소르브산을 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 분산제 또는 습윤제는 폴리(에틸렌 글리콜), 글리세롤, 소 혈청 알부민, Tween®, Span®을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
추가적인 재료 및 제형 처리 기술 등이 The Science and Practice of Pharmacy (Remington: The Science & Practice of Pharmacy), 22 nd Edition, 2012, Lloyd, Ed. Allen , Pharmaceutical Press에 기재되어 있고, 이는 참조로 본 명세서에 포함된다.
본 발명의 고체 조성물은 통상적인 방식으로 제형화된 정제 또는 로젠지의 형태일 수 있다. 예를 들어, 경구 투여용 정제 및 캡슐은 결합제, 충전제, 윤활제, 붕해제 및 습윤제를 포함하나 이에 제한되지 않는 통상적인 부형제를 함유할 수 있다. 결합제는 시럽, 아카시아, 젤라틴, 소르비톨, 트라가칸트, 전분의 점액질 및 폴리비닐피롤리돈을 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 충전제는 유당, 설탕, 미세결정질 셀룰로스, 옥수수 전분, 인산칼슘 및 소르비톨을 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 윤활제는 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 활석, 폴리에틸렌 글리콜 및 실리카를 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 붕해제는 감자 전분 및 나트륨 전분 글리콜레이트를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 습윤제는 소듐 라우릴 설페이트를 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 정제는 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 코팅될 수 있다.
본 발명에 따른 농업용 조성물은 식물 성장 촉진제, 종자 발아 증진제, 수분 및 영양 유지 제제, 살충제 증진제, 연장된 형태 및 페로몬 안정화제, 살충제의 점막접착성 형태, 거미류 살충제 및 항연체동물 제제를 포함한다.
특정 구현예에 따르면, 약 0.001 내지 약 99% w/w의 본 발명의 가교 키토산, 예를 들어 약 0.05 내지 약 0.1%(w/w)를 포함하는 농업용 조성물이 제공된다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 또는 나노입자는 가교된 키토산 조성물에 분산되거나 공유적으로 부착되는 생물활성제를 추가로 포함한다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 또는 나노입자는 생물활성제 전달 시스템의 형태이다.
일 구현예에서, 적어도 하나의 생물활성제는 본 발명의 가교된 키토산 조성물 또는 나노입자의 총량을 기준으로 약 0.001 내지 20 중량%, 바람직하게는 약 0.01 내지 10 중량%의 양으로 존재할 수 있다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명에 따른 조성물은 가교된 키토산 또는 이의 조성물을 포함하는 세포 또는 생물학적 조직 배양 배지를 포함한다. 이 배양 배지는 포도당, 비타민, 성장 인자, 금속 이온 등과 같은 세포 영양소를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명에 따른 조성물은 표피, 신경, 연골 또는 뼈 조직과 같은 신체의 손상된 조직을 복구하는 데 유용한 생물학적 조직(내인성 또는 외인성) 또는 합성 또는 반합성 물질을 포함한다.
다른 특정 구체예에서, 본 발명에 따른 가교 키토산을 포도당, 비타민, 성장 인자, 금속 이온 등과 같은 세포 배양 영양소와 혼합하는 단계를 포함하는 배양 배지의 제조 방법이 제공된다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 가교 키토산 또는 이의 조성물을 줄기 세포 또는 표피, 신경, 연골 또는 뼈 조직 등과 같은 신체의 손상된 조직을 복구하는데 유용한 물질, 조직 또는 세포와 조합하는 단계를 포함하는 재건 조직의 제조 방법이 제공된다.
특정 측면에 따르면, 본 발명의 조성물 또는 나노입자는 일단 생물활성제 또는 제제가 로딩되면, 상기 활성 성분 주사의 투여 및 제자리 방출에 유용할 수 있다.
투여 모드
본 발명의 조성물은 또한 피하 주사, 활막 내, 동맥 내, 정맥 내, 관절 내, 근육 내, 피하, 점막하, 안구 내, 두개 내, 위 내, 장, 항문, 복강 내, 종양 내 및 간질 주사 등과 같은 주사에 의해 임의의 방식으로 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 치은을 포함하는 구강의 점막 표면, 구강 바닥, 뺨, 입술, 혀, 치아를 포함하는 경구 경로에 의해 임의의 방식으로 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 피부, 다양한 점액 또는 눈에 국소적으로 투여될 수 있다.
조합
일 측면에 따르면, 본 발명의 가교 키토산 또는 이의 나노입자 또는 이의 임의의 적합한 약제학적으로 허용되는 약제학적 제형은 단독으로 또는 적어도 하나의 조제와 조합하여 투여될 수 있다.
특정 측면에 따르면, 본 발명에 따른 조제는 항생제, 유전자 구성물을 포함하는 핵산, 항체 및 항체 단편, 독소, 세포증식억제제, 항진균제, 화학요법 약물의 성분, 항고혈압제, 항부정맥 물질, 증식 활성화 물질, 호르몬, 사이토카인, 산화질소 기증자 및 황화수소 기증자를 포함한다.
본 발명은 본 발명의 가교 키토산 또는 이의 입자 및 이의 약제학적 제형을 상기 적어도 조제와 동시에 또는 순차적으로 개체에게 투여하는 것을 포함한다.
상기 조제와 동시에 투여되는 본 발명에 따른 가교 키토산 또는 이의 나노입자 또는 이의 약제학적 제형은 동일하거나 상이한 조성물(들) 및 동일하거나 상이한 투여 경로(들)에 의해 투여될 수 있다.
개인에게 단일 또는 다중 용량으로 투여되는 용량은 약동학적 특성, 환자 상태 및 특성(성별, 연령, 체중, 건강 및 크기), 증상의 정도, 동시 치료, 치료 빈도 및 원하는 효과를 비롯한 다양한 요인에 따라 달라질 것이다.
환자
일 구현예에서, 본 발명에 따른 환자는 심장 부정맥, 특히 심방세동 및 고혈압과 같은 심혈관 질환을 앓고 있는 대상체이다.
다른 구체예에서, 본 발명에 따른 환자는 관절 병리 및 관절 질환, 예컨대 류마티스 관절염, 골관절염, 척추관절염, 및 연골, 뼈, 인대 또는 활액낭 손상을 초래하는 외상성 사고으로 고통받는 대상체이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 환자는 눈 병리 및 손상, 예컨대 안구 건조 증후군, 포도막염, 녹내장, 각막 병변을 앓고 있는 대상체이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 환자는 루푸스 및 다발근염과 같은 결합 조직 장애를 앓고 있는 대상체이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 환자는 피부/점막 장애 또는 손상, 예컨대 상처, 흉터, 건선, 여드름, 습진, 주사비, 물리적 또는 화학적 성질의 화상, 특히 외과적 상처 및 일광 화상, 궤양, 치질을 앓고 있는 대상체이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 환자는 치주 및 치과 질환을 앓고 있는 대상체이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 환자는 우발적 손상 또는 뇌 및 중추 신경계 수술과 같은 경막 손상을 앓고 있는 대상체이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 환자는 악성 및 양성 신생물을 앓고 있는 대상체이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 환자는 누공 및 감염과 같은 수술후 합병증을 앓고 있는 대상체이다.
또 다른 추가 구현예에서, 본 발명에 따른 환자는 심미적 또는 치료적 이유로 신체 부위의 부피 증가 또는 임의의 증진/수정 및/또는 신체 부위의 부피 증가와 같은 신체 부위 부피 증가 또는 해부학적 형태를 원하거나 필요로 하는 대상체이다.
또 다른 추가 구현예에서, 본 발명에 따른 환자는 종양, 혈관 기형 또는 통증을 유발하는 임의의 다른 새로 발생하는 물리적 조직 또는 기관 이상을 앓고 있는 대상체이다.
발명에 따른 용도
특정 구현예에 따르면, 본 발명의 가교 키토산은 자발적으로 나노입자를 형성하는 능력으로 인해 조직 충전제, 화장품, 조직 및 오르가노이드 공학 및 재료 과학 응용을 위한 시험관 내 세포 또는 생물학적 조직 배양과 같은 다양한 응용에 유용하다.
특히, 일 측면에 따르면, 본 발명의 가교 키토산은 약제학적 활성 성분의 담체 (예: 약물 전달 시스템, 세포 투과 시스템(예: 유전자 요법 또는 비-세포 침투제), 가용화제, 포획제: 예를 들어 산에서 알칼리성 pH로 전환함으로써 용액으로부터 효과적인 제거를 위한 현탁액을 생성하기 위한 나노입자 내 관심 성분의 캡슐화)로서 사용될 수 있다.
다른 양태에 따르면, 본 발명의 가교 키토산은 의료용 임플란트(예: 생체적합성 개선을 위한 임플란트의 코팅, 세포 함유 재생 의료 임플란트) 또는 재료(예: 지혈 재료)로 사용될 수 있다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명의 가교 키토산은 영상화제(예: 표준 혈관 조영술(CT) 및 기타 새로운 영상 기법에 사용됨(예: EPR 기반, NMR 기반 및 X선 기반))에 사용됨)의 기재로 사용될 수 있다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명의 가교 키토산은 세포 배양(예: 줄기 세포), 세포 배양 배지, 오르가노이드의 3D 프린팅과 같은 조직 공학, 분리/정제 기술, 세포 형질감염을 위한 기재로 사용될 수 있다.
다른 측면에 따르면, 본 발명의 가교 키토산은 나노 크기의 윤활제(예: 열분해 후), 콜로이드 제제용 분산제 또는 응집제로서 사용될 수 있다.
또 다른 특정 구현예에 따르면, 시험관 내 세포 또는 생물학적 조직 배양 또는 신경외과, 뼈, 연골, 표피 재건 조직과 같은 조직 공학 재료의 전달 시스템의 제조를 위한 본 발명의 가교 키토산 또는 본 발명에 따른 나노입자 또는 이의 제제의 용도가 제공된다.
또 다른 특정 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 가교 키토산 또는 나노입자 또는 이의 제제는 의학적 장애, 특히 심혈관 질환, 예컨대 심장 부정맥, 특히 심방세동 및 고혈압, 관절 병리 및 관절 질환(예: 류마티스 관절염, 골관절염, 척추관절염) 및 연골, 뼈, 인대 또는 활액낭 손상으로 이어지는 외상성 사고, 눈 병리 및 손상(예: 안구 건조 증후군, 포도막염, 녹내장, 각막 병변, 결합성 손상), 루푸스 및 다발근염과 같은 조직 장애, 피부/점막 장애 또는 부상, 예를 들어 상처, 흉터, 건선, 여드름, 습진, 주사비, 물리적 또는 화학적 성질의 화상, 특히 외과적 상처 및 일광 화상, 궤양, 치질, 치주 및 치과 질환, 우발적 손상 또는 뇌 및 중추 신경계에 따른 경막 손상 임시 수술, 악성 및 양성 신생물, 특히 암종, 육종, 림프종 및 흑색종, 누공 및 감염과 같은 수술 후 합병증, 종양 또는 혈관 기형의 예방 및/또는 치료, 또는 조직 변성 및 관련 장애의 예방 및/또는 치료에 사용하기에 유용하다.
또 다른 추가의 특정 측면에 따르면, 미용 및 재건 수술을 위한 본 발명에 따른 가교 키토산 또는 나노입자 또는 이의 제제가 제공된다.
또 다른 추가의 특정 측면에 따르면, 생체내 약물 전달에 사용하기 위한 본 발명에 따른 가교 키토산 또는 나노입자 또는 이의 제제가 제공된다.
특정 측면에 따르면, 적어도 하나의 생물활성제에 대한 전달 시스템으로서 본 발명에 따른 나노입자의 용도가 제공된다.
특정 구현예에 따르면, 조직 공학, 세포 또는 생물학적 조직 배양 시스템 등에서 적어도 하나의 생물활성제 또는 세포 전달 시스템을 위한 전달 시스템 등과 같은 많은 의학적 적용에 유용한 본 발명에 따른 적어도 하나의 가교 키토산 또는 나노입자를 포함하는 조성물이 제공된다.
본 발명을 예시하는 실시예는 도면에 나타낸 실시예를 참조하여 보다 상세한 방식으로 이하에서 설명될 것이다.
실시예
다음 약어는 각각 아래 정의를 나타낸다:
DMF (디메틸포름아미드); DMSO (디메틸 설폭사이드); MWCO (분자량 컷오프).
실시예 1: 본 발명의 키토산의 합성
본 발명의 키토산의 나노입자가 상술한 반응식 1에서와 같이 합성되며, 여기서 사용된 출발 물질은 다음과 같다:
a) 키토산을 제공하고 상기 키토산을 물의 부재 하에 팽윤 단계로 처리하는 단계 (예: 비양성자성 용매에서)
건조 키토산 450g(키토산은 진공에서 산화인 상에서 건조될 수 있으며, 진공에서 적당한 열, 에탄올, 아세토니트릴, 아세톤 또는 기타 적절한 용매와 공비 증류)을 불활성 분위기의 반응기에 넣는다(예: 아르곤으로 퍼징함). 이 반응기는 바람직하게는 자기 교반기, 불활성 가스(예: 아르곤)로 퍼지하기 위해 Drexel 플라스크의 노즐이 들어가는2개의 뿔이 달린 노즐, 시약 추가를 위한 배압이 있는 적하 깔때기가 장착된 둥근 바닥 2리터 플라스크이다.
비양성자성 용매(예: DMF) 1,400ml를 반응기에 붓고 키토산을 실온에서 약 1시간 동안 팽윤시켰다.
건조되지 않은 키토산이 제공되는 경우 비양성자성 용매(예:DMF) 1,500ml를 반응기에 붓고 키토산을 실온에서 1시간 동안 팽윤시킨 후 비양성자성 용매(예: DMF) 300ml를 진공에서 (in vacuo) 증류 제거한 다음 200ml의 DMF를 건조된 키토산에 반응기에 첨가하고 키토산을 실온에서 1시간 동안 팽윤되게 한다.
팽윤된 키토산을 포함하는 반응 매질은 그 다음 약 2℃ 내지 6℃ 동안 온도 조절 장치에 연결된 욕조 또는 얼음 수조에서 약 2℃ 내지 6℃로 냉각된다. 같은 수조에서 100ml 건조 DMF가 있는 250ml 반응기(예: 둥근 바닥 플라스크)도 냉각된다. 냉각 후, 아실화제를 비양성자성 용매(100ml의 DMF)에 용매를 휘저으면서 교반하여 국부 과열을 방지하며 적가한다. DMF의 아실화 시약 용액은 실온 정도까지 데울 수 있다.
b) 물의 부재 하에 화학식 (I)의 아크릴 화합물로 상기 키토산의 아미노기를 아실화하는 단계:
위에서 제조한 아크릴로일 화합물의 용액을 격렬하게 교반하면서 약 15분 이내에 위에서 얻은 키토산 현탁액에 첨가하되, 바람직하게는 반응기를 부드럽게 흔들면서(예: 수동으로), 아크릴로일 화합물의 첨가를 중지하는 동안, 이는 플라스크의 상부 벽에서 용매 스프레이로 키토산 덩어리를 씻어낼 수 있기 때문이다. 아크릴로일 화합물 용액의 첨가가 완료된 후, 적하 깔때기를 10ml 내지 15ml 정도의 최소량의 용매(예: DMF)로 세척하고 이 용액을 반응 매질에 첨가한다. 냉각을 제거하고 이따금 흔들어주면서 또 다른 2시간 동안 교반을 계속하여 반응 매질이 실온으로 가온되도록 하였다. 교반 후 플라스크를 약 15분 동안 초음파 수조에 넣고 반응 혼합물을 초음파 처리한다. 이 초음파 노출 시간 동안은 반응 혼합물을 30℃ 이하로 약간의 가열만 해도 발생한다.
c) 비친핵성 염기의 존재 하에 단계 b)의 아실화 생성물을 친핵성 부가 반응(아자-마이클 부가)에 적용하는 단계:
그 후, 격렬하게 교반하고 주기적으로 흔들면서 약 15분 이내에 비친핵성 염기(예: 트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민)를 단계 b)에서 사용된 아크릴로일 화합물의 양에 비해 과량으로 반응 매질(예: 적하 깔때기를 통해)에 첨가한다. 혼합물을 밤새 또는 실온에서 약 15 내지 18 시간 동안 혼합되도록 방치한다. 그 다음, 반응기를 온도가 약 55℃인 수조에 넣고 혼합물을 약 6시간 동안 교반한다. 반응기를 수조에서 제거하고 약 15분 동안 약 55℃로 예열된 초음파 수조에 놓고 반응 혼합물을 초음파 처리한다.
초음파 처리 후 반응기를 회전식 증발기로 옮기고 휘발성 유기 비친핵성 염기를 사용하는 경우 비친핵성 염기를 증류 제거한다. 비휘발성 염기를 사용하는 경우에는 반응기를 실온 이하로 냉각하고, 격렬하게 교반하면서 등량의 산(예: 염산)을 첨가한다. 생성된 반응 매질의 pH는 중성 반응 매질을 달성하도록 제어된다.
d) 본 발명 가교 키토산의 수득
가교된 키토산은 염 불순물과 함께 비양성자성 용매(예: DMF)에 현탁액으로 c) 단계에서 얻어진다. 따라서, 생성물은 예를 들어 탈이온수에 대한 투석에 의한 정제 단계를 거친다. 예를 들어, 이 목적을 위해 단계 c)에서 얻은 반응 용액을 투석 백으로 옮기고 클램프로 닫고 마그네틱 교반기에서 탈이온수가 혼합된 용기에 넣는다. 투석은 다양한 방법으로 모니터링할 수 있다: 예를 들어 세척액의 전도도 측정을 통해 염 함량을 모니터링하거나 260nm 미만의 파장에서 UV 흡수를 통해 DMF 함량을 모니터링한다. 탈이온수와 투석된 생성물을 20분 동안 배양한 후 전기 전도도나 UV 흡수에 큰 차이가 없으면 투석 과정이 완료된 것으로 간주한다.
e) 선택적으로 건조 상태에서 본 발명의 가교 키토산을 얻는 단계
단계 d)에서 얻은 습윤 생성물을 건조하지 않고 사용할 수 있다. 그러나, 예를 들어 제제화/저장 또는 운송을 위해서는 건조될 수도 있다.
이어서, 단계 d)에서 수득된 정제된 생성물을 건조시킨다. 예를 들어, 생성물의 예비 동결과 함께 동결 건조기에서 건조를 수행할 수 있습니다. 먼저 인산 무수물 또는 분자체, 수산화칼륨 등과 같은 적절한 건조제의 존재하에 대기압에서 대부분의 액체를 흡수한 다음 진공에서 (in vacuum) 무수 인산 또는 임의의 적절한 건조제의 존재 또는 예비 증발과 함께 회전식 증발기에서 물을 에탄올로 반복적인 공비 증류한 다음 인산 무수물 또는 적절한 건조제로 진공 건조한다.
일반적으로 본 발명의 방법의 수율은 약 90%이다. 손실은 무균의 우선 순위와 오염의 부재가 수율의 우선 순위보다 높기 때문에 건조 중 나노 입자의 비말동반뿐만 아니라 반응 용기, 투석 백에서 이동하는 동안의 손실과 가장 관련이 있다.
f) 건조 상태의 추가적인 본 발명의 가교 키토산
선택적으로, 단계 c), 단계 d) 또는 단계 e)에서 얻어진 정제된 가교 키토산은 비누화될 수 있다. 이를 위해, 단계 d)에서 얻은 가교 키토산을 불활성 분위기(예: 아르곤으로 퍼지) 하에 반응기에 넣는다. 1,200ml의 탈이온수를 플라스크에 붓고 약 100ml의 탈이온수에 사용된 아크릴로일 화합물의 양에 비해 20% 몰 과량의 알칼리 용액(예: 물 속의 NaOH)을 세게 저으면서 약 15분 이상에 걸쳐 첨가한다. 이 절차를 통해 반응기 상부 벽에 용매 스프레이로 붙은 키토산 덩어리를 씻어낼 수 있으므로 알칼리 첨가를 중단하는 동안 플라스크를 수동으로 부드럽게 흔드는 것이 좋다. 교반 후 반응기를 초음파 수조에 넣고 반응 혼합물을 초음파 처리한다. 약 55℃의 반응 질량에 도달한 후 이 온도에서 초음파 처리를 추가로 2시간 동안 계속한다. 그 후, 얻어진 생성물은 등량의 산으로 중화되거나, 투석되거나 중화 없이 건조될 수 있고, 건조 후에 다시 단계 b) 내지 c) (또는 d)/e)의 적어도 하나의 사이클을 거칠 수 있다. 단계 b) 내지 c) (또는 d)/e)의 시퀀스의 적어도 하나의 주기를 사용하면 카르복실 기능을 갖는 가교 키토산의 포화도를 증가시킬 수 있다.
실시예 2: 본 발명의 가교 키토산 합성의 예
본 발명의 다양한 가교 키토산(CHI)은 가교제의 성질 및 비율을 변화시키면서 거기에 기술된 방법에 따라 합성되었다. 실시예는 하기 표 1에 제시되어 있다.
각각의 경우 450g의 키토산이 출발 물질로 사용된다. 실시예 2a-2r 및 C1에서, 아크릴로일 화합물은 아크릴로일 클로라이드(CAS 등록 번호: 814-68-6)이다. 실시예 2t-2al에서 아크릴로일 화합물은 메타크릴로일 클로라이드(CAS 등록 번호: 920-46-7)이다. 반응은 본 발명의 방법의 단계 a) 내지 단계 c)에 기재된 바와 같이 수행된다. 실시예 2am-는 아크릴로일 화합물로서 상이한 아크릴로일 클로라이드이다.
CHI 키토산 아크릴로일 화합물 가교/키토산 - 이론적 링크 수 또는 가교 비율
2a MW: 11.5 kDa
DD: 62%		 4.250 g (키토산 20% 초과) 1
2b MW: 10.7 kDaDD: 91% 4.570 g (키토산 20% 초과) 1
2c 2a와 동일 11.278 g 키토산 거대분자에 초기에 존재하는 아미드/아민기의 9.8% (단계 b)에서 생성된 4.9% 및 단계 c)에서 생성된 4.9%)
2d 2b와 동일 12.112 g 2c와 같음
2e 2a와 동일 71.35 g 아민기 총체
2f 2b와 동일 112.47 g 2e와 같음
2g MW: 53.0 kDaDD: 70% 0.922 g (키토산 20% 초과) 1
2h MW: 50.3 kDaDD: 91% 0.972 g (키토산 20% 초과) 1
2i 2g와 동일 3.754 g 키토산 거대분자에 초기에 존재하는 아미드/아민기의 3.2% (단계 b)에서 생성된 1.6% 및 단계 c)에서 생성된 1.6%)
2j 2h와 동일 3.953 g 2i와 같음
2k 2g와 동일 82.12 g 2e와 같음
2l 2h와 동일 112.40 g 2e와 같음
2m MW: 543.4 kDaDD: 60% 90 mg (키토산 20% 초과) 1
2n MW: 501 kDaDD: 93% 98 mg (키토산 20% 초과) 1
2o 2m과 동일 4.60 g 키토산 거대분자에 초기에 존재하는 아미드/아민기의 4.0% (단계 b)에서 생성된 2.0% 및 단계 c)에서 생성된 2.0%)
2p 2n과 동일 5.00 g 2o와 같음
2q 2m과 동일 68.72 g 2e와 같음
2r 2n과 동일 115.53 g 2e와 같음
C1 Glucosamine MW:179.17 g/mol
DD: 100%		 113.66 g 2e와 같음
2t 2a와 동일 4.908 g (키토산 20% 초과) 1
2u 2b와 동일 5.275 g (키토산 20% 초과) 1
2v 2a와 동일 13.025 g 2c와 같음
2w 2b와 동일 13.988 g 2c와 같음
2x 2a와 동일 82.40 g 2e와 같음
2y 2b와 동일 129.89 g 2e와 같음
2z 2g와 동일 1.065 g (키토산 20% 초과) 1
2aa 2h와 동일 1.122 g (키토산 20% 초과) 1
2ab 2g와 동일 4.335 g 2i와 같음
2ac 2h와 동일 4.565 g 2i와 같음
2ae 2g와 동일 94.84 g 2e와 같음
2af 2h와 동일 129.81 g 2e와 같음
2ag 2m과 동일 104 mg (키토산 20% 초과) 1
2ah 2n과 동일 113 mg (키토산 20% 초과) 1
2ai 2m과 동일 4.233 g 2i와 같음
2aj 2n과 동일 4.591 g 2i와 같음
2ak 2m과 동일 79.37 g 2e와 같음
2al 2n과 동일 133.42 g 2e와 같음
2am 2n과 동일 α,β-디메틸 아크릴로일 클로라이드 (CAS [49651-33-4], M.W. 118.56 g/mol, 5.207 g 2i와 같음
2an 2n과 동일 2-메틸렌 도데칸산 클로라이드 (CAS [52756-21-5], M.W. 230.77 g/mol, 10.135 g 2i와 같음
2ao 2n과 동일 (Z)-유로칸산 클로라이드 (CAS [91788-89-5], M.W. 138.13 g/mol, 6.066 g 2i와 같음
2ap 2n과 동일 (Z)-2-클로로-2-부테노일 클로라이드 (CAS [56030-36-5], M.W. 138.98 g/mol, 6.104 g 2i와 같음
2aq 2n과 동일 뮤코닉 클로라이드 (CAS [58823-55-5], M.W. 179.00 g/mol, 3.931 g 2i와 같음
2ar 2n과 동일 (Z)-2- 메틸헵트-2-엔-6-이노일 클로라이드 (CAS [313217-54-8], M.W. 156.61 g/mol, 6.878 g 2i와 같음
2as 2n과 동일 말레산 무수물 (CAS [108-31-6], M.W. 98.06 g/mol, 4.307 g 2i와 같음
2at 2h와 동일 2j와 동일 c) 단계에서 b) 단계의 시작 온도는 -70℃이고 반응은 10일 동안 -20℃에서 수행된다.
2au 2h와 동일 2j와 동일한 1/1000 부, 4 mg 반응이 일반적인 방법의 c) 단계에서 b) 단계에 기재된 대로 수행하되, 1000배 적은 질량과 밀폐된 5ml 반응기에서 수행된다. c) 단계에서 단계 b)의 시작 온도는 -70℃이고 반응이 30분 동안 +150℃에서 수행된다.
2av 2f 에서 수득 반응은 단계 f)에 기재된 바와 같이 수행된다. 이러한 조건에서 프로피온산 아미노기로 변형된 최종 양은 키토산 거대분자에 초기에 존재하는 아민기의 절반에 해당한다.
2ax 2k 에서 수득 2av 와 같음
2ay 2r에서 수득 2av 와 같음
2az 2av 에서 수득 56.24 g의 아크릴로일 클로라이드 반응이 단계 b), 단계 c), 단계 f)에 기재된 바와 같이 수행된다. 이러한 조건 하에서, 키토산 거대분자에 초기에 존재하는 아민기의 75%는 프로피온산으로 변형된다.
2ba 2ax에서 수득 41.05 g 의 아크릴로일 클로라이드 2az와 같음
2bb 2ay에서 수득 57.77 g의 아크릴로일 클로라이드 2az와 같음
2bc 2r에서 수득 반응이 단계 f)에 기재된 대로 수행되지만 비누화는 0℃에서 시작하여 이 온도에서 10일 동안 계속된다. 염기의 양은 사용된 아크릴오일 클로라이드와 등가의 몰이다. 이러한 조건에서 프로피온산 아미노기로 변형된 최종 양은 키토산 거대분자에 초기에 존재하는 아민기의 절반에 해당한다.
2bd 2r에서 수득 반응이 단계 f)에 기재된 대로 수행되지만 비누화는 0℃에서 시작하여 압력 하에 140℃에서 30분 동안 계속된다. 염기의 양은 사용된 아크릴오일 클로라이드와 등가의 몰이다. 이러한 조건에서 프로피온산 아미노기로 변형된 최종 양은 키토산 거대분자에 초기에 존재하는 아민기의 절반에 해당한다.
2be 2r에서 수득 반응이 단계 f)에 기재된 대로 수행되지만 비누화는 0℃에서 시작하여 0℃에서 10일 동안 계속된다. 염기의 양은 사용된 아크릴오일 클로라이드로 10당량이다. 이러한 조건에서 프로피온산 아미노기로 변형된 최종 양은 키토산 거대분자에 초기에 존재하는 아민기의 절반에 해당한다.
2bf 2r에서 수득 반응이 단계 f)에 기재된 대로 수행되지만 비누화는 0℃에서 시작하여 압력 하에 140℃에서 30분 동안 계속된다. 염기의 양은 사용된 아크릴오일 클로라이드로 10당량이다. 이러한 조건에서 프로피온산 아미노기로 변형된 최종 양은 키토산 거대분자에 초기에 존재하는 아민기의 절반에 해당하고 아세틸기의 약간의 비누화가 일어난다.
2bg 2a와 동일 143 g의 아크릴로일 클로라이드 반응이 단계 b)에 기재된 대로 수행된다. 이러한 조건에서 초기에 키토산 거대분자에 존재하는 아민 기의 총체는 이중 결합을 포함하는 아크릴산 형성 아크로로일 아미드로 변형된다.
2bh 2000 kDa,DD 10% 3.278g의 아크릴로일 클로라이드 및 용매로서 N,N-디메틸아세트아미드 중 LiCl의 10% 용액 반응이 단계 b) 및 단계 c)에 기재된 대로 수행된다. 2i와 같음.
실시예 3: 본 발명의 키토산 나노입자의 특성화
위에서 설명한 대로 제조된 3.2% 가교된 501kDa 키토산(실시예 2i)의 샘플을 포름바르(formvar)/탄소 코팅된 구리 그리드에 30초 동안 흡착시키고 5초 동안 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)로 염색했다. 그런 다음 Jem1400 투과 전자 현미경(Jeol)과 Veleta 카메라(SIS, Germany)를 사용하여 염색된 물질의 현미경 사진을 얻었으며(도 1A), 이는 제제의 벌크가 작은 포유동물 바이러스와 크기가 유사한 대략 15 nm의 직경을 갖는 구형 입자로 구성되어 있음을 보여준다. 중간 크기의 바이러스 입자에 해당하는 직경이 60 내지 80 nm 범위인 더 큰 입자도 관찰할 수 있다.
또한, 표준 선형 키토산(MW: 501 kDa, 93% DD)(Bioavanta) 및 동일한 키토산 (실시예 2i) 으로 제조된 본 발명에 따른 가교 키토산의 건조 필름을 1% 숙신산 수용액에 2% 키토산 용액을 페트리 접시에 부어 1mm 층을 형성하였고, 이는 상온에서 항량이 될 때까지 인산 무수물에서 진공 건조하고 이 필름을 ≪Solver Bio≫ 원자력 현미경(NT-MDT, Zelenograd, Russia)으로 반접촉 모드로 분석했다. 표준 키토산 샘플(MW: 501kDa, 93% DD)의 100μm x 100μm 필름 표면적의 3차원 표현은 표면이 매끄럽고 선형 키토산 중합체가 아마도 동일선상으로 배열되어 있음을 보여주며 (도1B1), 한편 구형 구조의 덩어리로 형성된 "피크"와 "골짜기"가 있는, 실시예 2i 의 상응하는 가교 키토산 샘플의 표면적은 울퉁불퉁하다 (도1B2). 도 1B3 및 B4는 수중 본 발명에 따른 1% w/w 가교 키토산으로 침윤된 박테리아 나노셀룰로오스를 포함하는 원자력 현미경 필름을 시각화하고 있다. AFM 측정은 공기 중 표준 실내 조건(T = 26℃, RH = 15%)에서 Solver Next 스캐닝 프로브 현미경(NT-MDT, Russia)에서 반접촉 모드로 수행되었다. ScanAsyst-AIR AFM 프로브(Bruker, USA)는 ~0.4N/m의 빔-캔틸레버 강성, ~70kHz의 공진 주파수 및 2nm의 공칭 곡률 반경(AFM 프로브의 선명도)이 최적의 압력(SetPoint) 측정을 위해 사용되었다. 모든 측정은 0.5Hz의 스캔 속도와 512×512 포인트의 해상도에서 수행되었다. 경사면을 빼고 측정 결함("고착 (sticking)")을 제거하여 ImageAnalysis 3.5 프로그램에서 후속 처리를 수행했다. 얻어진 도 1 B3 및 B4 의 분석은 샘플 표면에 균일하게 분포된 구형 구조(도 1 B3 및 B4)를 보여주었으며, 이 구형 구조는 Caliciviridae, Picornaviridae, Parvoviridae 와 같은 작은 바이러스의 크기에 해당하는 20 nm의 평균 직경을 가진다. 원자현미경에서 관찰된 구조의 존재는 이전 투과 전자 현미경의 데이터에 의해 확인되었다 (도 1 A).
표준 키토산(음성 대조군)과 본 발명의 가교 키토산(실시예 2i)과 가교 글루코사민(비교예 C1)(양성 대조군) 사이의 구조적 차이는 불활성 분위기(예: 아르곤)에서 다음과 같이 성공적인 가교의 경우에만 형성되는 마커 물질을 식별하기 위해 저분자량 물질을 정확한 방식으로 분석할 수 있는 환류산 가수분해 방법에 의해 추가로 조사되었다:
샘플(각각 100mg)을 -20℃로 냉각된 5ml의 메틸렌 1ml의 아세틸 클로라이드 용액에 격렬하게 교반하면서 첨가한다. 이어서, 혼합물을 0℃로 가열하고 30분 동안 격렬하게 교반하면서 유지하였다. 디이소프로필에틸아민(1 ml)을 첨가하고 혼합물을 실온으로 가온하고 추가 30분 동안 격렬하게 교반하면서 유지한다. 생성된 하이드로클로라이드를 중화하면 분석을 방해하는 모든 물질을 물로 세척할 수 있으며 또한 비친핵성 강염기의 존재로 인해 아세틸화가 가능한 한 완전히 수행될 수 있다. 모든 용매를 진공에서 조심스럽게 증발시키고 잔류물을 물 샘플 1ml로 3회 세척한다. 세척수를 버리고 고체 침전물에 28% 염산 10ml를 가하여 2시간 동안 환류시킨다. 반응 혼합물을 진공 하에 조심스럽게 증발시키고 잔류물(약 100mg)을 2% 수성 아세트산 100ml에 재현탁시켰다. 이 시점에서 샘플이 준비된다. 중합체의 글루코사민 및 글루코사민 유도체로의 완전한 가수분해가 현재 조건하에서 발생하였다. 따라서 화학식 (II) 물질은 천연 키틴 및 키토산에서 발견되지 않기 때문에 아자-마이클과 잔여 아크릴산의 반응에 의해서만 얻어질 수 있으므로 이러한 물질의 검출은 교차 확인에 사용할 수 있고, 따라서 이러한 물질의 검출은 본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 가교 키토산을 확인하기 위해 사용될 수 있다.
화학식 (I)의 아크릴로일 클로라이드(예: 본 발명에 따른 가교 단계에 사용되는 임의의 아크릴산 산염화물)가 가교제로서 사용되는 경우(예를 들어, 2i 실시예의 경우 예비 샘플 준비(예: 아세틸화, 세척) 후, 글루코사민 단위 사이의 글리코시드 결합의 가수분해 뿐만 아니라 아세틸글루코사민과 가교제(예: 아실화를 위해 활성화된 치환 또는 비치환된 아크릴산 유도체)를 사용한 아실화시에 생성된 아미드 결합의 아미드 결합의 가수분해를 유도하는 수득된 중합체의 환류산 가수분해는 하기 화학식 (IIIa)의 글루코사민 및 프로피온산 유도체를 유도하며:
Figure pct00052
(IIIa)
상기 화학식에서 R2 내지 R4 는 본 출원에서 정의된 바와 같으며, 특히 비치환, 아실화 - 활성화된 아크릴산이 사용되는 경우 하기 화학식 (II)의 글루코사민 및 프로피온산 유도체이다:
Figure pct00053
(II)
이 물질은 가수분해적으로 안정하며 처음에 가교가 발생한 경우 혼합물에 존재해야 한다. 다른 가교 시약을 사용하면 유사한 유도체(IIIa)가 형성된다. 높은 정도의 가교가 수행되는 경우, 화학식 (IIIb)의 유도체의 검출은 본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 가교된 키토산을 확인하는 데 사용될 수 있다.
Figure pct00054
(IIIb)
여기서 R2 내지 R4는 본원에서 정의된 바와 같고, R2' 내지 R4'는 본원에서 각각 R2 내지 R4 로 정의된 바와 같으며, 여기서, R2' 내지 R4' 는 각각의 상응하는 R2 내지 R4와 동일하거나, 본 발명의 방법에서 단계 b) 내지 단계 c)의 후속 시퀀스에서 사용된 화학식 (I)의 아크릴 화합물이 제1 시퀀스에서 사용된 것과 상이한 경우에는 상이할 수 있다.
본 발명의 방법으로부터 생성된 생성물에서 가교의 존재를 뒷받침하기 위해, 상기 기재된 바와 같이 제조된 샘플 용액을 질량 분광 분석(Bruker Daltonics TOF 180 mkl/h, tune_low.m, ES pos. 스캔, N2- 4l/분, 190℃, Nb.=0.4, 스펙트럼 시간 1초)에 직접 사전 크로마토그래피 없이 사용한다. 비교 표준 키토산(도 A2)과 본 발명의 가교 키토산(도 B2) 모두에 대한 관심 이온 영역 (낮은 m/z 비율)의 질량 스펙트럼에서 글루코사민 특이적 피크가 관찰되며(m/z = 180.073), 아미노 포도당의 온전한 잔기의 존재를 반영한다. 그러나, 본 발명의 가교된 키토산의 경우, m/z = 252.077인 새로운 피크가 나타나며(도 B2), 이는 프로피온산을 사용한 아미노 글루코스의 알킬화로 인한 화학식 II의 생성물에 해당한다. 이 예에서 피크 강도는 낮으며, 이는 샘플의 낮은 가교 비율(반응 조건 2i에 의해 결정된 3.2% 가교)을 반영한다. 이는 본 발명의 방법에 따른 성공적인 키토산 가교를 지원하는 특징적인 피크이다. 이는 상기 표 1(비교용 글루코사민 양성 대조군 포함)에 기재된 바와 같은 다양한 적절한 조건 하에 수행된 본 발명의 방법으로부터 생성된 모든 샘플에 존재하고 시험된 모든 키토산 및 키틴에는 존재하지 않았다.
글루코사민과 화합물(II)에 대한 m/z = 180 및 m/z = 252 피크의 속성을 확인하기 위해 서로 다른 충격 에너지(AB SCIEX Triple Quad™ 3500)(5V 및 15V)에서 충돌 연구를 수행했다. 이 경우, 전처리된 건조 잔류물(가수분해 후, 반응 혼합물은 진공 (vacuum)하에 증발됨)을 10% 메탄올 및 0.1% 포름산을 함유하는 수용액에 용해시켰다. m/z = 180 화합물의 더 높은 충격 에너지(Sciex 기기)에서 단편화 시 수분 손실 스펙트럼(-18 m/z, -2*18 m/z, -3*18 m/z)이 관찰 m/z = 180 화합물의 더 높은 충격 에너지(Sciex 기기)에서 단편화 시 수분 손실 스펙트럼(-18 m/z, -2*18 m/z, -3*18 m/z)이 관찰된다(도 5A 및 5B). 충돌 에너지가 증가함에 따라 물 손실 피크의 강도도 증가한다. 이 현상은 탄수화물의 특징입니다. m/z = 252 화합물의 이온에 대해서도 유사한 도면이 관찰된다(도 5B 및 5C). 그러나 탄수화물의 유도체로서 동일한 충돌 에너지에서 수분 손실과 관련하여 더 안정적일 수 있다. 따라서, 물 손실을 나타내는 피크의 관찰된 상대 강도는 더 낮다.
위에서 설명한 대로 제조된 본 발명의 3.2% 가교된 501 kDa 키토산(실시예 2i)의 안정성은 본 발명의 5 mg에 아세트산나트륨 완충액(pH 5.5) 중 10 mg/ml 농도의 계란 리소자임 용액 500 μl를 첨가한 후 질량 분석에 의해 모니터링되었다. 혼합물을 더 이상 질량 스펙트럼의 변화가 관찰되지 않을 때까지 37℃에서 진탕기에서 7일 동안 인큐베이션했다. 그 단계에서 질량 스펙트럼은 고분자량 화합물의 특징적인 "빗(comb)" 모양의 패턴: 955-958, 1023-1024, 1101-1104, 1193-1196 m/z 비율에서 규칙적으로 증가하는 강도와 함께 규칙적으로 산재된 피크를 보였다. 이 피크들은 전하 단위에 따라 다른 동일한 단편에 해당한다. 주어진 질량에 대해 이온 전하는 +15, +14, +13 및 +12이다. 주요 파편의 질량은 14'305 Da이다. 유사한 결과가 더 긴 기간, 최대 3주 동안 배양된 샘플에서도 얻어졌다. 이것은 난백 리소자임과 온혈 동물의 조직 모두에서 키토산과 그 유도체의 가수분해를 담당하는 가수분해효소가 가교된 키토산을 약 14kDa의 질량을 가진 다소 큰 단편으로만 가수분해할 수 있음을 보여주는 것이다. 따라서 이는 고분자량의 탈아세틸화된 키토산을 사용하여 나노입자를 제조할수록 효소적 가수분해에 더 안정적임을 시사한다.
따라서, 이러한 데이터는 나노입자를 형성하는 본 발명의 가교 키토산과 출발 물질로 사용되는 표준 키토산 사이의 구조의 큰 차이를 뒷받침한다. 또한, 화학식 (II)의 물질 또는 관련 물질의 검출에 기초한 방법은 본 발명의 방법에 의해 수득된 나노입자의 검출에 매우 민감하고 고도로 특이적이다.
실시예 4: 본 발명의 키토산 나노입자의 세포 내재화
세포에 의해 내재화되는 본 발명의 키토산 나노입자의 능력은 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 및 5-(및 6-)카복시플루오레세인(FAM)으로 표지된 키토산 침투를 사용하여 쥐의 각막 내부에 형광 현미경으로 다음과 같이 시험하였다.
플루오레세인으로 표지된 가교 키토산은 501 kDa의 분자량과 93% 또는 3.2%의 탈아세틸화도를 갖는 표준 초기 키토산, 본 발명에 따른 가교 키토산을 사용하여 제조되었다(실시예 2p). 얼음 수조에서 미리 냉각된 DMF(1ml)를 Eppendorf 튜브의 두 키토산(100mg)에 첨가하고 현탁액을 1시간 동안 팽윤되도록 방치했다. 그런 다음 250μL의 DMF에 2.85mg의 플루오레세인-5-이소티오시아네이트(FITC) 또는 5-(및 6-) 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르(NHS-플루오레세인) 용액을 얼음물로 채워진 초음파 수조에 첨가하고 초음파 처리했다. 처음 20분 동안 수조의 온도를 0℃로 유지한 다음, 수조를 40℃로 가열하고 이 온도에서 100분 동안 반응을 수행하였다. 튜브의 내용물을 12 내지 14 kDa 투석 튜브로 옮기고 물에 대해 투석했다. 100ml의 물에 대해 20번의 투석 절차를 거친 후, 50mg의 숙신산을 각 투석관에 첨가하고 키토산을 용해시키고 투석 절차를 반복하였다. 생성된 용액을 동결건조하고 이어서 재현탁하여 0.25% 용액을 수득하였다.
쥐 백혈구를 이 용액과 함께 37℃에서 4시간 동안 배양하고 DNA 특이적 염료(Hoechst 33258)로 염색하고 형광 현미경으로 분석했다. 형광 분석(도 2)은 녹색 형광(C)이 세포질 전체에 걸쳐 균일함을 보여주며, 이는 FITC-표지된 가교 키토산이 세포 내부에 있고 따라서 세포내이입되었음을 나타낸다(표지된 키토산과 세포막의 단순한 결합은 세포 경계에 형광 고리를 생성했을 것이다(A). 핵(D) 외부에서 관찰되는 청색 형광은 세포 사멸의 개시로 인해 발생할 수 있다.
동일한 용액(0.25%)의 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 및 5(6)-카르복시플루오레세인(FAM)으로 표지된 CBA 마우스의 눈에 적용했다(각 눈에 한 방울). 6시간 후, 실험 동물을 희생시키고 눈을 포르말린으로 고정하고 Stradleigh et al., 2015, Prog Retin Eye Res., 48: 181-202 에 기재된 대로 염색하고 형광 현미경으로 분석했다. 표준 키토산은 각막과 공막 표면에 우선적으로 집중된 반면(도 3A), 본 발명의 키토산 나노입자(밝은 녹색 형광)는 균일한 방식으로 각막 깊숙이 침투함을 관찰하였다(도 3B).
이러한 데이터는 본 발명의 가교 키토산 나노입자가 나노입자-매개 세포내이입을 통해 세포내 위치로 및/또는 가능하게는 나노입자-매개 트랜스사이토시스를 통해 세포를 가로질러, 불량한 세포-침투성(친수성) 또는 세포 비-침투성(대분자) 활성 성분의 세포 침투 능력을 증가시키는 데 유용할 것임을 뒷받침한다.
실시예 5: 본 발명의 키토산 나노입자의 생체적합성
본 발명의 가교 키토산(실시예 2i)의 생체 적합성은 MSC의 문화와 성장에 대한 가능한 영향을 평가하기 위하여 Bieback et al., 2008, Transfus Med Hemother., 35(4): 286-294, doi: 10.1159/000141567에 기재된 대로 골수 흡인을 통해 건강한 기증자로부터 수집한 인간 골수 중간엽 줄기 세포(MSC)의 시험관 내 배양에서 평가되었다.
MSC는 1,077g/ml 밀도 구배 원심분리를 통해 Bieback , et al., 2008, supra 에 기재된 바와 같이 단리된 후 2회 세척하고 10% 메세컬트 태아 혈청, l-글루타민 및 항생제를 함유하는 DMEM 성장 배지에서 성장시켰다. 배양의 순도는 유세포 분석을 사용하여 확인되었다. 배양된 MSC는 Ciuffreda et al., 2016, Methods Mol Biol. 2016;1416:149-58. doi: 10.1007/978-1-4939-3584-0_8에 기재된 바와 같이 특정 배지 추가 시 연골 형성, 골 형성 및 지방 형성 분화에 대한 입증된 능력을 갖는 다음의 표현형을 나타냈다: CD44+/CD73+/CD90+/CD105+/CD34-/HLA-DR. 연구는 4 계대에서 세포를 사용하였다.
25 cm2 배양 접시의 벽을 가교 키토산 필름으로 덮고, 접시를 건조 성장 배지로 2회 세척하고 세포를 파종하였다. 동일한 크기의 처리되지 않은 배양 접시를 비교를 위해 유사하게 파종하였다. 배양 접시의 플라스틱 벽에 교차 결합된 키토산의 존재는 세포 부착 및 세포 성장을 방해하지 않았다. 접종 후 3-4시간 이내에 세포가 퍼지고 특징적인 방추형 모양을 채택한다. 성장 속도는 가교 키토산 처리 접시에서 다소 느렸다. 밀집도(Confluency)는 표준 배양 접시에서 48 내지 56 시간 후에 그리고 가교 키토산 처리 배양 접시에서 68-76시간 후에 도달하였다.
결론적으로, 본 발명의 가교 키토산은 비록 표준 조건보다 낮은 효율이지만 인간 골수 간엽 줄기 세포의 성장 및 증식을 지속시킨다.
실시예 6: 농업에 적용하기 위한 본 발명의 키토산의 용도
본 발명의 가교 키토산(실시예 2i)의 유용성을 다음과 같이 봄 밀 종자에 대해 시험하였다. 본 발명의 가교 키토산의 수중 현탁액은 2가지 다른 농도로 제조되었으며, 종자는 현탁액에 침지되었으며 각 실험은 적용된 처리에 따라 다음 군의 종자를 포함하였다:
(A) 대조군 (종자 처리 없음);
(B) 0.1%(w/w) 가교 키토산 처리,
(C) 0.05%(w/w) 가교 키토산 처리.
기관 형성 (organogenesis)초기 단계의 성장 촉진 효과 평가
24시간 처리 후, 종자를 페트리 접시(접시당 12개의 종자, 4중)의 습한 기재(면층이 있는 필터), 자연광, t = +20-22℃에 놓았다. 발아 에너지는 Domin et al., 2020, Sustainability　2020,　12(1), 46 에 설명된 대로 측정되었으며 습한 기재와 접촉시킨 후 1일과 3일 후에 측정되었고, 발아 능력 (발아된 종자의 수를 시험된 총 종자 수에서 빈 종자를 뺀 값으로 나눈 값)은 습한 기재와 접촉시킨 후 7일 후에 판단하였다. 기관형성 초기 단계의 성장 지표는 3일 후(각 묘목의 뿌리 길이, 묘목 전체 길이) 및 7일 후(묘목당 뿌리 수, 묘목 길이, 묘목당 뿌리 및 싹의 총 질량, 및 각 뿌리의 질량) 습기 접촉 후 기록하였다.
본 발명의 가교 키토산 처리의 긍정적인 효과는 발아에 대해 도 6에 도시된 바와 같이 기관형성의 초기 단계에서의 묘목 발달에 대해 하기 표 2에 요약된 바와 같이 최저 농도에서 입증되었다:
성장 기간 성장 지표 A B C
3 일 묘목 당 뿌리 수 2.9 3.0 3.0
묘목 당 뿌리 길이, cm 7.79±0.27 8.64±0.46 10.20±0.94
개별 뿌리 길이, cm 2.60±0.12 2.86±0.08 3.4±0.11
싹의 길이, cm 1.84±0.09 2.29±0.03 2.69±0.30
7 일 묘목 당 뿌리 수 4.41 4.68 4.83
싹의 길이, cm 10.05±0.75 10.11±0.69 11.27±0.26
묘목당 뿌리의 공기 건조 바이오매스, mg 8.20±0.07 9.60±0.56 9.40±0.20
1 뿌리의 공기 건조 바이오 매스, mg 1.86±0.02 2.06±0.15 1.95±0.08
1 묘목의 공기 건조 바이오 매스, mg 15.13±0.13 17.25±0.19 16.45±0.41
가교 키토산 처리 1일 이내에 더 높은 치근 출현율이 관찰되었다. 가장 강력한 효과는 저농도 현탁액에서 관찰되었다 (가교 키토산 0.05%로 22.9% 증가, 14.6% 증가, 가교 키토산 0.1% 증가, 75% 기준선 대조군 사용). 발아 에너지(6.2% 증가)와 발아 능력(대조군 = 93.8%)을 측정할 때도 동일한 경향이 관찰되었다. 고농도 가교 키토산 현탁액으로 종자를 처리하면 발아 능력이 4.1% 증가했다. 기관 형성의 초기 단계에서 가교 키토산은 뿌리 성장을 증가시켰다. 3일 후, 뿌리의 총 길이는 가교 키토산 0.1% 및 가교 키토산 0.05% 군에서 각각 10.9% 및 30.9% 증가했다(대조군 = 7.79 cm). 동시에 고농도 가교 키토산군에서 가장 균일한 증가가 관2837찰되었다 (가교 키토산 0.1% 균일성 계수 = 81%(n = 45); 가교 키토산 0.05% = 78.2%(n = 48), 대조군 = 68.9%(n = 45)). 묘목의 높이를 측정할 때도 동일한 경향이 관찰되었다. 가교 키토산 0.05% 처리 후 증가(대조군보다 46.2% 높음 = 1.84cm)가 가교 키토산 0.1% 처리 후(대조군 보다 24.4% 높음)보다 더 유의한 경우, 균일성 계수는 고농도 가교 키토산 처리군(가교 키토산 0.1%=75.4%; 가교 키토산 0.05%=72.8% 대조군= 61.7%)에 대하여 더 높았다. 실험 시작 7일 후 측정한 결과, 저농도 가교 키토산 처리가 뿌리 형성을 가장 많이 향상시켰다(가교 키토산 0.05%: 9.5% 증가, 가교 키토산 0.1%: 6.1% 증가, 대조군의 평균 뿌리 수: 묘목당 4.41개). 전체 묘목 길이의 증가(가교 키토산 0.05%: 7.7% 증가, 대조군: 10.05 cm)에서도 동일한 결과가 나타났다. 대조적으로, 바이오매스의 가장 높은 증가는 뿌리 모두(가교 키토산 0.1%: 17.1% 증가; 가교 키토산 0.05%: 14.6% 증가) 및 전체 묘목에 대해 (가교 키토산 0.1%: 12.9% 증가, 가교 키토산 0.05%: 8.7% 증가)에 대해 더 농축된 가교 키토산 현탁액으로 처리한 후 관찰되었다.
토양 기재에서 봄 밀 묘목의 성장 및 발달에 미치는 영향 평가
종자는 파종 7일 전에 처리되었다 (알칼리성 체르노젬, 플라스틱 화분당 500g/12개 화분, 4회 반복, 자연 채광, t = 20-22℃, 제어된 토양 습도). 묘목의 발아에너지, 발아능, 높이 및 바이오매스를 측정하였다. 처음 7일 동안 성장 매개변수를 기록했다. 가교 키토산으로 처리한 종자, 특히 더 높은 농도(대조군: 70.8%, 처리된 종자에 대한 상대 증가: 27.1% 및 23%)에서 24시간 후에 더 높은 치근 출현 비율이 관찰되었습니다. 하기 표 3 및 도 6에 나타난 바와 같이 고농도 가교 키토산 처리 후 100% 발아를 얻었다.
지표 실험군
A
B C
발아 에너지, % 1일 후 치근 출현 70.8 97.9 93.8
2일 후 정상적으로 발아된 묘목 % 95.9 93.8 100
3일 후 97.9 100 83.4
발아, % 7 일 후 93.8 100 83.4
정상적으로 발달된 싹의 길이, cm 2 일 후 0.71±0.05 1.11±0.05 0.85±0.03
3 일 후 2.87±0.13 3.40±0.13 2.92±0.06
7 일 후 18.95±0.30 20.48±0.24 19.31±0.28
공기 건조 바이오매스, mg 총 묘목 16.65±0.32 18.95±0.41 20.90±0.37
묘목당 뿌리 6.93±0.14 8.53±0.23 9.33±0.22
0.1% 가교 키토산 처리로 인한 높은 초기 성장 자극 속도는 2일 후 56.3%) 3일 후 3배(가교 키토산, 0.05%, 11.6배), 7일 후 2.3배 감소했다. 대조군(16.63 mg)과 비교하여 7일 후 바이오매스의 증가는 0.1% 처리군(총 바이오매스의 경우 14%, 뿌리의 경우 23.8% 높음) 및 0.05% 처리된 그룹(총 바이오매스의 경우 25.7% 및 뿌리의 경우 35.1% 높음) 모두에서 더 높았다. 0.05% 가교 키토산 처리는 총 바이오매스 1.8배 증가, 뿌리 바이오매스 1.5배 증가로 이어졌다.
종합하면, 이들 데이터는 본 발명의 가교 키토산을 사용한 처리가 봄 밀 발아에서 상당한 성장 자극을 초래했음을 뒷받침한다.

Claims (24)

  1. 하기 단계를 포함하는 가교 키토산의 제조 방법:
    a) 키토산을 제공하고 상기 키토산이 용매에서 팽윤되도록 방치하는 단계;
    b) 상기 키토산의 아미노기를 화학식 I의 아크릴 화합물로 아실화하는 단계로서:
    Figure pct00055

    여기서, R1은 할로겐, 또는 제거시 3-히드록시벤조트리아졸 에스테르, 무수물(혼합 무수물 포함), N-히드록시숙신이미드, 펜타클로로페놀, 2-니트로-4-술포페놀 에스테르 및 기타 유사한 이탈기와 같은 아미노기의 아실화를 보장하는 기타 이탈기이고; R2, R3 및 R4는 독립적으로 H로부터 선택되며, 선택적으로 치환된 알킬(예: C1-C6 알킬), 선택적으로 치환된 알케닐(예: C2-C6 알케닐), 선택적으로 치환된 알키닐(예: C3-C6 알키닐), 선택적으로 치환된 사이클로알킬(예: C3-C8-사이클로알킬), 선택적으로 치환된 사이클로알케닐(예: C4-C8 사이클로알케닐), 선택적으로 치환된 사이클로알키닐(예: C5-C8 사이클로알키닐), 선택적으로 치환된 헤테로사이클로알킬이고; 선택적으로 치환된 아릴(예: 선택적으로 치환된 페닐), 선택적으로 치환된 헤테로아릴 및 선택적으로 치환된 아릴 C1-C6 알킬, 특히 벤질이며; 여기서 "치환된(substituted)이라는 용어는 할로겐, -COOR', -NR'R'', =O, -OR', -COR', -CONR'R'', -SR', -SO3R', -SO2NR'R '', -SOR', -SO2R', -NO2 또는 -CN으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 5개의 치환기로 치환된 기를 지칭하며; 또는 R1 및 R2 또는 R1 및 R3, 또는 R1 및 R4는 함께 4-24원 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬(예: 8-24원 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬과 같은, 6-24원 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬)을 형성하고;
    c) 염기의 존재 하에 단계 b)의 아실화 생성물을 반응시키는 단계(Aza-Michael 반응);
    d) (예를 들어, 염 불순물 및/또는 비양성자성 용매로부터) 단계 c)에서 얻은 가교 키토산을 정제하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 단계 d)로부터의 생성물의 건조 단계 e)를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    단계 a) 하에 제공된 키토산은 약 5 내지 약 2,000 kDalton, 특히 약 150 내지 2,000 kDalton 범위의 평균 분자량을 갖는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    R은 할로겐, 특히 클로로(chloro)인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아크릴 화합물은 아크릴로일 클로라이드 및 메타크릴로일 클로라이드로부터 선택되는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 알칼리 조건 하에 단계 c) 또는 단계 d) 후에 비누화 단계 f)를 추가로 포함하고, 수득된 생성물은 단계 b) 내지 단계 c) (또는 단계 d))의 적어도 하나의 시퀀스를 추가로 처리할 수 있는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능한 가교 키토산 또는 이의 임의의 약제학적으로 허용되는 염.
  8. m/z=252.077 ± 0.01 전자분무 양이온을 갖는 피크를 포함하는 질량 스펙트럼 패턴에 의하여 특성화되는 가교 키토산 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염,
  9. 제7항 또는 제8항에 따른 적어도 하나의 가교 키토산 및 적어도 하나의 담체를 포함하는 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 조성물은 약제학적 조성물이고, 상기 담체는 약제학적으로 허용되는 담체인 조성물.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 조성물은 세포 또는 조직 영양소를 추가로 포함하는 세포 또는 조직 배양 배지인 조성물.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 조성물은 재건 조직인 조성물.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 조성물은 농업용 조성물인 조성물.
  14. 제9항에 있어서,
    상기 조성물은 화장료 조성물이고, 상기 담체는 화장용으로 허용되는 담체인 조성물.
  15. 제7항 또는 제8항에 따른 적어도 하나의 가교 키토산 또는 이의 조성물을 포함하는 연조직 충전제, 상처 드레싱 또는 재건 조직.
  16. 제7항 또는 제8항에 따른 적어도 하나의 가교 키토산에 따른 하나의 가교 키토산을 포함하는 나노입자.
  17. 제7항 또는 제8항에 따른 적어도 하나의 가교 키토산을 포함하는 세포 또는 생물학적 조직용 배양 배지.
  18. 세포 또는 생물학적 배양 배지의 제조 또는 재건 조직의 제조를 위한 제7항 또는 제8항에 따른 가교 키토산의 용도.
  19. 제7항 또는 제8항에 따른 가교 키토산 또는 이의 조성물로서,
    심장 부정맥, 특히 심방세동 및 고혈압과 같은 심혈관 질환, 류마티스 관절염, 골관절염, 척추관절염과 같은 관절 병리 및 관절 질환, 및 연골, 뼈, 인대 또는 활액낭 손상으로 이어지는 외상성 사고, 안구 건조 증후군, 포도막염, 녹내장, 각막 병변 등의 눈 병리 및 부상, 루푸스 및 다발성 근염과 같은 결합 조직 장애, 상처, 흉터, 건선, 여드름, 습진, 주사비와 같은 피부/점막 장애 또는 부상, 물리적 또는 화학적 성질의 화상, 특히 외과적 상처 및 일광 화상, 궤양, 치질, 치주 및 치과 질환, 우발적 손상 또는 뇌 및 중추 신경계 수술 후와 같은 경막 손상, 악성 및 양성 신생물, 특히 암종, 육종, 림프종 및 흑색종, 수술 후 누공 및 감염, 종양 또는 혈관 기형과 같은 합병증으로부터 선택된 질병 또는 장애의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 가교 키토산 또는 이의 조성물.
  20. 다음 단계를 포함하는, 생물활성제용 약물 전달 시스템의 제조 방법:
    - 제7항 또는 제8항에 따른 가교 키토산을 습윤 또는 건조 상태로 제공하는 단계;
    - 전달될 생물활성제를 제공하는 단계;
    - 상기 생물활성제를 용매 또는 초임계 유체에 용해시키는 단계;
    - 상기 가교 키토산에 생물활성제 용액을 함침시키거나 전기영동 또는 전기장에 의한 가속에 의해 나노입자에 직접 도입함으로써 본 발명의 상기 가교 키토산의 나노입자를 로딩하는 단계;
    - 이렇게 수득된 조성물 또는 생물활성제(예: 약물)가 로딩된 나노입자를 수집하는 단계.
  21. 의학적 장애, 특히 심장 부정맥, 특히 심방세동 및 고혈압과 같은 심혈관 상태, 류마티스 관절염, 골관절염, 척추관절염과 같은 관절 병리 및 관절 질환, 및 연골, 뼈, 인대 또는 활액낭 손상으로 이어지는 외상성 사고, 안구 건조 증후군, 포도막염, 녹내장, 각막 병변과 같은 눈 병리 및 부상, 루푸스 및 다발성 근염과 같은 결합 조직 장애, 상처, 흉터, 건선, 여드름, 습진, 주사비와 같은 피부/점막 장애 또는 부상, 물리적 또는 화학적 화상 자연, 특히 수술 상처 및 일광 화상, 궤양, 치질, 치주 및 치과 질환, 우발적 손상 또는 뇌 및 중추 신경계 수술 후와 같은 경막 손상, 악성 및 양성 신생물, 특히 암종, 육종, 림프종 및 흑색종, 수술 후 누공 및 감염, 종양 또는 혈관 기형과 같은 합병증을 예방, 치료 또는 개선하는 방법으로서,
    상기 방법은 제7항 또는 제8항에 따른 유효량의 적어도 하나의 가교 키토산 또는 이의 제약 제제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  22. 제7항 또는 제8항에 따른 적어도 하나의 가교 키토산 또는 이의 조성물을 예를 들어 동결건조된 형태로 포함하는 키트.
  23. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법에 의해 얻을 수 있는 가교 키토산을 확인하는 방법으로서, 상기 방법은
    - 용매에서 특성화될 키토산을 제공하는 단계;
    - 격렬한 교반 하에 상기 키토산을 아실화하는 단계;
    - 염기로 반응 매질을 중화하는 단계;
    - 상기 용매를 증발시키고 얻어진 중화된 생성물을 세척하는 단계;
    - 생성물을 환류산 가수분해에 적용하는 단계;
    - 반응 혼합물을 증발시키고 가수분해된 생성물을 아세트산과 같은 약산에 재현탁시키는 단계;
    - 화학식 (IIIa) 또는 화학식 (IIIb)에 따른 생성물로부터 선택된 생성물의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하고,
    Figure pct00056
    (IIIa);
    Figure pct00057
    (IIIb);
    상기 화학식에서, R2 내지 R4 는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같고, R2' 내지 R4'는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에서의 R2 내지 R4로 각각 정의된 바와 같고, 여기서 화학식 (IIIa) 및/또는 (IIIb)의 생성물의 존재는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의하여 수득된 가교 키토산을 나타내는 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    화학식 (III), 특히 화학식 (II)에 따른 생성물의 존재 또는 부재는 질량 분광법 전자분무 분석에 의해 수행되는 것인 방법.
    Figure pct00058
    (II)
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