KR20220130162A - 재생 의학에서의 로도코커스 루버 세포벽 골격의 용도 - Google Patents

재생 의학에서의 로도코커스 루버 세포벽 골격의 용도 Download PDF

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Abstract

줄기 세포의 증식 촉진, 줄기 세포의 성장 촉진, 줄기 세포의 분화 촉진, 줄기 세포의 이동 촉진 및 줄기 세포의 생존율 향상에서의 로도코커스 루버 세포벽 골격의 용도가 제공되고; 상기 줄기 세포는 성체 줄기 세포, iPSC 및 간엽 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.

Description

재생 의학에서의 로도코커스 루버 세포벽 골격의 용도
본원은 재생 의학 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 이는, 줄기 세포의 증식 촉진 및 줄기 세포의 분화 촉진에서의 로도코커스 루버(Rhodococcus ruber)(특히 세포벽 골격)의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 2020년 1월 21일에 출원된 중국 특허 출원 번호 CN 202010068249.1의 우선권을 주장한다.
줄기 세포는 자가-재생 능력과 다방향 분화 잠재성을 가진 원시 세포이다. 특정 조건에서, 이는 증식하고 다른 기능 세포로 분화할 수 있다. 따라서, 줄기 세포는 생명체의 다양한 조직과 기관의 재생 및 손상 복구에 매우 중요한 역할을 하며 많은 난치성 질환, 특히 세포 및 조직이 소실되거나 손상되는 질환의 희망이 되고 있다.
줄기 세포에는 배아줄기 세포와 성체 줄기 세포가 있다. 배아줄기 세포의 적용은 윤리적인 문제로 인해 크게 제한되는 한편, 성체 줄기 세포는 기능적 세포 및 조직으로 분화할 수 있어 줄기 세포의 광범위한 적용을 위한 기반을 제공하고, 많은 질환에 대한 세포 대체 요법을 위한 새로운 세포 공급원을 제공한다. 따라서, 성체 줄기 세포가 연구의 초점이 되었다.
그러나, 정상 성체 포유동물의 줄기 세포 수는 적으며, 분화는 다양한 내재적 기전과 미세환경적 인자에 의해 영향을 받고, 시험관 내에서 이들 세포를 대량으로 장기간 배양(특히 무혈청 확장 배양(serum-free expansion culture)) 하는 것은 매우 어렵기 때문에 이러한 세포는 실제 치료에 적합하지 않는다.
많은 질환은 기능 세포의 손실 또는 손상으로 거슬러 올라갈 수 있으며, 세포 대체 요법은 이러한 질환에 대한 효과적인 치료이다. 줄기 세포 관련 약물은 생명체에서 줄기 세포의 증식과 분화를 조절하여 세포 소실이나 손상으로 인한 질환을 예방하고 치료할 수 있다. 줄기 세포 관련 약물은 자가 줄기 세포의 증식과 유도 분화 잠재성(directed differentiation potential)을 조절하여 손상된 기능 세포를 재구성하고 이의 생물학적 기능을 회복시킨다.
지방-유래 성체 줄기 세포(Ad-MSC)는 자가-재생 능력이 뛰어난 지방 조직 스트로마로부터 유래된 성체 줄기 세포이며, 다양한 유형의 기능 세포로 분화할 수 있다. Ad-MSC가 줄기 세포 기반 만성 상처 치료에 큰 잠재성을 가지고 있다는 증거가 있다. 그러나, 잠재적 세포 요법에서 Ad-MSC의 성공적인 사용에 대한 중요한 장애물은 이식 후 세포의 생존율이다. 손상된 피부 조직에 세포를 이식하면 저산소증, 염증, 산화 스트레스 등을 비롯한 불리한 조건을 경험하며, 이는 불가피하게 이식 후 시드 세포의 불량한 생존을 초래하여 Ad-MSC의 치료 효과를 방해한다.
로도코커스 루버는 그램-양성 박테리아이다. 일반적으로, 콜로니는 주황색-황색 또는 주황색-적색이고, 모양이 둥글고; 콜로니의 크기는 약 1 내지 2 mm이고; 세포는 구형 또는 짧은 막대 모양이고; 이것은 일차 분지 균사체를 형성할 수 있고; 편모가 없다. 로도코커스 루버는 호기성 및 화학적 종속영양성이다.
현재, 연구자들은 로도코커스 루버에 대한 전체 유전자 서열분석을 수행하였다. 예를 들어, 판 신(Fan Xin) 등은 로도코커스 루버 SD3 균주에 대한 전체 유전자 서열분석을 수행하고, 생물정보학적 분석을 수행하였다. SD3 균주의 전체 게놈 길이는 약 5.37 Mb이고, GC 함량은 약 70.63%이고, 젠뱅크(GenBank) 수탁번호는 CP029146이다(문헌[Fan Xin, Whole-genome sequencing and expression analysis of heat shocking protein DnaK from Rhodococcus ruber SD3, Genomics and Applied Biology, January 2019]).
로도코커스 속은 유기 물질에 대한 강한 내성과 넓은 분해 스펙트럼으로 인해 다양한 생활 환경에 적응할 수 있다. 따라서, 로도코커스는 오염 정화, 유기 화합물 분해, 하수 처리 등의 분야에서 널리 사용된다. 현재, 로도코커스 루버의 주요 적용 분야는 환경 관리이다(CN 108862590 A, CN 107151635 A, CN 102250796 A, CN 1519312 A, CN 103627653 A, CN 101033454 A, CN 108130288 A, CN 104830738 A, CN 101619299 A, CN 103509833 A, CN 106434466 A, CN 101580808 A, CN 102604875 A, CN 103160491 A, CN 106591168 A, CN 106591172 A 및 CN 105820982 A 참고).
CN 109576180 A는 중국 광저우 판위 디스트릭트 근교 교외의 붉은 토양에서 선별한 박테리아 RDC-01을 개시한다. 상기 균주는 16S rRNA 유전자 염기서열 분석 및 배양 특성 동정에 의해 로도코커스 루버로 동정되었다. 불활성화 후, 면역 보조제(immune adjuvant)로서 박테리아를 동물용 불활성화 백신에 첨가하였고, 동물의 항체 생산을 촉진할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 인간 의학 분야에서의 로도코커스 루버의 적용은 보고되지 않았다.
따라서, 성체 줄기 세포의 증식과 분화를 특이적으로 조절하는 활성 성분을 찾는 것이 줄기 세포 관련 약물의 연구 초점이다.
본원은 줄기 세포의 조절을 위한 활성 성분 및 이의 응용을 제공한다.
본 발명의 일부 양태에 따라, 단리된 로도코커스 루버가 제공된다.
본 발명의 일부 특정 양태에 따라, 2019년 3월 22일자로 중국 일반 미생물 균주 수집 센터(CGMCC)(베이징 차오양 디스트릭트 웨스트 베이천 로드 야드 번호 1(3), 중국 과학원 미생물학 연구소, 우편번호: 100101)에 수탁번호 CGMCC 17431로 기탁된 단리된 로도코커스 루버가 제공된다. 기탁은 특허 절차상 미생물기탁의 국제 승인에 관한 부다페스트 조약의 요건을 충족한다.
본 발명의 일부 양태에 따라, 로도코커스 루버 및 이의 유도 생성물이 제공된다. 유도 생성물은 로도코커스 루버로부터 유래되고, 로도코커스 루버의 성분을 포함한다(예컨대, 단백질, 핵산, 지질, 세포벽 및 이의 성분, 탄수화물 또는 대사산물).
특정 양태에서, 단리된 로도코커스 루버 세포벽이 제공된다.
특정 양태에서, 단리된 로도코커스 루버 세포벽이 제공되고, 로도코커스 루버는 CGMCC 수탁번호 17431의 균주를 지칭한다.
특정 양태에서, 로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물이 제공된다.
특정 양태에서, 단리된 로도코커스 루버 세포벽 골격이 제공된다.
특정 양태에서, 단리된 로도코커스 루버 세포벽 골격이 제공되고, 로도코커스 루버는 CGMCC 수탁번호 17431의 균주를 지칭한다.
본 발명의 일부 양태에 따라, 본 발명에 따른 로도코커스 루버 세포벽 또는 로도코커스 루버 세포벽 골격을 포함하는 약학 조성물이 제공된다.
본 발명의 일부 양태에 따라, 로도코커스 루버의 파쇄에 의해 수득된 생성물을 포함하는, 로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물이 제공된다.
본 발명의 일부 다른 양태에 따라, 로도코커스 루버 세포벽의 파쇄 및 정제(지질, 핵산 및 단백질의 제거)에 의해 수득된 생성물을 포함하는, 로도코커스 루버로부터 유래된 생성물이 제공된다.
본 발명의 일부 다른 양태에 따라, 로도코커스 루버 세포벽을 포함하는, 로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물이 제공된다.
본 발명의 일부 양태에 따라, 로도코커스 루버 세포벽 골격을 포함하는, 로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물이 제공된다.
본 발명의 일부 양태에 따라, 로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물을 포함하는 약학 조성물 또는 의료 기기가 제공된다.
본 발명의 일부 다른 양태에 따라, 로도코커스 루버의 파쇄 및 정제(지질 및/또는 핵산 및/또는 단백질의 제거)에 의해 수득된 생성물을 포함하는 약학 조성물 또는 의료 기기가 제공된다.
본 발명의 일부 다른 양태에 따라, 로도코커스 루버 세포벽을 포함하는 약학 조성물 또는 의료 기기가 제공된다.
본 발명의 일부 다른 양태에 따라, 로도코커스 루버 세포벽 골격을 포함하는 약학 조성물 또는 의료 기기가 제공된다.
본 발명의 일부 다른 양태에 따라, 전술한 로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물을 포함하는 약학 조성물 또는 의료 기기가 제공된다.
특정 양태에서, 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함한다.
약학 조성물의 일부 양태에서, 로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물은 1 중량부이고, 약학적으로 허용되는 부형제는 50 내지 5000 중량부(예컨대, 50, 100, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 500, 600, 700, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 중량부, 및 상기 임의의 2개의 값들 사이의 범위 내의 임의의 값)이다.
약학 조성물의 일부 다른 양태에서, 로도코커스 루버 세포벽은 1 중량부이고, 약학적으로 허용되는 부형제는 50 내지 5000 중량부(예컨대, 50, 100, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 500, 600, 700, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 중량부, 및 상기 임의의 2개의 값들 사이의 범위 내의 임의의 값)이다.
약학 조성물의 또 다른 양태에서, 로도코커스 루버 세포벽 골격은 1 중량부이고, 약학적으로 허용되는 부형제는 50 내지 5000 중량부(예컨대, 50, 100, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 500, 600, 700, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 중량부, 및 상기 임의의 2개의 값들 사이의 범위 내의 임의의 값)이다.
일부 양태에서, 약학 조성물은 액체(액체 제형)로 제형화될 수 있다.
일부 다른 양태에서, 약학 조성물은 고체(분말 제형 또는 동결건조 분말 제형)로 제형화될 수 있다.
당업자는 본 발명의 약학 조성물의 경우, 액상 제형과 분말 제형(또는 동결건조 분말 제형)이 서로 전환될 수 있고, 차이는 단지 수분 함량에만 있음을 이해한다. 분말 제형(또는 동결건조 분말 제형)은 액체 제형으로부터 대부분의 또는 모든 물을 제거함으로써 수득된다. 액체 제형은 분말 제형(또는 동결건조 분말 제형)을 용해(또는 재구성)시킴으로써 수득된다.
일부 양태에서, 약제 또는 약학 조성물은 연고, 크림, 유화액, 현탁액, 페이스트, 젤, 로션, 팅크제(tincture), 연고(salve), 정제, 에어로졸, 스프레이, 도찰제(liniment) 및 분말로 이루어진 군으로부터 선택되는 투여 형태로 제조되되, 상기 연고는 연질 연고, 고약 및 크림으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 약학적으로 허용되는 부형제는 비제한적으로 충전제, 안정화제, 향미제, 붕해제, 결합제 및 윤활제에 관한 것이다.
일부 양태에서, 약학적으로 허용되는 부형제는 예컨대 비제한적으로 덱스트란, 락토스, 미세결정질 셀룰로스, 트레할로스, 글리신, 자일리톨, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 에리트리톨, 젤라틴, 마그네슘 스테아레이트, 추진제, 습윤제, 용매, 가용화제, 유화제, 산화방지제, pH 조절제 및 보존제이다.
구체적으로, 비제한적인 예는 또한 백색 바셀린, 카보머, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 나트륨 하이드록시메틸 셀룰로스, 키토산, 수크랄페이트 키토산, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐 알코올, 나트륨 히알루로네이트, 다이메틸 에터, 테트라플루오로에탄, 하이드로플루오로알칸, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 탈이온수, 주사용수, 증류수, 에탄올, 헥사데칸올, 옥타데칸올, p-아미노벤조산, 아세트아미드, 이소프로판올, 트윈, 폴리옥시에틸 수소화 피마자유, 스테아르산, 글리세릴 모노스테아레이트, 트라이글리세롤 모노스테아레이트, 수크로스 지방산 에스터, 수크로스 에스터, 수크로스 아세테이트 이소부티레이트, 소르비탄 트라이스테아레이트, 이소프로필 미리스테이트, 콜레스테롤, 스쿠알렌, 스쿠알란, n-부탄올, 에틸렌 글리콜, 에탄올, 프로필렌 글리콜, 폴리글리세롤 에스터, 설파이트, 시스테인, 다이-tert-부틸 하이드록시톨루엔, 칼륨 소르베이트, 포스페이트 완충 용액, 트라이에탄올아민, 나트륨 하이드록사이드, 에틸렌다이아민, 라우릴아민, 나트륨 바이카보네이트, 염산, 니파인, 티머로살, 클로로크레졸, 트라이클로로부탄올, 벤조산 및 이들의 나트륨 염을 포함한다.
본 발명의 일부 양태에 따라, 하기 단계를 포함하거나 이들로 이루어진, 로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물의 제조 방법이 제공된다:
1) 로도코커스 루버를 제공하는 단계;
2) 임의적으로, 상기 로도코커스 루버를 배양하는 단계;
3) 임의적으로, 배양된 로도코커스 루버를 수집하는 단계;
4) 상기 배양된 로도코커스 루버를 파쇄하여 파쇄된 생성물을 수득하는 단계;
5.1) 임의적으로, 상기 파쇄된 생성물로부터 지질을 제거하는 작업을 수행하는 단계;
5.2) 임의적으로, 상기 파쇄된 생성물로부터 핵산을 제거하는 작업을 수행하는 단계;
5.3) 임의적으로, 상기 파쇄된 생성물로부터 단백질을 제거하는 작업을 수행하는 단계;
5.4) 정제된 생성물을 수득하는 단계;
6) 임의적으로, 상기 정제된 생성물로부터 물을 제거하는 단계, 바람직하게는 동결건조에 의해 상기 정제된 생성물로부터 물을 제거하는 단계;
7) 임의적으로, 분취(aliquoting)하는 단계;
8) 로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물을 수득하는 단계
(이때, 단계 5.1), 5.2) 및 5.3)은 순서에서 상호교환가능하거나 병렬로 수행되고; 단계 6) 및 단계 7)은 순서에서 상호교환가능하거나 병렬로 수행된다).
임의적으로, 단계 5)는 (예를 들어, 비이온성 계면활성제를 사용하여) 세포막을 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
로도코커스 루버의 배양은 특정 배양 배지 및 배양 파라미터로 제한되지 않는다. 당업자는 배양을 위한 주지되고 적합한 방법을 사용할 수 있고, 제조 규모에 따라서 배양 디쉬, 배양 플라스크 및 발효기를 사용할 수 있다.
로도코커스 루버의 파쇄의 경우, 목적은 세포 내부의 물질을 제거하는 것이다. 그러므로, 초음파처리, 리소자임 및 기타 기술이 사용될 수 있다. 당업자는 그램-양성 박테리아의 파쇄에 적합한 임의의 공지된 또는 미래의 방법이 본 발명의 기술적 해결에 적합하다는 것을 이해한다.
당업자는, 제조 단계에서 후속 적용에 영향을 미치는 인자를 도입하지 않도록, 활성 성분(세포벽 및 이의 성분)의 후속 적용(예컨대 경구 투여, 주사, 국소 적용 등)에 따라 배양, 파쇄, 분리, 수집, 불순물 제거 및 분취를 위한 특정 매개변수 및 장비를 조정하는 능력을 갖는다.
일부 양태에서, 유기 용매는 파쇄된 생성물로부터 지질을 제거하는 데 사용된다. 일부 양태에서, 뉴클레아제는 파쇄된 생성물로부터 DNA 및 RNA를 제거하는 데 사용된다. 일부 양태에서, 하이드롤라제는 파쇄된 생성물에서 단백질을 분해하는 데 사용된다. 일부 양태에서, 계면활성제는 파쇄된 생성물로부터 세포막을 제거하는 데 사용된다.
일부 양태에서, 파쇄의 평균 입자 크기는 10 내지 1,000 nm이고; 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 nm ± 10 nm가 언급될 수 있고, 상기 값 중 임의의 2개 사이의 범위가 언급할 수 있다. 입자 크기를 측정하기 위한 많은 방법이 존재한다(문헌[Hu Songqing et al., Modern technology of particle size measurement, Modern Chemical Industry, 2002, 22:1]).
일부 특정 양태에서, 파쇄의 평균 입자 크기는 10 내지 800 nm이다.
일부 다른 특정 양태에서, 파쇄의 평균 입자 크기는 10 내지 500 nm이다.
일부 특정 양태에서, 분취는 용기 내로의 분취 또는 고체 지지체 상으로의 분취를 지칭한다. 용기는 바이알, 튜브, 패키지, 백(bag), 플레이트, 앰풀, 주사 장치, 알루미늄-필름 패키징, 드레싱 및 캡슐로 이루어진 군으로부터 선택된다.
예를 들어, 특정 양태에서, 분취는 바이알/앰풀로의 분취를 지칭한다. 용매는, 사용 직전에 바이알/앰풀에 첨가된다.
본 발명의 일부 양태에 따라, 본 발명의 제조 방법에 의해 수득된, 로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물이 제공된다.
본 발명의 일부 양태에 따라, 본 발명에 따른 제조 방법에 의해 수득된, 로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물을 포함하는 약학 조성물 또는 의료 기기가 제공된다.
본 발명의 일부 양태에 따라, 성체 줄기 세포의 조절에 사용되는 단리된 로도코커스 루버 세포벽이 제공된다. 조절은, 줄기 세포의 증식 촉진, 줄기 세포의 성장 촉진, 줄기 세포의 분화 촉진, 줄기 세포의 이동 촉진 및 줄기 세포의 생존율 향상 중 하나 또는 이들의 조합으로부터 선택되고; 줄기 세포는 성체 줄기 세포, iPSC 및 간엽 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 간엽 줄기 세포는, 골수 간엽 줄기 세포, 지방-유래 간엽 줄기 세포, 활액 간엽 줄기 세포, 탯줄 간엽 줄기 세포, 제대혈 간엽 줄기 세포, 태반 간엽 줄기 세포, 양막 간엽 줄기 세포, 간 간엽 줄기 세포, 근육 간엽 줄기 세포, 폐 간엽 줄기 세포, 췌장 간엽 줄기 세포 및 치수 간엽 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일부 양태에 따라, 성체 줄기 세포의 조절에 사용되는 로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물이 제공된다.
본 발명의 일부 양태에 따라, 성체 줄기 세포의 조절에 사용되는 약학 조성물 또는 의료 기기가 제공된다.
본 발명의 일부 양태에 따라, 성체 줄기 세포의 조절에서의 본 발명에 따른 로도코커스 루버 세포벽의 용도가 제공된다.
성체 줄기 세포의 조절용 약제/의료 기기 제조에서의 본 발명에 따른 로도코커스 루버 세포벽의 용도가 제공된다.
본 발명의 일부 양태에 따라, 성체 줄기 세포의 조절을 위한 본 발명에 따른 로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물의 용도가 제공되고; 성체 줄기 세포의 조절용 약제/의료 기기의 제조에서의 본 발명에 따른 로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물의 용도가 제공된다.
본 발명의 일부 양태에 따라, 성체 줄기 세포의 조절을 위한 본 발명에 따른 약학 조성물의 용도가 제공되고; 또한, 성체 줄기 세포의 조절을 위한 약제/의료 기기의 제조에서의 본 발명에 따른 약학 조성물의 용도가 제공된다.
본 발명의 일부 양태에 따라, 약제(또는 의료 기기)의 제조에서의 하기로부터 선택되는 어느 하나의 용도가 제공된다:
- 본 발명에 따른 로도코커스 루버,
- 본 발명에 따른 단리된 로도코커스 루버 세포벽,
- 본 발명에 따른 로도코커스 루버로부터 유래된 생성물,
- 본 발명에 따른 약학 조성물.
일부 특정 양태에서, 약제는 성체 줄기 세포의 조절에 사용된다.
일부 특정 양태에서, 의료 기기(예컨대 드레싱, 패치, 붕대 및 필름 등)는 성체 줄기 세포의 조절에 사용된다.
본 발명의 양태에 따라, 또한, 대상을 치료 유효량(또는 예방 유효량)의 하기로부터 선택되는 어느 하나에 노출시키는 단계를 포함하는 성체 줄기 세포의 조절 방법이 제공된다:
- 본 발명에 따른 단리된 로도코커스 루버 세포벽,
- 본 발명에 따른 로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물,
- 본 발명에 따른 약학 조성물,
- 본 발명에 따른 의료 기기.
일부 특정 양태에서, 줄기 세포를 로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물에 노출시키는 단계를 포함하는 줄기 세포의 조절 방법이 제공된다.
일부 특정 양태에서, 줄기 세포의 수/로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물의 비율은 1 내지 1000개의 줄기 세포/로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물 1 ng; 바람직하게는 5 내지 50개의 줄기 세포/로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물 1 ng이다. 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000개의 줄기 세포/로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물 1 ng, 및 이들 사이의 임의의 범위를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
일부 특정 양태에서, 대상의 상처를 치료 유효량의 간엽 줄기 세포 및 로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물에 노출시키는 단계를 포함하는 상처 치유를 촉진하는 방법이 제공된다.
일부 양태에서, 간엽 줄기 세포의 수/로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물의 비율은, 1 내지 100개의 줄기 세포/로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물 1 ng; 바람직하게는 5 내지 50개의 줄기 세포/로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물 1 ng. 일부 특정 양태에서, 상처는 당뇨병-관련 상처이다.
일부 특정 양태에서, 약제(또는 의료 기기)는 병반의 면적 및 깊이에 따라 상기 병반에 투여된다. 이의 예는 비제한적으로 하기와 같다:
- 로도코커스 루버 세포벽 골격을 포함하는 약제를 적용함; 또는
- 병반을 로도코커스 루버 세포벽 골격으로 함침된 패치(또는 필름 또는 거즈)로 덮음; 또는
- 로도코커스 루버 세포벽 골격을 포함하는 동결건조된 분말을 병반에 직접 투여함; 또는
- 로도코커스 루버 세포벽 골격을 포함하는 연고/크림을 병반에 투여함.
일부 특정 양태에서, 평균 노출 기간은 2일 내지 2개월 또는 그 이상 동안 지속된다. 구체적으로, 예를 들어, 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60일; 또는 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18주 또는 그 이상이 언급될 수 있다. 특정 양태에서, 활성 성분은 3 내지 4주 동안 대상에게 투여된다.
특정 양태에서, 활성 성분은 하기로부터 선택되는 빈도로 투여된다: 1일당 1 내지 3회, 2일당 1 내지 6회, 3일당 1 내지 9회, 1주당 1 내지 14회, 1개월당 1 내지 60회의 투여. 일부 양태에서, 활성 성분은 1일에 2회, 1일에 1회, 또는 2일에 1회 투여된다.
각각의 투여량에 있어서, 대상의 특정 병태에 따라 상이한 용량이 적용되고, 일반적으로 1 내지 1,000 μg/단위 용량/각각의 투여량; 구체적으로, 예컨대 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 μg/단위 용량/각각의 투여 및 상기 값의 임의의 2개 사이의 범위이다.
일부 특정 양태에서, 노출은 예를 들어 비제한적으로 경구, 점막, 경피(percutaneous), 경피(transdermal), 복강내, 천자, 비강 스프레이, 점안제, 좌약 및 설하 경로에 의해 달성된다.
일부 특정 양태에서, 대상은 인간 이외의 동물, 예컨대 농장 동물, 반려 동물, 사역 동물, 관상용 동물 및 생산 동물이다.
특정 양태에서, 대상은 인간이다.
일부 특정 양태에서, 대상은, 표적 질환 또는 이의 증상을 갖는 것으로 의심되거나, 이를 갖는 것으로 확인되거나, 이를 앓고 있거나, 또는 이에 민감하다.
일부 양태에서, 하기로부터 선택된 하나 또는 조합을 포함하는 세포 배양 배지가 제공된다:
- 본 발명에 따른 로도코커스 루버,
- 본 발명에 따른 단리된 로도코커스 루버 세포벽,
- 본 발명에 따른 로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물,
- 본 발명에 따른 약학 조성물.
일부 특정 양태에서, 줄기 세포, 특히 간엽 줄기 세포를 배양하기에 적합한 당업계에 널리 공지된 다른 성분을 추가로 포함하는 세포 배양 배지가 제공된다. 인간에게 적용하는 경우, 더 안전한 세포를 제공하기 위해, 배양 과정에 이종 동물 성분이 없는 것이 권장된다(예를 들어 무혈청 배양 배지의 사용).
일부 특정 양태에서, 당업자는, 필요에 따라(예를 들어, 줄기화(stemness)를 유지하거나 분화를 촉진하기 위해), 사이토카인, 예컨대 FGF, PDGF, TGF-β, HGF, EGF, CTGF, VEGF, 인슐린 및 인슐린-유사 성장 인자 중 하나 또는 조합을 세포 배양 배지에 첨가할 수 있다.
일부 특정 양태에서, FGF의 함량(최종 농도)은 바람직하게는 0.1 내지 100 ng/ml이다. FGF는 섬유아세포 성장 인자 패밀리의 성장 인자, 바람직하게는 FGF-1, FGF-2(bFGF)를 지칭한다.
일부 특정 양태에서, PDGF의 함량(최종 농도)은 바람직하게는 0.5 내지 100 ng/ml이다. PDGF는 혈소판 유래 성장 인자 패밀리의 성장 인자, 바람직하게는 PDGF-BB 또는 PDGF-AB를 지칭한다.
일부 특정 양태에서, TGF-β의 함량(최종 농도)은 바람직하게는 0.5 내지 100 ng/ml이다. TGF-β는 형질전환 성장 인자-베타 패밀리의 성장 인자, 바람직하게는 TGF-β3을 지칭한다.
일부 특정 양태에서, HGF의 함량(최종 농도)은 바람직하게는 0.1 내지 50 ng/ml이다.
일부 특정 양태에서, EGF의 함량(최종 농도)은 바람직하게는 0.5 내지 200 ng/ml이다.
일부 특정 양태에서, 하나 이상의 인지질 및/또는 하나 이상의 지방산을 추가로 포함하는 세포 배양 배지가 제공된다.
인지질은, 예를 들어 포스파티드산, 리소포스파티드산, 포스파티딜 사이클로헥산올, 포스파티딜 세린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 콜린 및 포스파티딜 글리세롤을 포함한다. 인지질의 총 함량(최종 농도)은 바람직하게는 0.1 내지 30 μg/ml이다.
지방산은, 예를 들면 리놀레산, 올레산, 리놀렌산, 아라키돈산, 테트라데칸산, 팔미톨레산, 팔미트산, 스테아르산 등을 포함한다. 지방산의 총 함량은 배지의 1/1000 내지 1/10인 것이 바람직하다.
일부 특정 양태에서, 콜레스테롤을 추가로 포함하는 세포 배양 배지가 제공된다.
일부 특정 양태에서, 아스코르브산을 추가로 포함하는 세포 배양 배지가 제공된다.
일부 특정 양태에서, 산화방지제를 추가로 포함하는 세포 배양 배지가 제공된다. 산화 방지제는 예를 들어 DL-α-토코페릴 아세테이트(비타민 E)를 포함한다.
일부 특정 양태에서, 트랜스페린을 추가로 포함하는 세포 배양 배지가 제공된다.
일부 특정 양태에서, 셀레네이트를 추가로 포함하는 세포 배양 배지가 제공된다.
일부 특정 양태에서, 세포를 유지하는데 필요한 아미노산, 뉴클레오티드 및 미량 원소를 추가로 포함하는 세포 배양 배지가 제공된다.
특정 예에서, 본 출원의 조성물은 공지된 상업적으로 입수가능한 간엽 줄기 세포 배양 배지에 첨가되고; 예를 들어, 상업적으로 이용가능한 간엽 줄기 세포 배양 배지는 MesenPRO RSTM, StemPro® MSC SFM, StemPro® MSC SFM XenoFree 및 StemPro® 인간 지방-유래 줄기 세포 배지로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 양태에 따르면,
- 간엽 줄기 세포, 및
- 로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물
을 포함하는 치료 조성물이 제공된다.
치료 조성물의 일부 양태에서, 간엽 줄기 세포의 수/로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물의 비율은 1 내지 100개의 줄기 세포/로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물 1 ng; 바람직하게는 5 내지 50개의 줄기 세포/로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물 1 ng이다.
치료 조성물의 일부 양태에서, 간엽 줄기 세포는, 골수 간엽 줄기 세포, 지방-유래 간엽 줄기 세포, 활액 간엽 줄기 세포, 탯줄 간엽 줄기 세포, 제대혈 간엽 줄기 세포, 태반 간엽 줄기 세포, 양막 간엽 줄기 세포, 간 간엽 줄기 세포, 근육 간엽 줄기 세포, 폐 간엽 줄기 세포, 췌장 간엽 줄기 세포, 치수 간엽 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 양태에 따르면, 줄기 세포를 유효량의 상기 언급된 로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물에 노출시키는 단계를 포함하는, 줄기 세포 세포사멸(apoptosis) 개선 방법이 제공된다.
일부 양태에 따르면, 줄기 세포를 유효량의 상기 언급된 로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물에 노출시키는 단계를 포함하는, 줄기 세포 생존 개선 방법이 제공된다.
본원의 문맥에서, 약제 또는 의료 기기의 유일한 치료(또는 예방) 활성 성분은, 특히 로도코커스 루버 세포벽의 성분(예컨대, 단백질, 핵산, 지질, 세포벽 및 이의 성분, 탄수화물 또는 대사산물)을 포함하는, 로도코커스 루버로부터 유래된 생성물이고; 구체적으로, 로도코커스 루버 세포벽(더욱 바람직하게는 로도코커스 루버 세포벽 골격 또는 이의 성분)을 포함하는 생성물이다.
도 1: 10 μg/ml의 본원의 조성물 1을 24시간, 48시간, 72시간 및 96시간 동안 Ad-MSC에 적용하였다. 그 후, 450 nm의 파장에서 Ad-MSC의 흡광도(OD)를 CCK-8을 사용하는 효소-결합 면역 측정기로 검출했다.
도 2: Ad-MSC를 72시간 및 96시간 동안 10 μg/ml, 50 μl의 본원의 조성물 1로 처리하였다. 그 후, EdU 키트를 이용하여 EdU 혼입 분석을 수행하였고, 각 그룹의 세포 증식율를 통계적으로 분석하고, 실험을 3회 반복하였다. 데이터는 평균 ± SD로 막대 그래프로 표시된다(*P<0.05, **P<0.01, 대 대조군).
도 3a 및 도 3b: 48시간 및 72시간에 블랭크 대조군, 고 글루코스 그룹 및 본원의 조성물로 처리된 그룹에서의 줄기 세포의 세포사멸률을 유동 세포분석(flow cytometry)에 의해 검출하였다. 실험을 3회 반복하였다. 데이터는 평균 ± SD로 막대 그래프로 표시된다(**P<0.01, 대 글루코스).
도 4a 및 도 4b: 세포사멸을 유도하기 위해 고 글루코스를 세포에 첨가했다. c-카스파제(caspase)-3 및 Bax의 단백질 발현 수준을 검출하기 위해 웨스턴 블럿팅을 수행하였다. 실험을 3회 반복하였다. 데이터는 평균 ± SD로 막대 그래프로 표시된다(*P<0.05, **P<0.01, 대 고 글루코스).
도 5a: 당뇨병 마우스의 상처에 세포를 접종했다. 그 후, 0일, 2일 및 7일에 형광 염료 CM-Dil로 표지된 세포에 따라 각 그룹의 Ad-MSC의 생존율을 관찰하였다. CM-Dil로 표지된 세포의 형광 플럭스 결과를 통계적으로 분석하였다.
도 5b: 각 그룹의 상처 치유율을 측정하고 계산했다(*P<0.05, **<0.01, 대 블랭크).
"단리/단리된"은 원래 성장 환경으로부터의 본 발명의 로도코커스 루버의 분리를 지칭한다.
당업자는 그램-양성 박테리아와 그램-음성 박테리아의 세포벽 구조가 상이함을 알고 있다. 구체적으로, 그램-양성 박테리아의 세포벽은 약 90% 펩티도글리칸과 약 10% 테이코산(통상적으로 당 에스터 또는 아미노산 에스터의 형태로 존재하는 알코올과 인산 분자에 의해 형성되는 중합체)을 포함하여 더 두껍다(통상적으로 20 내지 80 nm). 펩티도글리칸 층은 심지어 20개 층으로서 밀집되어 있다. 그러나, 그램-음성 박테리아의 세포벽은 그램-양성 박테리아보다 훨씬 얇고, 구조가 더 복잡하여 외막과 펩티도글리칸 층(통상적으로 2 내지 3 nm)으로 구분된다.
펩티도글리칸 층은 박테리아 세포벽의 독특한 성분이고, 헤테로폴리사카라이드의 유도체이다. 각각의 펩티도글리칸 단량체는 하기 3개의 부분을 포함한다: 당 단위(예를 들어, 2개 이상의 당 분자가 글리코사이드 결합에 의해 연결되어 펩티도글리칸의 프레임워크를 형성함), 펩티드 꼬리(N-아세틸무람산 분자에 연결된, 여러 아미노산을 연결함으로써 형성된 짧은 펩티드 쇄) 및 펩티드 가교(인접한 "펩티드 꼬리"를 가교결합하여 고강도 네트워크 구조를 형성함). 상이한 박테리아는 상이한 펩티드 가교, 펩티드 꼬리 및 가교결합 방식을 갖는다.
단리된 로도코커스 루버 세포벽 골격
본 발명에서, "단리된 로도코커스 루버 세포벽"은 완전한 세포벽 또는 불완전한 세포벽(예를 들어, 파쇄되거나 부분적으로 분해됨)으로 해석될 수 있다. 본 발명의 교시 하에, 당업자는 목적 활성을 나타내는 성분이 로도코커스 루버 세포벽(예를 들어, 세포벽 자체 또는 이의 성분)으로부터 유래함을 이해할 것이다. 따라서, 완전한 세포벽, 파쇄된 세포벽, 세포벽의 불완전 분해 생성물, 세포벽 성분, 세포벽 추출물 및 기타 다양한 형태가 임상 적용에 사용될 수 있고, 이들은 모두 본 발명의 범주에 포함된다.
세포벽 골격
세포벽의 주요 구조를 구성하는 성분이지만; 단순히 세포벽에서 가교결합된 네트워크형 실체를 나타내는 것으로 해석될 수 없고, 당업자는 가교결합된 네트워크형 실체 상으로 흡착되고, 이에 결합되고, 이에 의해 운반되는 다른 세포벽 성분이 제외되지 않음을 이해한다.
로도코커스 루버
본 발명의 양태에 사용된 로도코커스 루버는 로도코커스 속의 로도코커스 루버 종을 지칭하고, 특정 세포 균주로 제한되지 않는다.
비제한적인 예는 TOY7 균주(농업 환경 미생물 배양 컬렉션, 난징 농업 대학), CGMCC 4795, DSM 43338, CCTCC 2012035, CGMCC 16640 및 CGMCC 17431을 포함한다.
로도코커스 루버의 동정
공지된 또는 미래의 미생물 동정 기술에 따라, 당업자는 박테리아의 균주에 대한 분류학적 동정을 수행할 수 있다. 예를 들어, 이용가능한 동정 기술은 형태학, 생리학 및 생화학적 특징, 16S rRNA 등을 포함한다. 당업자는 과학 및 기술의 발전에 따라 동정 기술이 상이한 방법을 포함함을 이해한다. 초기에는, 형태학적 및 생화학적 동정 방법이 주로 사용되었으나, 이러한 방법의 신뢰도는 높지 않다. 서열분석 기술의 도래 후, 당업자는 보다 신뢰할 수 있는 방식으로 박테리아 균주를 동정할 수 있다. 예를 들어, 16S rRNA의 DNA 서열이 97% 초과(포함)의 동일성을 갖는 것으로 동정될 때, 2개 박테리아는 동일한 종에 속하는 것으로 결정된다(문헌[Hua Gougen et al., The taxonomy and application of Rhodococcus, Microbiology China, 2003: 30 (4)]). 로도코커스 루버에 관하여, 균주의 국제(또는 국가) 수집 당국에 기탁된 공지된 균주가 모델 균주로서 사용되고, 동정될 균주는 모델 균주와 비교된다.
투여 형태
본 발명의 약제 또는 약학 조성물 또는 활성 성분 또는 생성물은 비제한적으로 하기 형태로 제형화될 수 있다: 연고, 크림, 고약, 젤, 로션, 팅크제, 도찰제, 연고, 페이스트, 동결건조 분말, 에어로졸, 좌제, 패치, 현탁액, 경구 용액, 협측 정제 및 피부 케어 제품(클렌저, 토닝 로션, 세럼, 로션, 크림 및 마스크).
제형 단위
본 발명의 약제 또는 약학 조성물 또는 활성 성분 또는 생성물은 제형 단위(또는 단위 용량)의 형태로 제형화될 수 있다.
일부 양태에서, 약제(또는 제형, 치료제 또는 의료 기기)의 단위 용량은 다음을 포함한다:
- 1 내지 1,000 μg의 로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물; 또는
- 1 내지 1,000 μg의 로도코커스 루버 세포벽; 또는
- 1 내지 1,000 μg의 로도코커스 루버 세포벽 골격.
단위 용량의 특정 예는 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 mg ± 10% 및 상기 값 중 임의의 2개 사이의 범위이다.
동물, 인간, 세포, 조직, 기관 또는 생물학적 샘플에 적용될 때 "투여하는", "제공하는", "~와 제공되는" 및 "치료하는"은 동물, 인간, 세포, 조직, 기관 또는 생물학적 샘플과의 약제 또는 의료 기기의 접촉을 지칭한다.
"치료"는 치료될 대상(또는 이의 집단)에서 임상적으로 측정가능한 정도까지 하나 이상의 질병 증상을 완화(경감, 지연, 개선, 치유)하기 위하여 내용 또는 외용 약제(치료제, 활성 성분 또는 조성물)(예컨대, 본 발명에 따른 로도코커스 루버 세포벽 또는 약학 조성물) 또는 의료 기기를 대상에게 투여하는 것을 의미하고, 이때 대상은 하나 이상의 질병 또는 이의 증상을 갖거나, 갖는 것으로 의심되거나, 이에 걸리기 쉽다.
임의의 질병 증상을 효과적으로 완화시킬 수 있는 약제(치료제, 활성 성분 또는 조성물)의 양은 치료 유효량으로 지칭된다. 이는 대상의 질병 상태, 연령 및 체중과 같은 다양한 인자에 따라 달라질 수 있다. 약제(치료제, 활성 성분 또는 조성물)가 단일 대상의 표적 질병 또는 이의 증상을 완화시키는 데 효과가 없을 수 있지만, 당업계에 공지된 임의의 통계적 시험 방법[예컨대, 만(Mann)과 휘트니(Whitney)에 따른 스튜던츠 검정(Student's t test), 카이-제곱 검정(chi-square test) 및 U 검정]에 따라 표적 질병 또는 이의 증상에 대해 통계적으로 유효함이 이해되어야 한다.
용어 "임의적으로"는 상기 용어 뒤의 사건이 발생할 수 있지만, 필수적으로 발생하는 것은 아니고; 이는 상황에 따라 다름을 의미한다. 예를 들어, "임의적으로, 분취하는"은 생성물이 분취될 수 있지만, 필수적으로 분취되지는 않고; 생성물이 분취되는지 여부는 기술 효과의 구현에 영향을 주지 않음을 의미한다.
단수 형태는, 명백히 언급되지 않는 한, 또한 복수 형태를 포함한다.
본 발명은 실시예, 제조예 및 시험예를 참조하여 하기에 추가로 설명된다. 그러나, 이러한 실시예, 제조예 및 시험예는 본 발명의 범주를 제한하지 않는다. 특정 조건이 특정되지 않는 경우, 작동은 통상적인 조건 및 원재료 공급자에 의해 추천된 조건에 따라 수행되어야 한다. 특정 공급원을 제공하지 않는 시약은 시장에서 구입한 통상적인 시약이다.
실시예
실시예 1. 균주의 공급원
하기 실시예에서 사용되는 로도코커스 루버는 CGMCC 번호 17431 균주이고, 이는 2019년 3월 22일자로 중국 일반 미생물 균주 수집 센터(CGMCC, 중국 베이징 차오양 디스트릭트 웨스트 베이첸 로드 야드 번호 1(3) 중국 과학 아카데미 미생물학 연구소)에 기탁되었다.
당업자는 특히, 하기 특정 실시예에서 특정 세포 균주를 사용하지만, 기술적 효과의 실현이 특정 세포주에 의존하지 않으며, 로도코커스 속, 로도코커스 루버 종에 속하는 임의의 종을 적용할 수 있음을 이해한다.
실시예 2. 균주의 동정
1. 콜로니의 형태학적 특징의 시각적 관찰
균주를 글리세롤 한천 배지에서 30 내지 37℃(구체적으로, 32 내지 35℃)에서 12 내지 72시간(구체적으로, 36 내지 60시간, 예컨대 40 내지 50시간) 동안 배양하고, 다음을 관찰하였다:
- 콜로니가 뭉쳤고;
- 주황색-적색였고(빛의 영향, 배양 배지의 색상 등에 따라 약간 다름);
- 표면이 건조하고 주름지고 약간 광택이 있었고(배양 조건의 차이에 따라 약간 다름);
- 만지면 부서지기 쉬웠고;
- 콜로니 크기는 약 1 내지 2 mm였다(배양 조건의 차이에 따라 약간 다름).
2. 현미경 관찰
- 균사는 격벽을 갖는 분지 구조로 성장하고, 균사체를 형성하였고(배양 조건의 차이에 따라 약간 다름);
- 균사의 분열은 규칙적인 짧고 두꺼운 세포를 형성하였고(배양 조건의 차이에 따라 약간 다름);
- 4 내지 5일 배양 후, 박테리아는 짧은 막대 모양 또는 구형이 되었다(배양 조건의 차이에 따라 약간 다름).
3. 착색성
균주는 그램 염색 양성이었다.
4. 생화학적 반응
균주를 글리세롤 한천 경사 배지 상에서 30 내지 37℃(구체적으로, 32 내지 35℃)에서 12 내지 72시간(구체적으로, 36 내지 60시간, 예컨대 40 내지 50시간) 동안 배양하였다. 이어서, 배양물에 대해 하기 시험을 수행하였다.
4.1. 탄수화물로부터의 산 생산
산 생산 시험
양성 글리세린, 만니톨, 소르비톨, D-아라비톨, D-프룩토스 및 D-글루코스
음성 이노시톨, 이눌린, 락토스, 수크로스, 전분, 말토스, 글리코겐, 자일리톨, 글루코네이트, 트레할로스, 에리트리톨, 멜레지토스, 멜리비오스, 라피노세, 셀로비오스, 아미그달린, 젠티오비오스, 아도놀, 알부틴, D-아라비노스, L-아라비노스, α-메틸-D-글루코사이드, α-메틸-D-만노사이드, D-리보스, D-자일로스, L-자일로스, N-아세틸-글루코사민, D-터비오스, D-릭소스, β-메틸-D-자일로사이드, D-갈락토스, D-타가토스, D-푸코스, L-푸코스, D-만노스, L-소르보스, L-아라비니톨, L-람노스 및 2-케토-글루코네이트.
4.2. 효소 활성 측정(API ZYM)
효소 활성 측정
양성 알칼리성 포스파타제, 지질 에스터라제(C8), 리파제(C14), 류신 아라미나제, 발린 아라미나제, 시스틴 아라미나제, 트립신, 키모트립신, 산 포스파타제, 나프톨-AS-B1-포스포하이드롤라제 및 α-글루코시다제
음성 N-아세틸-글루코사미니다제, 에스터라제(C4), β-갈락토시다제, β-글루쿠로니다제, β-글루코시다제, α-갈락토시다제, α-만노시다제 및 β-푸코시다제.
4.3. 니트레이트 환원 반응: 양성, 카탈라제: 양성, 티로시나제: 양성, 아밀라제: 음성, 옥시다제: 음성, 젤라틴 액화: 음성.
4.4. 유일한 탄소원
탄소원
바이올로그 젠(Biolog Gen) II 성장 실험 글루쿠론아미드, β-하이드록시-DL 부티르산, D-프룩토스-6-포스페이트, α-D-글루코스, D-프룩토스, D-만니톨, D-아라비톨, D-소르비톨, 퀸산, γ-아미노부티르산, 시트르산, L-말산, 브로모석신산, 트윈 40, 프로피온산 및 아세트산에 대해 양성
바이올로그 젠 III 화학적 민감도 실험 다이메틸아민 테트라사이클린, 나트륨 테트라데실 설페이트, 리파마이신 SV, pH 5.0, 8% 나트륨 클로라이드, 린코마이신, 푸시드산, D-세린, 반코마이신, 테트라졸륨 바이올렛 및 테트라졸륨 블루에 대한 민감성; 나트륨 브로메이트, 1% 나트륨 락테이트, pH 6.0, 1 내지 4% 나트륨 클로라이드, 날리딕산, 리튬 클로라이드, 칼륨 텔루라이트, 아즈트레오남 및 나트륨 부티레이트에 대한 내성.
4.5. 16S rRNA 동정
작업 시드 튜브로부터 단리된 15개의 균주 및 원래의 시드 튜브로부터 단리한 10개의 상이한 균주에 대해 게놈 추출, 16S rRNA 증폭 및 서열분석을 수행하였다. 총 25개 균주 중, 16S rRNA 유전자 동일성은 100%였다.
또한, 기무라(Kimura)2-파라미터 알고리즘을 기반으로 구축된 이웃-접합 균주 계통수는 균주가 로도코커스 루버로서 분류됨을 나타냈다.
제조예
제조예 1. 배양 방법
1. 로도코커스 루버를 통상적인 미생물 생산 방법으로 배양할 수 있다.
2. 배양 방법은 고체 배양 또는 액체 배양일 수 있다.
3. 배양 배지의 영양 공급원에 대한 특별한 요건은 없다. 배양 배지는 미생물 배양에 통상적으로 사용되는 탄소원, 질소원 및 기타 영양원을 함유할 수 있다.
- 탄소원은 로도코커스 루버에 의해 소비될 수 있는 임의의 탄소원, 예를 들어 프룩토스, 글루코스 등일 수 있다.
- 질소 공급원은 브로스, 펩톤, 암모늄 염, 니트레이트 및 기타 유기 또는 무기 질소-함유 화합물일 수 있다.
- 기타 영양원의 경우, NaCl 및 포스페이트와 같은 일부 무기 염을 적절하게 첨가할 수 있다.
4. 배양 조건(온도, 시간 등)에 대한 엄격한 제한은 없다. 당업자는 예비 소규모 파일럿 시험 데이터를 기반으로 수율을 최대화하는 조건을 선택할 수 있다.
5. 일례로서, 하기 배양 조건을 사용하여 로도코커스 루버를 발효시켰다:
(1) 다음을 포함하는 배양 배지 조성물:
펩톤, 브로스, 나트륨 클로라이드, 포스페이트, 글리세린(및 임의적으로 고체 배양될 때 한천).
(2) 배양 방법의 파라미터:
작업 균주를 회수한 후, 고체 배양 배지에 3 내지 5일 동안 옮기고, 이어서 액체 배양(30 내지 37℃, 3 내지 5일 동안 유지)으로 옮겼다. 유가식 반연속 모드 또는 회분 모드를 사용할 수 있다. pH, 박테리아 밀도, 용존 산소 및 탄소원 소비를 배양하는 동안 모니터링하였다.
제조예 2. 박테리아 파쇄
제조예 1에서 수득한 박테리아를 수집하여 세포를 파쇄하였다(예를 들어, 비제한적으로 초음파처리에 의함). CN 101250490 A 또는 CN 101323865 A와 같은 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법을 사용하여 박테리아를 파쇄할 수도 있다.
파쇄 상태는 현미경으로 검사하였다. 각각의 시야에 5개 초과의 온전한 박테리아가 존재하지 않아야 한다. 검사된 여러(10 내지 30개) 시야가 이러한 표준을 충족할 때 파쇄가 적격한 것으로 간주되었다.
제조예 3. 핵산, 지질, 단백질 및 세포막의 제거
1. 핵산의 제거:
파쇄 후 수득된 상청액을 원심분리하였다. 수득한 침전물에 DNase와 RNase를 첨가하고, 효소 공급자가 권장하는 작업에 따라 핵산을 제거하였다.
2. 단백질 제거:
통상적으로 사용되는 프로테아제(예컨대, 트립신)를 침전물에 첨가하고, 효소 공급자가 권장하는 작업에 따라 단백질을 제거하였다.
3. 지질의 제거:
유기 시약(예를 들어, 비제한적으로 아세톤, 에터 및 에탄올 중 어느 하나 또는 이들의 조합)을 침전물에 첨가하고, 지질을 당업계의 통상적인 작업에 따라 제거하였다.
4. 세포막의 제거:
트리톤 X-100을 침전물에 첨가하고, 침전물을 당업계의 통상적인 작업에 따라 원심분리하여 수집하고, PBS로 세정하였다.
불순물을 제거하기 위한 상기 단계 중에서, 당업자가 단계의 순서를 조정하여 서로 호환되도록 할 수 있음이 이해되어야 한다.
비-세포벽 성분을 제거한 후, 침전물을 주사용수에서 재구성하고, 이어서 사용할 때까지 따로 두었다. 임의적으로, 세포벽 골격(주로 세포벽 골격 및 이의 성분을 포함함)의 저장 용액으로서 115℃에서 20 내지 30분 동안 멸균할 수 있다.
제조예 4. 약학 조성물의 제조 방법
1. 액체 조성물
부형제(예컨대, 덱스트란 40, 만니톨 또는 트레할로스)를 제조예 3에서 수득된 생성물에 첨가하였다. 분취물로 충전 후 생성된 생성물을 약학 조성물로 지칭하였다.
약학 조성물은 다양한 형태로 제형화될 수 있다
조성물 각각의 바이알의 용량 성분 및 양
조성물 1 2 mL 활성 성분 60 μg
덱스트란 40 15 mg
조성물 2 2 mL 활성 성분 60 μg
덱스트란 40 12 mg
조성물 3 2 mL 활성 성분 120 μg
덱스트란 40 36 mg
조성물 4 2 mL 활성 성분 60 μg
트레할로스 12 mg
조성물 5 2 mL 활성 성분 120 μg
트레할로스 36 mg
조성물 6 2 mL 활성 성분 120 μg
만니톨 36 mg
조성물 7 2 mL 활성 성분 60 μg
만니톨 12 mg
2. 분말 조성물
상기 1의 약학 조성물을 동결건조하여 동결건조 분말(각각 동결건조 분말 조성물 1 내지 동결건조 분말 조성물 7로 넘버링됨)을 제조하였다.
3. 품질 검사(동결건조 분말 조성물 1을 일례로서 취함).
품질 검사 항목
외관 백색의 비통합된 고체 또는 분말
수분 함량 ≤6%
용해도 2.0ml의 NaCl 주사를 첨가할 때 1분 이내에 용해되면 제품이 적격인 것으로 간주되었다.
단백질의 잔류량 0.4 μg/바이알(기준: ≤ 9.0 μg/바이알)
RNA의 잔류량 0.8%(기준: 5% 이하)
DNA의 잔류량 0.9%(기준: 5% 이하)
Triton X-100 잔류량 감지 불가(기준: 5% 이하)
지질의 잔류량 3.8%(기준: 5% 이하)
식세포율 75%(기준: ≥ 40%)
식세포 지수 1.05(기준: ≥ 0.50)
마우스에서의 비정상적 독성 모든 마우스는 관찰 기간 동안 생존하고 비정상적 반응이 없어야 한다. 각 마우스의 체중이 기한 시점에 증가하면 조성물이 적격으로 간주되었다.
기니피그에서의 비정상적 독성 모든 기니피그는 관찰 기간 동안 생존하고 비정상적 반응이 없어야 한다. 각 기니피그의 체중이 기한 시점에 증가하면 조성물이 적격으로 간주되었다.
시험예
재료 및 방법
1. 인간 Ad-MSC의 단리, 배양 및 계대(passage)
지방 조직 샘플은 대상(연령 범위 25-35세)의 지방 흡입 흡인물(liposuction aspirate)에서 수득하였고, Ad-MSC를 단리하고, 배양했다. 대상은 쉬저우(Xuzhou) 의과 대학 부속 병원의 성형 외과 환자 중에서 선택되었다. 실험은 윤리 위원회의 승인을 받았고 환자의 동의를 받았다.
수득된 신선한 지방 조직 추출물을 0.25% 트립신-EDTA로 분해하고, 여과하고, 원심분리하여 세포 펠렛을 유지하였다. 10% 소 태아 혈청(FBS, Gibco) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 DMEM(Invitrogen) 배양 배지를 첨가하였다. 세포 배양 디쉬를 37℃, 5% CO2 인큐베이터에 넣어 세포를 배양하였다. 그 후, PBS로 세포를 세척한 후 2-3일마다 배양 배지를 교체하였다. 세포는 80%까지 성장할 때 계대되었다.
2. 세포 생존성의 결정
대수 성장기(logarithmic growth phase)의 Ad-MSC를 96-웰 플레이트에 4 x 103 세포/웰로 시딩(seeding)하고; DMEM + 10% 소 태아 혈청 + 1% 페니실린/스트렙토마이신을 공동 배양에 사용했다. 본원의 조성물(조성물 1)을 용해시키고, PBS 완충액으로 10 μg/ml로 희석하였다. Ad-MSC가 웰에 부착된 후, 시험될 각각의 샘플에 대해 실험을 대조군, 25 μl, 50 μl 및 75 μl의 4개 그룹으로 나누었다. 24시간, 48시간, 72시간 또는 96시간 후에 10 μL의 CCK-8 시약을 각 웰에 첨가하고, 2시간 동안 인큐베이션했다. 그 후, 450 nm의 파장에서 각 웰의 흡광도를 효소-결합 면역 측정기로 검출했다. 세포 성장 곡선은 가로축으로 배양 시간을, 세로축으로 세포 수(흡광도)로써 플롯팅했다.
3. EdU 혼입 실험
EdU 혼입 분석은 Cell-Light EdU 567 시험관내 이미징 키트(RiboBio)를 사용하여 수행되었다. 대수 성장기의 Ad-MSC를 4×103 세포/웰로 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 10 μg/ml, 50 μl의 본원의 조성물을 Ad-MSC에 적용하였다. 72시간 또는 96시간 후 각 웰에 100 μl의 EdU 배지를 첨가하고, 2 시간 동안 배양한 후 PBS로 1-2회 세척하였다. 4% 파라포름알데히드 고정액을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 2 mg/ml 글리신 용액을 첨가하고, 플레이트를 진탕기에서 5분 동안 진탕하였다. PBS로 세척한 후, 삼투압제를 첨가하고, 플레이트를 진탕기에서 10분간 진탕시킨 후 PBS로 세척하였다. 아폴로 염색 반응 용액을 첨가하고, 플레이트를 암실에서 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 염색 반응 용액을 버렸다. 침투제(PBS 중 0.5% TritonX-100)를 첨가하고, 플레이트를 진탕기에서 매회 10분씩 2-3회 진탕하고, 침투제를 버렸다. 플레이트를 다시 PBS로 세척하고, Hoechest 33342 반응 용액을 첨가하였다. 플레이트를 암실에서 30분 동안 실온에서 인큐베이션하고, 반응 용액을 버렸다. PBS로 1-3회 세척한 후, 형광 현미경으로 양성 세포를 관찰하였다.
4. 세포사멸의 검출
4.1 유동 세포 분석 :
Ad-MSC가 80% 합류(confluence)에 도달했을 때, 6-웰 플레이트에 1×104 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 실험은 4개의 그룹으로 나누었다. 세포가 벽에 부착된 후, 각 실험 그룹에 100 μl의 50% 수크로스를 첨가하여 Ad-MSC의 세포사멸을 유도하고, 10 μg/ml의 본원의 조성물 100 μl 또는 250 μl를 이들 그룹 중 2개의 실험 그룹에 각각 첨가하였다. 48시간 및 72시간 후, 각 세포 그룹의 상청액을 유동 튜브에 수집하였다. 부착된 세포를 무-EDTA 트립신으로 분해시키고, 동일한 그룹의 유동 튜브에 수집했다. 튜브를 2000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, PBS 완충액으로 2회 세척하고, 진탕하고, 잘 혼합했다. 500 μl의 결합 완충액(Annexin V-FITC 세포사멸 검출 키트, Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd.), 5 μl의 FITC 및 5 μl의 PI를 각 튜브에 연속적으로 첨가하였다. 튜브를 진탕시키고, 잘 혼합하고, 암실에서 4℃에서 5-15분 동안 인큐베이션했다. 결과는 유동 세포 분석기(BD Biosciences)로 검출 및 분석되었다.
4.2 TUNEL 방법:
여러 18mm × 18mm 커버슬립을 75% 에탄올에 침지시켜 살균했다. 사용할 때, 커버슬립을 6웰 플레이트에 놓고, 에탄올 잔류물이 완전히 제거될 때까지 PBS 완충액으로 여러 번 헹구었다. Ad-MSC를 6웰 플레이트에서 웰당 1 x 104 세포의 세포 밀도로 배양하였다. 실험 그룹핑은 유동 세포 분석의 그룹핑과 동일했다. 세포를 PBS 완충액으로 3회 세척하고, 30분 동안 실온에서 4% 파라포름알데히드에서 고정시키고, PBS 완충액으로 3회 세척하고, 0.1% TritionX-100과 함께 2℃-8℃에서 10분 동안 인큐베이션하고; PBS 완충액으로 3회 세척하였다. TUNEL 반응 용액(TUNEL 세포사멸 키트, Roche) 500 μl를 준비하였다. 효소 용액 50 μl와 표지 용액 450 μl를 혼합하여 시약 A를 제조하였다. 음성 대조군에 시약 A 50 μl를 첨가 하고, 암실에서 37℃ 인큐베이터에 60분간 두었다. DNase I을 양성 대조군에 첨가하고, 실온에서 10분 동안 배양하였다. 세포를 PBS 완충액으로 3회 세척하고, 50 μl/웰의 TUNEL 반응 혼합물을 첨가하였다. 세포를 암실에서 37℃ 인큐베이터에서 60분 동안 인큐베이션하고, PBS 완충제로 3회 세척하였다. 50 μl/웰의 DAPI 염색 용액을 첨가하고, 세포를 실온에서 3분 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 분석을 위해 형광 현미경 하에 촬영하였으며, 검출광의 파장 범위는 570-620 nm(최대 파장 580 nm)였다.
5. 웨스턴 블롯 분석
처리된 세포를 수집하였다. 300 μl의 세포 용해 혼합물(얼음 상에서 PIPA 세포 용해 용액을 용해시키고, 100:1의 비율로 PMSF를 첨가함)을 각 디쉬에 첨가한 다음 얼음 위에 놓았다. 세포를 완전히 용해시키고, 부착 세포를 긁어냈다. 혼합물을 Centrifuge-5810R 냉장 고속 원심분리기에서 4℃, 12,000 rpm에서 20분 동안 원심분리하고, 상청액을 수집하였다.
세포 추출물을 SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 분리하였다. 그 후, 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 옮기고, 하기 항체와 함께 인큐베이션하였다: 토끼-항-인간 카스파제-3 단일클론 항체(1:400; CST, USA), 래빗-항-인간 Bax 단일클론 항체(1:400; CST, USA). 1차 항체로 인큐베이션한 후, 막을 5분 x 3회 세척하고, 희석된 2차 항체(1:10000)와 함께 실온에서 암실에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 2차 항체는 버리고, 막을 5분 x 3회 세척하였다. 동일한 양의 ECL 발광 용액 A와 B를 각각 피펫팅하고, 잘 혼합하여 ECL 작업 용액을 준비했다. ECL 작업 용액을 막 상에 균일하게 적하하였다. 막을, 노출 및 현상을 위해 TANON 겔 이미저에 넣고, 촬영하고, ImageJ 소프트웨어로 분석했다.
6. 당뇨병 상처 동물 모델의 확립
실험 동물은 4주령 BALB/c 흉선 누드 마우스, SPF 등급이었다. 모든 동물 연구는 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았다. 실험용 쥐는 SPF 등급 동물 방에 보관되었다. 마우스를, 모델 확립 전에 12시간 동안 금식시키고, 체중을 측정하고, 기록하였다. 당뇨병 마우스를 150 mg/kg의 용량으로 2% STZ(Sigma)의 복강내 주사로 유도하였다.
혈당은 주사 후 7일째에 측정하였다. 꼬리 정맥을 통해 혈액을 수집하고, 혈당 측정기로 마우스의 혈당 농도를 측정하여 기록하였다. 7일째부터 마우스의 혈당 농도는 16.7 mmol/L 초과였고, 당뇨병의 대표적인 증상인 "다갈증, 다식증, 다뇨증 및 체중 감소"가 발생하여 성공적인 모델 확립으로 간주되었다.
실험 동물을 3개의 그룹으로 나누었다(각 그룹에 5마리의 동물):
- 블랭크 대조군,
- Ad-MSC 그룹,
- 본원의 조성물 + Ad-MSC 그룹.
당뇨병 마우스 모델이 성공적으로 확립되면, 마우스를 마취시키고, 직경 1.5 cm의 상처를 냈다. 전처리된 Ad-MSC는, 각 상처에 6개 지점과 각 지점에 0.1 ml의 세포가 주사된 다지점 피내 주사에 의해 각 그룹의 마우스의 피부에 주입되었다. 상처 표면을 멸균 거즈로 덮고, 급식과 관찰을 계속하였다. LB983 생체내 이미징 시스템을 이용하여 상처 내 세포의 생존과 마우스의 피부 치유를 관찰하였다.
7. CM-Dil 생 세포 염색약으로 염색
Ad-MSC는 주사 전에 CM-Dil로 표지되었다. 공급업체에서 권장하는 방법에 따라 CM-Dil 생 세포 염색약을 세포에 첨가하고, 30분 동안 인큐베이션하였다. 원심분리 후 상청액을 버리고, 세포를 PBS 완충액으로 3회 세척하였다. 마지막으로 적당량의 PBS를 첨가하고, 잘 혼합한 후, 표지된 Ad-MSC를 나중에 사용하기 위해 아이스박스에 넣었다.
8. 조직 면역형광 염색
조직 파라핀 섹션을 탈랍하고, 실온에서 5-10분 동안 3% H2O2와 인큐베이션하여 내인성 과산화효소 활성을 제거했다. 섹션을 증류수로 헹구고, 매회 5분 동안 PBS에 2회 침지시키고, 실온에서 10분 동안 10% 정상 염소 혈청(PBS에 희석)으로 차단하였다. 차단 용액은 섹션을 세척하지 않고 폐기되었다. CD31 1차 항체(희석비 1:300) 작업 용액을 적가하고, 밤새 인큐베이션했다. 섹션을 매회 5분 동안 PBS로 3회 헹구었다. 적당량의 비오틴-표지된 형광 2차 항체 작업 용액(희석비 1:400)을 암실에서 적가하였다. 섹션을 암실에서 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하고, 매회 5분 동안 PBS로 3회 헹구었다. 적당량의 DAPI 염색 용액을 적가하였다. 섹션을 암실에서 3분 동안 실온에서 인큐베이션하고, 매회 5분 동안 PBS로 3회 헹구었다. 마지막으로, 항형광 소광 밀봉 용액을 각 섹션에 적가하였다. 섹션을 커버 슬립으로 덮고, 고정하고, 암실에서 보관했다.
9. 통계 분석
통계 분석은 SPSS 소프트웨어(SPSS 16.0)를 이용하여 수행하였다. 실험 결과는 평균 ± SD로 표시되었다. 두 그룹 간의 비교는 독립 샘플 t-검정으로, 여러 그룹 간의 평균 비교는 일원 분산분석(one-way ANOVA)으로 수행했다. α=0.05가 유의 수준이었고, P <0.05의 차이는 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
시험예 1. 인간 Ad-MSC의 형태, 표면 마커 및 유도 분화능의 확인
콜라게나아제 분해법을 사용하였다. 지방 조직 추출물에서 추출한 1차 Ad-MSC를 세포 배양 디쉬에 시딩하고, 80% 합류에 도달했을 때 계대했다. 세포의 증식 속도는 계대 후 크게 증가했다. 세포는 형태 및 스핀들-형상의 관점에서 균일하였다. P3 세대의 잘 성장된 Ad-MSC는 각각 지방 분화 및 골 형성 분화에 사용되었다. 현미경으로 2주 후 오일 레드로 염색된 세포를 관찰한 결과 세포에 다양한 크기의 적색 지질 소적이 분명히 존재함을 보여주었고, 알리자린(alizarin) S 염색으로 염색된 세포를 관찰한 결과 적색 칼슘 결절의 명확한 침착이 나타났다. 이는, 단리 및 추출된 세포가 줄기 세포 분화 잠재성의 특성을 가지고 있음을 나타내었다.
6개의 다른 세포 표면 마커가 유동 세포 분석에 의해 검출되었다. 결과는, 세포가 CD105, CD90 및 CD44에 대해 양성이고; CD31, CD34 및 CD106에 대해 음성인 것으로 나타났다. 이러한 결과는 Ad-MSC 면역표현형의 특징과 일치하였다.
시험예 2. Ad-MSC의 활성 및 증식에 대한 본원의 조성물의 효과
Ad-MSC의 활성에 대한 본원의 조성물의 효과를 검출하기 위해, 본원의 조성물 1을 24시간, 48시간, 72시간 및 96시간 동안 Ad-MSC에 적용하였다. 그 후, CCK-8 시약을 사용하여 효소-결합 면역 측정기로 450 nm 파장에서 줄기 세포의 흡광도를 측정했다. 그 결과는, 본원의 조성물을 10 μg/ml의 농도 및 50 μl의 부피로 줄기 세포에 도입한 후 Ad-MSC의 생존성이 72시간 및 96시간에 유의하게 향상되었음을 보여주었다(도 1).
본원의 조성물이 Ad-MSC의 증식에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 본원의 조성물 10 μg/ml, 50 μl를 줄기 세포에 적용하였다. EdU의 혼입은 각각 72시간 및 96시간 후 EdU 키트를 사용하여 분석되었다. 형광 현미경으로 양성 세포를 관찰하였다. 결과는, 본원의 조성물이 Ad-MSC의 증식 속도를 증가시킬 수 있음을 보여주었다(도 2).
시험예 3. 본원의 조성물은 Ad-MSC의 고 글루코스-유도 세포사멸을 억제함
Ad-MSC에 고 글루코스를 첨가하여 세포사멸을 유도했다. 세포를 각각 48시간 및 72시간 동안 상이한 농도의 본원의 조성물 1로 처리한 후, FITC-PI 유동 세포 분석 세포사멸 검출 키트를 사용하여 세포사멸을 검출하였다.
결과는, 본원의 조성물이 고 글루코스-유도 줄기 세포의 세포사멸을 억제할 수 있음을 보여주었다(도 3a, 도 3b).
시험예 4. 세포사멸 마커 단백질의 발현 수준의 검출
세포사멸을 유도하기 위해 고 글루코스를 세포에 첨가했다. 세포를 48시간 및 72시간 동안 상이한 농도의 본원의 조성물로 처리하고, 세포 단백질을 추출하였다. c-카스파제-3 및 Bax(두 가지 주요 세포사멸 마커)의 단백질 발현 수준은 웨스턴 블럿팅 실험에 의해 검출되었으며 β-액틴은 내부 레퍼런스로 사용되었다. 결과는, 본원의 조성물로 처리한 후 c-카스파제-3 및 Bax 단백질의 발현 수준이 감소되었음을 보여주었다(도 4a, 도 4b).
시험예 5. 본원의 조성물은 Ad-MSC의 생존율을 향상시키고, 누드 마우스에서 상처 치유를 촉진함
당뇨병 상처 치유에서의 Ad-MSC에 대한 본원의 조성물의 효과를 추가로 조사하기 위해, 당뇨병 누드 마우스에서 인간 피부의 상처 회복 메커니즘을 시뮬레이션하는 상처 모델을 확립하였다.
당뇨병 마우스 모델의 성공적인 확립 후, 마우스를 마취시키고, 직경 1.5 cm의 상처를 냈다. 형광 염료 CM-Dil로 표지된 전처리된 세포를 처리 그룹의 마우스의 상처 피부에 피내 주사에 의해 주입하였다. 세포의 생존은 LB983 생체내 이미징 시스템을 사용하여 관찰되었다.
그 결과는, 본원의 조성물로 처리된 그룹의 Ad-MSC가, 단독 Ad-MSC를 사용한 그룹보다 더 높은 생존율을 가짐을 보여주었다(도 5a). Ad-MSC로 처리된 당뇨병 마우스의 상처 치유 과정도 14일 동안 평가되었다. 블랭크 그룹과 비교하여, Ad-MSC로 처리된 마우스의 상처는 잘 치유된 반면, 본원의 조성물로 처리한 그룹은, 상처 치유가 가속화되고(도 5b) 상처 치유율이 증가하여(표 6) 더 잘 치유되었다.
작업 후 14일째의 상처 치유(평균 ± SD, n=3)
그룹 상처 치유율(%)
블랭크
Ad-MSC
Ad-MSC + 본원의 조성물		 58.5±1.8
78.0±1.5**
90.5±0.8**
**P<0.01, 대 블랭크.
당뇨병성 난치성 상처의 형성에는 많은 이유가 있고, 예를 들어 정상적 상처 치유 과정에 필요한 세포 및 분자 신호의 부재가 있다. 또한, 말초 신경병증, 말초 순환 손상 및 프로테아제 균형 장애는 모두 당뇨병 상처의 난치성 치유에 중요한 인자이다(문헌[Rathur HM et al., The diabetic foot. Clin Dermatol. 2007; 25(1): 109-120]). 한편, 고 글루코스 조건에서의 비정상적 혈관 미세 환경은 비정상적 세포 성장 환경을 유발할 수 있으며, 궁극적으로 외상 부위의 혈관 재건을 손상시킬 수 있다(문헌[Guo WY et al., Acceleration of diabetic wood healing by low-dose radiation is associated with peripheral mobilization of bone marrow stem cells. Radiat Res. 2010; 174(4): 467-479]). 또한, 섬유아세포의 수 감소, 당화 단백질(glycosylated protein) 증가, 비정상적 성장 인자 발현, 염증 과정 지연, 당뇨병성 고 글루코스 조건에서 외상을 입은 조직의 당화 최종 생성물의 축적은 모두 골수-유래 세포의 이동과 기능에 영향을 미친다(문헌[Fiorina P et al., The mobilization and effect of endogenous bone marrow progenitor cells diabetic wound healing. Cell Transplant. 2010; 19(11): 1369-1381]).
Ad-MSC는, 지방 조직에서 추출한 다방향 분화 잠재성을 가진 줄기 세포의 일종이다(문헌[Kato Y et al., Creation and transplantation of an adipose-derived stem cell (ASC) sheet in a diabetic wound-healing model. Jove-J Vis Exp. 2017; 12(6): 1-10]). Ad-MSC는 분화 잠재성을 통해 손상된 부위로 이동하고, 분화된 세포로 손상된 피부를 복구하며, 다양한 성장 인자를 분비할 수 있다(문헌[Rehman J et al., Secretion of angiogenic and anti-apoptotic factors by human adipose stromal cells. Circulation. 2004; 109: 1292-8]). 이는, 상처 혈관 신생을 촉진하고, 상처 치유를 촉진한다(문헌[Ebrahimian TG et al., Cell therapy based on adipose tissue-derived stromal cells promotes physiological and pathological wound healing.　Arterioscler Thromb Vasc Biol.　2009; 29(4): 503-510]).
일부 학자들은 Ad-MSC가 섬유아세포로 분화할 수 있어 형태적 유사성뿐만 아니라 비멘틴 및 피브로넥틱을 비롯한 섬유아세포 표면 단백질을 발현하는 능력도 보인다는 것을 발견했다(문헌[Kim WS et al., Wound healing effect of adipose-derived stem cells: a critical role of secretory factors on human dermal fibroblasts. J Dermatol Sci. 2007; 48:15-24]). 한편, Ad-MSC는 또한 상처 회복을 위해 섬유아세포 및 각질형성세포(keratinocyte)로 직접 형질전환될 수 있다(문헌[Unnikrishnan S et al., Constitution of fibrin-based niche for in vitro differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells to keratinocytes.　Biores Open Access. 2014; 3(6): 339-347]). 그러나, 이전 연구에서는, 대부분의 Ad-MSC가 당뇨병 마우스의 상처에 주사될 때 세포사멸을 거쳐 상처 치유가 지연된다는 것을 발견했다. 고 글루코스 조건에서 배양된 Ad-MSC는 시간-의존적 방식으로 세포사멸을 겪는다(문헌[Li Q et al., Stromal cell-derived factor-1 promotes human adipose tissue-derived stem cell survival and chronic wound healing. Exp Ther Med. 2016; 12: 45-50]).
시험예에서, Ad-MSC의 시험관내 활성 및 증식 능력에 대한 본원의 조성물의 효과는 CCK-8 및 EdU에 의해 검출되었다. 결과는, 본원의 조성물이 Ad-MSC의 활성 및 증식 능력을 향상시킬 수 있음을 보여주었다. 세포의 세포사멸은 유동 세포 분석에 의해 검출되었으며, 본원의 조성물은 시간- 및 농도-의존적 방식으로 Ad-MSC의 고 글루코스-유도 세포사멸을 억제할 수 있음이 확인되었다.
Ad-MSC의 생존율에 대한 본원의 조성물의 효과는 동물에서 생체내 시험되었고, 그 결과는, 본원의 조성물로 처리된 Ad-MSC의 생존율은 단독 Ad-MSC으로 처리된 경우보다 높고 상처 치유 속도는 더 빠른 것으로 나타났다.
중국 일반 미생물 균주 수집 센터(CGMCC) CGMCC17431 20190322

Claims (13)

  1. 로도코커스 루버(Rhodococcus ruber) 세포벽으로부터 유래된 생성물에 줄기 세포를 노출시키는 단계를 포함하는 줄기 세포의 조절 방법으로서,
    줄기 세포 수/로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물의 비율이 1 내지 100개의 줄기 세포/로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물 1 ng; 바람직하게는 5 내지 50개의 줄기 세포/로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물 1 ng이고;
    상기 조절은, 줄기 세포의 증식 촉진, 줄기 세포의 성장 촉진, 줄기 세포의 분화 촉진, 줄기 세포의 이동 촉진 및 줄기 세포의 생존율 향상 중 하나 또는 이들의 조합으로부터 선택되고;
    상기 줄기 세포는 성체 줄기 세포, iPSC 및 간엽(mesenchymal) 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 상기 줄기 세포는 간엽 줄기 세포이고;
    상기 간엽 줄기 세포는 골수 간엽 줄기 세포, 지방-유래(adipose-derived) 간엽 줄기 세포, 활액(synovial) 간엽 줄기 세포, 탯줄(umbilical cord) 간엽 줄기 세포, 제대혈(umbilical cord blood) 간엽 줄기 세포, 태반 간엽 줄기 세포, 양막(amniotic) 간엽 줄기 세포, 간 간엽 줄기 세포, 근육 간엽 줄기 세포, 폐 간엽 줄기 세포, 췌장 간엽 줄기 세포 및 치수(dental pulp) 간엽 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 상기 간엽 줄기 세포는 지방-유래 간엽 줄기 세포이고;
    바람직하게는, 상기 성체 줄기 세포는 상피 성체 줄기 세포인, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물이 로도코커스 루버 세포벽 또는 이의 성분(component)인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물이
    1) 로도코커스 루버를 제공하는 단계;
    2) 로도코커스 루버를 파쇄하여 파쇄된 생성물을 수득하는 단계;
    3.1) 임의적으로, 상기 파쇄된 생성물로부터 지질을 제거하는 단계;
    3.2) 임의적으로, 상기 파쇄된 생성물로부터 핵산을 제거하는 단계;
    3.3) 임의적으로, 상기 파쇄된 생성물로부터 단백질을 제거하는 단계;
    3.4) 로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물을 수득하는 단계;
    4) 임의적으로, 상기 로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물로부터 물을 제거하는 단계, 바람직하게는 상기 로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물을 동결건조(lyophilizing)하는 단계; 및
    5) 임의적으로, 분취(aliquoting)를 수행하는 단계
    를 포함하는 방법에 의해 수득되되,
    단계 (3.1), 단계 (3.2) 및 단계 (3.3)이 순서 면에서 상호교환가능하거나 병렬로 수행되고,
    단계 (4) 및 단계 (5)가 순서 면에서 상호교환가능한, 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 로도코커스 루버가 2019년 3월 22일에 CGMCC 번호 17431로 CGMCC에 기탁된 것인, 방법.
  5. 로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물의, 시약(reagent)의 제조에서의 용도로서,
    상기 시약은 줄기 세포의 증식 촉진, 줄기 세포의 성장 촉진, 줄기 세포의 분화 촉진, 줄기 세포의 이동 촉진, 및 줄기 세포의 생존율 향상 중 하나 또는 이들의 조합을 위해 사용되고;
    상기 줄기 세포는 성체 줄기 세포, iPSC 및 간엽 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 상기 줄기 세포는 간엽 줄기 세포이고;
    상기 간엽 줄기 세포는 골수 간엽 줄기 세포, 지방-유래 간엽 줄기 세포, 활액 간엽 줄기 세포, 탯줄 간엽 줄기 세포, 제대혈 간엽 줄기 세포, 태반 간엽 줄기 세포, 양막 간엽 줄기 세포, 간 간엽 줄기 세포, 근육 간엽 줄기 세포, 폐 간엽 줄기 세포, 췌장 간엽 줄기 세포 및 치수 간엽 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 상기 간엽 줄기 세포는 지방-유래 간엽 줄기 세포이고;
    바람직하게는, 상기 성체 줄기 세포는 상피 성체 줄기 세포인, 용도.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물이 로도코커스 루버 세포벽 또는 이의 성분인, 용도.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    상기 로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물이
    1) 로도코커스 루버를 제공하는 단계;
    2) 로도코커스 루버를 파쇄하여 파쇄된 생성물을 수득하는 단계;
    3.1) 임의적으로, 상기 파쇄된 생성물로부터 지질을 제거하는 단계;
    3.2) 임의적으로, 상기 파쇄된 생성물로부터 핵산을 제거하는 단계;
    3.3) 임의적으로, 상기 파쇄된 생성물로부터 단백질을 제거하는 단계;
    3.4) 로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물을 수득하는 단계;
    4) 임의적으로, 상기 로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물로부터 물을 제거하는 단계, 바람직하게는 상기 로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물을 동결건조하는 단계; 및
    5) 임의적으로, 분취를 수행하는 단계
    를 포함하는 방법에 의해 수득되되,
    단계 (3.1), 단계 (3.2) 및 단계 (3.3)이 순서 면에서 상호교환가능하거나 병렬로 수행되고,
    단계 (4) 및 단계 (5)가 순서 면에서 상호교환가능한, 용도.
  8. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    상기 로도코커스 루버가 2019년 3월 22일에 CGMCC 번호 17431로 CGMCC에 기탁된 것인, 용도.
  9. 로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물을 포함하는 세포 배양 배지로서, 바람직하게는 상기 로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물이 로도코커스 루버 세포벽 또는 이의 성분인, 세포 배양 배지.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물이
    1) 로도코커스 루버를 제공하는 단계;
    2) 로도코커스 루버를 파쇄하여 파쇄된 생성물을 수득하는 단계;
    3.1) 임의적으로, 상기 파쇄된 생성물로부터 지질을 제거하는 단계;
    3.2) 임의적으로, 상기 파쇄된 생성물로부터 핵산을 제거하는 단계;
    3.3) 임의적으로, 상기 파쇄된 생성물로부터 단백질을 제거하는 단계;
    3.4) 로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물을 수득하는 단계;
    4) 임의적으로, 상기 로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물로부터 물을 제거하는 단계, 바람직하게는 상기 로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물을 동결건조하는 단계; 및
    5) 임의적으로, 분취를 수행하는 단계
    를 포함하는 방법에 의해 수득되되,
    단계 (3.1), 단계 (3.2) 및 단계 (3.3)이 순서 면에서 상호교환가능하거나 병렬로 수행되고,
    단계 (4) 및 단계 (5)가 순서 면에서 상호교환가능한, 세포 배양 배지.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 로도코커스 루버가 2019년 3월 22일에 CGMCC 번호 17431로 CGMCC에 기탁된 것인, 세포 배양 배지.
  12. 로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물과 함께 치료 효과량의 줄기 세포에 대상(subject)의 상처(wound)를 노출시키는 단계를 포함하는 상처 치유(healing)를 촉진하는 방법으로서, 이때
    상기 줄기 세포는 성체 줄기 세포, 간엽 줄기 세포 및 iPSC로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    줄기 세포 수/로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물의 비율이 1 내지 100개의 줄기 세포/로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물 1 ng; 바람직하게는 5 내지 50개의 줄기 세포/로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물 1 ng이고;
    상기 간엽 줄기 세포는 골수 간엽 줄기 세포, 지방-유래 간엽 줄기 세포, 활액 간엽 줄기 세포, 탯줄 간엽 줄기 세포, 제대혈 간엽 줄기 세포, 태반 간엽 줄기 세포, 양막 간엽 줄기 세포, 간 간엽 줄기 세포, 근육 간엽 줄기 세포, 폐 간엽 줄기 세포, 췌장 간엽 줄기 세포 및 치수 간엽 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 상기 간엽 줄기 세포는 지방-유래 간엽 줄기 세포이고;
    바람직하게는, 상기 성체 줄기 세포는 상피 성체 줄기 세포이고;
    바람직하게는, 상기 상처는 당뇨병-관련 상처인, 방법.
  13. - 줄기 세포, 및
    - 로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물
    을 포함하는 약학 조성물로서,
    상기 줄기 세포는 성체 줄기 세포, 간엽 줄기 세포 및 iPSC로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    줄기 세포 수/로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물의 비율이 1 내지 100개의 줄기 세포/로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물 1 ng; 바람직하게는 5 내지 50개의 줄기 세포/로도코커스 루버 세포벽으로부터 유래된 생성물 1 ng이고;
    상기 간엽 줄기 세포는 골수 간엽 줄기 세포, 지방-유래 간엽 줄기 세포, 활액 간엽 줄기 세포, 탯줄 간엽 줄기 세포, 제대혈 간엽 줄기 세포, 태반 간엽 줄기 세포, 양막 간엽 줄기 세포, 간 간엽 줄기 세포, 근육 간엽 줄기 세포, 폐 간엽 줄기 세포, 췌장 간엽 줄기 세포 및 치수 간엽 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 상기 간엽 줄기 세포는 지방-유래 간엽 줄기 세포이고;
    바람직하게는, 상기 성체 줄기 세포는 상피 성체 줄기 세포인, 약학 조성물.
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Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1223673C (zh) 2003-01-23 2005-10-19 中国科学院微生物研究所 一种产生生物乳化剂和降解多环芳烃的赤红球菌Em及用途
CN100519737C (zh) 2006-04-29 2009-07-29 浙江工业大学 赤红球菌zjb-064及其应用
CN101250490A (zh) 2008-03-28 2008-08-27 天津科技大学 活酵母细胞衍生物的生产方法
CN101580808B (zh) 2008-05-15 2011-11-16 汕头大学 一株赤红球菌及其在降解烃类化合物中的应用
CN101323865B (zh) 2008-08-07 2012-07-18 山东省科学院能源研究所 微生物油脂分离提取方法
CN101619299B (zh) 2009-07-08 2012-07-04 天津科技大学 一种赤红球菌以及利用该菌制备5-氰基戊酰胺的方法
CN102071141B (zh) * 2010-03-26 2013-03-20 无锡中佳科技股份有限公司 一种脱氮微生物菌剂及其制备方法和应用
CN102250796B (zh) 2011-06-21 2013-11-06 中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所 一种赤红球菌和微生物菌剂及它们的应用
CN102604875B (zh) 2012-03-26 2014-12-10 江西师范大学 赤红球菌及其在降解苯酚污染物中的应用
CN103160491B (zh) 2013-04-15 2014-12-10 江西师范大学 赤红球菌sd3的诱变菌m1的固定化细胞及其在降解苯酚污染物中的应用
CN103509833B (zh) 2013-08-15 2016-04-06 天津科技大学 一种利用赤红球菌制备2,6-二氟苯甲酰胺的方法
CN103627653B (zh) 2013-10-17 2016-01-20 浙江省环境保护科学设计研究院 一种赤红球菌菌株及其在含有机污染物的废水处理中的应用
CN104830738B (zh) 2015-05-22 2017-09-15 厦门大学 一种赤红球菌及其在制备十溴联苯醚降解剂中的应用
CN106591168B (zh) 2016-02-02 2019-08-16 江苏南资环保科技有限公司 一种烟嘧磺隆降解赤红球菌ymhl-1及其应用
CN106591172B (zh) 2016-04-01 2019-11-29 江苏南资环保科技有限公司 一种赤红球菌pta-2及其固定化和应用
CN105820982B (zh) 2016-04-29 2019-06-28 河北省科学院生物研究所 一种赤红球菌xs-2、其生物菌剂及制备方法和应用
CN106434466B (zh) 2016-10-14 2019-10-18 天津科技大学 一种产生天然红色素的赤红球菌及其制备方法与应用
CN107151635B (zh) 2017-04-28 2020-02-18 中国农业科学院研究生院 一种能够降解邻苯二甲酸酯的赤红球菌及其应用
CN108815198A (zh) * 2017-05-03 2018-11-16 辽宁格瑞仕特生物制药有限公司 红色诺卡氏菌细胞壁骨架作为巨噬细胞增殖促进剂的用途
CN108815197A (zh) * 2017-05-03 2018-11-16 辽宁格瑞仕特生物制药有限公司 红色诺卡氏菌细胞壁骨架作为cd4+t细胞增殖促进剂的用途
CN108795859A (zh) * 2017-05-03 2018-11-13 辽宁格瑞仕特生物制药有限公司 红色诺卡氏菌细胞壁骨架作为自然杀伤细胞增殖促进剂的用途
CN108130288B (zh) 2017-12-15 2020-10-09 浙江工业大学 赤红球菌及其降解有机污染物的应用
CN108862590B (zh) 2018-08-03 2021-01-12 中国石油大学(北京) 一种降解丙烯腈废水cod的方法
CN109576180B (zh) 2018-12-17 2021-11-26 北京利昂盛生物技术有限公司 一株赤红球菌及其作为免疫佐剂在制备疫苗中的应用
WO2020147472A1 (zh) * 2019-01-15 2020-07-23 辽宁格瑞仕特生物制药有限公司 赤红球菌产品及其制药用途
CN110184215B (zh) * 2019-05-21 2021-08-13 福建省微生物研究所 一种赤红球菌菌株、菌制剂及其菌体细胞与提取物的应用

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